RS67328B1 - Lečenje amd-a korišćenjem aav2 varijante sa afliberceptom - Google Patents

Lečenje amd-a korišćenjem aav2 varijante sa afliberceptom

Info

Publication number
RS67328B1
RS67328B1 RS20251055A RSP20251055A RS67328B1 RS 67328 B1 RS67328 B1 RS 67328B1 RS 20251055 A RS20251055 A RS 20251055A RS P20251055 A RSP20251055 A RS P20251055A RS 67328 B1 RS67328 B1 RS 67328B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cases
aflibercept
fold
composition
use according
Prior art date
Application number
RS20251055A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Blumenkranz
Mehdi Gasmi
Original Assignee
Adverum Biotechnologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adverum Biotechnologies Inc filed Critical Adverum Biotechnologies Inc
Publication of RS67328B1 publication Critical patent/RS67328B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
    • A61M5/178—Syringes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)

Description

[0001] Pozadina obelodanjivanja
[0003] Aflibercept je rekombinantni fuzioni protein koji deluje kao receptor za mamac za podtipove vaskularnog endotelnog faktora rasta A i B (VEGF-A i VEGF-B) i faktora rasta placente (PIGF). Vezivanjem za ove ligande, aflibercept je u stanju da spreči vezivanje ovih liganada za receptore vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR), VEGFR-1 i VEGFR-2, kako bi suzbio neovaskularizaciju i smanjio vaskularnu propusnost. Aflibercept se sastoji od domena 2 VEGFR-1 i domena 3 VEGFR-2 spojenog sa Fc fragmentom IgG1. Aflibercept se komercijalno prodaje pod trgovačkim imenom EYLEA<®>(aflibercept), što je oftalmička intravitrealna injekcija fuzionog proteina aflibercepta.
[0005] Sledeći dokumenti otkrivaju rAAV2.7m8: (1) WO 2016/141078; (2) Deniz Dalkara i sar. „In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous“, Science translational medicine, (2013), strane 1-11 i (3) US2014294771.
[0007] Sledeći dokumenti otkrivaju VEGF Trap agent koji blokira delovanje VEGF-a, ali ne otkrivaju rAAV2.7m8: (1) PETER PECHAN i sar. „Gene Therapies for Neovascular Age-Related Macular Degeneration“, COLD SPRING HARBOR PERSPECTIVES IN MEDICINE, (2014), tom 5, br.7, strana a017335;
[0008] (2) US2014371438; i (3) WO2015058048.
[0010] Sažetak obelodanjivanja
[0012] Iako je EYLEA<®>(aflibercept) trenutni standard nege za lečenje vlažnog AMD-a kod pacijenata, metoda genske terapije za isporuku aflibercepta u oko može pružiti poboljšanu opciju lečenja za pacijente jer genska terapija može obezbediti produženo ili održivo oslobađanje aflibercepta in vivo bez potrebe za ponovljenim injekcijama, što može povećati rizik od upale, infekcije i drugih neželjenih efekata kod nekih pacijenata. Pored toga, time što ne zahteva ponovljene injekcije, genska terapija se bavi izazovom usaglašenosti i pridržavanja pacijenata povezanim sa terapijama koje zahtevaju ponovljene injekcije, jer neusaglašenost može dovesti do gubitka vida i pogoršanja bolesti ili stanja oka. Stopa neusaglašenosti i nepoštovanja režima lečenja koji zahtevaju ponovljene ili česte posete medicinskim ordinacijama za primenu je veća među starijim pacijentima, koji su najviše pogođeni AMD-om. Isporuka aflibercepta u oko pacijenta putem genske terapije stoga može pružiti bezbedniju, potencijalno isplativiju i pogodniju opciju lečenja za pacijente i poboljšati ishode pacijenta rešavanjem problema neusaglašenosti i nepridržavanja.
[0014] Ovo obelodanjivanje se odnosi na farmaceutske sastave i metode za prevenciju ili lečenje neovaskularne (vlažne) starosne makularne degeneracije (AMD), makularnog edema nakon okluzije retinalne vene (RVO), dijabetičkog makularnog edema (DME), dijabetičke retinopatije (DR) kod pacijenata sa DME, okluzijom retinalne vene i srodnim bolestima ili stanjima oka, kod primata ili ljudskog subjekta primenom intravitrealno ili subretinalno farmaceutskog sastava koji se sastoji od farmaceutski efikasne količine vektora ili virusnih čestica (npr. rAAV) koji se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njihovu varijantu.
[0016] U nekim aspektima, ovde obelodanjeno je metoda lečenja stanja ili bolesti oka, metoda koja se sastoji od primene jedinične doze farmaceutskog sastava intravitrealnom injekcijom u oko subjekta primata kome je to potrebno, pri čemu farmaceutski sastav sadrži: (a) varijantu rAAV2 koja sadrži sekvencu aminokiselina LGETTRP umetnutu između pozicija 587 i 588 kapsidnog proteina VP1, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima najmanje 95% homologije sa afliberceptom pod transkripcionom kontrolom promotera citomegalovirusa (CMV), i (b) farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu. U nekim slučajevima, stanje ili bolest oka je neovaskularna (vlažna) makularna degeneracija povezana sa starenjem (AMD), makularni edem nakon okluzije retinalne vene, dijabetički makularni edem (DME) ili dijabetička retinopatija povezana sa DME. U nekim slučajevima, stanje ili bolest oka je horoidalna neovaskularizacija ili vlažna AMD. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od vektorskih genoma od 1E12 do 1E13. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od vektorskih genoma od 2E12 do 6E12. U nekim slučajevima, jedinična doza sadrži zapreminu koja nije veća od 100 µl. U nekim slučajevima, jedinična doza sadrži zapreminu koja nije veća od 50 µl. U nekim slučajevima, subjekt je neljudski primat. U nekim slučajevima subjekt je čovek. U nekim slučajevima, subjekt reaguje na aflibercept. U nekim slučajevima, subjekt je prethodno lečen afliberceptom. U nekim slučajevima, primena intravitrealnom injekcijom se javlja ne više od jednom u najmanje 2 godine. U nekim slučajevima, primena intravitrealnom injekcijom se javlja ne više od jednom u najmanje 5 godina. U nekim slučajevima, primena intravitrealnom injekcijom je jednokratna primena. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav je suspenzija ili rashlađena suspenzija. U nekim slučajevima, metoda dalje sadrži mešanje suspenzije kako bi se osigurala ravnomerna raspodela suspenzije pre koraka primene. U nekim slučajevima, metoda dalje sadrži zagrevanje farmaceutskog sastava na sobnu temperaturu pre koraka primene.
[0018] U drugim aspektima ovog tehničkog obelodanjivanja, farmaceutski sastav se sastoji od suspenzije koja dalje sadrži varijantu rAAV2 koja se sastoji od aminokiselinske sekvence LGETTRP umetnute između pozicija 587 i 588 kapsidnog proteina VP1 i sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima najmanje 95% homologije sa afliberceptom pod transkripcionom kontrolom promotora citomegalovirusa (CMV). U nekim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 2. U nekim slučajevima, jedinična doza sastava sadrži između 1E12 i 1E13 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava sadrži vektorske genome 2E12 do 6E12. U nekim slučajevima, komplet se sastoji od farmaceutskog sastava suspenzije i rastvora za razblaživanje farmaceutskog sastava. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav ne sadrži više od 1 ml. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav ne sadrži više od 0,5–1,0 ml. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav sadrži manje od ili jednako 0,5 ml. U nekim slučajevima, rastvor u kompletu sadrži pufer, so, alkohol, surfaktant ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim slučajevima, komplet se sastoji od šprica.
[0020] U drugim aspektima ovog tehničkog obelodanjivanja, metoda lečenja stanja ili bolesti oka obuhvata: mešanje rashlađene suspenzije, pri čemu suspenzija obuhvata: varijantu rAAV2 koja se sastoji od sekvence aminokiselina LGETTRP umetnute između pozicija 587 i 588 kapsidnog proteina VP1 i sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima najmanje 95% homologije sa afliberceptom pod transkripcionom kontrolom promotora citomegalovirusa (CMV); i davanje zapremine rashlađene suspenzije u oko ljudskog subjekta putem intravitrealne injekcije. U nekim slučajevima, subjekt se karakteriše kao prethodno tretiran afliberceptom. U nekim slučajevima, subjekt reaguje na aflibercept. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija ne sadrži više od 1 ml rastvora. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija ne sadrži više od 0,5 ml. U nekim slučajevima, zapremina koja se daje subjektu nije veća od 50 µl. U nekim slučajevima, zapremina koja se daje subjektu nije veća od 100 µl. U nekim slučajevima, zapremina se sastoji od jedinične doze između 1E12 i 1E13 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, zapremina se sastoji od jedinične doze između 2E12 do 6E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, korak primene se javlja ne više od jednom u najmanje 2 godine. U nekim slučajevima, korak primene je jednokratna injekcija. U nekim slučajevima, metoda dalje obuhvata ispitivanje odgovora subjekta na aflibercept pre primene sastava. U nekim slučajevima, suspenzija sadrži farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu. U nekim slučajevima, pomoćna supstanca sadrži surfaktant ili stabilizator. U nekim slučajevima, surfaktant se bira između polisorbata, natrijum dodecil sulfata, natrijum lauril sulfata, lauril dimetil amin oksida, polietoksiliranih alkohola, polioksietilen sorbitana, oktoksinola, Brija, pluronskog i polioksil ricinusovog ulja. U nekim slučajevima, farmaceutski prihvatljiva pomoćna supstanca sadrži fenol, manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. U nekim slučajevima, stanje ili bolest oka je neovaskularna (vlažna) makularna degeneracija povezana sa starenjem (AMD), makularni edem nakon okluzije retinalne vene, dijabetički makularni edem (DME) ili dijabetička retinopatija povezana sa DME. U nekim slučajevima, stanje ili bolest oka je horoidalna neovaskularizacija ili vlažna AMD. U nekim slučajevima, metoda dalje obuhvata zagrevanje suspenzije na sobnu temperaturu pre primene.
[0022] Kratak opis crteža
[0024] Nove karakteristike pronalaska su posebno izložene u priloženim patentnim zahtevima. Bolje razumevanje karakteristika i prednosti predmetnog pronalaska dobiće se pozivanjem na sledeći detaljan opis u kojem se koriste principi pronalaska i pri čemu prateći crteži:
[0025] SL 1 ilustruje primer slike fundusa oka primata (afričkog zelenog majmuna) nakon indukcije CNV lezija laserskim zračenjem bez tretmana. Devet lezija indukovano je jednom laserskom primenom laserskim zračenjem od 750 mW, 50 µm, 100 ms za sva mesta osim centralnog mesta, koje je tretirano sa 400 mW. Fotografija fundusa u boji je urađena odmah nakon laserskog zračenja kako bi se dokumentovale laserske lezije.
[0027] SL. 2 ilustruje reprezentativne slike fundusa fluorescentne angiografije 70. dana nakon intravitrealne (IVT) injekcije sa bilo kojom kontrolom vehikule koja se sastoji samo od pufera ili AAV2.7m8-aflibercepta. Majmuni tretirani AAV2.7m8-afliberceptom pokazivali su manje lezija IV stepena i nižeg stepena od majmuna kojima je ubrizgana samo kontrola vehikule.
[0029] SL. 3 ilustruje procenat lezija CNV-a IV stepena kod majmuna nakon intravitrealne injekcije leka EYLEA<®>(aflibercept), koja je korišćena kao pozitivna kontrola, u poređenju sa kontrolom vehikule koja obuhvata samo pufer. Lečenje lekom EYLEA<®>(aflibercept) pokazalo je značajno smanjenje količine lezija IV stepena u poređenju sa kontrolom vehikule na osnovu slika fundusa prikupljenih 14. dana (svetlo siva traka) i 28. dana (tamno siva traka).
[0031] SL. 4 ilustruje procenat lezija CNV stadijuma IV kod majmuna lečenih intravitrealnom injekcijom kontrole vehikule, AA V2.7m8-aflibercept, ili AAV2.7m8-sVEGFR-1 14. dana (svetlo siva traka) i 28. dana (tamno siva traka) nakon intravitrealne injekcije. Majmuni lečeni intravitrealnom injekcijom AAV2.7m8-aflibercept pokazali su značajno smanjenje broja lezija IV stepena u poređenju sa majmunima lečenim kontrolom vehikule na dan 14 i dan 28, slično rezultatima pozitivne kontrole prikazanoj na SL.3. Lečenje intravitrealnom injekcijom AAV2.7m8-sVEGFR-1 nije pokazalo značajno smanjenje lezija stadijuma IV u poređenju sa kontrolom vehikule.
[0033] SL. 5 ilustruje sekvencu nukleinske kiseline aflibercepta.
[0035] SL. 6 ilustruje sekvencu nukleinske kiseline rastvorljive fms-slične tirozin kinaze-1 (sFlt-1 ili sVEGFR-1). sVEGFR-1 je varijanta spajanja VEGF receptora 1.
[0036] Detaljan opis obelodanjivanja
[0038] Nekoliko aspekata predmetnog tehničkog obelodanjivanja opisano je u nastavku sa osvrtom na primere primene za ilustraciju. Treba shvatiti da su navedeni brojni specifični detalji, odnosi i metode kako bi se obezbedilo potpuno razumevanje karakteristika opisanih u ovom dokumentu. Međutim, onaj ko ima uobičajenu veštinu u relevantnoj umetnosti, lako će prepoznati da se ovde opisane karakteristike mogu praktikovati bez jednog ili više specifičnih detalja ili drugim metodama. Karakteristike opisane u ovom dokumentu nisu ograničene ilustrovanim redosledom radnji ili događaja, jer se neke radnje mogu pojaviti u različitim redosledima i/ili istovremeno sa drugim radnjama ili događajima. Pored toga, nisu svi ilustrovani akti ili događaji potrebni za implementaciju metodologije u skladu sa karakteristikama opisanim u ovom dokumentu.
[0040] Ovo obelodanjivanje se odnosi na farmaceutske sastave i metode lečenja ili prevencije očnih bolesti ili stanja koja se sastoje od primene genske terapije, vektora ili konstrukta intravitrealnom injekcijom u oko primata (npr. majmuna ili čoveka) koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline (npr. cDNK) koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njihovu varijantu. Nakon intravitrealne injekcije genske terapije, vektora ili konstrukta koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline aflibercepta, funkcionalnog fragmenta ili njegove varijante, sekvenca nukleinske kiseline se izražava in vivo, npr. u ćelijama mrežnjače, kako bi se generisao fuzioni protein aflibercepta, ili funkcionalni fragment, ili njegova varijanta, koji proizvodi terapijski efekat.
[0042] U nekim primenama pronalaska, genska terapija, vektor ili konstrukt koji se sastoji od aflibercepta koristi se za lečenje ili sprečavanje jedne ili više očnih bolesti ili stanja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, neovaskularnu (vlažnu) makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem (AMD), makularni edem nakon okluzije retinalne vene (RVO), dijabetički makularni edem (DME) i/ili dijabetičku retinopatiju (DR) kod pacijenata sa DME, okluzijom retinalne vene ili bilo kojom drugom povezanom bolešću ili stanjem oka koje uključuje neovaskularizaciju (npr. horoidna neovaskularizacija (CNV)) kod primata ili ljudskog subjekta. U nekim primenama pronalaska, ovde opisane metode se koriste za lečenje očne bolesti ili stanja koje reaguje na aflibercept (npr. EYLEA<®>). U nekim primenama pronalaska, ovde opisane metode se koriste za lečenje bolesti oka ili stanja koje reaguje na trenutni standard nege ili na najmanje jednu od odobrenih terapija za AMD, RVO, DME ili DR kod pacijenata sa DME, kao što je injekcija aflibercepta, injekcija ranibizumaba ili injekcija bevacizumaba.
[0044] U nekim primenama pronalaska, primenom intravitrealno ili subretinalno farmaceutskog sastava prilagođenog ili pogodnog za genetsku terapiju, npr. rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) sa varijantom ili modifikovanim kapsidnim proteinom VP1, kao što je kapsidna varijanta 7m8, koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein ili polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologan afliberceptu. Takva homologija može se zasnivati na sekvenci nukleinskih kiselina, sekvenci aminokiselina, prostornoj konformaciji ili proteinskoj strukturi aflibercepta.
[0046] Proteinska sekvenca aflibercepta je javno dostupna u bazi podataka DrugBank, pristupni broj DB08885. U nekim slučajevima, aflibercept se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein, kao što je objavljeno u USA patentoj publikaciji 2014/0371438 (SL.5).
[0048] Jedna od prednosti genske terapije u odnosu na proteinske injekcije je da genska terapija omogućava produženo ili kontinuirano oslobađanje terapijskog agensa (npr. aflibercepta) i, u nekim slučajevima, ne zahteva višestruke ili ponovljene injekcije. Ovo produženo ili zadržano oslobađanje aflibercepta proizilazi iz isporuke sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein aflibercepta, koji se izražava in vivo kako bi se obezbedio terapijski efekat. U nekim slučajevima, ekspresija aflibercepta iz heterologne nukleinske kiseline koja se isporučuje u ćelijama mrežnjače može se nastaviti tokom najmanje 1 godine, tokom više od 1 godine, tokom najmanje 2, 3, 4, 5, 10 ili više godina.
[0050] U nekim slučajevima, rAAV može da sadrži protein kapsidne varijante koji povećava njegovu infektivnost ciljnih ćelija ili tkiva u oku (npr. ćelije mrežnjače), omogućavajući efikasniju isporuku sekvence nukleinske kiseline koja kodira terapijski transgen kao što je fuzioni protein aflibercepta, ili njegov funkcionalni fragment ili varijanta, u ciljne ćelije ili tkivo gde se terapijski transgen može izraziti tokom određenog vremenskog perioda (npr. tokom najmanje 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10 ili više godina). Genska terapija, kao što je ovde obelodanjeno, može ciljati specifično tkivo ili ćelijski tip od interesa, npr. fotoreceptorske ćelije, što može pomoći da se minimiziraju efekti van cilja ili da se obezbedi ciljanija isporuka terapijskog transgena kao što je aflibercept in vivo.
[0052] Sa produženom ili zadržanom isporukom aflibercepta in vivo putem genske terapije, moglo bi se primeniti farmaceutski sastav koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment, mutant ili njegovu varijantu, u manje doza u određenom vremenskom periodu u poređenju sa trenutnim standardom nege (npr. injekcije proteina ili tretmani zasnovani na terapiji koja nije zasnovana na genu). U nekim slučajevima, ukupan broj primenjenih doza genske terapije koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, nije veći od 1 jedinične doze u najmanje 1,5 godine, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine, najmanje 4 godine, najmanje 5 godina, najmanje 6 godina, najmanje 7 godina, najmanje 8 godina, najmanje 9 godina ili najmanje 10 godina. U nekim slučajevima, primena genske terapije koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, je samo jednom ili jednom u životu pacijenta. U nekim slučajevima, jednokratna primena genske terapije koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, može proizvesti terapeutski efekat kod pacijenta koji traje više od 1 godine ili više od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 godina. U nekim slučajevima, genska terapija koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, daje se pacijentu ne više od jednom u najmanje 2 ili više godina, u najmanje 3 ili više godina, u najmanje 4 ili više godina, u najmanje 5 ili više godina, u najmanje 6 ili više godina, u najmanje 7 ili više godina, u najmanje 8 ili više godina, u najmanje 9 ili više godina, ili u najmanje 10 ili više godina. U nekim slučajevima, genska terapija koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept se daje pacijentu koji reaguje na aflibercept ili koji je prethodno lečen lekom EYLEA<®>pre nego što je primio genetsku terapiju koja je ovde navedena. U nekim slučajevima, pacijent koji prima genetsku terapiju navedenu u ovom dokumentu (npr. AAV2.7m8-aflibercept) može započeti terapiju afliberceptom, ranibizumabom i/ili bevacizumabom, po potrebi, nakon što prođe najmanje 2, 3, 4, 5, 10 ili više godina od primanja genske terapije. U nekim slučajevima, anti-VEGF terapija nije potrebna nakon što pacijent primi terapiju sa genetskom terapijom koja je ovde obelodanjena.
[0054] U nekim slučajevima, jednokratna primena genske terapije koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, uklanja potrebu da pacijent prima injekciju leka EYLEA<®>više od godinu dana, više od 1,5 godine ili više od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 godina. U nekim slučajevima, pacijentu koji primi intravitrealnu injekciju genske terapije koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, nije potrebna dodatna injekcija aflibercepta do kraja života pacijenta. U drugim slučajevima, pacijent koji primi jednokratnu intravitrealnu injekciju 7m8-aflibercept genske terapije može započeti terapiju bilo kojim afliberceptom, ranibizumabom i/ili bevacizumabom, po potrebi, najmanje 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina nakon primanja genske terapije.
[0056] Terminologija ovog obelodanjivanja služi samo za opis određenih slučajeva i nije namenjena ograničavanju sastava, metoda i sastava predmetnog obelodanjivanja.
[0058] Sastavi i metode predmetnog obelodanjivanja na način opisan u ovom dokumentu mogu koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike i opise molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), ćelijske biologije, biohemije, imunohemije i oftalmoloških tehnika, koje su u okviru veština stručnjaka u predmetnoj oblasti. Takve konvencionalne tehnike uključuju metode za posmatranje i analizu mrežnjače, ili vida kod subjekta, kloniranje i razmnožavanje rekombinantnog virusa, formulaciju farmaceutskog sastava i biohemijsko prečišćavanje i imunohemiju. Specifične ilustracije odgovarajućih tehnika mogu se dobiti pozivanjem na primere u ovom dokumentu. Međutim, mogu se koristiti i ekvivalentne konvencionalne procedure. Takve konvencionalne tehnike i opisi mogu se naći u standardnim laboratorijskim priručnicima kao što su Green, i sar., Izd., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (tomovi I-IV) (1999); Weiner, i sar., Izd., Genetic Variation: A Laboratory Manual
