RS67635B1

RS67635B1 - Genetskim inženjeringom dobijeni imunoglobulini sa izmenjenim vezivanjem za fcrn

Info

Publication number: RS67635B1
Application number: RS20260045A
Authority: RS
Inventors: Stian Foss; Jan Terje Andersen; Inger Sandlie
Original assignee: Univ Oslo
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2026-02-27
Also published as: IL261783B2; AU2017232546B2; HRP20260060T1; SG11201807949WA; WO2017158426A1; FI3430039T3; JP7155008B2; KR102895909B1; IL261783B; CR20180445A; AU2017232546A1; MA43773B1; US20190077883A1; US11319383B2; CN109071631A; CO2018009687A2; PT3430039T; JP7636081B2; SI3430039T1; TN2018000301A1

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije korisne u postupcima za terapiju posredovanu antitelima. Konkretno, ovde su obezbeđeni imunoglobulini dobijeni genetskim inženjeringom sa izmenjenim poluživotom.

[0007] OSNOV PRONALASKA

[0009] Antitela su imunološki proteini koji se vezuju za specifični antigen. Kod većine sisara, uključujući ljude i miševe, antitela su konstruisana od uparenih teških i lakih polipeptidnih lanaca. Svaki lanac je sačinjen od pojedinačnih imunoglobulinskih (Ig) domena, pa se za takve proteine koristi generički termin imunoglobulin. Svaki lanac je sačinjen od dva različita regiona, koji se nazivaju varijabilni i konstantni region. Varijabilni regioni lakog i teškog lanca pokazuju značajnu raznolikost sekvenci među antitelima i odgovorni su za vezivanje ciljnog antigena. Konstantni regioni pokazuju manju raznolikost sekvenci i odgovorni su za vezivanje brojnih prirodnih proteina kako bi izazvali važne biohemijske događaje. Kod ljudi postoji pet različitih klasa antitela, uključujući IgA (koji uključuje podklase IgA1 i IgA2), IgD, IgE, IgG (koji uključuje podklase IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) i IgM. Karakteristika po kojoj se ove klase antitela razlikuju su njihovi konstantni regioni, iako suptilnije razlike mogu da postoje i u V regionu. Slika 1 prikazuje IgG1 antitelo, koje se ovde koristi kao primer za opisivanje opštih strukturnih karakteristika imunoglobulina. IgG antitela su tetramerni proteini sačinjeni od dva teška lanca i dva laka lanca. Teški lanac IgG je sačinjen od četiri imunoglobulinska domena povezana od N- ka C-terminusu redosledom VH-CH1-CH2-CH3, što se odnosi na varijabilni domen teškog lanca, konstantni domen teškog lanca 1, konstantni domen teškog lanca 2, odnosno konstantni domen teškog lanca 3 (takođe se naziva VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3, što se odnosi na varijabilni domen teškog lanca, konstantni gama 1 domen, konstantni gama 2 domen, odnosno konstantni gama 3 domen). Laki lanac IgG je sačinjen od dva imunoglobulinska domena povezana od N- ka C-terminusu redosledom VL-CL, što se odnosi na varijabilni domen lakog lanca, odnosno konstantni domen lakog lanca.

[0010] Varijabilni region antitela sadrži determinante vezivanja antigena molekula i time određuje specifičnost antitela za njegov ciljni antigen. Varijabilni region je tako nazvan jer se po sekvenci najviše razlikuje od drugih antitela unutar iste klase. Većina varijabilnosti sekvence javlja se u regionima koji određuju komplementarnost (CDR). Ukupno postoji 6 CDR, po tri po teškom i lakom lancu, koji su označeni kao VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3. Varijabilni region izvan CDR regiona naziva se okvirni (FR) region. Iako oni nisu toliko raznoliki kao CDR regioni, među različitim antitelima javlja se varijabilnost sekvence u FR regionu. Generalno, ova karakteristična arhitektura antitela pruža stabilnu osnovu (FR region) na kojoj imuni sistem može da istraži značajnu raznolikost vezivanja antigena (CDR) kako bi se dobila specifičnost za širok spektar antigena. Dostupan je niz struktura visoke rezolucije za različite fragmente varijabilnih regiona iz različitih organizama, neke nevezane, a neke u kompleksu sa antigenom. Sekvenca i strukturne karakteristike varijabilnih regiona antitela su dobro okarakterisane (Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9‑16; Morea et al., 2000, Methods 20:267‑279, a konzervirane karakteristike antitela omogućile su razvoj mnoštva tehnika za dobijanje antitela genetskim inženjeringom (Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339‑376). Na primer, moguće je kalemiti CDR regione sa jednog antitela, na primer mišjeg antitela, na okvirni region drugog antitela, na primer humanog antitela. Ovaj postupak, koji se u struci naziva „humanizacija“, omogućava generisanje manje imunogenih terapijskih antitela iz antitela koja nisu humana. Fragmenti koji uključuju varijabilni region mogu da postoje u odsustvu drugih regiona antitela, uključujući na primer antigen-vezujući fragment (Fab) koji uključuje VH-Cγ1 i VH-CL, varijabilni fragment (Fv) koji uključuje VH i VL, jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji uključuje VH i VL povezane zajedno u istom lancu, kao i razne druge fragmente varijabilnog regiona (Little et al., 2000, Immunol Today 21:364‑370).

[0011] Fc region antitela interaguje sa brojnim Fc receptorima i ligandima, dajući niz važnih funkcionalnih sposobnosti koje se nazivaju efektorske funkcije.

[0012] [0005] Kod IgG, mesto na Fc koje uključuje aminokiseline iz oba CH2 i CH3 domena posreduje u interakciji sa neonatalnim Fc receptorom (FcRn), receptorom koji reciklira endocitozirano antitelo iz endozoma nazad u krvotok (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181‑220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739‑766,). Ovaj proces, zajedno sa sprečavanjem filtracije bubrega zbog velikih dimenzija molekula pune dužine, rezultuje povoljnim poluživotom antitela u serumu, u rasponu od jedne do tri nedelje. Vezivanje Fc za FcRn takođe igra ključnu ulogu u transportu antitela unutar i između ćelija. Mesto vezivanja za FcRn na Fc je takođe mesto na kojem se vezuju bakterijski proteini A i G. Čvrsto vezivanje ovih proteina se obično koristi kao sredstvo za prečišćavanje antitela primenom afinitetne hromatografije proteina A ili proteina G tokom prečišćavanja proteina. Stoga je vernost ovog regiona na Fc važna i za klinička svojstva antitela i za njihovo prečišćavanje.

[0013] FcRn je ključni igrač u nekoliko imunoloških i neimunoloških procesa, jer posreduje u prenosu IgG sa majke na fetus, reguliše perzistenciju IgG i albumina u serumu i transportuje oba liganda između različitih ćelijskih odeljaka. Pored toga, FcRn poboljšava prezentaciju antigena i unakrsnu prezentaciju. Za razliku od TRIM21 koji se nalazi u citosolu, FcRn je transmembranski receptor koji se pretežno nalazi unutar acidifikovanih endozoma i transportuje svoje ligande ili reciklažnim putem ili transcitotskim putem preko polarizovanih ćelijskih slojeva. Međutim, FcRn takođe može da poboljša obradu imunih kompleksa praćenu prezentacijom antigenih peptida T ćelijama. Glavna odlika interakcije između FcRn i IgG je to što FcRn vezuje IgG Fc na strogo pH zavisan način, vezujući se pri kiselom pH, dok pri neutralnom pH nema vezivanja ili dolazi do otpuštanja, što je preduslov za FcRn-posredovan transport u ćeliju i van nje. Inženjering FcRn-IgG Fc interakcije doveo je do razvoja antitela sa kraćim ili dužim poluživotom u serumu ili izmenjenom sposobnošću transporta kroz ćelijske slojeve. FcRn je široko eksprimiran, i kao takav se nalazi na različitim ćelijskim lokacijama u hematopoetskim, kao i u nehematopoetskim ćelijama.

[0014] Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metabolism and Disposition, tom. 35, No. 1, str. 86‑94, opisuju humanizovane IgG1 varijante sa različitim svojstvima vezivanja za neonatalni Fc receptor. Nekoliko dvostruko mutantnih varijanti (Q311I/P257I i N434H/D376V) pokazalo je povećano vezivanje za FcRn in vitro. Međutim, ovo se nije pretvorilo u poboljšana farmakokinetička svojstva. Naprotiv, varijante su pokazale povećani klirens iz cirkulacije u poređenju sa antitelom divljeg tipa, kada su primenjene na miševe. Varijante autora Datta-Mannan et al. nisu pokazale povećan serumski poluživot.

[0015] Potrebni su poboljšani terapijski IgG koji pokazuju poboljšano vezivanje za FcRn zavisno od pH.

[0017] IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0019] Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije i imunoglobuline za upotrebu u postupcima za terapiju posredovanu antitelima, kako je definisano u zahtevima. Konkretno, ovde su obezbeđeni imunoglobulini dobijeni genetskim inženjeringom sa izmenjenim poluživotom.

[0020] Predmetni pronalazak pruža kompoziciju koja sadrži imunoglobulin koji ima mutacije Q311R, N434W i M428E, u Fc regionu humanog IgG1 divljeg tipa, gde navedeni imunoglobulin ima izmenjeno vezivanje za FcRn, i pri čemu je navedeni imunoglobulin humanizovani IgG1Q311R/N434W/M428E, i gde mutacije produžavaju poluživot imunoglobulina u serumu u poređenju sa divljim tipom humanog IgG1, i gde se numeracija odnosi na EU indeks (npr. konstantni region imunoglobulina ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 2 i 7).

[0021] U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje za ciljni molekul odabran od, na primer, markera kancera, citokina, markera infektivne bolesti ili faktora rasta.

[0022] Drugi primeri izvođenja obezbeđuju ovde opisane imunoglobuline za upotrebu u terapiji. U nekim primerima izvođenja, bolest za terapiju je, na primer, kancer, autoimuna bolest, inflamatorna bolest, odbacivanje transplantata ili infektivna bolest. U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje za ciljni molekul izabran od, na primer, markera kancera, citokina, markera infektivne bolesti ili faktora rasta.

[0023] Sledeći primeri izvođenja obezbeđuju kompozicije vakcina koje sadrže varijante imunoglobulina ili fuzije njihovih Fc regiona (npr. fuzionisane sa imunogenom) kako je definisano u zahtevima, opciono za upotrebu u postupku za lečenje generisanjem imunog odgovora kod subjekta.

[0024] Dodatni primeri izvođenja su ovde opisani.

[0026] KRATAK OPIS CRTEŽA

[0028]

[0030] SL. 1. Rezultati ELISA testa koji prikazuju vezivanje panela h9C12 varijanti IgG1 sa Fc dobijenim genetskim inženjeringom za humani FcRn pri pH 6,0 (gornji panel) i 7,4 (donji panel).

