RS67450B1 - Upotreba mišolikih sisara koji proizvode antitela za generisanje visokoafinitetnih antitela - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST TEHNIKE

[0005] Pronalazak se odnosi na upotrebu transgenih mišolikih sisara za proizvodnju visokoafinitetnih antitela, koja se eksprimiraju iz bar delimično egzogenih nukleinskih kiselina (transgena). Objavljeni su transgeni za proizvodnju takvih transgenih mišolikih sisara i postupci za prozvodnju takvih heterolognih antitela; postupci i vektori za proizvodnju takvih transgenih mišolikih sisara. Predmetni pronalazak definisan je priloženim patentnim zahtevima.

[0007] OSNOV PRONALASKA

[0009] B ćelije posreduju humoralnu imunost proizvodnjom specifičnih antitela. Osnovna strukturna podjedinica antitela (antibody, Ab) je molekul imunoglobulina (immunoglobulin, Ig). Ig molekuli sastoje se od kompleksa dva identična teška (heavy, H) i dva identična laka (light, L) polipeptidna lanca. Na amino-kraju svakog H lanca i L lanca je region koji varira u aminokiselinskoj sekvenci, nazvan varijabilni (variable, V) region. Preostali deo H i L lanaca relativno je konstantne aminokiselinske sekvence i nazvan je konstantni (constant, C) region. U Ig molekulu, V regioni H i L lanca (VH i VL) su jukstapozicionirani da bi formirali potencijalno antigen-vezujuće mesto. Geni koji kodiraju V regione H i L lanca asamblirani su somatski od segmenata DNK germinativne linije, tokom diferencijacije prekursora B (pre-B) ćelija: V, D i J genski segmenti za H lanac i V i J genski segmenti za L lanac. Unutar Ig V regiona su tri regiona najveće varijabilnosti aminokiselinske sekvence, koja interaguju da bi formirala antigen-prepoznavajuće mesto i označavaju se, prema tome, kao regioni koji određuju komplementarnost (complementarity determining regions, CDR).

[0010] V genski segment kodira najveći deo domena V regiona, uključujući CDR1 i CDR2. Raznolikost CDR1 i CDR2 proizlazi iz heterogenosti sekvenci između više različitih V segmenata kodiranih germinativnom linijom. CDR3 je kodiran sekvencama koje se formiraju spajanjem V, D i J genskih segmenata H lanca i V i J segmenata L lanca i mehanizmima koji kreiraju heterogenost nukleotidne sekvence tamo gde se ti segmenti kombinuju. Dodatna raznolikost može se izvesti iz sparivanj različitih V regiona H i L lanca. Zajedno, ovi procesi daju primarni repertoar antitela kodiranih genskim segmentima germinativne linije i eksprimiranih od strane novoformiramih B ćelija.

[0011] Dodatni izvor raznolikosti antitela nameće se povrh raznolikosti generisane rekombinacijom Ig genskih segmenata,. U V regione antitela koja eksprimiraju, B ćelije mogu uvesti mutacije, što je proces koji se naziva somatska hipermutacija. Prema tome, kada se životinja prvi put susretne sa antigenom, antigen se vezuje za specifičnu B ćeliju za koju se ispostavi da nosi antitela sa V domenom koji se vezuje za taj antigen. Ovaj primarni odgovor može aktivirati tu B ćeliju da nastavi da sekretuje odgovarajuće antitelo. Ove aktivirane B ćelije sada mogu takođe usmeriti proces somatskih mutacija ka svojim rearanžiranim genskim segmentima antitela i time omogućiti proizvodnju ćerki-ćelija koje stvaraju varijante antitela primarnog odgovora. Proces selekcije amplifikuje one varijante potomaka B ćelija koje stvaraju antitelo sa poboljšanim afinitetom za antigen. U B ćelijama, somatske hipermutacije usmerene su ka ograničenom regionu genoma koji uključuje rearanžirane VH i VL gene. Prema tome, somatska mutacija omogućava afinitetno sazrevanje - proizvodnju i selekciju visokoafinitetnih antitela. Somatska mutacija je stoga važna za generisanje visokoafinitetnih antitela.

[0012] Izuzetna specifičnost i visoki afinitet antitela i otkriće tehnologije hibridoma koja omogućava generisanje monoklonskih antitela (monoclonal antibodies, mAb) stvorili su velika očekivanja od njihove upotrebe kao ciljajućih terapeutika za oboljenja kod ljudi. MAb su identična jer ih proizvodi jedna B ćelija i njeno potomstvo. MAb se izrađuju fuzionisanjem ćelija slezine miša imunizovanog željenim antigenom sa ćelijama mijeloma, kako bi se generisali imortalizovani hibridomi. Jedna od glavnih prepreka sa kojima se suočava razvoj in vivo primene mAb kod ljudi je intrinzična imunogenost nehumanih Ig. Na terapijske doze mišjih mAb pacijenti odgovaraju stvaranjem antitela protiv mišjih Ig sekvenci (humana antimišja antitela, human anti mouse antibodies; HAMA), koja izazivaju akutnu toksičnost, menjaju njihovu biodistribuciju i ubrzavaju klirens, smanjujući time efikasnost kasnijih primena (Mirick, et al., (2004) Q. Nucl. Med. Mol. Imaging 48, 251‑257).

[0013] Da bi se zaobišlo generisanje HAMA, razvijeni su postupci humanizacije antitela, u pokušaju da se proizvedu mAb sa smanjenom imunogenošću kada se primenjuju kod ljudi. Ti napori doveli su do različitih pristupa baziranih na rekombinantnoj DNK, čiji je cilj bio da se poveća sadržaj humanih aminokiselinskih sekvenci u mAb, uz zadržavanje specifičnosti i afiniteta roditeljskog nehumanog antitela. Humanizacija je počela konstruisanjem himernih miš-čovek mAb (Morrison, S. L., et al., (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 6851‑5), u kojima su Ig C regioni u mišjim mAb bili zamenjeni humanim C regionima. Himerna mAb sadrže 60-70% humanih aminokiselinskih sekvenci i znatno su manje imunogena od svojih mišjih parnjaka, kada se injektiraju kod ljudi, iako se i dalje zapaža odgovor ljudi protiv himernih antitela (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3-10).

[0014] U pokušajima daljnje humanizacije mišjih mAb, razvijeno je kalemljenje CDR. Kod kalemljenja CDR, mišja antitela humanizuju se kalemljenjem njihovih CDR na VL i VH okvire humanih Ig molekula, uz zadržavanje onih rezidua mišjeg okvira koje se smatraju bitnim za specifičnost i afinitet (Jones, P.T., et al., (1986). Nature, 321, 522). Ukupno uzevši, antitela sa kalemljenim CDR sastoje se od preko 80% humanih aminokiselinskih sekvenci (Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 10029; Carter, P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 4285). Uprkos ovim naporima, pokazalo se da humanizovana antitela sa kalemljenim CDR i dalje pobuđuju odgovor antitela protiv kalemljenog V regiona (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3).

[0015] Posle kalemljenja CDR, razvijeni su postupci humanizacije zasnovani na različitim paradigmama kao što su modifikovanje površine (Padlan, E. A., et al., (1991). Mol. Immunol., 28, 489), superhumanizacija (Tan, P., D. A., et al., (2002) J. Immunol., 169, 1119), optimizacija sadržaja humanog niza (Lazar, G. A., et al., (2007). Mol. Immunol., 44, 1986) i humaneering, u pokušaju daljnjeg smanjenja sadržaja nehumanih sekvenci u terapijskim mAb (Almagro, J. C., et al., (2008). Frontiers in Bioscience 13, 1619). Kao i u pristupima kalemljenja CDR, ovi postupci počivaju na analizama strukture antitela i upoređivanju sekvenci nehumanih i humanih mAb, u cilju evaluacije uticaja procesa humanizacije na imugenost konačnog proizvoda. Kada se upoređuje imunogenost himernih i humanizovanih antitela, izgleda da humanizacija varijabilnih regiona dodatno smanjuje imunogenost (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3‑10).

[0016] Deimunizacija je još jedan pristup koji je razvijen za smanjenje imunogenosti himernih ili mišjih antitela. Uključuje identifikaciju linearnih T-ćelijskih epitopa u antitelu od interesa, uz korišćenje bioinformatike i zatim, pomoću usmerene mutageneze, njihovu zamenu humanim ili neimunogenim sekvencama (WO09852976A1). Iako su deimunizovana antitela pokazala smanjenu imunogenost kod primata u poređenju sa svojim himernim parnjacima, uočen je određeni gubitak vezujućeg afiniteta (Jain, M., et al., (2007). Trends in Biotechnol. 25, 307).

[0017] Razvoj tehnologije prikazivanja na fagima dopunio je i proširio pristupe humanizacije u pokušajima dobijanja manje imunogenih mAb za lečenje ljudi. Kod prikazivanja na fagima, velike kolekcije ('biblioteke') VH i VL regiona humanih antitela eksprimiraju se na površini čestica filamentoznih bakteriofaga. Iz tih biblioteka, samo neki fagi selektuju se kroz vezujuće interakcije sa antigenom; rastvorljivi fragmenti antitela eksprimiraju se iz inficiranih bakterija i afinitet vezivanja odabranih antitela poboljšava se mutacijom (Winter, G., et al. (1994). Annu. Rev. Immunol. 12, 433). Proces imitira imunsku selekciju, a antitela sa mnogo različitih vezujućih specifičnosti izoluju se korišćenjem ovog pristupa (Hoogenboom, H. R., et al. (2005).

[0018] Nat. Biotechnol., 23, 1105). Različiti izvori V regiona H i L lanca korišćeni su za konstruisanje biblioteka prikazivanja na fagima, uključujući one izolovane od neimunih ili imunih donora. Pored toga, biblioteke prikazivanja na fagima konstruisane su od V regiona koji sadrže veštački randomizovane sintetske CDR regione kako bi se stvorila dodatna raznolikost. Antitela dobjena iz biblioteka prikazivanja na fagima često se izlažu in vitro afinitetnom sazrevanju kako bi se dobila visokoafinitetna antitela (Hoogenboom, H. R., et al. (2005). Nat. Biotechnol., 23, 1105).

[0019] Stvaranje transgenih sojeva miševa koji proizvode humana antitela, uz odsustvo antitela miša, obezbedilo je još jednu tehnološku platformu za generisanje specifičnih i visokoafinitetnih humanih mAb za primenu kod ljudi. Kod ovih transgenih životinja, endogena mašinerija za antitela miša je inaktivirana i zamenjena je humanim Ig lokusima kako bi se humani humoralni imunski sistem suštinski reprodukovao u miševima (Jakobovits, A., et al. (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134. Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 1117). U ovim miševima, verno se reprodukuju razvijanje B ćelija kao i diverzifikacija Ig rekombinacijom genskih segmenata, dovodeći do raznolikog repertoara mišjih B ćelija koje eksprimiraju humane Ig. Imunizacijom ovih miševa antigenima, pokazano je još i to da su te transgene životinje akumulirale somatske mutacije u V regionima i teških i lakih lanaca da bi proizvele visokoafinitetna humana mAb široke raznolikosti (Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 1117).

[0020] Na pitanje da li su "potpuno humana" mAb, poput onih koja su dobijena iz biblioteka prikazivanja na fagima ili transgenih miševa, manje imunogena nego humanizovana mAb, još se ne može odgovoriti, jer su potpuni podaci o imunogenosti dostupni samo za dva humana mAb. mAb protiv faktora nekroze tumora, razvijeno iz humanih biblioteka prikazivanja na fagima, izazvalo je odgovore antitela kod 12% pacijenata - što je na gornjoj granici incidence odgovora na antitela za humanizovana antitela (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3‑10).

[0021] Evaluacija imunogenosti prvog registrovanog humanog mAb generisanog transgenim pristupom pokazala je da lečenje mAb rezultuje generisanjem antitela kod približno 5.5% lečenih pacijenata sa kancerom (Jakobovits, A., et al. (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134., Lofgren, J. A., et al. (2007). J. Immunol. 178, 7467).

[0022] EP0814159 objavljuje teorijski eksperiment za proizvodnju transgenog miša za proizvodnju antitela koje sadrži rearanžirani humani V domen povezan sa konstantnim domenom humanog lakog lanca. Transgeni miševi nisu bili proizvedeni.

[0023] [0015] Prema tome, i dalje postoji potreba za postupkom i načinom proizvodnje antitela koja su specifična za svoje ciljeve, ali su manje imunogena. Kao što je ovde opisano, smanjenje imunogenosti se bar delimično postiže obezbeđivanjem transgenog mišolikog sisara koji sadrži, bar u svojoj B-ćelijskoj liniji, nukleinsku kiselinu koja kodira bar laki lanac imunoglobulina, pri čemu je kodirajuća sekvenca lakog lanca obezbeđena na način koji ga čini rezistentnim na rearanžmane DNK i/ili somatske hipermutacije, poželjno je da je takav mišoliki sisar glodar, tačnije miš. Nukleinska kiselina kodira rearanžirani humani VL region humanog imunoglobulina.

[0025] KRATAK OPIS PRONALASKA

[0027] Prema patentnim zahtevima, predmetni pronalazak odnosi se na upotrebu transgenog mišolikog sisara koji u svom genomu sadrži integrisanu rearanžiranu nukleinsku kiselinu koja kodira rearanžirani varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina, pri čemu je navedeni varijabilni region lakog lanca sposoban da se sparuje sa najmanje dva različita teška lanca kodirana od strane mišolikog sisara, tako da se raznovrsnost u specifičnosti antitela zadržava kroz rearanžmane i hipermutacije u teškim lancima, za generisanje visokoafinitetnih antitela koja sadrže navedeni rearanžirani varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina, pri čemu su antitela kodirana VH genima koji su prošli somatsku hipermutaciju posle imunizacije, i nemutiranim rearanžiranim humanim VL genom integrisanim u genom.

[0029] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0031] U preostalom delu specifikacije, kao primeri mišolikih sisara obično se koriste miševi. Transgeni mišoliki domaćini sposobni su da uspostave imunski odgovor na antigen, pri čemu odgovor proizvodi antitela koja imaju varijabilne regione humanog lakog lanca. Miševi su korišćeni za proizvodnju B-limfocita za imortalizaciju radi proizvodnje antitela. Pošto je sa miševima lako rukovati, mogu se gajiti u velikom broju i poznato je da imaju opsežan imunski repertoar, miševi će obično biti životinje izbora. Prema tome, razmatranje koje sledi odnosiće se na miševe, ali opisano je da treba razumeti da druge mišolike životinje mogu lako zameniti miševe, uz praćenje istih procedura

[0032] Razlog za prevenciju rearanžmana i hipermutacije je što se na taj način neimunogeni polipeptid može odabrati unapred znajući da će taj polipeptidni lanac ostati neimunogen. Stoga je bar laki lanac rezultujućeg imunoglobulina manje imunogen. Rezultujuće antitelo treba da ima (obično) i laki i teški lanac. Neimunogeni lanac dakle mora biti sposoban za sparivanje sa drugim lancem. Drugi lanac može biti endogeni lanac, egzogeni lanac ili hibrid ta dva. Za lečenje ljudi, neimunogeni lanac treba da bude što sličniji humanom.

[0033] Način da se gen koji kodira imunoglobulinski lanac (ili lance) učini rezistentnim na rearanžman i/ili mutaciju DNK je naravno uklanjanje svih genetičkih elemenata odgovornih za navedeni rearanžman i/ili mutaciju. Nedostatak toga je što se eliminiše varijabilnost dvaju lanaca, dok mišoliki sisar korišćen u skladu sa pronalaskom zadržava varijabilnost teškog lanca i inhibira i/ili prevenira rearanžman-mutaciju lakog lanca.

[0034] Elementi za rearanžman i/ili hipermutaciju okarakterisani do sada locirani su u lokusima za imunoglobuline. Prema tome, način da se sekvenca koja kodira imunoglobulin učini rezistentnom na rearanžman i/ili mutaciju DNK je insertovanje gena u lokus izvan imunoglobulinskog lokusa.

[0035] Prema tome, u skladu sa pronalaskom, upotrebljen je transgeni mišoliki sisar, pri čemu je sekvenca koja kodira laki lanac integrisana u genom mišolikog sisara, u lokusu izvan imunoglobulinskog lokusa. U jednom primeru izvođenja, insercija je u lokusu rezistentnom na utišavanje gena. Prema jednom primeru izvođenja pronalaska, integrisanje je u Rosa-lokusu ili uporedivom lokusu.

[0036] [0022] Poželjno je obezbediti ekspresionu kasetu koja se može insertovati u Rosa lokus ili uporedivi lokus na način koji omogućava ekspresiju imunoglobulinskog lanca(-aca) suštinski ograničenu na ćelije B-ćelijske linije, poželjno na način koji omogućava ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira laki lanac tokom određenog stupnja razvića B ćelija. Izraz "suštinski ograničena ekspresija" ukazuje na to da se ekspresija dešava predominantno u ćelijama B-ćelijske linije, ali da su u drugim ćelijama mogući niži nivoi ekspresije, u poređenju sa nivoom ekspresije u B ćelijama. U poželjnom primeru izvođenja, izraz "suštinski ograničena ekspresija" ukazuje na to da je ekspresija prisutna isključivo u ćelijama B-ćelijske linije. Takvi načini tipično i poželjno uključuju specifične (za razvojni stupanj) promotore B ćelije poput CD19, CD20, µHC (svi V-geni), VpreB 1, VpreB2, VpreB3, λ5, Igα, Igβ, κLC (svi geni), λLC (svi geni), BSAP (Pax5). Iako je takvim promotorima veoma lako moguće usmeriti ekspresiju DNK lanca rezistentnog na rearanžman i/ili mutaciju, oni su relativno slabi. Snažan promotor će tipično biti potreban za osiguranje adekvatne površinske ekspresije B-ćelijskog receptora (sačinjenog od Ig H i L lanca prikačenih za membranu) i za kompeticiju sa ekspresijom i sparivanjem endogenih lanaca (ako su prisutni) kroz isključivanje alela. Takav promotor, međutim, obično nije tkivno specifičan. Za postizanje ciljne specifičnosti, poželjan je indirektan sistem koji upotrebljava Cre/lox ili slično. Željeni lanac se stavlja pod kontrolu snažnog promotora inhibiranog elementom koji može da se ukloni delovanjem Cre-proteina, što dovodi do aktivacije željenog gena koji kodira immunoglobulin. Ovaj sistem je detaljno opisan u Wunderlich F. T. (2004), "Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice", Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln; http://deposit.ddb.de/cgibin/dokserv?idn=97557230x&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=97557230x.pdf.

[0037] Laki lanac imunoglobulina može da se sparuje sa različitim teškim lancima koje kodira mišoliki sisar. Laki lanac će tada biti isti (i manje imunogen) u svim antitelima, ali raznovrsnost u specifičnosti je zadržana kroz rearanžmane i hipermutacije u teškim lancima. U tom slučaju može biti poželjno utišati najmanje jedan od endogenih lokusa koji kodiraju laki lanac, iako isključivanje alela može ovo učiniti nepotrebnim.

[0038] Prema ovom primeru izvođenja, poželjno je da endogeni lokus kapa (κ) lakog lanca bude funkcionalno utišan.

[0039] Ako je endogeni lokus κ lakog lanca utišan, ali i iz drugih razloga, poželjno je da rezistentni laki lanac bude κ laki lanac, poželjno laki lanac koji ima sekvencu sličnu germinativnoj liniji. Prema pronalasku, takav laki lanac bi doveo do antitela sa smanjenom imunogenošću. Poželjna sekvenca germinativne linije bazirana je na humanom IGKV1‑39 (012) s obzirom na to da se ovaj laki lanac vrlo često zapaža u humanom repertoaru (de Wildt et al. 1999. J. Mol. Biol. 285(3):895) i ima superiornu termodinamičku stabilnost, prinos i rastvorljivost (Ewert et al.2003. J. Mol. Biol.325(3):531).

[0040] U nastavku su navedeni specifičniji primeri izvođenja ekspresione kasete kojom se može snabdeti mišoliki sisar za upotrebu prema pronalasku. To je tipično pogodno za imunoglobuline.

[0041] Prema tome, pronalazak upotrebljava, u specifičnom primeru izvođenja, transgenog mišolikog sisara pri čemu nukleinska kiselina koja kodira laki lanac sadrži u 5’‑3’ smeru: promotor specifičan za B ćeliju, lider, rearanžirani humani V gen, opciono MοEκi enhenser, konstantni region (κ) i opciono (skraćeni) MοEκ3’ enhenser. Neuberger je identifikovao i ispitao novi enhenser specifičan za B ćeliju, lociran nizvodno od kapa konstantnog regiona (EP004690251). Pokazano je da ovaj enhenser igra ključnu ulogu u ekspresiji kapa gena jer uklanjanje enhensera od 808bp snažno smanjuje ekspresiju. Delecija 3’ kapa enhensera takođe snažno smanjuje nivo somatskih hipermutacija (somatic hypermutations, SHM). U transgenim studijama i studijama ćelijske ekspresije otkriveno je da smanjeni, mutirani ili deletovani 3’ kapa enhenseri ne samo da snižavaju nivoe ekspresije nego i smanjuju nivo somatskih hipermutacija. Trenutno nije moguće odrediti da li je 3’ kapa enhenser uključen u SHM procese, regulaciju ekspresije ili oba (pregled dat u Odegard, V. H., et al. (2006). Nat. Rev. Immunol.6, 573; Inlay, M., et al. (2002). Nat. Immunol. 3, 463.).

[0042] [0028] Detaljne studije ekspresije u kojima se koriste inženjerisane varijante 3’ kapa enhensera ukazuju na to da je region od 50 nukleotida dovoljan za vođenje ekspresije. Međutim, za pogodnu ekspresiju poželjna je redukovana sekvenca od 145 nukleotida (EP04690251; Meyer, K. B., et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(19):5609‑15)

[0043] Prema tome, pronalazak u jednom aspektu obezbeđuje, u kontekstu patentnih zahteva, upotrebu nukleinske kiseline za inserciju u genom mišolikog sisara, koja je ekspresiona kaseta za ekspresiju željenog proteinskog molekula u ćelijama koje se razvijaju u zrele B ćelije, tokom određenog stupnja razvića, navedena kaseta sadrži sredstvo za prevenciju utišavanja ekspresije željenog proteinskog molekula posle uvođenja u ćeliju-domaćina, i sredstvo za usklađivanje vremena ekspresije željenog proteinskog molekula sa željenim razvojnim stupnjem ćelijedomaćina.