[0059] (2007); Dieffenbach, Dveksler, Izd., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell i Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual
[0062] 1
[0063] (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook i Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); i Sambrook i Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (sve od Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4. izdanje) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, „Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach“ IRL Press, London (1984); Nelson i Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3. izdanje, W.H. Freeman Pub., New York (2000); i Berg i sar., Biochemistry, 5. izdanje, W.H. Freeman Pub., New York (2002).
[0065] U nekim slučajevima, ovde obelodanjene su farmaceutske formulacije koje sadrže: (a) virion rekombinantnog adeno-povezanog virusa (rAAV2) prilagođen za genetsku terapiju koji sadrži: (i) varijantu AAV2 kapsidnog proteina, pri čemu varijanta AAV2 kapsidnog proteina obuhvata umetanje LGETTRP između pozicija 587 i 588, i pri čemu varijanta kapsidnog proteina daje povećanje infektivnosti očne ćelije u odnosu na AAV virion koji obuhvata odgovarajući nevarijantni AAV2 kapsidni protein; i (ii) heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu; i (b) farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu. U nekim slučajevima, genski proizvod koji je kodiran je fuzioni protein ili polipeptid koji ima najmanje 95%, ili 99% homologije sa afliberceptom.
[0067] Ovde su takođe obelodanjene metode lečenja stanja ili bolesti oka za koje je aflibercept indikovan ili odobren za lečenje, koje obuhvataju primenu farmaceutske formulacije prilagođene genskoj terapiji, tj. isporuku sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept in vivo, kao što je ovde opisano, u oko subjekta intravitrealnom injekcijom.
[0069] Ovde su takođe obelodanjeni farmaceutski sastavi koji se sastoje od genske terapije ili vektora koji kodira fuzioni protein ili polipeptid koji ima najmanje 95%, ili 99% homologije sa afliberceptom koji se može liofilizovati, ili isporučiti u obliku suspenzije. U nekim slučajevima, liofilizovani oblik ili suspenzija farmaceutskog sastava se obezbeđuje u kompletu sa puferom za rekonstituisanje farmaceutskog sastava ili za razblaživanje, respektivno.
[0070] Ovde su takođe obelodanjeni farmaceutski sastavi koji se sastoje od genske terapije ili vektora koji kodira fuzioni protein ili polipeptid koji ima najmanje 95%, ili 99% homologije sa afliberceptom koji se isporučuje kao rashlađena suspenzija. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija farmaceutskog sastava je obezbeđena u kompletu sa puferom za razblaživanje farmaceutskog sastava.
[0072] Ovde su takođe obelodanjeni rekombinantni virioni adeno-asociranog virusa (rAAV) prilagođeni genskoj terapiji za smanjenje horoidalne neovaskularizacije koja sadrži: (a) varijantu AAV2 kapsidnog proteina koji se sastoji od peptidnog umetanja aminokiselinske sekvence LGETTRP umetnute na aminokiselinskoj poziciji između 587 i 588 u AAV2, pri čemu peptidno umetanje dovodi do povećanja infektivnosti očne ćelije u odnosu na AAV virion koji se sastoji od odgovarajućeg nepromenjenog ili nemodifikovanog AAV2 kapsidnog proteina; (b) heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid ili terapeutski transgen koji ima najmanje 95% homologije sa afliberceptom pod transkripcionom kontrolom promotera citomegalovirusa (CMV).
[0074] Ovde su takođe obelodanjene metode lečenja stanja ili bolesti oka koje se sastoje od primene rAAV viriona prilagođenog za genetsku terapiju i in vivo isporuke sekvence nukleinske kiseline za ekspresiju aflibercepta, ili njegovog funkcionalnog fragmenta ili varijante, kako je ovde opisano u oku ljudskog subjekta; kada je ljudskom subjektu prethodno dijagnostikovano stanje oka povezano sa neovaskularizacijom. U nekim slučajevima, terapija aflibercept genom se daje pacijentu koji reaguje na aflibercept ili koji je prethodno lečen lekom EYLEA<®>(aflibercept).
[0076] U nekim slučajevima, ovde su obelodanjene metode i farmaceutske formulacije koje sadrže: (a) virion rekombinantnog adeno-povezanog virusa (rAAV) prilagođen za genetsku terapiju koji sadrži: (i) varijantu AAV kapsidnog proteina koji se sastoji od umetanja aminokiselina izabranih između LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF i STGKVPN na poziciji koja odgovara aminokiselinama 570-611 kapsidnog proteina VP1 u AAV2, i gde varijanta kapsidnog proteina dovodi do povećanja infektivnosti retinalne ćelije (npr. fotoreceptorskih ćelija ili epitela pigmenta mrežnjače) u odnosu na AAV virion koji se sastoji od odgovarajućeg nevarijantnog AAV2 kapsidnog proteina; i (ii) heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aflibercept; i (b) farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu. U nekim slučajevima, genski proizvod koji je kodiran je fuzioni protein ili polipeptid koji ima najmanje 95% homologije sa afliberceptom pod transkripcionom kontrolom promotera citomegalovirusa (CMV). U nekim slučajevima, farmaceutski prihvatljiva pomoćna supstanca sadrži surfaktant (npr. nejonski surfaktant, pluronski, poloksamer ili polisorbat) koji sprečava agregaciju u farmaceutskom sastavu koji je ovde obelodanjen.
[0078] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički termini korišćeni ovde imaju isto značenje kao što ga uobičajeno razume stručnjak u predmetnoj oblasti.
[0080] Terminologija koja se ovde koristi je samo u svrhu opisivanja određenih slučajeva i nije namenjena da bude ograničavajuća. Jedninski oblici uključuju referente množine, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Pored toga, u meri u kojoj se termini „uključiti“, „uključuje“, „imati“, „ima“, „sa“, ili njihove varijante koriste u detaljnom opisu i/ili potraživanjima, takvi termini imaju za cilj da budu inkluzivni na način sličan terminu „sadržati“. Termin „sadržati“ kako se ovde koristi je sinonim za „uključivati“ ili „sastojati“, i inkluzivan je ili otvoren.
[0082] Svako pozivanje na „ili“ ovde ima za cilj da obuhvati „i/ili“ osim ako nije drugačije navedeno. Kao što se ovde koristi, termin „oko“ se odnosi na taj broj plus ili minus 10% tog broja. Termin „oko“ se odnosi na taj opseg minus 10% njegove najniže vrednosti i plus 10% njegove najveće vrednosti.
[0084] Termin „subjekt“, „pacijent“ ili „pojedinac“ odnosi se na primate, uključujući primate koji nisu ljudi, kao što su majmuni, npr. afrički zeleni majmuni i rezus majmuni i ljudi. U poželjnim slučajevima, subjekt je čovek ili ljudski pacijent.
[0086] Termini „lečenje“, „lečiti“, „lečenje“, „poboljšati“ ili „poboljšanje“ i drugi gramatički ekvivalenti koji se ovde koriste, uključuju ublažavanje, blažavanje ili poboljšanje simptoma bolesti ili stanja, sprečavanje dodatnih simptoma, ublažavanje ili sprečavanje osnovnih metaboličkih uzroka simptoma, inhibiranje bolesti ili stanja, npr. zaustavljanje razvoja bolesti ili stanja, ublažavanje bolesti ili stanja, izazivanje regresije bolesti ili stanja, ublažavanje stanja uzrokovanog bolešću ili stanjem, ili zaustavljanje simptoma bolesti ili stanja, i namenjeni su za
[0089] 1
[0090] uključivanje profilakse. Termini dalje uključuju postizanje terapijske koristi i/ili profilaktičke koristi. Pod „terapijskom koristi“ se podrazumeva iskorenjivanje ili poboljšanje osnovnog poremećaja koji se leči. Takođe, terapijska korist se postiže iskorenjivanjem ili ublažavanjem jednog ili više fizioloških simptoma povezanih sa osnovnim poremećajem tako da se primećuje poboljšanje kod pacijenta, bez obzira na to što je pacijent i dalje oboleo od osnovnog poremećaja. Za profilaktičku korist, farmaceutski sastavi se daju pacijentu koji je izložen riziku od razvoja određene bolesti ili pacijentu koji prijavi jedan ili više fizioloških simptoma bolesti, čak i ako dijagnoza bolesti nije postavljena.
[0092] Termini „dati“, „davati“, „davanje“ i slično, kako se ovde koriste, mogu se odnositi na metode koje se koriste za omogućavanje isporuke terapeutskih ili farmaceutskih sastava na željeno mesto biološkog delovanja. Ove metode uključuju intravitrealno ili subretinalno ubrizgavanje u oko.
[0094] Termini „efikasna količina“, „terapijski efikasna količina“ ili „farmaceutski efikasna količina“ koji se ovde koriste, mogu se odnositi na dovoljnu količinu najmanje jednog farmaceutskog sastava ili jedinjenja koje se primenjuje, što će u određenoj meri ublažiti jedan ili više simptoma bolesti ili stanja koje se leči.
[0096] Termin „farmaceutski prihvatljiv“ kako se ovde koristi, može se odnositi na materijal, kao što je nosač ili razblaživač, koji ne ukida biološku aktivnost ili svojstva jedinjenja koja su ovde obelodanjena i relativno je netoksičan (tj. kada se materijal primenjuje na pojedincu, ne izaziva neželjene biološke efekte niti interaguje na štetan način sa bilo kojom komponentom sastava u kojem se nalazi).
[0098] Termin „farmaceutski sastav“, ili jednostavno „sastav“ kako se ovde koristi, može se odnositi na biološki aktivno jedinjenje, opciono pomešano sa najmanje jednom farmaceutski prihvatljivom hemijskom komponentom, kao što su, mada ne ograničavajući se na nosače, stabilizatore, razređivače, disperzione agense, suspenzione agense, agense za zgušnjavanje, ekscipijense i slično.
[0100] „AAV vektor“ ili „rAAV vektor“ kako se ovde koristi odnosi se na vektor adeno-asociranog virusa (AAV) ili rekombinantni AAV (rAAV) vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja nije AAV porekla (tj. polinukleotid heterologan na AAV kao što je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira terapijski transgen, npr.
[0101] aflibercept), tipično sekvenca od interesa za genetsku transformaciju ćelije.
[0102] Generalno, heterologni polinukleotid je okružen najmanje jednom, i generalno sa dve, AAV obrnute terminalne sekvence ponavljanja (ITR). Termin rAAV vektor obuhvata i rAAV vektorske čestice i rAAV vektorske plazmide. Vektor rAAV može biti jednolančani (ssAAV) ili samokomplementarni (scAAV).
[0104] „AAV virus“ ili „AAV virusna čestica“ ili „rAAV vektorska čestica“ odnosi se na virusnu česticu sastavljenu od najmanje jednog AAV kapsidnog proteina (obično svih kapsidnih proteina divljeg tipa AAV) i polinukleotidnog rAAV vektora. Ako čestica sadrži heterologni polinukleotid (tj. polinukleotid koji nije divlji tip AAV genoma, kao što je transgen koji se isporučuje u ćeliju sisara), obično se naziva „AAV vektorska čestica“ ili jednostavno „AAV vektor“. Dakle, proizvodnja AAV vektorske čestice nužno uključuje proizvodnju AAV vektora, jer je takav vektor sadržan u AAV vektorskoj čestici.
[0106] Termin „pakovanje“ koji se ovde koristi može se odnositi na niz unutarćelijskih događaja koji mogu rezultirati sklapanjem i enkapsidacijom rAAV čestice.
[0108] AAV „rep“ i „cap“ geni se odnose na polinukleotidne sekvence koje kodiraju replikaciju i enkapsidacione proteine adeno-povezanog virusa. AAV rep i cap se ovde nazivaju AAV „geni za pakovanje“.
[0110] Termin „polipeptid“ može obuhvatiti i proteine koji se javljaju u prirodi i proteine koji se ne javljaju u prirodi (npr. fuzioni protein), peptide, fragmente, mutante, derivate i njihove analoge. Polipeptid može biti monomerni, dimerni, trimerni ili polimerni. Dalje, polipeptid može da se sastoji od više različitih domena od kojih svaki ima jednu ili više različitih aktivnosti. Da bi se izbegla sumnja, „polipeptid“ može biti bilo koje dužine veće od dve aminokiseline.
[0112] Kao što se ovde koristi, „polipeptidna varijanta“ ili jednostavno „varijanta“ odnosi se na polipeptid čija sekvenca sadrži modifikaciju aminokiselina. U nekim slučajevima, modifikacija može biti umetanje, dupliranje, brisanje, preuređivanje ili zamena jedne ili više aminokiselina u poređenju sa sekvencom aminokiselina referentnog proteina ili polipeptida, kao što je nativni ili divlji tip proteina. Varijanta može imati jednu ili više aminokiselinskih zamena tačaka, u
[0115] 1
[0116] kojima je jedna aminokiselina na poziciji promenjena u drugu aminokiselinu, jedno ili više umetanja i/ili brisanja, u kojima se jedna ili više aminokiselina ubacuje ili briše, respektivno, u sekvenci referentnog proteina, i/ili skraćivanja sekvence aminokiselina na jednom ili oba amino ili karboksi termina. Varijanta može imati istu ili različitu biološku aktivnost u poređenju sa referentnim proteinom ili nemodifikovanim proteinom.
[0118] U nekim slučajevima, varijanta može imati, na primer, najmanje oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homologiju ukupne sekvence u odnosu na svoj ekvivalentni referentni protein. U nekim slučajevima, varijanta može imati najmanje oko 90% ukupne homologije sekvence proteina divljeg tipa. U nekim slučajevima, varijanta pokazuje najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, najmanje oko 99,5% ili najmanje oko 99,9% ukupnog identiteta sekvence.
[0120] Kao što se ovde koristi, „rekombinantni“ se može odnositi na biomolekula, npr. gen ili protein, koji (1) je uklonjen iz svog prirodnog okruženja, (2) nije povezan sa svim ili delom polinukleotida u kojem se gen nalazi u prirodi, (3) operativno je povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (4) se ne javlja u prirodi. Termin „rekombinantni“ se može koristiti u odnosu na klonirane izolate DNK, hemijski sintetizovane polinukleotidne analoge ili polinukleotidne analoge koji su biološki sintetizovani heterolognim sistemima, kao i proteine i/ili mRNK kodirane takvim nukleinskim kiselinama. Tako, na primer, protein koji sintetiše mikroorganizam je rekombinantan, na primer, ako se sintetiše iz iRNK sintetizovane iz rekombinantnog gena prisutnog u ćeliji.
[0122] „Operativno povezani“ ili „operativno povezani“ ili „spojeni“ mogu se odnositi na jukstapoziciju genetskih elemenata, pri čemu su elementi u odnosu koji im omogućava da rade na očekivani način. Na primer, promoter može biti operativno povezan sa regionom kodiranja ako promoter pomogne u pokretanju transkripcije sekvence kodiranja. Može doći do interventnih rezidua između promotera i regiona kodiranja sve dok se održava ovaj funkcionalni odnos.
[0124] Termin „ekspresijski vektor“ ili „ekspresijski konstrukt“ ili „kaseta“ ili „plazmid“ ili jednostavno „vektor“ može uključivati bilo koju vrstu genetskog
[0127] 1
[0128] konstrukta, uključujući AAV ili rAAV vektore, koji sadrže nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji kodiraju genski proizvod u kojem se deo ili cela sekvenca koja kodira nukleinsku kiselinu može transkribovati i prilagođena je genskoj terapiji. Transkript se može prevesti u protein. U nekim slučajevima može biti delimično preveden ili ne preveden. U određenim otelotvorenjima, ekspresija uključuje i transkripciju gena i translaciju mRNK u genski proizvod. U drugim otelotvorenjima, ekspresija uključuje samo transkripciju nukleinske kiseline koja kodira gen od interesa. Vektor ekspresije takođe može da sadrži kontrolne elemente operativno povezane sa regionom kodiranja kako bi se olakšala ekspresija proteina u ciljnim ćelijama. Kombinacija kontrolnih elemenata i gena ili gena sa kojima su operativno povezani za ekspresiju ponekad se može nazvati „ekspresijskom kasetom“, čiji je veliki broj poznat i dostupan u umetnosti ili se može lako konstruisati od komponenti koje su dostupne u umetnosti.
[0130] Termin „heterologan“ može se odnositi na entitet koji se genotipski razlikuje od onog ostatka entiteta sa kojim se upoređuje. Na primer, polinukleotid uveden tehnikama genetskog inženjeringa u plazmid ili vektor izveden iz različite vrste može biti heterologni polinukleotid. Promotor uklonjen iz svoje izvorne sekvence kodiranja i operativno povezan sa sekvencom kodiranja sa kojom nije prirodno povezan može biti heterologni promoter.
[0132] Kao što se ovde koristi, „7m8“ se odnosi na 7-mer aminokiselinsku sekvencu LGETTRP.
[0134] „7m8 varijanta“ se odnosi na rAAV, koji može biti bilo kog serotipa, sa aminokiselinskom sekvencom LGETTRP umetnutom u petlju GH izloženu rastvaraču kapsidnog proteina.
[0136] Kada se 7m8 ubaci u rAAV2 (takođe se naziva AAV2.7m8), sekvenca aminokiselina 7-mera LGETTRP se ubacuje u petlju GH AAV2 kapsidnog proteina, npr. između pozicija 587 i 588 AAV2 kapsidnog proteina, VP1. Kada se 7m8 ubaci u rAAV1 (takođe se naziva AAV1.7m8), 7-merna aminokiselinska sekvenca LGETTRP se ubacuje u GH petlju AAV1 kapsidnog proteina, npr. između aminokiselina 590 i 591 AAV1 kapsidnog proteina. Kada se 7m8 ubaci u rAAV5 (takođe se naziva AAV5.7m8), sekvenca aminokiselina 7-mera LGETTRP
[0139] 1
[0140] se ubacuje u petlju GH kapsidnog proteina AAV5, npr. između aminokiselina 575 i 576 kapsidnog proteina AAV5. Kada se 7m8 ubaci u rAAV6 (takođe se naziva AAV6.7m8), sekvenca aminokiselina 7-mera LGETTRP se ubacuje u petlju GH kapsidnog proteina AAV6, npr. između aminokiselina 590 i 591 kapsidnog proteina AAV6. Kada se 7m8 ubaci u rAAV7 (takođe se naziva AAV7.7m8), 7-merna aminokiselinska sekvenca LGETTRP se ubacuje u GH petlju AAV7 kapsidnog proteina, npr. između aminokiselina 589 i 590 AAV7 kapsidnog proteina. Kada se 7m8 ubaci u rAAV8 (takođe se naziva AAV8.7m8), sekvenca aminokiselina 7-mera LGETTRP se ubacuje u petlju GH kapsidnog proteina AAV8, npr. između aminokiselina 590 i 591 kapsidnog proteina AAV8. Kada se 7m8 ubaci u rAAV9 (takođe se naziva AAV9.7m8), sekvenca aminokiselina 7-mera LGETTRP se ubacuje u petlju GH kapsidnog proteina AAV9, npr. između aminokiselina 588 i 589 kapsidnog proteina AAV9. Kada se 7m8 ubaci u rAAV10 (takođe se naziva AAV10.7m8), sekvenca aminokiselina 7-mera LGETTRP se ubacuje u petlju GH kapsidnog proteina AAV10, npr. između aminokiselina 589 i 590 kapsidnog proteina AAV10.
[0142] Naslovi odeljaka korišćeni ovde služe isključivo za organizacione svrhe i ne smeju se tumačiti kao ograničavanje opisane materije.
[0144] Vektori
[0146] U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi i metode obelodanjivanja predviđaju isporuku sekvence nukleinske kiseline (npr. cDNK sekvence) koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu, ćelijama mrežnjače kod ljudskog subjekta ili pacijenta kome je to potrebno (npr. pacijentu sa dijagnozom AMD, RVO, DME). Isporuka nukleinske kiseline terapijskog transgena pacijentu pomoću sistema za isporuku, kao što je rAAV ili virusni vektor, takođe se naziva genska terapija.
[0148] U nekim slučajevima, isporuka sekvence aflibercepta nukleinske kiseline može se izvršiti korišćenjem bilo kog odgovarajućeg „vektora“ (koji se takođe naziva „isporuka gena“ ili „vehikula prenosa gena“). Vektor (npr. rAAV), vehikula isporuke, vehikula isporuke gena ili vehikula prenosa gena, može obuhvatiti bilo koji odgovarajući makromolekul ili kompleks molekula koji se sastoji
[0151] 1
[0152] od polinukleotida koji se isporučuje u ciljnu ćeliju, npr. ćelije mrežnjače, uključujući fotoreceptor, ćeliju retinalne ganglije, Milerovu ćeliju, bipolarnu ćeliju, amakrinu ćeliju, horizontalnu ćeliju ili ćeliju pigmentiranog epitela mrežnjače. U nekim slučajevima, ciljna ćelija može biti bilo koja ćelija kojoj se isporučuje molekul ili gen nukleinske kiseline. Polinukleotid koji treba isporučiti može da sadrži sekvencu kodiranja terapijskog transgena, kao što je aflibercept transgen.
[0154] Sastav i metode obelodanjivanja predviđaju bilo koju odgovarajuću metodu za isporuku sekvence nukleinske kiseline aflibercepta u ćelije oka ili mrežnjače ne-ljudskog primata ili ljudskog subjekta. U nekim slučajevima, isporuka molekula nukleinske kiseline, polinukleotida ili genske terapije je formulisana ili prilagođena za intravitrealnu injekciju u oko ne-ljudskog primata ili ljudskog subjekta.
[0156] U nekim slučajevima, pogodni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore kao što su adenovirusi, adeno-asocirani virusi (AAV) i retrovirusi, retrovirusi, lentivirusi, liposomi, kompleksi koji sadrže lipide, nanočestice i drugi makromolekularni kompleksi koji mogu da isporuče polinukleotid ćelijama mrežnjače. U nekim slučajevima, virusni vektor se sastoji od jakog eukariotskog promotera operativno povezanog sa polinukleotidom, npr. promotora citomegalovirusa (CMV) ili konstitutivnog promotora.
[0158] U nekim slučajevima, vektor se sastoji od rekombinantnog virusnog vektora koji uključuje jedan ili više molekula nukleinske kiseline. Kao što je ovde opisano, nukleinske kiseline se odnose na polinukleotide. Nukleinska kiselina i polinukleotid se mogu koristiti naizmenično. U nekim slučajevima, nukleinske kiseline obuhvataju DNK ili RNK. U nekim slučajevima, nukleinske kiseline uključuju DNK (npr. cDNK) ili RNK za ekspresiju aflibercepta. U nekim slučajevima, RNK može uključivati transkript gena od interesa (npr. aflibercept), introne, neprevedene regione (UTR), završne sekvence i slično. U drugim slučajevima, DNK može uključivati, ali nije ograničena na, sekvence kao što su sekvence promotera, gen od interesa (npr. aflibercept), UTR, sekvence prekida i slično. U nekim slučajevima može se koristiti kombinacija DNK i RNK.
[0161] 1
[0162] U nekim slučajevima, ovo obelodanjivanje opisuje rekombinantni virus, kao što je rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) kao vektor za isporuku i ekspresiju aflibercepta kod ispitanika.