[0031] SL. 2. SPR senzogrami koji prikazuju vezivanje panela h9C12 varijanti IgG1 sa Fc dobijenim genetskim inženjeringom za humani FcRn pri pH 6,0 (7,8-4000,0 nM) i pH 7,4 (4000,0 nM). IgG1-M252Y/S254T/T256E je uključen kao referenca.

[0032] SL. 3 prikazuje poravnanje koje pokazuje aminokiselinska sekvenca varijanti IgG1. Aminokiselinska sekvenca konstantnog domena varijanti IgG1 sa Fc dobijenim genetskim inženjeringom.

[0033] SL. 4 prikazuje sekvence sa slike 3.

[0034] SL. 5 prikazuje ELISA test koji pokazuje vezivanje panela h9C12 varijanti IgG1 i IgG3 sa Fc dobijenim genetskim inženjeringom za humani FcRn pri pH 6,0 i 7,4.

[0035] SL. 6 prikazuje SPR senzograme koji pokazuju vezivanje panela h9C12 varijanti IgG1 sa Fc dobijenim genetskim inženjeringom za humani FcRn pri pH 6,0 (1000-15,6 nM) (A-D) i pH 7,4 (1000 nM) (E-F).

[0036] SL. 7 prikazuje podatke o poluživotu in vivo (ostatak, %) (A) h9C12 i (B) NIP varijanti IgG1 kod miševa Tg32-Alb-/- transgenih za humani FcRn. NIP = 4-hidroksi-3-jodo-5-nitrofenilsirćetna kiselina.

[0037] SL. 8 prikazuje sekvence varijanti IgG.

[0039] DEFINICIJE

[0041] Termin „antitelo“ se ovde koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, sve dok pokazuju željenu aktivnost vezivanja antigena. Takođe su uključeni fragmenti antitela koji imaju Fc region i fuzioni proteini koji sadrže region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina.

[0042] „Fragment antitela“ se odnosi na molekul koji nije intaktno antitelo, a koji sadrži deo intaktnog antitela koji se vezuje za antigen za koji se vezuje intaktno antitelo. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab').sub.2, molekule jednolančanih antitela (npr. scFv), dijatela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0043] Termin „Fc region“ ovde se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje Fc regione nativne sekvence i varijantne Fc regione. U jednom primeru izvođenja, Fc region teškog lanca humanog IgG proteže se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog kraja teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali i ne mora da bude prisutan. Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, numerisanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je u skladu sa EU sistemom numeracije, takođe nazvanim EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991.

[0044] Pojam „efektorske funkcije“, kako se ovde koristi, odnosi se na biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; sekreciju citokina; imunokompleksom posredovano preuzimanje antigena od strane antigen-prezentujućih ćelija; nishodnu regulaciju receptora na ćelijskoj površini (npr. receptor B ćelija); i aktivaciju B ćelija. Termin „divlji tip“ kada se koristi u vezi sa proteinom odnosi se na proteine kodirane genomom ćelije, tkiva ili organizma, osim onog kojim je manipulisano da bi se proizveli sintetički proteini.

[0045] Termin „domen koji vezuje antigen“ odnosi se na deo molekula koji vezuje antigen, a koji sadrži područje koje se specifično vezuje za deo ili ceo antigen i komplementarno je delu ili celom antigenu. Tamo gde je antigen veliki, molekul koji vezuje antigen može da se veže samo za određeni deo antigena, a taj deo se naziva epitop. Domen koji vezuje antigen može da formira, na primer, jedan ili više varijabilnih domena antitela (takođe nazvanih varijabilni regioni antitela). Poželjno je da domen koji vezuje antigen obuhvata varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).

[0046] Termin „himerno“ antitelo odnosi se na antitelo u kome deo teškog i/ili lakog lanca potiče iz određenog izvora ili vrste, dok ostatak teškog i/ili lakog lanca potiče iz drugog izvora ili vrste. Kod himernih antitela, na primer, komponente koje se ne vezuju za antigen mogu da potiču iz širokog spektra vrsta, uključujući primate kao što su šimpanze i ljudi. Humanizovana antitela su posebno poželjan oblik himernih antitela.

[0047] „Klasa“ antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih može dalje da se podeli na podklase (izotipove), npr. IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>i IgA<2>. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se α, β, δ, ε, γ i µ.

[0048] „Region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina“ treba da obuhvati prirodno prisutne alelne varijante Fc regiona imunoglobulina, kao i varijante sa promenama koje proizvode supstitucije, adicije ili delecije, ali koje ne smanjuju značajno sposobnost imunoglobulina da posreduje u efektorskim funkcijama (kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela). Na primer, jedna ili više aminokiselina mogu da budu deletirane sa N-terminusa ili C-terminusa Fc regiona imunoglobulina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Takve varijante mogu da budu odabrane prema opštim pravilima poznatim u struci kako bi imale minimalan uticaj na aktivnost (videti, npr. Bowie, J. U. et al., Science 247:1306‑10 (1990)).

[0049] „Region okvira“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR) (ili CDR). FR varijabilnog domena se generalno sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence se generalno pojavljuju u sledećem nizu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[0050] Termini „antitelo pune dužine“, „intaktno antitelo“ i „celo antitelo“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela ili ima teške lance koji sadrže Fc region kako je ovde definisano.

[0051] „Humani konsenzusni region okvira“ je region okvira koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u uzorku VL ili VH sekvenci regiona okvira humanog imunoglobulina. Tipično, VL ili VH sekvence humanog imunoglobulina su odabrane iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91‑3242, Bethesda Md. (1991), vols.1‑3. U jednom primeru izvođenja, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I kao u Kabat et al., iznad. U jednom primeru izvođenja, za VH, podgrupa je podgrupa III kao u Kabat et al., iznad.

[0052] „Humanizovano“ antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke iz nehumanih HVR regiona i aminokiselinske ostatke iz humanih FR regiona. U određenim primerima izvođenja, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi HVR regioni (npr. CDR) odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi ili suštinski svi FR regioni odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela koji potiče iz humanog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumano antitelo, odnosi se na antitelo koje je prošlo humanizaciju.

[0053] Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“). Generalno, prirodna antitela sa četiri lanca sadrže šest HVR; tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR generalno sadrže aminokiselinske ostatke iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz „regiona koji određuju komplementarnost“ (CDR), pri čemu ovi poslednji imaju najveću varijabilnost sekvence i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe nazivaju regionima koji određuju komplementarnost (CDR), i ovi termini se ovde koriste naizmenično u odnosu na delove varijabilnog regiona koji formiraju regione za vezivanje antigena. Ovaj poseban region je opisan kod Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i kod Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901‑917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se upoređuju jedni sa drugima. Ipak, primena bilo koje definicije za označavanje CDR antitela ili njegovih varijanti treba da bude u okviru termina kako je ovde definisano i korišćeno. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kako je definisano svakom od gore navedenih referenci navedeni su u nastavku u Tabeli 1 radi poređenja. Tačan broj ostataka koji obuhvataju određeni CDR variraće u zavisnosti od sekvence i veličine CDR.

[0054] Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski da utvrde koji ostaci čine određeni CDR uzimajući u obzir sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona antitela.

[0055] Termini „varijanta“ i „mutant“ kada se koriste u vezi sa polipeptidom odnose se na aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje za jednu ili više aminokiselina od drugog, obično srodnog polipeptida. Varijanta može da ima „konzervativne“ promene, kod kojih supstituisana aminokiselina ima slična strukturna ili hemijska svojstva. Jedna vrsta konzervativnih aminokiselinskih supstitucija odnosi se na zamenljivost ostataka koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa aminokiselina koje imaju alifatične bočne lance je glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; grupa aminokiselina koje imaju alifatične hidroksilne bočne lance je serin i treonin; grupa aminokiselina koje imaju bočne lance koji sadrže amide je asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koje imaju aromatične bočne lance je fenilalanin, tirozin i triptofan; neprirodne aminokiseline poput p-aminofenilalanina, grupa aminokiselina koje imaju bazne bočne lance je lizin, arginin i histidin; i grupa aminokiselina koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor je cistein i metionin. Poželjne konzervativne grupe za supstituciju aminokiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin i asparagin-glutamin. Ređe, varijanta može da ima „nekonzervativne“ promene (npr. zamenu glicina triptofanom). Slične manje varijacije mogu takođe da uključuju delecije ili insercije aminokiselina (tj. adicije), ili oboje. Uputstvo za određivanje koji i koliko ostataka aminokiselina može da bude supstituisano, inserirano ili deletirano bez ukidanja biološke aktivnosti može da se pronađe korišćenjem računarskih programa dobro poznatih u struci, na primer, DNAStar softvera. Varijante mogu da se testiraju u funkcionalnim testovima. Poželjne varijante imaju manje od 10%, a poželjno manje od 5%, a još poželjnije manje od 2% promena (bilo da su u pitanju supstitucije, delecije itd.). Za supstituciju aminokiseline koristi se sledeća nomenklatura: Originalna aminokiselina, pozicija, supstituentska aminokiselina. Shodno tome, supstitucija lizina alaninom na poziciji 573 označena je kao „K573A“, a supstitucija lizina prolinom na poziciji 573 označena je kao K573P. Višestruke mutacije su odvojene oznakama adicije („+“) ili „/“, npr. „Gly205Arg Ser411Phe“ ili „G205R/S411F“, koje predstavljaju mutacije na pozicijama 205 i 411 koje zamenjuju glicin (G) argininom (R), odnosno serin (S) fenilalaninom (F).

[0056] [0030] Srodnost između dve aminokiselinske sekvence ili između dve nukleotidne sekvence opisana je parametrom „identičnost“. Za potrebe ovog pronalaska, stepen identičnosti između dve aminokiselinske sekvence određuje se korišćenjem algoritma Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443‑453) kao što je implementirano u programu Needle iz paketa EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276‑277), poželjno verzija 3.0.0 ili novija. Opcioni parametri 11644.000-EP7 koji se koriste su kazna za otvaranje praznine od 10, kazna za produženje praznine od 0,5 i matrica supstitucije EBLOSUM62 (EMBOSS verzija BLOSUM62). Izlaz funkcije Needle označen kao „najduža identifikacija“ (dobijen korišćenjem opcije -nobrief) koristi se kao procenat identičnosti i izračunava se na sledeći način:

[0058] (Identični ostaci x 100)/(Dužina poravnanja – Ukupan broj praznina u poravnanju)

[0060] Izraz „pozicija aminokiseline koja odgovara“ poziciji u referentnoj sekvenci i slični izrazi imaju za cilj da identifikuju aminokiselinski ostatak koji u primarnoj ili prostornoj strukturi odgovara određenoj poziciji u referentnoj sekvenci. Stručnjak će razumeti da se to može učiniti poravnavanjem date sekvence sa referentnom sekvencom i identifikovanjem aminokiselinskog ostatka koji se poravnava sa određenom pozicijom u referentnoj sekvenci.

[0061] Izraz Xnnn treba da označava aminokiselinski ostatak X koji se nalazi na poziciji koja odgovara poziciji nnn u HSA, a izraz XnnnY treba da znači supstituciju bilo koje aminokiseline X koja se nalazi na poziciji koja odgovara poziciji nnn u HSA aminokiselinskim ostatkom Y.

