KR20200057093A - 항체 생산 비-인간 포유동물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 비-인간 동물을 제공하고, 여기서 면역글로불린 경쇄는 인간, 인간-유사, 또는 인간화 경쇄이다. 핵산에는 그를 DNA 재배열 및/또는 체세포 과다돌연변이에 저항성이 되도록 만드는 수단이 제공된다. 한 실시태양에서, 핵산은 성숙 B 세포로 발달하는 세포 내에서 특정 발달 단계 동안 세포 내에서 목적하는 분자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함한다. 본 발명은 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 면역글로불린을 생산하기 위한 방법을 추가로 제공한다.

Description

항체 생산 비-인간 포유동물{ANTIBODY PRODUCING NON-HUMAN MAMMALS}

본 발명은 적어도 부분적으로 외인성 핵산 (트랜스젠 (transgene))으로부터 발현되는, 항체 또는 그의 유도체를 생산할 수 있는 비-인간 동물의 생산 및 사용에 관한 것이다. 그러한 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 생산하기 위한 트랜스젠 및 그러한 이종 항체를 생산하기 위한 방법; 그러한 트랜스제닉 동물을 생산하기 위한 방법 및 벡터를 개시한다.

B 세포는 특이적 항체를 생산함으로써 체액성 면역을 매개한다. 항체 (Ab)의 기본 구조적 하위단위는 면역글로불린 (Ig) 분자이다. Ig 분자는 2개의 동일한 중쇄 (H) 및 2개의 동일한 경쇄 (L) 폴리펩티드 사슬의 복합체로 구성된다. 각각의 H쇄 및 L쇄의 아미노 말단에 가변 (V) 구역으로 불리는 아미노산 서열이 변하는 구역이 있다. H쇄 및 L쇄의 나머지 부분은 아미노산 서열이 비교적 변하지 않고, 불변 (C) 구역으로 불린다. Ig 분자에서, H쇄 및 L쇄 V 구역 (VH 및 VL)은 병치하여 잠재적인 항원 결합 부위를 형성한다. H쇄 및 L쇄 V 구역을 코딩하는 유전자는 전구체 B (프리-B (pre-B)) 세포 분화 동안 생식계열 (germline) DNA의 세그먼트로부터 체세포성으로 조립된다: H쇄에 대해 V, D 및 J 유전자 세그먼트 및 L쇄에 대해 V 및 J 유전자 세그먼트. Ig 내에서, V 구역은 상호작용하여 항원-인식 부위를 형성하는 최대 아미노산 서열 가변성의 3개의 구역이고, 따라서 상보성 결정 구역 (CDR)으로서 칭해진다.

V 유전자 세그먼트는 CDR1 및 CDR2를 포함한 V 구역 도메인의 부피를 코딩한다. CDR1 및 CDR2 내의 다양성은 다수의 상이한 생식계열-코딩된 V 세그먼트 사이의 서열 비균질성으로부터 유래한다. CDR3은 H쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트 및 L쇄 V 및 J 세그먼트의 연결에 의해 및 이들 세그먼트가 조합되는 곳에서 뉴클레오티드 서열 비균질성을 생성시키는 메카니즘에 의해 형성되는 서열에 의해 코딩된다. 추가의 다양성은 상이한 H쇄 및 L쇄 V 구역들의 페어링 (pairing)으로부터 유래될 수 있다. 종합하면, 이들 과정은 생식계열 유전자 세그먼트에 의해 코딩되고 새로 형성된 B 세포에 의해 발현되는 항체의 1차 레퍼토리 (repertoire)를 생성시킨다.

항체 다양성의 추가의 공급원은 Ig 유전자 세그먼트의 재조합에 의해 생성된 다양성의 상단에 부과된다. B 세포는 그들이 발현하는 항체 V 구역 내로 돌연변이를 도입할 수 있다 (체세포 과다돌연변이 (somatic hypermutation)로 불리는 과정). 따라서, 동물이 항원에 처음 마주칠 때, 항원은 항원에 결합하는 V 도메인을 갖는 항체를 보유하게 되는 특이적 B 세포에 결합한다. 상기 1차 반응은 상기 B 세포를 활성화시켜 동족 (cognate) 항체를 분비하도록 할 수 있다. 이들 활성화된 B 세포는 또한 이제 체세포 돌연변이 과정을 그들의 재배열된 항체 유전자 세그먼트를 표적으로 하여, 1차 반응의 항체의 변이체를 만드는 딸 세포의 생산을 허용할 수 있다. 선택 과정은 항원의 개선된 친화도의 항체를 만드는 변이체 B 세포 자손을 증폭시킨다. B 세포에서, 체세포 과다돌연변이는 재배열된 VH 및 VL 유전자를 모두 포함하는 제한된 게놈 구역에 표적화된다. 따라서, 체세포 돌연변이는 친화도 성숙 (maturation) (고친화도 항체의 생산 및 선택)을 허용한다. 따라서, 체세포 돌연변이는 고친화도 항체의 생성을 위해 중요하다.

정교한 특이성 및 고친화도의 항체, 및 모노클로날 항체 (mAb)의 생성을 허용하는 하이브리도마 기술의 발견이 인간 질병에 대한 표적화된 치료제로서 그들의 활용에 대해 큰 기대를 불러일으켰다. MAb는 단일 B 세포 및 그의 자손체에 의해 생산되므로 동일하였다. MAb는 목적하는 항원으로 면역화시킨 마우스로부터의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켜 불멸화 하이브리도마를 생성함으로써 제조된다. 인간에서 mAb에 대한 생체내 용도의 개발에서 만나는 주요 장애 중 하나는 비-인간 Ig의 고유한 면역원성이다. 환자는 마우스 Ig 서열에 대한 항체 (인간 항 마우스 항체; HAMA)를 만듦으로써 치료 용량의 마우스 mAb에 반응하여, 급성 독성을 일으키고, 그들의 생체분포를 변경시키고 청소를 가속화시키고, 따라서 후속적인 투여의 효능을 감소시킨다 (Mirick, et al., (2004) Q. Nucl. Med. Mol. Imaging 48, 251-257).

HAMA의 생성을 피하기 위해, 인간에 투여될 때 면역원성이 감소된 mAb를 생산하려는 시도에서 항체 인간화 방법이 개발되었다. 이들 노력으로 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유하면서 mAb에서 인간 아미노산 서열의 함량을 증가시키는 것을 목표로 하는 다양한 재조합 DNA-기반 방법이 생성되었다. 인간화는 마우스-인간 키메릭 (chimeric) mAb의 제작으로 시작하였고 (Morrison, S. L., et al., (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 6851-5), 여기서 쥐 mAb 내의 Ig C 구역은 인간 C 구역에 의해 교체되었다. 키메릭 mAb는 60-70%의 인간 아미노산 서열을 함유하고, 인간 항-키메릭 항체 반응이 여전히 관찰되었지만 인간에 주입될 때 그들의 쥐 대응물보다 면역원성이 상당히 더 적다 (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3-10).

쥐 mAb를 추가로 인간화하기 위해, CDR 그라프팅 (grafting)이 개발되었다. CDR 그라프팅에서, 쥐 항체는 특이성 및 친화도를 위해 필수적인 것으로 보이는 쥐 프레임워크 잔기를 보유하면서 그들의 CDR을 인간 Ig 분자의 VL 및 VH 프레임워크 내로 그라프팅함으로써 인간화된다 (Jones, P.T., et al., (1986). Nature, 321, 522). 종합하면, CDR-그라프팅된 항체는 80% 초과의 인간 아미노산 서열로 구성된다 ([Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 10029]; [Carter, P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 4285]). 이들 노력에도 불구하고, CDR-그라프팅된 인간화된 항체는 여전히 그라프팅된 V 구역에 대한 항체 반응을 일으키는 것으로 나타났다 (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3).

CDR 그라프팅에 후속적으로, 재표면화 (resurfacing) (Padlan, E. A., et al., (1991). Mol. Immunol., 28, 489), 초인간화 (Tan, P., D. A., et al., (2002) J. Immunol., 169, 1119), 인간 스트링 함량 (string content) 최적화 (Lazar, G. A., et al., (2007). Mol. Immunol., 44, 1986) 및 휴머니어링 (humaneering)과 같은 상이한 방식에 기반한 인간화 방법이 치료적 mAb에서 비-인간 서열의 함량을 추가로 감소시키기 위해 개발되었다 (Almagro, J. C, et al., (2008). Frontiers in Bioscience 13, 1619). CDR 그라프팅 방법에서와 같이, 이들 방법은 최종 생성물의 면역원성에 대한 인간화 과정의 영향을 평가하기 위해 항체 구조의 분석 및 비-인간 및 인간 mAb의 서열 비교에 의존한다. 키메릭 및 인간화된 항체의 면역원성을 비교할 때, 가변 구역의 인간화는 면역원성을 추가로 감소시키는 것으로 보인다 (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3-10).

탈-면역화는 키메릭 또는 마우스 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 개발된 다른 방법이다. 이 방법은 생물정보학을 이용한 관심있는 항체에서 선형 T-세포 에피토프의 확인, 및 부위 지정 돌연변이 유발에 의한 인간 또는 비-면역원성 서열로의 그들의 후속적인 교체를 수반한다 (WO09852976A1). 탈-면역화시킨 항체는 그들의 키메릭 대응물에 비해 영장류에서 감소된 면역원성을 보였지만, 결합 친화도의 일부 손실이 관찰되었다 (Jain, M., et al., (2007). Trends in Biotechnol. 25, 307).

파지 디스플레이 기술의 개발은 인간에서 치료를 위한 면역원성이 보다 적은 mAb를 얻기 위해 인간화 방법을 보완하고 확장시켰다. 파지 디스플레이에서, 인간 항체 VH 및 VL 구역의 큰 컬렉션 (collection) ('라이브러리')이 섬유상 박테리오파지 입자의 표면 상에 발현된다. 상기 라이브러리로부터, 희귀한 (rare) 파지를 항원과의 결합 상호작용을 통해 선택하고; 가용형 항체 단편을 감염된 세균으로부터 발현시키고, 선택된 항체의 결합 친화도를 돌연변이에 의해 개선시킨다 (Winter, G., et al. (1994). Annu. Rev. Immunol. 12, 433). 과정은 면역 선택을 모방하고, 많은 상이한 결합 특이성을 갖는 항체가 상기 방법을 이용하여 단리되었다 (Hoogenboom, H. R., et al. (2005). Nat. Biotechnol., 23, 1105). H쇄 및 L쇄 V 구역의 다양한 공급원이 비-면역 또는 면역 공여체로부터 단리된 것을 포함한 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하기 위해 사용되었다. 또한, 추가의 다양성을 생성하기 위해 인공적으로 무작위화된 합성 CDR 구역을 함유하는 V 구역의 파지 디스플레이 라이브러리가 제작되었다. 종종, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 얻어진 항체는 고친화도 항체를 얻기 위해 시험관내 친화도 성숙으로 처리된다 (Hoogenboom, H. R., et al. (2005). Nat. Biotechnol., 23, 1105).

마우스 항체의 부재 하에 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스 주의 생성은 인간에 적용을 위한 특이적인 고친화도 인간 mAb의 생성을 위한 또다른 기술 플랫폼 (platform)을 제공하였다. 이들 트랜스제닉 동물에서, 내인성 마우스 항체 기구는 불활성화되고, 마우스에서 인간 체액성 면역계를 실질적으로 재현하기 위해 인간 Ig 로커스로 교체된다 ([Jakobovits, A., et al. (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134]; [Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 1117]). B 세포 발달, 및 유전자 세그먼트의 재조합에 의한 Ig 다양화가 이들 마우스에서 충실하게 재현되어, 인간 Ig를 발현하는 쥐 B 세포의 다양한 레퍼토리를 생성시킨다. 이들 마우스를 항원으로 면역화시킴으로써, 이들 트랜스제닉 동물은 고-친화도 인간 mAb의 광범위한 다양성을 생산하기 위해 중쇄 및 경쇄 모두의 V 구역에서 체세포 돌연변이를 축적하였음이 추가로 입증되었다 (Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 1117).

단지 2개의 인간 mAb에 대한 완전한 면역원성 데이타가 이용가능하므로, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 것과 같은 "완전 인간" mAb가 인간화 mAb보다 면역원성이 더 적은지의 질문에 대한 해답은 아직 구하지 못한 상태이다. 파지-디스플레이된 인간 라이브러리로부터 발달된 항-종양 괴사 인자 mAb는 12%의 환자에서 항체 반응을 유도하였다 (인간화 항체의 항-항체 반응의 보다 높은 말단에서) (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3-10).

트랜스제닉 방법에 의해 생성된 처음 등록된 인간 mAb의 면역원성의 평가에서는 mAb 처리가 대략 5.5%의 처리된 암 환자에서 항체 생성을 일으켰음을 입증하였다 ([Jakobovits, A., et al. (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134], [Lofgren, J. A., et al. (2007). J. Immunol. 178, 7467]).

따라서, 그들의 표적에 특이적이지만 면역원성이 보다 적은 항체를 생산하기 위한 방법 및 수단이 필요하다. 본 발명에 따르면, 면역원성의 감소는 적어도 부분적으로는, 적어도 그의 B 세포 계열 내에 적어도 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 제공함으로써 달성되고, 여기서 중쇄 또는 경쇄 코딩 서열에는 그를 DNA 재배열 및/또는 체세포 과다돌연변이에 저항성이 되도록 만드는 수단이 제공되고, 바람직하게는 상기 비-인간 동물은 설치류, 보다 구체적으로 마우스이다. 핵산은 바람직하게는 인간, 인간-유사 또는 인간화 면역글로불린 사슬을 코딩한다.

도 1
마우스 특이적 VH 프라이머의 어닐링 (annealing) 위치, 및 프라이머의 3' 말단에서 서열들을 오버행잉 (overhanging)함으로써 도입되는 요구되는 제한 부위의 위치의 토폴로지 (topology) 맵.
도 2
PCR 증폭 단계 (증폭, 중간 및 부위 도입). 마우스 VH 증폭 프라이머 (및 프라이머의 혼합물)의 위치 및 명칭을 단계마다 나타낸다.
도 3
MV1043 벡터의 토폴로지. 상기 벡터는 인간 또는 쥐 VH 단편의 클로닝을 위해 사용된다. O12 (IGKV1-39)가 VL 유전자로서 표시된다. 이. 콜라이 세포 내에서 헬퍼 파지와 조합으로 상기 벡터의 생성물은 g3 단백질에 대한 융합 생성물으로서 파지 입자의 표면 상에 Fab 단편을 디스플레이하는 파지의 생성 및 유전자 내용물로서 파지 내에 벡터의 존재를 허용한다 (F1 ORI).
도 4
J-세그먼트의 하류의 마우스 C카파 로커스의 토폴로지. 인핸서 및 C카파 구역 모두를 나타낸다. 하부 화살표는 로커스를 사일런싱시키기 위해 제거되는 구역을 나타낸다.
도 5
마우스 C-람다 로커스의 토폴로지. 3개의 모든 활성 V-구역을 나타내고 (Igl-V1, V2 및 V3), J-세그먼트 (Igl-J1, Igl-J2, Igl-J3, Igl-J4 및 슈도 세그먼트 Igl-J3p) 및 불변 구역 (Igl-C1, Igl-C2, Igl-C3 및 Igl-C4)도 또한 나타낸다. 로커스를 사일런싱시키기 위해 결실되는 구역은 결실 마커로 표시된다. 이들 결실은 모든 활성 V 유전자 (1, 2 및 3), 및 V2 및 V3 사이의 유전자간 세그먼트를 포함한다.
도 6
인트론이 리더 개방 해독 프레임 (ORF) 내에 위치하는 IGKV1-39/J-Ck의 구성체 토폴로지.
도 7
인트론이 리더 개방 해독 프레임 (ORF) 내에 위치하는 IGLV2-14/J-Ck의 구성체 토폴로지.
도 8
VkP-IGKV1-39/J-Ck (VkP-O12)의 구성체 토폴로지. 프로모터는 IGKV1-39 유전자로부터 기원하고, 효율적인 전사 및 번역을 위한 요구되는 요소의 바로 앞에 놓인다. 유전자간 서열 (인핸서 포함)은 마우스로부터 유래하고, BAC 클론으로부터 얻는다. C-카파 서열은 래트의 카파 불변 구역을 코딩한다.
도 9
VkP-IGLV2-14/J-Ck (VkP-2a2)의 구성체 토폴로지. 프로모터는 IGKV1-39 유전자로부터 기원하고, 효율적인 전사 및 번역을 위한 요구되는 요소의 바로 앞에 놓인다. 유전자간 서열 (인핸서 포함)은 마우스로부터 유래하고, BAC 클론으로부터 얻는다. C-카파 서열은 래트의 카파 불변 구역을 코딩한다.
도 10
VkP-IGKV1-39/J-Ck-△1 (VkP-O12-del1)의 구성체 토폴로지는 인트론 인핸서 구역이 제거된 것을 제외하고는 도 9의 VkP-IGKV1-39/J-Ck와 동일하다.
도 11
VkP-IGKV1-39/J-Ck-△2 (VkP-O12-del2)의 구성체 토폴로지는 Ck 유전자 및 3' 인핸서 사이의 유전자간 구역의 큰 부분이 결실되는 것을 제외하고는 도 10의 VkP-IGKV1-39/J-Ck-△1과 동일하다. 또한, 3' 인핸서는 크기가 809 bp에서 125 bp로 감소된다.
도 12
본원에서 사용되고 언급되는 서열의 개요.
도 13
Rosa26-IgVk1-39 KI 대립유전자의 생성. (a) pCAGGS-IgVK1-39 표적화 벡터의 개략도. (b) pCAGGS-IgVK1-39 표적화 벡터의 뉴클레오티드 서열. (c) 표적화 계획.
도 14
(a) pCAGGS-IgVK1-39 표적화 벡터의 삽입을 포함하는 ES 클론의 게놈 DNA의 서던 블롯 분석. 4개의 독립적인 클론의 게놈 DNA를 AseI로 소화시키고, 표적화 벡터의 5'-경계를 나타내는 5e1로 프로빙하였다. 모든 클론은 5' 말단에서 표적화 벡터의 정확한 삽입을 포함한다.
(b) pCAGGS-IgVK1-39 표적화 벡터의 삽입을 포함하는 ES 클론의 게놈 DNA의 서던 블롯 분석. 4개의 독립적인 클론의 게놈 DNA을 MscI로 소화시키고, 표적화 벡터의 3'-경계를 나타내는 3e1로 프로빙하였다. 모든 클론은 3' 말단에서 표적화 벡터의 정확한 삽입을 포함한다.
(c) pCAGGS-IgVK1-39 표적화 벡터의 삽입을 포함하는 ES 클론의 게놈 DNA의 서던 블롯 분석. 4개의 독립적인 클론의 게놈 DNA을 BamHI로 소화시키고, 표적화 벡터의 5'-경계를 나타내는 내부 Neo 프로브로 프로빙하였다. 모든 클론은 표적화 벡터의 정확한 단일 삽입을 포함한다.
도 15
Rosa26-IgVl2-14 KI 대립유전자의 생성. (a) pCAGGS-IgVL2-14 표적화 벡터의 개략도. (b) 재배열된 생식계열 IGLV2-14/J V 람다 구역 (IGLV2-14/J-Ck)에 기반한 CAGGS 발현 삽입물을 함유하는 pCAGGS-IgVL2-14 표적화 벡터의 뉴클레오티드 서열. (c) 표적화 계획.
도 16
IGKV1-39 잔기 1-107의 에피베이스(Epibase)® 프로필. 하위-도 a는 DRB1 동종이형 (allotype)에 대한 결합 강도를 나타내는 한편, C는 DRB3/4/5, DQ 및 DP 동종이형에 대한 결합 강도를 나타낸다. 도면 내의 값은 해리 상수 (Kd)를 나타내고, 0.01 μM - 0.1 μM 범위에서 로그 눈금 (logarithmic scale) 상에 플로팅된다 (매우 강한 결합물질 (binder)은 플롯을 벗어날 수 있다). 중간 결합 펩티드에 대해, 정성적 값만이 제시되고, 약한 및 비-결합물질은 제시되지 않는다. 값은 표적 서열 내의 펩티드의 제1 잔기에 대해 플로팅된다 (펩티드 자체는 추가의 9개의 잔기에 의해 연장한다). 중요하게는, 각각의 펩티드에 대해 가장 강한 결합 수용체만이 제시되고: 보다 낮은 친화도의 교차-반응하는 동종이형은 상기 플롯에서 보이지 않는다. 가장 강한 결합 수용체는 그의 혈청형 명칭으로 표시된다. 마지막으로, 임의의 생식계열-여과된 펩티드를 에피토프 맵에서 보다 밝은 색상으로 플로팅한다 (본 경우에, 비-자가 에피토프가 발견되지 않았다). 하위-도 b는 모든 10량체 펩티드에 대한 HLA 결합 불규칙성 (promiscuity)을 보여준다 (Y-축: X-축에 제시된 표시된 잔기에서 시작하는 각각의 펩티드 내의 중요한 에피토프를 인식하는 HLA 동종이형의 수). 불규칙성은 그에 대해 펩티드가 중요한 결합물질인 총 47 중의 동종이형의 수로서 측정된다. 백색 컬럼은 자가-펩티드를 나타내고, 흑색 컬럼 (여기에는 없음)은 비-자가 펩티드를 나타낸다.
도 17
15량체 형식에서 혈청형에 의해 IGKV1-39의 서열에서 예측된 펩티드 결합물질의 존재를 보여주는 IGKV1-39의 에피토프 맵. 각각의 15량체는 도면의 상단에 지시된 바와 같이 넘버링된다. 상응하는 15량체의 전체 서열은 표 7에 나열된다. 흑색 상자는 좌측에 나열된 혈청형에 대한 15량체 내의 하나 이상의 중요한 자가-에피토프의 존재를 나타낸다. 중요한 에피토프는 강한 또는 중간 DRB1 결합물질 및 강한 DRB3/4/5 또는 DP 또는 DQ 결합물질로서 작동 측면에서 규정된다.
도 18
Ig 카파 로커스의 구성적 낙아웃 (knock-out; KO). (a) 표적화 계획. (b) pIg카파 표적화 벡터의 개략도.
도 19
Ig 람다 로커스의 구성적 KO. (a) 표적화 계획의 제1 단계. (b) 표적화 계획의 제2 단계.
도 20
표적화 벡터의 개략도의 개략도. (a) pVkP-O12 (VkP-IGKV1-39/J-Ck); (b) pVkP-O12-del1 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-△1); (c) pVkP-O12-del2 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-△2).
도 21
RMCE를 이용하는 표적화된 트랜스제네시스에 의해 Rosa26 로커스 내로 트랜스젠의 삽입을 위한 표적화 계획. (a) VkP-O12 (VkP-IGKV1-39/J-Ck); (b) VkP-O12-del1 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-△1); (c) VkP-O12-del2 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-△2).
도 22
MV1057 벡터의 토폴로지. 지시된 스터퍼 (stuffer) 단편을 VH 단편으로 교체하면, O12 (IGKV1-39) VL 유전자를 함유하는 경쇄를 갖는 IgG1 항체의 생산을 위해 진핵 세포에 형질감염될 수 있는 발현 벡터를 수득한다.
도 23
비장의 비-B 세포 집단에서 트랜스제닉 인간 Vk1 경쇄 발현의 결핍.
도 24
트랜스제닉 인간 Vk1 경쇄는 비장의 모든 B 세포 집단에서 발현된다.
도 25
트랜스제닉 인간 Vk1 경쇄는 복강의 B1 세포에서 발현된다.
도 26
트랜스제닉 인간 Vk1 경쇄는 프로-B 세포 (pro-B cell) 및 프리-B 세포에서 발현되지 않지만, 골수 내의 미성숙 및 재순환 집단 B 세포에서 발현된다. (a) 골수 세포의 게이팅 (gating). (b) 하나의 WT 대조군으로부터 오버레이 (overlay)를 갖는 트랜스젠 발현의 막대그래프.
도 27
트랜스제닉 인간 Vk1 경쇄는 혈액 내의 순환하는 B 세포 내의 내인성 경쇄 및 IgM 발현과 직접적으로 상호관련된다.