[0164] U nekim slučajevima, svi pogodni virusni vektori mogu biti projektovani ili optimizovani za upotrebu sa sastavom i metodama obelodanjivanja. Na primer, rekombinantni virusni vektori izvedeni iz adenovirusa (Ad) ili adeno-asociranog virusa (AAV) mogu biti izmenjeni tako da su defektni u replikaciji kod ljudi ili primata. U nekim slučajevima, hibridni virusni vektorski sistemi mogu se dobiti metodama poznatim stručnjaku u struci i koristiti za isporuku nukleinske kiseline koja kodira aflibercept u ćelije mrežnjače. U nekim slučajevima, sistem za isporuku virusa ili genska terapija mogu integrisati sekvencu nukleinske kiseline koja se sastoji od gena aflibercepta u genom ciljne ćelije (npr. genom ćelija mrežnjače) i rezultirati stabilnom ekspresijom gena tokom vremena. U nekim slučajevima, gen aflibercepta nije integrisan u genom ciljne ćelije i izražava se iz plazmida ili vektora uvedenog u ciljne ćelije.
[0166] U nekim slučajevima, pogodan virusni vektor za isporuku sekvence nukleinske kiseline aflibercepta u ćelije mrežnjače je AAV ili rAAV, koji su mali jednolančani DNK virusi bez omotača. rAAV su nepatogeni ljudski parvovirusi i mogu se učiniti zavisnim od virusa pomagača, uključujući adenovirus, virus herpes simpleksa, virus vakcinije i CMV, za replikaciju. Izloženost divljem tipu (wt) AAV nije povezana niti je poznato da izaziva bilo kakve ljudske patologije i uobičajena je u opštoj populaciji, što AAV ili rAAV čini pogodnim sistemom isporuke za genetsku terapiju. AAV i rAAV koji se koriste za genetsku terapiju za isporuku terapijskog transgena, npr. aflibercept, mogu biti bilo kog serotipa. U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi i metode obelodanjivanja odnose se na upotrebu bilo kog odgovarajućeg AAV serotipa, uključujući AAV1, AAV2, AAV2.5, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10, AAV-DJ i bilo koji hibridni ili himerni AAV. U nekim slučajevima, korišćeni serotip se zasniva na tropizmu virusa ili infektivnosti ciljne ćelije od interesa. U nekim slučajevima, AAV2 ili rAAV2 se koristi za isporuku sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept u očne ili retinalne ćelije subjekta putem intravitrealne ili
[0169] 2
[0170] subretinalne injekcije. U nekim slučajevima, rAAV2.7m8 se koristi za isporuku sekvence nukleinske kiseline aflibercepta u ćelije mrežnjače ispitanika.
[0172] U nekim slučajevima, AAV ili rAAV virusi, čestice ili virioni koji se sastoje od varijante kapsidnog proteina koji ima povećanu infektivnost ciljnih ćelija, npr. ćelija mrežnjače, koriste se za povećanje transdukcije ćelija mrežnjače ili za povećanje ciljanja isporuke gena na ćelije mrežnjače kod subjekta. U nekim slučajevima, rAAV virion se sastoji od modifikacije aminokiselina u kapsidnom proteinu GH petlje/petlje IV AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, mesto modifikacije je deo GH petlje/petlje IV AAV kapsidnog proteina dostupan rastvaračima. Za opis GH petlje/petlje IV AAV kapside, vidi, npr. Van Vliet i sar. (2006) Mol. Ther.14:809; Padron et al. (2005) J. Virol.79:5047; i Shen i sar.
[0173] (2007) Mol. Ther.15:1955. Poznato je nekoliko AAV kapsidnih varijanti, uključujući varijantu 7m8. U nekim slučajevima, rAAV virion se sastoji od varijante AAV kapsidnog proteina koji se sastoji od umetanja 5 aminokiselina u 11 aminokiselina, npr. 7 aminokiselinskih sekvenci, u GH petlju kapsidnog proteina u odnosu na odgovarajući roditeljski AAV kapsidni protein, i pri čemu varijanta kapsidnog proteina donosi povećanu infektivnost ćelije mrežnjače u poređenju sa infektivnošću ćelije mrežnjače od strane AAV viriona koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, bilo koja od sledećih sekvenci aminokiselina može biti umetnuta u petlju GH kapsidnog proteina: LGETTRP (7m8), NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF i STGKVPN. U nekim slučajevima, bilo koja od aminokiselinskih sekvenci LGETTRP (7m8), NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF i STGKVPN se ubacuje u petlju GH izloženu rastvaraču VP1 kapsidnog proteina u rAAV. U nekim slučajevima, rAAV.7m8 koji se sastoji od aflibercepta se koristi za genetsku terapiju.
[0175] U nekim slučajevima, bilo koja od sledećih sekvenci aminokiselina: NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF i STGKVPN mogu se umetnuti na sledeće položaje da bi se generisala varijanta rAAV za upotrebu u genskoj terapiji: između položaja 587 i 588 AAV2 kapsidnog proteina; između aminokiselina 590 i 591 AAV1 kapsidnog proteina; između aminokiselina 575 i 576 AAV5 kapsidnog proteina; između aminokiselina 590 i 591 AAV6 kapsidnog proteina; između aminokiselina 589 i 590 AAV7 kapsidnog proteina; između aminokiselina 590 i 591 AAV8 kapsidnog proteina; između aminokiselina 588 i 589 AAV9 kapsidnog proteina; ili između aminokiselina 589 i 590 AAV10 kapsidnog proteina.
[0177] U nekim slučajevima, nukleinska kiselina koja kodira genski proizvod kao što je aflibercept može biti pod transkripcionom kontrolom promotera koji inicira transkripciju gena. U nekim slučajevima, promoter je „jak“ ili konstitutivno aktivan promoter, npr. CMV promoter. U nekim slučajevima, promotor koneksina 36 se koristi za pokretanje ekspresije terapijskog transgena, npr. aflibercepta. U nekim slučajevima, promoteri specifični za tkivo mogu se koristiti za transkripciju u određenim tkivima ili ćelijama, kao što su ćelije mrežnjače, kako bi se smanjila potencijalna toksičnost ili neželjeni efekti na neciljane ćelije. U nekim slučajevima, rekombinantni virus i/ili plazmid koji se koristi za generisanje rAAV virusa može da sadrži druge transkripcione ili regulatorne elemente, kao što su poli A (poliadenilaciona) sekvenca, neprevedeni regioni (UTR), 3' UTRs ili završne sekvence. U nekim slučajevima, više od jednog gena može biti izraženo iz vektora ili plazmida koristeći unutrašnje mesto ulaska ribosoma (IRES) ili slične elemente koji omogućavaju koekspresiju dva ili više proteina ili stvaraju multigen ili policistronsku mRNK.
[0179] U nekim slučajevima, rAAV i/ili plazmid koji se koristi za generisanje rAAV virusa obuhvata sledeće elemente nukleinske kiseline: prvu ITR sekvencu; sekvencu promotera: intronsku sekvencu; prvu UTR sekvencu; sekvencu koja kodira aflibercept; drugu UTR sekvencu; poliA sekvencu; i drugu ITR sekvencu. U nekim slučajevima, sekvenca linkera se koristi između svakog od ovih elemenata nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, sekvenca koja kodira aflibercept obuhvata sekvencu koja kodira fuzioni protein aflibercepta ili njegov funkcionalni fragment.
[0181] U nekim slučajevima, virusni vektor otkrivanja se meri kao vektorski genomi. U nekim slučajevima, jedinična doza rekombinantnih virusa ovog obelodanjivanja obuhvata između 1×10<10>do 2×10<10>, između 2×10<10>do 3×10<10>, između 3×10<10>do 4×10<10>, između 4×10<10>do 5×10<10>, između 5×10<10>do 6×10<10>, između 6×<10>do 7×10<10>, između 7×<10>do 8×10<10>, između 8×10<10>do 9×10<10>, između 9×10<10>do 10×<10>, između 1×10<11>do 2×10<11>, između 2×10<11>do 3×10<11>, između 3×10<11>do 4×10<11>, između 4×10<11>do 5×10<11>, između 5×10<11>do 6×10<11>, između 6×10<11>do 7×10<11>, između 7×10<11>do 8×10<11>, između 8×10<11>do 9×10<11>, između 9×10<11>do 10×10<11>, između 1×10<12>do 2×10<12>, između 2×10<12>do 3×10<12>, između 3×10<12>do 4×10<12>, između 4×10<12>do 5×10<12>, između 5×10<12>do 6×10<12>, između 6×10<12>do 7×10<12>, između 7×10<12>do 8×10<12>, između 8×10<12>do 9×10<12>, između 9×10<12>do 10×10<12>, između 1×10<13>do 2×10<13>, između 2×10<13>do 3×10<13>, između 3×10<13>do 4×10<13>, između 4×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 6×10<13>, između 6×10<13>do 7×10<13>, između 7×10<13>do 8×10<13>, između 8×10<13>do 9×10<13>, ili između 9×10<13>do 10×10<13>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, rAAV ovog otkrića je oko 2,1×10<12>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, rAAV obelodanjivanja obuhvata vektorske genome od 2E12 do 6E12. U nekim slučajevima, rAAV ovog obelodanjivanja je između 10<10>do 10<13>, između 10<10>do 10<11>, između 10<11>do 10<12>, između 10<12>do 10<13>, između 10<13>do 10<14>, između 2×10<11>do 4×10<11>, između 3×10<11>do 5×10<11>, između 4×10<11>do 6×10<11>, između 5×10<11>do 7×10<11>, između 6×10<11>do 8×10<11>, između 7×10<11>do 9×10<11>, između 8×10<11>do 10×10<11>, između 1×10<12>do 3×10<12>, između 2×10<12>do 4×10<12>, između 3×10<12>do 5×10<12>, između 4×10<12>do 6×10<12>, između 5×10<12>do 7×10<12>, između 6×10<12>do 8×10<12>, između 7×10<12>do 9×10<12>, između 8×10<12>do 10×10<12>, između 1×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 10×10<13>, između 10<12>do 5×10<12>, ili između 5×10<12>do 1×10<13>vektorskih genoma.
[0183] U nekim slučajevima, za jediničnu dozu se bira niža količina ili opseg vektorskih genoma kako bi se izbegla agregacija. U nekim slučajevima, za jediničnu dozu se bira veća količina ili opseg vektorskih genoma, tako da se za ubrizgavanje može koristiti manja zapremina. Manja zapremina (npr. manja od 50, 40, 30, 20, 10 ili 5 µl) injekcije može pomoći u smanjenju promena očnog pritiska i drugih neželjenih efekata povezanih sa intravitrealnom injekcijom. U nekim slučajevima, veća koncentracija rAAV takođe pomaže da se obezbedi efikasna isporuka terapijskog transgena u ciljne ćelije.
[0185] U nekim slučajevima, rekombinantni virusi ovog otkrića su oko 1E10, oko 1,5E10, oko 2E10, oko 2,5E10, oko 3E10, oko 3,5E10, oko 4E10, oko 4,5E10, oko 5E10, oko 5,5E10, oko 6E10, oko 6,5E10, oko 7E10, oko 7,5E10, oko 8E10,
[0188] 2
[0189] oko 8,5E10, oko 9E10, oko 9,5E10, oko 10E10, oko 1E11, oko 1,5E11, oko 2E11, oko 2,5E11, oko 3E11, oko 3,5E11, oko 4E11, oko 4,5E11, oko 5E11, oko 5,5E11, oko 6E11, oko 6,5E11, oko 7E11, oko 7,5E11, oko 8E11, oko 8,5E11, oko 9E11, oko 9,5E11, oko 10E11, oko 1E12, oko 1,3E12, oko 1,5E12, oko 2E12, oko 2,1E12, oko 2,3E12, oko 2,5E12, oko 2,7E12, oko 2,9E12, oko 3E12, oko 3,1E12, oko 3,3E12, oko 3,5E12, oko 3,7E12, oko 3,9E12, oko 4E12, oko 4,1E12, oko 4,3E12, oko 4,5E12, oko 4,7E12, oko 4,9E12, oko 5E12, oko 5,1E12, oko 5,3E12, oko 5,5E12, oko 5,7E12, oko 5,9E12, oko 6E12, oko 6,1E12, oko 6,3E12, oko 6,5E12, oko 6,7E12, oko 6,9E12, oko 7E12, oko 7,1E12, oko 7,3E12, oko 7,5E12, oko 7,7E12, oko 7,9E12, oko 8E12, oko 8,1E12, oko 8,3E12, oko 8,5E12, oko 8,7E12, oko 8,9E12, oko 9E12, oko 9,1E12, oko 9,3E12, oko 9,5E12, oko 9,7E12, oko 9,9E12, oko 10E12, oko 10,1E12, oko 10,3E12, oko 10,5E12, oko 10,7E12, oko 10,9E12, oko 11E12, oko 11,5E12, oko 12E12, oko 12,5E12, oko 13E12, oko 13,5E12, oko 14E12, oko 14,5E12, oko 15E12, oko 15,5E12, oko 16E12, oko 16,5E12, oko 17E12, oko 17,5E12, oko 18E12, oko 18,5E12, oko 19E12, oko 19,5E12, oko 20E12, oko 20,5E12, oko 30E12, oko 30,5E12, oko 40E12, oko 40,5E12, oko 50E12, oko 50,5E12, oko 60E12, oko 60,5E12, oko 70E12, oko 70,5E12, oko 80E12, oko 80,5E12, oko 90E12, oko 95E12, ili oko 100E12, pri čemu E predstavlja skraćenicu za bazu 10 za eksponenciranje, a xEy označava x pomnoženo sa bazom 10 na y stepen/eksponent.
[0191] U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije ovde otkrivene sadrže rekombinantne viruse u količinama od najmanje 5E11, najmanje 5,5E11, najmanje 6E11, najmanje 6,5E11, najmanje 7E11, najmanje 7,5E11, najmanje 8E11, najmanje 8,5E11, najmanje 9E11, najmanje 9,5E11, najmanje 10E11, najmanje 1E12, najmanje 1,3E12, najmanje 1,5E12, najmanje 2E12, najmanje 2,1E12, najmanje 2,3E12, najmanje 2,5E12, najmanje 2,7E12, najmanje 2,9E12, najmanje 3E12, najmanje 3,1E12, najmanje 3,3E12, najmanje 3,5E12, najmanje 3,7E12, najmanje 3,9E12, najmanje 4E12, najmanje 4,1E12, najmanje 4,3E12, najmanje 4,5E12, najmanje 4,7E12, najmanje 4,9E12, najmanje 5E12, najmanje 5,1E12, najmanje 5,3E12, najmanje 5,5E12, najmanje 5,7E12, najmanje 5,9E12, najmanje 6E12, najmanje 6,1E12, najmanje 6,3E12, najmanje 6,5E12, najmanje 6,7E12, najmanje 6,9E12, najmanje 7E12, najmanje 7,1E12, najmanje 7,3E12, najmanje 7,5E12, najmanje 7,7E12, najmanje 7,9E12, najmanje 8E12, najmanje 8,1E12, najmanje 8,3E12, najmanje 8,5E12, najmanje 8,7E12, najmanje 8,9E12, najmanje 9E12, najmanje 9,1E12, najmanje 9,3E12, najmanje 9,5E12, najmanje 9,7E12, najmanje 9,9E12, najmanje 10E12, najmanje 10,1E12, najmanje 10,3E12, najmanje 10,5E12, najmanje 10,7E12, najmanje 10,9E12, najmanje 11E12, najmanje 11,5E12, najmanje 12E12, najmanje 12,5E12, najmanje 13E12, najmanje 13,5E12, najmanje 14E12, najmanje 14,5E12, najmanje 15E12, najmanje 15,5E12, najmanje 16E12, najmanje 16,5E12, najmanje 17E12, najmanje 17,5E12, najmanje 18E12, najmanje 18,5E12, najmanje 19E12, najmanje 19,5E12, najmanje 20E12, najmanje 20,5E12, najmanje 30E12, najmanje 30,5E12, najmanje 40E12, najmanje 40,5E12, najmanje 50E12, najmanje 50,5E12, najmanje 60E12, najmanje 60,5E12, najmanje 70E12, najmanje 70,5E12, najmanje 80E12, najmanje 80,5E12, najmanje 90E12, najmanje 95E12, ili najmanje 100E12 vektorskih genoma, pri čemu E predstavlja skraćenicu za bazu 10 kod eksponencijacije, i pri čemu xEy označava x pomnoženo sa bazom 10 na stepen y.
[0193] U nekim slučajevima, jedinična doza obuhvata između 2E12 i 6E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od oko 1E12, 1,5E12, 2E12, 2,5E12, 3E12, 3,5E12, 4E12, 4,5E12, 5E12, 5,5E12, 6E12, 6,5E12, 7E12, 7,5E12, 8E12, 8,5E12, 9E12 ili 9,5E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od između 1E12 i 1,5E12, između 1,5E12 i 2E12, između 2E12 i 2,5E12, između 2,5E12 i 3,0E12, između 3,0E12 i 3,5E12, između 3,5E12 i 4,0E12, između 4,0E12 i 4,5E12, između 4,5E12 i 5,0E12, između 5,0E12 i 5,5E12, između 5,5E12 i 6,0E12, između 6,0E12 i 6,5E12, između 6,5E12 i 7,0E12, između 7,0E12 i 7,5E12, između 7,5E12 i 8,0E12, između 8,0E12 i 8,5E12, između 8,5E12 i 9,0E12, između 9,0E12 i 9,5E12, ili između 9,5E12 i 10E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od najmanje 1E12, 1,5E12, 2E12, 2,5E12, 3E12, 3,5E12, 4E12, 4,5E12, 5E12, 5,5E12, 6E12, 6,5E12, 7E12, 7,5E12, 8E12, 8,5E12, 9E12 ili 9,5E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza ne sadrži više od 1E12, 1,5E12, 2E12, 2,5E12, 3E12, 3,5E12, 4E12, 4,5E12, 5E12, 5,5E12, 6E12, 6,5E12, 7E12, 7,5E12, 8E12, 8,5E12, 9E12 ili 9,5E12 vektorskih genoma.
[0196] 2
[0197] U nekim slučajevima, virusni vektor otkrivanja se meri korišćenjem mnoštva infekcija (MOI). U nekim slučajevima, MOI se odnosi na odnos, ili više vektorskih ili virusnih genoma prema ćelijama kojima se nukleinska kiselina može isporučiti. U nekim slučajevima, MUP je 1×10<6>. U nekim slučajevima, rekombinantni virusi obelodanjivanja mogu biti najmanje 1×101,<1>×10<2>, 1×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>i 1×10<18>MOI. U nekim slučajevima, rekombinantni virusi obelodanjivanja mogu biti od 1×10<8>do 1×10<15>MOI. U nekim slučajevima, rekombinantni virusi obelodanjivanja mogu biti najviše 1×101,<1>×10<2>, 1×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>i 1×10<18>MOI.
[0199] U nekim slučajevima, nukleinska kiselina se može isporučiti bez upotrebe virusa (tj. sa nevirusnim vektorom) i može se meriti kao količina nukleinske kiseline. Generalno, bilo koja odgovarajuća količina nukleinske kiseline može se koristiti sa farmaceutskim sastavima i metodama ovog obelodanjivanja. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina je najmanje 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 µg, 10 µg, 100 µg, 200 µg, 300 µg, 400 µg, 500 µg, 600 µg, 700 µg, 800 µg, 900 µg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 1 g, 2 g, 3 g, 4 g ili 5 g. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina može biti najviše oko 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 µg, 10 µg, 100 µg, 200 µg, 300 µg, 400 µg, 500 µg, 600 µg, 700 µg, 800 µg, 900 µg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4g ili 5 g.
[0201] U nekim slučajevima može se koristiti samokomplementarni vektor (sc). Upotreba samokomplementarnih AAV vektora može zaobići zahtev za virusnu sintezu DNK drugog lanca i može dovesti do veće stope ekspresije transgenskog proteina, kako je predviđeno od strane Wu, Hum Gene Ther.2007, 18(2):171-82.
[0204] 2
[0205] U nekim aspektima, može se generisati nekoliko AAV vektora kako bi se omogućio izbor najoptimalnijeg serotipa i promotera za upotrebu sa aflibercept transgenom.
[0207] U nekim slučajevima, vektor može biti ciljani vektor, posebno ciljani rAAV (npr. AAV2.7m8) koji pokazuje veću infektivnost određene ćelije, kao što su ćelije mrežnjače, ili fotoreceptor, ćelija ganglija mrežnjače, Milerova ćelija, bipolarna ćelija, amakrina ćelija, horizontalna ćelija ili ćelija pigmentiranog epitela mrežnjače. Virusni vektori koji se koriste u obelodanjivanju mogu uključivati one koji pokazuju nisku toksičnost i/ili nisku imunogenost kod ispitanika i izražavaju terapijski efikasne količine proteina aflibercepta kod ispitanika, npr. ljudskog pacijenta.
[0209] Ovde su obelodanjeni farmaceutski sastavi i metode za isporuku nukleinske kiseline koja kodira aflibercept u ciljnu ćeliju mrežnjače subjekta koristeći rAAV koji se sastoji od 7m8 varijante kapsidnog proteina, ili rAAV2.7m8, i sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept u primatu koji nije čovek ili ljudskom subjektu. U nekim slučajevima, isporuka aflibercepta putem genske terapije može se koristiti za barem delimično ublažavanje ili sprečavanje očne bolesti ili stanja koje je ovde obelodanjeno.
[0211] U nekim slučajevima, povećanje infektivnosti retinalnih ćelija varijante rAAV (npr. varijanta 7m8) je najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 100% u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, povećanje infektivnosti ćelija mrežnjače je povećanje između 5% i 100%, između 5% i 95%, između 5% i 90%, između 5% i 85%, između 5% i 80%, između 5% i 75%, između 5% i 70%, između 5% i 65%, između 5% i 60%, između 5% i 55%, između 5% i 50%, između 5% i 45%, između 5% i 40%, između 5% i 35%, između 5% i 30%, između 5% i 25%, između 5% i 20%, između 5% i 15%, između 5% i 10% u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV kapsidnog proteina.
[0213] U nekim slučajevima, povećanje infektivnosti retinalnih ćelija rAAV varijante je najmanje 1 puta, najmanje 1,1 puta, najmanje 1,2 puta, najmanje 1,3
[0216] 2
[0217] puta, najmanje 1,4 puta, najmanje 1,5 puta, najmanje 1,6 puta, najmanje 1,7 puta, najmanje 1,8 puta, najmanje 1,9 puta ili najmanje 2 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, povećanje infektivnosti je najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta ili najmanje 10 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, povećanje infektivnosti je najmanje 15 puta, najmanje 20 puta, najmanje 25 puta, najmanje 30 puta, najmanje 35 puta, najmanje 40 puta, najmanje 45 puta, najmanje 50 puta, najmanje 55 puta, najmanje 60 puta, najmanje 65 puta, najmanje 70 puta, najmanje 75 puta, najmanje 80 puta, najmanje 85 puta, najmanje 90 puta ili najmanje 100 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV kapsidnog proteina.
[0219] U nekim slučajevima, povećanje infektivnosti ćelija mrežnjače je između 10 puta i 100 puta, između 10 puta i 95 puta, između 10 puta i 90 puta, između 10 puta i 85 puta, između 10 puta i 80 puta, između 10 puta i 75 puta, između 10 puta i 70 puta, između 10 puta i 65 puta, između 10 puta i 60 puta, između 10 puta i 55 puta, između 10 puta i 50 puta, između 10 puta i 45 puta, između 10 puta i 40 puta, između 10 puta i 35 puta, između 10 puta i 30 puta, između 10 puta i 25 puta, između 10 puta i 20 puta, ili između 10 puta i 15 puta u poređenju sa AAV virionom koji sadrži odgovarajući roditeljski ili nemodifikovani AAV kapsidni protein.
[0221] U nekim slučajevima, povećanje infektivnosti ćelija mrežnjače je između 2 puta i 20 puta, između 2 puta i 19 puta, između 2 puta i 18 puta, između 2 puta i 17 puta, između 2 puta i 16 puta, između 2 puta i 15 puta, između 2 puta i 14 puta, između 2 puta i 13 puta, između 2 puta i 12 puta, između 2 puta i 11 puta, između 2 puta i 10 puta, između 2 puta i 9 puta, između 2 puta i 8 puta, između 2 puta i 7 puta, između 2 puta i 6 puta, između 2 puta i 5 puta, između 2 puta i 4 puta, ili između 2 puta i 3 puta u poređenju sa AAV virionom koji sadrži odgovarajući roditeljski ili nemodifikovani AAV kapsidni protein.
[0224] 2
[0225] U nekim slučajevima, aminokiselinska modifikacija ovde opisanog proteina kapside može dovesti do povećanja sposobnosti prelaska unutrašnje limitirajuće membrane (ILM) u oku primata ili ljudskog subjekta u poređenju sa sposobnošću AAV viriona koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV proteina kapside da pređe ILM u oku subjekta. U nekim slučajevima, povećanje sposobnosti da se pređe ILM je povećanje od najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 100% u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, povećanje sposobnosti prelaska ILM-a je povećanje između 5% i 100%, između 5% i 95%, između 5% i 90%, između 5% i 85%, između 5% i 80%, između 5% i 75%, između 5% i 70%, između 5% i 65%, između 5% i 60%, između 5% i 55%, između 5% i 50%, između 5% i 45%, između 5% i 40%, između 5% i 35%, između 5% i 30%, između 5% i 25%, između 5% i 20%, između 5% i 15%, ili između 5% i 10% u poređenju sa roditeljskim ili nemodifikovanim AAV kapsidnim proteinom.