[0062] Kako se ovde koristi, termin „afinitet“ odnosi se na meru jačine vezivanja između dva člana vezujućeg para, na primer, imunoglobulina i FcRn. K<d>je konstanta disocijacije i ima jedinice molarnosti. Konstanta afiniteta je inverzna vrednost konstante disocijacije. Konstanta afiniteta se ponekad koristi kao generički termin za opisivanje ovog hemijskog entiteta. On predstavlja direktnu meru energije vezivanja. Prirodni logaritam K je linearno povezan sa Gibsovom slobodnom energijom vezivanja preko jednačine ΔG<0>= -RT LN(K) gde je R = gasna konstanta, a temperatura je u stepenima Kelvina. Afinitet se može eksperimentalno odrediti, na primer površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) korišćenjem komercijalno dostupnih Biacore SPR jedinica (GE Healthcare).

[0063] Kako se ovde koristi, izraz „pod takvim uslovima, da navedeni subjekt generiše imuni odgovor“ odnosi se na bilo koju kvalitativnu ili kvantitativnu indukciju, stvaranje i/ili stimulaciju imunog odgovora (npr. urođenog ili stečenog).

[0064] [0035] Kako se ovde koristi, termin „imuni odgovor“ odnosi se na odgovor imunog sistema subjekta. Na primer, imuni odgovori uključuju, ali nisu ograničeni na, detektabilnu promenu (npr. povećanje) aktivacije Toll receptora, ekspresiju i/ili sekreciju limfokina (npr. citokina (poput citokina tipa Th1 ili Th2) ili hemokina), aktivaciju makrofaga, aktivaciju dendritičnih ćelija, aktivaciju T ćelija (npr. CD4+ ili CD8+ T ćelije), aktivaciju NK ćelija i/ili aktivaciju B ćelija (npr. stvaranje i/ili sekrecija antitela). Dodatni primeri imunih odgovora uključuju vezivanje imunogena (npr. antigena (npr. imunogenog polipeptida)) za MHC molekul i indukovanje citotoksičnog T limfocitnog („CTL“) odgovora, indukovanje B ćelijskog odgovora (npr. proizvodnja antitela) i/ili odgovora T-pomoćnih limfocita, i/ili odgovora preosetljivosti odloženog tipa (DTH) protiv antigena iz kojeg je imunogeni polipeptid izveden, širenje (npr. rast populacije ćelija) ćelija imunog sistema (npr. T ćelije, B ćelije (npr. bilo koje faze razvoja (poput plazma ćelija) i povećanu obradu i prezentaciju antigena od strane antigenprezentujućih ćelija. Imuni odgovor može da se razvije na imunogene koje imuni sistem subjekta prepoznaje kao strane (npr. ne-sopstveni antigeni iz mikroorganizama (poput patogena) ili sopstveni antigeni prepoznati kao strani). Stoga, treba razumeti da se, kako se ovde koristi, „imuni odgovor“ odnosi na bilo koju vrstu imunog odgovora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, urođene imune odgovore (npr. aktivacija kaskade signalizacije Toll receptora), ćelijski posredovane imune odgovore (npr. odgovori posredovani T ćelijama (poput antigen-specifičnih T ćelija) i nespecifičnim ćelijama imunog sistema) i humoralne imune odgovore (poput odgovora posredovanih B ćelijama (npr. putem stvaranja i sekrecije antitela u plazmu, limfu i/ili tkivne tečnosti). Termin „imuni odgovor“ treba da obuhvati sve aspekte sposobnosti imunog sistema subjekta da reaguje na antigene i/ili imunogene (npr. i početni odgovor na imunogen (npr. patogen), kao i stečene (npr. memorijske) odgovore koji su rezultat adaptivnog imunog odgovora).

[0065] Kako se ovde koristi, termin „imunitet“ se odnosi na zaštitu od bolesti (npr. sprečavanje ili ublažavanje (npr. suzbijanje) znaka, simptoma ili stanja bolesti) nakon izlaganja mikroorganizmu (npr. patogenu) sposobnom da izazove bolest. Imunitet može da bude urođen (npr. neadaptivni (tj. nestečeni) imuni odgovori koji postoje u odsustvu prethodnog izlaganja antigenu) i/ili stečen (npr. imuni odgovori koji su posredovani B i T ćelijama nakon prethodnog izlaganja antigenu (npr. koji pokazuju povećanu specifičnost i reaktivnost na antigen)).

[0066] Kako se ovde koristi, termin „imunogen“ se odnosi na agens (npr. mikroorganizam (poput bakterija, virusa ili gljivica) i/ili njegov deo ili komponentu (npr. proteinski antigen)) koji je sposoban da izazove imuni odgovor kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, imunogeni izazivaju imunitet protiv imunogena (npr. mikroorganizma (poput patogena ili patogenog proizvoda)).

[0067] [0038] Termin „ispitivano jedinjenje“ odnosi se na bilo koji hemijski entitet, farmaceutski proizvod, lek i slično koji može da se koristi za lečenje ili sprečavanje bolesti, oboljenja, tegoba ili poremećaja telesne funkcije, ili na drugi način menja fiziološki ili ćelijski status uzorka. Ispitivana jedinjenja obuhvataju i poznata i potencijalna terapijska jedinjenja. Za ispitivano jedinjenje može da se utvrdi da je terapijsko skriningom korišćenjem postupaka skrininga prema ovom pronalasku. „Poznato terapijsko jedinjenje“ odnosi se na terapijsko jedinjenje za koje je pokazano (npr. kroz ispitivanja na životinjama ili prethodno iskustvo sa primenom na ljudima) da je efikasno u takvom lečenju ili prevenciji.

[0068] Termin „uzorak“, kako se ovde koristi, koristi se u svom najširem smislu. Kako se ovde koristi, termin „uzorak“ se koristi u svom najširem smislu. U jednom smislu, može se odnositi na uzorak tkiva. U drugom smislu, podrazumeva se da uključuje uzorak ili kulturu dobijenu iz bilo kog izvora, kao i biološke. Biološki uzorci mogu se dobiti od životinja (uključujući ljude) i obuhvataju tečnosti, čvrste materije, tkiva i gasove. Biološki uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na, krvne proizvode, kao što su plazma, serum i slično. Uzorak za koji se sumnja da sadrži humani hromozom ili sekvence povezane sa humanim hromozomom može da sadrži ćeliju, hromozome izolovane iz ćelije (npr. razmaz metafaznih hromozoma), genomsku DNK (u rastvoru ili vezanu za čvrsti nosač kao što je za Southern blot analizu), RNK (u rastvoru ili vezanu za čvrsti nosač kao što je za Northern blot analizu), cDNA (u rastvoru ili vezanu za čvrsti nosač) i slično. Uzorak za koji se sumnja da sadrži protein može da sadrži ćeliju, deo tkiva, ekstrakt koji sadrži jedan ili više proteina i slično.

[0069] Kako se ovde koristi, termin „afinitet“ odnosi se na meru jačine vezivanja između dva člana vezujućeg para, na primer, imunoglobulina i FcRn. K<d>je konstanta disocijacije i ima jedinice molarnosti. Konstanta afiniteta je inverzna vrednost konstante disocijacije. Konstanta afiniteta se ponekad koristi kao generički termin za opisivanje ovog hemijskog entiteta. On predstavlja direktnu meru energije vezivanja. Prirodni logaritam K je linearno povezan sa Gibsovom slobodnom energijom vezivanja preko jednačine ΔG<0>= -RT LN(K) gde je R = gasna konstanta, a temperatura je u stepenima Kelvina. Afinitet se može eksperimentalno odrediti, na primer površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) korišćenjem komercijalno dostupnih Biacore SPR jedinica (GE Healthcare).

[0070] Kako se ovde koristi, izraz „pod takvim uslovima, da navedeni subjekt generiše imuni odgovor“ odnosi se na bilo koju kvalitativnu ili kvantitativnu indukciju, stvaranje i/ili stimulaciju imunog odgovora (npr. urođenog ili stečenog).

[0071] [0042] Kako se ovde koristi, termin „imuni odgovor“ odnosi se na odgovor imunog sistema subjekta. Na primer, imuni odgovori uključuju, ali nisu ograničeni na, detektabilnu promenu (npr. povećanje) aktivacije Toll receptora, ekspresiju i/ili sekreciju limfokina (npr. citokina (poput citokina tipa Th1 ili Th2) ili hemokina), aktivaciju makrofaga, aktivaciju dendritičnih ćelija, aktivaciju T ćelija (npr. CD4+ ili CD8 T ćelije), aktivaciju NK ćelija i/ili aktivaciju B ćelija (npr. stvaranje i/ili sekrecija antitela). Dodatni primeri imunih odgovora uključuju vezivanje imunogena (npr. antigena (npr. imunogenog polipeptida)) za MHC molekul i indukovanje citotoksičnog T limfocitnog („CTL“) odgovora, indukovanje B ćelijskog odgovora (npr. proizvodnja antitela) i/ili odgovora T-pomoćnih limfocita, i/ili odgovora preosetljivosti odloženog tipa (DTH) protiv antigena iz kojeg je imunogeni polipeptid izveden, širenje (npr. rast populacije ćelija) ćelija imunog sistema (npr. T ćelije, B ćelije (npr. bilo koje faze razvoja (poput plazma ćelija) i povećanu obradu i prezentaciju antigena od strane antigenprezentujućih ćelija. Imuni odgovor može da se razvije na imunogene koje imuni sistem subjekta prepoznaje kao strane (npr. ne-sopstveni antigeni iz mikroorganizama (poput patogena) ili sopstveni antigeni prepoznati kao strani). Stoga, treba razumeti da se, kako se ovde koristi, „imuni odgovor“ odnosi na bilo koju vrstu imunog odgovora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, urođene imune odgovore (npr. aktivacija kaskade signalizacije Toll receptora), ćelijski posredovane imune odgovore (npr. odgovori posredovani T ćelijama (poput antigen-specifičnih T ćelija) i nespecifičnim ćelijama imunog sistema) i humoralne imune odgovore (poput odgovora posredovanih B ćelijama (npr. putem stvaranja i sekrecije antitela u plazmu, limfu i/ili tkivne tečnosti). Termin „imuni odgovor“ treba da obuhvati sve aspekte sposobnosti imunog sistema subjekta da reaguje na antigene i/ili imunogene (npr. i početni odgovor na imunogen (npr. patogen), kao i stečene (npr. memorijske) odgovore koji su rezultat adaptivnog imunog odgovora).

[0072] Kako se ovde koristi, termin „imunitet“ se odnosi na zaštitu od bolesti (npr. sprečavanje ili ublažavanje (npr. suzbijanje) znaka, simptoma ili stanja bolesti) nakon izlaganja mikroorganizmu (npr. patogenu) sposobnom da izazove bolest. Imunitet može da bude urođen (npr. neadaptivni (tj. nestečeni) imuni odgovori koji postoje u odsustvu prethodnog izlaganja antigenu) i/ili stečen (npr. imuni odgovori koji su posredovani B i T ćelijama nakon prethodnog izlaganja antigenu (npr. koji pokazuju povećanu specifičnost i reaktivnost na antigen)).