명세서의 나머지 부분에서, 마우스가 비-인간 포유동물의 예로서 일반적으로 사용된다. 트랜스제닉 비-인간 포유동물 숙주는 항원에 대한 면역 반응을 착수할 수 있고, 여기서 반응은 영장류, 특히 인간, 가변 구역을 갖는 항체를 생산한다. 다양한 트랜스제닉 숙주, 특히 쥐, 토끼, 양, 소, 돼지, 말, 개, 고양이 등이 사용될 수 있다. 항체 생산을 위한 불멸화를 위한 B-림프구 생산을 위해 마우스가 사용되었다. 마우스는 취급하기 쉽고, 다수로 사육될 수 있고, 광범한 면역 레퍼토리를 갖는 것으로 알려져 있으므로, 마우스가 대체로 선택 동물일 것이다. 따라서, 아래의 논의에서, 논의는 마우스를 언급할 것이지만, 다른 동물, 특히 비-영장류 포유동물이 동일한 절차에 따라 마우스를 쉽게 대체할 수 있음을 이해해야 한다.

재배열 및 과다돌연변이를 방지하는 이유는 상기 방식에서 폴리펩티드 사슬이 비-면역원성으로 유지될 것임을 미리 알면서 비-면역원성 폴리펩티드가 선택될 수 있다는 점이다. 따라서, 생성되는 면역글로불린의 적어도 하나의 사슬은 면역원성이 보다 낮다. 생성되는 항체는 (대체로) 경쇄 및 중쇄를 모두 가질 필요가 있다. 따라서, 비-면역원성 사슬은 다른 사슬과 페어링할 수 있어야 한다. 다른 사슬은 내인성 사슬, 외인성 사슬 또는 둘 모두의 하이브리드 (hybrid)일 수 있다. 인간 치료법을 위해, 비-면역원성 사슬은 가능한 한 인간에 가까워야 한다.

면역글로불린 사슬(들)을 코딩하는 유전자를 DNA 재배열 및/또는 돌연변이에 저항성이 되도록 만드는 수단은 물론 상기 재배열 및/또는 돌연변이를 담당하는 모든 유전적 요소의 제거이다. 그의 단점은 2개의 사슬의 가변성이 제거되는 것인 반면, 본 발명은 바람직하게는 하나의 사슬 (바람직하게는 중쇄)의 가변성을 보유하고, 다른 사슬 (바람직하게는 경쇄)의 재배열-돌연변이를 억제 및/또는 방지한다.

지금까지 특성 결정된 재배열 및/또는 과다돌연변이를 위한 요소는 면역글로불린에 대한 로커스 내에 위치한다. 따라서, 면역글로불린 코딩 서열을 DNA 재배열 및/또는 돌연변이에 저항성이 되도록 만드는 수단은 면역글로불린 로커스 외부의 로커스에 유전자를 삽입하는 것이다.

따라서, 본 발명에 따르면, 경쇄/중쇄 코딩 서열이 면역글로불린 로커스 외부의 로커스에서 비-인간 포유동물의 게놈 내에 통합되는 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 제공한다. 바람직하게는, 삽입은 유전자 사일런싱 (silencing)에 저항성인 로커스 내에 있다. 본 발명에 따르면, 통합은 Rosa-로커스 또는 대등한 로커스에 있다.

Rosa 로커스 또는 대등한 로커스에 삽입될 수 있는 발현 카세트 (cassette)에, B 세포 계열의 세포로 본질적으로 제한된 면역글로불린 사슬(들)의 발현을 허용하는 수단, 바람직하게는 B 세포의 특정 발달 단계 동안 경쇄 코딩 핵산의 발현을 허용하는 수단을 제공하는 것이 바람직하다. 용어 "본질적으로 제한된 발현"은 발현이 B-세포 계열의 세포 내에 우세하지만, B-세포 내의 발현 수준에 비해 다른 세포 내에서 더 낮은 수준의 발현이 가능함을 나타낸다. 바람직한 실시태양에서, 용어 "본질적으로 제한된 발현"은 발현이 독점적으로 B-세포 계열의 세포 내에 존재함을 나타낸다. 그러한 수단은 일반적으로 및 바람직하게는 B 세포 (발달 단계) 특이적 프로모터, 예를 들어 CD19, CD20, μHC (모든 V-유전자), VpreB1, VpreB2, VpreB3, λ5, Igα, Igβ, κLC (모든 유전자), λLC (모든 유전자), BSAP (Pax5)를 포함한다. 그러한 프로모터에 의해 DNA 재배열 및/또는 돌연변이 저항성 사슬의 발현을 유도하는 것이 가능하지만, 이들은 비교적 약하다. B 세포 수용체 (막 부착형 Ig H쇄 및 L쇄로 구성된)의 적당한 표면 발현을 보장하기 위해 및 대립유전자 배제를 통해 내인성 사슬 (존재하는 경우)의 발현 및 페어링과 경쟁하기 위해 강한 프로모터가 대개 요구될 것이다. 그러나, 그러한 프로모터는 대체로 조직 특이적이지 않다. 조직 특이성을 부여하기 위해, Cre/lox 등을 사용한 간접적 시스템이 바람직하다. 목적하는 사슬을 목적하는 면역글로불린 코딩 유전자의 활성화를 일으키는, Cre-단백질의 작용에 의해 제거될 수 있는 요소에 의해 억제되는 강한 프로모터의 제어 하에 놓는다. 상기 시스템은 문헌 [Wunderlich F. T. (2004), "Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice", Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultaet der Universitaet zu Koeln; http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn= 97557230x&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=97557230x.pdf]에 상세히 설명되어 있다.

바람직하게는, 재배열 및 과다돌연변이에 저항성인 방식으로 생산된 면역글로불린 사슬은 비-인간 포유동물에 의해 코딩되는 상이한 중쇄와 페어링할 수 있는 경쇄이다. 따라서, 경쇄는 모든 항체에서 동일할 (및 덜 면역원성) 것이지만, 특이성에서의 다양성은 중쇄에서 재배열 및 과다돌연변이를 통해 보유된다. 이 경우에 경쇄를 코딩하는 적어도 하나의 내인성 로커스를 사일런싱시키는 것이 바람직할 수 있지만, 대립유전자 배제가 이를 불필요하게 만들 수 있다.

상기 실시태양에 따르면, 바람직하게는 내인성 카파 (κ) 경쇄 로커스가 기능적으로 사일런싱된다.

내인성 κ 경쇄 로커스가 사일런싱되는 경우에 또한 다른 이유로 인해, 저항성 경쇄가 κ 경쇄, 바람직하게는 생식계열-유사 서열을 갖는 경쇄인 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 그러한 경쇄는 감소된 면역원성을 갖는 항체를 생성시킬 것이다. 바람직한 생식계열 서열은 인간 IGKV1-39 (O12)에 기반하고, 이는 상기 경쇄가 인간 레퍼토리에서 매우 빈번하게 관찰되고 (de Wildt et al. 1999. J. Mol. Biol. 285(3):895), 뛰어난 열역학적 안정성, 수율 및 용해도를 갖기 때문이다 (Ewert et al. 2003. J. Mol. Biol. 325(3):531).

다음은 그를 사용하여 비-인간 동물이 본 발명에 따라 제공될 수 있는 발현 카세트의 보다 특정한 실시태양을 제공한다. 이것이 면역글로불린에 대해 일반적으로 유리하지만, 다른 관심있는 유전자가 또한 고려된다.

따라서, 본 발명은 특정 실시태양에서, 경쇄 코딩 핵산이 5'-3' 방향으로 B 세포 특이적 프로모터, 리더 (leader), 재배열된 인간 V 유전자, 임의로 MoEκi 인핸서, 불변 구역 (κ) 및 임의로 (말단절단된 (truncated)) MoEκ3' 인핸서를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 포유동물을 제공한다. 노이베르거 (Neuberger)는 카파 불변 구역의 하류에 위치하는 신규한 B-세포 특이적 인핸서를 확인하고 검사하였다 (EP004690251). 808 bp 인핸서의 제거는 발현을 강하게 감소시키므로, 상기 인핸서는 카파 유전자의 발현에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 3' 카파 인핸서의 결실이 또한 체세포 과다돌연변이 (SHM)의 수준을 강하게 감소시켰다. 트랜스제닉 및 세포 발현 연구에서, 감소된, 돌연변이된 또는 결실된 3' 카파 인핸서는 발현 수준을 저하시킬 뿐만 아니라, 또한 체세포 과다돌연변이의 수준을 감소시킨 것으로 밝혀졌다. 현재, 3' 카파 인핸서가 SHM 과정, 발현 조절 또는 둘 모두에 관여하는지는 결정될 수 없었다 ([Odegard, V. H., et al. (2006). Nat. Rev. Immunol. 6, 573]; [Inlay, M., et al. (2002). Nat. Immunol. 3, 463] 검토).

3' 카파 인핸서의 공학처리된 변이체를 사용하는 상세한 발현 연구에서는 50개 뉴클레오티드의 구역이 발현을 유도하기에 충분함을 나타냈다. 그러나, 적합한 발현을 위해, 145개 뉴클레오티드의 감소된 서열이 바람직하다 (EP04690251; [Meyer, K. B., et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(19):5609-15]).

따라서, 본 발명은 한 측면에서, 특정 발달 단계 동안 성숙 B 세포로 발달하는 세포 내에서 목적하는 단백질성 분자를 발현하기 위한 발현 카세트인 비-인간 동물의 게놈 내로 삽입을 위한 핵산을 제공하고, 상기 카세트는 숙주 세포 내로 도입된 후 목적하는 단백질성 분자의 발현의 사일런싱을 방지하기 위한 수단, 및 목적하는 단백질성 분자의 발현을 숙주 세포의 목적하는 발달 단계와 시기를 맞추기 위한 수단을 포함한다.

발현 카세트는 게놈 내의 특정 부위에서 상동성 재조합을 허용하는 서열과 같은, 숙주 세포의 게놈 내로 도입하기 위한 수단이 제공된 핵산으로서 정의된다. 대체로 핵산은 DNA, 대개 이중 가닥 DNA일 것이다. 일반적으로, 발현 카세트는 그로부터 세포의 게놈으로 전달되는 벡터 내에서 세포로 제공될 것이다. 발현 카세트는 숙주 세포 내에서 유전자의 발현을 위해 필요한 모든 요소를 추가로 포함하지만, 특정 실시태양에서 그러한 요소 중 일부는 도입시킬 제2 핵산 상에 존재할 수 있어서, 그에 의해 이들 요소는 인 트랜스 (in trans)로 작용한다. 숙주 세포 내에서 발현을 위해 필요한 요소는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소를 포함한다. 숙주 세포에 의해 제공되지 않는 요소만이 필요하다.

본 발명에 따르면, 관심있는 유전자의 발현이 숙주 세포의 게놈에서 사일런싱되지 않는 것이, 특히 발현이 요구되는 발달 단계에서 사일런싱되지 않는 것이 중요하다. 이것은 다양한 수단, 예를 들어 내인성 로커스 내로 삽입에 의해 또는 카세트에 사일런싱을 방지하는 핵산 요소를 제공함으로써 이루어질 수 있다 ([Kwaks et al. (2006) Trends Biotechnol. 24(3), p.137-142]; 본원에 참고로 포함됨). 발현 카세트가 숙주 세포에서 사일런싱되지 않는 로커스 내에 삽입되는 것이 바람직하다 (EP 01439234; 본원에 참고로 포함됨).

상기 사일런싱 방지 수단은 안정화 항-억압-서열 (STAR®-서열) 및 매트릭스 부착 구역 (MAR)을 포함한다. STAR 서열은 인 시스 (in cis)로 유전자의 전사에 영향을 미치는 능력을 포함하는 핵산 서열이다. 반드시는 아니지만 일반적으로, STAR 서열은 홀로 기능적 단백질 요소를 코딩하지 않는다. 한 실시태양에서, 하나의 STAR 요소가 사용된다. 그러나, 바람직하게는, 하나 초과의 STAR 요소가 사용된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 발현 카세트에는 2개의 STAR 서열이 제공된다; 면역글로불린 유전자의 코딩 서열의 5' 측면에서 하나의 STAR 서열, 및 면역글로불린 유전자의 코딩 서열의 3' 측면에서 하나의 STAR 서열. MAR은 DNA/염색질을 핵 매트릭스에 고정시키는데 관여하는 DNA 서열이고, 이들은 포유동물 및 식물 종 모두에서 설명되었다. MAR는 진정염색질 (euchromatin)의 개방 및 유지를 용이하게 하는 많은 특징을 갖는다. MAR은 트랜스젠 발현을 증가시키고, 위치-효과를 제한할 수 있다.

본 발명에 따르면, 카세트로부터의 발현이 세포의 발달에서, 특히 발달하는 B 세포, 보다 특히 트랜스제닉 비-인간 동물, 특히 마우스 내의 B 세포에서 특정 기간 동안에만 일어나는 것이 중요하다. 상기 특정 경우에, 발달 기간은 카세트로부터 유전자의 발현 (대개 경쇄 또는 중쇄-유사 폴리펩티드)이 세포의 정상적인 분화 및/또는 성숙을 유의하게 저해하지 않고, 적용가능한 경우에, 생산된 폴리펩티드 사슬과 그의 상대물과의 페어링을 허용하도록 선택된다.

본 발명에 따르면, 한 실시태양에서, 이것은 본 발명에 따른 핵산을 제공함으로써 달성할 수 있고, 여기서 발현 시기를 맞추기 위한 상기 수단은 그 활성이 특정 발달 단계에 본질적으로 제한되는 프로모터이다. 예를 들어, 면역화 후에 성숙하고/하거나 분화하는 발달하는 B 세포에서, 면역글로불린의 폴리펩티드 사슬 중 하나일 때 관심있는 유전자의 발현은 상기 성숙 및/또는 분화를 (유의하게) 저해하지 않아야 하고, 생성되는 폴리펩티드가 그의 상대물과 페어링할 수 있도록 시기를 맞출 필요가 있다. 따라서, 본 발명은 상기 특정 단계가 성숙 B 세포로의 특정 발달 단계에서 상기 세포에 의한 경쇄 분자의 발현의 개시 바로 전의 또는 개시와 동시의 단계에서 시작하는 본 발명에 따른 핵산을 제공한다.

이것은 상기 적합한 기간 동안에만 활성인 프로모터를 선택함으로써 달성할 수 있다. 상기 프로모터는 CD19 프로모터, Ig-α 프로모터, Ig-β 프로모터, μhc (모든 유전자) 프로모터, Vk 프로모터 또는 그의 유사체 또는 상동체일 수 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 상기 개시된 바와 같이 프로모터는 관심있는 유전자의 발현을 직접 유도하지 않는다. 대신에, 이는 그의 생성물이 관심있는 유전자의 인 트랜스 발현을 활성화시키는 유전자의 발현을 유도한다. 그러한 활성화 유전자는 소위 Cre 재조합효소 또는 Cre-유사 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 관심있는 유전자에 대한 발현 카세트에는 예를 들어 관심있는 유전자의 발현을 억제하는 서열이 제공될 수 있다. 상기 서열은 목적하는 프로모터 (적합한 발달 단계 동안 활성인)의 제어 하에 있는 Cre 재조합효소의 작용에 의해 제거될 수 있다. 상기 실시태양에서, 발현 카세트의 세트가 요구된다.

따라서, 본 발명은 발현 카세트인 핵산의 세트를 제공하고, 여기서 하나의 핵산은 숙주 세포의 목적하는 발달 단계 동안 활성인 프로모터의 제어 하에 Cre-유사 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고 제2 핵산은 Cre-유사 단백질의 작용에 의해 활성화될 수 있는 구성적 프로모터의 제어 하에 목적하는 단백질성 분자를 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 활성화는 바람직하게는 loxP 부위가 측면에 접하는 중지 서열의 제거에 의해 달성된다. Cre/lox 시스템은 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Rajewsky et al. (1996) J. Clin. Invest. 98, p.600-603]에 상세히 설명된다. 그러한 시스템은 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Wunderlich F. T. (2004), "Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice", Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultaet der Universitaet zu Koeln; http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=97557230x&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=97557230x.pd]에서 검토된다.