[0227] U nekim slučajevima, povećanje sposobnosti prelaska ILM je najmanje 1 puta, najmanje 1,1 puta, najmanje 1,2 puta, najmanje 1,3 puta, najmanje 1,4 puta, najmanje 1,5 puta, najmanje 1,6 puta, najmanje 1,7 puta, najmanje 1,8 puta, najmanje 1,9 puta ili najmanje 2 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, povećanje sposobnosti prelaska ILM je najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta ili najmanje 10 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog AAV kapsidnog proteina. U nekim slučajevima, povećanje sposobnosti prelaska ILM je najmanje 15 puta, najmanje 20 puta, najmanje 25 puta, najmanje 30 puta, najmanje 35 puta, najmanje 40 puta, najmanje 45 puta, najmanje 50 puta, najmanje 55 puta, najmanje 60 puta, najmanje 65 puta, najmanje 70 puta, najmanje 75 puta, najmanje 80 puta, najmanje 85 puta, najmanje 90 puta ili najmanje 100 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV kapsidnog proteina.
[0230] 2
[0231] U nekim slučajevima, povećanje sposobnosti prelaska ILM je između 10 puta i 100 puta, između 10 puta i 95 puta, između 10 puta i 90 puta, između 10 puta i 85 puta, između 10 puta i 80 puta, između 10 puta i 75 puta, između 10 puta i 70 puta, između 10 puta i 65 puta, između 10 puta i 60 puta, između 10 puta i 55 puta, između 10 puta i 50 puta, između 10 puta i 45 puta, između 10 puta i 35 puta, između 10 puta i 30 puta, između 10 puta i 25 puta, između 10 puta i 20 puta, ili između 10 puta i 15 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV Capsid proteina.
[0233] U nekim slučajevima, povećanje sposobnosti prelaska ILM je između 2 puta do 20 puta, između 2 puta do 19 puta, između 2 puta do 18 puta, između 2 puta do 17 puta, između 2 puta do 16 puta, između 2 puta do 15 puta, između 2 puta do 14 puta, između 2 puta do 13 puta, između 2 puta do 12 puta, između 2 puta do 11 puta, između 2 puta do 10 puta, između 2 puta do 9 puta, između 2 puta do 8 puta, između 2 puta do 7 puta, između 2 puta do 6 puta, između 2 puta do 5 puta, između 2 puta do 4 puta, ili između 2 puta do 3 puta u poređenju sa AAV virionom koji se sastoji od odgovarajućeg roditeljskog ili nemodifikovanog AAV Capsid proteina.
[0235] Aflibercept
[0237] U nekim slučajevima, genska terapija se koristi za isporuku terapeutskog transgena koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira ili eksprimira aflibercept kada se primenjuje na oko ili staklasto oko ne-ljudskog primata ili ljudskog subjekta. U nekim slučajevima, rAAV koji se sastoji od kapsidne varijante (npr. AAV2.7m8) opisane ovde, sastoji se od heterologne sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept i koristi se za isporuku sekvence gena aflibercepta u ćelije mrežnjače nakon intravitrealne ili subretinalne injekcije subjektu. U nekim slučajevima, rAAV koji se sastoji od gena aflibercepta formulisan je za gensku terapiju i intravitrealnu injekciju. U nekim slučajevima, gen aflibercepta se odnosi na funkcionalni fragment ili njegovu varijantu. U nekim slučajevima, sekvenca nukleinskih kiselina aflibercepta izvedena je iz njegove sekvence aminokiselina. U nekim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline aflibercepta je kodon optimizovan za poboljšanje njegove ekspresije kod subjekta.
[0238] Optimizacija kodona može se postići bilo kojom metodom poznatom u predmetnoj oblasti. Optimizacija kodona se odnosi na proces modifikacije sekvence nukleinske kiseline za poboljšanu ekspresiju gena u ciljnim ili ćelijama domaćina od interesa, npr. ljudskim ćelijama mrežnjače, zamenom najmanje jednog kodona (npr. oko ili više od 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100 ili više kodona) nativne sekvence kodonima koji se koriste češće ili se najčešće koriste u ćeliji domaćina uz održavanje nativne sekvence aminokiselina. Tabele korišćenja kodona su lako dostupne, uključujući, na primer, GenScript Codon Usage Frequence Table Tool na http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table; Codon Usage Database na http://www.kazusa.orjp/codon/; i Nakamura, Y., i sar. „Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000“ Nucl. Acids Res.28:292 (2000).
[0240] Aflibercept je fuzioni protein od 115 kDa, koji se može glikozilirati.
[0241] Aflibercept se sastoji od okosnice IgG spojene sa ekstracelularnim sekvencama VEGF receptora humanog VEGFR-1 i VEGFR-2 i funkcioniše kao rastvorljiv receptor za mamac vezivanjem VEGF-A sa većim afinitetom od njegovih prirodnih ili endogenih receptora. Vidi, na primer, Stewart mW. Aflibercept (VEGF Trapeye): the newest anti-VEGF drug. Br. J. Ophthalmol. Sept.2012.;96(9):1157-8. Afliberceptov visok afinitet za VEGF ometa ili remeti naknadno vezivanje i aktivaciju nativnih ili endogenih VEGF receptora. Smanjena aktivnost VEGF može dovesti do smanjene angiogeneze i vaskularne propusnosti. Inhibicija placentarnog faktora rasta PIGF i VEGF-B afliberceptom takođe može doprineti lečenju angiogenih stanja. PIGF je povezan sa angiogenezom i može biti povišen u više stanja, kao što je vlažna AMD. Prekomerna ekspresija VEGF-B može biti povezana sa raspadom krvno-retinalne barijere i angiogeneze mrežnjače. Dakle, inhibicija VEGF-A, VEGF-B i PIGF može doprineti efikasnosti aflibercepta.
[0243] Genski proizvod koji je ovde obelodanjen sastoji se od aflibercepta, funkcionalnog fragmenta ili mutanta ili njihove varijante. Aminokiselinska sekvenca aflibercepta je poznata u predmetnoj oblasti: C4318H6788N1164O1304S32, FDA jedinstveni identifikator sastojaka (UNII) je 15C2VL427D. Aminokiselinska
[0246] 1
[0247] sekvenca aflibercepta je dostupna u DrugBank, pristupni broj DB08885:
[0249]
[0252] Sekvenca nukleinskih kiselina aflibercepta (SEQ ID NO: 2) prikazana je na SL.5. U nekim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline aflibercepta je optimizovana za ekspresiju kodona kod primata ili ljudskog subjekta. Konstrukcija sintetičkog gena koji odgovara sekvenci aminokiselina aflibercepta opisana je u literaturi, npr. Kanda A, Noda K, Saito W, Ishida S. Aflibercept Traps Galectin-1, an Angiogenic Factor Associated with Diabetic Retinopathy. Scientific Reports 5:17946 (2015) (koji opisuju „VEGF-TrapR1R2 (koji odgovara afliberceptu) cDNK je generisan kao sintetički gen od strane IDT (Coralville, IA)“). S obzirom na dostupnu sekvencu aminokiselina aflibercepta, svaka metoda poznata u predmetnoj oblasti može se koristiti za generisanje cDNK aflibercepta za upotrebu u genskoj terapiji ili rAAV opisanoj u ovom dokumentu.
[0254] Homologija se odnosi na % očuvanja ostataka poravnanja između dve sekvence, uključujući, ali ne ograničavajući se na funkcionalne fragmente, sekvence koje se sastoje od umetanja, brisanja, zamena, pseudofragmenata, pseudogena, varijanti spajanja ili veštački optimizovanih sekvenci.
[0256] U nekim slučajevima, genski proizvod aflibercepta ili aflibercept transgen, kako je uključen u genetsku terapiju zasnovanu na rAAV-u, sadrži kapsidnu varijantu kako je ovde obelodanjeno (npr. varijanta 7m8), kodira protein, fuzioni protein ili polipeptid koji ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili najmanje 100% homologije gorenavedene sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 1, ili između odgovarajućih cDNK sekvenci aflibercepta (npr. cDNK sekvence aflibercepta koja se koristi u genskoj terapiji u poređenju sa SEQ ID NO: 2). U nekim slučajevima, ovde obelodanjene metode i
[0259] 2
[0260] farmaceutski sastavi čine funkcionalni fragment aflibercepta, ili njegovu varijantu ili mutant. U nekim slučajevima, sekvenca nukleinske kiseline aflibercepta je modifikovana ili optimizovana kodonom kako bi se poboljšala njegova aktivnost, ekspresija, stabilnost i/ili rastvorljivost in vivo.
[0262] U nekim slučajevima, AAV2.7m8 se koristi kao genska terapija ili sistem isporuke aflibercepta. AAV2.7m8-aflibercept se odnosi na rAAV2 koji se sastoji od umetanja 7m8 između pozicija 587 i 588 u kapsidnom proteinu VP1 rAAV2 i sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept.
[0264] Farmaceutski sastavi
[0266] U nekim slučajevima, farmaceutski sastav je formulacija koja sadrži jedan ili više aktivnih sastojaka, npr. AAV2.7m8 koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein aflibercepta, ili njegov fragment ili varijantu, kao i jednu ili više pomoćnih supstanci, nosača, stabilizatora ili sredstava za povećanje zapremine, koji su pogodni za primenu na ljudskom pacijentu intravitrealnom ili subretinalnom injekcijom kako bi se postigao željeni terapeutski ili profilaktički efekat.
[0268] U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi koji se sastoje od rAAV ili AAV2.7m8 i sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein aflibercepta, ili njegov fragment ili varijantu, isporučuju se kao rekonstituisani homogeni rastvor. U nekim slučajevima, rastvor može biti suspenzija. U nekim slučajevima, rastvor je izotoničan. U drugim slučajevima, farmaceutski sastavi koji se sastoje od rAAV ili AAV2.7m8 i sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein aflibercepta, ili njegov fragment ili varijantu, isporučuju se u liofilizovanom obliku i rekonstituišu pre primene kod pacijenta. U nekim slučajevima, metoda lečenja ili prevencije bolesti ili stanja oka kako je ovde obelodanjeno obuhvata prvo rekonstituisanje, rastvaranje ili solubizaciju liofilizovanog farmaceutskog sastava koji se sastoji od rAAV (npr. AAV2.7m8) i sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein aflibercepta, ili njegov funkcionalni fragment ili varijantu u puferu. U nekim slučajevima, takav liofilizovani farmaceutski sastav može dalje da sadrži krioprotektant, surfaktant, so, stabilizator ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim slučajevima, homogeni rastvor koji sadrži farmaceutski sastav isporučuje se kao napunjeni špric.
[0270] U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi navedeni u ovom dokumentu isporučuju se kao suspenzija. U nekim slučajevima, suspenzija je rastrvor. U nekim slučajevima, suspenzija je u frižideru. U nekim slučajevima, način lečenja ili prevencije bolesti ili stanja oka kako je ovde obelodanjeno obuhvata zagrevanje rashlađene suspenzije na sobnu temperaturu i/ili mešanje suspenzije kako bi se osigurala ravnomerna distribucija pre primene ili intravitrealne injekcije pacijentu. U nekim slučajevima, suspenzija se razblažuje pre primene na pacijentu. U nekim slučajevima, takav farmaceutski sastav sadrži surfaktant, so, stabilizator ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim slučajevima, suspenzija koja sadrži farmaceutski sastav isporučuje se kao napunjeni špric.
[0272] U nekim slučajevima, genska terapija ili farmaceutski sastavi opisani u ovom dokumentu obezbeđeni su kao suspenzija ili rashlađena suspenzija. U nekim slučajevima, suspenzija sadrži farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu, npr. surfaktant, glicerol, nejonski surfaktant, pufer, glikol, so i bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim slučajevima, hlorovodonična kiselina i natrijum hidroksid se koriste za podešavanje pH rastvora. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija je na neutralnoj pH vrednosti, ili na pH vrednosti između 6,5 i 7,5. U nekim slučajevima, pH rashlađene suspenzije je blago bazičan (npr. pH oko 7,5, 8, 8,2, 8,4, 8,5 ili 9). U nekim slučajevima, pH suspenzije ili rastvora je blago kiseo (npr. pH oko 6,5, 6,3, 6,1, 6, 6,5 ili 5). U nekim slučajevima, suspenzija je rastvor. U nekim slučajevima, suspenzija se sastoji od micela. U nekim slučajevima, suspenzija se meša i/ili zagreva na sobnu temperaturu pre primene.
[0274] U nekim slučajevima, genska terapija koja obuhvata farmaceutski sastav koji sadrži rAAV (npr. AAV2.7m8) i sekvencu nukleinske kiseline aflibercepta isporučuje se kao komplet, koji sadrži liofilizovani ili liofilizovani farmaceutski sastav (npr. jednu jediničnu dozu u bočici) opisan ovde i rastvor za rastvaranje, razblaživanje i/ili rekonstituciju liofilizovanog farmaceutskog sastava. U nekim slučajevima, rastvor za rekonstituisanje ili razređivanje može se isporučiti kao napunjeni špric. U nekim slučajevima, komplet se sastoji od liofiliziranog farmaceutskog sastava koji se sastoji od rAAV (npr. AAV2.7m8) i rastvora za
[0277] 4
[0278] rekonstituisanje farmaceutskog sastava do željene koncentracije ili zapremine. U nekim slučajevima, komplet uključuje pufer koji pomaže u sprečavanju agregacije nakon rekonstitucije farmaceutskog sastava koji je ovde obelodanjen. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav se isporučuje u napunjenom špricu. U nekim slučajevima, komplet se sastoji od šprica ili posude sa dve komore pri čemu jedna od komora sadrži pufer za rastvaranje ili razređivanje farmaceutskog sastava. U nekim slučajevima, komplet se sastoji od šprica za ubrizgavanje. U nekim slučajevima, rekonstituisani rastvor se filtrira pre primene. U nekim slučajevima, komplet sadrži filter ili filter špric za filtriranje rekonstituisanog farmaceutskog sastava pre primene pacijentu.
[0280] U nekim slučajevima, radi stabilnosti skladištenja i praktičnosti rukovanja, farmaceutski sastav, koji se sastoji od rAAV (npr. AAV2.7m8) i sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein aflibercepta, može se formulisati kao liofilizovani, liofilizovani ili vakuumski osušeni prah koji se može rekonstituisati fiziološkim rastvorom, puferom ili vodom pre primene na subjektu. Alternativno, farmaceutski sastav se može formulisati kao vodeni rastvor, kao što je suspenzija ili homogeni rastvor. Farmaceutski sastav može da sadrži rAAV virione ili čestice koje se sastoje od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept. U nekim slučajevima, drugačiji virus ili sistem isporuke, npr. nanočestice ili kompleksi na bazi lipida, mogu se koristiti za isporuku sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept. Za stabilizaciju farmaceutskog sastava mogu se koristiti različite pomoćne supstance, kao što su fosfat, PBS ili Tris pufer, glikol, glicerol, fiziološki rastvor, surfaktant (npr. pluronski ili polisorbat), ili bilo koja njihova kombinacija. Pored toga, krioprotektori, kao što su alkoholi, mogu se koristiti kao stabilizatori pod uslovima zamrzavanja ili sušenja liofilizacije. U nekim slučajevima, genska terapija se obezbeđuje kao suspenzija ili rashlađena suspenzija.
[0282] U nekim slučajevima, suspenzija ili rekonstituisani oblik liofilizovanog farmaceutskog sastava koji se sastoji od genske terapije afliberceptom kako je ovde obelodanjeno ima zapreminu od oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ili 1000 µl. U nekim slučajevima, suspenzija farmaceutskog sastava koja se sastoji od terapije aflibercept genom kako je ovde obelodanjeno ima zapreminu između 0,1 i 0,5 ml, između 0,1 i 0,2 ml, između 0,3 i 0,5 ml, između 0,5-1,0 ml, između 0,5-0,7 ml, između 0,6 i 0,8 ml, između 0,8 i 1 ml, između 0,9 i 1,1 ml, između 1,0 i 1,2 ml, ili između 1,0 i 1,5 ml. U drugim slučajevima zapremina nije veća od 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 ili 1,5 ml.
[0284] U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi opisane ovde su dizajnirani, konstruisani ili prilagođeni za primenu primatima (npr. neljudskim primatima i ljudskim subjektima) putem intravitrealne ili subretinalne injekcije. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav koji se sastoji od rAAV viriona koji se sastoje od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept formulisan je za intravitrealnu injekciju u oko subjekta. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav je formulisan ili rekonstituisan do koncentracije koja omogućava intravitrealnu injekciju zapremine ne veće od oko ili ne veće od 2, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ili 200 µl. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava sadrži zapreminu ne veću od oko ili ne veću od 2, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ili 200 µl. U nekim slučajevima, ovde opisani metodi lečenja obuhvataju intravitrealnu injekciju zapremine od oko 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150 µl rastvora koji sadrži rAAV (npr. AAV2.7m8) i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aflibercept.
[0286] U nekim slučajevima, AAV2,7m8 virion koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline ovde opisanog aflibercept transgena može biti komponenta farmaceutskog sastava genske terapije. U nekim slučajevima, rAAV virion bilo kog serotipa koji sadrži varijantni kapsidni protein 7m8 kao što je ovde opisano može se koristiti za pravljenje liofilizovanog farmaceutskog sastava ili njegove suspenzije. U nekim slučajevima, genska terapija je formulisana kao rashlađena suspenzija. U nekim slučajevima, rAAV virion je rAAV2. U nekim slučajevima, liofilizovani ili suspenzija farmaceutskog sastava sadrži rAAV2 koji ima 7m8 varijantu kapsidnog proteina i DNK sekvencu koja kodira aflibercept, funkcionalni fragment ili njegovu varijantu. U nekim slučajevima, suspenzija je u frižideru.
[0287] U nekim slučajevima, farmaceutski sastav koji je ovde obelodanjen prilagođen je za genetsku terapiju ili intravitrealnu isporuku aflibercepta kao terapijskog agensa kod ljudskih pacijenata ili primata koji nisu ljudi. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava sadrži između 1×10<10>do 1×10<13>virusnih genoma (vg). U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od oko 2,1×10<11>, oko 2,1×10<12>, ili oko 2,1×10<13>vektorskog genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je 1×10<10>do 3×10<12>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je 1×10<9>do 3×10<13>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je 1×10<10>do 1×10<11>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je 1×10<8>do 3×10<14>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je najmanje 1×10<1>, 1×10<2>, 1 ×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>ili 1×10<18>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je 1×10<10>do 5×10<13>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je najviše oko 1×10<8>, 1×10<9>, 1×1010, 1× 10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>i 1×10<18>vektorskih genoma.
[0289] U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja može se meriti kao pfu (jedinice koje formiraju plak). U nekim slučajevima, pfu jedinične doze farmaceutskog sastava obelodanjivanja može biti oko 1×10<8>do oko 1×10<12>pfu. U nekim slučajevima, pfu jedinične doze farmaceutskog sastava obelodanjivanja može biti najmanje oko 1×10<8>, 2×10<8>, 3 ×10<8>, 4 ×10<8>, 5 ×10<8>, 6 ×10<8>, 7 ×10<8>, 8 ×10<8>, 9 ×10<8>, 1 ×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>, 6×10<9>, 7×10<9>, 8×10<9>, 9×10<9>, 1×10<10>, 2×10<10>, 3×10<10>, 4×10<10>, 5×10<10>, 6×10<10>, 7×10<10>, 8×10<10>, 9×10<10>, 1×10<11>, 2×10<11>, 3×10<11>, 4×10<11>, 5×10<11>, 6×10<11>, 7×10<11>, 8×10<11>, 9×10<11>ili 1×10<12>pfu. U nekim slučajevima, pfu jedinične doze farmaceutskog sastava obelodanjivanja može biti najviše oko 1×10<8>, 2×10<8>, 3 ×10<8>, 4 ×10<8>, 5 ×10<8>, 6 ×10<8>, 7 ×10<8>, 8 ×10<8>, 9 ×10<8>, 1 ×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>, 6×10<9>, 7×10<9>, 8×10<9>, 9×10<9>, 1×10<10>, 2×10<10>, 3×10<10>, 4×10<10>, 5×10<10>, 6×10<10>, 7×10<10>, 8×10<10>, 9×10<10>, 1×10<11>, 2×10<11>, 3×10<11>, 4×10<11>, 5×10<11>, 6×10<11>, 7×10<11>, 8×10<11>, 9×10<11>ili 1×10<12>pfu.
[0291] U nekim slučajevima, virusni vektor obelodanjivanja može se meriti kao vektorski genomi (vg). U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja može biti 1×10<10>do 1×10<13>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja može biti 1×10<9>do 1×10<14>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja može biti 1×10<10>do 1×10<11>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja može biti 1×10<8>do 1×10<15>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je najmanje 1×10<1>, 1×10<2>, 1 ×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>i 1×10<18>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je 1×10<8>do 1×10<15>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je najviše oko 1×10<1>, 1×10<2>, 1 ×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>ili 1×10<18>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza je između 10<10>do 10<11>, između 10<11>do 10<12>, između 10<10>do 10<12>, između 10<12>do 10<13>, između 10<11>do 10<13>, između 10<12>do 10<13>, između 10<12>do 10<14>, između 10<11>do 10<14>, između 10<11>do 10<15>, između 10<12>do 10<15>, između 10<13>do 10<14>, između 10<14>do 10<15>, između 10<15>do 10<16>, između 10<16>do 10<17>, između 10<17>do 10<18>, između 10<18>do 10<19>ili između 10<19>do 10<20>vektorskih genoma.
[0293] U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja je između 1×10<10>do 2×10<10>, između 2×10<10>do 3×10<10>, između 3×10<10>do 4×10<10>, između 4×10<10>do 5×10<10>, između 5×10<10>do 6×10<10>, između 6×10<10>do 7×10<10>, između 7×10<10>do 8×10<10>, između 8×10<10>do 9×10<10>, između 9× 10<10>do 10×10<10>, između 1×10<11>do 2×10<11>, između 2×10<11>do 3×10<11>, između 2×10<11>do 2,5×10<11>, između 2,5×10<11>do 3×10<11>, između 3×10<11>do 4×10<11>, između 4×10<11>do 5×10<11>, između 5×10<11>do 6×10<11>, između 6×10<11>do 7×10<11>, između 7×10<11>do 8×10<11>, između 8×10<11>do 9×10<11>, između 9×10<11>do 10×10<11>, između 1×10<12>do 2×10<12>, između 2×10<12>do 3×10<12>, između 2,5×10<12>do 3×10<12>, između 3×10<12>do 4×10<12>, između 4×10<12>do 5×10<12>, između 5×10<12>do 6×10<12>, između 6×10<12>do 7×10<12>, između 7×10<12>do 8×10<12>, između 8×10<12>do 9×10<12>, između 9×10<12>do 10×10<12>, između 1×10<13>do 2×10<13>, između 2×10<13>do 3×10<13>, između 3×10<13>do 4×10<13>, između 4×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 6×10<13>, između 6×10<13>do 7×10<13>, između 7×10<13>do 8×10<13>, između 8×10<13>do 9×10<13>ili između 9×10<13>do 10×10<13>vektorskih genoma.