[0073] Kako se ovde koristi, termin „imunogen“ se odnosi na agens (npr. mikroorganizam (poput bakterija, virusa ili gljivica) i/ili njegov deo ili komponentu (npr. proteinski antigen)) koji je sposoban da izazove imuni odgovor kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, imunogeni izazivaju imunitet protiv imunogena (npr. mikroorganizma (poput patogena ili patogenog proizvoda)).

[0075] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0077] Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije koje sadrže imunoglobulin i na imunoglobuline za upotrebu u postupcima za terapiju posredovanu antitelima, kako je definisano u zahtevima. Posebno, ovde su obezbeđeni imunoglobulini dobijeni genetskim inženjeringom sa izmenjenim poluživotom.

[0078] [0046] Molekul imunoglobulina je sačinjen od dva identična teška i dva identična laka polipeptidna lanca, koji su povezani međulančanim disulfidnim vezama. Svaki pojedinačni laki i teški lanac se savija u regione od oko 110 aminokiselina, zauzimajući konzerviranu trodimenzionalnu konformaciju. Laki lanac sadrži jedan varijabilni region (nazvan VL) i jedan konstantni region (CL), dok teški lanac sadrži jedan varijabilni region (VH) i tri konstantna regiona (CH1, CH2 i CH3). Parovi regiona se udružuju i formiraju diskretne strukture. Konkretno, varijabilni regioni lakog i teškog lanca, VL i VH, udružuju se i formiraju „FV“ područje koje sadrži antigen-vezujuće mesto.

[0079] Varijabilni regioni i teških i lakih lanaca pokazuju značajnu varijabilnost u strukturi i sastavu aminokiselina od jednog molekula antitela do drugog, dok konstantni regioni pokazuju malu varijabilnost. Svako antitelo prepoznaje i vezuje antigen preko mesta vezivanja definisanog povezivanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca u FV oblast. Varijabilni region lakog lanca VL i varijabilni region teškog lanca VH određenog molekula antitela imaju specifične sekvence aminokiselina koje omogućavaju antigen-vezujućem mestu da preuzme konformaciju koja se vezuje za antigenski epitop koji prepoznaje to određeno antitelo.

[0080] Unutar varijabilnih regiona nalaze se regioni u kojima je aminokiselinska sekvenca izuzetno varijabilna među antitelima. Tri od ovih takozvanih „hipervarijabilnih“ regiona ili „regiona koji određuju komplementarnost“ (CDR) nalaze se u svakom od lakog i teškog lanca. Tri CDR iz lakog lanca i tri CDR iz odgovarajućeg teškog lanca formiraju antigen-vezujuće mesto.

[0081] Aminokiselinske sekvence mnogih teških i lakih lanaca imunoglobulina su određene i otkrivaju dve važne karakteristike molekula antitela. Prvo, svaki lanac se sastoji od niza sličnih, iako ne identičnih, sekvenci, svaka dužine oko 110 aminokiselina. Svako od ovih ponavljanja odgovara diskretnom, kompaktno presavijenom regionu proteinske strukture poznatom kao proteinski domen. Laki lanac je sačinjen od dva takva imunoglobulinska domena, dok teški lanac IgG antitela sadrži četiri.

[0082] Druga važna karakteristika otkrivena poređenjem aminokiselinskih sekvenci jeste da se aminoterminalne sekvence i teškog i lakog lanca značajno razlikuju između različitih antitela. Varijabilnost u sekvenci je ograničena na približno prvih 110 aminokiselina, što odgovara prvom domenu, dok su preostali domeni konstantni između imunoglobulinskih lanaca istog izotipa. Amino-terminalni varijabilni ili V domeni teškog i lakog lanca (V<H>, odnosno V<L>) zajedno čine V region antitela i daju mu sposobnost vezivanja za specifični antigen, dok konstantni domeni (C domeni) teškog i lakog lanca (C<H>, odnosno C<L>) čine C region. Višestruki C domeni teškog lanca su numerisani od aminoterminalnog kraja ka karboksi kraju, na primer C<H>1, C<H>2 i tako dalje.

[0083] [0051] Gore opisani proteinski domeni se udružuju i formiraju veće globularne domene. Dakle, kada je potpuno presavijen i sastavljen, molekul antitela se sastoji od tri globularna dela jednake veličine spojena fleksibilnim nizom polipeptidnog lanca poznatim kao region zgloba. Svaki krak ove strukture u obliku slova Y formiran je povezivanjem lakog lanca sa amino-terminalnom polovinom teškog lanca, dok je stablo slova Y formirano uparivanjem karboksi-terminalnih polovina dva teška lanca. Povezivanje teškog i lakog lanca je takvo da su domeni V<H>i V<L>upareni, kao što su i domeni C<H>1 i C<L>. Domeni C<H>3 se uparuju jedni sa drugima, ali domeni C<H>2 ne interaguju; bočni lanci ugljenih hidrata vezani za C<H>2 domene se nalaze između dva teška lanca. Dva antigen-vezujuća mesta formiraju upareni V<H>i V<L>domeni na krajevima dva kraka Y.

[0084] Proteolitički enzimi (proteaze) koji cepaju polipeptidne sekvence korišćeni su za analizu strukture molekula antitela i za određivanje delova molekula koji su odgovorni za njegove različite funkcije. Ograničena digestija proteazom papainom cepa molekule antitela na tri fragmenta. Dva fragmenta su identična i sadrže aktivnost vezivanja antigena. Oni se nazivaju Fab fragmenti, odnosno fragmenti koji vezuju antigen. Fab fragmenti odgovaraju dvama identičnim kracima molekula antitela, koji sadrže kompletne lake lance uparene sa V<H>i C<H>1 domenima teških lanaca. Drugi fragment ne sadrži aktivnost vezivanja antigena, ali je prvobitno primećeno da lako kristališe, pa je zbog toga nazvan Fc fragment, što znači „fragment koji kristališe“. Ovaj fragment odgovara uparenim C<H>2 i C<H>3 domenima i deo je molekula antitela koji interaguje sa efektorskim molekulima i ćelijama. Funkcionalne razlike između izotipova teškog lanca leže uglavnom u Fc fragmentu. Region zgloba koji povezuje Fc i Fab delove molekula antitela je u stvarnosti fleksibilna veza, koja omogućava nezavisno kretanje dva Fab kraka, a ne kruti zglob. Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije i postupke za imunitet posredovan antitelima usmeren na viruse. Konkretno, ovde su obezbeđeni imunoglobulini dobijeni genetskim inženjeringom sa antivirusnom aktivnošću.

[0085] Predmetni pronalazak obezbeđuje mutantne imunoglobuline koji imaju mutacije definisane u zahtevima. Predmetni pronalazak obezbeđuje varijantu imunoglobulina koji je humani IgG1-Q311R/N434W/M428E za modulaciju vezivanja FcRN kako bi se povećao poluživot antitela in vivo. Povećani poluživot predstavlja prednost za terapijska antitela.

[0086] [0054] Imunoglobulin ovog pronalaska pokazuje izmenjeno vezivanje (npr. povećan ili smanjen afinitet vezivanja) za FcRN u odnosu na imunoglobulin bez mutacija. Imunoglobulin ovog pronalaska je podklasa IgG1. Imunoglobulin ovog pronalaska ima mutacije na pozicijama 311, 428 i 434, numerisane po Kabat sistemu. U ovom otkriću, poziva se na sistem numerisanja Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) i (1991). U ovim zbirkama, Kabat navodi mnoge aminokiselinske sekvence za antitela za svaku podklasu i navodi najčešće prisutnu aminokiselinu za svaku poziciju ostatka u toj podklasi. Kabat koristi metod za dodeljivanje broja ostatka svakoj aminokiselini u navedenoj sekvenci, i ovaj metod za dodeljivanje brojeva ostataka postao je standard u ovoj oblasti. U ovom opisu se prati Kabat šema numeracije. Za potrebe ovog pronalaska, da bi se dodelili brojevi ostataka aminokiselinskoj sekvenci antitela-kandidata koja nije uključena u Kabat zbirku, prate se sledeći koraci. Generalno, sekvencakandidat se poravnava sa bilo kojim imunoglobulinskom sekvencom ili bilo kojom konsenzusnom sekvencom prema Kabatu. Poravnanje se može obaviti ručno ili pomoću računara korišćenjem opšteprihvaćenih računarskih programa; primer takvog programa je program Align 2. Poravnanje se može olakšati korišćenjem nekih aminokiselinskih ostataka koji su zajednički za većinu Fab sekvenci. Na primer, laki i teški lanac obično imaju po dva cisteina koji imaju iste brojeve ostataka; u V<L>domenu dva cisteina su tipično na ostacima broj 23 i 88, a u V<H>domenu, dva cisteinska ostatka su tipično numerisana brojevima 22 i 92. Ostaci okvirnog regiona obično, ali ne uvek, imaju približno isti broj ostataka, međutim, CDR regioni će varirati u veličini. Na primer, u slučaju CDR u sekvenci-kandidatu koji je duži od CDR u sekvenci prema Kabatu sa kojim je poravnat, obično se broju ostatka dodaju sufiksi da bi se naznačilo umetanje dodatnih ostataka. Kod sekvenci-kandidata koje su, na primer, poravnate sa Kabat sekvencom za ostatke 34 i 36, ali između njih nema ostatka za poravnanje sa ostatkom 35, broj 35 se jednostavno ne dodeljuje ostatku.

[0087] Ovde su opisane varijante konstantnog lanca (npr. Fc). Imunoglobulini opisani ovde nisu ograničeni na određene CDR ili sekvence varijabilnog regiona i mogu da budu generisani ili dobijeni genetskim inženjeringom tako da prepoznaju bilo koji željeni antigen ili epitop. Mutacija je IgG1-Q311R/N434W/M428E (npr. konstantni region imunoglobulina ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 2 ili 7). Prema pronalasku, imunoglobulin ima mutacije Q311R, N434W i M428E.

[0088] Gore opisane mutacije mogu da se uvedu u bilo koji odgovarajući molekul imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, imunoglobulin je monoklonsko antitelo i poželjno je proizveden rekombinantnim tehnikama.

[0089] Monoklonska antitela protiv ciljnih antigena (npr. proteina na površini ćelije, kao što su receptori) proizvode se različitim tehnikama, uključujući konvencionalne metodologije monoklonskih antitela kao što su tehnike hibridizacije somatskih ćelija prema Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975). Iako su u nekim primerima izvođenja poželjni postupci hibridizacije somatskih ćelija, razmatraju se i druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela (npr. virusna ili onkogena transformacija B limfocita). Poželjni životinjski sistem za pripremu hibridoma je mišji sistem.