본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트가 제공된 트랜스제닉 비-인간 동물을 추가로 제공하고, 여기서 목적하는 단백질성 분자는 면역글로불린의 폴리펩티드 사슬이다. 바람직한 폴리펩티드 사슬은 경쇄이다. 보다 바람직한 폴리펩티드는 생식계열 또는 생식계열-유사 경쇄이다. 가장 바람직한 폴리펩티드는 O12, 바람직하게는 재배열된 생식계열 카파 경쇄 IGKV1-39^*01/IGKJ1^*01 (IMGT 데이타베이스에 따른 명명법, http://www.imgt.org)이다.

폴리펩티드 사슬이 본질적으로 재배열할 수 없고/없거나 B 세포 친화도 성숙의 과정 동안 Ig에 대해 정상적으로 작동하는 것과 같은 임의의 서열 변형이 배제되도록 되는 것이 추가로 바람직하다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트가 제공된 트랜스제닉 비-인간 동물을 제공하고, 여기서 상기 재배열 및/또는 서열 변형은 적어도 부분적으로 체세포 과다돌연변이를 담당하는 요소, 예를 들어, MoEκi 인핸서의 부재에 의해 방지된다.

본 발명에 따른 바람직한 발현 카세트는 사일런싱의 방지 수단을 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 사일런싱 방지 수단은 사일런싱에 저항성인 숙주 세포의 게놈 내의 로커스 내로의 삽입을 위한 수단이다. 상기 삽입 수단은 바람직하게는 사일런싱에 저항성인 상기 부위 내로의 상동성 재조합을 위한 수단이다. 비-인간 동물이 마우스일 때 바람직한 로커스는 rosa-로커스이다.

본 발명에 따른 추가의 바람직한 발현 카세트는 5'-3' 방향으로 Vκ 프로모터, 마우스 리더, 인간 V 유전자, 임의로 MoEκi 인핸서, 래트 불변 구역 (Cκ) 및 임의로 (말단절단된) MoEκ3' 인핸서를 포함한다.

본 발명에 따른 또다른 추가의 바람직한 발현 카세트는 5'-3' 방향으로 Vκ 프로모터, 인간 리더, 인간 V 유전자, 임의로 MoEκi 인핸서, 래트 불변 구역 (Cκ) 및 임의로 (말단절단된) MoEκ3' 인핸서를 포함한다.

물론, 본 발명의 궁극적인 목표는 인간 치료제에서 사용할 항체를 생산하는 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 비-인간 포유동물을 항원에 노출시켜 항체 반응을 유도하고, 항원에 특이적인 항체를 단리하는 것을 포함하는, 목적하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

별도의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 비-인간 포유동물을 항원에 노출시켜 항체 반응을 유도하고, 상기 항체를 생산하는 세포를 단리하고, 상기 세포를 배양하고 임의로 불멸화시키고, 상기 항체를 수거하는 것을 포함하는, 목적하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 비-인간 포유동물을 항원에 노출시켜 항체 반응을 유도하고, 그러한 항체의 적어도 일부를 코딩하는 핵산을 단리하고, 상기 핵산 또는 그의 카피 또는 유도체를 발현 카세트 내에 삽입하고, 상기 상체를 숙주 세포 내에서 발현시키는 것을 포함하는, 목적하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

트랜스제닉 마우스로부터 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 하나의 세포로부터 항체의 혼합물의 생산 방법이 특히 바람직하고, 그에 의해 상기 항체를 코딩하는 핵산은 본 발명에 따른 마우스로부터 유래되었다.

이들 소위 올리고클로닉 (oligoclonic)은 본원에 참고로 포함되는 WO04106375 및 WO05068622에 개시되어 있다.

본 발명은 바람직하게는 생식계열 입체형상 (configuration)으로 또는 그에 가까운 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 구역 및 바람직하게는 항원-유도된 친화도 성숙의 과정 동안 축적된 체세포 돌연변이를 가질 수 있는 쥐 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 구역을 갖는 특이적인 고친화도 하이브리드 마우스-인간 항체를 생성할 수 있는, 트랜스제닉 비-인간 포유동물, 바람직하게는 마우스를 제공한다. 하이브리드 항체의 쥐 VH 구역은 생식계열 또는 거의-생식계열 VL 구역 및 인간화된 쥐 VH 구역에 기초하여 인간에 적용될 때 면역원성이 감소된 mAb를 얻도록 인간화 절차로 처리될 수 있음이 예상된다.

특히, 본 발명에서, B 세포 발달 동안 유의한 비율의 B 세포 상에 트랜스젠의 시기적절하고 조절된 발현을 제공하지만, 트랜스젠에 대한 체세포 과다돌연변이 기구를 유도하는 요소가 결핍되는 시스-작용 유전자 요소의 제어 하에 재배열된 인간 VL 구역을 코딩하는 DNA 발현 구성체를 보유하는 트랜스제닉 마우스는 본질적으로 비돌연변이된 L쇄를 갖는 특이적인 고친화도 마우스-인간 하이브리드 항체를 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 재배열된 인간 트랜스젠은 다양한 내인성 쥐 면역글로불린 H쇄와 페어링하여, B 세포의 표면 상에서 발현된 마우스-인간 하이브리드 면역글로불린을 형성할 수 있고, 쥐 B 세포 발달을 충분하게 용이하게 하여 많고 다양한 말초 B 세포 컴파트먼트 (compartment)를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

바람직한 실시태양에서, 트랜스젠 발현 구성체는 B-세포 특이적 발현을 유도하는 인간 VL 프로모터의 제어 하에 인간 재배열된 L쇄 V 구역의 코딩 서열을 보유한다. 또한, 구성체는 트랜스젠의 B 세포 특이적이고 유도가능한 고수준 발현을 위한 쥐 3' Ck 인핸서 서열을 보유한다. 추가로, 구성체는 트랜스젠에 대한 체세포 과다돌연변이 기구의 동원을 용이하게 하는 조절 요소, 예를 들어 인트론 인핸서 및 3' C-카파 인핸서가 결핍되도록 설계된다.

관련 실시태양에서, 재배열된 인간 VL 유전자는 부위 특이적 통합에 의해 쥐 Rosa26 로커스 내에 삽입된다. 예측가능한 트랜스젠 발현 패턴을 갖는 트랜스제닉 유기체 (예를 들어, 마우스)의 효율적인 생성을 위한 "표적화된 트랜스제네시스 (transgenesis)" 방법의 문맥에서 Rosa26 로커스가 유용하다.

바람직한 실시태양에서, 재배열된 인간 VL 구역은 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 갖는 B 세포의 집단의 생성을 보장하도록 많은 상이한 쥐 VH 유전자와 페어링하는 그의 능력에 대해 선택된다. 그러한 VL 구역을 얻는 방법은 마우스의 B 세포로부터 재배열된 VH 유전자의 레퍼토리 및 인간의 B 세포로부터 인간 재배열된 생식계열 VL 구역의 레퍼토리를 증폭시키고, 이들을 파지미드 디스플레이 벡터 내로 클로닝하여 세균 내에서 하이브리드 면역글로불린의 다양한 라이브러리를 제조하는 것을 포함한다. 비선택된 및 항원-선택된 VH/VL 짝의 컬렉션의 뉴클레오티드 서열 분석에 의해, 많은 상이한 쥐 VH 유전자와 페어링하는 인간 생식계열 VL 유전자가 확인된다. 상기 능력을 가진 인간 생식계열 VL 유전자의 컬렉션이 설명된다.

한 실시태양에서, 항원으로 면역화시킬 때, B 세포는 면역 반응을 착수하여, 높은 특이성 및 친화도를 갖는 하이브리드 항체를 분비하는 B 세포의 생성을 일으킬 수 있는 것으로 나타난다. 이들 항체를 코딩하는 V 구역은 돌연변이를 보유하지 않거나 매우 적게 보유하는 인간 트랜스제닉 경쇄 및 체세포 과다돌연변이 기구에 의해 도입된 가변적인 수의 돌연변이를 보유하는 쥐 중쇄를 특징으로 한다.

관련 실시태양에서, 하이브리도마 및 디스플레이 기술에 의해 트랜스제닉 마우스로부터 고친화도 하이브리드 모노클로날 항체를 얻는 계획, 및 인간에 적용하기 위해 면역원성이 더 적은 항체를 얻기 위해 쥐 VH 구역을 인간화하는 절차가 고려된다.

한 실시태양에서, 본 발명은 동물 면역글로불린 단백질의 경쇄 불변 구역 (CL)과 조합되어 인간 면역글로불린 VL 구역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 면역글로불린 L쇄 트랜스젠 구성체를 제공하고, 여기서 서열은 비-인간 트랜스제닉 동물에 통합될 때, 체세포 과다돌연변이되지 않거나 근소하게 체세포 과다돌연변이된 인간 VL 구역을 갖는 Ig VL-CL 폴리펩티드를 생산하는 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. Ig VL은 비-인간 트랜스제닉 동물에서 B 세포 발달 동안 생성된 재배열된 VH-CH 폴리펩티드와 페어링할 수 있고, 여기서 상기 VH-CH 폴리펩티드는 자극 시에 체세포 과다돌연변이하는 능력을 보유한다. CL 구역은 임의의 동물 종의 것일 수 있고, 일반적으로 비-인간 트랜스제닉 동물의 CH 구역과 페어링할 수 있다.

본 발명은 또한 VL 구역이 인간 기원의 것이고 CL, VH 및 CH는 인간을 포함한 임의의 동물 종의 것일 수 있는 VL-CL 폴리펩티드 및 VH-CH 폴리펩티드로 구성되는 하이브리드 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 비-인간 동물을 생산하는데 있어서 상기한 트랜스젠 구성체의 용도를 포함한다. 면역화 시에, 이들 트랜스제닉 동물은 체세포 과다돌연변이된 VH 유전자에 의해 코딩되는 고친화도 항체, 및 트랜스젠에 의해 코딩되는 본질적으로 비-돌연변이된 VL 유전자를 생성할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 내인성 면역글로불린 경쇄 로커스를 기능적으로 파괴하고, 동물 게놈 내로 본 발명의 트랜스젠 구성체를 삽입하는 것을 포함하는, 항원 접종에 반응하여 하이브리드 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 비-인간 동물의 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 인간 VL 경쇄를 갖는 면역글로불린을 생산하는 B 세포의 생산에 있어서 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 동물의 용도를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기한 방법에 의해 수득가능한 동물에게 상기 항원을 접종하고, 상기 항원에 결합하는 상기 동물로부터 B 세포를 스크리닝하는 것을 포함하는 인간 VL을 갖고 선택된 항원에 결합하는 면역글로불린을 생산하는 B 세포의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 방법에 의해 수득가능한 B 세포, 및 그러한 B 세포를 불멸화시킴으로써 수득가능한 하이브리도마, 예를 들어 상기한 바와 같은 B 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 수득된 하이브리도마를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 하이브리도마를 배양하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체의 생산 방법을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 하이브리도마 또는 상응하는 모노클로날 항체를 생산하는데 있어서 상기 B 세포의 용도를 제공한다.

본 발명의 또다른 추가의 측면은 상기한 바와 같이 수득가능한 동물에게 상기 항원을 접종하고, 그로부터 면역글로불린을 수득하는 것을 포함하는, 인간 VL쇄를 갖고 선택된 항원에 결합하는 면역글로불린의 생산 방법이다.

하나의 계획에서, 개발 단계로서, 인간 생식계열 V 및 J 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 재배열된 VL 구역 및 임의의 동물 종의 경쇄 불변 구역, 그러나 바람직하게는 쥐 불변 구역을 마우스 생식계열 내로 도입시킨다. 트랜스젠 DNA는 배아 줄기 세포 또는 수정된 난자의 전핵 (pronucleus) 내로 도입될 수 있다. 통합은 사용할 특정 계획에 따라 무작위 또는 상동성일 수 있다. 예를 들어, VL 트랜스젠은 무작위 삽입에 의해 도입되어, 게놈 내에 하나 또는 다수 카피의 트랜스젠을 갖는 마우스를 생성할 수 있다. 별법으로, 인간 VL 트랜스젠은 당업계에 설명된 바와 같이 부위-특이적 재조합을 사용하여 특이적 게놈 로커스에 표적화될 수 있다.

하나의 바람직한 실시태양에서, VL 트랜스젠은 삽입된 트랜스젠의 강하고 예측가능한 발현을 허용하는 적합한 통합 부위인 쥐 ROSA26 로커스에 표적화된다 (EP 1439234). 표적화 벡터는 단일 카피의 유전자 발현 카세트의 삽입을 허용하여, 다수 카피의 배열에 의한 트랜스젠 발현의 조정을 방지한다. 삽입 부위로서 상염색체 Rosa26 로커스를 선택함으로써, 비-인간 동물에서 삽입된 트랜스젠의 발현 패턴을 예측가능하다. 추가로, 무작위 X 불활성화 및/또는 염색체 위치 효과에 의한 조정이 피해진다. 이것은 또한 임의의 제시된 트랜스젠에 대해 다수의 트랜스제닉 주를 생성하고 분석할 필요를 없앤다. 마지막으로, 부위-특이적 통합을 위한 Rosa26 표적화 벡터를 다수의 유전자 발현 카세트를 위해 사용할 수 있다. 따라서, 2개 이상의 상이한 재배열된 생식계열 인간 VL 구역이 하이브리드 또는 인간 항체의 레퍼토리의 다양성을 추가로 증가시키기 위해 Rosa26 로커스 내로 삽입되는 것을 예상할 수 있다.

다른 실시태양에서, 재배열된 인간 VL 구역은 내인성 로커스를 기능적으로 불활성화시키도록 쥐 Ig 카파 또는 람다 경쇄 로커스에 표적화될 수 있거나, 재배열된 인간 VL 구역을 함유하는 마우스를 기능적 카파 또는 람다 Ig 로커스 또는 둘 모두가 결핍되는 마우스와 교배할 수 있다. 따라서, 형질전환을 이용하거나, 반복적 단계를 이용하거나, 교배와 조합함으로써, 내인성 숙주 면역글로불린 경쇄가 실질적으로 부재하는 인간 VL 트랜스젠을 보유하는 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물은 얻을 수 있다.

한 실시태양에서, 인간 VL 트랜스젠은 B 세포의 표면에서 발현된 기능적 마우스-인간 하이브리드 항체의 다양한 레퍼토리를 형성하도록 쥐 VH 구역의 실질적인 부분과 페어링하는 그의 능력에 대해 선택된다. 쥐 VH 구역의 실질적인 부분은 인간 VL이 B 세포 발달 동안 생성된 쥐 VH 구역의 적어도 0.1%, 보다 바람직하게는 적어도 1%, 가장 바람직하게는 적어도 10%와 페어링하는 것을 의미한다. 상기 특징을 갖는 인간 VL 유전자를 확인하는 방법은 인간 VL 구역의 레퍼토리를 쥐 VH 구역의 레퍼토리와 무작위로 페어링시키고, 적절한 진핵 또는 원핵 발현 벡터 내에서 VH 및 VL 구역을 동시-발현시키고, 쥐 VH 구역의 실질적인 부분과 페어링하는 인간 VL 구역에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 파지미드 벡터는 세균 세포 내에서 또는 섬유상 파지의 표면에 마우스-인간 항체 단편의 발현을 유도하기 위해 및 당업계에 공지된 방법에 의한 항체 단편의 결합 능력의 분석에 사용될 수 있다.

다른 실시태양에서, 인간 VL 트랜스젠은 B 세포의 표면에서 발현된 인간 항체의 다양한 레퍼토리를 형성하도록 인간 VH 구역의 실질적인 부분과 페어링하는 그의 능력에 대해 선택된다. 인간 VH 구역의 실질적인 부분은 인간 VL이 B 세포 발달 동안 생성된 인간 VH 구역의 적어도 0.1%, 보다 바람직하게는 적어도 1%, 가장 바람직하게는 적어도 10%와 페어링하는 것을 의미한다.

후자의 실시태양에서, 인간 VL 트랜스제닉 마우스를 기능적 재배열된 또는 비-재배열된 인간 H쇄 면역글로불린 로커스 및 당업계에 설명된 바와 같은 기능적으로 불활성화된 내인성 H쇄 Ig 로커스를 보유하는 마우스와 교배한다. 숙주가 인간 IgH 및 재배열된 인간 VL 트랜스젠을 함유하는, 각각의 3개의 숙주 Ig 로커스 (중쇄, 카파 및 람다 경쇄)의 2개의 카피의 기능적 불활성화는 숙주 또는 숙주 인간 키메라 항체의 생산 없이 순수한 인간 항체 분자의 생산을 허용한다. 특이적 항원을 사용한 면역화에 의해 그러한 숙주 동물주는 특이적 인간 항체를 생산하는 마우스 B-세포의 생산에 의해 반응할 것이고, 여기서 B-세포는 후속적으로 마우스 골수종 세포와 융합되거나 인간 모노클로날 항체의 연속적인 안정한 생산을 위해 임의의 다른 방식으로 불멸화된다. 별법으로, 상기 B 세포 집단은 cDNA 라이브러리를 제조함으로써 또는 당업계에 공지된 바와 같이 인간 VH 구역에 대한 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있는 VH 구역의 공급원으로서 사용된다.

인간 재배열된 VL 유전자는 적절한 진핵 또는 원핵 미생물 내에서 재구성되고, 생성되는 DNA 단편은 배아 줄기 세포 또는 수정된 마우스 난자의 전핵 내로 도입될 수 있다. VL 트랜스젠의 B 세포 특이적 발현을 유도하는 다양한 구성체가 당업계에서 설명되었고, 다음과 같은 일반적인 형식을 갖는다: 트랜스젠의 B 세포 특이적 발현을 유도하는 리더 서열 및 관련 상류 서열, 인간 VL 트랜스젠의 코딩 서열, 트랜스젠의 B 세포 특이적인 고수준 발현을 유도하는 인핸서 서열, 및 쥐 불변 구역 유전자. 바람직한 형식에서, 인핸서는 C-카파 3' 인핸서이고, 이는 B-계열 세포에서 고수준 발현을 유도하지만, 트랜스젠 구성체에서 사용될 때 체세포 과다돌연변이를 동원하지 않기 때문이다.

한 실시태양에서, 게놈 내에 하나 또는 다수 카피의 트랜스젠을 포함하는 동물, 바람직하게는 마우스를 단리하고, 안정한 발현을 위해 분석한다. 바람직하게는 B-세포 내에서, 장기간에 걸쳐 트랜스젠의 안정한 발현을 보이는 동물을 선택한다. 요구되는 경우에, 바람직하게는 상이한 염색체 상에, 하나 또는 다수 카피의 트랜스젠의 독립적인 삽입을 포함하는 상이한 동물주를 교배하여, 바람직하게는 B-세포 내에서 동물에서 트랜스젠의 발현을 증가시키기 위해 하나 또는 다수 카피의 트랜스젠의 상이한 삽입을 갖는 동물을 얻는다.

본 발명은 본 발명에 따른 트랜스제닉 비-인간 동물의 자손체를 추가로 제공하고, 상기 자손체는 적어도 그의 B-세포 계열 내에, 서열을 DNA 재배열 및/또는 체세포 과다돌연변이에 저항성이 되도록 만드는 수단과 함께 중쇄 또는 경쇄 코딩 서열을 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 트랜스제닉 비-인간 동물의 자손체를 추가로 제공하고, 상기 자손체는 성숙 B 세포로 발달하는 세포 내에서 특정 발달 단계 동안 세포 내에서 목적하는 단백질성 분자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 단리된 세포를 제공하고, 상기 세포는 서열을 DNA 재배열 및/또는 체세포 과다돌연변이에 저항성이 되도록 만드는 수단과 함께 중쇄 또는 경쇄 코딩 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 단리된 세포를 제공하고, 상기 세포는 성숙 B 세포로 발달하는 세포 내에서 특정 발달 단계 동안 세포 내에서 목적하는 단백질성 분자를 발현하기 위한 발현 카세트를 포함한다. 본 발명에 따른 세포, 바람직하게는 항체-생산 B-세포 또는 항체-생산 B-세포로 분화하거나 성숙할 수 있는 세포는 예를 들어 문헌 [Gascan et al. 1991. J. Exp. Med. 173: 747-750]으로부터 당업자에게 공지된 바와 같이 항체의 시험관내 생산을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 세포의 불멸화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 골수종 세포와의 융합에 의한 하이브리도마의 생성, 엡스타인 바아 (Epstein Barr) 바이러스를 사용한 형질전환; 활성화 및 전사의 신호 변환인자 (STAT)의 발현, CD40 및 IL4 수용체 신호전달을 통한 활성화, 및/또는 Bcl6의 발현을 포함한다 (Shvarts et al. 2002. Genes Dev 16: 681-686).