[0295] U nekim slučajevima, jedinična doza rAAV ovog obelodanjivanja je između 2,1×10<11>ili između 2,1×10<12>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza rAAV ovog obelodanjivanja je između 10<10>do 10<13>, između 10<10>do 10<11>, između 10<11>do 10<12>, između 10<12>do 10<13>ili između 10<13>do
[0296] 10<14>vektorskih genoma.
[0298] U nekim slučajevima, jedinična doza rAAV ovog obelodanjivanja je između 1×10<10>do 2×10<10>, između 2×10<10>do 4×10<10>, između 3×10<10>do 5×10<10>, između 4×10<10>do 6×10<10>, između 5×10<10>do 7×10<10>, između 6×10<10>do 8×10<10>, između 7×10<10>do 9×10<10>, između 8×10<10>do 10<11>, između 1×10<11>do 2×10<11>, između 2×10<11>do 4×10<11>, između 3×10<11>do 5×10<11>, između 4×10<11>do 6×10<11>, između 5×10<11>do 7×10<11>, između 6×10<11>do 8×10<11>, između 7×10<11>do 9×10<11>, između 8×10<11>do 10×10<11>, između 1×10<12>do 3×10<12>, između 2×10<12>do 4×10<12>, između 3×10<12>do 5×10<12>, između 4×10<12>do 6×10<12>, između 5×10<12>do 7×10<12>, između 6×10<12>do 8×10<12>, između 7×10<12>do 9×10<12>, između 8×10<12>do 10×10<12>, između 1×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 10×10<13>, između 10<12>do 5×10<12>, između 5×10<12>do 1×10<13>, između 7×10<12>do 1×10<13>, između 8×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 4×10<13>, između 1×10<13>do 3×10<13>, između 1×10<13>do 2×10<13>, između 2×10<13>do 3×10<13>, između 3×10<13>do 4×10<13>, između 4×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 6×10<13>, između 6×10<13>do 7×10<13>, između 7×10<13>do 8×10<13>, između 8×10<13>do 9×10<13>, ili između 8×10<13>do 1×10<14>vektorskih genoma.
[0300] U nekim slučajevima, niža koncentracija (npr. vektorski genomi) se koristi za jediničnu dozu kako bi se sprečila agregacija, koja se može javiti pri višim koncentracijama. U nekim slučajevima, veća koncentracija, npr. veći vektorski genomi, se bira za jediničnu dozu kako bi se povećala efikasnost genske terapije, ili da bi se maksimizirala isporuka aflibercept transgena u jednoj injekciji ili u jednokratnoj primeni genske terapije. U nekim slučajevima, veće koncentracije ovde navedenih farmaceutskih sastava omogućavaju manje zapremine injekcije, što može smanjiti neželjena dejstva povezana sa intravitrealnom injekcijom, npr. povišeni intraokularni pritisak, upalu, iritaciju ili bol.
[0302] U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava obelodanjivanja može se izmeriti korišćenjem mnoštva infekcija (MOI). U nekim slučajevima, MOI se može odnositi na odnos ili više vektorskih ili virusnih genoma prema ćelijama kojima se nuklein može isporučiti. U nekim slučajevima, MOI može biti 1×10<6>. U nekim slučajevima, MOI može biti između oko 1×10<5>do oko 1×10<7>. U nekim slučajevima, MOI može biti 1×10<4>-1×10<8>. U nekim slučajevima, rekombinantni virusi obelodanjivanja mogu biti najmanje oko 1×10<1>, 1×10<2>, 1×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>i 1×10<18>MOI. U nekim slučajevima, rekombinantni virusi obelodanjivanja mogu biti od oko 1×10<8>do oko 1×10<15>MOI. U nekim slučajevima, rekombinantni virusi obelodanjivanja mogu biti najviše oko 1×10<1>, 1×10<2>, 1×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>, 1×10<12>, 1×10<13>, 1×10<14>, 1×10<15>, 1×10<16>, 1×10<17>i 1×10<18>MOI. U nekim slučajevima, MUP je između 1×10<10>do 2×10<10>, između 2×10<10>do 4×10<10>, između 3×10<10>do 5×10<10>, između 4×10<10>do 6×10<10>, između 5×10<10>do 7×10<10>, između 6×10<10>do 8×10<10>, između 7×10<10>do 9×10<10>, između 8×10<10>do 10<11>, između 1×10<11>do 2×10<11>, između 2×10<11>do 4×10<11>, između 3×10<11>do 5×10<11>, između 4×10<11>do 6×10<11>, između 5×10<11>do 7×10<11>, između 6×10<11>do 8×10<11>, između 7×10<11>do 9×10<11>, između 8×10<11>do 10×10<11>, između 1×10<12>do 3×10<12>, između 2×10<12>do 4×10<12>, između 3×10<12>do 5×10<12>, između 4×10<12>do 6×10<12>, između 5×10<12>do 7×10<12>, između 6×10<12>do 8×10<12>, između 7×10<12>do 9×10<12>, između 8×10<12>do 10×10<12>, između 1×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 10×10<13>, između 10<12>do 5×10<12>, između 5×10<12>do 1×10<13>, između 7×10<12>do 1×10<13>, između 8×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 4×10<13>, između 1×10<13>do 3×10<13>, između 1×10<13>do 2×10<13>, između 2×10<13>do 3×10<13>, između 3×10<13>do 4×10<13>, između 4×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 6×10<13>, između 6×10<13>do 7×10<13>, između 7×10<13>do 8×10<13>, između 8×10<13>do 9×10<13>, ili između 8×10<13>do 1×10<14>.
[0305] 4
[0306] Farmaceutski nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za privremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzije. Za intravitrealnu primenu, odgovarajući nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS) i/ili izotonično sredstvo, npr. glicerol. U svim slučajevima, formulacija mora biti sterilna i mora biti tečna u meri u kojoj postoji jednostavna mogućnost ubrizgavanja. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se čuvati od kontaminacije mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav može uključivati izotonično sredstvo, kao što je so ili glicerol. U nekim slučajevima, farmaceutskom sastavu se dodaje surfaktant ili stabilizator kako bi se sprečila agregacija.
[0308] U nekim slučajevima, pomoćna supstanca može biti nosač. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol tečni polietilen glikol i slično), njihove pogodne smeše i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata kao što su polisorbati (npr. Tween<™>, polisorbat 20, polisorbat 80), natrijum dodecil sulfat (natrijum lauril sulfat), lauril dimetil amin oksid, cetiltrimetilamonijum bromid (CTAB), polietoksilovani alkoholi, polioksietilen sorbitan, oktoksinol (Triton X100<™>), N,N-dimetildodecilamin-N-oksid, heksadeciltrimetilamonijum bromid (HTAB), polioksil 10 lauril etar, Brij 721<™>, žučne soli (natrijum deoksiholat, natrijum holat), pluronske kiseline (F-68, F-127), polioksil ricinusovo ulje (Cremophor<™>), nonilfenol etoksilat (Tergitol<™>), ciklodekstrini i etilbenzetonijum hlorid (Hyamine<™>). Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, krezolom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole, kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u sastav. Dugotrajna apsorpcija sastava koji se ubrizgavaju može se postići uključivanjem u sastav sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina. U nekim slučajevima, farmaceutski nosač uključuje natrijum fosfat, natrijum hlorid, polisorbat i saharozu. U nekim slučajevima, farmaceutski sastav se sastoji od surfaktanta, npr.
[0309] nejonskog surfaktanta kao što su polisorbat, poloksamer ili pluron. U nekim slučajevima, dodavanje nejonskog surfaktanta smanjuje agregaciju u farmaceutskom sastavu.
[0311] U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi korisni za ovo obelodanjivanje mogu se upakovati u komplet kako bi se olakšala primena ovog obelodanjivanja. U nekim aspektima, ova metoda predviđa komplet koji se sastoji od rekombinantnog nukleinskog (npr. rAAV ili rAAV2.7m8 koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline aflibercepta) obelodanjivanja. U nekim aspektima, ova metoda predviđa komplet koji se sastoji od liofilizovanog oblika rekombinantnog virusa otkrivanja i rastvora za rekonstituisanje virusa pre primene na pacijentu. U nekim slučajevima, komplet se sastoji od: rekombinantnog virusa kako je ovde opisano i uputstava za primenu na očne ili retinalne ćelije subjekta u terapeutski efikasnoj količini rekombinantnog virusa. U nekim aspektima, komplet sadrži farmaceutski prihvatljive soli ili rastvore za primenu rekombinantnog virusa. Opciono, komplet može dalje da sadrži uputstva za odgovarajuće radne parametre u obliku etikete ili posebnog umetka. Na primer, komplet može imati standardna uputstva koja obaveštavaju lekara ili laboratorijskog tehničara da pripremi jediničnu dozu rekombinantnog virusa i/ili da rekonstituiše liofilizovane sastave. U nekim slučajevima, opciono, komplet dalje sadrži uređaj za primenu, kao što su špric, igla za filter, produžni tubing, kanila ili subretinalni injektor.
[0313] U nekim slučajevima, farmaceutski sastav se obezbeđuje kao suspenzija ili rashlađena suspenzija. U nekim slučajevima, suspenzija ili rashlađena suspenzija je obezbeđena u kompletu, koji može uključivati špric ili pufer za razblaživanje. U nekim slučajevima, suspenzija ili rashlađena suspenzija se obezbeđuje kao napunjeni špric.
[0315] U nekim slučajevima, bilo koja pogodna metoda može se koristiti u biohemijskom prečišćavanju rekombinantnih virusa (npr. rAAV) za upotrebu u farmaceutskom sastavu kao što je ovde opisano. Rekombinantni AAV virusi mogu se sakupljati direktno iz ćelija ili iz medija za kulturu koji se sastoji od ćelija. Virus se može prečišćavati različitim biohemijskim sredstvima, kao što su filtracija gela, filtracija, hromatografija, prečišćavanje afiniteta, gradijentna ultracentrifugacija ili metode isključivanja veličine pre liofilizacije ili pre formulisanja kao suspenzije.
[0316] Indikacije
[0318] U nekim slučajevima, rAAV virion bilo kog serotipa koji se sastoji od varijante 7m8 (npr. rAAV2.7m8) ili njegovog farmaceutskog sastava kako je ovde opisano može bar delimično da ublaži stanje oka ili bolest povezanu sa neovaskularizacijom oka ili CNV-om. U nekim slučajevima, rAAV virion koji se sastoji od proteina kapsidne varijante se koristi za isporuku aflibercepta, funkcionalnog fragmenta ili njegove varijante, u oko ljudskog subjekta.
[0320] Indikacije odobrene za fuzioni protein aflibercepta uključuju neovaskularnu (vlažnu) makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem (AMD), makularni edem nakon okluzije retinalne vene (RVO), dijabetički makularni edem (DME) i dijabetičku retinopatiju (DR) kod pacijenata sa DME. U nekim slučajevima, ovde navedene metode i farmaceutski sastavi mogu se koristiti za sprečavanje ili lečenje stanja ili bolesti oka za koje je aflibercept odobren ili indikovan. U nekim slučajevima, genska terapija (npr. AAV2.7m8 genska terapija) se koristi za lečenje ili sprečavanje stanja ili bolesti oka koja reaguje na aflibercept, uključujući, ali ne ograničavajući se na, CNV, vlažnu AMD, suvu AMD, DME, RVO, makularni edem nakon RVO i dijabetičku retinopatiju kod pacijenata sa DME. U nekim slučajevima, rAAV genska terapija se koristi za lečenje ili sprečavanje bilo kog stanja ili poremećaja oka koje karakteriše neovaskularizacija ili CNV. U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje opisuje farmaceutski sastav za lečenje bolesti kao što su AMD, DME, RVO, bolesti povezane sa angiogenezom, rak, autoimune bolesti, organizmi infektivnih bolesti i slično.
[0322] U nekim slučajevima, stanje oka može biti dijabetički makularni edem. Dijabetički makularni edem (DME) je otok mrežnjače kod dijabetes melitusa usled curenja tečnosti iz krvnih sudova unutar makule. Makula je centralni deo mrežnjače, mala oblast bogata čunjevima, specijalizovanim nervnim završecima koji detektuju boju i od kojih zavisi dnevni vid. Kako se razvija makularni edem, dolazi do zamućenja u sredini ili samo sa strane centralnog vidnog polja. Gubitak vida od dijabetičkog makularnog edema može napredovati tokom perioda od nekoliko meseci i onemogućiti jasno fokusiranje. Uobičajeni simptomi DME-a su zamagljen vid, plutači, dvostruki vid i na kraju slepilo ako se ne leči. U nekim
[0325] 4
[0326] slučajevima, metode i farmaceutski sastavi kao što je ovde obelodanjeno koriste se za lečenje DME.
[0328] U nekim slučajevima, stanje oka može biti okluzija retinalne vene.
[0329] Okluzija retinalne vene je blokada malih vena koje nose krv dalje od mrežnjače. Mrežnjača je sloj tkiva na zadnjoj strani unutrašnjeg oka koji pretvara svetlosne slike u nervne signale i šalje ih u mozak. Okluzija retinalne vene najčešće je uzrokovana otvrdnjavanjem arterija (ateroskleroza) i stvaranjem krvnog ugruška. Blokada manjih vena (granastih vena ili brvo) u mrežnjači često se javlja na mestima gde retinalne arterije koje su zadebljale ili otvrdnule aterosklerozom prelaze preko i vrše pritisak na retinalnu venu. Simptomi okluzije retinalne vene mogu uključivati iznenadno zamućenje ili gubitak vida u celom ili delu jednog oka. U nekim slučajevima, metode i farmaceutski sastavi kao što je ovde obelodanjeno koriste se za lečenje okluzije retinalne vene.
[0331] U nekim slučajevima, stanje oka može biti horoidalna neovaskularizacija (CNV), takođe poznata kao vlažna AMD. Horoidalna neovaskularizacija može uključivati rast novih krvnih sudova koji potiču iz horoida putem loma Bruhove membrane u subretinalni pigmentni epitel (sub-RPE) ili subretinalni prostor, što može biti glavni uzrok gubitka vida. CNV može izazvati naglo pogoršanje centralnog vida, primetno u roku od nekoliko nedelja. Drugi simptomi mogu uključivati poremećaje boje i metamorfopsiju (distorzije u kojima prave linije izgledaju talasasto). Krvarenje novih krvnih sudova može ubrzati pojavu simptoma CNV-a. CNV takođe može uključivati osećaj pritiska iza oka. U nekim slučajevima, metode i farmaceutski sastavi kao što je ovde obelodanjeno koriste se za lečenje CNV-a ili stanja oka povezanog sa neovaskularizacijom.
[0333] Uznapredovali „vlažni“ oblik (neovaskularni ili eksudativni) AMD-a je ređi, ali često može izazvati brz i često značajan gubitak centralnog vida kod pacijenata. U vlažnom obliku AMD-a, horoidalna neovaskularizacija se formira i razvija u mrežu sudova koji mogu rasti ispod i kroz retinalni pigmentni epitel. Pošto je ovo praćeno curenjem plazme i/ili krvarenjem u subretinalni prostor, može doći do ozbiljnog naglog gubitka centralnog vida ako se to dogodi u makuli. Termin „AMD“, ako nije drugačije navedeno, može biti ili suvi AMD ili vlažni AMD. Ovo obelodanjivanje razmatra lečenje ili prevenciju AMD-a, vlažnog AMD-a i/ili suvog AMD-a. U nekim slučajevima, metode i farmaceutski sastavi kao što je ovde obelodanjeno koriste se za lečenje AMD.
[0335] U nekim slučajevima, metode i farmaceutski sastavi kao što je ovde obelodanjeno koriste se za sprečavanje ili lečenje bolesti ili stanja oka koje reaguje na aflibercept in vivo.
[0337] U nekim slučajevima, ovde otkrivene metode i farmaceutski sastavi, tj. AAV genska terapija koja se sastoji od aflibercepta, funkcionalnog fragmenta ili njegove varijante, rezultira smanjenjem neovaskularizacije ili CNV-a, mereno procentom lezija stadijuma IV nakon formiranja CNV-a prema fotografiji fundusa u boji, za najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 7%, najmanje 8%, najmanje 9%, najmanje 10%, najmanje 11%, najmanje 12%, najmanje 13%, najmanje 14%, najmanje 15%, najmanje 16%, najmanje 17%, najmanje 18%, najmanje 19%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% u poređenju sa kontrolom vehikule ili pufera.
[0339] U nekim slučajevima, ovde obelodanjene metode i farmaceutski sastavi, tj. AAV genska terapija koja se sastoji od aflibercepta, funkcionalnog fragmenta ili njegove varijante, rezultira smanjenjem neovaskularizacije ili CNV-a, mereno procentom lezija stadijuma IV nakon formiranja CNV-a prema fotografiji fundusa u boji, što je uporedivo sa afliberceptom ili afliberceptom koji nije zasnovan na genskoj terapiji. U nekim slučajevima, smanjenje CNV-a ili terapijski efekat traje duže sa primenom genske terapije koja se sastoji od aflibercepta u poređenju sa primenom aflibercepta koji nije zasnovan na genskoj terapiji ili proteinskog rastvora aflibercepta. U nekim slučajevima, terapeutski efekat genske terapije afliberceptom traje najmanje 1 godinu, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina nakon jedne intravitrealne injekcije. U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi otkriveni u ovom dokumentu inhibiraju ili odvajaju endogeni VEGF i/ili PIGF.
[0342] 4
[0343] Načini korišćenja
[0345] U nekim slučajevima, ovo obelodanjivanje opisuje metod za lečenje bolesti oka povezane sa patološkom angiogenezom, koji se sastoji od primene farmaceutski efikasne količine farmaceutskih sastava opisanih u ovom dokumentu na ljudskom subjektu kome je potrebno takvo lečenje. U nekim slučajevima, bolest se bira iz grupe očnih neovaskularnih bolesti uključujući starosnu makularnu degeneraciju (AMD), vlažnu AMD, suvu AMD, neovaskularizaciju mrežnjače, dijabetičku retinopatiju horoidalne neovaskularizacije, proliferativnu dijabetičku retinopatiju, okluziju retinalne vene, okluziju centralne retinalne vene, okluziju razgranate retinalne vene, dijabetički makularni edem, dijabetičku retinalnu ishemiju, ishemijsku retinopatiju i dijabetički retinalni edem i bilo koju njihovu kombinaciju.
[0347] U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi koji se sastoje od rAAV koji se sastoji od varijante kapsidnog proteina (npr. rAAV.7m8) i sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept se koriste za lečenje ili sprečavanje AMD-a, uključujući suvi AMD i vlažni AMD. U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi koji se sastoje od rAAV koji se sastoji od varijante kapsidnog proteina (npr. rAAV.7m8) i sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept se koriste za lečenje ili sprečavanje CNV-a ili smanjenje lezija CNV-a IV stepena. U nekim slučajevima, farmaceutski sastavi koji se sastoje od rAAV koji se sastoje od varijante kapsidnog proteina (npr. rAAV.7m8) i sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept se koriste za lečenje ili sprečavanje bilo koje od AMD, vlažne-AMD, suve-AMD, retinalne neovaskularizacije, dijabetičke retinopatije horoidalne neovaskularizacije, proliferativne dijabetičke retinopatije, okluzije retinalne vene, okluzije centralne retinalne vene, okluzije razgranate retinalne vene, RVO, dijabetičkog makularnog edema, dijabetičke retinopatije, ishemijske retinopatije i dijabetičkog retinalnog edema, DR kod pacijenata sa DME i bilo kojom njihovom kombinacijom.
[0349] U nekim slučajevima, metoda lečenja AMD, DME, RVO ili DR obuhvata prethodno lečenje pacijenta lekom EYLEA<®>pre primene genske terapije koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline aflibercepta kod istog pacijenta. U nekim slučajevima, pacijent se prethodno leči lekom EYLEA<®>pre nego što primi jednokratnu dozu terapije aflibercept genom, kao što je ovde obelodanjeno. U
[0352] 4
[0353] nekim slučajevima, pacijent reaguje na aflibercept pre nego što primi jednokratnu dozu terapije aflibercept genom, kao što je ovde obelodanjeno. U nekim slučajevima, pacijent koji reaguje na aflibercept ili koji je prethodno lečen afliberceptom leči se genskom terapijom aflibercepta, kao što je ovde obelodanjeno, nakon čega sledi period od najmanje 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina, ili više od 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina tokom kojih pacijent ne prima ni EYLEA<®>ni aflibercept gensku terapiju. U nekim slučajevima, nakon što pacijent primi intravitrealnu injekciju genske terapije afliberceptom, pacijent ne počinje da prima EYLEA<®>ili drugu standardnu injekciju za negu, ili drugu odobrenu terapiju (npr. ranibizumab ili injekciju bevacizumaba) sve dok ne istekne najmanje 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina nakon tretmana genske terapije. U nekim slučajevima, metoda lečenja obuhvata procenu ili evaluaciju pacijenata u pogledu odgovora na aflibercept (npr. imunološkim testom ili testom krvi) pre nego što se pacijentu primeni genska terapija afliberceptom.
[0355] U nekim slučajevima, ovde navedena genska terapija afliberceptom je jednokratna primena. U nekim slučajevima, nakon što pacijent primi jediničnu dozu ovde navedene genske terapije afliberceptom, pacijent ne mora da koristi nijednu drugu terapiju na bazi aflibercepta.
[0357] U nekim slučajevima, pacijenti koji dožive neželjena dejstva povezana sa ponovljenim intravitrealnim injekcijama leka EYLEA<®>ili druge odobrene terapije, npr. upala, povišen intraokularni pritisak ili bakterijska infekcija, mogu biti kandidati za lečenje terapijom aflibercept genom koja je ovde navedena. U nekim slučajevima, takvi rizici su manji kod genske terapije jer zahteva samo jednu injekciju u životu pacijenta ili se daje ne više od jednom u najmanje 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ili više godina. U nekim slučajevima, lečenje ovde obelodanjenom genetskom terapijom aflibercepta može biti isplativije od injekcija zasnovanih na proteinima, jer terapijski efekti genske terapije mogu trajati duže, a troškovi jednokratne genske terapije mogu biti niži od kombinovanih troškova višestrukih, ponovljenih injekcija proteina.
[0359] Takođe, time što ne zahteva ponovljene injekcije, genska terapija se bavi izazovom usaglašenosti i pridržavanja pacijenta u vezi sa terapijama koje zahtevaju ponovljene injekcije, jer neusaglašenost (npr. kada pacijent zaboravi ili propusti
[0362] 4
[0363] jednu ili više planiranih injekcija) može dovesti do gubitka vida i pogoršanja bolesti ili stanja oka. Stopa neusaglašenosti i nepoštovanja režima lečenja koji zahtevaju ponovljene ili česte posete medicinskim ordinacijama za primenu je veća među starijim pacijentima, koji su najviše pogođeni AMD-om. Stoga, isporuka aflibercepta u oko pacijenta putem genske terapije, npr. kao jednokratna intravitrealna injekcija, može pružiti pogodniju opciju lečenja za pacijente i poboljšati ishode pacijenta rešavanjem problema neusaglašenosti i nepridržavanja.