[0044] Ekspresiona kaseta je definisana kao nukleinska kiselina koja je snabdevena sredstvom za introdukovanje u genom ćelije-domaćina, poput sekvence koja omogućava homolognu rekombinaciju sa određenim mestom u genomu. Nukleinska kiselina će obično biti DNK, tipično dvolančana. Tipično, ekspresiona kaseta će biti data ćeliji u formi vektora, odakle će se preneti u genom ćelije. Ekspresiona kaseta sadrži još i sve elemente neophodne za ekspresiju gena u ćeliji-domaćinu, iako u određenim aspektima neki od tih elemenata mogu biti prisutni na drugoj nukleinskoj kiselini koja će se introdukovati, pri čemu ti elementi imaju in trans delovanje. Elementi potrebni za ekspresiju u ćeliji-domaćinu uključuju promotore, enhensere i druge regulatorne elemente. Potrebni su samo oni elementi koje ne obezbeđuje ćelija-domaćin.

[0045] Važno je da ekspresija gena od interesa nije utišana u genomu ćelije-domaćina, posebno ne u fazi razvoja kada je ekspresija potrebna. To se može učiniti na različite načine, kao što je insertovanje u endogeni lokus ili snabdevanje kasete nukleinskokiselinskim elementima koji preveniraju utišavanje (Kwaks et al. (2006) Trends Biotechnol.24(3), str.137‑142). Poželjno je da se ekspresiona kaseta insertuje u lokus koji u ćeliji-domaćinu nije utišan (EP 01439234).

[0046] [0032] Navedena sredstva za prevenciju utišavanja uključuju stabilišuće antirepresione sekvence (stabilizing anti-repression-sequences, STAR<®>-sekvence) i regione pričvršćivanja za matriks (matrix attachment regions, MAR). STAR sekvenca je sekvenca nukleinske kiseline koja ima kapacitet da utiče na transkripciju gena delujući in cis. Tipično, iako ne obavezno, sama STAR sekvenca ne kodira funkcionalni proteinski element. U jednom primeru izvođenja koristi se jedan STAR element. Poželjno, međutim, koristi se više od jednog STAR elementa. U posebno poželjnom primeru izvođenja, ekspresiona kaseta za upotrebu prema pronalasku snabdevena je dvema STAR sekvencama; jednom STAR sekvencom na 5’ strani kodirajuće sekvence imunoglobulinskog gena i jednom STAR sekvencom na 3’ strani kodirajuće sekvence imunoglobulinskog gena. MAR su DNK sekvence koje su uključene u ukotvljavanje DNK/hromatina za nukelusni matriks i opisane su i kod sisarskih i kod biljnih vrsta. MAR imaju brojne odlike koje olakšavaju otvaranje i održavanje euhromatina. MAR mogu povećati transgenu ekspresiju i ograničiti pozicione efekte.

[0047] Prema jednom aspektu pronalaska, važno je da se ekspresija iz kasete dešava samo tokom određenog perioda razvića ćelije, posebno B ćelije u razviću, naročito B ćelije u transgenom mišolikom sisaru, posebno mišu. U ovom konkretnom slučaju, period razvića odabran je tako da ekspresija lakog lanca ne interferira značajno sa normalnom diferencijacijom i/ili sazrevanjem ćelije i, kada je primenljivo, omogućava sparivanje proizvedenog polipeptidnog lanca i njegovog parnjaka

[0048] Ovo se, u jednom primeru izvođenja, može postići obezbeđivanjem nukleinske kiseline korisne za pronalazak, pri čemu je navedeno sredstvo za vremensko usklađivanje ekspresije promotor čija je aktivnost suštinski ograničena na određeni stupanj razvića. U B ćeliji u razviću, koja npr. posle imunizacije sazreva i/ili se diferencira, ekspresija gena od interesa, a to je rearanžirani humani VL region humanog imunoglobulina, ne sme interferirati (značajno) sa navedenim sazrevanjem i/ili diferencijacijom i treba da bude vremenski usklađena tako da rezultujući polipeptid može da se sparuje sa svojim parnjacima. Prema tome, opisana je nukleinska kiselina korisna za pronalazak, pri čemu navedeni određeni stupanj počinje na stupnju koji neposredno prethodi ili se podudara sa početkom ekspresije molekula lakog lanca od strane navedenih ćelija na određenom stupnju razvića ka zreloj B ćeliji.

[0049] Ovo se može postići izborom promotora koji je aktivan samo tokom navedenog pogodnog perioda. Takav promotor može biti CD19 promotor, Ig-α promotor, Ig-β promotor, µhc (svi geni) promotor, Vk promotor ili njihovi analozi ili homolozi.

[0050] Promotor, kako je gore objavljeno, ne mora direktno voditi ekspresiju gena od interesa. Umesto toga, on vodi ekspresiju gena čiji proizvod in trans aktivira ekspresiju gena od interesa. Takav aktivirajući gen može biti gen koji kodira takozvanu Cre rekombinazu ili Cre-sličan protein. Ekspresiona kaseta za gen od interesa može npr. biti snabdevena sekvencom koja inhibira ekspresiju gena od interesa. Navedena sekvenca može da se ukloni delovanjem Cre rekombinaze koja je pod kontrolom željenog promotora (aktivnog tokom odgovarajućeg stupnja razvića). Može biti potreban skup ekspresionih kaseta.

[0051] Prema tome, opisan je set nukleinskih kiselina koje su ekspresione kasete, pri čemu jedna nukleinska kiselina sadrži ekspresionu kasetu koja kodira Cre-sličan protein pod kontrolom promotora aktivnog tokom željenog stupnja razvića ćelije-domaćina, a druga nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja kodira željeni proteinski molekul pod kontrolom konstitutivnog promotora koji može da se aktivira delovanjem Cre-sličnog proteina. Navedena aktivacija može se postići uklanjanjem stop-sekvence ograničene loxP mestima. Cre/lox sistem

[0054] 1

[0055] detaljno je opisan u Rajewsky et al. (1996) J. Clin. Invest. 98, str. 600-603. Pregled takvih sistema dat je u Wunderlich F. T. (2004), "Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice", Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln; http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv? idn=97557230x&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename =9755723 0x.pd.

[0056] U pronalasku se koristi transgeni mišoliki sisar snabdeven ovde opisanom ekspresionom kasetom, pri čemu je željeni proteinski molekul rearanžirani varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina. Poželjni polipeptid je laki lanac germinativne linije ili je sličan lakom lancu germinativne linije. Najpoželjniji polipeptid je O12, poželjno rearanžirani kapa laki lanac germinativne linije IGKV1‑39*0 1/IGKJ1*01 (nomenklatura prema IMGT bazi podataka, http://www.imgt.org).

[0057] Rearanžirani varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina onesposobljen je za rearanžman i isključen je iz bilo kakve modifikacije sekvence, poput one koja normalno deluje na Ig tokom procesa afinitetnog sazrevanja B ćelija. Prema tome, pronalazak može koristiti transgenog mišolikog sisara snabdevenog ekspresionom kasetom, pri čemu su navedeno rearanžiranje i modifikacije sekvence sprečeni odsustvom elemenata bar delimično odgovornih za somatsku hipermutaciju, kao što je, na primer, MοEκi enhenser.

[0058] Ekspresiona kaseta može sadržati sredstva za prevenciju utišavanja. U jednom aspektu, navedena sredstva za prevenciju utišavanja su sredstva za inserciju u lokus u genomu ćelijedomaćina, koji je rezistentan na utišavanje. Navedena sredstva su poželjno sredstva za homolognu rekombinaciju u navedeno mesto rezistentno na utišavanje. Kada je mišoliki sisar miš, poželjni lokus je rosa-lokus.

[0059] Još jedna poželjna ekspresiona kaseta sadrži u 5’‑3’ smeru: Vκ promotor, mišji lider, humani V gen, opciono MoEκi enhenser, pacovski konstantni region (Cκ) i opciono (skraćeni) MοEκ3’ enhenser.

[0060] Još jedna poželjna ekspresiona kaseta sadrži u 5’‑3’ smeru: Vκ promotor, humani lider, humani V gen, opciono MοEκi enhenser, pacovski konstantni region (Cκ) i opciono (skraćeni) MοEκ3’ enhenser.

[0061] Naravno, krajnji cilj pronalaska je proizvodnja antitela koja će se koristiti u lečenju ljudi. Prema tome, ovde je opisan postupak za proizvodnju željenog antitela, koji uključuje izlaganje mišolikog sisara korišćenog prema pronalasku antigenu tako da se indukuje odgovor antitela, i izolovanje antitela specifičnih za antigen.

[0062] Opisan je još i postupak za proizvodnju željenog antitela, koji uključuje izlaganje mišolikog sisara korišćenog prema pronalasku, antigenu tako da se indukuje odgovor antitela, i izolovanje ćelija koje proivode takva antitela, kultivisanje i, opciono, imortalizacija navedenih ćelija i sakupljanje navedenih antitela.

[0063] Opisan je još i postupak za proizvodnju željenog antitela, koji uključuje izlaganje mišolikog sisara korišćenog prema pronalasku, antigenu tako da se indukuje odgovor antitela, i izolovanje nukleinske kiseline koja kodira bar deo takvog antitela, insertovanje navedene nukleinske kiseline ili njene kopije ili derivata u ekspresionu kasetu i eksprimiranje navedenog antitela u ćeliji-domaćinu.

[0064] Postupci za proizvodnju antitela iz transgenih miševa poznati su stručnjaku u oblasti. Posebno su poželjni postupci za proizvodnju smeša antitela iz jedne ćelije, pri čemu su nukleinske kiseline koje kodiraju ta antitela izvedene iz miševa prema pronalasku.

[0065] Ti takozvanio oligoklonici objavljeni su u WO04106375 i WO05068622.

[0066] Predmetni pronalazak koristi transgene mišolike sisare, poželjno miševe, sposobne da generišu specifična i visokoafinitetna hibridna miš-čovek antitela sa varijabilnim regionima lakog lanca (VL) humanog imunoglobulina u konfiguraciji germinativne linije ili njoj bliskoj, i poželjno varijabilnim regionima teškog lanca (VH) mišjeg imunoglobulina, koji mogu imati akumulirane somatske mutacije tokom procesa afinitetnog sazrevanja pokrenutog antigenom. Predviđeno je da mišji VH regioni hibridnih antitela mogu da se podvrgnu procedurama humanizacije kako bi dali mAb koja imaju smanjenu imunogenost kada se primjenjuju kod ljudi, na bazi VL regiona germinativne linije ili bliskih germinativnoj liniji i mišjih VH regiona koji su bili humanizovani

[0067] Posebno, u ovom pronalasku je pokazano da su transgeni miševi koji nose DNK ekspresioni konstrukt koji kodira rearanžirani humani VL region pod kontrolom cis-delujućih genetičkih elemenata koji obezbeđuju pravovremenu i regulisanu ekspresiju transgena na značajnom udelu B ćelija tokom razvića B ćelija, ali im nedostaju elementi koji usmeravaju mašineriju somatskih hipermutacija na transgen, sposobni da generišu specifična i visokoafinitetna hibridna miš-čovek antitela sa suštinski nemutiranim L lancima. Pokazano je da je rearanžirani humani transgen sposoban da se sparuje sa raznolikim endogenim mišjim imunoglobulinskim H lancima kako bi se formirali hibridni miš-čovek imunoglobulini eksprimirani na površini B ćelija i dovoljno olakšalo razviće mišjih B ćelija za dobijanje prilično velikog i raznolikog perifernog kompartmenta B ćelija.

[0068] [0050] U poželjnom primeru izvođenja, transgeni ekspresioni konstrukt za upotrebu prema pronalasku nosi kodirajuće sekvence humanog rearanžiranog V regiona L lanca pod kontrolom humanog VL promotora za usmeravanje specifične ekspresije B ćelija. Pored toga, konstrukt nosi mišju 3’ Ck enhensersku sekvencu za specifičnu i inducibilnu ekspresiju transgena na visokom nivou, u B ćelijama. Pored toga, konstrukt je dizajniran tako da mu nedostaju regulatorni elementi koji olakšavaju regrutovanje mašinerije somatskih hipermutacija za transgen, kao što su intronski enhenser i

kapa enhenser.

[0069] U povezanom primeru izvođenja, rearanžirani humani VL gen za upotrebu prema pronalasku insertovan je u mišji Rosa26 lokus, integracijom specifičnom za mesto. Rosa26 lokus koristan je u kontekstu pristupa "ciljane transgeneze" za efikasno generisanje transgenih organizama (kao što su miševi) sa predvidljivim obrascem ekspresije transgena.

[0070] U poželjnom primeru izvođenja, rearanžirani humani VL region za upotrebu prema pronalasku selektovan je prema svom kapacitetu da se sparuje sa najmanje dva različita mišja VH gena tako da se osigura generisanje populacije B ćelija sa raznolikim repertoarom VH gena. Postupak dobijanja takvih VL regiona uključuje amplifikaciju repertoara rearanžiranih VH gena iz B ćelija miševa i repertoara humanih rearanžiranih VL regiona germinativne linije iz B ćelija ljudi i njihovo kloniranje u fagemidne vektore za prikazivanje da bi se pripremile raznolike biblioteke hibridnih imunoglobulina u bakterijiama. Analizom nukleotidne sekvence kolekcija neselektovanih i antigen-selektovanih VH/VL parova identifikovani su VL geni germinativne linije čoveka koji se sparuju sa mnogim različitim VH genima miša. Opisana je kolekcija VL gena humane germinativne linije sa ovim kapacitetom.

[0071] Pokazano je da posle imunizacije antigenom, B ćelije mogu da uspostave imunski odgovor, što dovodi do generisanja B ćelija koje sekretuju hibridna antitela sa visokom specifičnošću i afinitetom. V regioni koji kodiraju ova antitela karakterišu se humanim transgenim lakim lancem koji nosi veoma malo ili nimalo mutacija, i mišjim teškim lancem koji nosi varijabilni broj mutacija uvedenih mašinerijom somatskih hipermutacija.

[0072] Razmatraju se strategije za dobijanje visokoafinitetnih hibridnih monoklonskih antitela iz transgenih miševa, tehnologijama hibridoma i prikazivanja kao i procedure za humanizovanje mišjih VH regiona za dobijanje antitela sa manjom imunogenošću za primenu kod ljudi.

[0073] U jednom primeru izvođenja, pronalazak koristi transgeni konstrukt L lanca imunoglobulina koji sadrži DNK sekvence koje kodiraju VL region humanog imunoglobulina u kombinaciji sa konstantnim regionom lakog lanca (CL) imunoglobulinskog proteina životinje, a te sekvence su operabilno povezane sa transkripcionim regulatornim sekvencama koje, kada se integrišu u transgenog mišolikog sisara, proizvode Ig VL-CL polipeptid sa humanim VL regionom koja nije ili je marginalno podložan somatskoj hipermutaciji. Ig VL

[0076] 1

[0077] sposoban je za sparivanje sa rearanžiranim VH-CH polipeptidima generisanim tokom razvića B ćelija u transgenom mišolikom sisaru, pri čemu navedeni VH-CH polipeptidi zadržavaju sposobnost da budu podvrgnuti somatskoj hipermutaciji posle stimulacije. CL region može biti iz bilo koje životinjske vrste i uošteno, sposoban je za sparivanje sa CH regionima transgenog mišolikog sisara.

[0078] Opisana je i upotreba transgenog konstrukta kao što je gornji, u proizvodnji transgenog mišolikog sisara sposobnog da proizvodi hibridna antitela koja se sastoje od VL-CL polipeptida i VH-CH polipeptida gde je VL region humanog porekla a CL, VH i CH mogu biti iz bilo koje vrste životinja, uključujući čoveka. Posle imunizacije, ove transgene životinje sposobne su da generišu visokoafinitetna antitela kodirana somatski hipermutiranim VH genima i nemutiranim rearanžiranim humanim VL genom kodiranim transgenom.

[0079] U drugom aspektu, opisan je proces za proizvodnju transgenog mišolikog sisara sposobnog da proizvodi hibridna antitela u odgovoru na izazov antigenom, koji uključuje funkcionalno remećenje endogenog lokusa lakog lanca imunoglobulina i insertovanje transgenog konstrukta u životinjski genom, kako je opisano.

[0080] Pronalazak uključuje upotrebu transgenog mišolikog sisara koji se može dobiti ovim procesom, u proizvodnji B ćelija koje proizvode imunoglobulin sa humanim VL lakim lancem kako je definisano u patentnim zahtevima. Opisan je proces za proizvodnju B ćelija koje proizvode imunoglobulin sa humanim VL i vezuju se sa selektovanim antigenom, koji uključuje izazivanje mišolikog sisara dobijenog gornjim procesom, navedenim antigenom i skrining B ćelija iz navedene životinje u pogledu vezivanja sa navedenim antigenom. Opisane su još i B ćelije koje se mogu dobiti ovim procesom i hibridomi koji se mogu dobiti imortalizacijom takvih B ćelija, npr. hibridomi dobijeni fuzijom B ćelija kao gore, sa ćelijama mijeloma. Opisan je i proces za proizvodnju monoklonskog antitela, koji uključuje kultivisanje takvog hibridoma. Opisana je još i upotreba gore navedenih B ćelija u proizvodnji hibridoma ili odgovarajućeg monoklonskog antitela.

[0081] Opisan je još i proces za proizvodnju imunoglobulina koji ima humani VL lanac i vezuje se za selektovani antigen, koji uključuje izazivanje mišolikog sisara koji se može dobiti kako je gore rečeno, navedenim antigenom i dobijanje imunoglobulina iz njega.

[0082] [0060] U jednoj strategiji, kao pojedinačni korak, rearanžirani VL region kodiran V i J genskim segmentima humane germinativne linije i konstantni region lakog lanca iz bilo koje životinjske vrste, ali poželjno mišji konstantni region introdukuju se u mišju germinativnu liniju. Transgena DNK može se introdukovati u pronukleuse oplođenih oocita ili embrionalne matične ćelije. Integracija može biti nasumična ili homologna zavisno od određene strategije koja će se upotrebiti. Na primer, VL transgen može da se introdukuje nasumičnom insercijom, što rezultuje miševima koji nose jednu ili više kopija transgena u genomu. Alternativno, humani VL transgen može da bude usmeren ka specifičnom lokusu genoma korišćenjem rekombinacije specifične za mesto, kako je opisano u struci.

[0083] U jednom poželjnom primeru izvođenja, VL transgen za upotrebu prema pronalasku usmeren je ka mišjem ROSA26 lokusu koji je pogodno mesto integracije koje omogućava snažnu i predvidljivu ekspresiju insertovanih transgena (EP 1439234). Ciljajući vektor omogućava inserciju jedne kopije genske ekspresione kasete, čime se izbegava modulacija ekspresije transgena aranžmanom više kopija. Izborom autozomalnog Rosa26 lokusa kao mesta insercije, obrazac ekspresije insertovanog transgena u mišolikom sisaru je predvidljiv. Pored toga, izbegavaju se nasumična X inaktivacija i/ili modulacija putem hromozomskih pozicionih efekata. Ovim se takođe eliminiše potreba za generisanjem i analizom više transgenih sojeva za svaki dati transgen. Konačno, Rosa26-ciljajući vektor za integraciju specifičnu za mesto može se koristiti za multigenske ekspresione kasete. Prema tome, može se zamisliti da se 2 ili više različito rearanžiranih humanih VL regiona germinativne linije insertuje u Rosa26 lokus kako bi se dodatno povećala raznolikost repertoara hibridnih ili humanih antitela.

[0084] U drugom primeru izvođenja, rearanžirani humani VL region za upotrebu prema pronalasku može se usmeriti ka kapa ili lambda lokusu lakog lanca mišjeg Ig tako da funkcionalno inaktivira endogeni lokus, ili miševi koji sadrže rearanžirani humani VL region mogu da se ukrštaju sa miševima kojima nedostaju funkcionalni kapa ili lambda lokusi Ig, ili oba. Prema tome, korišćenjem transformacija, uz upotrebu repetitivnih koraka ili u kombinaciji sa oplemenjivanjem, mogu se dobiti transgeni mišoliki sisari koji su u stanju da proizvedu antitela koja nose humani VL transgen suštinski u odsustvu endogenih lakih lanaca imunoglobulina domaćina.

[0085] U jednom primeru izvođenja, humani VL transgen za upotrebu prema pronalasku selektovan je prema svom kapacitetu da se sparuje sa značajnim delom mišjih VH regiona da bi se formirao raznoliki repertoar funkcionalnih hibridnih miš-čovek antitela eksprimiranih na površini B ćelija. Pod značajnim delom mišjih VH regiona misli se na to da se humani VL sparuje sa najmanje 0.1% mišjih VH regiona generisanih tokom razvića B ćelija, poželjnije sa najmanje 1% i najpoželjnije sa najmanje 10%. Postupci za identifikovanje humanih VL gena sa ovom karakteristikom uključuju nasumično sparivanje repertoara humanih VL regiona sa repertoarom mišjih VH regiona, koekspresiju VH i VL regiona u odgovarajućim eukariotskim ili prokariotskim ekspresionim vektorima i skrining u pogledu humanih VL regiona koji se sparuju sa značajnim delom mišjih VH regiona. Fagemidni vektori mogu da se koriste za

[0088] 1

[0089] usmeravanje ekspresije fragmenata antitela miš-čovek u bakterijskim ćelijama ili na površini filamentoznog faga i analizu vezujućeg kapaciteta fragmenata antitela postupcima poznatim u struci.

[0090] U još jednom primeru izvođenja, humani VL transgen za upotrebu prema pronalasku selektovan je prema svom kapacitetu da se sparuje sa značajnim delom humanih VH regiona da bi se formirao raznoliki repertoar humanih antitela eksprimiranih na površini B ćelija. Pod značajnim delom humanih VH regiona misli se na to da se humani VL sparuje sa najmanje 0,1% humanih VH regiona nastalih tokom razvića B ćelija, poželjnije sa najmanje 1%, i najpoželjnije sa najmanje 10%.