별개의 단계에서, 마우스 내인성 카파 및 람다 경쇄 로커스는 트랜스제닉 마우스 내의 적어도 대다수의 B 세포가 트랜스제닉 인간 VL 구역을 함유하는 Ig 수용체를 보유하도록 본질적으로 비-기능적으로 된다. 내인성 마우스 면역글로불린 로커스의 불활성화는 마우스 배아 줄기 세포에서 상동성 재조합에 의한 적절한 로커스의 표적화된 파괴에 의해 달성된다. 상기 표적화된 파괴는 기능적 내인성 마우스 면역글로불린 카파 및/또는 람다 경쇄가 실질적으로 생산되지 않도록 게놈 서열의 변경을 포함한다. 용어 "기능적 내인성 마우스 면역글로불린이 실질적으로 없는"은 내인성 카파 및/또는 람다 경쇄 로커스, 바람직하게는 내인성 카파 경쇄 로커스의 기능적 단백질 발현의 수준이 참조 마우스에서의 발현 수준의 약 20%, 보다 바람직하게는 약 10%, 보다 바람직하게는 약 5%, 보다 바람직하게는 약 2%, 보다 바람직하게는 약 1%로 감소하도록 내인성 카파 및/또는 람다 경쇄 로커스가 기능적으로 사일런싱되는 것을 나타낸다. 가장 바람직한 실시태양에서, 내인성 카파 및/또는 람다 경쇄 로커스의 기능적 단백질 발현의 수준은 0%로 감소한다. 기능적 단백질 발현의 수준은 웨스턴 블로팅 및 마우스 중쇄와의 페어링을 포함한, 당업자에게 공지된 수단에 의해 결정될 수 있다. 상기 참조 마우스는 내인성 카파 및/또는 람다 경쇄 로커스가 파괴되지 않은 마우스이다. 상기 변경은 내인성 면역글로불린 유전자의 기능적 발현을 위해 요구되는 유전자 서열의 돌연변이 및/또는 결실을 포함한다. 별법으로, 상기 변경은 내인성 면역글로불린 유전자의 기능적 발현이 감소되도록 내인성 마우스 면역글로불린 카파 및/또는 람다 경쇄 로커스 내로 핵산의 삽입을 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 핵산은 내인성 면역글로불린 유전자의 전사 사일런싱을 일으키는 사일런싱 요소를 포함한다. 추가의 실시태양에서 또는 추가로, 상기 핵산은 예를 들어 코딩 서열 내에서 프레임 이동을 일으키는 엑손을 도입함으로써 내인성 면역글로불린 유전자의 스플라이싱 및/또는 번역을 파괴하는 서열, 또는 조기 중지 코돈을 포함하는 서열을 포함한다. 각각의 경우에, 변형된 배아 줄기 세포로부터 부분적으로 유래되고 생식계열을 통해 유전자 변형을 전달할 수 있는 키메라 동물이 생성된다. 인간 면역글로불린 로커스를 갖는 마우스 동물주를 불활성화된 마우스 로커스를 갖는 동물주와 교배시키면 본질적으로 인간 경쇄만을 포함하는 항체를 생산하는 동물을 얻는다.

상동성 재조합을 위한 구성체는 당업계에 공지된 수단에 의해 제조되고, 임의의 바람직하지 않은 서열, 예를 들어, 원핵생물 서열은 제거된다. 상동성 재조합을 위한 구성체를 표적 세포 내로 도입하기 위한 임의의 편리한 기술을 사용할 수 있다. 이들 기술은 스페로플라스트 (spheroplast) 융합, 리포펙션 (lipofection), 전기천공, 인산칼슘-매개된 DNA 전달 또는 직접 미세주사를 포함한다. 표적 세포의 형질전환 또는 형질감염 후에, 양성 및/또는 음성 마커에 의해, 예를 들어 마이신 내성 및/또는 아시클로버 및/또는 갠시클로버 내성에 의해 표적 세포를 선택한다. 이어서, 목적하는 표현형을 보이는 세포를 제한 분석, 전기영동, 서던 (Southern) 분석, PCR 등에 의해 더욱 분석할 수 있다. 표적 로커스에서 병변(들)의 존재를 보이는 단편을 확임함으로써, 표적 로커스의 카피를 불활성화시키기 위해 상동성 재조합이 일어난 세포가 확인된다.

추가로, 면역화 시에, 상기 언급된 트랜스제닉 마우스 내의 쥐 및 인간 VH 구역은 고친화도 항체를 생성하도록 체세포 과다돌연변이를 거칠 수 있지만 VL 구역은 그렇지 않은 것으로 나타났다. 유리하게는, 생식계열 VL 구역에 의해 코딩되는 이들 항체는 인간에 적용될 때 보다 낮은 면역원성에 기여하는 것으로 예측되고, 응집하는 경향이 더 적고 따라서 인간에서 치료 용도를 위해 더 안전한 보다 안정한 항체를 생성한다.

상기 언급된 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 세포로부터 유래된 MAb는 모두 동일한 인간 VL 구역을 공유한다. 동일한 VL 구역을 공유하는 mAb는 기능적 결합 부위를 갖는 재조합 항체의 혼합물의 생산을 위해 단일 클로날 세포 내에서 동시-발현될 수 있는 것으로 설명되었다 (WO04106375 및 WO05068622 참조). 따라서, 본 발명은 클로날 세포에 의해 생산된 mAb의 혼합물에 대한 기초를 구성하는 특이적인 고친화도 mAb의 생성을 위한 플랫폼을 제공한다.

상기 언급된 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 세포로부터 유래된 mAb는 세포 표적에 대해 생성되는 것이 바람직하다. 바람직한 표적은 인간 표면-발현된 또는 가용형 단백질 또는 탄수화물 분자이다. 더욱 바람직한 표적은 특히 인간의, 세균, 바이러스 및 다른 병원체의 표면에서 발현된 표면-발현된 단백질 또는 탄수화물 분자이다.

보다 구체적으로, 바람직한 표적은 시토킨 및 케모킨, 예를 들어 비제한적으로 인터루킨 1베타 (IL1베타), IL2, IL4, IL5, IL7, IL8, IL12, IL13, IL15, IL18, IL21, IL23 및 케모킨, 예를 들어, CXC 케모킨, CC 케모킨, C 케모킨 (또는 γ 케모킨), 예를 들어 XCL1 (림포탁틴-α) 및 XCL2 (림포탁틴-β), 및 CX3C 케모킨을 포함한다. 바람직한 표적으로서 시토킨 및 케모킨의 수용체 분자, 예를 들어 타입 I 시토킨 수용체, 예를 들어, IL-2 수용체, 타입 II 시토킨 수용체, 예를 들어 인터페론 수용체, 면역글로불린 (Ig) 수퍼패밀리 (superfamily) 수용체, 종양 괴사 인자 수용체 패밀리, 예를 들어 CD40, CD27 및 CD30에 대한 수용체, 세린/트레오닌-단백질 키나제 수용체, 예를 들어 TGF 베타 수용체, G-단백질 결합 수용체, 예를 들어 CXCR1-CXCR7, 및 티로신 키나제 수용체, 예를 들어 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 패밀리 멤버, EGF 수용체 패밀리 멤버, 예를 들어 erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3) 및 erbB4 (HER4), 인슐린 수용체 패밀리 멤버, 예를 들어 IGF-R1 및 IGF-RII, PDGF 수용체 패밀리 멤버, 간세포 성장 인자 수용체 패밀리 멤버, 예를 들어 c-Met (HGF-R), Trk 수용체 패밀리 멤버, AXL 수용체 패밀리 멤버, LTK 수용체 패밀리 멤버, TIE 수용체 패밀리 멤버, ROR 수용체 패밀리 멤버, DDR 수용체 패밀리 멤버, KLG 수용체 패밀리 멤버, RYK 수용체 패밀리 멤버, MuSK 수용체 패밀리 멤버, 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR) 패밀리 멤버가 추가로 포함된다.

추가로 바람직한 표적은 종양에서 과다-발현되거나 선택적으로 발현되는 표적, 예를 들어, VEGF, CD20, CD38, CD33, CEA, EpCAM, PSMA, CD54, 루이스 (Lewis) Y, CD52, CD40, CD22, CD51/CD61, CD74, MUC-1, CD38, CD19, CD262 (TRAIL-R2), RANKL, CTLA4, 및 CD30; 만성 염증에 관여하는 표적, 예를 들어, CD25, CD11a, TNF, CD4, CD80, CD23, CD3, CD14, IFN감마, CD40L, CD50, CD122, TGF베타 및 TGF알파이다.

특히 인간의, 세균, 바이러스 및 다른 기생충 병원체의 표면에서 발현되는 바람직한 표면-발현된 단백질 또는 탄수화물 분자는 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 표면 마커, 예를 들어 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA), 필로바이러스, 예를 들어 에볼라 바이러스, 광견병, 홍역, 풍진, 유행성 이하선염, 플라비바이러스, 예를 들어 뎅기 바이러스 타입 1-4, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 및 황열병 바이러스, 파리믹소바이러스, 예를 들어 파리믹소바이러스, 예를 들어 파라인플루엔자 1, 3, 루불라바이러스, 예를 들어 멈프스바이러스 및 파라인플루엔자 2, 4, 모르빌리바이러스, 및 뉴모바이러스, 예를 들어 호흡기 합포체 바이러스, 우두, 천연두, 코로나바이러스, 예를 들어 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 바이러스, A, B 및 C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 포진 바이러스, 예를 들어 사이토메갈로바이러스, 엡스타인 바아 바이러스, 단순 포진 바이러스, 및 수두 대상포진 바이러스, 파르보바이러스, 예를 들어, B19; 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila); 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes); 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni); 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus); 이. 콜라이 (E. coli) O157:H7; 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi); 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori); 에를리키아 샤펜시스 (Ehrlichia chaffeensis); 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile); 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera); 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 (Salmonella enterica Serotype Typhimurium); 바르토넬라 헨셀라에 (Bartonella henselae); 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (그룹 A 스트렙토코커스); 스트렙토코커스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae) (그룹 B 스트렙토코커스); 다제 약물 내성 에스. 아우레우스 (S. aureus) (예를 들어 MRSA); 클라미디아 뉴모니아에 (Chlamydia pneumoniae); 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum); 비브리오 불리피쿠스 (Vibrio vulnificus); 파라클라미디아 뉴모니아 (Parachlamydia pneumonia); 코리네박테리움 아미콜라툼 (Corynebacterium amycolatum); 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia); 리네졸리드 (Linezolid)-내성 장구균 (이. 파에칼리스 (E. faecalis) 및 이. 파에시움 (E. faecium)); 및 다제 약물 내성 아시네토박터 바우마니이 (Acinetobacter baumannii)를 포함한다.

가장 바람직한 표적은 IL-6 및 그의 수용체, IL-6R알파, 당단백질-표시된 gp130, RSV, 특히 표면 단백질 F, G 및 SH, 및 비-구조 단백질, 예를 들어 N 및 M, 및 수용체 티로신 키나제, 특히 erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2 (HER2), erbB3 (HER3), erbB4 (HER4), IGF-R1 및 IGF-RII, c-Met (HGF-R)이다.

따라서, 본 발명은 클로날 세포에 의해 생산된 mAb의 혼합물에 대한 기초를 구성하는 상기 언급된 표적에 대해 생성된 특이적인 고친화도 mAb의 생성을 위한 플랫폼을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 특이적인 고친화도 mAb는 적어도 하나의 표적 상의 상이한 에피토프에 대해 생성되는 mAb를 포함한다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 특이적인 고친화도 mAb는 상이한 표적, 예를 들어, EGF-수용체 패밀리의 하나 이상의 멤버, 예를 들어 erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2 (HER2), erbB3 (HER3) 및 erbB4 (HER4)에 대해 생성되는 mAb를 포함한다.

달리 정의하지 않으면, 본 발명과 연관하여 사용되는 학술 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해되는 것과 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않으면, 단수형 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재되는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 연관하여 사용되는 명명법 및 그의 기술은 당업계에 잘 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위한 표준 기술이 사용된다. 효소에 의한 반응 및 정제 기술은 제조사의 명세사항에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 상기한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본 명세서 전체에서 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참조문에 설명된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001))]을 참조한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 제약 화학과 연관하여 사용되는 명명법 및 그의 실험실 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제형화, 및 전달, 및 환자의 치료를 위한 표준 기술이 사용된다.

실시예

실시예 1

인간 경쇄 V-유전자 클론

본 실시예는 경쇄 발현 트랜스제닉 마우스라는 개념에 대한 증거로서 사용되는 2개의 인간 경쇄 V-유전자 (카파형의 하나의 유전자 및 람다형의 하나의 유전자)의 선택에 대한 원리를 설명한다. De Wildt 등 (1990)의 문헌 ([de Wildt et al. (1999) J. Mol. Biol. 285(3):895])에서는 말초 IgG-양성 B-세포에서 인간 경쇄의 발현을 분석하였다. 상기 데이타를 기초로 하여, B-세포 레퍼토리에서 잘 제시되기 때문에 IGKV1-39 (O12) 및 IGLV2-14 (2a2)를 경쇄로 선택하였다. 경쇄의 J-세그먼트 서열은 IGKV1-39에 대해 GenBank ABA26122에서 제시되는 서열 (Rabquer, B.J., Smithson, S.L., Shriner, A.K. and Westerink, M.A.J.) 및 IGLV2-14에 대해 GenBank AAF20450에서 제시되는 서열 (Ignatovich, O., Tomlinson, I.M., Popov, A.V., Bruggemann, M. and Winter, G. J. Mol. Biol. 294 (2), 457-465 (1999))을 기초로 하여 선택하였다.

모든 프레임워크 세그먼트는 잠재적인 임상 용도에서 가능한 가장 낮은 면역원성을 제공하도록 생식계열 아미노산 서열로 전환된다.

실시예 2

인간 IGKV1-39 유전자 세그먼트와 페어링하여 기능적 항체 결합 부위를 형성하는 마우스 중쇄 V-유전자의 획득

본 실시예는 단일의 재배열된 인간 생식계열 IGKV1-39/J 구역과 페어링할 수 있는 마우스 중쇄 V-유전자의 확인에 대해 설명한다. 파상풍 톡소이드로 면역화시킨 마우스로부터의 비장 VH 레퍼토리를 단일 인간 IGKV1-39-C 카파 경쇄와 함께 파지 디스플레이 Fab 벡터에 클로닝하고, 파상풍 톡소이드에 대해 패닝 (panning)하였다. 1 라운드의 패닝 후에 얻은 클론을 그들의 결합 특이성에 대해 분석하였다. 특유한 클론을 확인하고 VH, DH 및 JH 이용을 지정하기 위해서 파상풍 톡소이드-특이적 Fab 단편을 코딩하는 쥐 VH 유전자의 서열을 분석하였다.

본원에서 설명되는 많은 프로토콜은 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 및 관심있는 항원에 대한 결합을 위한 파지의 패닝을 위한 표준 프로토콜이고, 문헌 [Antibody Phage Display: Methods and Protocols (editor(s): Philippa M. O'Brien, Robert Aitken)]에 기재되어 있다.

면역화

BALB/c 마우스를 파상풍 톡소이드로 1회 면역화시키고, 6주 후에 파상풍 톡소이드로 부스터 (booster) 처리하였다.

비장세포 단리

비장 세포 현탁액의 제조. 절개 후에, 비장을 PBS로 세척하고, 20 ml PBS가 존재하는 60 mm 페트리디쉬에 옮겼다. 20 ml PBS 및 G20 바늘이 있는 주사기를 사용하여 비장을 반복적으로 씻어내렸다. 씻어내린 세포를 PBS로 세척한 후, 20 ml PBS를 사용하여 세포를 조심스럽게 현탁액으로 만들고, 비장세포를 파쇄물 및 세포 클러스터로부터 분리하기 위해 5분 동안 벤치에 정치시켰다. 비장세포 현탁액을 Ficoll- Paque™ PLUS-충전 튜브의 상부에 옮기고, 림프구 단리를 위한 제조사의 절차에 따라 처리하였다 (아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences)).

RNA 단리 및 cDNA 합성

림프구의 단리 및 펠렛화 후에, 세포를 총 RNA의 단리를 위해 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol LS 시약 (인비트로겐 (Invitrogen))에 현탁시키고, 제조사의 절차 (인비트로겐)에 따라 dT20과 조합하여 1 ㎍의 RNA, Superscript III RT를 사용하여 역전사 반응에 적용하였다.

cDNA의 PCR 증폭

cDNA는 15개의 VH 패밀리에 속하는 대략 110개의 상이한 쥐 V-유전자의 증폭을 허용하는 프라이머 조합물을 사용하여 PCR 반응으로 증폭하였다 (표 1; RefSeq NG_005838; Thiebe et al., 1999. European Journal of Immunology 29: 2072 - 2081). 제1 라운드에서, V-유전자의 5' 말단 및 J 구역의 3' 말단에 결합하는 프라이머 조합물을 사용하였다. 제2 라운드에서, MJH-Rev2 프라이머로 생성시킨 PCR 생성물은 생성물의 효율적인 클로닝을 가능하도록 3' 구역에 변형을 도입하기 위해 증폭하였다. 마지막 증폭 라운드에서, 모든 PCR 생성물은 5' 말단에 SfiI 제한 부위를, 3' 말단에 BstEII 제한 부위를 도입하는 프라이머를 사용하여 증폭하였다 (도 1 및 2, 및 표 1 참조).

제1 라운드 PCR의 반응 조건: 반응당 모든 25개의 전방향 프라이머 (MVH1 내지 MVH25, 표 1 및 도 2) 및 1개의 역방향 프라이머를 조합한 4개의 상이한 반응 (MJH-Rev1, MJH-Rev2, MJH-Rev3 또는 MJH-Rev4; 표 1 및 도 2 참조). 50 ㎕ PCR 부피는 2 ㎕ cDNA (RT 반응으로부터의), 10 ㎕ 5^* Phusion 중합효소 HF 버퍼, 40 nM의 각각의 25개의 전방향 프라이머 (총 농도 1 마이크로몰), 1 마이크로몰 역방향 프라이머, 1 ㎕ 10 mM dNTP 원액, 1.25 단위 Phusion 중합효소 및 MQ 멸균수로 구성되었다. 열순환기 프로그램은 다음과 같은 터치 다운 (touch down) 프로그램으로 구성되었다: 1 사이클 - 98℃ 30초, 30 사이클 - 98℃ 10초, 58℃ (사이클당 0.2℃씩 감온) 10초, 72℃ 20초 및 1 사이클 - 72℃ 3분. 제2 라운드 PCR 프로그램은 MJH-Rev2 프라이머: 역방향 프라이머 ExtMJH-Rev2int (표 1 및 도 2)와 함께 ExtMVH-1 또는 ExtMVH-2 프라이머 (표 1 및 도 2)를 조합한 2개의 상이한 반응물을 함유하는 제1 PCR 생성물에 대해서만 설정되었다. 50 ㎕ PCR 부피는 50 ng PCR 생성물 (제1 PCR 라운드로부터의), 10 ㎕ 5^* Phusion 중합효소 HF 버퍼, 500 nM의 각각의 전방향 프라이머, 1 마이크로몰 역방향 프라이머, 1 ㎕ 10 mM dNTP 원액, 1.25 단위 Phusion 중합효소 및 MQ 멸균수로 구성되었다. 열순환기 프로그램은 터치 다운 프로그램, 이어서 통상적인 증폭 단계로 구성되었다: 1 사이클 - 98℃ 30초, 10 사이클 - 98℃ 10초, 65℃ (사이클당 1.5℃씩 감온) 10초, 72℃ 20초, 10 사이클 - 98℃ 10초, 55℃ 10초, 72℃ 20초 및 1 사이클 - 72℃ 3분. 제3 라운드 PCR 프로그램은 도 2에 제시된 바와 같이 설정하였다. 50 ㎕ PCR 부피는 50 ng PCR 생성물 (이전 PCR 라운드로부터의, 도 2), 10 ㎕ 5^* Phusion 중합효소 HF 버퍼, 1 마이크로몰 전방향 프라이머 (표 1 및 도 2), 1 마이크로몰 역방향 프라이머, 1 ㎕ 10 mM dNTP 원액, 1.25 단위 Phusion 중합효소 및 MQ 멸균수로 구성되었다. 프로그램은 터치 다운 프로그램, 이어서 통상적인 증폭 단계로 구성되었다: 1 사이클 - 98℃ 30초, 10 사이클 - 98℃ 10초, 65℃ (사이클당 1.5℃씩 감온) 10초, 72℃ 20초, 10 사이클 - 98℃ 10초, 55℃ 10초, 72℃ 20초 및 1 사이클 - 72℃ 3분. PCR 증폭 후에, 모든 PCR 생성물은 제조사의 프로토콜에 따라 Qiaex II를 사용하여 겔 정제하였다.