[0090] Proizvodnja hibridoma kod miša je dobro uspostavljena procedura. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u struci. Fuzioni partneri (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i postupci fuzije su takođe poznati. Humana monoklonska antitela (mAb) usmerena protiv humanih proteina mogu da se generišu korišćenjem transgenih miševa koji nose kompletan humani imuni sistem umesto mišjeg sistema. Splenociti iz transgenih miševa se imunizuju antigenom od interesa, koji se koristi za proizvodnju hibridoma koji luče humana mAb sa specifičnim afinitetom za epitope iz humanog proteina. (Videti npr. Wood et al., WO 91/00906, Kucherlapati et al., WO 91/10741; Lonberg et al., WO 92/03918; Kay et al., WO 92/03917; N. Lonberg et al., Nature, 368:856‑859 [1994]; L.L. Green et al., Nature Genet., 7:13‑21 [1994]; S.L. Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851‑6855 [1994]; Bruggeman et al., Immunol., 7:33‑40 [1993]; Tuaillon et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90:3720‑3724 [1993]; i Bruggernan et al. Eur. J. Immunol., 21:1323‑1326 [1991]).

[0091] Monoklonska antitela se takođe mogu generisati drugim postupcima poznatim stručnjacima u oblasti tehnologije rekombinantne DNK. Alternativni postupak, nazvan postupkom „kombinatornog prikaza antitela“, razvijen je za identifikaciju i izolaciju fragmenata antitela koji imaju određenu antigensku specifičnost i može da se koristi za proizvodnju monoklonskih antitela. (Videti npr. Sastry et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:5728 [1989]; Huse et al., Science, 246:1275 [1989]; i Orlandi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:3833 [1989]). Nakon imunizacije životinje imunogenom kao što je gore opisano, repertoar antitela rezultujućeg B-ćelijskog fonda se klonira. Uopšteno su poznati postupci za dobijanje DNK sekvence varijabilnih regiona raznovrsne populacije molekula imunoglobulina korišćenjem mešavine oligomernih prajmera i PCR tehnike. Na primer, mešoviti oligonukleotidni prajmeri koji odgovaraju 5' liderskim (signalni peptid) sekvencama i/ili sekvencama okvira 1 (FR1), kao i prajmer za konzervirani 3' konstantni region, mogu da se koriste za PCR amplifikaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca iz brojnih mišjih antitela. (Videti npr. Larrick et al., Biotechniques, 11:152‑156 [1991]). Slična strategija takođe može da se koristi za amplifikaciju varijabilnih regiona humanih teških i lakih lanaca iz humanih antitela (Videti npr. Larrick et al., Methods: Companion to Methods in Enzymology, 2:106‑110 [1991]).

[0092] [0060] Himerna monoklonska antitela miša i čoveka mogu da se proizvedu tehnikama rekombinantne DNK poznatim u struci. Na primer, gen koji kodira Fc konstantni region molekula monoklonskog antitela miša (ili druge vrste) se digestira restrikcionim enzimima da bi se uklonio region koji kodira mišji Fc, a ekvivalentni deo gena koji kodira humani Fc konstantni region se zamenjuje. (Videti npr. Robinson et al., WO 87/02671; Evropska patentna prijava EP 0 184 187; Evropska patentna prijava EP 0 171 496; Evropska patentna prijava EP 0 173 494; WO 86/01533; US 4,816,567; Evropska patentna prijava EP 0 125 023; Better et al., Science, 240:1041‑1043 [1988]; Liu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:3439‑3443 [1987]; Liu et al., J. Immunol., 139:3521‑3526 [1987]; Sun et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:214‑218 [1987]; Nishimura et al., Canc. Res., 47:999‑1005 [1987]; Wood et al., Nature, 314:446‑449 [1985]; i Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:1553‑1559 [1988]). Himerno antitelo može dalje da se humanizuje zamenom sekvenci varijabilnog regiona Fv koje nisu direktno uključene u vezivanje antigena ekvivalentnim sekvencama iz humanih varijabilnih regiona Fv. Opšti pregledi humanizovanih himernih antitela dati su u S.L. Morrison, Science, 229:1202‑1207 (1985) and by Oi et al., Bio. Techniques, 4:214 (1986). Ti postupci uključuju izolovanje, manipulaciju i ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve ili deo varijabilnih regiona Fv imunoglobulina iz najmanje jednog teškog ili lakog lanca. Izvori takve nukleinske kiseline su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i, na primer, mogu se dobiti iz 7E3, hibridoma koji proizvodi anti-GPIIbIIIa antitelo. Rekombinantna DNK koja kodira himerno antitelo, ili njegov fragment, može zatim da se klonira u odgovarajući vektor ekspresije.

[0093] Pogodna humanizovana antitela mogu alternativno da se proizvedu supstitucijom CDR (npr. US 5,225,539; Jones et al., Nature, 321:552‑525 [1986]; Verhoeyan et al., Science, 239:1534 [1988]; and Beidler et al., J. Immunol., 141:4053 [1988]). Svi CDR regioni određenog humanog antitela mogu da budu zamenjeni barem delom nehumanog CDR ili samo neki od CDR mogu da budu zamenjeni nehumanim CDR regionima. Potrebno je zameniti samo onaj broj CDR koji je potreban za vezivanje humanizovanog antitela za Fc receptor.

[0094] Antitelo može da bude humanizovano bilo kojim postupkom koji može da zameni barem deo CDR humanog antitela CDR regionom koji potiče iz nehumanog antitela. Humani CDR mogu da budu zamenjeni nehumanim CDR regionima; korišćenjem mesto-usmerene mutageneze oligonukleotida.

[0095] Ovde su takođe opisana himerna i humanizovana antitela u kojima su specifične aminokiseline supstituisane, deletirane ili adirane. Posebno, poželjna humanizovana antitela imaju supstitucije aminokiselina u regionu okvira, na primer za poboljšanje vezivanja antigena. Na primer, u humanizovanom antitelu koje ima mišje CDR, aminokiseline koje se nalaze u humanom regionu okvira mogu da se zamene aminokiselinama koje se nalaze na odgovarajućim pozicijama u mišjem antitelu. Poznato je da takve supstitucije u nekim slučajevima poboljšavaju vezivanje humanizovanih antitela za antigen.

[0096] U poželjnim primerima izvođenja, imunoglobulin je rekombinantno antitelo (npr. himerno ili humanizovano antitelo), podjedinica ili njen antigen-vezujući fragment (npr. ima varijabilni region ili barem region koji određuje komplementarnost (CDR)). U nekim primerima izvođenja, imunoglobulin je monovalentan (npr. uključuje jedan par teških i lakih lanaca ili njihovih antigen-vezujućih delova). U drugim primerima izvođenja, imunoglobulin je dvovalentan (npr. uključuje dva para teških i lakih lanaca ili njihovih antigen-vezujućih delova).

[0097] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije vakcine koje sadrže varijantu imunoglobulina ili njegovu Fc fuziju i imunogen. Ovaj pronalazak nije ograničen posebnom formulacijom kompozicije vakcine. Zaista, kompozicija vakcine ovog pronalaska može da sadrži jedan ili više različitih agenasa pored fuzionog proteina. Ovi agensi ili kofaktori uključuju, ali nisu ograničeni na, adjuvanse, surfaktante, aditive, pufere, solubilizatore, helatore, ulja, soli, terapijske agense, lekove, bioaktivne agense, antibakterijske i antimikrobne agense (npr. antibiotike, antivirusne agense itd.). U nekim primerima izvođenja, kompozicija vakcine koja sadrži fuzioni protein sadrži agens i/ili kofaktor koji poboljšavaju sposobnost imunogena da indukuje imuni odgovor (npr. adjuvans). U nekim poželjnim primerima izvođenja, prisustvo jednog ili više kofaktora ili agenasa smanjuje količinu imunogena potrebnu za indukovanje imunog odgovora (npr. zaštitnog imunog odgovora (npr. zaštitne imunizacije)). U nekim primerima izvođenja, prisustvo jednog ili više kofaktora ili agenasa može da se koristi za usmeravanje imunog odgovora ka ćelijskom (npr. posredovanom T ćelijama) ili humoralnom (npr. posredovanom antitelima) imunom odgovoru. Predmetni pronalazak nije ograničen vrstom kofaktora ili agensa koji se koristi u terapijskom agensu ovog pronalaska.

[0098] Adjuvansi su generalno opisani u knjizi Vaccine Design--the Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995. Predmetni pronalazak nije ograničen vrstom korišćenog adjuvansa (npr. za upotrebu u kompoziciji (poput farmaceutske kompozicije). Na primer, u nekim primerima izvođenja, pogodni adjuvansi uključuju aluminijumsku so kao što je aluminijum hidroksid gel (stipsa) ili aluminijum fosfat. U nekim primerima izvođenja, adjuvans može da bude so kalcijuma, gvožđa ili cinka, ili može da bude nerastvorljiva suspenzija aciliranog tirozina ili aciliranih šećera, katjonski ili anjonski derivatizovanih polisaharida ili polifosfazena.

[0099] [0067] Generalno, imuni odgovor na antigen se generiše interakcijom antigena sa ćelijama imunog sistema. Imuni odgovori mogu grubo da se podele u dve kategorije: humoralni i ćelijski posredovani imuni odgovori (npr. tradicionalno okarakterisani mehanizmima zaštite antitelima, odnosno ćelijskim efektorskim mehanizmima zaštite). Ove kategorije odgovora su nazvane Th1-tip odgovora (ćelijski posredovan odgovor) i Th2-tip imunih odgovora (humoralni odgovor).

[0100] Stimulacija imunog odgovora može da bude rezultat direktnog ili indirektnog odgovora ćelije ili komponente imunog sistema na intervenciju (npr. izlaganje imunogenu). Imuni odgovori mogu da se mere na mnogo načina, uključujući aktivaciju, proliferaciju ili diferencijaciju ćelija imunog sistema (npr. B ćelije, T ćelije, dendritične ćelije, APC ćelije, makrofage, NK ćelije, NKT ćelije itd.); povećanu ili smanjenu ekspresiju markera i citokina; stimulaciju titra IgA, IgM ili IgG; splenomegaliju (uključujući povećanu celularnost slezine); hiperplaziju i mešovite ćelijske infiltrate u različitim organima. Drugi odgovori, ćelije i komponente imunog sistema koje se mogu proceniti u odnosu na imunološku stimulaciju poznate su u struci.

[0101] U nekim primerima izvođenja, kompozicije ovog pronalaska indukuju ekspresiju i sekreciju citokina (npr. makrofagima, dendritičnim ćelijama i CD4+ T ćelijama). Modulacija ekspresije određenog citokina može se desiti lokalno ili sistemski. Poznato je da profili citokina mogu da odrede regulatorne i efektorske funkcije T ćelija u imunim odgovorima. U nekim primerima izvođenja, citokini tipa Th1 mogu da budu indukovani, i stoga, imunostimulatorne kompozicije ovog pronalaska mogu da podstaknu antigen-specifični imuni odgovor tipa Th1, uključujući citotoksične T ćelije (npr. čime se izbegavaju neželjeni imuni odgovori tipa Th2 (npr. stvaranje citokina tipa Th2 (poput IL-13) koji učestvuju u pogoršanju težine bolesti (npr. indukcija stvaranja sluzi dejstvom IL-13))).