[0365] U nekim slučajevima, metoda primene obuhvata prethodno lečenje ljudskog pacijenta ili subjekta lekom koji se smatra trenutnim standardom nege, npr. injekcijom proteina aflibercepta, injekcijom ranibizumaba ili injekcijom bevacizumaba, određivanje reakcije pacijenta na aflibercept i davanje ovde opisane genske terapije afliberceptom pacijentu koji reaguje na aflibercept.
[0366] Određivanje reagovanja pacijenta na aflibercept može uključivati, ali ne ograničavajući se na, krvne testove, imunološki test, ex vivo eksperimente ili primenu injekcije proteina aflibercepta na pacijenta i ispitivanje pacijenta na reagovanje na aflibercept.
[0368] U nekim slučajevima, metoda upotrebe ovde opisane genske terapije afliberceptom uključuje rekonstituisanje liofilizovanog oblika farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu (tj., rAAV2.7m8 koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline aflibercepta) u skladu sa oznakom leka i primenu navedene rekonstituisane genske terapije afliberceptom na ispitaniku ili ljudskom pacijentu. U nekim slučajevima, terapija aflibercept genom se obezbeđuje kao suspenzija. U nekim slučajevima, suspenzija se meša pre primene. U nekim slučajevima, suspenzija je u frižideru. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija se pre primene zagreva na sobnu temperaturu. U nekim slučajevima, takav ljudski pacijent je prethodno lečen injekcijom aflibercepta ili nekom drugom injekcijom proteinskog leka, npr. injekcijom ranibizumaba ili injekcijom bevacizumaba. U nekim slučajevima, takav pacijent prima ne više od jedne injekcije ili primene rAAV2.7m8-aflibercept genske terapije najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina; ili prima ne više od jedne injekcije ili primene rAAV2.7m8-aflibercept genske terapije u više od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina.
[0371] 4
[0372] U nekim slučajevima, ovde su takođe obelodanjene metode sprečavanja ili lečenja očnog stanja ili bolesti, metoda koja se sastoji od primene na pojedincu kome je to potrebno, npr. na pojedincu sa očnim stanjem ili bolešću koja reaguje na aflibercept, efikasnu količinu rAAV viriona koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept kako je ovde opisano ili njegov farmaceutski sastav. U nekim slučajevima, rAAV2.7m8-aflibercept virion se može primeniti intraokularnom injekcijom, intravitrealnom injekcijom, subretinalnom injekcijom ili bilo kojim drugim pogodnim načinom ili putem primene u oko pojedinca. Drugi pogodni načini ili putevi primene mogu uključivati, npr. intravenske, topikalne, kapi za oči itd. U nekim slučajevima, ovde navedene metode i farmaceutski sastavi uključuju primenu intravitrealnom injekcijom.
[0374] U nekim slučajevima, genska terapija ili farmaceutski sastavi opisani u ovom dokumentu obezbeđeni su kao rashlađena suspenzija. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija sadrži farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu, npr. surfaktant, glicerol, nejonski surfaktant, pufer, glikol, so i bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim slučajevima, hlorovodonična kiselina i natrijum hidroksid se koriste za podešavanje pH rastvora. U nekim slučajevima, suspenzija je na neutralnoj pH vrednosti, ili na pH vrednosti između 6,5 i 7,5. U nekim slučajevima, pH suspenzije je blago bazičan (npr. pH oko 7,5, 8, 8,2, 8,4, 8,5 ili 9). U nekim slučajevima, pH suspenzije ili rastvora je blago kiseo (npr. pH oko 6,5, 6,3, 6,1, 6, 6,5 ili 5). U nekim slučajevima, suspenzija je rastvor. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija se sastoji od micela. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija se meša pre primene. U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija se skladišti na temperaturama između 35F i 46F (2C i 8C). U nekim slučajevima, rashlađena suspenzija se zagreva na sobnu temperaturu pre primene na pacijenta.
[0376] „Terapijski efikasna količina“ kako je ovde opisano može biti relativno širok opseg koji se može odrediti kliničkim ispitivanjima. Za injekciju direktno u oko ili intravitrealnu injekciju, terapijski efikasna doza može biti reda veličine od 10<11>do 10<12>ili od 10<12>do 10<13>vektorskih genoma 7m8-aflibercepta. U nekim slučajevima, jedinična doza ili terapeutski efikasna količina 7m8-aflibercepta je između 10<10>do 10<11>, između 10<11>do 10<12>, između 10<10>do 10<12>, između 10<12>do 10<13>, između
[0379] 4
[0380] 10<11>do 10<13>, između 10<12>do 10<13>, između 10<12>do 10<14>, između 10<11>do 10<14>, između 10<11>do 10<15>, između 10<12>do 10<15>, između 10<13>do 10<14>, između 10<14>do 10<15>, između 10<15>do 10<16>, između 10<16>do 10<17>, između 10<17>do 10<18>, između 10<18>do 10<19>ili između 10<19>do 10<20>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza farmaceutskog sastava koji sadrži 7m8-aflibercept iz obelodanjivanja je između 1×10<10>do 2×10<10>, između 2×10<10>do 3×10<10>, između 3×10<10>do 4×10<10>, između 4×10<10>do 5×10<10>, između 5×10<10>do 6×10<10>, između 6×10<10>do 7×10<10>, između 7×10<10>do 8×10<10>, između 8×10<10>do 9×10<10>, između 9× 10<10>do 10× 10<10>, između 1×10<11>do 2×10<11>, između 2×10<11>do 3×10<11>, između 2×10<11>do 2,5×10<11>, između 2,5×10<11>do 3×10<11>, između 3×10<11>do 4×10<11>, između 4×10<11>do 5×10<11>, između 5×10<11>do 6×10<11>, između 6×10<11>do 7×10<11>, između 7×10<11>do 8×10<11>, između 8×10<11>do 9×10<11>, između 9×10<11>do 10×10<11>, između 1×10<12>do 2×10<12>, između 2×10<12>do 3×10<12>, između 2,5×10<12>do 3×10<12>, između 3×10<12>do 4×10<12>, između 4×10<12>do 5×10<12>, između 5×10<12>do 6×10<12>, između 6×10<12>do 7×10<12>, između 7×10<12>do 8×10<12>, između 8×10<12>do 9×10<12>, između 9×10<12>do 10×10<12>, između 1×10<13>do 2×10<13>, između 2×10<13>do 3×10<13>, između 3×10<13>do 4×10<13>, između 4×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 6×10<13>, između 6×10<13>do 7×10<13>, između 7×10<13>do 8×10<13>, između 8×10<13>do 9×10<13>ili između 9×10<13>do 10×10<13>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza 7m8-aflibercept ovog obelodanjivanja je između 2,1×10<11>ili između 2,1×10<12>vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza rAAV ovog obelodanjivanja je između 10<10>do 10<13>, između 10<10>do 10<11>, između 10<11>do 10<12>, između 10<12>do 10<13>ili između 10<13>do 10<14>vektorskih genoma.
[0382] U nekim slučajevima, jedinična doza 7m8-aflibercept ovog obelodanjivanja je između 1×10<10>do 2×10<10>, između 2×10<10>do 4×10<10>, između 3×10<10>do 5×10<10>, između 4×10<10>do 6×10<10>, između 5×10<10>do 7×10<10>, između 6×10<10>do 8×10<10>, između 7×<10>do 9×10<10>, između 8×10<10>do 10<11>, između 1×10<11>do 2×10<11>, između 2×10<11>do 4×10<11>, između 3×10<11>do 5×10<11>, između 4×10<11>do 6×10<11>, između 5×10<11>do 7×10<11>, između 6×10<11>do 8×10<11>, između 7×10<11>do 9×10<11>, između 8×10<11>do 10×10<11>, između 1×10<12>do 3×10<12>, između 2×10<12>do 4×10<12>, između 3×10<12>do 5×10<12>, između 4×10<12>do 6×10<12>, između 5×10<12>do 7×10<12>, između 6×10<12>do 8×10<12>, između 7×10<12>do 9×10<12>, između 8×10<12>do 10×10<12>, između 1×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 10×10<13>, između 10<12>do 5×10<12>, između 5×10<12>do 1×10<13>, između 7×10<12>do 1×10<13>, između 8×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 2×10<13>, između 9×10<12>do 4×10<13>, između 1×10<13>do 3×10<13>, između 1×10<13>do 2×10<13>, između 2×10<13>do 3×10<13>, između 3×10<13>do 4×10<13>, između 4×10<13>do 5×10<13>, između 5×10<13>do 6×10<13>, između 6×10<13>do 7×10<13>, između 7×10<13>do 8×10<13>, između 8×10<13>do 9×10<13>, ili između 8×10<13>do 1×10<14>vektorskih genoma.
[0384] U nekim slučajevima, terapeutski efikasna količina farmaceutskih sastava otkrivenih ovde sastoji se od između 2E12 i 6E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od oko 1E12, 1,5E12, 2E12, 2,5E12, 3E12, 3,5E12, 4E12, 4,5E12, 5E12, 5,5E12, 6E12, 6,5E12, 7E12, 7,5E12, 8E12, 8,5E12, 9E12 ili 9,5E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od između 1E12 i 1,5E12, između 1,5E12 i 2E12, između 2E12 i 2,5E12, između 2,5E12 i 3,0E12, između 3,0E12 i 3,5E12, između 3,5E12 i 4,0E12, između 4,0E12 i 4,5E12, između 4,5E12 i 5,0E12, između 5,0E12 i 5,5E12, između 5,5E12 i 6,0E12, između 6,0E12 i 6,5E12, između 6,5E12 i 7,0E12, između 7,0E12 i 7,5E12, između 7,5E12 i 8,0E12, između 8,0E12 i 8,5E12, između 8,5E12 i 9,0E12, između 9,0E12 i 9,5E12, ili između 9,5E12 i 10E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza se sastoji od najmanje 1E12, 1,5E12, 2E12, 2,5E12, 3E12, 3,5E12, 4E12, 4,5E12, 5E12, 5,5E12, 6E12, 6,5E12, 7E12, 7,5E12, 8E12, 8,5E12, 9E12 ili 9,5E12 vektorskih genoma. U nekim slučajevima, jedinična doza ne sadrži više od 1E12, 1,5E12, 2E12, 2,5E12, 3E12, 3,5E12, 4E12, 4,5E12, 5E12, 5,5E12, 6E12, 6,5E12, 7E12, 7,5E12, 8E12, 8,5E12, 9E12, 9,5E12 ili 10E12 vektorskih genoma.
[0386] U nekim slučajevima, ukupna količina 7m8-aflibercepta ubrizgana u humanog pacijenta ili subjekta u periodu od 2 do 5 godina ili 5 do 10 godina nije veća od 10<10>do 10<13>, 10<10>do 10<11>, 10<11>do 10<12>, 10<12>do 10<13>, ili 10<13>do
[0387] 10<14>vektorskih genoma, ili ne veća od 1×10<10>do 2×10<10>, 2×10<10>do 4×10<10>, 3×10<10>do 5×10<10>, 4×10<10>do 6×10<10>, 5×10<10>do 7×10<10>, 6×10<10>do 8×10<10>, 7×10<10>do 9×10<10>, 8×10<10>do 10<11>, 1×10<11>do 2×10<11>, 2×10<11>do 4×10<11>, 3×10<11>do 5×10<11>, 4×10<11>do 6×10<11>, 5×10<11>do 7×10<11>, 6×10<11>do 8×10<11>, 7×10<11>do 9×10<11>, 8×10<11>do 10×10<11>, 1×10<12>do 3×10<12>, 2×10<12>do 4×10<12>, 3×10<12>do 5×10<12>, 4×10<12>do 6×10<12>, 5×10<12>do 7×10<12>, 6×10<12>do 8×10<12>, 7×10<12>do 9×10<12>,
[0390] 1
[0391] 8×10<12>do 10 ×10<12>, 1 × 10<13>do 5 ×10<13>, 5×10<13>do 10 ×10<13>, 1012 do 5 × 10<12>, 5×10<12>do 1 ×10<13>, 7 ×10<12>do 1 ×10<13>, 8 ×10<12>do 2 ×10<13>, 9 ×10<12>do 2×10<13>, 9×10<12>do 2×10<13>, 9×10<12>do 2×10<13>, 9×10<12>do 4×10<13>, 1×10<13>do 3×10<13>, 1×10<13>do 2×10<13>, 2×10<13>do 3×10<13>, 3×10<13>do 4×10<13>, 4×10<13>do 5×10<13>, 5×10<13>do 6×10<13>, 6×10<13>do 7×10<13>, 7×10<13>do 8×10<13>, 8×10<13>do 9×10<13>, ili 8×10<13>do 1×10<14>vektorskih genoma.
[0393] U nekim slučajevima, rAAV.7m8-aflibercept virion ili njegov farmaceutski sastav može se primeniti kao jedna doza ili jednokratna doza. U nekim slučajevima, može se koristiti više od jedne primene za postizanje željenog nivoa ekspresije gena tokom kontinuiranog perioda različitih intervala, npr. ne više od jednom u najmanje 2 godine, ili najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina. U nekim slučajevima, intravitrealna injekcija 7m8-aflibercepta sprečava potrebu pacijenta da primi injekciju aflibercept proteina najmanje 1 godinu, 1,5. godine ili najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ili više godina.
[0395] Primeri
[0397] Primer 1: Procena efikasnosti rAAV2.7m8-aflibercepta kod majmuna
[0398] Pretpostavljeno je da isporuka terapijskog transgena (ili korisnog tereta) u ciljne ćelije ili tkivo putem genske terapije u velikoj meri zavisi od AAV kapsidnih proteina i njihove uloge u ciljanju AAV virusa na relevantne ili ciljne ćelije kod primata ili ljudskog subjekta. Takođe je prijavljeno da varijanta 7m8 pokazuje povećanu infektivnost ili ciljanje ćelija mrežnjače kada se ubrizgava intravitrealno. Stoga bi se očekivalo da varijanta 7m8 funkcioniše na sličan način u ciljanju različitih terapijskih transgena na ćelije mrežnjače kada se ubrizgavaju intravitrealno.
[0400] Cilj: Za procenu efikasnosti rAAV2.7m8 koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept sa sekvencom rAAV2.7m8 koja se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira sVEGFR-1 nakon intravitrealne (IVT) primene svake genske terapije u dozi od 2 × 10<12>vg za inhibiciju razvoja horoidalne neovaskularizacije (CNV) izazvane laserskom fotokoagulacijom kod afričkih zelenih majmuna. Sekvenca nukleinskih kiselina sVEGFR-1 (takođe se naziva sFLT-1) je javno dostupna, npr. kao što je opisano u USA patentnoj publikaciji 2014/0371438.
[0403] 2
[0404] SL. 5 ilustruje sekvencu nukleinske kiseline aflibercepta. Slika 6 ilustruje sekvencu nukleinske kiseline sFLT-1 (SEQ ID NO: 3).
[0406] Model CNV lezija kod majmuna je opšte prihvaćen i široko korišćen standardni model primata za procenu potencijalne efikasnosti terapija za lečenje očnih bolesti povezanih sa neovaskularizacijom, kao što je vlažni AMD.
[0408] Majmuni su podvrgnuti osnovnom skriningu kako bi se procenilo očno i opšte zdravlje tonometrijom, biomikroskopijom sa procjepnom lampom, fundoskopijom, fotografijom fundusa u boji (CFP), fluorescentnom angiografijom (FA) i optičkom koherentnom tomografijom (OCT). Majmuni sa normalnim nalazima su uključeni u studiju i nasumično podeljeni u tri grupe za lečenje prema početnoj telesnoj težini i polu (Tabela 1). Atropin 1% oftalmološka mast je primenjena nakon početnog pregleda.
[0410] Kao što se ovde koristi, rAAV2.7m8-sVEGFR-1 se sastoji od rAAV2 koji se sastoji od umetanja 7m8 između pozicija 587 i 588 u kapsidnom proteinu VP1 rAAV2 i sekvence nukleinske kiseline koja kodira sVEGFR-1.
[0412] Tabela 1: Dodeljivanje lečenja
[0414]
[0415] Na dan ispitivanja 0, majmuni grupa 1-3 primili su intravitrealni (IVT) AAV2.7m8-aflibercept, vehikulu ili AAV2.7m8-sVEGFR-1 OU u skladu sa rasporedom lečenja (Tabela 1). Pre IVT doziranja primenjena je topikalna lokalna anestezija (0,5% proparakaina) i oči se mogu dezinfikovati 5% Betadinom i isprati sterilnim fiziološkim rastvorom. IVT injekcije su primenjene pomoću igle kalibra 31 0,5 inča postavljene 2 mm posteriorno u odnosu na limbus u donjem temporalnom kvadrantu, ciljajući centralni staklovinu.
[0417] 56. dana ispitivanja, majmuni grupe 4 primili su IVT aflibercept (EYLEA<®>, 30 µl od 40 mg/ml/oko) OU odmah nakon laserskog tretmana, nakon identičnih procedura za IVT ubrizgavanje kao kod grupa 1-3, sa izuzetkom smanjene zapremine ubrizgavanja (30 µl). IVT primena aflibercepta je klinički standard nege CNV-a i stoga se koristi kao pozitivna kontrola u ovoj studiji. Doza je prilagođena tako da primi relativno manju zapreminu staklastog tela kod afričkog zelenog majmuna (2,7 ml) u poređenju sa čovekom (4 ml).
[0419] Nakon svih IVT injekcija usledila je topikalna primena 0,3% ciprofloksacina, ili ekvivalentnog oftalmološkog rastvora antibiotika, i 1% masti atropin sulfata.
[0421] Na dan 56, CNV je indukovan između temporalnih vaskularnih arkada laserskim opekotinama. Devet laserskih tačaka je simetrično postavljeno u svako oko od strane oftalmologa koji koristi Iridex Oculight TX 532 nm laser sa trajanjem lasera od 100 ms, veličina tačke 50 µm, snaga 750 mW. Laserske tačke su primenjene pomoću kontaktnog laserskog sočiva od 0,9x. Ciljnu lokaciju laserskih tačaka je mapirao obučeni oftalmolog na slikama fundusa u boji dobijenim pre laserskog tretmana (i nakon postavljanja blebetanja) za referencu tokom postavljanja laserske tačke. Fotografija fundusa u boji je urađena odmah nakon laserskog tretmana kako bi se dokumentovale laserske lezije. Sve tačke koje pokazuju ozbiljno retinalno/subretinalno krvarenje odmah nakon lasera isključene su iz analiza. SL. 1 ilustruje primer fotografije fundusa oka ne-ljudskog primata nakon indukcije CNV lezija laserskim zračenjem bez tretmana.
[0423] Bilateralne slike fundusa mrežnjače u boji snimljene su sa 50 stepeni pogleda usmerenim na foveu pomoću Topcon TRC-50EX retinalne kamere sa
[0426] 4
[0427] Canon 6D hardverom za digitalno snimanje i softverom New Vision Fundus Image Analysis System. FA je izvršena uz intravensku primenu 0,1 ml/kg 10% natrijum fluoresceina. Curenje fluoresceina u angiogramima CNV lezija je klasifikovano I-IV (Tabela 2) od strane maskiranog oftalmologa koji procenjuje kompozite nastale nakon ujednačenog prilagođavanja intenziteta slike. Procena ocenjivanja lezija potvrđena je na slikama fundusa od strane još dva obučena oftalmologa. Analiza denzitometrije fluorescencije slike neobrađenih angiograma u kasnoj fazi takođe se može izvršiti pomoću softvera ImageJ.
[0429] Tabela 2: Laserske skale za ocenjivanje lezija
[0432]
[0435] Subjekti su procenjivani dva puta dnevno za opšte blagostanje. Detaljna osmatranja vršena su jednom nedeljno. Telesna težina je dobijena u vreme početnog skrininga i svake dve nedelje tokom in-life studije.
[0437] Sve životinje su eutanazirane pentobarbitalom nakon potvrde kvaliteta snimanja fundusa 85. dana ili ubrzo nakon toga, do pregleda slika. Životinje su eutanazirane pentobarbitalom i enukleiranim kuglama. Višak orbitalnog tkiva je obrezan i oba OD i OS globusa su brzo zamrznuta u tečnom azotu, a zatim secirana duž smrznutih ravni tkiva na sobnoj temperaturi kako bi se izolovali staklovina i mrežnjača sa horoidalnim podtkivima. Nakon prikupljanja staklastog, iz makule i gornjeg, donjeg, temporalnog i nazalnog regiona uzeti su uzorci neuralne mrežnjače sa RPE/horoidom od 5 mm. Mrežnjača sa osnovnim RPE/horoidalnim tkivima iz svakog zumbalice je prebačena u prethodno tared označene kriotubes, i izmerena i brzo zamrznuta u tečnom azotu. Pre i nakon prikupljanja biopsija uzoraka, snimljena je fotografija ravne mrežnjače sa naznakom orijentacije kako bi se dokumentovali regioni iz kojih su prikupljenog uzorka.
[0439] Statističke metode: Fišerov egzaktni test je korišćen za procenu incidence različitih stepena lezija. Dvosmerna ANOVA sa ponovljenim merama praćena Tukey-Kramer testom ili kontrastnom procedurom korišćena je za analizu podataka CNV kompleksa OCT i denzitometrije slike angiograma. Neparametrijski testovi su primenjeni ako podaci nisu normalno distribuirani i imaju nejednaku varijansu. P vrednost od 0,05 ili manje smatrala se statistički značajnom.
[0441] CNV lezije su indukovane laserskim zračenjem odmah nakon ubrizgavanja kod svake grupe subjekata (majmuna), a fotografija fundusa u boji je korišćena za ocenjivanje svake lezije na skali I-IV. SL.2 ilustruje primer fotografije fundusa koja se koristi za procenu lezija majmuna 70. dana nakon tretmana ili AAV2.7m8-afliberceptom ili kontrolom vehikule intravitrealno u dozi od 2,1 × 10<12>vg. Majmun tretiran AAV2.7m8-afliberceptom pokazao je lezije II i III stepena i nije imao lezije IV stepena, dok je majmun tretiran kontrolom vehikule pokazao više lezija IV stepena. Slični podaci od više majmuna su objedinjeni i ucrtani za kvantitativnu analizu za svaku ispitnu grupu opisanu u nastavku (SL.3 i 4).
[0443] SL. 3 ilustruje grafikon procenta lezija stadijuma IV 14. i 28. dana majmuna grupe 4 koji su intravitrealno ubrizgani sa EYLEA<®>ili kao pozitivna kontrola (ili aflibercept fuzioni protein bez pristupa genske terapije) ili kao kontrola vehikule koja se sastoji samo od pufera za formulaciju.30 µl od 40 mg/ml/oka EYLEA<®>OU je primenjen odmah nakon laserskog zračenja, nakon identičnih procedura IVT ubrizgavanja kao što je korišćeno za grupe 1-3 (Tabela 1) sa izuzetkom smanjene zapremine injekcije (30 µl) za smeštaj relativno manje zapremine stakla kod afričkog zelenog majmuna (2,7 ml) u poređenju sa čovekom (4 ml). IVT primena leka EYLEA<®>je klinički standard nege CNV-a i stoga se koristi kao pozitivna kontrola u ovoj studiji. Podaci od više majmuna su prosečni i ucrtani za kvantitativnu analizu. Životinje tretirane intravitrealnom injekcijom leka EYLEA<®>pokazale su značajno smanjenje količine lezija IV stepena u poređenju sa primenom same vehikule intravitrealnom injekcijom, mereno slikama fundusa prikupljenim 14. i 28. dana nakon injekcije.
[0445] SL. 4 ilustruje grafikon procenta lezija IV stepena 14. i 28. dana majmuna (grupe 1-3 u Tabeli 1) koji su intravitrealno ubrizgani ili rAAV2.7m8-aflibercept (što je genska terapija koja obuhvata rAAV2 sa 7m8 varijantom kapsidnog proteina i sekvencom nukleinske kiseline aflibercepta); ili AAV2.7m8-sVEGFR-1 (što je genska terapija koja se sastoji od rAAV2 sa kapsidnim proteinom varijante 7m8 i sekvencom nukleinske kiseline sVEGFR-1), svaka u dozi od 2,1 × 10<12>vg, ili kontrola vehikule koja se sastoji samo od pufera za formulaciju. CNV lezije su izazvane laserskim zračenjem, a fotografija fundusa u boji je korišćena za ocenjivanje svake lezije na skali I-IV. Zatim su objedinjena i ucrtana merenja procenta lezija IV stepena. Majmuni tretirani intravitrealnom injekcijom rAAV2.7m8-aflibercepta pokazali su značajno smanjenje količine lezija IV stepena u poređenju sa samom kontrolom vehikule za slike fundusa prikupljene 14. i 28. dana. Nasuprot tome, i neočekivano, majmuni tretirani intravitrealnom injekcijom rAAV2.7m8-sVEGFR-1 pokazali su malo ili nikakvo smanjenje lezija CNV stadijuma IV u poređenju sa kontrolom vehikule. Ovi podaci sugerišu da varijacija kapside i/ili put primene možda neće delovati na sve transgene, što je u suprotnosti sa onim što su mnogi ranije mislili, i da svojstva transgena mogu igrati značajnu ulogu u efikasnosti terapije AAV genima. Takvi in vivo podaci kod majmuna takođe su ilustrovali da je lečenje primata rAAV2.7m8-afliberceptom dovelo do manje lezija IV stepena u poređenju sa majmunima koji su primili samo kontrolu vehikule, što ukazuje na to da rAAV2.7m8-aflibercept može biti održiva opcija genske terapije za ljude.
[0447] Ove in vivo studije rAAV2.7m8-aflibercepta pokazale su da rAAV2 koji se sastoji od kapsidnog proteina varijante 7m8 može biti efikasan kao genska terapija za isporuku sekvence nukleinske kiseline koja kodira aflibercept u ćelije mrežnjače subjekta intravitrealnom injekcijom i rezultira ekspresijom aktivnog aflibercepta in vivo tako da vrši terapijski efekat, tj. smanjenje CNV lezija, na nivoima koji su slični terapijskom efektu pozitivne kontrole EYLEA<®>.