제한효소 소화

정제된 생성물을 2 단계로 BstEII 및 SfiI로 소화시켰다. 먼저, 1 ㎍의 DNA를 스토브 내에서 10 ㎕의 10^* NEB 버퍼 3 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)), 1 ㎕ 100^* BSA, 12.5 단위 BstEII 및 멸균수로 구성된 100 ㎕ 반응물에서 6시간 동안 60℃에서 소화시켰다. 생성물을 취급설명서의 지시에 따라 퀴아겐 (Qiagen)의 Qiaquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 40 ㎕ 물에 용출시켰다. 이어서, 모든 생성물을 스토브 내에서 10 ㎕의 10^* NEB 버퍼 2 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), 1 ㎕ 100^* BSA, 12.5 단위 SfiI 및 멸균수로 구성된 100 ㎕ 반응물 중에서 12시간 동안 50℃에서 SfiI으로 추가로 소화시켰다. 소화된 단편을 80 V에서 20 cm 1.5% 아가로스 TBE + 에티듐 브로마이드 겔 상에서의 겔 분리 후에 Qiaquick 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 100 ㎍의 수용 벡터 (MV1043, 도 3 및 12)를 표준 조건 (Tango 버퍼) 하에 600 ㎕ 내에서 50 단위 Eco91I로 소화시킨 후, 0.9% 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 12시간 동안 500 ㎕ 내에서 400 단위 SfiI를 사용한 규정된 조건 하의 제2 소화 단계 후에, 100 단위 BsrGI를 3시간 동안 50℃에서 첨가하였다.

라이게이션

각각의 PCR 생성물을 다음 방식에 따라 별개로 라이게이션시켰다: 30 ㎕ 중의 70 ng 소화된 PCR 생성물, 300 ng 소화된 수용 벡터, 100 단위 T4 리가제 (NEB), 1^* 리가제 버퍼, 12℃에서 16시간. 라이게이션 반응물을 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출, 이어서 제조사의 프로토콜에 따른 글리코겐 침전 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) #G1767)으로 정제한 후, 25 ㎕ 멸균수에 용해시켰다.

형질전환 및 라이브러리 보관

정제된 라이게이션 생성물을 라이게이션 배치당 1200 ㎕ TG1 전기수용성 (electrocompetent) 세균 (스트라타젠 (Stratagene) #200123)을 사용하여 전기천공에 의해 형질전환시키고, 4% 글루코스를 함유하는 LB 카르베니실린 플레이트에 도말하였다. 50 ml LB 카르베니실린에 세균을 긁어내어 라이브러리를 수거하였다. 4℃에서 20분 동안 2000g에서 원심분리한 후, 세균 펠렛을 빙수 상의 2 ml 빙냉 2^*TY/30% 글리세롤에 조심스럽게 재현탁시키고, -80℃에서 보관하기 전에 드라이아이스/에탄올 상에서 동결시켰다.

라이브러리 증폭

라이브러리를 성장시키고, 헬퍼 파지 균주로서 VCSM13 (스트라타젠)을 사용하여 문헌 [Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11): e59]에 기재된 절차에 따라 수거하였다.

코팅된 면역시험관에서 파지의 선택

파상풍 톡소이드를 PBS에 2 ㎍/ml의 농도로 용해시키고, MaxiSorp Nunc-Immuno Tube (Nunc 444474)에 4℃에서 철야 코팅하였다. 코팅 용액을 버리고, 시험관을 PBS (차단 버퍼) 중의 2% 탈지유 (ELK)로 1시간 동안 RT에서 차단하였다. 이와 함께, 0.5 ml의 파지 라이브러리를 1 ml 차단 버퍼와 혼합하고, 20분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 파지의 차단 후에, 파지 용액을 파상풍 톡소이드 코팅된 시험관에 첨가하고, 결합시키기 위해 서서히 회전하는 플랫폼 상에서 2시간 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 시험관을 PBS/0.05% Tween-20으로 10회 세척한 후, 회전 휠 상에서 1 ml 50 mM 글라이신-HCl (pH 2.2)과 10분 동안 RT에서 인큐베이팅하는 파지 용출, 바로 이어서 수거된 용리액의 0.5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5)을 사용한 중화를 수행하였다.

파지 클론의 수거

O.D. 0.4의 5 ml XL1-Blue MRF (스트라타젠) 배양액을 수거된 파지 용액에 첨가하고, 파지를 감염시키기 위해서 진탕하지 않으면서 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세균을 카르베니실린/테트라사이클린 4% 글루코스 2^*TY 플레이트에 도말하고, 37℃에서 철야 성장시켰다.

파지 생산

파지를 성장시키고, 헬퍼 파지 균주로서 VCSM13을 사용하여 문헌 [Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11): e59]에 기재된 바와 같이 처리하였다.

파지 ELISA

ELISA 플레이트를 PBS 중의 2 ㎍/ml의 농도로 웰당 100 ㎕ 파상풍 톡소이드로 4℃에서 철야 코팅하였다. PBS 중의 2 ㎍/ml의 농도로 100 ㎕ 갑상선글로불린으로 코팅된 플레이트를 음성 대조군으로 사용하였다. 웰을 비우고, 종이 타월에 가볍게 두드려 건조시키고, PBS-4% 탈지유 (ELK)로 완전히 채우고, 웰을 차단하기 위해서 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 차단 용액을 버린 후, 50 ㎕ 차단 용액과 미리 혼합한 파지 미니프렙 (miniprep)을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, PBS-0.05% Tween-20으로 5회 세척하여 미결합된 파지를 제거하였다. 결합된 파지는 웰을 100 ㎕ 항-M13-HRP 항체 접합체 (차단 버퍼에 1/5000로 희석)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅함으로써 검출하였다. 유리 항체는 상기한 바와 같은 세척 단계를 반복하여 제거하고, 발색이 가시화될 때까지 TMB 기질 인큐베이팅을 수행하였다. 웰당 100 ㎕의 2 M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm 방출 파장에서 ELISA 판독기로 분석하였다 (표 2). 보다 높은 수는 신호가 더 강함을 나타내고, 따라서 파지-Fab 복합체의 특이적 결합의 발생률이 더 높음을 나타낸다.

서열결정

배경 신호보다 적어도 3배의 신호를 생성시킨 클론 (표 2)을 증식시키고, DNA 미니프렙 절차 (절차는 퀴아겐 미니프렙 취급설명서 참조)에 사용하고, 뉴클레오티드 서열 분석을 수행하였다. 서열결정은 인간 IgG1 중쇄의 CH1 구역의 5' 서열 (Fab 디스플레이 벡터 MV1043에 존재, 도 3 및 12)을 인식하는 역방향 프라이머 (CH1_Rev1, 표 1)를 사용하여 빅 다이 (Big Dye) 1.1 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))에 동봉된 취급설명서에 따라 수행하였다. 28개의 파상풍 톡소이드 결합 클론의 마우스 VH 서열을 표 3에 제시한다. 그 결과는 선택된 쥐 VH 유전자가 상이한 유전자 패밀리에 속하고, 상기 유전자 패밀리의 상이한 개별적인 멤버가 인간 IGKV1-39/J VH 구역과 페어링하여 기능적 파상풍 톡소이드-특이적 항체 결합 부위를 형성할 수 있음을 보여준다. 서열 분석으로부터, 쥐 VH 구역이 다양한 DH 및 JH 유전자 세그먼트를 이용한다고 결론내렸다.

실시예 3

마우스 카파 경쇄 로커스의 사일런싱

본 실시예는 마우스 내인성 카파 경쇄 로커스의 사일런싱을 설명한다. 내인성 카파 로커스는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 변형된 후, 유전적으로 변형된 자손을 얻기 위해 유전적으로 변형된 ES 세포를 마우스 배아에 도입하였다.

3' CK 인핸서의 3'에서 끝나는 서열에 융합된 J5 유전자 세그먼트의 338 bp 하류에 J-구역을 포함하는 부분으로 구성되는 조립된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터가 ES 세포에서 상동성 재조합을 위해 사용되었다. 조립된 서열은 JK 구역의 3'으로부터 3' CK 인핸서의 3'까지 이어지는 게놈 DNA 단편을 삭제하기 위해 사용되었다. 상기 절차에 의해, CK 불변 유전자, 3' 인핸서 및 몇몇 유전자간 구역이 삭제되었다 (도 4 및 18 참조).

표적화 벡터의 제조

결실 세그먼트에 융합된 3' 및 5' 말단 상에 4.5-8 kb의 측면에 접하는 아암 (arm)을 수용하는 벡터를 ES 세포주에서 표적화된 상동성 재조합을 위해 사용하였다. 두 아암은 최대 상동성을 보장하는 PCR 수단에 의해 얻었다. 표적화 전략은 구성적 KO 대립유전자의 생성을 허용한다. Igk 인트론 인핸서, Igk 불변 구역 및 Igk 3' 인핸서를 포함하는 마우스 게놈 서열을, F3 부위가 측면에 접하고 Jk 요소의 하류에 삽입된 PuroR 카세트로 대체하였다. 선택 마커의 Flp-매개 제거를 통해 구성적 KO 대립유전자를 얻었다. Igk MiEk-Igk C-Igk 3'E 게놈 구역 (약 10 kb)을 F3-Puro 카세트 (약 3 kb)로 대체하면, 상동성 재조합의 효율이 감소할 가능성이 있었다. 따라서, 상동성의 아암을 연장하고, 상동성 재조합 클론을 확인하기 위해 보다 많은 ES 세포 콜로니를 형질감염 후에 분석하였다.

결실된 카파 단편을 보유하는 ES 세포의 생성

유전적으로 변형된 ES 세포의 생성은 본질적으로 문헌 [Seibler et al. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31(4):e12]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 또한, 상세한 설명에 대해서는 실시예 14를 참조한다.

사배체 배아 보완 (complementation)에 의한 ES 마우스의 생성

유전적으로 변형된 ES 세포를 사용한 사배체 배아 보완에 의한 마우스의 생산은 본질적으로 문헌 [Eggan et al., PNAS 98, 6209-6214]; [Seibler J, et al. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31(4):e12]; [Hogan et al., (Summary of mouse development. Manipulating the Mouse Embryo, (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), pp. 253-289]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

실시예 4

마우스 람다 경쇄 로커스의 사일런싱

본 실시예는 마우스 내인성 람다 경쇄 로커스의 사일런싱을 설명한다. 내인성 람다 로커스는 ES 세포에서 상동성 재조합에 의해 변형된 후, 유전적으로 변형된 자손을 얻기 위해 유전적으로 변형된 ES 세포를 마우스 배아에 도입하였다.

함께 모든 기능적 람다 V 구역을 포함하는 쥐 람다 로커스의 2개의 구역을 제거하였다.

상동성 재조합-기반 제거를 위해 표적화된 제1 구역은 IGLV2 유전자 세그먼트의 출발 부위의 408 bp 상류에 위치하고 IGLV3 유전자 세그먼트의 215 bp 하류에서 끝나는, 상기 IGLV 유전자 세그먼트 사이의 유전자간 서열 스트레치 (stretch)를 포함하는 구역이다. 제거가 수행되는 제2 구역은 IGLV1 유전자 세그먼트의 392 bp 상류로부터 171 bp 하류까지 이어지는 단편으로 구성된 IGLV1 유전자 세그먼트를 포함한다. 상기 2개의 삭제 단계에 의해, 모든 기능적 V-람다 유전자 세그먼트가 삭제되어, 로커스를 기능적으로 불활성화되도록 만들었다 (도 5 및 19).

표적화 벡터의 제조

결실 세그먼트에 융합된 3' 및 5' 말단 상에 3-9.6 kb의 측면에 접하는 아암을 수용하는 벡터를 ES 세포주에서 표적화된 상동성 재조합을 위해 사용하였다. 두 아암은 최대 상동성을 보장하는 PCR 수단에 의해 얻었다. 제1 단계에서, Igl V2-V3 구역을 포함하는 마우스 게놈 서열을, F3 부위가 측면에 접하는 PuroR 카세트로 대체하여, 선택 마커의 Flp-매개 제거 후에 구성적 KO 대립유전자를 얻었다 (도 19a 참조). 제2 단계에서, Igl V1 구역을 포함하는 마우스 게놈 서열을, Igl V2-V3 구역이 이미 삭제된 ES 세포 클론에서 Neo 카세트로 교체하였다 (도 19b 참조). 선택 마커 (NeoR)에는 FRT 부위가 측면에 접하였다. 구성적 KO 대립유전자는 선택 마커의 Flp-매개 제거 후에 얻었다.

결실된 람다 단편을 보유하는 ES 세포의 생성

유전적으로 변형된 ES 세포의 생성은 본질적으로 문헌 [Seibler J, Zevnik B, Kueter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kuehn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31(4):e12]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 또한, 상세한 설명에 대해서는 실시예 14를 참조한다. 두 표적화 사건이 동일한 염색체 상에서 발생하였음을 보여주기 위해서, 여러 개의 이중 표적화된 클론을 pCMV C31델타CpG를 사용한 시험관내 삭제를 위해 선택하였다. 클론을 20% FCS (PAN) 및 1200 u/mL 백혈병 억제 인자 (Millipore ESG 1107)를 포함하는 DMEM 고 글루코스 배지 내에서 마우스 배아 섬유모세포로 이루어진 유사분열 불활성화된 영양세포층 (feeder layer) 상에서 항생제 압력 하에서 팽창시켰다. 각각의 클론으로부터의 1x10⁷개의 세포를 240 V 및 500 μF에서 20 ㎍의 환상 pCMV C31델타CpG로 전기천공시키고, 각각 4개의 10 cm 접시에 도말하였다. 2-3일 후에, 전기천공 세포를 수거하고, PCR에 의해 분석하였다. 다음 프라이머를 사용하였다:

PCR 반응은 5 ㎕ PCR 버퍼 10x (인비트로겐), 2 ㎕ MgCl₂ (50 mM), 1 ㎕ dNTP (10 mM), 1 ㎕ 제1 프라이머 (5 μM), 1 ㎕ 제2 프라이머 (5 μM), 0.4 ㎕ Taq (5 U/㎕, 인비트로겐), 37.6 ㎕ H₂O, 및 2 ㎕ DNA를 포함하는 혼합물에서 수행하였다. 사용된 프로그램은 다음과 같았다: 95℃ 5'; 이어서 95℃ 30"; 60℃ 30"; 72℃ 1'의 35회의 사이클; 이어서 72℃ 10'.

사배체 배아 보완에 의한 ES 마우스의 생성

유전적으로 변형된 ES 세포를 사용한 사배체 배아 보완에 의한 마우스의 생산은 본질적으로 문헌 [Eggan et al., PNAS 98, 6209-6214]; [Seibler J, Kueter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kuehn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31(4):e12]; [Hogan et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), pp. 253-289]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

실시예 5

재배열된 인간 생식계열 IGKV1-39/J-Ck 유전자 (IGKV1-39/J-Ck)를 기초로 한 CAGGS 발현 삽입물의 제조

본 실시예는 재배열된 인간 생식계열 IGKV1-39/J 구역을 포함하는 CAGGS 발현 카세트의 제조에 대해 설명한다. 상기 삽입 발현 카세트는 클로닝 부위, Kozak 서열, 인트론을 포함하는 리더 서열, 재배열된 IGKV1-39 구역의 개방 해독 프레임, 대립유전자 a로부터의 래트 CK 불변 구역 및 번역 중지 서열을 포함한다 (IGKV1-39/J-Ck; 도 6). 1차 구성체는 천연 생성 서열로 구성되고, 분석되고, 바람직하지 않은 시스 작용 요소, 예를 들어 내부 TATA-박스, 폴리아데닐화 신호, 카이 부위 (chi-site), 리보좀 도입 부위, AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치, ARE-, INS- 및 CRS 서열 요소, 반복 서열, RNA 2차 구조, (잠재) 스플라이스 (splice) 공여자 및 수용자 부위 및 스플라이스 분지점 (진아트 게엠베하 (GeneArt GmbH))을 제거함으로써 최적화되었다. 또한, 개방 해독 프레임 구역 내의 코돈 사용 빈도는 마우스에서의 발현을 위해 최적화된다. 인트론 서열은 변하지 않고, 따라서 인간 IGKV1-39 리더 인트론의 코딩 부분에 동일한 서열을 나타낸다.

발현 카세트의 5' 말단에 NotI 부위를 도입하고, 3' 부위에는 NheI 부위를 도입하였다. 두 부위는 CAGGS 발현 모듈에서 클로닝을 위해 사용된다. 진아트에 의해 사용된 방법에 따른 유전자 조립 후에, 삽입물을 NotI-NheI로 소화시키고, CAGGS 프로모터, LoxP 부위가 측면에 접하는 중지 서열 ('floxed'), 폴리아데닐화 신호 서열, 및, 5' 및 3' 말단에 마우스 ES 세포주의 Rosa26 로커스 내로의 상동성 재조합을 용이하게 하는 서열을 포함하는 발현 모듈 내로 클로닝하였다. 프로모터 및/또는 cDNA 단편을 PCR에 의해 증폭하고, 서열결정에 의해 확인하고/하거나 전달된 플라스미드로부터 표시된 특징을 갖는 RMCE 교환 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 최종 표적화 벡터 pCAGGS-IgVK1-39의 개략도 및 확인된 서열을 도 13a 및 13b에 제시한다. 표적화 전략은 도 13c에 도시한다.

실시예 6

재배열된 생식계열 IGLV2-14/J V 람다 구역 (IGLV2-14/J-Ck)를 기초로 한 CAGGS 발현 삽입물

본 실시예는 재배열된 생식계열 IGLV2-14/J V 람다 구역을 포함하는 발현 카세트의 서열 및 삽입에 대해 설명한다. 상기 삽입물은 클로닝 부위, Kozak 서열, 인트론을 포함하는 리더 서열, 재배열된 IGLV2-14/J 구역의 개방 해독 프레임, 대립유전자 a로부터의 래트 CK 불변 구역 및 번역 중지 서열을 포함한다 (IGLV2-14/J-Ck; 도 7). 1차 구성체는 천연 생성 서열로 구성되고, 분석되고, 바람직하지 않은 시스 작용 요소, 예를 들어 내부 TATA-박스, 폴리아데닐화 신호, 카이 부위, 리보좀 도입 부위, AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치, ARE-, INS- 및 CRS 서열 요소, 반복 서열, RNA 2차 구조, (잠재) 스플라이스 공여자 및 수용자 부위 및 스플라이스 분지점 (진아트 게엠베하)을 제거함으로써 최적화되었다. 또한, 개방 해독 프레임 구역 내의 코돈 사용 빈도는 마우스에서의 발현을 위해 최적화된다. 인트론 서열은 변하지 않고, 따라서 인간 IGKV1-39 리더 인트론에 동일한 서열을 나타낸다.

발현 카세트의 5' 말단에 NotI 부위를 도입하고, 3' 부위에는 NheI 부위를 도입하였다. 두 부위는 타코닉아르테미스 (TaconicArtemis)에 의해 설명된 바와 같이 CAGGS 발현 모듈에서 클로닝을 위해 사용된다. 진아트에 의해 사용된 방법에 따른 유전자 조립 후에, 삽입물을 NotI-NheI로 소화시키고, CAGGS 프로모터, LoxP 부위가 측면에 접하는 중지 서열 ('floxed'), 폴리아데닐화 신호 서열, 및, 5' 및 3' 말단에 마우스 ES 세포주의 Rosa26 로커스 내로의 상동성 재조합을 용이하게 하는 서열을 포함하는 발현 모듈 내로 클로닝하였다. 최종 ROSA26 RMCE 표적화 벡터를 제조하기 위해서, 프로모터 및/또는 cDNA 단편을 PCR에 의해 증폭하였다. 증폭 생성물을 서열결정에 의해 확인하고/하거나 전달된 플라스미드로부터 표시된 특징을 갖는 RMCE 교환 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 최종 표적화 벡터 pCAGGS-IgVL2-14의 개략도 및 확인된 서열을 도 15a 및 15b에 제시한다. 표적화 전략은 도 15c에 도시한다.