[0102] Citokini igraju ulogu u usmeravanju odgovora T ćelija. Pomoćne (CD4+) T ćelije usmeravaju imuni odgovor sisara kroz proizvodnju rastvorljivih faktora koji deluju na druge ćelije imunog sistema, uključujući B ćelije i druge T ćelije. Većina zrelih CD4+ T pomoćnih ćelija eksprimira jedan od dva profila citokina: Th1 ili Th2. CD4+ T ćelije tipa Th1 luče IL-2, IL -3, IFN-γ, GM-CSF i visoke nivoe TNF-α. Th2 ćelije eksprimiraju IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF i niske nivoe TNF-α. Citokini tipa Th1 podstiču i ćelijski posredovan imunitet i humoralni imunitet koji se karakteriše prebacivanjem klase imunoglobulina na IgG2a kod miševa i IgG1 kod ljudi. Th1 odgovori takođe mogu da budu povezani sa preosetljivošću odloženog tipa i autoimunim bolestima. Citokini tipa Th2 indukuju prvenstveno humoralni imunitet i indukuju prebacivanje klase na IgG1 i IgE. Izotipovi antitela povezani sa Th1 odgovorima generalno imaju neutrališuće i opsonizujuće sposobnosti, dok su oni povezani sa Th2 odgovorima više povezani sa alergijskim odgovorima.

[0103] Pokazano je da nekoliko faktora utiče na pomeranje imunog odgovora ka Th1 ili Th2 tipu odgovora. Najbolje okarakterisani regulatori su citokini. IL -12 i IFN-γ su pozitivni Th1 i negativni Th2 regulatori. IL-12 podstiče proizvodnju IFN-γ, a IFN-γ stvara pozitivnu povratnu spregu za IL-12.

[0104] Izgleda da su IL-4 i IL-10 značajni za uspostavljanje Th2 citokinskog profila i za smanjenje proizvodnje Th1 citokina.

[0105] Dakle, ovde je opisan postupak stimulisanja imunog odgovora tipa Th1 kod subjekta koji obuhvata davanje subjektu kompozicije koja sadrži imunogen. Dalje je ovde opisan postupak stimulisanja imunog odgovora tipa Th2 kod subjekta (npr. ako je potrebno uravnotežiti odgovor posredovan T ćelijama) koji obuhvata davanje subjektu kompozicije koja sadrži imunogen. Adjuvansi mogu da se koriste (npr. mogu da se primenjuju istovremeno sa kompozicijom ovog pronalaska) da bi se usmerio imuni odgovor ka imunom odgovoru tipa Th1 ili Th2. Na primer, adjuvansi koji indukuju Th2 ili slabe Th1 odgovore uključuju, ali nisu ograničeni na, stipsu, saponine i SB-As4. Adjuvansi koji indukuju Th1 odgovore uključuju, ali nisu ograničeni na MPL, MDP, ISCOMS, IL-12, IFN-γ i SB-AS2.

[0106] Nekoliko drugih tipova imunogena tipa Th1 može se koristiti (npr. kao adjuvans) u ovde opisanim kompozicijama i postupcima. To uključuje, ali nije ograničeno na, sledeće. U nekim primerima izvođenja, koristi se monofosforil lipid A (npr. posebno 3-de-O-acilovani monofosforil lipid A (3D-MPL)).3D-MPL je dobro poznati adjuvans koji proizvodi Ribi Immunochem, Montana. Hemijski se često isporučuje kao smeša 3-de-O-aciliranog monofosforil lipida A sa 4, 5 ili 6 acilovanih lanaca. U nekim primerima izvođenja, koriste se difosforil lipid A i njegove 3-O-deacilovane varijante. Svaki od ovih imunogena može da se prečisti i pripremi postupcima opisanim u GB 2122204B. Opisani su i drugi prečišćeni i sintetički lipopolisaharidi (videti, npr. SAD pat. br. 6,005,099 i EP 0 729 473; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392‑6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141‑6; i EP 0549074). U nekim primerima izvođenja, 3D-MPL se koristi u obliku čestične formulacije (npr. sa malom veličinom čestica manjom od 0,2 µm u prečniku, kao što je opisano u EP 0689 454).

[0107] U nekim primerima izvođenja, saponini se koriste kao imunogen (npr. adjuvans tipa Th1) u kompoziciji ovog pronalaska. Saponini su dobro poznati adjuvansi (videti, npr. Lacaille-Dubois and Wagner (1996) Phytomedicine vol 2 pp 363‑386). Primeri saponina uključuju Quil A (dobijen iz kore južnoameričkog drveta Quillaja Saponaria Molina) i njegove frakcije (videti, npr. SAD pat. br.

[0108] 5,057,540; Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1‑2):1‑55; i EP 0362 279). Takođe se smatra da su korisni hemolitički saponini QS7, QS17 i QS21 (frakcije Quil A prečišćene pomoću HPLC; videti, npr. Kensil et al. (1991). J. Immunology 146,431‑437, SAD pat. br.5,057,540; WO 96/33739; WO 96/11711 i EP 0 362 279). Takođe se smatra da su korisne kombinacije QS21 i polisorbata ili ciklodekstrina (videti, npr. WO 99/10008).

[0109] U nekim primerima izvođenja, imunogeni oligonukleotid koji sadrži nemetilovane dinukleotide CpG („CpG“) se koristi kao adjuvans. CpG je skraćenica za motive dinukleotida citozinguanozin prisutne u DNK. CpG je poznat u struci kao adjuvans kada se primenjuje sistemskim, kao i mukoznim putem (videti, npr. WO 96/02555, EP 0 468 520, Davis et al., J.Immunol, 1998, 160(2):870‑876; McCluskie and Davis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463‑6; i SAD pat. prijavu br.

[0110] 2005/0238660). Na primer, u nekim primerima izvođenja, imunostimulatorna sekvenca je purinpurin-C-G-pirimidin-pirimidin; pri čemu CG motiv nije metilovan.

[0111] U nekim ovde opisanim primerima izvođenja, prisustvo jednog ili više CpG oligonukleotida aktivira različite imunološke podskupove, uključujući ćelije prirodne ubice (koje proizvode IFN-γ) i makrofage. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidi CpG su formulisani u kompoziciju ovog pronalaska za indukovanje imunološkog odgovora. U nekim primerima izvođenja, slobodan rastvor CpG se primenjuje uporedo sa antigenom (npr. prisutnim u rastvoru (videti, npr. WO 96/02555). U nekim primerima izvođenja, oligonukleotid CpG je kovalentno konjugovan sa antigenom (videti, npr. WO 98/16247,), ili formulisan sa nosačem kao što je aluminijum hidroksid (videti, npr. Brazolot-Millan et al., Proc.Natl.AcadSci., USA, 1998, 95(26), 15553‑8).

[0112] U nekim primerima izvođenja, sa kompozicijom koja sadrži imunogen prema ovom pronalasku koriste se adjuvansi, kao što su kompletni Frojndov adjuvans i nepotpuni Frojndov adjuvans, citokini (npr. interleukini (poput IL-2, IFN-γ, IL-4, itd.), faktor koji stimuliše kolonije makrofaga, faktor nekroze tumora, itd.), detoksikovani mutanti bakterijskog ADP-ribozilacionog toksina kao što je toksin kolere (CT), toksin pertusisa (PT) ili termolabilni toksin E. coli (LT), posebno LT-K63 (gde je aminokiselina divljeg tipa na poziciji 63 supstituisana lizinom) LT-R72 (gde je aminokiselina divljeg tipa na poziciji 72 supstituisana argininom), CT-S109 (gde je aminokiselina divljeg tipa na poziciji 109 supstituisana serinom) i PT-K9/G129 (gde je aminokiselina divljeg tipa na poziciji 9 supstituisana lizinom i na poziciji 129 supstituisana glicinom) (videti, npr. WO93/13202 i WO92/19265), i druge imunogene supstance (npr. koje poboljšavaju efikasnost kompozicije ovog pronalaska).

[0113] Dodatni primeri adjuvanasa uključuju poli(di(karboksilatofenoksi)fosfazen (PCPP polimer; Institut za istraživanje virusa, SAD); derivate lipopolisaharida kao što su monofosforil lipid A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana), muramil dipeptid (MDP; Ribi) i treonilmuramil dipeptid (t-MDP; Ribi); OM-174 (glukozamin disaharid srodan lipidu A; OM Pharma SA, Seattle, Švajcarska); i faktor elongacije leišmanije (prečišćeni protein leišmanije; Corixa Corporation, Seattle, Vašington, SAD).

[0114] Adjuvansi mogu da se dodaju kompoziciji koja sadrži imunogen, ili adjuvans može da se formuliše sa nosačima, na primer lipozomima ili metalnim solima (npr. aluminijumskim solima (poput aluminijum hidroksida)) pre kombinovanja ili uporedne primene sa kompozicijom.

[0115] U nekim primerima izvođenja, kompozicija koja sadrži imunogen sadrži samo jedan adjuvans. U drugim primerima izvođenja, kompozicija sadrži dva ili više adjuvansa (videti, npr. WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241; i WO 94/00153).

[0116] U nekim primerima izvođenja, kompozicija koja sadrži imunogen sadrži jedan ili više mukoadheziva (videti, npr. SAD pat. prijavu br.20050281843). Predmetni pronalazak nije ograničen vrstom korišćenog mukoadheziva. Zaista, smatra se da su korisni različiti mukoadhezivi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, umrežene derivate poli(akrilne kiseline) (npr. karbopol i polikarbofil), polivinil alkohol, polivinil pirolidon, polisaharide (npr. alginat i hitozan), hidroksipropil metilcelulozu, lektine, fimbrijalne proteine i karboksimetilcelulozu. U nekim ovde opisanim primerima izvođenja, upotreba mukoadheziva (npr. u kompoziciji koja sadrži imunogen) pojačava indukciju imunog odgovora kod subjekta (npr. kod koga je primenjena kompozicija ovog pronalaska) zbog povećanja trajanja i/ili količine izlaganja imunogenu koju subjekt doživljava kada se koristi mukoadheziv u poređenju sa trajanjem i/ili količinom izlaganja imunogenu u odsustvu upotrebe mukoadheziva.

[0117] U nekim primerima izvođenja, imunoglobulinske i/ili kompozicije vakcine se koriste zajedno sa odgovarajućim solima i puferima kako bi se omogućila isporuka kompozicija subjektu. Puferi se takođe koriste kada se kompozicije unose u pacijenta. Vodene kompozicije sadrže efikasnu količinu kompozicije dispergovane u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenom medijumu. Takve kompozicije se takođe nazivaju inokulumima.