Claims (15)

1. PATENTNI ZAHTEVI
1. Farmaceutski sastav, koji sadrži:
(a) varijantu rAAV2 koja sadrži sekvence aminokiselina LGETTRP umetnute između pozicija 587 i 588 kapsidnog proteina VP1 i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima najmanje 95% homologije sa afliberceptom pod transkripcionom kontrolom promotera citomegalovirusa (CMV), i
(b) farmaceutski prihvatljivu pomoćnu supstancu;
za upotrebu u metodi lečenja stanja ili bolesti oka, metoda sadrži primenu jedinične doze farmaceutskog sastava intravitrealnom injekcijom u oko primata kome je to potrebno.
2. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je stanje ili bolest oka neovaskularna (vlažna) starosna makularna degeneracija (AMD), makularni edem nakon okluzije retinalne vene, dijabetički makularni edem (DME) ili dijabetička retinopatija povezana sa DME.
3. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je stanje ili bolest oka horoidalna neovaskularizacija ili vlažna AMD.
4. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu polipeptid kodiran nukleinskom kiselinom sadrži sekvencu koja ima 100% homologiju sa afliberceptom.
5. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je jedinična doza: (a) između vektorskih genoma 1E12 i 1E13; (b) između vektorskih genoma 2E12 i 6E12; (c) između vektorskih genoma 1E9 i 3E13, (d) između vektorskih genoma 1E10 i 3E12, ili (e) između vektorskih genoma 1E8 i 3E14.
6. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je jedinična doza: (a) u zapremini koja nije veća od 100 µl; ili (b) u zapremini koja nije veća od 50 µl.
7. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je subjekt ljudsko biće.
8. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu subjekt reaguje na aflibercept.
9. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je subjekt prethodno tretiran afliberceptom.
10. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se primena intravitrealnom injekcijom javlja ne više od jednom u najmanje 2 godine.
11. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu se primena intravitrealnom injekcijom javlja ne više od jednom u najmanje 5 godina.
12. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, pri čemu je davanje intravitrealnom injekcijom jednokratna primena.
13. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je farmaceutski sastav suspenzija.
14. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, koji dalje sadrži mešanje suspenzije kako bi se osigurala ravnomerna raspodela suspenzije pre koraka primene.
15. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji dalje sadrži zagrevanje farmaceutskog sastava na sobnu temperaturu pre koraka primene.
RS20251055A 2016-06-16 2017-06-16 Lečenje amd-a korišćenjem aav2 varijante sa afliberceptom RS67328B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662351234P 2016-06-16 2016-06-16
EP20196657.9A EP3795181B1 (en) 2016-06-16 2017-06-16 Treatment of amd using aav2 variant with aflibercept