[0091] Humani VL-transgeni miševi mogu da se ukrste sa miševima koji nose funkcionalno rearanžirane ili nerearanžirane lokuse humanog H lanca imunoglobulina i funkcionalno inaktivirane endogene lokuse H lanca Ig, kako je opisano u struci. Funkcionalna inaktivacija dveju kopija svakog od tri Ig lokusa domaćina (teški lanac, kapa i lambda laki lanac), pri čemu domaćin sadrži humani IgH i rearanžirani humani VL transgen, omogućila bi proizvodnju čisto humanih molekula antitela, bez proizvodnje antitela domaćina ili himernih antitela domaćina i čoveka. Takav soj domaćina, na imunizaciju specifičnim antigenima odgovorio bi proizvodnjom mišjih B ćelija koje proizvode specifična humana antitela, i te B ćelije se zatim fuzionišu sa ćelijama mišjeg mijeloma ili se imortalizuju na bilo koji drugi način, za kontinuiranu stabilnu proizvodnju humanih monoklonskih antitela. Alternativno, navedena populacija B ćelija koristi se kao izvor VH regiona koji mogu da se dobiju konstruisanjem cDNK biblioteka ili PCR amplifikacijom uz korišćenje prajmera za humane VH regione, kako je poznato u struci.

[0092] Humani rearanžirani VL gen se rekonstruiše u odgovarajućem eukariotskom ili prokariotskom mikroorganizmu i rezultujući DNK fragmenti mogu da se introdukuju u pronukleuse oplođenih mišjih oocita ili embrionalne matične ćelije. Različiti konstrukti koji usmeravaju ekspresiju VL transgena specifičnu za B ćelije opisani su u struci i imaju sledeći opšti format: liderska sekvenca i relevantne uzvodne sekvence za usmeravanje ekspresije transgena specifične za B ćelije, kodirajuća sekvenca humanog VL transgena, enhenserska sekvenca koja usmerava za B ćelije specifičnu ekspresiju transgena na visokom nivou i gen mišjeg konstantnog regiona. U poželjnom formatu, enhenser je C-kapa 3’ enhenser zbog toga što on usmerava ekspresiju visokog nivoa u ćelijama B linije, ali ne regrutuje somatsku hipermutaciju kada se koristi u transgenim konstruktima.

[0093] Mišoliki sisari, poželjno miševi, koji sadrže jednu ili više kopija transgena u genomu, izoluju se i analiziraju u pogledu stabilne ekspresije. Mišoliki sisari se biraju tako da pokažu

[0096] 1

[0097] stabilnu ekspresiju transgena tokom dužih vremenskih perioda, poželjno u B ćelijama. Po potrebi, različite mišje linije koje sadrže nezavisne insercije jedne ili više kopija transgena, poželjno na različitim hromozomima, ukrštaju se da se dobiju mišoliki sisari sa različitim insercijama jedne ili više kopija transgena, radi porasta ekspresije transgena u mišolikim sisarima, poželjno u B ćelijama.

[0098] Opisano je još i potomstvo transgenih mišolikih sisara upotrebljenih prema pronalasku, potomstvo sadrži bar u svojoj B-ćelijskoj liniji, sekvencu koja kodira laki lanac, zajedno sa sredstvima koja sekvencu čine rezistentnom na rearanžmane DNK i/ili somatske hipermutacije.

[0099] Opisano je još i potomstvo transgenih mišolikih sisara upotrebljenih prema pronalasku, potomstvo sadrži ekspresionu kasetu za ekspresiju željenog proteinskog molekula u ćelijama tokom određenog stupnja razvića ćelija koje se razvijaju u zrele B ćelije.

[0100] Opisana je još i ćelija koja je izolovana iz transgenog mišolikog sisara upotrebljenog prema pronalsku, ćelija sadrži sekvencu koja kodira laki lanac, zajedno sa sredstvima koja sekvencu čine rezistentnom na rearanžmane DNK i/ili somatske hipermutacije. Opisana je i ćelija koja je izolovana iz transgenog mišolikog sisara upotrebljenog prema pronalasku, ćelija sadrži ekspresionu kasetu za ekspresiju željenog proteinskog molekula u ćelijama tokom određenog stupnja razvića ćelija koje se razvijaju u zrele B ćelije. Ćelija, poželjno B ćelija koja proizvodi antitela ili ćelija koja je sposobna da se diferencira u ćeliju koja proizvodi antitela, može da se upotrebi za in vitro proizvodnju antitela, kako je poznato stručnjaku u oblasti, na primer iz Gascan et al. 1991. J. Exp. Med. 173: 747‑750. Ovde opisani postupci za imortalizaciju ćelije poznati su u struci i uključuju generisanje hibridoma, na primer fuzijom sa ćelijom mijeloma, transformaciju Epstein Barr virusom; ekspresiju prenosilaca signala i aktivatora transkripcije (signal transducer of activation and transcription, STAT), aktivaciju preko CD40 i IL4-receptorsku signalizaciju, i/ili ekspresiju Bcl6 (Shvarts et al. 2002. Genes Dev 16: 681‑686).

[0101] U odvojenom koraku, mišji endogeni lokusi kapa i lambda lanca čine se suštinski nefunkcionalnim tako da bar većina B ćelija u transgenim miševima nosi Ig receptore koji sadrže transgeni humani VL region. Inaktivacija endogenih mišjih imunoglobulinskih lokusa postiže se ciljanim remećenjem odgovarajućih lokusa homolognom rekombinacijom u embrionalnim matičnim ćelijama miša. Pomenuto ciljano remećenje uključuje izmenu genomske sekvence tako da se suštinski ne proizvodi funkcionalni endogeni mišji imunoglobulinski kapa i/ili lambda laki lanac. Izraz "suštinski se ne proizvodi funkcionalni endogeni mišji imunoglobulin" ukazuje na to da su endogeni lokusi kapa i/ili lambda lakog lanca funkcionalno utišani tako da je nivo funkcionalne proteinske ekspresije endogenih lokusa

[0104] 1

[0105] kapa i/ili lambda lakog lanca, poželjno endogenog lokusa kapa lakog lanca, smanjen na oko 20% od nivoa ekspresije u referentnom mišu, poželjnije na oko 10%, poželjnije na oko 5%, poželjnije na oko 2% i poželjnije na oko 1%. U najpoželjnijem primeru izvođenja, nivo funkcionalne proteinske ekspresije endogenih lokusa kapa i/ili lambda lakog lanca smanjen je na 0%. Nivo funkcionalne proteinske ekspresije može se odrediti na načine koji su poznati stručnjacima u oblasti, uključujući western blotovanje i sparivanje sa mišjim teškim lancem. Navedeni referentni miš je miš u kojem endogeni lokusi kapa i/ili lambda lakog lanca nisu poremećeni. Navedena alteracija uključuje mutaciju i/ili deleciju genske sekvence potrebne za funkcionalnu ekspresiju endogenih imunoglobulinskih gena. Alternativno, navedena alteracija uključuje inserciju nukleinske kiseline u endogene lokuse mišjeg imunoglobulinskog kapa i/ili lambda lakog lanca tako da je funkcionalna ekspresija endogenih imunoglobulinskih gena smanjena. U jednom aspektu, navedena nukleinska kiselina uključuje utišavajući element što rezultuje utišavanjem transkripcije endogenog imunoglobulinskog gena. U još jednom aspektu, ili dodatno, navedena nukleinska kiselina uključuje sekvencu koja remeti splajsovanje i/ili translaciju endogenog imunoglobulinskog gena, na primer introdukcijom egzona koji dovodi do pomeranja rama u kodirajućoj sekvenci, ili koji sadrži prevremeni stop-kodon. U svakom slučaju, generišu se himerne životinje izvedene delom iz modifikovanih embrionalnih matičnih ćelija i koje su sposobne da prenesu genetičke modifikacije kroz germinativnu liniju. Parenje sojeva miševa sa humanim imunoglobulinskim lokusima i sojeva sa inaktiviranim mišjim lokusima daje životinje koje proizvode antitela koja se suštinski sastoje samo od humanih lakih lanaca.

[0106] Konstrukt za homolognu rekombinaciju priprema se na načine poznate u struci i uklanjaju se sve neželjene sekvence, npr., prokariotske sekvence. Može se upotrebiti svaka konvencionalna tehnika za introdukciju konstrukta za homolognu rekombinaciju u ciljnu ćeliju. Ove tehnike uključuju fuziju sferoplasta, lipofekciju, elektroporaciju, transfer DNK posredovan kalcijum-fosfatom ili direktno mikroinjektiranje. Posle transformacije ili transfekcije ciljnih ćelija, ciljne ćelije se selektuju putem pozitivnih i/ili negativnih markera, na primer putem rezistencije na neomicin i/ili aciklovir i/ili ganciklovir. Ćelije koje pokazuju željeni fenotip mogu zatim dalje da se analiziraju restrikcionom analizom, elektroforezom, southern analizom, PCR ili slično. Identifikovanjem fragmenata koji pokazuju prisustvo lezije(a) na ciljnom lokusu, identifikuju se ćelije u kojima je došlo do homologne rekombinacije kako bi se inaktivirala kopija ciljnog lokusa.

[0107] Pored toga, pokazano je da su posle imunizacije mišji i humani VH regioni u gore pomenutim transgenim miševima, ali ne i VL regioni, sposobni da prođu somatske

[0110] 1

[0111] hipermutacije kako bi se generisala visokoafinitetna antitela. Pogodno, predviđa se da će ova antitela kodirana VL regionima germinativne linije doprineti nižoj imunogenosti kada se primjenjuju kod ljudi i rezultovati stabilnijim antitelima koja su manje sklona agregaciji, a time i bezbednija za terapijsku upotrebu kod ljudi.

[0112] Sva mAb izvedena iz gore pomenutog transgenog mišolikog sisara imaju iste identične humane VL regione. Opisano je da mAb koja imaju isti identični VL region mogu da se koeksprimiraju u jednoj klonskoj ćeliji za proizvodnju smeša rekombinantnih antitela sa funkcionalnim vezujućim mestima (vidi WO04106375 i WO05068622). Prema tome, transgeni mišoliki sisar pogodan za upotrebu prema pronalasku obezbeđuje platformu za generisanje specifičnih i visokoafinitetnih mAb koja sačinjavaju bazu za smeše mAb proizvedenih klonskim ćelijama.

[0113] Poželjno je da mAb izvedena iz gore pomenutog transgenog mišolikog sisara budu usmerena protiv ćelijskih ciljeva. Poželjni ciljevi su humani, površinski eksprimirani ili rastvorljivi proteinski ili ugljenohidratni molekuli. Poželjni ciljevi su još i površinski eksprimirani proteinski ili ugljenohidratni molekuli koji se eksprimiraju na površini bakterija, virua i drugih patogena, posebno patogena ljudi.

[0114] Tačnije, poželjni ciljevi uključuju citokine hemokine uključujući, ali ne ograničavajući se na interleukin 1beta (IL1beta), IL2, IL4, IL5, IL7, IL8, IL12, IL13, IL15, IL18, IL21, IL23 i hemokine kao što su, na primer, CXC hemokini, CC hemokini, C hemokini (ili y hemokini) kao što su XCL1 (limfotaktin-α) i XCL2 (limfotaktin-B), i CX3C hemokini. Uključeni kao poželjni ciljevi su još i receptorski molekuli za citokine i hemokine, uključujući citokinske receptore tipa I kao što je, na primer, IL‑2 receptor, citokinske receptore tipa II kao što su, na primer interferonski receptori, receptori imunoglobulinske (Ig) superfamilije, receptori familije faktora nekroze tumora uključujući receptore za CD40, CD27 i CD30, serin/treonin-protein kinazne receptori kao što su receptori za TGF beta, receptori kuplovani sa G-proteinom kao što je CXCR1-CXCR7, i tirozin-kinazni receptori kao što su članovi familije receptora za faktor rasta fibroblasta (fibroblast growth factor receptor, FGFR), članovi familije receptora za EGF uključujući erbB 1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3), i erbB4 (HER4), članovi familije receptora za insulin uključujući IGF-R1 i IGF-RII, članovi familije receptora za PDGF, članovi familije receptora za faktor rasta hepatocita uključujući c-Met (HGF-R), članovi familije receptora za Trk, članovi familije receptora za AXL, članovi familije receptora za LTK, članovi familije receptora za TIE, članovi familije receptora za ROR, članovi familije receptora za DDR, članovi familije receptora za KLG, članovi familije receptora za RYK, članovi familije

[0117] 1

[0118] receptora za MuSK, i članovi familije receptora za faktor rasta vaskularnog endotela (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR).

[0119] Poželjni ciljevi su i ciljevi koji se prekomerno eksprimiraju ili selektivno eksprimiraju u tumorima kao što su na primer, VEGF, CD20, CD38, CD33, CEA, EpCAM, PSMA, CD54, Lewis Y, CD52, CD40, CD22, CD51/CD61, CD74, MUC‑1, CD38, CD19, CD262 (TRAIL-R2), RANKL, CTLA4, i CD30; ciljevi koji su uključeni u hronično zapaljenje kao što su, na primer, CD25, CD11a, TNF, CD4, CD80, CD23, CD3, CD14, IFNgama, CD40L, CD50, CD122, TGFbeta i TGFalfa.

[0120] Poželjni površinski eksprimirani proteinski ili ugljenohidratni molekuli koji se eksprimiraju na površini bakterija, virusa i drugih parazitskih patogena, posebno patogena ljudi, uključujući površinske markere virusa influence A i B poput hemaglutinina (hemagglutinin, HA) i neuraminidaze (neuraminidase, NA), filovirusa poput ebola virusa, besnila, malih boginja, rubele, zauški, flavivirusa poput denga virusa tipovi 1‑4, virusa krpeljskog encefalitisa, virusa Zapadnog Nila, virusa japanskog encefalitisa, i virusa žute groznice, paramiksovirusa uključujući paramiksovirus poput parainfluence 1, 3, rubulavirus poput virusa zauški i parainfluence 2, 4, virus malih boginja, i pneumovirus poput respiratornog sincicijalnog virusa, virusa vakcinije, velikih boginja, koronavirusa, uključujući virus teškog akutnog respiratornog sindroma (severe acute respiratory syndrome, SARS), virusa hepatitisa A, B i C, virusa humane imunodeficijencije, herpes virusa, uključujući citomegalovirus, Epstein Barr virus, herpes simpleks virus, i varičela zoster virus, parvovirusa poput, na primer, B19; Legionella pneumophila; Listeria monocytogenes; Campylobacter jejuni; Staphylococcus aureus; E. coli 0157:H7; Borrelia burgdorferi; Helicobacter pylori; Ehrlichia chaffeensis; Clostridium difficile; Vibrio cholera; Salmonella enterica serotip tifimurijum; Bartonella henselae; Streptococcus pyogenes (streptokok grupe A); Streptococcus agalactiae (streptokok grupe B); S. aureus multirezistentan na lekove (npr. MRSA); Chlamydia pneumoniae; Clostridium botulinum; Vibrio vulnificus; Parachlamydia pneumonia; Corynebacterium amycolatum; Klebsiella pneumonia; enterokoke rezistentne na linezolid (E. faecalis i E. faecium); i Acinetobacter baumannii multirezistentan na lekove.

[0121] Najpoželjniji ciljevi su IL‑6 i njegov receptor, IL‑6Ralfa, glikoprotein-denominovani gp130, RSV, posebno površinski proteini F, G i SH i nestrukturni proteini kao što su N i M, i receptorske tirozin-kinaze, posebno erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3), erbB4 (HER4), IGF-R1 i IGF-RII, c-Met (HGF-R).

[0122] Prema tome, mišoliki sisar pogodan za upotrebu prema pronalasku obezbeđuje platformu za generisanje specifičnih i visokoafinitetnih mAb protiv gore pomenutih ciljeva,

[0125] 2

[0126] koja čine osnovu za smeše mAb proizvedenih klonskim ćelijama. U poželjnom aspektu, navedena specifična i visokoafinitetna mAb uključuju mAb koja su usmerena protiv različitih epitopa na najmanje jednom od ciljeva. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, navedena specifična i visokoafinitetna mAb uključuju mAb koja su usmerena protiv različitih ciljeva, kao što su, na primer, jedan ili više članova familije EGF receptora, uključujući erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3) i erbB4 (HER4).

[0127] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi upotrebljeni u vezi sa predmetnim pronalaskom imaće značenja koja uobičajeno razume prosečno obučeni stručnjak u oblasti. Pored toga, ukoliko kontekst ne nalaže drugačije, izrazi u jednini uključuju i izraze u množini, a izrazi u množini uključuju i izraze u jednini. Uopšteno, ovde opisane tehnike i nomenklatura, upotrebljene u vezi sa kulturom ćelija i tkiva, molekularnom biologijom, i hemijom proteina i oligo‑ ili polinukleotida i hibridizacijom su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u struci. Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se u skladu sa proizvođačkim specifikacijama ili kako se uobičajeno obavljaju u struci ili kako je ovde opisano. Gore navedene tehnike i procedure se uopšteno izvode prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u struci i kako je opisano u raznim opštim i specifičnijim referencama navedenim i razmatranim u ovoj specifikaciji. Vidi npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)). Laboratorijske procedure i tehnike i nomenklatura, upotrebljene u vezi sa analitičkom hemijom, hemijom organske sinteze, i medicinskom i farmaceutskom hemijom opisane ovde su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u struci. Standardne tehnike upotrebljene su za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulisanje, i dostavu, i lečenje pacijenata.

[0129] Opis slika

[0131]

[0133] Slika 1

[0134] Topološka mapa mesta hibridizacije mišjih specifičnih VH prajmera i položaj potrebnih restrikcionih mesta koja su introdukovana prepusnim sekvencama na 3' kraj prajmera.

[0135] Slika 2

[0136] Koraci PCR amplifikacije (amplifikacija, intermedijarni korak i introdukcija na mesto). Lokacija i nazivi mišjih VH amplifikacionih prajmera (i smeša prajmera) naznačeni su po koraku.

[0138] Slika 3

[0139] Topologija MV1043 vektora. Ovaj vektor se koristi za kloniranje humanih ili mišjih VH fragmenata. 012 (IGKV1‑39) je označen kao VL gen. Proizvodi ovog vektora u kombinaciji sa pomagačkim fagima u ćelijama E. coli omogućavaju generisanje faga koji prikazuju Fab fragmente na površini fagnih čestica kao proizvod fuzije sa g3 proteinom i prisustvo vektora u fagu kao genetičkog sadržaja (F1 ORI).

[0141] Slika 4

[0142] Topologija mišjeg Ckapa lokusa nizvodno od J-segmenata. Označeni su i enhenseri i Ckapa region. Donja strelica označava region koji je uklonjen kako bi se lokus utišao.

[0143] Slika 5

[0144] Topologija mišjeg C-lambda lokusa. Označena su sva tri aktivna V-regiona (Igl-V1, V2 i V3) kao i J-segmenti (Igl-J1, Igl-J2, Igl. J3, Igl-J4 i pseudo segment Igl-J3p) i konstantni regioni (Igl-C1, Igl-C2, Igl-C3 i Igl-C4). Regioni koji su deletovani u cilju utišavanja lokusa označeni su oznakama za deleciju. Ove delecije uključuju sve aktivne V gene (1, 2 i 3) i intergenski segment između V2 i V3.

[0146] Slika 6

[0147] Topologija konstrukta IGKV1‑39/J-Ck sa intronom lociranim u liderskom otvorenom ramu čitanja (open reading frame, ORF).

[0149] Slika 7

[0150] Topologija konstrukta IGLV2‑14/J-Ck sa intronom lociranim u liderskom otvorenom ramu čitanja (ORF).

[0152] Slika 8

[0153] Topologija konstrukta VkP-IGKV1‑39/J-Ck (VkP‑012). Promotor počinje od IGKV1‑39 gena i smešten je direktno ispred elemenata potrebnih za efikasnu transkripciju i translaciju. Intergenske sekvence (uključujući enhensere) izvedene su iz miševa i dobijene iz BAC klonova. C-kapa sekvenca kodira kapa konstantni region pacova.

[0154] Slika 9

[0155] Topologija konstrukta VkP-IGLV2‑14/J-Ck (VkP‑2a2). Promotor počinje od IGKV1‑39 gena i smešten je direktno ispred elemenata potrebnih za efikasnu transkripciju i translaciju. Intergenske sekvence (uključujući enhensere) izvedene su iz miševa i dobijene iz BAC klonova. C-kapa sekvenca kodira kapa konstantni region pacova.

[0156] Slika 10

[0157] Topologija konstrukta VkP-IGKV1‑39/J-Ck-Δ1 (VkP-O12-del1) identična je sa VkP-IGKV1‑39/J-Ck sa Slike 9 osim što je uklonjen intronski enhenserski region.

[0159] Slika 11

[0160] Topologija konstrukta VkP-IGKV1‑39/J-Ck-Δ2 VkP-O12-del2) identična je sa VkP-IGKV1‑39/J-Ck- Δ1 sa Slike 10 osim što je deletovan veliki deo intergenskog regiona između Ck gena i 3’enhensera. Pored toga, smanjena je veličina 3’ enhensera sa 809 bp na 125 bp.

[0162] Slika 12

[0163] Pregled sekvenci koje su korišćene ili na koje se upućuje u ovoj patentnoj prijavi.

[0164] Slika 13

[0165] Generisanje Rosa26-IgVk1‑39 KI alela. (A) Šematizovani crtež pCAGGS-IgVK1‑39 ciljajućeg vektora. (B) Nukleotidna sekvenca pCAGGS-IgVK1‑39 ciljajućeg vektora. (C) Strategija ciljanja.

[0167] Slika 14

[0169] (A) Southern blot analiza genomske DNK ES klonova koji sadrže inserciju pCAGGS-IgVK1‑39 ciljajućeg vektora. Genomska DNK 4 nezavisna klona digestirana je korišćenjem AseI i ispitana pomoću 5e1 koji ukazuje na 5’-granicu ciljajućeg vektora. Svi klonovi sadrže ispravnu inserciju ciljajućeg vektora na 5’ kraju.

[0170] (B) Southern blot analiza genomske DNK ES klonova koja sadrži inserciju pCAGGS-IgVK1‑39 ciljajućeg vektora. Genomska DNK 4 nezavisna klona digestirana je korišćenjem MscI i ispitana pomoću 3e1 koji ukazuje na 3’-granicu ciljajućeg vektora. Svi klonovi sadrže ispravnu inserciju ciljajućeg vektora na 3’ kraju.

[0173] 2

[0174] (C) Southern blot analiza genomske DNK ES klonova koja sadrži inserciju pCAGGS-IgVK1‑39 ciljajućeg vektora. Genomska DNK 4 nezavisna klona digestirana je korišćenjem BamHI i ispitana pomoću unutrašnje Neo probe koja ukazuje na 5’-granicu ciljajućeg vektora. Svi klonovi sadrže ispravnu jednu inserciju ciljajućeg vektora.