실시예 7

HEK293 세포주에서 IGKV1-39/J-Ck의 발현 (pSELECT-IGKV1-39/J-Ck)

본 실시예는 실시예 5에서 설명된 IGKV1-39/J-Ck 구성체가 HEK293 세포에서 IGKV1-39/J-Ck L쇄를 발현 및 검출할 수 있는지를 확인하는 방법에 대해 설명한다. IGKV1-39/J 삽입물 (도 6)을, NotI 부위를 SalI 부위로 변경함으로써 5' 말단에서 변형하였다. 상기 변경은 생성물을 발현 카세트 플라스미드 pSELECT-hygro (인비보겐 (InvivoGen)) 내로 클로닝하기 위해 필요하다. CAGGS 발현 삽입물 IGKV1-39/J-Ck 및 pSELECT-hygro를 SalI 및 NheI으로 소화하고, 라이게이션시키고, 표준 기술을 사용하여 전능성 XL1-Blue 세포의 형질전환을 위해 사용하였다. 콜로니를 수거하고, 제조사의 절차에 따라 퀴아겐 Midi-prep 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하였다. 생성되는 경쇄 (LC) 발현 벡터, 즉 0817676_pSELECT_0815426을 제조사의 프로토콜에 따라 Fugene6 (로슈 (Roche))를 사용하여 HEK293 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. 상등액을 항-래트-Ck 항체 (벡톤 디킨슨 (Beckton Dickinson) #550336 및 553871)를 사용한 ELISA 및 웨스턴 블롯 및 당업계에서 사용되는 프로토콜에 의해 IGKV1-39/J-Ck 경쇄의 존재에 대해 스크리닝하였다.

항-파상풍 톡소이드 (TT) IgG MG1494의 VH를 제한 부위 SfiI 및 BstEII를 사용하여 IgG 발현 벡터 MV1056 내로 클로닝하였다. 생성되는 클론의 서열을 확인하였다. HEK293T 세포를 표 4에 제시된 5개의 상이한 벡터 조합물로 형질감염시켰다 (벡터 0817678_pSELECT_0815427의 상세한 내용에 대해서는 실시예 8 참조). 상등액을 수거하고, IgG 농도를 결정하였다 (표 4 참조). 예상되는 바와 같이 경쇄만을 함유하는 상등액 A 및 B에 대해 어떠한 IgG도 검출될 수 없었다 (검출 항체는 IgG의 Fc 부분을 인식하였다). 상등액 C 및 D 내의 IgG 농도는 양성 대조군 상등액 E의 농도와 대등하였고, 이것은 경쇄 구성체의 적정한 발현을 나타낸다.

TT에 대한 결합은 음성 대조군 항원으로서 헤모글로빈을 사용하여 생산된 항체의 기능성을 조사하기 위해 ELISA로 분석하였다. 예상되는 바와 같이 경쇄만을 함유하는 상등액 A 및 B에 대해 어떠한 TT-특이적 결합도 검출될 수 없었다. 상등액 C 및 D에 대한 TT-특이적 결합은 적어도 양성 대조군 상등액 E에 대해서만큼 양호하였고, 이를 통해 경쇄 구성체의 적정한 발현 및 중쇄와의 기능적 조립을 확인할 수 있다. 항체는 항-인간 IgG 2차 항체뿐만 아니라 항-래트 C카파 경쇄 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 이 결과를 통해, 항-래트 C카파 항체 (비디 파밍겐 (BD Pharmingen) #553871, 클론 MRK-1)가 pSELECT 벡터에 의해 발현된 경쇄를 인식한다는 것을 확인하였다.

상등액은 비-환원성 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (제시되지 않음)에 의해 분석하였다. 항-인간 IgG 중쇄 항체를 사용한 검출은 예상되는 바와 같이 경쇄만을 함유하는 상등액 A 및 B에 대한 밴드를 보이지 않았다. 상등액 C 및 D에 대한 결과는 양성 대조군 상등액 E와 대등하였고, 한 밴드는 무손상 IgG에 대해 예상되는 170 kD 마커와 근접하였다. 추가의 더 낮은 분자량 밴드가 상등액 C, D 및 E에 대해서도 관찰되었고, 이것은 분해 생성물, (부분적인) 환원에 의한 IgG 단편 및/또는 검출 항체의 비-특이적 결합에 의한 무관한 단백질 밴드를 나타낼 수 있다.

항-래트 C카파 경쇄 항체를 사용한 검출은 단지 경쇄에 대해 예상되는 바와 같이 상등액 A 및 B에 대한 26 kD 마커에 근접한 밴드를 보였다. 상기 밴드는 B보다 A에 대해 훨씬 더 강하였고, 이것은 유리 IGKV1-39 경쇄가 유리 IGLV2-14 경쇄보다 더 우수하게 발현되고/되거나 더 안정할 수 있음을 나타낸다. 예상되는 바와 같이 대조군 상등액 E에 대해 어떠한 밴드도 검출되지 않았고, 이것은 발현된 IgG가 인간 C카파 경쇄를 함유하기 때문이다. 상등액 C 및 D에 대해, 170 kD 마커에 근접한 예상된 밴드가 관찰되었고; 보다 낮은 분자량 밴드도 관찰되었지만, 항-인간 IgG 항체 사용시보다 더 낮은 수준이었다.

결론적으로, 항-파상풍 톡소이드 (TT) IgG MG1494의 중쇄와 조합된 경쇄 발현 구성체의 형질감염은 pSELECT 카파 및 람다 경쇄 구성체 모두에 대해 양성 대조군 구성체에 대등한 IgG 생산을 유발하였다. 두 IgG 생산은 TT ELISA에서 대조군 IgG보다 우수하거나 대등한 ELISA 신호를 생성하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 무손상 IgG의 존재를 확인하였다. 시험된 항-래트 C카파 항체는 ELISA 및 웨스턴 블롯 모두에서 효율적으로 작용하였다. 경쇄 구성체만으로 형질감염된 세포로부터의 배양 상등액은 검출가능한 IgG 생산 또는 검출가능한 TT-특이적 결합을 보이지 않은 반면, 유리 경쇄는 웨스턴 블롯에서 검출되었다.

실시예 8

HEK293 세포주에서 IGLV2-14/J-Ck의 발현 (pSELECT-IGLV2-14/J-Ck)

본 실시예는 실시예 6에서 설명된 IGLV2-14/J 구성체가 HEK293 세포에서 IGLV2-14/J-Ck L쇄를 발현 및 검출할 수 있는지를 확인하는 방법에 대해 설명한다. IGLV2-14/J-Ck 삽입물 (도 7)을, NotI 부위를 SalI 부위로 변경함으로써 5' 말단에서 변형하였다. 상기 변경은 생성물을 발현 카세트 플라스미드 pSELECT-hygro (인비보겐) 내로 클로닝하기 위해 필요하다. CAGGS 발현 삽입물 IGLV2-14/J-Ck 및 pSELECT-hygro를 SalI 및 NheI으로 소화하고, 라이게이션시키고, 표준 기술을 사용하여 전능성 XL1-Blue 세포의 형질전환을 위해 사용하였다. 콜로니를 수거하고, 제조사의 절차에 따라 퀴아겐 Midi-prep 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하였다. 생성되는 경쇄 (LC) 발현 벡터, 즉 0817678_pSELECT_0815427을 제조사의 프로토콜에 따라 Fugene6 (로슈)를 사용하여 HEK293 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. 상등액을 항-래트-Ck 항체 (벡톤 디킨슨 #550336 및 553871)를 사용한 ELISA 및 웨스턴 블롯 및 당업계에서 사용되는 프로토콜에 의해 IGLV2-14/J-Ck 경쇄의 존재에 대해 스크리닝하였다. 상세한 설명 및 결과에 대해서는 실시예 7을 참조한다.

실시예 9

IGKV1-39/J 삽입물 및 쥐 CK 로커스로부터 유도된 다수의 인핸서 요소를 함유하는 VK 프로모터-유도 발현 구성체 (VkP-IGKV1-39/J-Ck; VkP-O12)의 제조

본 실시예는 IGKV1-39 VK 프로모터 구역, 인트론을 포함하는 리더, 생식계열 V-유전자, CDR3, IGKJ 세그먼트, Jk와 CK 사이에 위치하는 마우스 유전자간 구역, 래트 Ck 대립유전자 a 개방 해독 프레임, 및 마우스 CK 유전자의 3' 말단으로부터 3'CK 인핸서의 3'에서 끝나는 마우스 유전자간 단편을 기초로 하는, 재배열된 인간 IGKV1-39 VK 구역의 B-세포 및 발달/분화 단계-특이적 발현을 가능하게 하는 관련 요소를 포함하는 발현 카세트의 제조에 대해 설명한다.

실시예 5에서 설명한 바와 같이 리더, IGKV1-39 재배열된 유전자, 및 래트 CK 대립유전자 a 유전자의 최적화된 개방 해독 프레임을 발현 카세트의 제조에 사용하였다. VK 프로모터 구역은 유전자 합성 절차 (진아트 게엠베하)에 의해 얻었고, 유전자의 -500 bp와 ATG (출발 부위) 사이의 인간 IGKV1-39 구역의 서열과 거의 동일하다. 천연 서열과의 유일한 차이는 번역을 촉진하기 위해 ATG (출발) 부위에 GCCACCATGG Kozak 서열을 도입한 것이다. 마우스 BAC 클론 (타코닉아르테미스)로부터의 게놈 단편이 개개의 요소의 도입을 위한 기초로서 사용된다. 상기 단편은 JK5 구역의 3'에 바로 위치하는 인트론 공여자 부위에서 시작하여 3'CK 인핸서의 3'에서 끝나는 마우스 VK 로커스의 서열과 동일하고, 대략 12.5 kb에 해당한다.

최종 구성체는 5' 단부로부터 3' 단부의 방향으로 다음 요소를 포함한다: 인간 게놈 IGKV1-39 프로모터 (500 bp), Kozak 서열, 인간 IGKV1-39 리더 부분 1 (최적화됨), 인간 IGKV1-39 리더 인트론, 인간 IGKV1-39 리더 부분 2 (최적화됨), 인간 IGKV1-39 생식계열 유전자 (최적화됨), 인간 J-구역 (최적화됨), 인트론 인핸서 요소를 포함하는 마우스 유전자간 구역, 래트 (라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus)) 카파 불변 구역 (최적화됨), 및 3' 카파 인핸서를 포함하는 마우스 유전자간 구역. 상기 발현 카세트의 요소를 도 8에 제시하고, VkP-IGKV1-39/J-Ck (VkP-O12)로 명명한다. pVkP-O12 벡터 및 표적화 계획에 대한 개요를 도 20a 및 21a에 도시한다. 벡터는 표준 절차에 따라 ES 세포 내로 도입하였다 (실시예 14 참조).

실시예 10

IGLV2-14/J 클론 및 다수의 CK 로커스-유도 인핸서 요소를 함유하는 VK 프로모터-유도 발현 구성체 (VkP-IGLVL2-14/J-Ck; VkP-2a2)의 제조

본 실시예는 IGKV1-39 유전자 및 J-구역이 특유한 V-J 구역을 포함하는 최적화된 인간 IGLV2-14 생식계열 유전자로 교체된 것을 제외하고는 실시예 9에서 설명된 바와 동일한 구성체 (VkP-IGLV2-14/J-Ck; VkP-2a2; 도 9)에 대해 설명한다.

실시예 11

CK 인트론 인핸서 요소가 결여된 IGKV1-39 클론을 포함하는 VK 프로모터-유도 발현 구성체 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-△1; VkP-O12-del1)의 제조

실시예 9에서 설명된 구성체를, 표준 PCR 변형 및 DNA 클로닝 방법 (진아트 게엠베하)에 의해 인간 J 구역과 래트 CK 구역 사이의 유전자간 구역에 위치한 CK 인트론 인핸서 요소를 제거함으로써 변형하였다. 생성되는 발현 카세트를 도 10에 도시하고, VkP-IGKV1-39/J-Ck-△1 (VkP-O12-del1)로 명명한다.

pVkP-O12-del1 벡터 및 표적화 계획에 대한 개요를 도 20b 및 21b에 도시한다. 벡터는 표준 절차에 따라 ES 세포 내로 도입하였다 (실시예 14 참조).

실시예 12

CK 인트론 인핸서 요소 및 말단절단된 3' CK 인핸서 요소가 결여된 IGKV1-39 클론을 포함하는 VK 프로모터-유도 발현 구성체 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-△2; VkP-O12- del2)의 제조

실시예 11에서 설명된 구성체를, 3' CK 인핸서 요소를 말단절단하고 잠재적인 억제 요소를 제거하기 위해서 래트 Ck 유전자의 3'에 위치하는 유전자간 구역의 일부를 제거함으로써 변형하였다. 이것은 표준 방법을 사용하여 EcoRV 부위 (래트 Ck 유전자의 3'에 위치함)와 3' 인핸서 (5993 bp) 내에 존재하는 NcoI 부위 사이의 유전자간 서열을 제거하고 3' 인핸서 BstXI 부위와 3' 인핸서 (474 bp)의 3'에 위치하는 BstXI 부위 사이의 서열을 추가로 제거함으로써 수행하였다. 생성되는 발현 카세트를 도 11에 제시하고, VkP-IGKV1-39/J-Ck-△2 (VkP-O12-del2)로 명명한다.

pVkP-O12-del2 벡터 및 표적화 계획에 대한 개요를 도 20c 및 21c에 도시한다. 벡터는 표준 절차에 따라 ES 세포 내로 도입하였다 (실시예 14 참조).

실시예 13

세포주에서 Vk 구성체의 발현

실시예 9-12에서 설명된 구성체를 골수종 세포주 MPC11 (ATCC CCL167), B-세포 림프종 WEHI231 (ATCC CRL-1702), T-세포 림프종 EL4 (ATCC TIB-39) 및 HEK293 (ATCC CRL1573)에서 경쇄 단백질을 생산하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 구성체 내의 인핸서 및 프로모터 요소는 다른 조직으로부터 유도된 세포주가 아니라 B-세포주에서의 발현을 가능하게 한다. 정제된 선형화된 DNA 및 Fugene6 (로슈)을 사용한 세포주의 형질감염 후에 세포를 일시 발현을 위해 배양하였다. 세포 및 상등액을 수거하고, SDS-PAGE 분석에 적용한 후, 특이적 항-래트-C-카파 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 상등액을 항-래트 CK 항체 (벡톤 디킨슨 #550336)를 사용하여 분비된 L쇄에 대해 ELISA로 분석하였다.

실시예 14

트랜스제닉 ES 주의 생성

실시예 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 및 12에서 설명된 모든 구성체를 사용하여 상동성 재조합에 의해 개개의 안정한 트랜스제닉 ES 주를 생성시켰다. 상동성 재조합을 통한 트랜스제닉 ES 주의 생성을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Eggan et al., PNAS 98, 6209-6214]; [Seibler J, Zevnik B, Kueter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kuehn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31(4):e12]; [Hogan et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), pp. 253-289]).

실시예 5-6, 및 실시예 9-12에서 설명된 모든 구성체에 대해, RMCE ES 세포주 (마우스 주 129S6B6F1-Gt(ROSA)26Sortm10Arte로부터 유도됨)를 15% FBS를 함유하는 DMEM 고 글루코스 배지 (PAN 1302-P220821) 내에서 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)로 이루어진 유사분열 불활성화된 영양세포층 상에서 성장시켰다. 백혈병 억제 인자 (케미콘 (Chemicon) ESG 1107)를 900 U/mL의 농도로 배지에 첨가하였다. 조작을 위해, 2x10⁵개의 ES-세포를 3.5 cm 접시의 2 ml 배지에 도말하였다. 형질감염 직전에, 2 ml의 신선 배지를 세포에 첨가하였다. 3 ㎕ Fugene6 시약 (로슈; 카탈로그 번호 1 814 443)을 100 ㎕ 혈청 미함유 배지 (Glutamax I가 존재하는 OptiMEM I; 인비트로겐; 카탈로그 번호 51985-035)와 혼합하고, 5분 동안 인큐베이팅하였다. 100 ㎕의 Fugene/OptiMEM 용액을 2 ㎍ 환상 벡터 및 2 ㎍ CAGGS-Flp에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이팅하였다. 상기 형질감염 복합체를 세포에 적가하고, 혼합하였다. 신선 배지를 다음날 세포에 첨가하였다. 제2일 이후에, 배지를 매일 250 ㎍/mL G418 (제네티신; 인비트로겐; 카탈로그 번호 10131-019)을 함유하는 배지로 교체하였다. 형질감염 7일 후에, 단일 클론을 단리하고, 팽창시키고, 분자를 표준 절차에 따라 서던 블로팅으로 분석하였다.

각각의 구성체에 대해, 단일 클론의 게놈 DNA의 제한효소 소화에 의한 다수 클론의 분석, 이어서 5' 프로브, 3' 프로브, 및 내부 프로브와의 혼성화를 통해 Rosa26 로커스 내의 적정 위치에 적정한 단일 삽입을 포함하는 클론을 생성하였다. 그 예는 도 14에 제시된다.

실시예 15

트랜스제닉 마우스주의 생성

실시예 14에서 설명된 바와 같이 생성되고 그들의 변형에 대해 확인된 모든 ES 세포주를, 사배체 재조합에 의해 안정한 트랜스제닉 마우스를 생성하기 위해 사용하였다. 그 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 호르몬의 투여 후에, 과배란된 Balb/c 암컷을 Balb/c 수컷과 교배시켰다. 포배를 dpc 3.5에 자궁으로부터 분리하였다. 미세주사를 위해, 포배를 광유 아래의 15% FCS와 함께 DMEM의 소적에 놓았다. 내경이 12 - 15 마이크로미터이고 끝이 평평한 피에조 구동 방식의 (piezo actuated) 미세주사-피펫을 10-15개의 표적화된 C57BL/6 N.tac ES 세포를 각각의 포배 내로 주사하기 위해 사용하였다. 회수 후에, 주사된 포배를 교배 2.5일 후의 위임신 NMRI 암컷의 각각의 자궁각에 옮겼다. 키메라 현상 (chimerism)은 Balb/c 숙주 (흑/백)에 대한 ES 세포의 외피 색상 기여도에 의해 키메라 (G0)에서 측정하였다. 키메라도가 높은 마우스를 C57BL/6 암컷과 교배시켰다. 계획의 필요성에 따라, 마우스주 C57BL/6 교배 파트너는 재조합효소 유전자 (Flp-딜리터 (deleter) 또는 Cre-딜리터 또는 CreER 유도가능 딜리터 또는 Flp-딜리터/CreER의 조합)의 존재에 대한 비-돌연변이체 (W) 또는 돌연변이체이다. 생식계열 전달은 흑색의 마우스주 C57BL/6, 자손 (G1)에 의해 확인되었다.

예를 들어, ESC 클론 IgVK1-39 2683 8 (실시예 5 및 14 참조)을 3회의 독립적인 실험에서 총 62개의 포배에 주사하였다. 3마리의 동배새끼를 포함하여 총 6마리의 새끼를 얻었다. 모든 새끼는 키메라이었다. 3마리의 이종접합성 자손 새끼를 얻고, 추가의 교배를 위해 사용하였다.

ESC 클론 카파 2692 A-C10 (실시예 3 및 14 참조)을 3회의 독립적인 실험에서 총 54개의 포배에 주사하였다. 3마리의 동배새끼를 포함하여 총 11마리의 새끼를 얻었고, 이 중에서 10마리는 키메라이었다. 8마리의 이종접합성 자손 새끼를 얻고, 추가의 교배를 위해 사용하였다.