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67328B1 true RS67328B1 (sr) 2025-11-28

Family

ID=60663653

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251055A RS67328B1 (sr) 2016-06-16 2017-06-16 Lečenje amd-a korišćenjem aav2 varijante sa afliberceptom
RS20201517A RS61311B1 (sr) 2016-06-16 2017-06-16 Lečenje amd korišćenjem varijante aav2 sa afliberceptom

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201517A RS61311B1 (sr) 2016-06-16 2017-06-16 Lečenje amd korišćenjem varijante aav2 sa afliberceptom

Country Status (25)

Country Link
US (2) US20190151409A1 (sr)
EP (3) EP3471780B1 (sr)
JP (5) JP6814822B2 (sr)
KR (2) KR102218265B1 (sr)
CN (2) CN109641065A (sr)
AU (3) AU2017286673B2 (sr)
BR (1) BR112018076124A2 (sr)
CA (1) CA3027737A1 (sr)
CY (1) CY1123697T1 (sr)
DK (2) DK3471780T3 (sr)
ES (2) ES2840059T3 (sr)
FI (1) FI3795181T3 (sr)
HR (2) HRP20251248T1 (sr)
HU (1) HUE051953T2 (sr)
IL (3) IL279919B2 (sr)
LT (2) LT3471780T (sr)
MX (2) MX391779B (sr)
PL (1) PL3795181T3 (sr)
PT (2) PT3471780T (sr)
RS (2) RS67328B1 (sr)
SG (1) SG11201811232XA (sr)
SI (2) SI3471780T1 (sr)
SM (2) SMT202500400T1 (sr)
WO (1) WO2017218974A2 (sr)
ZA (1) ZA201808538B (sr)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3800191B1 (en) 2014-03-17 2025-08-20 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
US11021519B2 (en) 2015-03-02 2021-06-01 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
ES2840059T3 (es) * 2016-06-16 2021-07-06 Adverum Biotechnologies Inc Tratamiento de la DMRE mediante el uso de la variante AAV2 con aflibercept
CA3040179A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
EP4653536A3 (en) 2017-03-17 2026-02-25 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression
CN107661492A (zh) * 2017-08-31 2018-02-06 中山大学中山眼科中心 Vegf‑b的新用途
CN107537026A (zh) * 2017-08-31 2018-01-05 中山大学中山眼科中心 Vegf‑b的应用
AU2018350990A1 (en) * 2017-10-18 2020-05-21 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified VEGF-Trap
CN111770999A (zh) * 2017-11-27 2020-10-13 4D分子治疗有限公司 腺相关病毒变体衣壳和用于抑制血管生成的应用
EP3727468A4 (en) 2017-12-19 2021-09-22 Akouos, Inc. AAV-MEDIATED THERAPEUTIC ANTIBODIES DELIVERY TO THE INTERNAL EAR
US20210154270A1 (en) * 2018-04-12 2021-05-27 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Anti-aging compositions and methods of use
DK4364724T3 (da) 2018-05-10 2025-12-22 Regeneron Pharma Formuleringer med høj koncentration af VEGF-receptorfusionsprotein
JP7597380B2 (ja) * 2019-03-04 2024-12-10 アドヴェラム バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド 対側眼へのａａｖ遺伝子治療の逐次的硝子体内投与
WO2020219868A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Regenxbio Inc. Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics
EP3886946A1 (en) 2019-06-05 2021-10-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Devices and methods for precision dose delivery
HRP20260137T1 (hr) * 2019-09-11 2026-03-13 Adverum Biotechnologies, Inc. Liječenje očnih neovaskularnih bolesti upotrebom aav2 varijanti koje kodiraju aflibercept
CA3147843A1 (en) * 2019-09-11 2021-03-18 Mehdi Gasmi Methods of treating ocular neovascular diseases using aav2 variants encoding aflibercept
TWI819268B (zh) 2020-01-16 2023-10-21 詹姆斯 Ｗ 希爾 藉由基因轉導改變眼睛顏色
FR3111913A1 (fr) * 2020-06-30 2021-12-31 Eyevensys Construction d’adn pour le traitement de pathologies oculaires
JP7842082B2 (ja) * 2020-07-21 2026-04-07 エフティージェン コーポレーション 眼疾患を処置するための組成物および方法
CN113952474A (zh) * 2020-07-21 2022-01-21 英斯培瑞有限公司 用于治疗眼部疾病的组合物和方法
CN113952473A (zh) * 2020-07-21 2022-01-21 英斯培瑞有限公司 用于治疗眼部疾病的组合物和方法
CN113817775B (zh) * 2020-08-25 2023-02-17 南京吉迈生物技术有限公司 修饰的阿柏西普、组合物、方法及其在基因治疗中的应用
CA3192736A1 (en) * 2020-09-03 2022-03-10 University Of Massachusetts Adeno-associated virus for delivery of kh902 (conbercept) and uses thereof
IL303317A (en) 2020-12-01 2023-07-01 Akouos Inc ANTI-NATURAL ANTIBODY STRUCTURES AND RELATED METHODS FOR THE TREATMENT OF SYMPTOMS ASSOCIATED WITH VESTIBULAR SWANNOMA
JP2021049374A (ja) * 2020-12-09 2021-04-01 株式会社三洋物産 遊技機
BR112023019056A2 (pt) * 2021-04-27 2024-01-16 Adverum Biotechnologies Inc Métodos para tratar doenças oculares usando variantes de aav2 que codificam aflibercepte
AU2023220237A1 (en) 2022-02-21 2024-08-15 Shanghai Regenelead Therapies Co., Ltd Vegf-binding molecule and pharmaceutical use thereof
USD1120314S1 (en) 2022-11-30 2026-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dose delivery device
TW202508610A (zh) 2023-08-23 2025-03-01 大陸商上海瑞宏迪醫藥有限公司 醫藥組成物及其用途
WO2025072688A2 (en) * 2023-09-27 2025-04-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Adeno-associated virus vectors for nucleic acid delivery to retinal cells, for nucleic acid delivery across retinal regions, or for nucleic acid delivery to retinal ganglion cells and/or retinal pigment epithelium cells
WO2025073297A1 (zh) * 2023-10-06 2025-04-10 甘李药业股份有限公司 表达抗vegf融合蛋白的aav病毒载体及其用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755044A (zh) * 2011-04-22 2016-07-13 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体及其使用方法
ES2753135T3 (es) * 2012-05-07 2020-04-07 Allergan Inc Método de tratamiento de DMAE en pacientes resistentes a terapia anti-VEGF
TWI698240B (zh) * 2012-05-15 2020-07-11 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
WO2013188316A1 (en) * 2012-06-11 2013-12-19 Avalanche Biotechnologies, Inc. Optical regulation of gene expression in the retina
DK4374873T3 (da) * 2013-07-12 2025-11-03 Astellas Us Llc Middel til brug ved behandling eller forebyggelse af oftalmologiske tilstande
CA2926853C (en) * 2013-10-18 2022-04-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of a vegf antagonist and an anti-ctla-4 antibody
US11021519B2 (en) * 2015-03-02 2021-06-01 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
ES2840059T3 (es) * 2016-06-16 2021-07-06 Adverum Biotechnologies Inc Tratamiento de la DMRE mediante el uso de la variante AAV2 con aflibercept

Also Published As

Publication number Publication date
CN117531025A (zh) 2024-02-09
EP3795181A1 (en) 2021-03-24
AU2021225178A1 (en) 2021-09-30
IL314568A (en) 2024-09-01
AU2021225178B2 (en) 2025-01-30
IL263686B (en) 2021-02-28
PT3795181T (pt) 2025-11-05
DK3795181T3 (da) 2025-10-13
DK3471780T3 (da) 2020-11-23
JP2022137244A (ja) 2022-09-21
PT3471780T (pt) 2020-12-17
IL279919B2 (en) 2025-01-01
ES2840059T3 (es) 2021-07-06
IL314568B1 (en) 2025-05-01
JP2020203941A (ja) 2020-12-24
US20190151409A1 (en) 2019-05-23
HUE051953T2 (hu) 2021-04-28
BR112018076124A2 (pt) 2019-03-26
EP3471780A2 (en) 2019-04-24
EP3471780A4 (en) 2019-04-24
MX2018015512A (es) 2019-04-24
CY1123697T1 (el) 2022-03-24
IL263686A (en) 2019-01-31
IL279919A (en) 2021-03-01
KR20190037228A (ko) 2019-04-05
CN109641065A (zh) 2019-04-16
FI3795181T3 (fi) 2025-10-14
SI3795181T1 (sl) 2025-11-28
KR20210021113A (ko) 2021-02-24
WO2017218974A3 (en) 2018-01-25
EP4671369A3 (en) 2026-03-18
JP2025186377A (ja) 2025-12-23
LT3471780T (lt) 2021-01-25
SMT202500400T1 (it) 2025-11-10
SMT202100010T1 (it) 2021-03-15
ES3049818T3 (en) 2025-12-18
AU2017286673B2 (en) 2021-06-24
WO2017218974A2 (en) 2017-12-21
EP4671369A2 (en) 2025-12-31
SI3471780T1 (sl) 2021-03-31
ZA201808538B (en) 2021-04-28
IL279919B1 (en) 2024-09-01
HRP20251248T1 (hr) 2026-01-16
JP6814822B2 (ja) 2021-01-20
EP3795181B1 (en) 2025-08-06
IL314568B2 (en) 2025-09-01
JP2024113193A (ja) 2024-08-21
JP2019521990A (ja) 2019-08-08
AU2025202930A1 (en) 2025-05-15
US20220265740A1 (en) 2022-08-25
MX2022004786A (es) 2022-05-16
CA3027737A1 (en) 2017-12-21
MX391779B (es) 2025-03-21
RS61311B1 (sr) 2021-02-26
HRP20201842T1 (hr) 2021-04-16
SG11201811232XA (en) 2019-01-30
AU2017286673A1 (en) 2019-01-31
LT3795181T (lt) 2025-12-29
PL3795181T3 (pl) 2025-12-22
KR102218265B1 (ko) 2021-02-25
EP3471780B1 (en) 2020-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021225178B2 (en) Treatment of AMD using AAV2 variant with aflibercept
US20230322911A1 (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
HK40049262B (en) Treatment of amd using aav2 variant with aflibercept
HK40049262A (en) Treatment of amd using aav2 variant with aflibercept
HK40115902A (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
HK40082757B (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
HK40008119A (en) Treatment of amd using aav2 variant with aflibercept
HK40008119B (en) Treatment of amd using aav2 variant with aflibercept
HK40007499A (en) Treatment of amd using aav2 variant with aflibercept
HK40008120B (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization
HK40008120A (en) Compositions and methods for reducing ocular neovascularization