[0118] Fraza „farmaceutski ili farmakološki prihvatljiv“ odnosi se na molekulske entitete i kompozicije koje ne proizvode neželjene, alergijske ili druge nepoželjne reakcije kada se primene na životinju ili čoveka. Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ obuhvata sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za usporavanje apsorpcije i slično. Osim ukoliko je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa vektorima ili ćelijama ovog pronalaska, razmatra se njegova upotreba u terapijskim kompozicijama. Dodatni aktivni sastojci takođe mogu da budu uključeni u kompozicije.

[0119] [0084] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, aktivne kompozicije uključuju klasične farmaceutske preparate. Primena ovih kompozicija prema predmetnom pronalasku vrši se bilo kojim uobičajenim putem, sve dok je ciljno tkivo dostupno tim putem. To uključuje oralnu, nazalnu, bukalnu, rektalnu, vaginalnu ili topikalnu primenu. Alternativno, primena može da bude ortotopskom, intradermalnom, potkožnom, intramuskularnom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom.

[0120] Kompozicije takođe mogu da se primenjuju parenteralno ili intraperitonealno. Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli pripremaju se u vodi, pogodno pomešanoj sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije takođe mogu da se pripremaju u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama, kao i u uljima. Pod uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama.

[0121] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Nosač može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), njihove odgovarajuće smeše i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom premaza, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može da se postigne različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, može da bude poželjno uključivanje izotoničnih agenasa, na primer, šećera ili natrijum hlorida. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može da se postigne upotrebom u kompozicijama agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0122] Sterilni injekcioni rastvori se pripremaju inkorporisanjem aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa raznim drugim sastojcima navedenim gore, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtracijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem različitih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih navedenih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjni postupci za pripremu su tehnike vakuumskog sušenja i liofilizacije koje daju prašak aktivnog sastojka zajedno sa bilo kojim dodatnim željenim sastojkom iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.

[0123] [0088] Nakon formulacije, kompozicije se primenjuju na način kompatibilan sa formulacijom doze i u količini koja je terapijski efikasna. Formulacije se lako primenjuju u različitim doznim oblicima kao što su injekcioni rastvori, kapsule za oslobađanje leka i slično. Za parenteralnu primenu u obliku vodenog rastvora, na primer, rastvor se po potrebi adekvatno puferuje, a tečni razblaživač se prethodno izotonizuje dodatkom dovoljne količine fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi konkretni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensku, intramuskularnu, potkožnu i intraperitonealnu primenu. Na primer, jedna doza može da se rastvori u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i doda u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili ubrizga na predloženo mesto infuzije (videti na primer, „Remington’s Pharmaceutical Sciences“ 15. izdanje, str. 1035‑1038 i 1570‑1580). U nekim ovde opisanim primerima izvođenja, aktivne čestice ili agensi su formulisani u terapijskoj smeši tako da sadrže oko 0,0001 do 1,0 miligrama, ili oko 0,001 do 0,1 miligrama, ili oko 0,1 do 1,0 ili čak oko 10 miligrama po dozi, ili slično. Mogu se primeniti višestruke doze.

[0124] Dodatne formulacije koje su pogodne za druge načine primene uključuju vaginalne supozitorije i pesarije. Mogu da se koriste i rektalna pesarija ili supozitorija. Supozitorije su čvrsti dozni oblici različitih težina i oblika, obično lekoviti, za umetanje u rektum, vaginu ili uretru. Nakon umetanja, supozitorije omekšavaju, tope se ili rastvaraju u tečnostima telesne šupljine. Generalno, za supozitorije, tradicionalna vezivna sredstva i nosači mogu da uključuju, na primer, polialkilen glikole ili trigliceride; takve supozitorije mogu da se formiraju od smeša koje sadrže aktivni sastojak u rasponu od 0,5% do 10%, poželjno 1%-2%. Vaginalne supozitorije ili pesarije su obično loptastog ili ovalnog oblika i teže oko 5 g svaka. Vaginalni lekovi su dostupni u različitim fizičkim oblicima, npr. kao kreme, gelovi ili tečnosti, što odstupa od klasičnog koncepta supozitorija.

[0125] „Lečenje“ u kontekstu ovog pronalaska znači ublažavanje, u potpunosti ili delimično, simptoma povezanih sa poremećajem ili bolešću, ili usporavanje, inhibiranje ili zaustavljanje daljeg napredovanja ili pogoršanja tih simptoma, ili prevenciju ili profilaksu bolesti ili poremećaja kod subjekta koji je u riziku od razvoja bolesti ili poremećaja. Tako, npr. lečenje virusne infekcije može da uključuje inhibiciju ili sprečavanje replikacije virusa kod subjekta ili smanjenje simptoma virusne infekcije kod subjekta. Kako se ovde koristi, „terapijski efikasna količina“ jedinjenja pronalaska odnosi se na količinu jedinjenja koja ublažava, u potpunosti ili delimično, simptome povezane sa poremećajem ili bolešću, ili usporava, inhibira ili zaustavlja dalje napredovanje ili pogoršanje tih simptoma, ili sprečava ili pruža profilaksu za bolest ili poremećaj kod subjekta koji je u riziku od razvoja bolesti ili poremećaja.

[0126] Subjekt je bilo koja životinja koja može imati koristi od primene jedinjenja kako je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, subjekt je sisar, na primer, čovek, primat, pas, mačka, konj, krava, svinja, glodar, kao što je na primer pacov ili miš. Tipično, subjekt je čovek.

[0127] [0092] Terapijski efikasna količina jedinjenja kako je ovde opisano, koja se koristi u ovom pronalasku, može da varira u zavisnosti od načina primene i doznog oblika. Efektivne količine jedinjenja iz pronalaska obično se kreću u opsegu od oko 0,001 do 100 mg/kg/dan, a tipičnije u opsegu od oko 0,05 do 10 mg/kg/dan. Obično, jedinjenje ili jedinjenja koja se koriste u ovom pronalasku su odabrana tako da obezbede formulaciju koja pokazuje visok terapijski indeks. Terapijski indeks je odnos doza između toksičnih i terapijskih efekata koji može da se izrazi kao odnos između LD50 i ED50. LD50 je doza smrtonosna za 50% populacije, a ED50 je doza koja je terapijski efikasna kod 50% populacije. LD50 i ED50 se određuju standardnim farmaceutskim postupcima u kulturama životinjskih ćelija ili eksperimentalnim životinjama. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije i lekove koji mogu da se pripreme kombinovanjem jednog ili više jedinjenja opisanih ovde, njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, njihovih stereoizomera, njihovih tautomera ili njihovih solvata, sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima, vezivnim sredstvima, razblaživačima ili slično, radi inhibiranja ili lečenja primarnih i/ili metastatskih kancera prostate. Takve kompozicije mogu da budu u obliku, na primer, granula, praškova, tableta, kapsula, sirupa, supozitorija, injekcija, emulzija, eliksira, suspenzija ili rastvora. Predmetne kompozicije mogu da budu formulisane za različite načine primene, na primer, oralnim, parenteralnim, topikalnim, rektalnim, nazalnim putem, ili putem implantiranog rezervoara. Parenteralna ili sistemska primena uključuje, ali nije ograničena na, potkožne, intravenske, intraperitonealne i intramuskularne injekcije. Sledeći dozni oblici su dati kao primer i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje predmetnog pronalaska.

[0128] Za oralnu, bukalnu i sublingvalnu primenu, praškovi, suspenzije, granule, tablete, pilule, kapsule, gel kapsule i kaplete su prihvatljive kao čvrsti dozni oblici. Oni se mogu pripremiti, na primer, mešanjem jednog ili više jedinjenja ovog pronalaska, ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli ili tautomera, sa najmanje jednim aditivom kao što je skrob ili drugi aditiv. Pogodni aditivi su saharoza, laktoza, celulozni šećer, manitol, maltitol, dekstran, skrob, agar, alginati, hitini, hitozani, pektini, tragakant guma, guma arabika, želatini, kolageni, kazein, albumin, sintetički ili polusintetički polimeri ili gliceridi. Opciono, oralni dozni oblici mogu da sadrže druge sastojke koji pomažu u primeni, kao što su neaktivni razblaživač, ili lubrikansi, poput magnezijum stearata, ili konzervansi, kao što su paraben ili sorbinska kiselina, ili antioksidansi, poput askorbinske kiseline, tokoferola ili cisteina, sredstvo za dezintegraciju, vezivna sredstva, zgušnjivači, puferi, zaslađivači, sredstva za poboljšanje ukusa ili mirisne materije. Tablete i pilule mogu dodatno da se obrade odgovarajućim materijalima za oblaganje poznatim u struci.

[0129] [0094] Tečni dozni oblici za oralnu primenu mogu da budu u obliku farmaceutski prihvatljivih emulzija, sirupa, eliksira, suspenzija i rastvora, koji mogu da sadrže neaktivni razblaživač, kao što je voda. Farmaceutske formulacije i lekovi mogu da se pripreme kao tečne suspenzije ili rastvori korišćenjem sterilne tečnosti, kao što su, ali ne ograničavajući se na, ulje, voda, alkohol i njihove kombinacije. Za oralnu ili parenteralnu primenu mogu da se dodaju farmaceutski pogodni surfaktanti, sredstva za suspendovanje, emulgatori. Kao što je gore navedeno, suspenzije mogu da uključuju ulja. Takva ulja uključuju, ali nisu ograničena na, ulje kikirikija, susamovo ulje, ulje pamučnog semena, kukuruzno ulje i maslinovo ulje. Suspenzioni preparati mogu takođe da sadrže estre masnih kiselina kao što su etil oleat, izopropil miristat, gliceridi masnih kiselina i acetilovani gliceridi masnih kiselina. Formulacije suspenzija mogu da uključuju alkohole, kao što su, bez ograničenja, etanol, izopropil alkohol, heksadecil alkohol, glicerol i propilen glikol. Etri, kao što su, bez ograničenja, poli(etilenglikol), naftni ugljovodonici kao što su mineralno ulje i vazelin; i voda takođe mogu da se koriste u formulacijama suspenzija. Injekcioni oblici doziranja generalno uključuju vodene suspenzije ili uljne suspenzije koje mogu da se pripreme korišćenjem odgovarajućeg disperzanta ili sredstva za kvašenje i sredstva za suspendovanje. Injekcioni oblici mogu da budu u fazi rastvora ili u obliku suspenzije, koja se priprema sa rastvaračem ili razblaživačem. Prihvatljivi rastvarači ili vehikulumi uključuju sterilisanu vodu, Ringerov rastvor ili izotonični vodeni rastvor soli. Alternativno, sterilna ulja se mogu koristiti kao rastvarači ili sredstva za suspendovanje. Tipično, ulje ili masna kiselina su neisparljivi i uključuju prirodna ili sintetička ulja, masne kiseline, mono-, di- ili trigliceride.

[0130] Za injekcije, farmaceutska formulacija i/ili lek može da bude prašak pogodan za rekonstituciju sa odgovarajućim rastvorom kao što je gore opisano. Primeri za to uključuju, ali nisu ograničeni na, liofilizovane praškove osušene rotaciono ili raspršivanjem, amorfne praškove, granule, precipitate ili čestice. Za injekcije, formulacije mogu opciono da sadrže stabilizatore, modifikatore pH vrednosti, surfaktante, modifikatore bioraspoloživosti i njihove kombinacije.