[0176] Slika 15

[0177] Generisanje Rosa26-IgVI2‑14 KI alela. (A) Šematizovani crtež pCAGGS-IgVL2‑14 ciljajućeg vektora. (B) Nukleotidna sekvenca pCAGGS-IgVL2‑14 ciljajućeg vektora koja sadrži CAGGS ekspresioni insert baziran na rearanžiranom IGLV2‑14/J V lambda regionu germinativne linije (IGLV2‑14/J-Ck). (C) Strategija ciljanja.

[0179] Slika 16

[0180] Epibase<®>profil IGKV1‑39 rezidua 1‑107. Podslika A prikazuje snagu vezivanja DRB1 alotipova, dok C prikazuje snagu vezivanja DRB3/4/5, DQ i DP alotipova. Vrednosti na slici predstavljaju konstante disocijacije (dissociation constant, Kd) i nanete su na logaritamsku skalu u rasponu 0.01 µM - 0.1 pM (veoma snažni vezivači mogu izaći izvan dijagrama). Za peptide sa srednjim vezivanjem date su samo kvalitativne vrednosti, a slabi vezivači ili nevezivači nisu prikazani. Vrednosti su prikazane na prvoj rezidui peptida u ciljnoj sekvenci (sam peptid se pruža još 9 rezidua). Što je važno, za svaki peptid prikazan je samo najsnažniji receptor za vezivanje: alotipovi koji reaguju unakrsno sa nižim afinitetom nisu vidljivi na ovom dijagramu. Najjači vezujući receptor označen je svojim serotipskim imenom. Konačno, svi peptidi filtrirani germinativnom linijom prikazani su svetlijom bojom na mapi epitopa (u ovom slučaju nisu pronađeni nesopstveni epitopi). Podslika B prikazuje promiskuitet vezivanja HLA za svaki dekamerni peptid (Y-osa: broj HLA alotipova koji prepoznaju kritične epitope u svakom od peptida počevši od naznačene rezidue prikazane na X-osi). Promiskuitet se meri kao broj alotipova od ukupno 47 za koje je peptid kritični vezivač. Beli stubići odnose se na sopstvene peptide, a crni stubići (ovde ih nema) na nesopstvene peptide.

[0182] Slika 17

[0183] Epitopska mapa IGKV1‑39 prikazuje prisustvo peptidnih vezivača predviđenih u sekvenci IGKV1‑39 po serotipu, u 15-mernom formatu. Svaki 15-mer je numerisan kako je naznačeno na vrhu slike. Puna sekvenca odgovarajućeg 15-mera navedena je u Tabeli 7. Crne kućice označavaju prisustvo jednog ili više kritičnih sopstvenih epitopa u 15-meru za serotip naveden sa leve strane. Kritični epitopi su operacionalno definisani kao jaki ili srednji vezivači DRB1 i jaki vezivači DRB3/4/5 ili DP ili DQ.

[0185] Slika 18

[0186] Konstitutivni nokaut (knock-out, KO) Ig kapa lokusa. (A) Strategija ciljanja. (B) Šematizovani crtež pIgKapa ciljajućeg vektora.

[0188] Slika 19

[0189] Konstitutivni KO Ig lambda lokusa. (A) Prvi korak strategije ciljanja. (B) Drugi korak strategije ciljanja.

[0191] Slika 20

[0192] Šematizovani crtež ciljajućih vektora. (A) pVkP-O12 (VkP-IGKV1‑39/J-Ck); (B) pVkP-O12-del1 (VKP-IGKV1‑39/JCk-Δ1); (C) pVkP-O12-del2 (VkP-IGKV1‑39/J-Ck-Δ2).

[0194] Slika 21

[0195] Strategije ciljanja za inserciju transgena u Rosa26 lokus ciljanom transgenezom uz korišćenje RMCE. (A) VkPO12 (VkP-IGKV1‑39/J-Ck); (B) VkP-O12-del1 (VkP-IGKV1‑39/J-Ck-Δ1); (C) VkP-O12-del2 (VkP-IGKV1‑39/J-Ck-Δ2).

[0197] Slika 22

[0198] Topologija MV1057 vektora. Zamenom naznačenog fragmenta punjenja VH fragmentom dobija se ekspresioni vektor koji se može transfektovati u eukariotske ćelije za proizvodnju IgG1 antitela sa lakim lancima koji sadrže VL gen 012 (IGKV1‑39).

[0199] Slika 23

[0200] Odsustvo ekspresije transgenog humanog Vk1lakog lanca u populacijama ne-B ćelija slezine.

[0202] Slika 24

[0203] Transgeni humani Vk1 laki lanac se eksprimira u svim populacijama B ćelija slezine.

[0204] Slika 25

[0205] Transgeni humani Vk1 laki lanac se eksprimira u B1 ćelijama peritonealne šupljine.

[0208] 2

[0209] Slika 26

[0210] Transgeni humani Vk1 laki lanac se ne eksprimira u pro‑ i pre-B ćelijama nego u nezrelim i recirkulišućim populacijama B ćelija u koštanoj srži. (A) Ograđivanje ćelija koštane srži. (B) Histogrami ekspresije transgena sa preklapanjem iz jedne WT kontrole.

[0211] Slika 27

[0212] Transgeni humani Vk1 laki lanac direktno korelira sa endogenim lakim lancem i ekspresijom IgM u cirkulišućim B ćelijama u krvi.

[0214] Primeri.

[0216] Primer 1

[0218] Klonovi V gena humanog lakog lanca

[0220] Ovaj primer opisuje razloge izbora dva V-gena humanog lakog lanca, jednog gena tipa kapa i jednog gena tipa lambda, koji se koriste kao dokaz koncepta transgenih miševa koji eksprimiraju laki lanac. De Wildt et al. 1999 (de Wildt et al. (1999) J. Mol. Biol.285(3):895) analizirali su ekspresiju humanih lakih lanaca u perifernim IgG-pozitivnim B-ćelijama. Na osnovu ovih podataka, IGKV1‑39 (012) i IGLV2‑14 (2a2) odabrani su kao laki lanci jer su oni bili dobro reprezentovani u repertoaru B ćelija. Sekvenca J-segmenta lakih lanaca bila je odabrana na osnovu sekvenci prikazanih u GenBank ABA26122 za IGKV1‑39 (Rabquer,B.J., Smithson,S.L., Shriner,A.K. and Westerink, M.A.J.) i GenBank AAF20450 za IGLV2‑14 (Ignatovich,O., Tomlinson,I.M., Popov,A.V., Bruggemann,M. and Winter,G. J. Mol. Biol.294 (2), 457‑465 (1999)).

[0221] Svi segmenti okvira konvertuju se u aminokiselinske sekvence germinativne linije kako bi se osigurala najniža moguća imunogenost u potencijalnim kliničkim primenama.

[0223] Primer 2

[0225] Dobijanje V-gena teškog lanca miša, koji se sparuju sa humanim IGKV1‑39 genskim segmentom kako bi formirali funkcionalna mesta vezivanja antitela

[0226] Ovaj primer opisuje identifikaciju V-gena teškog lanca miša, koji mogu da se sparuju sa jednim rearanžiranim IGKV1‑39/J regionom humane germinativne linije. Repertoar VH slezine miševa koji su imunizovani tetanusnim toksoidom kloniran je u vektor za prikazivanje Fab na fagima sa jednim humanim IGKV1‑39-C kapa lakim lancem i podvrgnut afinitetnoj selekciji u odnosu na tetanusni toksoid. Klonovi dobijeni posle jedne runde afinitetne selekcije analizirani su u pogledu specifičnosti vezivanja. Mišji VH geni koji kodiraju Fab fragmente specifične za

[0229] 2

[0230] tetanusni toksoid podvrgnuti su sekvencionoj analizi kako bi se identifikovali jedinstveni klonovi i dodelila VH, DH i JH iskoristljivost.

[0231] Mnogi od ovde opisanih protokola su standardni protokoli za konstruisanje biblioteka prikazivanja na fagima i afinitetnu selekciju faga u pogledu vezivanja za antigen od interesa, a opisani su u Antibody Phage Display: Methods and Protocols (editor(i): Philippa M. O’Brien, Robert Aitken).

[0233] Imunizacije

[0235] BALB/c miševi primili su jednu imunizaciju tetanusnim toksoidom i posle 6 nedelja odgovor je pojačan tetanusnim toksoidom.

[0237] Izolacija splenocita

[0239] Pripremanje suspenzije slezinskih ćelija. Posle disekcije, slezina se ispere pomoću PBS i prenese u Petrijevu posudu od 60 mm, sa 20 ml PBS. Špric sa čepom, sa 20 ml PBS i iglom G20 koriste se za ponavljano ispiranje slezine. Pošto se sprane ćelije isperu korišćenjem PBS, ćelije se pažljivo uvedu u suspenziju pomoću 20 ml PBS i ostave na radnoj površini 5 minuta kako bi se splenociti odvojili od detritusa i ćelijskih klastera. Suspenzija splenocita prenese se na vrh tube napunjene Ficoll-Paque™ PLUS i obradi prema procedurama proizvođača, da bi se izolovali limfociti (Amersham Biosciences).

[0241] Izolacija RNK i sinteza cDNK

[0243] Posle izolacije i peletiranja limfocita, ćelije se suspenduju u TRIzol LS reagensu (Invitrogen) za izolaciju ukupne RNK prema priloženom protokolu proizvođača i podvrgnu reakciji reverzne transkripcije korišćenjem 1 mikrograma RNK, Superscript III RT u kombinaciji sa dT20 prema procedurama proizvođača (Invitrogen).

[0245] PCR amplifkacija cDNK

[0247] cDNK se amplifikuje u PCR reakciji korišćenjem kombinacija prajmera koje omogućavaju amplifikaciju približno 110 različitih mišjih V-gena svrstanih u 15 VH familija (tabela 1; RefSeq NG_005838; Thiebe et al., 1999. European Journal of Immunology 29: 2072 - 2081). U prvoj rundi, koriste se kombinacije prajmera koji se vezuju za 5’ kraj V-gena i 3’ kraj J regiona. U drugoj rundi, PCR proizvodi koji su nastali MJH-Rev2 prajmerom amplifikuju se u cilju uvođenja modifikacija u 3’ regionu da bi se omogućilo efikasno kloniranje proizvoda. U

[0250] 2

[0251] poslednjoj rundi amplifikacije, svi PCR proizvodi se amplifikuju uz korišćenje prajmera koji uvode SfiI restrikciono mesto na 5’ kraju i BstEII restrikciono mesto na 3’ kraju (vidi slike 1 i 2, i tabelu 1).

[0252] Reakcioni uslovi za 1. rundu PCR: 4 različite reakcije kombinuju svih 25 nizvodnih prajmera (MVH1 do MVH25, tabela 1 i slika 2) i jedan uzvodni prajmer po reakciji (MJH-Rev1, MJH-Rev2, MJH-Rev3 ili MJH-Rev4; vidi tabelu 1 i sliku 2). Zapremine za PCR od 50 mikrolitara sastave se od 2 mikrolitra cDNK (iz RT reakcija), 10 mikrolitara 5* Phusion polimeraza HF pufera, 40 nM svakog od 25 nizvodnih prajmera (ukupna koncentracija od 1 mikromola), 1 mikromolarnog uzvodnog prajmera, 1 mikrolitra 10 mM dNTP stok rastvora, 1.25 jedinica Phusion polimeraze i sterilne MQ vode. Program termociklera sastojao se od touch down programa: 1 ciklus 98°C tokom 30 sekundi, 30 ciklusa 98°C tokom 10 sekundi, 58°C snižavanje 0.2°C po ciklusu 10 sekundi, 72°C 20 sekundi i 1 ciklus 72°C tokom 3 minuta. Druga runda PCR programa podešena je samo za proizvode 1. PCR koji sadrže MJH-Rev2 prajmer: 2 različite reakcije koje kombinuju ExtMVH‑1 ili ExtMVH‑2 prajmere (tabela 1 i slika 2) u kombinaciji sa uzvodnim prajmerom ExtMJH-Rev2int (tabela 1 i slika 2). Zapremine za PCR od 50 mikrolitara sastave se od 50 ng PCR proizvoda (iz prve runde PCR), 10 mikrolitara 5* Phusion polimeraza HF pufera, 500 nM svakog od nizvodnih prajmera, 1 mikromolarnog uzvodnog prajmera, 1 mikrolitra 10 mM dNTP stok rastvora, 1.25 jedinica Phusion polimeraze i sterilne MQ vode. Program termociklera sastojao se od touch down programa praćenog regularnim korakom amplifikacije: 1 ciklus 98°C tokom 30 sekundi, 10 ciklusa 98°C tokom 10 sekundi, 65°C smanjenje 1.5°C po ciklusu 10 sekundi, 72°C 20 sekundi, 10 ciklusa 98°C tokom 10 sekundi, 55°C 10 sekundi, 72°C 20 sekundi i 1 ciklus 72°C tokom 3 minuta. Treća runda PCR programa podešena je kao što je opisano na slici 2. Zapremine za PCR od 50 mikrolitara sastave se od 50 ng PCR proizvoda (iz ranijih rundi PCR, slika 2), 10 mikrolitara 5* Phusion polimeraza HF pufera, 1 mikromolarnog nizvodnog prajmera (tabela 1 i slika 2), 1 mikromolarnog uzvodnog prajmera, 1 mikrolitra 10 mM dNTP stok rastvora, 1.25 jedinica Phusion polimeraze i sterilne MQ vode. Program se sastoji od touch down programa praćenog regularnim korakom amplifikacije: 1 ciklus 98°C tokom 30 sekundi, 10 ciklusa 98°C tokom 10 sekundi, 65°C smanjenje 1.5°C po ciklusu 10 sekundi, 72°C 20 sekundi, 10 ciklusa 98°C tokom 10 sekundi, 55°C 10 sekundi, 72°C 20 sekundi i 1 ciklus 72°C tokom 3 minuta. Posle PCR amplifikacija, svi PCR proizvodi se prečiste na gelu uz korišćenje Qiaex II prema protokolima proizvođača.

[0255] 2

[0256] Digestije restrikcionim enzimima

[0258] Prečišćeni proizvodi digestiraju se u dva koraka, korišćenjem BstEII i SfiI. Prvo se 1 mikrogram DNK digestira u reakcionim smešama od 100 mikrolitara koje se sastoje od 10 mikrolitara 10* NEB pufera 3 (New England Biolabs), 1 mikrolitra 100* BSA, 12.5 jedinica BstEII i sterilne vode, tokom 6 sati na 60°C u pećnici. Prozvodi se prečiste korišćenjem PCR kita za prečišćavanje, proizvođača Qiagen, prema uputstvima za upotrebu i eluiraju u 40 mikrolitara vode. Zatim se svi proizvodi dalje digestiraju korišćenjem SfiI u reakcionim smešama od 100 mikrolitara koje se sastoje od 10 mikrolitara 10* NEB pufera 2 (New England Biolabs), 1 mikrolitra 100* BSA, 12.5 jedinica SfiI i sterilne vode, tokom 12 sati na 50°C u pećnici. Digestirani fragmenti se prečiste pomoću Qiaquick Gel kita za ekstrakciju, posle separacije na gelu na 20 cm 1.5% agarozi TBE plus etidijum bromid, na 80 V.100 mikrograma akceptorskog vektora (MV1043, slike 3 i 12) digestira se pomoću 50 jedinica Eco91I u 600 mikrolitara pod standardnim uslovima (Tango pufer) i zatim prečisti na 0.9% agaroznom gelu. Posle drugog koraka digestije pod propisanim uslovima, uz korišćenje 400 jedinica SfiI u 500 mikrolitara tokom 12 sati, doda se 100 jedinica BsrGI u trajanju od 3 sata na 50°C.

[0260] Ligacije

[0262] Ligacija svakog PCR proizvoda vrši se zasebno prema sledećoj šemi: 70 ng digestiranih PCR proizvoda, 300 ng digestiranog akceptorskog vektora, 100 jedinica T4 ligaze (NEB), 1* ligaznog pufera u 30 mikrolitara, tokom 16 sati na 12°C. Reakcione smeše ligacije se prečiste ekstrakcijama fenol/hloroform/izoamil alkoholom, što je praćeno precipitacijama glikogena (Sigma-Aldrich #G1767) prema protokolu proizvođača i konačno razblaže u 25 mikrolitara sterilne vode.

[0264] Transformacije i skladištenje biblioteka

[0266] Prečišćeni proizvodi ligacije transformišu se elektroporacijom uz korišćenje 1200 mikrolitara TG1 elektrokompetentnih bakterija (Stratagene #200123) po seriji ligacije i nanose na LB karbenicilinske ploče koje sadrže 4% glukozu. Biblioteke se prikupljaju struganjem bakterija u 50 ml LB karbenicilina. Posle centrifugiranja na 2000g tokom 20 minuta na 4°C, peleti bakterija se resuspenduju pažljivo u 2 ml ledenohladnog 2*TY/30% glicerola na ledenoj vodi i zamrznu na suvom ledu/etanolu pre nego što se uskladište na ‑80°C.

[0269] 2

[0270] Amplifikacija biblioteka

[0272] Biblioteke se gaje i sakupljaju prema postupcima koje su opisali Kramer et al. 2003 (Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res.31(11): e59) uz korišćenje VCSM13 (Stratagene) kao pomagačkog soja faga.

[0274] Selekcija faga na obloženim imunotubama

[0276] Tetanusni toksoid se rastvori u koncentraciji od 2 µg/ml i nanese na MaxiSorp Nuncimunotube (Nunc 444474) preko noći na 4°C. Posle odbacivanja rastvora za oblaganje, tube se blokiraju pomoću 2% obranog mleka (ELK) u PBS (blokirajući pufer) tokom 1 sata na RT. Paralelno, 0.5 ml fagne biblioteke se pomeša sa 1 ml blokirajućeg pufera i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi. Posle blokiranja, rastvor faga se doda tubama obloženim tetanusnim toksoidom i inkubira 2 sata na RT na spororotirajućoj platformi, da se omogući vezivanje. Zatim, tube se isperu 10 puta korišćenjem PBS/0.05% Tween‑20, što je praćeno eluiranjem faga inkubacijom sa 1 ml 50 mM glicin-HCl pH 2.2, 10 min na RT, na rotirajućem točku i direktno praćeno neutralizacijom prikupljenog eluenta pomoću 0.5 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5.

[0278] Prikupljanje fagnih klonova

[0280] 5 ml XL1-Blue MRF (Stratagene) kulture na O.D. 0.4 doda se prikupljenom rastvoru faga i inkubira 30 minuta na 37°C bez šejkiranja, da se omogući infekcija faga. Bakterije se nanesu na ploče sa karbenicilinom/tetraciklinom 4% glukozom 2*TY i gaje preko noći na 37°C.

[0281] Proizvodnja faga

[0283] Fagi se uzgajaju i obrađuju kako je opisano u Kramer et al.2003 (Kramer et al.2003. Nucleic Acids Res. 31(11): e59) uz korišćenje VCSM13 kao pomagačkog soja faga.

[0285] ELISA faga

[0287] [0100] ELISA ploče se oblože sa 100 mikrolitara tetanusnog toksoida po bunarčiću u koncentraciji od 2 mikrograma/ml u PBS, preko noći na 4°C. Ploče obložene sa 100 mikrolitara tiroglobulina u koncentraciji od 2 mikrograma/ml u PBS koriste se kao negativna kontrola. Bunačići se isprazne, osuše tapkanjem o papirni ubrus, potpuno napune PBS-4% obranim mlekom (ELK) i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi kako bi se bunarčići blokirali. Posle odlivanja rastvora za blokiranje, dodaju se minipreparati faga prethodno pomešani sa 50 μl rastvora za blokiranje i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi. Sledi 5 koraka ispiranja korišćenjem PBS-0,05% Tween-20 kojima uklanjaju nevezani fagi. Vezani fagi detektuju se inkubacijom bunarčića sa 100 mikrolitara anti-M13-HRP konjugata antitela (razblaženje 1/5000 u puferu za blokiranje) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Slobodna antitela uklanjaju se ponavljanjem koraka ispiranja kao što je gore opisano, posle čega sledi inkubacija sa TMB supstratom dok razvijanje boje ne postane vidljivo. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 100 mikrolitara 2 M H<2>SO<4>po bunarčiću i analizira na ELISA čitaču na talasnoj dužini emisije od 450 nm (Tabela 2). Veći brojevi označavaju jače signale i prema tome veću učestalost specifičnog vezivanja fag-Fab kompleksa

[0289] Sekvenciranje

[0291] Klonovi koji su dali signale najmanje 3 puta iznad pozadinskog signala (Tabela 2) se propagiraju, upotrebljavaju za procedure miniprep DNK (vidi priručnik za procedure Qiagen miniPrep) i podvrgavaju analizi nukleotidne sekvence. Sekvenciranje se sprovodi prema uputstvu koje je priloženo uz Big Dye 1.1 kit (Applied Biosystems) korišćenjem uzvodnog prajmera (CH1_Rev1, tabela 1) koji prepoznaje 5' sekvencu CH1 regiona teškog lanca humanog IgG1 (prisutnog u vektoru za prikazivanje Fab MV1043, slike 3 i 12). Sekvence VH miša iz 28 klonova koji vezuju tetanusni toksoid prikazane su u Tabeli 3. Rezultati pokazuju da selektovani mišji VH geni pripadaju različitim genskim familijama, a različiti pojedinačni članovi tih genskih familija mogu da se sparuju sa rearanžiranim humanim IGKV1‑39/J VH regionom kako bi formirali funkcionalna mesta vezivanja antitela specifična za tetanusni toksoid. Iz analiza sekvenci zaključeno je da mišji VH regioni koriste raznolike DH i JH genske segmente.

[0292] Primer 3

[0294] Utišavanje lokusa mišjeg kapa lakog lanca

[0296] Ovaj primer opisuje utišavanje endogenog lokusa lakog kapa lanca miša. Endogeni kapa lokus se modifikuje homolognom rekombinacijom u ES ćelijama, posle čega sledi uvođenje genetički modifikovanih ES ćelija u mišje embrione kako bi se dobilo genetički prilagođeno potomstvo.