ESC 클론 카파 2692 B-C1 (실시예 3 및 14 참조)을 3회의 독립적인 실험에서 총 51개의 포배에 주사하였다. 2마리의 동배새끼를 포함하여 총 6마리의 새끼를 얻었고, 이 중에서 4마리는 키메라이었다. 3마리의 이종접합성 자손 새끼를 얻고, 추가의 교배를 위해 사용하였다.

실시예 16

번식

본 실시예는 실시예 14에서 설명된 트랜스제닉 발현 카세트를 포함하는 마우스 및 내인성 람다 및 카파 로커스가 사일런싱되는 낙아웃 마우스를 얻기 위한 번식에 대해 설명한다. 염색체 16 상의 V-람다 및 염색체 7 상의 CD19의 편재를 통해 표준 번식 절차를 수행할 수 있다. 약 24 cM의 거리로 염색체 6 상에 공동 편재된 Vk 로커스 및 Rosa26 로커스의 번식은 단지 일부의 자손만이 두 변형이 하나의 염색체 상에서 함께 발생하는 방식으로 교차를 보이기 때문에 스크리닝 동안 특별히 유의해야 한다.

4개의 모든 로커스는 CD19-cre (설명하지 않음) 및 변형된 Rosa26 트랜스젠에 동종접합성 또는 이종접합성이고 다른 로커스에 동종접합성인 단일 마우스 주에서 조합되어야 한다. 번식은 상업적인 번식 회사 (예를 들어 타코닉아르테미스)에 의해 제공되는 적절한 표준 번식 및 스크리닝 기술에 의해 수행된다.

실시예 17

마우스의 면역화

마우스의 1차 및 부스터 면역화는 표준 프르토콜을 이용하여 수행한다.

CD19-HuVκ1 마우스로부터의 B 세포에서 인간 재배열된 Vκ O12 (IGKV1-39) - 래트 Cκ 경쇄 (실시예 5, 14-16 참조)의 트랜스제닉 발현을 확인하고 면역화 후에 VH 레퍼토리 크기, VH 패밀리 사용의 다양성 및 V(D)J 재조합에 대한 그의 영향을 평가하기 위해, CD19-HuVκ1 트랜스제닉 마우스를 파상풍 톡소이드 백신 (TT 백신)으로 면역화시키고, CD19-HuVκ1 마우스로부터 무작위로 선발된 클론의 VH 서열 다양성을 TT-면역화 wt 마우스 및 CD19-Cre HuVκ1 음성 동배새끼와 비교하였다. 면역화시킨 마우스에서 인간 Vκ O12 트랜스젠의 SHM 빈도에 대한 데이타를 얻었다. 인간 Vκ O12를 포함하는 적어도 40개의 TT-특이적이고 클론상 비관련된 mAb의 다양한 컬렉션을 파지 디스플레이에 의해 CD19-HuVκ1 마우스로부터 회수하였다.

이를 위해, 3마리의 성체 CD19-HuVκ1 마우스를 표준 면역화 절차를 사용하여 TT 백신으로 면역화하였다. 면역화 후에, 혈청 역가를 TT 특이적 ELISA (TT: 스타텐스 세럼 인스티튜트 (Statens Serum Institute), Art. no. 2674)를 사용하여 측정하고, 비장 현탁액을 트랜스제닉 B 세포를 단리하기 위해 래트 Cκ-특이적 모노클로날 항체 (클론 RG7/9.1; 비디 파밍겐# 553901, Lot# 06548)로 염색한 후 FACS 절차에 의한 세포 분류에 적용하였다. 래트 Cκ-양성 B 세포로부터의 RNA를 추출하고, 생성되는 cDNA 물질을 라이브러리 구축 및 SHM 분석에 사용하였다.

표준 모노클로날 마우스 항-래트 Cκ 항체 (클론 RG 7/9.1; 비디 파밍겐# 553901, Lot# 06548)를 B 세포를 발현하는 트랜스젠의 FACS 분석에 사용하였다 (Meyer et al., 1996, Int. Immunol., 8: 1561). 클론 RG7/9.1 항체는 단형 (monotypic) (공통적인) 카파 사슬 결정자와 반응한다. 상기 항-래트 Cκ 항체 (클론 RG7/9.1 (비디 파밍겐# 553901, Lot# 06548)를 FACS 분석 및 분류를 위해 제조사의 지시에 따라 LYNX 신속 접합 키트를 사용하여 R-피코에리트린 (PE)으로 표지하였다. 표지된 항체는 일시 형질감염된 HEK-293T 세포 내에서 생산된 래트 Cκ-함유 기능적 경쇄 단백질에 대한 결합에 대해 유동 세포 측정에 의해 먼저 시험하였고; 비-접합된 항체는 양성 대조군으로 기능하였다. ELISA 및 웨스턴-블롯에 의해 래트 Cκ에 결합하는 것으로 밝혀진 2개의 다른 항체 (실시예 7 참조)도 유동 세포 측정에 의해 시험하였다.

Fab-파지 디스플레이 라이브러리 구축은 C57BL/6 VH 유전자의 증폭을 위해 설계된 최적화된 축퇴성 (degenerate) PCR 프라이머의 세트를 사용하여 수행하고; 최소 라이브러리 크기는 10⁶개의 클론이고, 최소 삽입 빈도는 80%이었다. 사용된 벡터 MV1043 (도 3 및 12)는 인간 Cκ 구역에 융합된 인간 Vκ O12를 포함하였다. 따라서, 래트 Cκ는 라이브러리 생성 과정에서 인간 상대물로 교체된다.

선택 전에, 96개의 무작위로 선발된 클론의 VH 서열결정은 TT로 면역화시킨 BALB/c 마우스로부터 동일한 절차를 사용하여 이전에 생성된 비선택된 라이브러리로부터 얻은 다양성에 비교되는 VH 레퍼토리 다양성을 확인하기 위해 수행하였다. 동일한 방식으로 면역화시킨 C57Bl/6 wt 마우스로부터의 라이브러리를 사용하여 동일한 백신 및 동일한 유전적 배경을 공유하는 2개의 예비선택된 라이브러리 사이의 다양성을 비교할 수 있다.

여러 번의 독립적인 선택을 면역시험관에 코팅된 TT에 대해 수행하였다. 포함될 수 있는 변수는 용액에서 비오티닐화 항원을 사용하는 선택 또는 포획된 TT에 대한 선택이다. 제1 선택에서 얻은 ELISA-양성 클론의 수 및 다양성을 기초로 하여, 추가의 선택 라운드를 결정하였다. 클론은 음성 대조군 클론에 비해 > 3x 양성일 때 양성으로 간주하였다. 양성 클론은 항원 특이성을 확인하기 위해 일군의 음성 대조군 항원에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 그 목적은 특유한 CDR3 서열 및 V_HDJ_H 재배열을 기초로 하여 적어도 40개의 특유한 VH 구역을 확인하는 것이다.

래트 Cκ-양성 분류 B 세포로부터의 cDNA 물질의 증폭은 최근 연구 (Brady et al., 2006, JIM, 315: 61)에서 보고된 바와 같이 마우스 Cκ 서열에서 풍부하지 않은 구역에서 인간 리더 서열에 특이적인 PCR 전방향 프라이머 및 래트 Cκ 서열에 특이적인 PCR 역방향 프라이머를 사용하여 수행하였다. 프라이머 조합 및 어닐링 온도는 0817676_pSELECT_0815426 = IGKV1-39 DNA 카세트가 존재하는 pSELECT 벡터 (실시예 7 참조)로 형질감염된 HEK-293T 세포로부터의 cDNA에 대해 먼저 시험되었다.

증폭 생성물을 pJET-1 벡터에 클로닝하고, XL1-blue 형질전환 후에, Vκ O12 (IGKV1-39) 생식계열 서열에 대한 직접 비교에 의해 VL SHM 빈도를 평가하기 위해 96개의 콜로니의 서열을 결정하였다. 인간 TT-특이적 항체에 대한 본 발명자들의 연구에서 설명된 R/S 비율 방법 (de Kruif et al., 2009, J. Mol. Biol., 387: 548)을 통해 VL 서열에서 발생하는 무작위 돌연변이와 항원-유발 돌연변이를 구별할 수 있다.

실시예 18

트랜스제닉 마우스 주에서 B 세포 집단의 면역형광 분석

본 실시예는 1차 (골수) 및 2차 (비장, 복막) 림프 기관 및 혈액에서 B 세포 집단을 분석하기 위해 항체 및 유동 세포 측정법의 사용에 대해 설명한다. 방법 및 시약은 문헌 [Middendorp et al. (2002) J. Immunol. 168:2695] 및 [Middendorp et al. (2004) J. Immunol. 172:1371]에 기재되어 있다. 골수에서 조기 B 세포 발달의 분석을 위해, 세포 표면을 그들의 표면 상에 트랜스젠을 발현하는 프로-B 세포, 프리-B 세포, 큰 프리-B 세포, 조기 및 후기 미성숙 B 세포 및 재순환 B 세포 집단을 검출하기 위해 B220, CD19, CD25, IgM, IgD, 마우스 C카파, 마우스 C람다 및 래트 C카파에 특이적인 항체 (벡톤 디킨슨)의 조합물로 염색하였다. DAPI 염색 (인비트로겐)은 골수 세포 상의 Fc 수용체와의 항체 상호작용을 억제하기 위해서 분석 및 FC 차단 (벡톤 디킨슨)으로부터 죽은 세포를 배제하기 위해 포함되었다. 말초 림프 기관 및 혈액에서 B 세포 집단에 대한 표면 트랜스젠 발현의 분석을 위해, 세포를 B220, CD5, CD19, CD21, CD23, IgM, IgD, 마우스 C카파, 마우스 C람다 및 래트 C카파에 특이적인 항체 (벡톤 디킨슨)의 조합물로 염색하였다. DAPI 염색은 골수 세포 상의 Fc 수용체와의 항체 상호작용을 억제하기 위해서 분석 및 FC 차단으로부터 죽은 세포를 배제하기 위해 포함되었다. 또한, CD3, CD4, CD11b, CD11c 및 NK1.1에 특이적인 항체 (벡톤 디킨슨)의 조합은 트랜스젠이 B 세포 컴파트먼트 이외의 세포 종류에서 발생하는지 결정하기 위해 포함되었다.

C57BL6 배경에서 인간 IGKV1-39/래트 C카파 트랜스젠에 대해 이종접합성이고 CD19-Cre 트랜스젠에 대해 이종접합성인 3마리의 마우스 (HuVk1/CD19-Cre)를 분석하였다. FACS 분석의 대조군으로서, C57BL6 배경 (CD19-Cre)에서 인간 IGKV1-39/래트 C카파 트랜스젠에 대해 야생형이고 CD19-Cre 트랜스젠에 대해 이종접합성인 3마리의 동배새끼 마우스 및 2마리의 C57BL6/NTac 마우스 (Wt)가 포함되었다. 모든 동물은 분석 전에 1주 동안 동물 시설에 순응시켰고, 모든 마우스는 6주령의 수컷이었다. 림프구를 문헌에 설명된 바와 같은 통상적인 기술을 사용하여 마우스의 대퇴골, 비장, 복강 및 혈액으로부터 단리하였다 ([Middendorp et al. (2002) J. Immunol. 168:2695] 및 [Middendorp et al. (2004) J. Immunol. 172:1371]). 항체는 표 10에 제시된 바와 같이 예비 조합하고, 염색은 96웰 플레이트에서 수행하였다. PE-접합된 항-래트 C 카파 (상기한 바와 같은)와의 인큐베이션은 비-특이적 결합을 방지하기 위해 래트 항-쥐 항체를 사용한 염색 전에 수행하였다. 세포 염색 종료 후에, 표지된 세포를 벡톤 디킨슨 LSR II FACS 기기로 분석하고, 획득한 데이타를 FlowJo 소프트웨어 (v6.4.7)로 분석하였다.

트랜스제닉 마우스는 중량, 외관 및 활성이 야생형 마우스와 유사하였다. 조직 회수 동안 어떠한 전체적인 해부학적 변경도 관찰되지 않았다. 트랜스제닉 마우스와 야생형 마우스 사이에, 골수 (BM) 및 비장에서의 B 세포의 수 (표 11) 또는 말초 기관에서의 B 세포, T 세포 및 골수 세포의 수에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 또한, 상이한 림프구 발달 경로에서 세포의 빈도 또는 비율은 야생형 마우스에 비해 트랜스제닉 마우스에서 변경되지 않았다. 따라서, 이중 트랜스제닉 (HuVk1/CD19-Cre) 및 트랜스제닉 (CD19-Cre) 마우스에서 림프 및 가장 중요하게는 B 세포 발달이 야생형 마우스와 구별할 수 없었다.

말초 림프 기관에서, 트랜스젠 특이적 항체 (항-래트C카파-PE)를 사용한 염색은 B 세포 집단에서만 관찰되었다. T 세포, 골수 세포 및 NK 세포 집단은 비장에서 트랜스젠의 표면 발현에 대해 모두 음성이었다 (도 23). 이와 대조적으로, 범 (pan) B 세포 마커 B220 및 CD19로 염색된 세포에서 모든 세포는 FACS 플롯에서 우측으로 이동하였고, 이것은 트랜스젠의 세포 표면 발현을 나타낸다 (도 24). 유사한 트랜스젠-특이적 염색이 B 세포의 발달상 별개의 집단인 복막의 CD5⁺ B1 세포에서 측정되었다 (도 25).

다계열성 (multilineage) 전구체로부터 성숙 B 세포로의 B 세포의 분화가 골수에서 발생한다. 골수로부터 분석된 림프구에서, 세포외 및 트랜스젠 발현은 최조기 B 세포 기원세포인 프로- 및 프리-B 세포에서 검출가능하지 않았고, 이것은 정상 경쇄 발현의 패턴과 일치하였다 (도 26). 트랜스젠 발현은 처음으로 미성숙 B 세포에서 검출가능하였고, 이 발달 단계에서 생식계열 쥐 경쇄는 재배열을 거치고, 예비선택된 중쇄의 환경에서 세포 표면에서 발현되었다 (도 26). 또한, 비장 트랜스제닉 경쇄에서의 염색과 일치하게, 발현은 성숙 재순환 B 세포에서도 검출되었다 (도 26). 따라서, 트랜스젠의 CD19-Cre 유도 발현은 정상적인 경쇄 발현 패턴과 일치하였다. 내인성 경쇄-특이적 항체를 사용한 염색은 트랜스젠-특이적 경쇄 항체보다 더 강하였다. 이것은 내인성 경쇄의 보다 높은 발현 수준, 내인성 경쇄-특이적 항체를 사용한 염색의 보다 큰 감수성 또는 이 둘의 조합을 나타낼 수 있다. 중요한 사실은, 트랜스제닉 경쇄의 표면 발현의 강도가 혈액 내의 순환 B 세포의 염색에서 관찰되는 내인성 경쇄 및 IgM 표면 발현 모두와 상호관련된다는 것이다 (도 27).

따라서, 종합하면 상기 분석은 인간 IGKV1-39/C카파 트랜스젠의 발현이 B 세포 컴파트먼트로 제한되고, 그의 발현의 일시적인 조절은 내인성 카파 및 람다 경쇄와 유사하여 모든 B 세포 집단의 정상적인 발달을 야기함을 입증한다. 트랜스젠의 외관상 보다 낮은 발현 수준은 내인성 경쇄 유전자에 존재하는 프로모터 및 인핸서와 비교시의 프로모터의 강도에 의해 또는 재배열된 중쇄와 페어링하는데 있어서 내인성 경쇄에 경쟁적 잇점을 베공하는 트랜스젠 발현의 지연에 의해 설명될 수 있다. 이것은 B 세포가 성숙하면서 트랜스젠 염색의 상대 강도가 내인성 경쇄에 비해 증가한다는 관찰과 일치한다. 또한, B 세포 수가 정상이고 모든 표면 Ig+ B 세포가 내인성 및 트랜스제닉 경쇄를 동시 발현한다는 관찰은 IGKV1-39 가변 구역이 상이한 쥐 중쇄 가변 구역의 정상 레퍼토리와 페어링할 수 있다는 결론을 지지한다. 본 발명자들은 상기 분석으로부터 CD19-Cre 활성화되는 CAGGS 프로모터에 의해 유도되는 IGKV1-39/래트 C카파 트랜스젠을 Rosa 로커스에 삽입하면 트랜스젠의 시기적절한 B 세포-특이적 발현이 용이해지고 트랜스젠이 쥐 중쇄의 정상 레퍼토리와 페어링할 수 있다고 결론지었다.

실시예 19

IGKV1-39에 대한 에피베이스® T-세포 에피토프 프로필

IGKV1-39의 단백질 서열 (도 12, 인간 생식계열 IGKV1-39/J 단백질)을 T_H-에피토프로도 알려진 추정 HLA 클래스 II 제한 에피토프의 존재에 대해 스캐닝하였다. 이를 위해, 알고믹스 (Algonomics)의 에피베이스® 플랫폼을 IGKV1-39에 적용하였다. 간단히 설명하면, 플랫폼은 표적 서열로부터 유도된 모든 가능한 10량체 펩티드의 HLA 결합 특이성을 분석한다 ([Desmet et al. Nature 1992, 356:539-542]; [Desmet et al. FASEB J. 1997, 11:164-172]; [Desmet et al. Proteins 2002, 48:31-43]; [Desmet et al. Proteins 2005, 58:53-69]). 프로파일링은 20 DRB1, 7 DRB3/4/5, 13 DQ 및 7 DP, 즉 총 47개의 HLA 클래스 II 수용체 (표 5 참조)에 대해 동종이형 수준에서 수행되었다. 에피베이스®는 각각의 47개의 HLA 클래스 II 수용체에 대한 펩티드의 결합의 자유 에너지 △G_bind에 대한 정량적 추정치를 계산한다. 이어서, 상기 데이타를 다음과 같이 추가로 처리하였다:

- 자유 에너지는 △G_bind = RT ln(Kd)를 통해 Kd-값으로 전환되었다.

- 펩티드는 강한 (S), 중간 (M), 약한 및 비 (N) 결합물질로서 분류하였다. 다음 컷오프 (cutoff)가 적용되었다:

S: 강한 결합물질: Kd < 0.1 μM.

M: 중간 결합물질: 0.1 μM ≤ Kd < 0.8 μM.

N: 약한 및 비-결합물질: 0.8 μM ≤ Kd.

- 자가-펩티드에 상응하는 펩티드를 따로 처리하였다. 자가-펩티드의 목록은 293개의 항체 생식계열 서열로부터 취하였다. 이들을 '생식계열-여과된' 펩티드로서 칭한다.

S- 및 M-펩티드를 소위 에피토프 지도에서 표적 상에 매핑하였다; S-친화도는 정량적으로 플로팅되고; M-값은 정성적으로 제시된다. 그 결과에 대한 일반적인 개요로서, 표 6은 DRB1, DQ, DP 및 DRB3/4/5 유전자에 대응하는 HLA 클래스 II 수용체의 군에 대해 분석된 단백질에서 강한 및 중간 결합물질의 수를 제시한다. 계수는 강한 및 중간 친화도 결합물질에 대해 별개로 수행하였다. 동일한 군의 다수의 동종이형에 결합하는 펩티드는 하나로 계수하였다. 괄호 사이의 값은 생식계열-여과된 펩티드로 칭한다. 표 7에서, 서열은 실험 작업에 적합한 방식으로 제시된다. 서열은 12개 잔기가 중첩되는 연속적인 15량체로 분할하였다. 각각의 15량체에 대해, 불규칙성이 나열되고 (그에 대해 15량체가 중요한 결합물질을 함유하는, 총 47개 중에서 동종이형의 수), 함축된 혈청형도 제시된다. 에피베이스® 프로필 및 에피토프 지도는 도 16 및 17에 제시된다.