[0297] Vektor koji sadrži asambliranu nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od dela koji sadrži J-region do 338 bp nizvodno od J5 genskog segmenta fuzionisan sa sekvencom koja završava 3' kraj 3' CK enhensera, koristi se za homolognu rekombinaciju u ES ćelijama. Asamblirana sekvenca koristi se za deleciju fragmenta genomske DNK koji se pruža od 3' JK regiona do samog 3' kraja 3' CK enhensera. Kao posledica ove procedure, uklanjaju se gen za konstantni CK, 3' enhenser i neki intergenski regioni (vidi slike 4 i 18).

[0300] 1

[0301] Konstruisanje ciljajućeg vektora

[0303] Vektor koji je primio bočne ručice od 4.5-8 kb na 3' i 5' kraju spojene sa segmentom delecije, koristi se za ciljanu homolognu rekombinaciju u ES ćelijskoj liniji. Obe ručice dobijene su pomoću PCR kako bi se osigurala maksimalna homologija. Strategija ciljanja omogućava generisanje konstitutivno KO alela. Mišja genomska sekvenca koja obuhvata Igk intronski enhenser, Igk konstantni region i Igk 3' enhenser zamenjuje se PuroR kasetom koja je bočno ograničena F3 mestima i insertovana nizvodno od Jk elemenata. Flp-posredovano uklanjanje selekcionog markera rezultovalo je konstitutivno KO alelom. Zamena genomskog regiona Igk MiEk-Igk C-Igk 3'E (pribl. 10 kb) F3-Puro kasetom (pribl. 3 kb) verovatno je smanjila efikasnost homologne rekombinacije. Stoga su ručice homologije u skladu sa tim proširene i posle transfekcije analizirano je više kolonija ES ćelija kako bi se identifikovali homologni rekombinantni klonovi.

[0305] Generisanje ES ćelija koje nose deletovani kapa fragment

[0307] Generisanje genetički modifikovanih ES ćelija suštinski se obavlja kako je opisano (Seibler et al. Nucleic Acids Res. 2003 feb. 15;31(4):e 12). Vidi i primer 14 za detaljan opis.

[0308] Generisanje ES miševa komplementacijom tetraploidnih embriona.

[0310] Proizvodnja miševa komplementacijom tetraploidnih embriona uz korišćenje modifikovanih ES ćelija suštinski se izvodi kako je opisano (Eggan et al., PNAS 98, 6209‑6214; Seibler J, et al. Nucleic Acids Res.2003 feb. 15;31(4):e12; Hogan et al., (Summary of mouse development. Manipulating the Mouse Embryo, (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), str.253‑289.)).

[0312] Primer 4

[0314] Utišavanje lokusa lambda lakog lanca miša

[0316] Ovaj primer opisuje utišavanje endogenog lokusa lambda lakog lanca miša. Endogeni lokus lambda se modifikuje homolognom rekombinacijom u ES ćelijama, što je praćeno uvođenjem genetički modifikovanih ES ćelija u mišje embrione da bi se dobilo genetički prilagođeno potomstvo.

[0317] Dva regiona mišjeg lokusa lambda koji zajedno sadrže sve funkcionalne lambda V regione podvrgnu se deleciji.

[0320] 2

[0321] Prvi region koji je cilj delecije na bazi homologne rekombinacije je region koji je lociran 408 bp uzvodno od start-mesta IGLV2 genskog segmenta i završava se 215 nizvodno od IGLV3 genskog segmenta, uključujući niz intergenske sekvence između ovih IGLV genskih segmenata. Drugi region koji je podvrgnut deleciji uključuje IGLV1 genski segment koji se sastoji od fragmenta koji se pruža od 392 bp uzvodno do 171 bp nizvodno od IGLV1 genskog segmenta. Kao posledica ova dva koraka delecije, svi funkcionalni V-lambda genski segmenti su deletovani, čineći lokus funkcionalno neaktivnim (slike 5 i 19).

[0323] Konstruisanje ciljajućih vektora

[0325] Vektori koji su primili bočne ručice od 3‑9.6 kb na 3’ i 5’ kraju, fuzionisane za delecioni segment, koriste se za ciljanu homolognu rekombinaciju u ES ćelijskoj liniji. Obe ručice su dobijene putem PCR čime se osigurava maksimalna homologija. U prvom koraku, mišja genomska sekvenca koja obuhvata Igl V2-V3 regione zamenjuje se PuroR kasetom bočno ograničenom F3 mestima, što daje konstitutivno KO alel posle Flp-posredovanog uklanjanja selekcionog markera (vidi sliku 19A). U drugom koraku, mišja genomska sekvenca koja obuhvata Igl V1 region zamenjuje se Neo kasetom u ES ćelijskim klonovima koji već nose deleciju Igl V2-V3 regiona (vidi sliku 19B). Selekcioni marker (NeoR) je bočno ograničen FRT mestima. Konstitutivno KO alel dobija se posle Flp-posredovanog uklanjanja selekcionih markera

[0327] Generisanje ES ćelija koje nose deletovani lambda fragment

[0329] Generisanje genetički modifikovanih ES ćelija suštinski se obavlja kako je opisano (Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 feb. 15;31(4):e12). Vidi i primer 14 za detaljan opis. Da bi se pokazalo da se oba ciljajuća događaja dešavaju na istom hromozomu, nekoliko dvostruko ciljanih klonova selektuje se za in vitro deleciju sa pCMV C31deltaCpG. Klonovi se ekspandiraju uz pritisak antibioticima, na mitotički inaktiviranom hranljivom sloju koji se sastoji od mišjih embrionalnih fibroblasta u DMEM medijumu sa visokim sadržajem glukoze, koji sadrži 20% FCS (PAN) i 1200 u/mL leukemijskog inhibitornog faktora (Millipore ESG 1107).1x10<7>ćelija iz svakog klona elektroporiše se sa 20 µg cirkularnog pCMV C31deltaCpG na 240 V i 500 µF i nanese na četiri 10 cm-ske posude.2 - 3 dana posle elektroporacije ćelije se sakupe i analiziraju pomoću PCR. Prajmeri su bili:

[0330] 2005_5: CCCTTTCCAATCTTTATGGG

[0331] 2005_7: AGGTGGATTGGTGTCTTTTTCTC

[0332] 2005_9: GTCATGTCGGCGACCCTACGCC

[0334] PCR reakcije se izvode u smešama koje sadrže 5 µl PCR pufera 10x (Invitrogen), 2 µl MgCl<2>(50 mM), 1 µl dNTP (10 mM), 1 µl prvog prajmera (5 pM), 1 µl drugog prajmera (5 pM), 0.4 µl Taq (5 U/ul, Invitrogen), 37.6µl H<2>O, i 2 µl DNK. Korišćen je program 95°C 5’; praćeno sa 36 ciklusa od 95°C 30"; 60°C 30"; 72°C 1’; praćeno sa 72°C 10’.

[0336] Generisanje ES miševa tetraploidnom embrionskom komplementacijom.

[0338] Proizvodnja miševa tetraploidnom embrionskom komplementacijom uz korišćenje genetički modifikovanih ES ćelija suštnski se izvodi kako je opisano (Eggan et al., PNAS 98, 6209‑6214; Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 feb. 15;31(4):e12; Hogan et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), str.253‑289).

[0340] Primer 5

[0342] Konstruisanje CAGGS ekspresionog inserta na bazi rearanžiranog IGKV1‑39/J-Ck gena humane germinativne linije (IGKV1‑39/J-Ck)

[0344] Ovaj primer opisuje konstruisanje CAGGS ekspresione kasete koja inkorporiše rearanžirani IGKV1‑39/J region humane germinativne linije. Ova insertska ekspresiona kaseta obuhvata klonirajuća mesta, Kozak sekvencu, lidersku sekvencu koja sadrži intron, otvoreni ram čitanja rearanžiranog IGKVI‑39 regiona, CK konstantni region pacova iz alela a i stopsekvencu translacije (IGKV1‑39/J-Ck; slika 6). Primarni konstrukt sastoji se od prirodnih sekvenci i bio je analiziran i optimizovan uklanjanjem neželjenih cis-delujućih elemenata kao što su unutrašnji TATA-boksovi, poliadenilacioni signali, chi-mesta, mesta ulaska ribozoma, nizovi sekvenci bogati AT ili bogati GC, ARE‑, INS‑ i CRS sekvencioni elementi, ponavljajuće sekvence, RNK sekundarne strukture, (kriptička) splajsujuća donorska i akceptorska mesta i tačke grananja splajsovanja (GeneArt GmbH). Pored toga, upotreba kodona u regionima otvorenog rama čitanja optimizovana je za ekspresiju u miševima. Intronska sekvenca je nepromenjena i prema tome predstavlja sekvencu koja je identična sa kodirajućim delom humanog IGKV1‑39 liderskog introna.

[0347] 4

[0348] Na 5’ kraju ekspresione kasete, introdukovano je NotI mesto i na 3’ mestu NheI mesto. Oba mesta se upotrebljavaju za kloniranje u CAGGS ekspresioni modul. Posle asambliranja gena u skladu sa postupcima koje koristi GeneArt, insert se digestira pomoću NotI-NheI i klonira u ekspresioni modul koji sadrži CAGGS promotor, sekvencu zaustavljanja bočno ograničenu LoxP mestima (’floxed’), sekvencu poliadenilacionog signala i, na 5’ i 3’ kraju, sekvence za olakšavanje homologne rekombinacije u Rosa26 lokusu mišjih ES ćelijskih linija. Promotorski i/ili cDNK fragmenti se amplifikuju korišćenjem PCR, potvrđuju sekvenciranjem i/ili kloniraju direktno iz dostavljenih plazmida u RMCE razmenjivački vektor koji nosi naznačene osobine. Šematizovani crtež i potvrđena sekvenca konačnog ciljajućeg vektora pCAGGSIgVK1‑39 prikazani su na slici 13A i 13B. Strategija ciljanja prikazana je na slici 13C.

[0349] Primer 6

[0351] CAGGS ekspresioni insert na bazi rearanžiranog IGLV2‑14/J V lambda regiona germinativne linije (IGLV2‑141J-Ck)

[0353] Ovaj primer opisuje sekvencu i inserciju ekspresione kasete sa inkorporisanim rearanžiranim IGLV2‑14/J V lambda regionom germinativne linije. Ovaj insert obuhvata klonirajuća mesta, Kozak sekvencu, lidersku sekvencu koja sadrži intron, otvoreni ram čitanja rearanžiranog IGLV2‑14/J regiona, CK konstantni region pacova iz alela a i stop-sekvencu translacije (IGLV2‑141J-Ck; slika 7). Primarni konstrukt sastoji se od prirodnih sekvenci i bio je analiziran i optimizovan uklanjanjem neželjenih cis-delujućih elemenata kao što su: unutrašnji TATA-boksovi, poliadenilacioni signali, chi-mesta, mesta ulaska ribozoma, nizovi sekvenci bogati AT ili bogati GC, ARE‑, INS‑ i CRS sekvencioni elementi, ponavljajuće sekvence, RNK sekundarne strukture, (kriptička) splajsujuća donorska i akceptorska mesta i tačke grananja splajsovanja (GeneArt GmbH). Pored toga, upotreba kodona u regionima otvorenog rama čitanja optimizovana je za ekspresiju u miševima. Intronska sekvenca je nepromenjena i prema tome predstavlja sekvencu koja je identična sa humanim IGKV1‑39 liderskim intronom.

[0354] [0116] ] Na 5’ kraju ekspresione kasete, introdukovano je NotI mesto i na 3’ mestu NheI mesto. Oba mesta se upotrebljavaju za kloniranje u CAGGS ekspresioni modul kako je opisano od strane TaconicArtemis. Posle asambliranja gena u skladu sa postupcima koje koristi GeneArt, insert se digestira pomoću NotI-NheI i klonira u ekspresioni modul koji sadrži CAGGS promotor, sekvencu zaustavljanja bočno ograničenu LoxP mestima (’floxed’), sekvencu poliadenilacionog signala i, na 5’ i 3’ kraju, sekvence za olakšavanje homologne rekombinacije u Rosa26 lokusu mišjih ES ćelijskih linija. Za konstruisanje konačnog ROSA26 RMCE ciljajućeg vektora, promotorski i/ili cDNK fragmenti se amplifikuju korišćenjem PCR. Amplifikovani proizvodi se potvrđuju sekvenciranjem i/ili kloniraju direktno iz dostavljenih plazmida u RMCE razmenjivački vektor koji nosi naznačene osobine. Šematizovani crtež i potvrđena sekvenca konačnog ciljajućeg vektora pCAGGS-IgVL2‑14 prikazani su na slici 15A i 15B. Strategija ciljanja prikazana je na slici 15C.

[0356] Primer 7

[0358] Ekspresija IGKV1‑39/J-Ck u HEK293 ćelijskim linijama (pSELECT-IGKV1‑39/J-Ck)

[0360] Ovaj primer opisuje postupak za verifikovanje da IGKV1‑39/J-Ck konstrukti opisani u primeru 5 omogućavaju ekspresiju i detekciju IGKV1‑39/J-Ck L lanca u HEK293 ćelijama. IGKV1‑39/J insert (slika 6) modifikovan je na 5’ kraju promenom NotI mesta u SalI mesto. Ova promena je potrebna za kloniranje proizvoda u plazmid sa ekspresionom kasetom pSELECT-hygro (InvivoGen). CAGGS ekspresioni insert IGKV1‑39/J-Ck i pSELECT-hygro digestiraju se pomoću Sall i NheI, izvrši se ligacija i upotrebe se za transformaciju kompetentnih XL1-Blue ćelija uz korišćenje standardnih tehnika. Kolonije se sakupe i DNK se prečisti korišćenjem Qiagen Midi-prep kolona prema procedurama proizvođača. Rezultujući ekspresioni vektor lakog lanca (LC) nazvan 0817676_pSELECT_0815426 koristi se da se HEK293 ćelije transfektuju sa Fugene6 (Roche) prema protokolima proizvođača. Supernatanti se pretraže u pogledu prisustva IGKVI‑39/J-Ck lakih lanaca upotrebom ELISA i western blota uz korišćenje antipacovskih-Ck antitela (Beckton Dickinson #550336 i 553871) i protokola koji se koriste u struci.

[0361] VH iz IgG MG1494 protiv tetanusnog toksoida (TT) klonira se u IgG ekspresioni vektor MV1056 korišćenjem restrikcionih mesta SfiI i BatEII. Verifikuje se sekvenca rezultujućeg klona. HEK293T ćelije se transfektuju sa pet različitih kombinacija vektora kao što je prikazano u Tabeli 4 (vidi primer 8 za detalje vektora 0817878_pSELECT_0815427). Supernatanti se sakupe i odrede se koncentracije IgG (vidi Tabelu 4). IgG nije mogao da se detektuje za supernatante A i B koji sadrže samo laki lanac, kao što se očekivalo (detekciono antitelo prepoznalo je Fc deo IgG). Koncentracija IgG u supernatantima C i D bila je uporediva sa koncentracijom pozitivnog kontrolnog supernatanta E, što ukazuje na ispravnu ekspresiju konstrukata lakog lanca.

[0362] Vezivanje za TT je analizirano pomoću ELISA da bi se proverila funkcionalnost proizvedenih antitela, uz korišćenje hemoglobina kao negativnog kontrolnog antigena. TTspecifično vezivanje nije moglo da se detektuje za supernatante A i B koji sadrže samo laki lanac, kao što se očekivalo. TT-specifično vezanje za supernatante C i D bilo je bar jednako dobro kao i za pozitivni kontrolni supernatant E, što je potvrdilo ispravnu ekspresiju konstrukata lakog lanca i funkcionalno asambliranje sa teškim lancem. Antitela su detektovana ne samo korišćenjem antihumanog IgG sekundarnog antitela, već i korišćenjem sekundarnog antitela na Ckapa laki lanac pacova. Rezultati potvrđuju da antipacovsko Ckapa antitelo (BD Pharmingen #553871, klon MRK‑1) prepoznaje laki lanac eksprimiran pSELECT vektorima.

[0363] Supernatanti su analizirani neredukujućom SDS-PAGE i western blotom (nije prikazano). Detekcija korišćenjem antitela na teški lanac humanog IgG nije pokazala trake za supernatante A i B koji sadrže samo laki lanac, kao što se očekivalo. Rezultati za supernatante C i D bili su uporedivi sa pozitivnim kontrolnim supernatantom E, sa trakom blizu markera za 170 kD kao što se očekuje za intaktni IgG. Dodatne trake za niže molekulske težine zapažene su i za supernatante C, D i E, što bi moglo predstavljati degradacione proizvode, fragmente IgG koji su rezultat (delimične) redukcije i/ili trake irelevantnih proteina zbog nespecifičnog vezivanja detekcionog antitela.

[0364] Detekcija uz korišćenje antitela na Ckapa laki lanac pacova pokazala je traku blizu markera za 26 kD za supernatante A i B, kao što je očekivno za samo laki lanac. Ova traka je mnogo intenzivnija za A u poređenju sa B, što ukazuje na to da se IGKV1‑39 laki lanac bolje eksprimira i/ili je stabilniji nego slobodni IGLV2‑14 laki lanac. Nisu detektovane trake za kontrolni supernatant E, kao što se očekivalo, jer eksprimirani IgG sadrži humani Ckapa laki lanac. Za supernatante C i D, zapažene su očekivane trake u blizini markera za 170 kD; trake niže molekulske težine takođe su zapažene, ali u manjoj meri nego gore uz korišćenje antitela na humani IgG.

[0365] U zaključku, transfekcija ekspresionih konstrukata lakog lanca u kombinaciji sa teškim lancem IgG MG 1494 protiv tetanusnog toksoida (TT) rezultovala je proizvodnjom IgG koja je uporediva sa konstruktom pozitivne kontrole, i za pSELECT kapa i za lambda konstrukte lakog lanca. Proizvodnje oba IgG dale su ELISA signale u TT ELISA koji su bili bolji ili uporedivi sa kontrolnim IgG. SDS-PAGE i western blot analiza potvrdile su prisustvo intaktnog IgG. Testirano antipacovsko Ckapa antitelo delovalo je efikasno i u ELISA i u western blotu. Supernatant kulture iz ćelija transfektovanih samo konstruktima lakog lanca nije rezultovao detektabilnom proizvodnjom IgG ni detektabilnim TT-specifičnim vezivanjem, dok je slobodni laki lanac detektovan na western blotu.

[0366] Primer 8

[0368] Ekspresija IGLV2‑14/J-Ck u HEK293 ćelijskim linijama (pSELECT-IGLV2‑14/J-Ck)

[0370] Ovaj primer opisuje postupak za verifikovanje da IGLV2‑14/J konstrukti opisani u primeru 6 omogućavaju ekspresiju i detekciju IGLV2‑14/J-Ck L lanca u HEK293 ćelijama. IGLV2‑14/J-Ck insert (slika 7) modifikovan je na 5’ kraju promenom NotI mesta u SalI mesto. Ova promena je potrebna za kloniranje proizvoda u ekspresioni kasetni plazmid pSELECT-hygro (InvivoGen). CAGGS ekspresioni insert IGLV2‑14/J-Ck i pSELECT-hygro digestiraju se pomoću SalI i NheI, izvrši se ligacija i koriste se za transformaciju kompetentnih XL1-Blue ćelija uz korišćenje standardnih tehnika. Kolonije se sakupe i DNK prečisti korišćenjem Qiagen Midi-prep kolona prema procedurama proizvođača. Rezultujući ekspresioni vektor lakog lanca (LC) nazvan 0817678_pSELECT_0815427 upotrebljen je za transfekciju HEK293 ćelija sa Fugene6 (Roche) prema protokolima proizvođača. Supernatanti se pretražuju u pogledu prisustva IGLV2‑14/J-Ck lakih lanaca upotrebom ELISA i western blota uz korišćenje antipacovskih-Ck antitela (Beckton Dickinson #550336 i 553871) i protokola koji se koriste u struci. Vidi primer 7 za detalje i rezultate.

[0372] Primer 9

[0374] Konstruisanje ekspresionog konstrukta vođenog VK promotorom, koji sadrži IGKV1‑39/J insert i višestruke enhenserske elemente izvedene iz mišjeg CK lokusa (VkP-IGKV1‑39/J-Ck; VkP-O12)

[0376] Ovaj primer opisuje konstruisanje ekspresione kasete koja sadrži relevantne elemente za omogućavanje za B ćelije i stupanj njihovog razvoja/diferencijacije specifične ekspresije rearanžiranog humanog IGKV1‑39 VK regiona, na bazi IGKV1‑39 VK promotorskog regiona, lidera koji sadrži intron, V-gena germinativne linije, CDR3, IGKJ segmenta, mišjeg intergenskog regiona lociranog između Jk i CK, otvorenog rama čitanja pacovskog Ck alela a, i mišjeg intergenskog fragmenta sa 3’ kraja mišjeg CK gena sa završetkom neposredno 3’ od 3’CK enhansera.

[0377] [0125] Za konstrukciju ekspresione kasete korišćeni su optimizovani otvoreni ramovi čitanja lidera, rearanžiranog IGKV1-39 gena i gena pacovskog CK alela a, kako je opisano u primeru 5. VK promotorski region dobijen je procedurama sinteze gena (GeneArt, GmbH) i gotovo je identičan sekvenci humanog IGKV1-39 regiona između -500 bp i ATG (mesto početka) gena. Jedino odstupanje od prirodne sekvence je introdukcija GCCACCATGG Kozak sekvence na ATG (mesto početka) kako bi se podstakla translacija. Genomski fragment iz mišjeg BAC klona (TaconicArtemis) koristi se kao baza za uvođenje pojedinačnih elemenata. Ovaj fragment je identičan sekvenci mišjeg VK lokusa, počevši od donorskog mesta introna smeštenog direktno 3' od JK5 regiona i sa završetkom neposredno 3' od 3' CK enhensera i pokriva približno 12,5 kb.

[0378] Finalni konstrukt sadrži od 5' do 3' kraja sledeće elemente: humani genomski promotor IGKV1‑39 (500 bp), Kozak sekvencu, liderski deo 1 humanog IGKV1‑39 (optimizovan), liderski intron humanog IGKV1‑39, liderski deo 2 humanog IGKV1‑39 (optimizovan), gen humanog IGKV1‑39 germinativne linije (optimizovan), humani J-region (optimizovan), mišji intergenski region koji uključuje intronski enhenserski element, kapa konstantni region pacova (Rattus norvegicus) (optimizovan) i mišji intergenski region uključujući 3' kapa enhenser. Elementi ove ekspresione kasete prikazani su na slici 8 i nazvani su VkP-IGKV1‑39/J-Ck (VkP-O12). Skica vektora pVkP-O12 i strategija ciljanja prikazane su na slikama 20A i 21A. Vektor je introdukovan u ES ćelije prema standardnim procedurama (vidi primer 14).

[0380] Primer 10

[0382] Konstruisanje ekspresionog konstrukta vođenog VK promotorom, koji sadrži IGLV2‑14/J klon i višestruke enhenserske elemente izvedene iz CK lokusa (VkP-IGLVL2‑14/J-Ck; VkP.2a2).

[0383] Ovaj primer opisuje isti konstrukt kao što je opisan u primeru 9, osim što su IGKV1‑39 gen i J-region zamenjeni optimizovanim humanim IGLV2‑14 genom germinativne linije koji uključuje jedinstveni V-J region (VkP-IGLV2‑141J-Ck; VkP‑2a2; slika 9).

[0385] Primer 11

[0387] Konstruisanje ekspresionog konstrukta vođenog VK promotorom, koji sadrži IGKV1‑39 klon bez CK intronskog enhenserskog elementa (VkP-IGKV1‑39/J-Ck-Δ1; VkP-O12-del1)

[0389] Konstrukt opisan u primeru 9 modifikovan je uklanjanjem CK intronskog enhenserskog elementa lociranog u intergenskom regionu između humanog J regiona i pacovskog CK regiona, standardnim metodologijama PCR modifikacije i kloniranja DNK (GeneArt, GmBH). Rezultujuća ekspresiona kaseta prikazana je na slici 10 i nazvana je VkP-IGKV1‑39/JCk-Δ1 (VkP-O12-del1).

[0390] Skica pVkP-O12-del1 vektora i strategija ciljanja prikazane su na slici 20B i 21B. Vektor je introdukovan u ES ćelije praćenjem standardnih procedura (vidi primer 14).

[0391] Primer 12

[0393] Konstruisanje ekspresionog konstrukta vođenog VK promotorom, koji sadrži IGKV1‑39 klon bez CK intronskog enhenserskog elementa i skraćeni 3’ CK enhenserski element (VKP-IGKV1‑39/J-Ck-Δ2; VkP-O12-del2)

[0395] Konstrukt opisan u primeru 11 modifikovan je skraćivanjem 3’ CK enhenserskog elementa i delecijom dela intergenskog regiona 3’ od Ck gena pacova, da bi se uklonili potencijalni inhibitorni elemeneti. Ovo je postignuto uklanjanjem intergenske sekvence između EcoRV mesta (lociranog 3’ od Ck gena pacova) i NcoI mesta prisutnog u 3’ enhenseru (5993 bp) i još uklanjanja sekvence između 3’ enhenserskog BstXI mesta i BatXI mesta 3’ od 3’enhensera (474 bp) uz korišćenje standardnih postupaka. Rezultujuća ekspresiona kaseta prikazana je na slici 11 i nazvana je VkP-IGKV1‑39/JCk-Δ2 (VkP-O12-del2).

[0396] Skica pVkP-O12-del2 vektora i strategija ciljanja prikazane su na slici 20C i 21C. Vektor je introdukovan u ES ćelije praćenjem standardnih procedura (vidi primer 14).

[0398] Primer 13

[0400] Ekspresija Vk konstrukata u ćelijskim linijama

[0402] Konstrukti opisani u primerima 9‑12 testirani su u pogledu svoje sposobnosti da proizvode lakolančane proteine u ćelijskim linijama mijeloma MPC11 (ATCC CCL167), limfoma B-ćelija WEHI231 (ATCC CRL‑1702), limfoma T ćelija EL4 (ATCC TIB‑39) i u HEK293 (ATCC CRL1573). Enhenserski i promotorski elementi u konstruktu omogućavaju ekspresiju u linijama B ćelija, ali ne i u ćelijskim linijama izvedenim iz drugih tkiva. Posle transfekcije ćelijskih linija korišćenjem prečišćene linearizovane DNK i Fugene6 (Roche) ćelije se kultivišu za prolaznu ekspresiju. Ćelije i supernatant se sakupe i podvrgnu SDS-PAGE analizi praćenoj western blotovanjem uz korišćenje specifičnog antitela na C-kapa pacova. Supernatanti se analiziraju u ELISA na sekretovane L lance uz korišćenje antipacovskog CK antitela (Beckton Dickinson #550336).

[0404] Primer 14

[0406] Generisanje transgenih ES linija

[0408] Svi konstrukti opisani u primerima 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 i 12 korišćeni su za generisanje individualnih stabilnih transgenih ES linija putem homologne rekombinacije. Postupci za

[0411] 4

[0412] generisanje transgenih ES linija homolognom rekombinacijom poznati su u oblasti (npr. Eggan et al., PNAS 98, 6209‑6214; Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 feb. 15;31(4):e12; Hogan et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), str.253‑289.).

[0413] Za sve konstrukte opisane u primerima 5‑6, i primerima 9‑12, RMCE ES ćelijske linije (izvedene iz miševa soja 129S6B6F1-Gt(ROSA)26Sortm10Arte) gajene su na mitotički inaktiviranom hranljivom sloju sačinjenom od fibroblasta embriona miša (mouse embryonic fibroblasts, MEF) u DMEM medijumu sa visokim sadržajem glukoze, koji sadrži 15% FBS (PAN 1302-P220821). Leukemijski inhibitorni faktor (Chemicon ESG 1107) dodat je u medijum u koncentraciji od 900 U/mL. Za manipulaciju, 2x10<5>ES-ćelija zaseje se na posude od 3.5 cm, u 2 ml medijuma. Neposredno pre transfekcije, ćelijama se doda 2 ml svežeg medijuma. 3 ul Fugene6 reagensa (Roche; kataloški br. 1 814 443) pomeša se sa 100 ul medijuma koji ne sadrži serum (OptiMEM I sa Glutamax I; Invitrogen; kataloški br.51985‑035) i inkubira 5 min.100 ul Fugene/OptiMEM rastvora doda se u 2 ug cirkularnog vektora i 2 ug CAGGS-Flp i inkubira 20 min. Ovaj transfekcioni kompleks se u kapima doda ćelijama i promeša. Sveži medijum se ćelijama dodaje sledećeg dana. Od dana 2 i dalje medijum se svakodnevno zamenjuje medijumom koji sadrži 250 ug/mL G418 (Geneticin; Invitrogen; kataloški br. 10131‑019). Sedam dana posle transfekcije, pojedinačni klonovi se izoluju, ekspandiraju, i izvrši se molekularna analiza southern blotovanjem prema standardnim procedurama.

[0414] Za svaki konstrukt, analiza više klonova digestijom genomske DNK pojedinačnih klonova restrikcionim enzimima, praćena hibridizacijom sa 5' probama, 3' probama i unutrašnjim probama, rezultovala je klonovima koji su sadržali jednu ispravnu inserciju na ispravnom položaju u Rosa26 lokusu. Primer je prikazan na slici 14.

[0416] Primer 15

[0418] Generisanje transgenih sojeva miševa

[0420] [0137] Sve ES ćelijske linije koje su generisane i verifikovane u pogledu modifikacija, kako je opisano u Primeru 14, upotrebljene su za generisanje stabilnih transgenih miševa putem tetraploidne rekombinacije. Postupci su poznati u oblasti. Uopšteno, posle primene hormona, superovulirajuće Balb/c ženke sparuju se sa Balb/c mužjacima. Blastocisti se izoluju iz uterusa na dpc 3.5. Za mikroinjektiranje, blastocisti se stave u kap DMEM sa 15% FCS pod mineralnim uljem. Mikroinjekciona pipeta sa ravnim vrhom, unutrašnjeg prečnika 12-15 mikrometara, aktivirana piezo-delovanjem, upotrebljava se za injektiranje 10‑15 ciljanih C57BL/6 N.tac ES ćelija u svaki blastocist. Posle oporavka, injektirani blastocisti se prenesu u svaki rog uterusa 2.5 dana-postkoitalnih, lažno gravidnih NMRI ženki. Himerizam se meri u himerama (G0) putem doprinosa ES ćelija boji krzna Balb/c domaćina (crno/belo). Visokohimerni meševi se uzgajaju sa ženkama C57BL/6 soja. U zavisnosti od potreba projekta, C57BL/6 partneri u sparivanju nisu mutanti (W) ili su mutanti u pogledu prisustva gena za rekombinazu (Flpdeletor ili Cre-deletor ili CreER inducibilni deletor ili kombinacija Flp-deletor/CreER). Transmisija germinativne linije identifikovana je prisustvom crnog potomstva (G1) C57BL/6 soja.

[0421] Na primer, ESC klon IgVK1‑39 2683 8 (vidi primere 5 i 14) bio je injektiran u ukupno 62 blastocista u 3 nezavisna eksperimenta. Dobijena su 3 legla sa ukupno 6 mladunaca. Svi mladunci su bili himerni. Dobijena su 3 heterozigotna potomka koja su se koristila za dalje ukrštanje.

[0422] ESC klon kapa 2692 A-C10 (vidi primere 3 i 14) injektiran je u ukupno 54 blastocista u 3 nezavisna eksperimenta. Dobijena su 3 legla sa ukupno 11 mladunaca, od kojih je bilo 10 himernih. Dobijeno je 8 heterozigotnih potomaka koji su korišćeni za dalje ukrštanje.

[0423] ESC klon kapa 2692 B-C1 (vidi primere 3 i 14) injektiran je u ukupno 51 blastocist u 3 nezavisna eksperimenta. Dobijena su 2 legla sa ukupno 6 mladunaca, od kojih su 4 bila himerna. Dobijena su 3 heterozigotna potomka koja su korišćena za dalje ukrštanje.

[0425] Primer 16

[0427] Oplemenjivanje

[0429] Ovaj primer opisuje oplemenjivanje za dobijanje miševa koji sadrže transgene ekspresione kasete opisane u primeru 14 i nokaut miševe u kojima su endogeni lambda i kapa lokusi utišani. Lokalizacija V-lambda na hromozomu 16 i CD19 na hromozomu 7 omogućava standardne procedure oplemenjivanja. Oplemenjivanje kolokalizovanih Vk lokusa i Rosa26 lokusa na hromozomu 6 sa udaljenošću od oko 24 cM zahteva posebnu pažnju tokom skrininga jer samo procenat potomstva pokazuje krosover na takav način da se obe modifikacije nađu zajedno na jednom hromozomu.

[0430] [0142] Sva četiri lokusa treba da se kombinuju u jednom soju miševa koji je homo- ili heterozigotan za CD19-cre (nije opisano) i modifikovani Rosa26 transgen, i homozigotan za ostale lokuse. Oplemenjivanje se izvodi standardnim tehnikama oplemenjivanja i skrininga po potrebi, kako nude komercijalne kompanije za oplemenjivanje (npr. TaconicArtemis).

[0432] Primer 17

[0434] Imunizacije miševa

[0436] Primarna imunizacija miševa i imunizacija pojačavanja izvode se korišćenjem standardnih protokola.

[0437] Za validaciju transgene ekspresije humanih rearanžiranih V<Κ>012 (IGKV1‑39) -pacovskih C<Κ>lakih lanaca (vidi primer 5, 14‑16) u B ćelijama iz CD19-HuVκ1 miševa i za procenu njenog uticaja na veličinu VH repertoara, raznolikost upotrebe VH familije i V(D)J rekombinaciju posle imunizacije, CD19-HuVκ1 transgeni miševi se imunizuju vakcinom tetanusnog toksoida (TT vakcina) i raznolikost VH sekvence nasumično odabranih klonova iz CD18-HuVκ1 miševa upoređuje se sa TT-imunizovanim wt miševima i CD19-Cre HuVk1 negativnim jedinkama iz istog legla. Dobijeni su podaci o SHM učestalosti humanog Vκ 012 transgena u imunizovanim miševima. Raznolika kolekcija od najmanje 40 TT-specifičnih, klonski nesrodnih mAb koja sadrže humani Vκ 012 prikupljeni su iz CD19-HuVx1 miševa putem prikazivanja na fagima.

[0438] Za ovo, tri adultna CD19-HuVκ1 miša vakcinišu se TT vakcinom uz korišćenje standardnih procedura imunizacije. Posle imunizacije, mere se titri u serumu uz korišćenje TT specifičnog ELISA (TT: Statens Serum Institute, art. br. 2674) i suspenzije slezine se izlože sortiranju ćelija FACS procedurom posle bojenja monoklonskim antitelom specifičnim za Cκ pacova da bi se izolovale transgene B ćelije (klon RG7/9.1; BD Pharmingen# 553901, lot# 06548). RNK iz Cx-pozitivnih B ćelija pacova se ekstrahuju i rezultujući cDNK materijal se koristi za pravljenje biblioteke i SHM analizu.

[0439] Standardno monoklonsko mišje antitelo na Cκ pacova (klon RG7/9.1; BD Pharmingen# 553901, lot# 06548) koristi se u FACS analizi B ćelija koje eksprimiraju transgen (Meyer et al., 1996, Int. Immunol., 8: 1561). Antitelo klon RG7/9.1 reaguje sa monotipskom (opštom) determinantom kapa lanca. Ovo antipacovsko Cκ antitelo (klon RG719.1 (BD Pharmingen# 553901, lot# 06548) obeleženo je R-fikoeritrinom (R-phycoerythrin, PE) uz korišćenje LYNX kita za brzo konjugovanje, prema uputstvima proizvođača, za FACS analizu i sortiranje. Obeleženo antitelo se prvo testira protočnom citometrijom u pogledu vezivanja za funkcionalne lakolančane proteine koji sadrže Cκ pacova proizvedene u prolazno transfektovanim HEK‑293T ćelijama; nekonjugovano antitelo služi kao pozitivna kontrola. Druga dva antitela

[0442] 4

[0443] za koja je pomoću ELISA i western blota pokazano da se vezuju za pacovski Cκ (vidi primer 7) takođe su testirana protočnom citometrijom.

[0444] Stvaranje biblioteke prikazivanja Fab na fagima izvodi se sa setom optimizovanih degenerisanih PCR prajmera dizajniranih za amplifikovanje C57BL/6 VH gena; minimalna veličina biblioteke je 10<6>klonova, a minimalna frekvecija insercije je 80%. Upotrebljeni vektor, MV1043 (slike 3 i 12), sadrži humani Vκ 012 fuzionisan sa humanim Cx regionom. Pacovski Cκ se, prema tome, u procesu generisanja biblioteke zamenjuje humanim parnjakom.

[0445] Pre selekcije, izvodi se sekvenciranje VH 96 nasumično odabranih klonova da bi se validirala raznolikost VH repertoara, koja se upoređuje sa raznolikošću dobijenom iz neselekcionisane biblioteke prethodno generisane korišćenjem istih procedura, iz TT-imunizovanih BALB/c miševa. Biblioteka iz C57Bl/6 wt miševa koji su imunizovani na isti način, omogućava upoređivanje raznolikosti između dve prethodno selekcionisane biblioteke koje dele istu vakcinu i istu genetičku osnovu.

[0446] Nekoliko nezavisnih selekcionisanja izvedeno je na TT-obloženim imunotubama. Varijable koje mogu biti uključene su selekcionisanja uz korišćenje biotinizovanih antigena u rastvoru ili selekcionisanja na imobilisanom TT. Na osnovu broja i raznolikosti ELISA-pozitivnih klonova dobijenih u prvim selekcionisanjima, donose se odluke o dodatnim rundama selekcionisanja. Klonovi se smatraju pozitivnim kada su > 3x pozitivni u odnosu na negativan kontrolni klon. Pozitivni klonovi se analizirju pomoću ELISA u odnosu na panel negativnih kontrolnih antigena da bi se verifikovala specifičnost za antigen. Cilj je da se identifikuje najmanje 40 jedinstvenih VH regiona, na bazi jedinstvenih CDR3 sekvenci i V<H>DJ<H>rearanžmana.

[0447] Amplifikacija cDNK materijala iz Cκ-pozitivnih sortiranih B ćelija izvedena je pomoću PCR nizvodnog prajmera specifičnog za humanu lidersku sekvencu i PCR uzvodnog prajmera specifičnog za Cκ sekvencu pacova, u regionu koji nije redundantan sa mišjom Cx sekvencom, kako je saopšteno u nedavnoj studiji (Brady et al., 2006, JIM, 315: 61). Kombinacije prajmera i temperature hibridizacije se prvo testiraju na cDNK iz HEK‑293 T ćelija transfektovanih 0817676_pSELECT_0815426 =pSELECT vektorom sa IGKV1‑39 DNK kasetom (vidi primer 7).

[0448] [0151] Proizvodi amplifikacije se kloniraju u pJET‑1 vektor i posle XL1-blue transformacije, 96 kolonija se sekvencira da se proceni VL SHM frekvencija direktnim poređenjem sa Vκ 012 (IGKV1‑39) sekvencom germinativne linije. Postupak R/S odnosa, kako je opisano u našoj studiji na humanim antitelima specifičnim za TT (de Kruif et al., 2009, J. Mol. Biol., 387: 548) omogućava da se razlikuju nasumične mutacije i antigenom-vođene mutacije do kojih dolazi na VL sekvencama.

[0450] Primer 18

[0452] Imunofluorescentna analiza populacija B ćelija u transgenim mišjim linijama.

[0453] Ovaj primer opisuje upotrebu antitela i protočne citometrije za analizu populacija B ćelija u primarnim (koštana srž) i sekundarnim (slezina, peritoneum) limfoidnim organima i krvi. Postupci i reagensi opisani su u Middendorp et al. (2002) J. Immunol. 168:2695 i Middendorp et al. (2004) J. Immunol. 172:1371. Za analizu ranog razvića B ćelija u koštanoj srži, ćelije se površinski oboje kombinacijama antitela (Becton Dickinson) specifičnih za B220, CD19, CD25, IgM, IgD, mišji Ckapa, mišji Clambda i pacovski Ckapa, da bi se detektovale populacije pro-B ćelija, pre-B ćelija, velikih pre-B ćelija, ranih i kasnih nezrelih B ćelija i recirkulišućih B ćelija koje eksprimiraju transgen na svojoj površini. DAPI bojenje (Invitrogen) korišćeno je za isključivanje mrtvih ćelija iz analize, a FC blok (Becton Dickinson) za inhibiranje interakcije antitela sa Fc receptorima na mijeloidnim ćelijama. Za analizu površinske ekspresije transgena na populacijama B ćelija u perifernim limfoidnim organima i krvi, ćelije su obojene kombinacijama antitela (Becton Dickinson) specifičnih za B220, CD5, CD19, CD21, CD23, IgM, IgD, mišji Ckapa, mišji Clambda i pacovski Ckapa. DAPI bojenje korišćeno je za isključivanje mrtvih ćelija iz analize, a FC blok za inhibiranje interakcije antitela sa Fc receptorima na mijeloidnim ćelijama. Dodatno, kombinacije antitela (Becton Dickinson) specifičnih za CD3, CD4, CD11b, CD11c i NK1.1 uključene su za određivanje da li se ekspresija transgena dešava u tipovima ćelija izvan kompartmenta B ćelija.

[0454] Analizirana su tri miša heterozigotna za humani IGKV1‑39/pacovski Ckapa transgen i heterozigotna za CD19-Cre transgen na C57BL6 osnovi (HuVk1/CD19-Cre). Kao kontrole za FACS analizu, bila su uključena tri miša iz istog legla, divljeg tipa za humani IGKV1‑39/pacovski Ckapa transgen i heterozigotna za CD19-Cre transgen na C57BL6 osnovi (CD19-Cre) i dva C57BL6/NTac miša (Wt). Svim životinjama je dopušteno da se aklimatizuju u objektu za životinje tokom 1 nedelje pre analize i svi miševi su bili mužjaci stari 6 nedelja. Limfociti su izolovani iz butne kosti, slezine, peritonealne šupljine i krvi miševa uz korišćenje konvencionalnih tehnika, kako je ranije opisano (Middendorp et al. (2002) J. Immunol.

[0455] 168:2695 i Middendorp et al. (2004) J. Immunol.172:1371). Antitela su pretodno kombinovana kako je prikazano u Tabeli 10 i bojenje je izvedeno u pločama sa 96 bunarčića. Inkubacija sa PE-konjugovanim antipacovskim C kapa (opisano gore) izvedeno je pre bojenja pacovskim

[0458] 4

[0459] antimišjim antitelima da bi se izbeglo nespecifično vezivanje. Posle završetka bojenja ćelija, obeležene ćelije se analiziraju na Becton Dickinson LSR II FACS aparatu i dobijeni podaci se analiziraju FlowJo softverom (v6.4.7).

[0460] Transgeni miševi bili su slične težine, izgleda i aktivnosti kao miševi divljeg tipa. Nisu zapažene vidljive anatomske promene tokom izolovanja tkiva. Između transgenih miševa i miševa divljeg tipa nije zapažena razlika u broju B ćelija u koštanoj srži (bone marrow, BM) i slezini (Tabela 11) ili u broju B ćelija, T ćelija i mijeloidnih ćelija u perifernim organima. Pored toga, nije bilo promene frekvencije ili udela ćelija u različitim razvojnim putevima limfocita kod transgenih miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa. Prema tome, u dvostruko transgenim (HuVk1/CD19-Cre) i transgenim (CD19-Cre) miševima razvoj limfoidnih i, najvažnije, B ćelija nije se razlikovao od miševa divljeg tipa.

[0461] U perifernim limfoidnim organima, bojenje antitelom specifičnim za transgen (antipacovCkapa-PE) zapaženo je samo u populacijama B ćelija. Populacije T ćelija, mijeloidnih ćelija i NK ćelija bile su negativne na površinsku ekspresiju transgena u slezini (Slika 23). Nasuprot tome, u ćelijama obojenim pan-B ćelijskim markerima B220 i CD19, sve ćelije bile su pomerene udesno u FACS dijagramu što je ukazivalo na ekspresiju transgena na površini ćelija (Slika 24). Slično transgen-specifično bojenje izmereno je u CD5<+>B1 ćelijama peritoneuma, razvojno drugačijoj populaciji B ćelija (Slika 25).