IGKV1-39는 강한 비-자가 DRB1 결합물질을 함유하지 않는 것으로 결론내렸다. 일반적으로, 유의하게 더 많은 결합물질이 다른 HLA 유전자보다 DRB1에 대해서 발견되었다. 이것은 DRB1 군에 속하는 동종이형이 보다 강력한 펩티드 결합물질이라는 실험 증거와 일치한다. DRB1 동종이형에 대한 중간 강도의 에피토프는 집단 반응에 기여하는 것으로 예상되고, 이는 무시할 수 없는 것이다. 다시, 비-자가 DRB1 결합물질은 IGKV1-39에서 발견되지 않았다. 항원에 대해 유발된 체액 반응에서, 관찰된 T_H 세포 활성화/증식은 일반적으로 DRB1 특이성의 측면에서 해석된다. 그러나, DRB3/4/5, DQ 및 DP 유전자의 기여 가능성도 무시할 수 없다. DRB1에 비해 상기 유전자의 보다 낮은 발현 수준을 고려하여, DRB3/4/5, DQ 및 DP에 대한 강한 에피토프 클래스에 촛점을 맞추었다. '중요한 에피토프'는 임의의 DRB1, DRB3/4/5, DQ 또는 DP 동종이형에 대한 강한 결합물질 또는 DRB1에 대한 중간 결합물질인 에피토프이다. IGKV1-39는 DRB3/4/5, DQ, 또는 DP에 대한 강한 또는 중간 비-자가 결합물질을 함유하지 않는다.

또한, 많은 펩티드가 생식계열 서열에 존재한다 (표 6에서 괄호 내의 값). 그러한 펩티드는 HLA에 매우 잘 결합할 수 있지만, 이들은 자가, 따라서 비-면역원성인 것으로 가정된다. 총 6개의 강한 및 16개의 중간 생식계열-여과된 DRB1 결합물질이 IGKV1-39에서 발견되었다. 프레임워크 구역 1 내지 프레임워크 구역 3은 생식계열 V-세그먼트 VKI 2-1-(1) O12 (VBase), a.k.a. IGKV1-39^*01 (IMGT)에 정확하게 일치한다. 프레임워크 구역 4는 생식계열 J-세그먼트 JK1 (V-base) a.k.a. IGKJ1^*01(IMGT)에 정확하게 일치한다. 이들 세그먼트가 임의의 비-자가 에피토프를 함유하지 않는다는 것은 놀라운 사실이 아니다.

실시예 20

IGKV1-39의 생산 특징

열역학상 안정하고 우수한 발현 수율을 제시하는 치료 항체를 생산하는 항체 발견 플랫폼에 대한 수요가 매우 크다. 상기 특징은 생산 동안 및 약품의 환자 내로의 주사 후에 약물 물질의 안정성 보장에 중요하다. 또한, 우수한 발현 수율은 약물 제조 비용에 직접적인 영향을 주고, 따라서 가격 책정, 환자 이용성 및 수익성에 영향을 준다. 현재 임상에서 사용되는 실질적으로 모든 치료 항체는 인간 IgG1 및 카파 불변 구역으로 이루어지지만, 특이성을 부여하는 상이한 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 이용한다. 인간 가변 중쇄 및 경쇄 도메인은 80% 초과의 서열 차이를 갖는 패밀리로 나뉠 수 있다. 생식계열 입체형상에서 이들 패밀리의 재배열된 예를 조합하여 안정성 및 수율에 대해 비교할 때, 유전자 패밀리가 생물리학적 특성에서 동일하지 않다는 것이 분명하다. 특히, V_H3, V_H1 및 V_H5는 중쇄에 대한 유리한 안정성을 갖고, Vk1 및 Vk3은 경쇄에 대한 가장 우수한 안정성 및 수율을 갖는다. 또한, 돌연변이가 체세포 과다돌연변이 과정의 일부로서 도입될 때, 돌연변이는 V_H/V_L 페어링을 방해할 수 있다. 상이한 돌연변이 비율을 갖는 상이한 경쇄 유전자가 고정된 V_H 쇄의 생산 특징에 대해 갖는 효과를 평가하기 위해서, Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 면역화시킨 공여자로부터의 일군의 44개의 TT 결합 중쇄와 조합된 6개의 비처리된 건강한 공여자로부터의 경쇄 (카파 및 람다)로 구축하였다. 1 라운드의 선택 후에, TT 결합 Fab 클론을 단리하였다. 이들 중 몇몇은 상이한 경쇄와 조합된 TT 클론 PG1433과 동일한 V_H 유전자를 공유하였다. Fab 경쇄 단편을 카파 발현 벡터 내로 재클로닝하고, PG1433의 중쇄를 코딩하는 DNA와 조합하여 293 세포 내로 형질감염시키고, 특이적 IgG 생산을 ELISA로 측정하였다. 표 8에 예시된 바와 같이, 상이한 경쇄와 조합된 PG1433 V_H를 함유하는 선택된 클론은 IGKV1-39과 조합된 PG1433 V_H보다 5 내지 10배 더 낮은 단백질 발현을 보였다. 모든 경쇄가 V_H 페어링을 파괴하고 생산 안정성을 감소시킬 수 있는 그들의 코딩 구역 내에 아미노산 돌연변이를 포함함에 주목한다. 따라서, 원치 않는 면역원성의 가능성을 감소시키는 것 이외에, 돌연변이가 존재하지 않는 경쇄 IGKV1-39의 사용은 다양한 특이성에 기여하는 V_H 유전자의 개선된 생산 안정성 및 수율에 기여할 것으로 예상된다. 실제로, IGKV1-39와 페어링된 상이한 모든 V_H 유전자의 형질감염에 의해 생성된 안정한 클론은 고도로 계대배양될 수 있고, 표 9에 제시된 바와 같은 강력한 생산 특징을 계속 보유한다.

실시예 21

완전 인간 V_H 및 V_L 구역을 발현하는 마우스의 생성.

본 발명에 따른 트랜스제닉 마우스를 이미 인간 VH 로커스를 함유하는 마우스와 교배시켰다. 인간 VH 로커스를 포함하는 적절한 마우스의 예는 문헌 [Taylor et al. (1992). Nucleic Acids Res 20: 6287-95]; [Lonberg et al. (1994). Nature 368: 856-9]; [Green et al. (1994). Nat Genet 7: 13-21]; [Dechiara et al. (2009). Methods Mol Biol 530: 311-24]에 개시되어 있다.

교배 및 적어도 IGKV1-39 트랜스젠 및 인간 VH 로커스에 이종접합성인 마우스에 대한 선택 후에, 선택된 마우스를 표적으로 면역화시켰다. VH 유전자를 상기한 바와 같이 수거하였다. 상기 방법은 VH 유전자가 이미 완전 인간 유전자이고, 따라서 인간화를 필요로 하지 않는다는 잇점을 갖는다.

실시예 22

만성 염증성 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염의 치료를 위한, 인간 IL6을 표적화하는 항체의 단리, 특성 결정, 올리고클로닉 구성 및 생산

인간 재조합 IL6으로 면역화시킨 트랜스제닉 마우스로부터의 비장 VH 레퍼토리를 단일 인간 IGKV1-39-C 카파 경쇄 (마우스 트랜스젠과 동일)와 함께 파지 디스플레이 Fab 벡터에 클로닝하고, 면역원성 인간 IL6에 대해 패닝하였다. 2 내지 4 라운드의 패닝 후에 얻은 클론을 그들의 결합 특이성에 대해 분석하였다. 특유한 클론을 확인하고 VH, DH 및 JH 이용성을 지정하기 위해서 IL6-특이적 Fab 단편을 코딩하는 VH 유전자의 서열을 분석하였다. Fab 단편을 IgG1 분자로서 재구성하고, 일시 발현시켰다. 이어서, 특유한 클론을 결합 분석에서의 비-경쟁을 기초로 하여 분류하고, 친화도 및 기능적 분석을 수행하였다. 가장 강력한 항-IL6 IgG1 mAb는 하나의 IGKV1-39-C-계 카파 경쇄와 함께, 올리고클로닉 구성에서 상이한 VH-구역을 포함하는 2, 3, 4 또는 5개의 중쇄의 조합물로서 후속적으로 발현시키고, IL-6과의 복합체 형성에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 올리고클로닉을 또한 마우스로부터 인간 IL-6의 소실에 대해 생체 내에서 시험하였다. 가장 강력한 소실 활성을 갖는 올리고클로닉을 선택하고, 쥐 VH 유전자를 통상적인 방법에 따라 인간화하였다. 인간화 IgG1을 포유동물 세포주 내로 형질감염시켜 안정한 클론을 생성시켰다. 최적 하위클론을 마스터 세포 은행 (master cell bank)의 생성 및 임상 시험 물질의 생성에 대해 선택하였다.

본원에서 설명되는 많은 프로토콜은 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 및 관심있는 항원에의 결합에 대한 파지의 패닝을 위한 표준 프로토콜이고, 예를 들어 문헌 [Antibody Phage Display: Methods and Protocols. 2002. Editor(s): Philippa M. O'Brien, Robert Aitken. Humana Press, Totowa, New Jersey, USA]에 설명되어 있다.

면역화

어쥬번트 (adjuvant)로서 시그마 타이터맥스 (Sigma titerMax)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 트랜스제닉 마우스에 대한 면역화를 2주마다 인간 IL6으로 3회 수행하였다.

RNA 단리 및 cDNA 합성

마지막 면역화 3일 후에, 마우스로부터의 비장 및 림프절을 제거하고, PBS (pH 7.4)가 존재하는 시험관 내로 70 마이크로미터 필터를 통과시켜 단일 현탁액을 생성시켰다. 림프구의 세척 및 펠렛화 후에, 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 총 RNA의 단리를 위해 TRIzol LS 시약 (인비트로겐) 내에 현탁하고, 제조사 (인비트로겐)의 절차에 따라 1 ㎍의 RNA, Superscript III RT를 dT20과 조합하여 사용하는 역전사 반응에 적용하였다.

Fab 파지 디스플레이 라이브러리의 생성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행한다.

코팅된 면역시험관에서 파지의 선택

인간 재조합 IL6을 PBS에 5 ㎍/ml의 농도로 용해시키고, MaxiSorp Nunc-Immuno Tube (Nunc 444474)에 4℃에서 철야 코팅하였다. 코팅 용액을 버리고, 시험관을 PBS (차단 버퍼) 중의 2% 탈지유 (ELK)로 1시간 동안 실온 (RT)에서 차단하였다. 이와 함께, 0.5 ml의 파지 라이브러리를 1 ml 차단 버퍼와 혼합하고, 20분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 파지의 차단 후에, 파지 용액을 IL6 코팅된 시험관에 첨가하고, 결합시키기 위해 서서히 회전하는 플랫폼 상에서 2시간 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 시험관을 PBS/0.05% Tween-20으로 10회 세척한 후, 회전 휠 상에서 1 ml 50 mM 글라이신-HCl (pH 2.2)과 10분 동안 RT에서 인큐베이팅하는 파지 용출, 바로 이어서 수거된 용리액의 0.5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5)을 사용한 중화를 수행하였다.

파지 클론의 수거

O.D. 0.4의 5 ml XL1-Blue MRF (스트라타젠) 배양액을 수거된 파지 용액에 첨가하고, 파지를 감염시키기 위해서 진탕하지 않으면서 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 세균을 카르베니실린/테트라사이클린 4% 글루코스 2^*TY 플레이트에 도말하고, 37℃에서 철야 성장시켰다.

파지 생산

파지를 성장시키고, 헬퍼 파지 균주로서 VCSM13을 사용하여 문헌 [Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11): e59]에 기재된 바와 같이 처리하였다.

파지 ELISA

ELISA 플레이트를 PBS 중의 2.5 ㎍/ml의 농도로 웰당 100 ㎕ 인간 재조합 IL6으로 4℃에서 철야 코팅하였다. PBS 중의 2 ㎍/ml의 농도로 100 ㎕ 갑상선글로불린으로 코팅된 플레이트를 음성 대조군으로 사용하였다. 웰을 비우고, 종이 타월에 가볍게 두드려 건조시키고, PBS-4% 탈지유 (ELK)로 완전히 채우고, 웰을 차단하기 위해서 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 차단 용액을 버린 후, 50 ㎕ 차단 용액과 미리 혼합한 파지 미니프렙을 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, PBS-0.05% Tween-20으로 5회 세척하여 미결합된 파지를 제거하였다. 결합된 파지는 웰을 100 ㎕ 항-M13-HRP 항체 접합체 (차단 버퍼에 1/5000으로 희석)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅함으로써 검출하였다. 유리 항체는 상기한 바와 같은 세척 단계를 반복하여 제거하고, 발색이 가시화될 때까지 TMB 기질 인큐베이팅을 수행하였다. 웰당 100 ㎕의 2 M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm 방출 파장에서 ELISA 판독기로 분석하였다.

서열결정

배경 신호보다 적어도 3배의 신호를 생성시킨 클론을 증식시키고, DNA 미니프렙 절차 (절차는 퀴아겐 미니프렙 취급설명서 참조)에 사용하고, 뉴클레오티드 서열 분석을 수행하였다. 서열결정은 인간 IgG1 중쇄의 CH1 구역의 5' 서열 (Fab 디스플레이 벡터 MV1043에 존재, 도 3 및 12)을 인식하는 역방향 프라이머 (CH1_Rev1, 표 1)를 사용하여 빅 다이 1.1 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)에 동봉된 취급설명서에 따라 수행하였다. 쥐 VH 구역의 서열을 다양한 DH 및 JH 유전자 세그먼트에 대해 분석하였다.

키메라 IgG1의 제조 및 발현

트랜스젠 (IGKV1-39) L쇄 단편을 인간 IgG1- 및 카파 불변 구역을 포함하는 벡터 pcDNA3000Neo의 유도체 (크루셀 (Crucell), 네덜란드 라이덴) 내로 클로닝함으로써 벡터 MV1057 (도 12 및 22)을 생성하였다. VH 구역을 MV1057 내로 클로닝하고, 모든 구성체에 대한 뉴클레오티드 서열을 표준 기술에 따라 확인하였다. 생성되는 구성체를 HEK293T 세포에사 일시 발현시키고, 키메라 IgG1을 포함하는 상등액을 얻고, 문헌 (Throsby, M. 2006. J Virol 80: 6982-92)에 기재된 표준 절차를 사용하여 정제하였다.

IgG1 결합 및 경쟁 분석

IgG1 항체를 상기 설명한 바와 같은 IL6 코팅된 플레이트 및 항-인간 IgG 퍼옥시다제 접합체를 사용하여 ELISA에서 적정하였다. 에피토프 인식을 기초로 하여 항체를 분류하기 위한 경쟁 ELISA는 IL6 코팅된 플레이트에서 Fab 파지를 IgG1과 함께 또는 IL6에 대한 시판 항체 (예를 들어 아브캄 (Abcam) cat. no. ab9324)와 함께 인큐베이팅한 후, 항-M13 퍼옥시다제 접합체를 사용한 결합된 Fab 파지의 검출에 의해 수행하였다.

IgG1 친화도 측정

IL6에 대한 항체의 친화도는 Octet (포르테바이오 (ForteBio))에서 정량적 동적 프로토콜을 사용하여 결정하였다. 항체를 항-인간 IgG Fc 포획 바이오센서 상에 포획하고, 유리 IL6에 노출시키고, 각각의 항체의 Kd를 계산하기 위해서 독점 (proprietary) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

IL6 항체의 기능적 활성

IL6과 IL6 수용체 (IL6R) 사이의 결합을 억제하는 선택된 항체의 능력을 시험하기 위해서, ELISA 기반 분석을 사용하였다. 다양한 농도의 항체를 문헌 [Naoko et al. 2007, Can. Res. 67: 817-875]에 기재된 바와 같이 고정된 농도 (10 ng/ml)의 비오티닐화 IL6과 혼합하였다. IL6-항체 면역 복합체를 고정된 IL6R에 첨가하였다. 비오티닐화 IL6의 IL6R에 대한 결합은 호스래디시 (horseradish) 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘으로 검출하였다. ELISA 신호의 감소는 억제의 척도이다. IL6과 IL6R 사이의 결합 억제에 대한 양성 대조군으로서, 항-IL6R 항체 (아브캄 cat. no. ab34351; 클론 B-R6) 또는 항-IL6 항체 (아브캄 cat. no. ab9324)를 사용하였다. 선택된 항-IL6 항체의 시험관내 차단 활성은 IL6 의존 세포주 7TD1을 사용하는 증식 분석에서 측정하였다. 간단히 설명하면, 세포를 항-IL6 항체의 존재 또는 부재 하에 상이한 농도의 인간 IL6과 함께 인큐베이팅하였다. IL6의 이용가능한 양이 증식 정도를 결정한다. 따라서, 첨가된 항체가 IL6 결합을 차단하면, 증식 판독치는 비결합 항체 대조군에 비해 감소한다. 증식은 제조사의 지시에 따라 5-브로모-2'-데옥시-우리딘 (BrdU) 증식 키트 (로슈 cat. no. 11444611001)를 사용하여 BrdU을 DNA 내로 혼입시킴으로써 측정하였다.

항-IL6 올리고클로닉의 생성

가장 강력한 항-IL6 항체는 각각의 에피토프 기로부터 선택하였다. 상기 항체를 발현하는 발현 구성체를 상이한 비 (1:1:1; 3:1:1; 1:3:1; 1:1:3; 3:3:1; 1:3:3; 3:1:3; 10:1:1; 1:10:1; 1:1:10; 10:10:1; 1:10:10; 10:1:10; 3:10:1; 10:3:1; 1:10:3; 3:1:10; 10:1:3; 1:3:10)의 3개의 비-경쟁 기로 HEK293T 세포 내로 형질감염시켰다. 항체 함유 상등액을 수거하고, 정제하여 상기한 바와 같이 특성을 결정하였다.

항-IL6 올리고클로닉의 복합체 형성 및 생체내 소실

항-IL6 올리고클로닉이 면역 복합체를 형성하는 능력을 측정하고 상기 복합체를 분석하기 위해, TNFα에 대한 상이한 항체와 형성된 면역 복합체의 특성을 결정하는 문헌 [Min-Soo Kim et al. (2007) JMB 374: 1374-1388]에 개시된 방법에 따라 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하였다. 상이한 몰비의 항-IL6 올리고클로닉을 인간 IL6과 혼합하고, 20시간 동안 4℃ 또는 25℃에서 인큐베이팅하였다. 혼합물을 크기 배제 컬럼이 구비된 HPLC 시스템으로 분석하고; 여기서 상이한 용출 시간은 분자량 표준물질을 이용할 때 분자량과 상호관련된다. IL6과 복합체를 형성하는 항체의 능력은 생체 내에서 순환으로부터 시토킨을 신속하게 소실시키는 그들의 능력과 상호관련된다. 이것은 마우스로부터 방사성 표지된 IL6의 소실을 측정함으로써 확인된다. 간단히 설명하면, 6 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 얻고, 실험 18시간 전에 동물에게 상이한 용량의 정제된 항-IL6 올리고클로닉을 측부 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 (IV) 주사하였다. 제0일에, 마우스에게 50 ㎕의 방사성 표지된 IL-6 (1x10E7 cpm/mL)를 동일한 조건 하에 IV 주사하였다. 혈액 샘플 (대략 50 ㎕)을 수 시간 간격으로 수집하고, 4℃에서 보관하였다. 샘플을 5분 동안 4000 xg에서 원심분리하고, 혈청의 방사성을 측정하였다. 모든 약동학 실험은 각각의 처리에 대해 3마리의 동물을 사용하여 동시에 수행하였다.

항-IL6 올리고클로닉 안정한 클론의 생성 및 전임상 개발

선도적인 항-IL6 올리고클로닉은 상기 결정된 바와 같은 시험관내 및 생체내 효능을 기초로 하여 선택하였다. 쥐 VH 유전자는 표준 방법에 따라 인간화하고, 상기한 바와 같이 발현 벡터에서 완전 인간 IGKV1-39 경쇄와 조합하였다. 인간화 방법의 예는 재표면화 (Padlan, E. A., et al., (1991). Mol. Immunol., 28, 489), 초인간화 (Tan, P., D. A., et al., (2002) J. Immunol., 169, 1119) 및 인간 스트링 함량 최적화 (Lazar, G. A., et al., (2007). Mol. Immunol., 44, 1986)과 같은 방식을 기초로 한 것을 포함한다. 3개의 구성체를 표준 방법에 따라 G418의 선택압 하에서 소정의 최적 비율 (상기한 바와 같은)로 PER.C6 세포 내로 형질감염시켰다. 안정한 고생산 항-IL6 올리고클로닉 클론을 선택하고, 효과적인 검증된 마스터 세포 은행을 생성하였다.

Claims (1)

1. 인간 VL 경쇄를 갖는 면역글로불린을 생산하는 B 세포를 생산하기 위한, 트랜스제닉 (transgenic) 쥐과 포유동물의 용도.

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