[0462] Diferencijacija B ćelija iz multilinijskih prekursora u zrele B ćelije dešava se u koštanoj srži. U analiziranim limfocitima iz koštane srži, vanćelijska i transgena ekspresija nije bila detektabilna u najranijim progenitorima B ćelija, pro- i pre-B ćelijama, konzistentno sa normalnim obrascem ekspresije lakog lanca (Slika 26). Transgena ekspresija postaje detektabilna prvo u nezrelim B ćelijama, razvojnom stupnju na kojem laki lanac mišje germinativne linije prolazi rearanžman i eksprimira se na površini ćelije u kontekstu prethodno selektovanog teškog lanca (Slika 26). Konzistentno sa bojenjem u slezini, ekspresija transgenog lakog lanca takođe se detektuje na zrelim recirkulišućim B ćelijama (Slika 26). Prema tome, CD19-Cre-vođena ekspresija transgena je konzistentna sa normalnim obrascem ekspresije lakog lanca. Bojenje antitelom specifičnim za endogeni laki lanac intenzivnije je od bojenja antitelom specifičnim za transgeni laki lanac. Ovo može ukazivati na viši nivo ekspresije endogenog lakog lanca, osetljivije bojenje antitelom specifičnim za endogeni laki lanac ili kombinaciju ta dva. Što je važno, intenzitet površinske ekspresije transgenog lakog lanca u korelaciji je sa površinskom ekspresijom i endogenog lakog lanca i IgM, kako je zapaženo bojenjem cirkulišućih B ćelija u krvi (Slika 27).

[0465] 4

[0466] Prema tome, ova analiza u celini pokazuje da je ekspresija humanog IGKV1‑39/Ckapa transgena ograničena na kompartment B ćelija i da je vremenska regulacija njegove ekspresije slična endogenim kapa i lambda lakim lancima, što rezultuje normalnim razvićem svih populacija B ćelija. Prividno niži nivo ekspresije transgena mogao bi se objasniti snagom promotora u poređenju sa promotorom i enhenserima prisutnim na endogenim genima lakog lanca ili kašnjenjem u ekspresiji transgena koje daje endogenim lakim lancima kompetitivnu prednost u sparivanju sa rearanžiranim teškim lancem. Ovo je konzistentno sa zapažanjem da se, kako B ćelije sazrevaju, relativni intenzitet bojenja transgena povećava u poređenju sa endogenim lakim lancima. Pored toga, zapažanje da je broj B ćelija normalan i da svaka površinski Ig+ B ćelija koeksprimira endogeni i transgeni laki lanac, podržava zaključak da je varijabilni region IGKV1-39 sposoban za sparivanje sa normalnim repertoarom različitih varijabilnih regiona mišjih teških lanaca. Iz ove analize zaključujemo da insercija IGKV1-39/pacovski Ckapa transgen, vođena CD19-Cre-aktiviranim CAGGS promotorom u Rosa lokusu, olakšava blagovremenu i za B ćelije specifičnu ekspresiju transgena i da je transgen sposoban za sparivanje sa normalnim repertoarom mišjih teških lanaca.

[0468] Primer 19

[0470] Profil T-ćelijskih epitopa IGKV1‑39 uz korišćenje Epibase<®>.

[0472] Proteinska sekvenca IGKV1‑39 (slika 12, protein IGKV1‑39/J humane germinativne linije) skenirana je u pogledu prisustva pretpostavljenih HLA klasa II-ograničenih epitopa koji su poznati i kao T<H>-epitopi. Za ovo, Algonomics-ova Epibase<®>platforma primeni se na IGKV1‑39. Ukratko, platforma analizira HLA-vezujuće specifičnosti svih mogućih 10-mernih peptida izvedenih iz ciljne sekvence (Desmet et al. Nature 1992, 356:539‑542; Desmet et al. FASEB J. 1997, 11:164‑172; Desmet et al. Proteins 2002, 48:31‑43; Desmet et al. Proteins 2005, 58:53‑69). Profilisanje je obavljeno na alotipskom nivou za 20 DRB1, 7 DRB3/4/5, 13 DQ i 7 DP, tj. ukupno 47 receptora HLA klase II (vidi Tabelu 5). Epibase<®>izračunava kvantitativnu procenu slobodne energije vezivanja ΔG<bind>peptida za svaki od 47 receptora HLA klase II. Ovi podaci se zatim obrađuju kako sledi:

[0474] • Slobodne energije se konvertuju u Kd-vrednosti preko ΔG<bind>= RT In(Kd).

[0475] • Peptidi se klasifikuju kao jaki (strong, S), srednji (medium, M), slabi i oni koji se ne vezuju (non binders, N). Koriste se sledeće granične vrednosti:

[0477] S: snažni vezivač: Kd < 0.1 µM.

[0480] 4

[0481] M: srednji vezivač: 0.1 µM 5 Kd < 0.8 µM.

[0482] N: slabi vezivač ili nevezivač: 0.8 µM ≤ Kd.

[0484] • Peptidi koji odgovaraju sopstvenim peptidima tretiraju su zasebno. Spisak sopstvenih peptida uzet je iz 293 sekvence antitela germinativne linije. Označeni su kao ’germinativnom linijom-filtrirani’ peptidi.

[0486] S‑ i M-peptidi su mapirani na ciljnoj sekvenci u takozvanim epitopskim mapama; S-afiniteti su prikazani kvantitativno; M-vrednosti su prikazane kvalitativno. Kao opšti pregled rezultata, Tabela 6 navodi broj jakih i srednjih vezivača u analiziranim proteinima, za grupe HLA receptora klase II koje odgovaraju genima DRB1, DQ, DP i DRB3/4/5. Brojanje je vršeno odvojeno za vezivače jakog i srednjeg afiniteta. Peptidi koji se vezuju za više alotipova iste grupe brojani su kao jedan. Vrednosti u zagradama odnose se na peptide filtrirane germinativnom linijom. U Tabeli 7, sekvenca je prikazana u formatu pogodnom za eksperimentalni rad. Sekvenca je podeljena na uzastopne 15-mere koji se preklapaju za 12 rezidua. Za svaki 15-mer, navodi se promiskuitetnost (broj alotipova od ukupno 47 za koje 15-mer sadrži kritični vezivač), kao i implicitni serotipovi. Epibase<®>profil i mape epitopa prikazani su na slikama 16 i 17.

[0487] Zaključeno je da IGKV1-39 ne sadrži jake ne-sopstvene DRB1 vezivače. Tipično, pronađeno je znatno više vezivača za DRB1 nego za druge HLA gene. Ovo je u skladu sa eksperimentalnim dokazima da su alotipovi koji pripadaju DRB1 grupi potentniji vezivači za peptide. Očekuje se da epitopi srednje jačine za DRB1 alotipove doprinesu populacionom odgovoru i ne mogu se zanemariti. Ponovo, nisu pronađeni ne-sopstveni DRB1 vezivači u IGKV1-39. U humoralnom odgovoru pokrenutom na antigen, primećena aktivacija/proliferacija T<H>ćelija se uopšteno tumači u smislu DRB1 specifičnosti. Međutim, ne može se ignorisati mogući doprinos DRB3/4/5, DQ i DP gena. S obzirom na niže nivoe ekspresije ovih gena u poređenju sa DRB1, fokus je bio na klasi jakih epitopa za DRB3/4/5, DQ i DP. 'Kritični epitopi' su oni epitopi koji su jaki vezivači za bilo koji alotip DRB1, DRB3/4/5, DQ ili DP ili su srednji vezivači za DRB1, IGKV1-39 ne sadrži jake ili srednje nesopstvene vezivače za DRB3/4/5, DQ ili DP.

[0488] Više peptida je takođe prisutno u sekvencama germinativne linije (vrednosti u zagradama u Tabeli 6). Takvi peptidi se mogu veoma dobro vezati za HLA, ali se pretpostavlja da su sopstveni i, stoga, neimunogeni. Ukupno je u IGKV1-39 pronađeno 6 jakih i 16 srednje jakih DRB1 vezivača filtriranih germinativnom linijom. Region okvira 1 do regiona okvira 3 je

[0491] 4

[0492] potpuno podudaran sa V-segmentom germinativne linije VKI 2-1-(1) 012 (VBase), poznatim kao IGKV1-39*01 (IMGT). Region okvira 4 je potpuno podudaran sa J-segmentom germinativne linije JK1 (V-base), poznatim i kao IGKJ1*01(IMGT). Nije iznenađujuće da ovi segmenti ne sadrže nikakve ne-sopstvene epitope.

[0494] Primer 20

[0496] Proizvodne karakteristike IGKV1‑39

[0498] Postoji velika potražnja za platformama za otkrivanje antitela, koje daju terapijska antitela koja su termodinamički stabilna i daju dobre ekspresione prinose. Ove karakteristike su važne za obezbeđivanje stabilnosti lekovite supstance tokom proizvodnje i posle injektiranja leka u pacijenta. Pored toga, dobri ekspresioni prinosi direktno utiču na troškove proizvodnje lekova, a samim tim i na cenu, dostupnost pacijentima i profitabilnost. Gotovo sva terapijska antitela koja su danas u kliničkoj upotrebi sastoje se od humanih IgG1 i kapa konstantnih regiona, ali koriste različite varijabilne regione teškog i lakog lanca koji im daju specifičnost. Varijabilni domeni humanog teškog i lakog lanca mogu se podeliti u familije koje imaju više od 80% divergencije sekvenci. Kada se rearanžirani primeri ovih familija u konfiguraciji germinativne linije kombinuju i uporede u pogledu stabilnosti i prinosa, jasno je da genske familije nisu jednake u pogledu biofizičkih svojstava. Posebno V<H>3, V<H>1 i V<H>5 imaju povoljnu stabilnost za teške lance, a Vk1 i Vk3 imaju najbolju stabilnost i prinos lakih lanaca. Pored toga, kada se mutacije uvedu kao deo procesa somatske hipermutacije, one mogu ometati V<H>/V<L>sparivanje. Da bi se procenio efekat koji različiti geni lakih lanaca sa različitim stopama mutacija imaju na proizvodne karakteristike fiksiranog V<H>lanca, napravljena je biblioteka prikazivanja na fagima Fab lakih lanaca (kapa i lambda) iz šest zdravih naive donora, kombinovana sa panelom od 44 TT-vezujuća teška lanca iz imunizovanih donora. Posle jedne runde selekcije, izolovani su TT-vezujući Fab klonovi. Nekoliko njih je delilo isti V<H>gen kao TT klon PG1433 u kombinaciji sa različitim lakim lancima. Fab fragmenti lakog lanca su reklonirani u kapa ekspresioni vektor i transfektovani u kombinaciji sa DNK koja kodira teški lanac PG1433 u 293 ćelije, i proizvodnja specifičnog IgG merena je pomoću ELISA. Kao što je prikazano u tabeli 8, odabrani klonovi koji sadrže PG1433 V<H>u kombinaciji sa različitim lakim lancima imali su između 5 i 10 puta nižu ekspresiju proteina PG1433 V<H>u kombinaciji sa IGKV1-39. Treba napomenuti da su svi laki lanci unutar svojih kodirajućih regiona sadržali mutacije amino-kiselina koje bi mogle da poremete sparivanje V<H>i smanje stabilnost proizvodnje. Prema tome, pored smanjenja šansi za neželjenu imunogenost, očekuje se da

[0501] 4

[0502] upotreba lakog lanca IGKV1-39 bez mutacija doprinosi poboljšanoj stabilnosti proizvodnje i prinosima različitih V<H>gena koji doprinose specifičnosti. Zaista, stabilni klonovi generisani transfekcijom različitih V<H>gena, svi spareni sa IGKV1-39, mogu se ekstenzivno pasažirati, a da i dalje zadrže robustne karakteristike proizvodnje, kao što je prikazano u tabeli 9.

[0504] Primer 21

[0506] Generisanje miševa koji eksprimiraju potpuno humane VH i VL regione. Transgeni miševi pogodni za upotrebu prema pronalasku ukrštaju se sa miševima koji već sadrže humani VH lokus. Primeri odgovarajućih miševa koji sadrže humani VH lokus objavljeni su u Taylor et al. (1992). Nucleic Acids Res 20: 6287-95; Lonberg et al. (1994). Nature 368: 856-9; Green et al. (1994). Nat Genet 7: 13-21; Dechiara et al. (2009). Methods Mol Biol 530: 311-24.). Posle ukrštanja i selekcije miševa koji su bar heterozigotni za IGKV1-39 transgen i humani VH lokus, selektovani miševi se imunizuju ciljem. VH geni se sakupljaju kao što je gore opisano. Ovaj postupak ima prednost što su VH geni već potpuno humani i zato ne zahtevaju humanizaciju.

[0508] Primer 22

[0510] Izolacija, karakterizacija, formatiranje oligoklonika i proizvodnja antitela koja ciljaju humani IL6 za lečenje hroničnih zapaljenskih bolesti kao što je reumatoidni artritis

[0512] Slezinski VH repertoar transgenih miševa imunizovanih humanim rekombinantnim IL6 kloniran je u vektor za prikazivanje Fab na fagima sa jednim humanim IGKV1-39-C kapa lakim lancem (identičnim mišjem transgenu) i podvrgnut afinitetnoj selekciji u odnosu na imunogeni humani IL6. Klonovi dobijeni posle dve do četiri runde afinitetne selekcije analiziraju se u pogledu specifičnosti vezivanja. VH geni koji kodiraju IL6-specifične Fab fragmente podvrgavaju se analizi sekvenci kako bi se identifikovali jedinstveni klonovi i dodelila im se VH, DH i JH upotreba. Fab fragmenti se reformatiraju kao IgG1 molekuli i prolazno se eksprimiraju. Jedinstveni klonovi se zatim grupišu na osnovu nekompeticije u testovima vezivanja i podvrgnu se afinitetnoj i funkcionalnoj analizi. Najpotentnija anti-IL6 IgG1 mAb se zatim eksprimiraju kao kombinacije dva, tri, četiri ili pet teških lanaca koji sadrže različite VH-regione u oligokloničnom formatu, zajedno sa jednim IGKV1-39-C kapa lakim lancem i testiraju se in vitro na formiranje kompleksa sa IL-6. Oligoklonici se takođe testiraju in vivo u pogledu klirensa humanog IL-6 iz miševa. Odabere se oligoklonik sa najpotentnijom aktivnošću klirensa, i mišji VH geni se humanizuju prema konvencionalnim postupcima.

[0513] Humanizovani IgG 1 se transfektuju u sisarsku ćelijsku liniju da bi se generisao stabilan klon. Optimalni subklon se selektuje za generisanje glavne banke ćelija i generisanje materijala za kliničko ispitivanje.

[0514] Mnogi od ovde opisanih protokola su standardni protokoli za konstruisanje biblioteka prikazivanja na fagima i afinitetnu selekciju faga za vezivanje za antigen od interesa i opisani su, na primer, u Antibody Phage Display: Methods and Protocols.2002. Editor(i): Philippa M. O’Brien, Robert Aitken. Humana Press, Totowa, New Jersey, USA.

[0516] Imunizacije

[0518] Transgeni miševi primaju tri imunizacije humanim IL6 svake dve nedelje uz korišćenje adjuvansa Sigma titerMax prema uputstvima proizvođača.

[0520] Izolacija RNK i sinteza cDNK

[0522] Tri dana posle poslednje imunizacije, slezine i limfni čvorovi miševa se izoluju i propuste kroz filter od 70 mikrona u tubu koja sadrži PBS pH 7.4 da se dobije suspenzija pojedinačnih ćelija. Posle ispiranja i peletiranja limfocita, ćelije se suspenduju u TRIzol LS reagensu (Invitrogen) za izolaciju ukupne RNK prema protokolu proizvođača i izlaganje reakciji reverzne transkripcije uz korišćenje 1 mikrograma RNK, Superscript III RT u kombinaciji sa dT20, prema procedurama proizvođača (Invitrogen).

[0523] Generisanje biblioteka za prikazivanje Fab na fagima izvodi se kako je opisano u Primeru 2.

[0525] Selekcija faga na obloženim imunotubama

[0527] Humani rekombinantni IL6 se rastvara u PBS u koncentraciji od 5 µg/ml i njime se obloži MaxiSorp Nunc-imunotuba (Nunc 444474) preko noći na 4°C. Posle odlivanja rastvora za oblaganje, tube se blokiraju 2% obranim mlekom (ELK) u PBS (pufer za blokiranje) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (room temperature, RT). Paralelno, 0.5 ml biblioteke faga se meša sa 1 ml pufera za blokiranje i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi. Posle blokiranja faga, rastvor faga se dodaje u tube obložene IL6 i vrši se inkubacija 2 sata na RT na sporo rotirajućoj platformi kako bi se omogućilo vezivanje. Zatim se tube ispiraju 10 puta korišćenjem PBS/0.05% Tween-20, posle čega sledi elucija faga inkubacijom sa 1 ml 50 mM glicin-HCl pH 2.2, tokom 10 minuta na RT, na rotirajućem točku, a odmah posle toga sledi neutralizacija sakupljenog eluenta korišćenjem 0.5 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5.

[0530] 1

[0531] Sakupljanje klonova faga

[0533] 5 ml XL1-Blue MRF (Stratagene) kulture na O.D. 0.4 doda se sakupljenom rastvoru faga i inkubira 30 minuta na 37°C bez šejkiranja da se omogući infekcija faga. Bakterije se zaseju na karbenicilin/tetraciklin 4% glukoza 2*TY-ploče i gaje se preko noći na 37°C.

[0535] Proizvodnja faga

[0537] Fagi se gaje i obrađuju kako su opisali Kramer et al.2003 (Kramer et al.2008. Nucleic Acids Res. 31(11): e59) uz korišćenje VCSM13 kao pomoćnog soja faga.

[0539] ELISA faga

[0541] ELISA ploče se oblože sa 100 mikrolitara humanog rekombinantnog IL6 po bunarčiću, u koncentraciji od 2.5 mikrograma/ml u PBS, preko noći na 4°C. Ploče obložene sa 100 mikrolitara tiroglobulina, u koncentraciji od 2 mikrograma/ml u PBS, koriste se kao negativna kontrola. Bunarčići se isprazne, osuše tapkanjem o papirni ubrus, potpuno napune PBS‑4% obranim mlekom (ELK) i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi za blokiranje bunarčića. Posle odlivanja rastvora za blokiranje, minipreparati faga prethodno pomešani sa 50 µl blokirajućeg rastvora dodaju se i inkubiraju 1 sat na RT. Nevezani fagi se zatim uklone u 5 koraka ispiranja korišćenjem PBS‑0.05% Tween‑20. Vezani fagi se detektuju inkubiranjem bunarčića sa 100 mikrolitara anti-M13-HRP konjugata antitela (razblaženje 1/5000 u blokirajućem puferu) 1 sat na sobnoj temperaturi. Slobodno antitelo se ukloni ponavljanjem koraka ispiranja kako je opisano gore, što je praćeno inkubacijom sa TMB supstratom dok razvijanje boje ne postane vidljivo. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 100 mikrolitara 2 M H2SO4 po bunarčiću i analizira na ELISA čitaču na talasnoj dužini emisije od 450 nm.

[0543] Sekvenciranje

[0545] Klonovi koji daju signale najmanje 3 puta iznad pozadinskog signala se propagiraju, koriste za DNK miniprep-procedure (vidi uputstvo za procedure Qiagen miniPrep) i prolaze analizu nukleotidne sekvence. Sekvenciranje se izvodi prema uputstvu datom uz Big Dye 1.1 kit (Applied Biosystems) uz korišćenje uzvodnog prajmera (CH1_Rev1, tabela 1) koji prepoznaje 5’ sekvencu CH1 regiona teškog lanca humanog IgG1 (prisutnog u vektoru MV1043 za prikazivanje Fab na fagima, slike 3 i 12). Sekvence mišjih VH regiona analiziraju se u pogledu raznolikosti DH i JH genskih segmenata.

[0548] 2

[0549] Konstruisanje i ekspresija himernog IgG1

[0551] Vektor MV1057 (slike 12 i 22) generisan je kloniranjem transgenog (IGKV1‑39) fragmenta L lanca u derivat vektora pcDNA3000Neo (Crucell, Leiden, Holandija) koji sadrži humane IgG1‑ i kapa konstantne regione. VH regioni su klonirani u MV1057 i nukleotidne sekvence za sve konstrukte su verifikovane u skladu sa standardnim tehnikama. Rezultujući konstrukti se prolazno eksprimiraju u HEK293T ćelijama i supernatanti koji sadrže himerni IgG1 dobijeni su i prečišćeni standardnim procedurama kako je ranije opisano (Throsby, M.

[0552] 2006. J Virol 80: 6982‑92).

[0554] IgG1 vezivanje i analiza kompeticije

[0556] IgG1 antitela se titruju u ELISA korišćenjem ploča obloženih IL6 kao što je gore opisano, i konjugata antihumani IgG-peroksidaza. Kompetitivni ELISA za grupisanje antitela na bazi prepoznavanja epitopa izvode se inkubacijom Fab faga zajedno sa IgG1 ili sa komercijalnim antitelima protiv IL6 (npr. Abcam kat. br. ab9324) u pločama obloženim IL6, posle čega sledi detekcija vezanog Fab faga korišćenjem konjugata anti-M13-peroksidaza.

[0557] Merenje afiniteta IgG1

[0559] Afiniteti antitela na IL6 određuju se pomoću kvantitativnog kinetičkog protokola na Octet-u (ForteBio). Antitela se imobilišu na biosenzoru za imobilisanje antihumanog IgG Fc i izlažu slobodnom IL6 i analiziraju pomoću vlasničkog softvera za izračunavanje Kd svakog antitela.

[0561] Funkcionalna aktivnost IL6 antitela

[0563] Da bi se testirala sposobnost selektovanih antitela da inhibiraju vezivanje između IL6 i IL6-receptora (IL6R), koristi se test na bazi ELISA. Različite koncentracije antitela se mešaju sa fiksnom koncentracijom (10 ng/ml) biotinisanog IL6, kao što su opisali Naoko et al.2007, Can. Res.67: 817-875. Imunski kompleks IL6-antitelo dodaje se imobilisanom IL6R. Vezivanje biotinisanog IL6 za IL6R se detektuje streptavidinom konjugovanim sa peroksidazom rena. Smanjenje ELISA signala je mera inhibicije. Kao pozitivna kontrola za inhibiciju vezivanja između IL6 i IL6R koristi se ili anti-IL6R antitelo (Abcam kat. br. ab34351; klon B-R6) ili anti-IL6 antitelo (Abcam kat. br. ab9324). In vitro blokirajuća aktivnost selektovanih anti-IL6 antitela meri se u testu proliferacije korišćenjem IL6-zavisne ćelijske linije 7TD1. Ukratko, ćelije se inkubiraju sa različitim koncentracijama humanog IL6, sa ili bez anti-IL6 antitela.

[0564] Dostupna količina IL6 određuje stepen proliferacije. Prema tome, ako dodato antitelo blokira vezivanje IL6, očitavanje proliferacije je smanjeno u poređenju sa kontrolnim antitelom koje se ne vezuje. Proliferacija se meri inkorporisanjem 5-bromo-2’-deoksiuridina (5-bromo‑2’-deoxyuridine, BrdU) u DNK, korišćenjem BrdU kita za proliferaciju (Roche kat. br.

[0565] 11444611001) prema uputstvima proizvođača.

[0567] Generisanje anti-IL6 oligoklonika

[0569] Iz svake epitopske grupe selektuju se najpotentnija anti-IL6. Ekspresioni konstrukti koji eksprimiraju ova antitela transfektuju se u HEK293 T ćelije u nekompetirajućim grupama od po tri, u različitim odnosima (1:1:1; 3:1:1; 1:3:1; 1:1:3; 3:3:1; 1:3:3; 3:1:3; 10:1:1; 1:10:1; 1:1:10; 10:10:1; 1:10:10; 10:1:10; 3:10:1; 10:3:1; 1:10:3; 3:1:10; 10:1:3; 1:3:10). Supernatanti koji sadrže antitelo se sakupe i prečiste, i karakterišu kao gore.

[0571] Formiranje kompleksa i in vivo klirens anti-IL6 oligoklonika

[0573] Da bi se izmerila sposobnost anti-IL6 oligoklonika da formiraju imunske komplekse i da bi se analizirali ovi kompleksi, koristi se hromatografija isključivanja na osnovu veličine (size exclusion chromatography, SEC) prema pristupu koji su objavili Min-Soo Kim et al. (2007) JMB 374: 1374-1388 za karakterizaciju imunskih kompleksa formiranih sa različitim antitelima na TNFa. Anti-IL6 oligoklonici se u različitim molarnim odnosima mešaju sa humanim IL6 i inkubiraju 20 sati na 4°C ili 25°C. Smeša se analizira na HPLC sistemu opremljenom kolonom za isključivanje na osnovu veličine; različita vremena elucije su korelisana sa molekulskom težinom korišćenjem standarda molekulske težine.

[0574] Sposobnost antitela da formiraju komplekse sa IL6 je u korelaciji sa njihovom sposobnošću da brzo uklone citokin iz cirkulacije in vivo. Ovo je potvrđeno merenjem klirensa radioobeleženog IL6 miševa. Ukratko, dobijene su ženke Balb/c miševa starosti od 6 do 8 nedelja i 18 sati pre eksperimenta, životinjama se intravenski (IV) preko bočne repne vene ubrizgavaju različite doze prečišćenih anti-IL6 oligoklonika. Na dan 0, miševima se intravenski injektira 50 mikrolitara radioobeleženog IL-6 (1x10E7 cpm/mL) pod istim uslovima. Uzorci krvi (približno 50 mikrolitara) se sakupljaju u nekoliko vremenskih intervala i čuvaju na 4°C. Uzorci se centrifugiraju 5 minuta na 4000 xg i određuje se radioaktivnost seruma. Svi farmakokinetički eksperimenti se izvode istovremeno, sa tri životinje za svaki tretman.

[0576] Generisanje anti-IL6 stabilnih klonova oligoklonika i preklinički razvoj

[0579] 4

[0580] Vodeći anti-IL6 oligoklonik se bira na bazi in vitro i in vivo potencije kao što je gore određeno. Mišji VH geni su humanizovani prema standardnim postupcima i kombinovani sa potpuno humanim IGKV1-39 lakim lancem u ekspresionom vektoru kako je gore opisano. Primeri postupaka humanizacije uključuju one zasnovane na paradigmama kao što je modifikovanje površine (Padlan, E. A., et al., (1991). Mol. Immunol., 28, 489), superhumanizacija (Tan, P., D. A., et al., (2002) J. Immunol., 169, 1119) i optimizacija sadržaja humanog niza (Lazar, G. A., et al., (2007). Mol. Immunol., 44, 1986). Tri konstrukta se transfektuju u PER.C6 ćelije u prethodno određenom optimalnom odnosu (opisano gore) u uslovima selektivnog pritiska G418 u skladu sa standardnim postupcima. Selektuje se stabilni visokoproduktivni anti-IL6 oligoklonični klon i generiše se radna i kvalifikovana glavna banka ćelija.

[0581] Tabela 1 Spisak prajmera

[0583]

[0584]

[0586] Tabela 2

[0587] Nivoi ELISA signala faga mereni na 450 nm. TT-obložene ploče predstavljaju ploče koje su obložene tetanusnim toksoidom. Ploče obložene tiroglobulinom koriste se kao negativne kontrole. 10/10 i 15/15 označava broj koraka ispiranja korišćenjem PBS-Tween tokom procedure afinitetne selekcije. Ploče 10/10 tetanusni toksoid i 10/10 tiroglobulin i ploče 15/15 tetanusni toksoid i 15/15 tiroglobulin su međusobni duplikati, osim sredstva za oblaganje. OD vrednosti preko 3 puta više od pozadinske vrednosti smatraju se specifičnim.

[0588] TT-obložene ploče 10/10 ispiranja

[0590] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

[0591] A 0.139 0.093 0.089 0.121 0.117 0.598 0.146 0.115 0.18 0.155 0.543 0.601 B 0.136 0.404 0.159 0.187 0.489 0.134 0.216 0.092 0.222 0.108 0.181 0.484 C 0.197 0.526 0.09 0.213 0.395 0.155 0.108 0.12 0.183 0.136 0.092 0.866 D 0.143 0.258 0.101 0.422 0.088 0.243 0.485 0.251 0.304 0.198 0.478 0.091 E 0.445 0.169 0.526 0.481 0.206 0.285 0.111 0.119 0.128 0.2 0.118 0.098 F 0.237 0.291 0.594 0.139 0.206 0.565 0.543 0.091 0.136 0.227 0.228 0.099 G 0.459 0.102 0.152 0.659 0.203 0.452 0.152 0.133 0.094 0.102 0.375 0.098 H 0.341 0.623 0.745 0.415 0.682 0.527 0.655 0.114 0.258 0.284 0.685 0.113 TT-obložene ploče 15/15 ispiranja

[0593] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

[0594] A 0.247 0.582 0.421 0.428 0.133 0.082 0.262 0.079 0.343 0.414 0.095 0.292 B 0.065 0.364 0.073 0.042 0.049 0.071 0.046 0.103 0.078 0.057 0.048 0.155 C 0.081 0.044 0.066 0.082 0.225 0.444 0.203 0.362 0.122 0.047 0.052 0.309 D 0.092 0.11 0.59 0.22 0.33 0.544 0.058 0.159 0.047 0.174 0.086 0.05 E 0.469 0.577 0.206 0.304 0.13 0.749 0.431 0.062 0.167 0.049 0.056 0.049 F 0.846 0.07 0.561 0.656 0.882 0.094 0.383 0.13 0.152 0.098 0.134 0.048 G 0.537 0.052 0.49 0.105 0.337 0.193 0.514 0.294 0.068 0.35 0.525 0.05 H 0.061 0.306 0.157 0.853 0.054 0.534 0.102 0.235 0.441 0.412 0.565 0.061 Tiroglobulinom obložene ploče 10/10 ispiranja

[0596] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

[0597] A 0.047 0.051 0.045 0.043 0.051 0.044 0.046 0.042 0.047 0.048 0.049 0.05 B 0.042 0.042 0.042 0.042 0.043 0.041 0.041 0.042 0.043 0.045 0.042 0.046 C 0.044 0.043 0.043 0.044 0.043 0.044 0.043 0.042 0.043 0.041 0.044 0.046 D 0.045 0.044 0.044 0.044 0.045 0.046 0.045 0.056 0.045 0.049 0.048 0.73 E 0.046 0.045 0.046 0.044 0.045 0.044 0.044 0.044 0.047 0.046 0.047 0.926 F 0.048 0.045 0.044 0.046 0.044 0.043 0.044 0.046 0.046 0.046 0.046 0.792 G 0.051 0.048 0.045 0.045 0.044 0.043 0.048 0.045 0.048 0.051 0.045 0.053 H 0.064 0.05 0.049 0.047 0.05 0.051 0.047 0.046 0.047 0.047 0.047 0.056 Tiroglobulinom obložene ploče 15/15 ispiranja

[0599] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

[0600] A 0.036 0.049 0.045 0.044 0.046 0.047 0.046 0.042 0.042 0.043 0.042 0.041 B 0.045 0.042 0.041 0.043 0.043 0.043 0.045 0.045 0.047 0.048 0.044 0.045 C 0.049 0.047 0.047 0.046 0.046 0.046 0.045 0.047 0.046 0.045 0.045 0.052 D 0.047 0.049 0.048 0.048 0.048 0.048 0.047 0.052 0.048 0.046 0.048 0.456 E 0.049 0.047 0.047 0.047 0.047 0.049 0.047 0.048 0.047 0.046 0.048 0.412 F 0.05 0.047 0.046 0.046 0.046 0.046 0.046 0.046 0.046 0.047 0.048 0.528 G 0.05 0.048 0.045 0.045 0.046 0.049 0.048 0.046 0.053 0.049 0.05 0.057 H 0.057 0.05 0.046 0.045 0.047 0.049 0.047 0.047 0.046 0.047 0.053 0.048

[0602] Tabela 3

[0604]

[0607] Tabela 4

[0609]

[0610]

[0613] Tabela 5. HLA alotipovi razmatrani u profilisanju T<H>-epitopa. Prikazani su odgovarajući

[0614] serotipovi, kao i alotipske frekvencije u kavkazoidnoj populaciji (Klitz et al. Tissue Antigens

[0615] 2003, 62:296‑307; Gjertson and Terasake (ed.) u: HLA 1997; Gjertson and Terasake (ed.) u:

[0616] HLA 1998; Castelli et al. J. Immunol. 2002, 169:6928‑6934). Frekvencije se mogu sabrati i do

[0617] više od 100% jer svaka jedinka ima 2 alela za svaki gen. Ako bi bile poznate sve frekvencije

[0618] alela jednog gena, one bi se sabrale do nešto manje od 200% zbog homozigotnih jedinki.

[0619] HLA tip Serotip % populacije HLA tip Serotip % populacije DRB1*0101 DR1 17.4 DRB4*0103 DR53 21 DRB1*0102 DR1 4.9 DRB5*0101 DR51 15.8 DRB1*0301 DR17(3) 21.2 DRB5*0202 DR51 5.7 DRB1*0401 DR4 11.5 DQA1*0101/DQB1*0501 DQ5(1) 20.5 DRB1*0402 DR4 3.1 DQA1*0102/DQB1*0502 DQ5(1) 2.6 DRB1*0404 DR4 5.5 DQA1*0102/DQB1*0602 DQ6(1) 26.5 DRB1*0405 DR4 2.2 DQA1*0102/DQB1*0604 DQ6(1) 6.7 DRB1*0407 DR4 <2 DQA1*0103/DQB1*0603 DQ6(1) 11 DRB1*0701 DR7 23.4 DQA1*0104/DQB1*0503 DQ5(1) 4 DRB1*0801 DR8 3.3 DQA1*0201/DQB1*0202 DQ2 20.9 DRB1*0802 DR8 <2 DQA1*0201/DQB1*0303 DQ9(3) 7.2 DRB1*0901 DR9 <2 DQA1*0301/DQB1*0301 DQ7(3) 12.5 DRB1*1101 DR11(5) 17 DQA1*0301/DQB1*0302 DQ8(3) 18.3 DRB1*1104 DR11(5) 5.7 DQA1*0401/DQB1*0402 DQ4 4.5 DRB1*1201 DR12(5) 3.1 DQA1*0501/DQBL*0201 DQ2 24.6 DRB1*1301 DR13(6) 15.4 DQA1*0501/DQB1*0301 DQ7(3) 20.9 DRB1*1302 DR13(6) 10.8 DPA1*0103/DPB1*0201 DPw2 19.9 DRB1*1401 DR14(6) 4.2 DPA1*0103/DPB1*0401 DPw4 65.1 DRB1*1501 DR15(2) 13.2 DPA1*0103/DPB1*0402 DPw4 24.3 DRB1*1601 DR16(2) 5.5 DPA1*0201/DPB1*0101 DPw1 6.3 DRB3*0101 DR52 24.6 DPA1*0201/DPB1*0301 DPw3 <2 DRB3*0202 DR52 43 DPA1*0201/DPB1*0501 DPw5 <2 DRB3*0301 DR52 10 DPA1*0201/DPB1*0901 - 2.4 DRB4*0101 DR53 25.5

[0621] Tabela 6. Broj T<H>epitopa za IGKV1‑39. Peptidi koji se vezuju za više HLA iz iste grupe

[0622] (DRB1, DRB3/4/5, DP, DQ) brojani su kao jedan. Vrednosti u zagradama odnose se na

[0623] peptide filtrirane germinativnom linijom.

[0625] DRB1 DRB3/4/5 DQ DP Jaki Srednji Jaki Srednji Jaki Srednji Jaki Srednji Merus 0 (+6) 0 (+16) 0 (+0) 0 (+5) 0 (+3) 0 (+9) 0 (+0) 0 (+9) IGEKV1‑39

[0626] Tabela 7. Mapiranje Epibase<®>predviđanja za Merus IGKV1-39 u klasičnom 15-mernom

[0627] peptidnom formatu. Ova tabela prikazuje broj alotipova kritičnih epitopa i implicirane

[0628] serotipove za svaki od 15-mera koji obuhvataju sekvencu Merus IGKV1-39.

[0629] mer Start Sekvenca 15-mera Broj Implicirani serotipovi

[0630] pozicija alotipova

[0631] 1 DIQMTOSPSSLSASV 6 DR1, DR4, DR7, DR9

[0632] 4 MTQSPSSLSASVGDR 5 DR1, DR4, DR9

[0633] 7 SPSSLSASVGDRVTI 0

[0634] 10 SLSASVGDRVTITCR 0

[0635] 13 ASVGDRVTITCRASQ 0

[0636] 16 GDRVTITCRASQSIS 2 DR11(5), DR7

[0637] 19 VTITCFASQSISSYL 4 DQ2, DR11(5), DR4, DR7

[0638] 22 TCRASQSISSYLNWY 2 DQ2, DR4

[0639] 25 ASQSISSYLNWYQQK 5 DR13(6), DR15(2), DR4

[0640] DR12(5), DR13(6), DR15(2), DR16(2), DR4, 28 SISSYLNWYQQKPGK 8 DR8

[0642] 31 SYLNWYQQKPGKAPK 10 DR1, DR12(5), DR16(2), DR4, DR51, DR8

[0643] 34 NWYQQKPGRAPKLLI 9 DR1, DR15(2), DR4, DR51, DR8

[0645] 37 QQKPGKAPKLLIYAA 7 DQ4, DR1, DR11(5), DR15(2), DR51, DR8

[0646] 40 PGKAPKLLIYAASSL 7 DQ4, DR1, DR11(5), DR4, DR8

[0647] DR1, DR11(5), DR12(5), DR13(6), DR14(6),

[0648] 43 APKLLIYAASSLQSG 15 DR15(2), DR4, DR51, DR8, DR9

[0649] DR1, DR11(5), DR12(5), DR13(6), DR14(6),

[0650] 46 LLIYAASSLQSGVPS 15 DR15(2), DR4, DR51, DR8, DR9

[0651] 49 YAASSLQSGVPSRFS 1 DR15(2)

[0652] 52 SSLOSGVPSRFSGSG 1 DR15(2)

[0653] 55 QSGVPSRFSGSGSGT 0

[0654] 58 VPSRFSGSGSGTDFT 0

[0655] 61 RFSGSGSGTDFTLTI 0

[0656] 64 GSGSGTDFTLTISSL 1 DR52

[0657] 67 SGTDFTLTISSLQPE 4 DR4, DR52, DR7, DR9

[0658] 70 DFTLTISSLQPEDFA 4 DQ2, DR4, DR7, DR9

[0659] 73 LTISSLQPEDFATYY 1 DQ2

[0660] 76 SSLQPEDFATYYCQQ 0

[0661] 79 QPEDFATYYCQQSYS 1 DR4

[0662] 82 DFATYYCQQSYSTPP 5 DR4, DR51, DR7

[0663] 85 TYYCQQSYSTPPTFG 4 DR4, DR51, DR7

[0664] 88 CQQSYSTPPTFGQGT 0

[0665] 91 SYSTPPTFGQGTKVE 0

[0666] 94 TPPTFGQGTKVEIK 0

[0667] Tabela 8. V<H>gen iz PG1433 sparen sa različitim genima lakog lanca sa različitim stopama aminokiselinskih mutacija upoređuje se u pogledu nivoa proizvodnje sa originalnim klonom koji sadrži IGKV1‑39 gen.

[0669]

[0670]

[0671]

[0672]

[0675] 

[0676]

[0679] 

[0680]

[0683] 

[0684]

[0685]

[0686]

[0687]

[0688]

[0689]

[0690]

[0692] Tabela 11 Broj limfocita sakupljenih iz koštane srži i slezine divljeg tipa miševa i transgenih miševa

[0693]

[0694]

Claims (12)

1. PATENTNI ZAHTEVI

1. Upotreba transgenog mišolikog sisara koji u svom genomu sadrži integrisanu rearanžiranu nukleinsku kiselinu koja kodira rearanžirani varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina, pri čemu je navedeni varijabilni region lakog lanca sposoban za sparivanje sa najmanje dva različita teška lanca kodirana od strane mišolikog sisara, tako da se raznolikost u specifičnosti antitela zadržava kroz rearanžmane i hipermutacije u teškim lancima, za generisanje visokoafinitetnih antitela koja sadrže navedeni rearanžirani varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina, pri čemu su antitela kodirana VH genima koji su prošli somatsku hipermutaciju posle imunizacije i nemutiranim rearanžiranim humanim VL genom integrisanim u genom.

2. Upotreba prema patentnom zahtevu 1, pri čemu navedena nukleinska kiselina kodira još i konstantni region životinjskog lakog lanca.

3. Upotreba prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je navedeno antitelo usmereno protiv ćelijskog cilja.

4. Upotreba prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je navedeni ćelijski cilj humani na površini eksprimirajući ili rastvorljivi proteinski ili ugljenohidratni molekul.

5. Upotreba prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je navedeni ćelijski cilj na površini eksprimirajući proteinski ili ugljenohidratni molekul koji se eksprimira na površini bakterija, virusa, i drugih patogena, posebno patogena ljudi.

6. Upotreba prema patentnom zahtevu 3 ili 4, pri čemu navedeni cilj uključuje citokine i hemokine, receptorske molekule za citokine i hemokine, receptore imunoglobulinske (Ig) superfamilije, receptore familije faktora nekroze tumora, serin/treonin-protein kinazne receptore, tirozin kinazne receptore, članove familije EGF receptora, članove familije insulinskih receptora, članove familije PDGF receptora, članove familije receptora faktora rasta hepatocita, članove familije Trk receptora, članove familije AXL receptora, članove familije LTK receptora, članove familije TIE receptora, članove familije ROR receptora, članove familije DDR receptora, članove familije KLG receptora, članove familije RYK receptora, članove familije MuSK receptora, i članove familije receptora faktora rasta vaskularnog endotela (VEGFR).

7. Upotreba prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je navedeno antitelo usmereno protiv cilja koji se prekomerno eksprimira ili selektivno eksprimira u tumorima.

8. Upotreba prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je cilj VEGF, CD20, CD38, CD33, CEA, EpCAM, PSMA, CD54, Lewis Y, CD52, CD40, CD22, CD51/CD61, CD74, MUC‑1, CD38, CD19, CD262 (TRAIL-R2), RANKL, CTLA4, ili CD30.

9. Upotreba prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je navedeno antitelo usmereno protiv cilja koji je uključen u hronično zapaljenje.

10. Upotreba prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je cilj CD25, CD11a, TNF, CD4, CD80, CD23, CD3, CD14, IFNgama, CD40L, CD50, CD122, TGFbeta ili TGFalfa.

11. Upotreba prema patentnom zahtevu 3 ili 5, pri čemu navedeni cilj uključuje površinske markere virusa influence A i B poput hemaglutinina (HA) i neuraminidaze (NA), filovirusa poput ebola virusa, besnila, malih boginja, rubele, zauški, flavivirusa poput denga virusa tipovi 1‑4, virusa krpeljskog encefalitisa, virusa Zapadnog Nila, virusa japanskog encefalitisa, i virusa žute groznice, paramiksovirusa uključujući paramiksovirus poput parainfluence 1, 3, rubulavirus poput virusa zauški i parainfluence 2, 4, virus malih boginja, i pneumovirus poput respiratornog sincicijalnog virusa, virusa vakcinije, velikih boginja, koronavirusa, uključujući virus teškog akutnog respiratornog sindroma (SARS), virusa hepatitisa A, B i C, virusa humane imunodeficijencije, herpes virusa, uključujući citomegalovirus, Epstein Barr virus, herpes simpleks virus, i varičela zoster virus, parvovirusa poput, na primer, B19; Legionella pneumophila; Listeria monocytogenes; Campylobacter jejuni; Staphylococcus aureus; E. coli 0157:H7; Borrelia burgdorferi; Helicobacter pylori; Ehrlichia chaffeensis; Clostridium difficile; Vibrio cholera; Salmonella enterica serotip tifimurijum; Bartonella henselae; Streptococcus pyogenes (streptokok grupe A); Streptococcus agalactiae (streptokok grupe B); S. aureus multirezistentan na lekove (npr. MRSA); Chlamydia pneumoniae; Clostridium botulinum; Vibrio vulnificus; Parachlamydia pneumonia; Corynebacterium amycolatum; Klebsiella pneumonia; enterokoke rezistentne na linezolid (E. faecalis i E. faecium); i Acinetobacter baumannii multirezistentan na lekove.

1

12. Upotreba prema bilo kojem od patentnih zahteva 1‑11, pri čemu je VH gen koji je prošao somatsku hipermutaciju i koji kodira VH visokoafinitetnog antitela kako je generisano prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, izolovan i pri čemu su navedeni izolovani VH gen ili njegova kopija integrisani u ekspresionu kasetu i navedeno visokoafinitetno antitelo je eksprimirano u ćeliji-domaćinu.

2