[0131] [0096] Za rektalnu primenu, farmaceutske formulacije i lekovi mogu da budu u obliku supozitorija, masti, klistira, tablete ili kreme za oslobađanje jedinjenja u crevima, sigmoidnom pregibu i/ili rektumu. Rektalne supozitorije se pripremaju mešanjem jednog ili više jedinjenja ovog pronalaska, ili farmaceutski prihvatljivih soli ili tautomera jedinjenja, sa prihvatljivim vehikulumima, na primer, kakao puterom ili polietilen glikolom, koji je prisutan u čvrstoj fazi na normalnim temperaturama skladištenja, a prisutan je u tečnoj fazi na temperaturama pogodnim za oslobađanje leka unutar tela, kao što je u rektumu. Ulja se takođe mogu koristiti u pripremi formulacija tipa mekog želatina i supozitorija. Voda, fiziološki rastvor, vodeni rastvori dekstroze i srodnih šećera i gliceroli mogu da se koriste u pripremi formulacija suspenzija koje takođe mogu da sadrže sredstva za suspendovanje kao što su pektini, karbomeri, metil celuloza, hidroksipropil celuloza ili karboksimetil celuloza, kao i puferi i konzervansi. Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se primenjuju u plućima inhalacijom kroz nos ili usta. Pogodne farmaceutske formulacije za inhalaciju uključuju rastvore, sprejeve, suve praškove ili aerosole koji sadrže bilo koje odgovarajuće rastvarače i opciono druga jedinjenja kao što su, ali ne ograničavajući se na, stabilizatori, antimikrobni agensi, antioksidanti, modifikatori pH vrednosti, surfaktanti, modifikatori bioraspoloživosti i njihove kombinacije. Formulacije za inhalacionu primenu sadrže kao ekscipijense, na primer, laktozu, polioksietilen-9-lauril etar, glikoholat i deoksiholat. Vodeni i nevodeni aerosoli se tipično koriste za isporuku inovativnih jedinjenja inhalacijom.

[0132] Obično se vodeni aerosol pravi formulisanjem vodenog rastvora ili suspenzije jedinjenja zajedno sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačima i stabilizatorima. Nosači i stabilizatori variraju u zavisnosti od zahteva konkretnog jedinjenja, ali obično uključuju nejonske surfaktante (TWEEN, Pluronics ili polietilen glikol), bezopasne proteine poput serumskog albumina, sorbitan estara, oleinske kiseline, lecitina, aminokiselina poput glicina, pufera, soli, šećera ili šećernih alkohola. Aerosoli se generalno pripremaju iz izotoničnih rastvora. Nevodena suspenzija (npr. u fluorougljeničnom pogonskom gasu) takođe može da se koristi za isporuku jedinjenja ovog pronalaska.

[0133] Aerosoli koji sadrže jedinjenja za upotrebu prema ovom pronalasku se pogodno isporučuju pomoću inhalatora, atomizera, pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora i odgovarajućeg pogonskog gasa, npr. bez ograničenja, dihlordifluorometana, trihlorfluorometana, dihlortetrafluoroetana, azota, vazduha ili ugljen-dioksida pod pritiskom. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica može da se kontroliše obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži od, na primer, želatina za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu da se formulišu tako da sadrže praškastu mešavinu jedinjenja i odgovarajuću praškastu bazu kao što su laktoza ili skrob.

[0134] Isporuka aerosola ovog pronalaska korišćenjem zvučnih nebulizatora je prednost jer nebulizatori minimiziraju izlaganje agensa smicanju, koje može da dovede do razgradnje jedinjenja.

[0135] [0100] Za nazalnu primenu, farmaceutske formulacije i lekovi mogu da budu sprej, kapi za nos ili aerosol koji sadrži odgovarajući rastvarač(e) i opciono druga jedinjenja kao što su, bez ograničenja, stabilizatori, antimikrobni agensi, antioksidanti, modifikatori pH vrednosti, surfaktanti, modifikatori bioraspoloživosti i njihove kombinacije. Za primenu u obliku kapi za nos, jedinjenja se mogu formulisati u uljanim rastvorima ili kao gel. Za primenu nazalnog aerosola, može da se koristi bilo koji pogodan pogonski gas, uključujući komprimovani vazduh, azot, ugljen-dioksid ili rastvarač sa niskom tačkom ključanja na bazi ugljovodonika. Dozni oblici za topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu) ili transdermalnu primenu jedinjenja pronalaska uključuju praškove, sprejeve, masti, paste, kreme, losione, gelove, rastvore i flastere. Aktivna komponenta može da se meša pod sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom, i sa bilo kojim konzervansima ili puferima, koji mogu da budu potrebni. Praškovi i sprejevi mogu da se pripreme, na primer, sa ekscipijensima kao što su laktoza, talk, silicijumska kiselina, aluminijum hidroksid, kalcijum silikati i poliamidni prah, ili smeše ovih supstanci. Masti, paste, kreme i gelovi mogu takođe da sadrže ekscipijense kao što su životinjske i biljne masti, ulja, voskovi, parafini, skrob, tragakant, derivati celuloze, polietilen glikoli, silikoni, bentoniti, silicijumska kiselina, talk i cink oksid ili njihove smeše.

[0136] Transdermalni flasteri imaju dodatnu prednost jer obezbeđuju kontrolisanu isporuku jedinjenja pronalaska u telo. Takvi dozni oblici mogu da se naprave rastvaranjem ili dispergovanjem agensa u odgovarajućem medijumu. Za povećanje fluksa inventivnog jedinjenja kroz kožu mogu da se koriste i pojačivači apsorpcije. Brzina takvog fluksa može da se kontroliše ili obezbeđivanjem membrane koja kontroliše brzinu ili dispergovanjem jedinjenja u polimernoj matrici ili gelu.

[0137] Pored onih reprezentativnih doznih oblika opisanih gore, farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi i nosači su generalno poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Takvi ekscipijensi i nosači su opisani, na primer, u „Remingtons Pharmaceutical Sciences“ Mack Pub. Co., New Jersey (1991).

[0138] Formulacije pronalaska mogu da budu dizajnirane da budu kratkotrajnog dejstva, brzog oslobađanja, dugotrajnog dejstva i kontinuiranog oslobađanja kao što je opisano u nastavku. Stoga, farmaceutske formulacije mogu da budu formulisane i za kontrolisano oslobađanje ili za sporo oslobađanje. Predmetne kompozicije mogu takođe da sadrže, na primer, micele ili lipozome, ili neki drugi inkapsulirani oblik, ili mogu da se primenjuju u obliku sa produženim oslobađanjem kako bi se obezbedio produženi efekat skladištenja i/ili isporuke. Stoga, farmaceutske formulacije i lekovi mogu da budu komprimovani u pelete ili cilindre i implantirani intramuskularno ili potkožno kao depo injekcije ili kao implantati kao što su stentovi. Takvi implantati mogu da koriste poznate inertne materijale kao što su silikoni i biorazgradivi polimeri.

[0139] Specifične doze mogu da se podese u zavisnosti od stanja bolesti, starosti, telesne težine, opšteg zdravstvenog stanja, pola i ishrane subjekta, intervala između doza, načina primene, brzine izlučivanja i kombinacija lekova. Svi gore navedeni dozni oblici koji sadrže efikasne količine spadaju u okvir rutinskih eksperimentalnih postupaka, te stoga.

[0140] Imunoglobulin prema ovom pronalasku može da se koristi u postupku za lečenje ili sprečavanje kancera, autoimunih bolesti, inflamatornih bolesti, odbacivanja transplantata ili infekcije (npr. virusne infekcije).

[0141] U nekim primerima izvođenja, imunoglobulini opisani ovde se primenjuju u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom (npr. antikancerskim, imunosupresivnim ili antivirusnim agensom). U nekim primerima izvođenja, lečenje ovde opisanim imunoglobulinom prethodi ili sledi lečenje drugim agensom u intervalima od nekoliko minuta do nekoliko nedelja. U primerima izvođenja gde se drugi agens i imunoglobulin primenjuju na ćeliju odvojeno, uopšteno bi trebalo osigurati da između vremena svake primene ne prođe značajan vremenski period, tako da višestruke terapije i dalje mogu da izvrše povoljan kombinovani efekat na ćeliju. U takvim slučajevima, predviđeno je da ćelije budu dovedene u kontakt sa oba modaliteta u razmaku od oko 12-24 sata, a poželjnije u okviru od oko 6-12 sati, pri čemu se odlaganje od samo oko 12 sati smatra najpovoljnijim. U nekim situacijama, međutim, može da bude poželjno značajno produžiti period lečenja, pri čemu između odgovarajućih primena može da prođe od nekoliko dana (2 do 7) do nekoliko nedelja (1 do 8).

[0142] U nekim primerima izvođenja, koristi se više od jedne primene ovde opisane imunoterapijske kompozicije ili drugog agensa. Mogu da se koriste različite kombinacije, gde je imunoglobulin „A“, a drugi agens je „B“, kao što je prikazano u nastavku: A/B/A, B/A/B, B/B/A, A/A/B, B/A/A, A/B/B, B/B/B/A, B/B/A/B, A/A/B/B, A/B/A/B, A/B/B/A, B/B/A/A, B/A/B/A, B/A/A/B, B/B/B/A, A/A/A/B, B/A/A/A, A/B/A/A, A/A/B/A, A/B/B/B, B/A/B/B, B/B/A/B. Obuhvaćene su i druge kombinacije.

[0143] [0108] U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedno ili više jedinjenja pronalaska i dodatni aktivni agens se primenjuju kod subjekta, najčešće čoveka, u takvom redosledu i u vremenskom intervalu koji omogućavaju jedinjenju da deluje zajedno sa drugim agensom u cilju postizanja pojačanog efekta u poređenju sa efektima koji bi se dobili njihovom drugačijom primenom. Na primer, dodatni aktivni agensi mogu da se primenjuju uporedo putem zajedničke formulacije, da se primenjuju istovremeno ili da se primenjuju sekvencijalno bilo kojim redosledom u različitim vremenskim tačkama; međutim, ukoliko se ne primenjuju istovremeno, neophodno ih je primeniti u dovoljno bliskom vremenskom intervalu kako bi se postigao željeni terapijski ili profilaktički efekat. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje i dodatni aktivni agensi ispoljavaju svoje dejstvo u vremenima koja se preklapaju. Svaki dodatni aktivni agens može da se primenjuje odvojeno, u bilo kom odgovarajućem obliku i bilo kojim odgovarajućim putem. U drugim primerima izvođenja, jedinjenje se primenjuje pre, istovremeno ili posle primene dodatnih aktivnih agensa. U različitim primerima, jedinjenje i dodatni aktivni agensi se primenjuju u razmaku manjem od oko 1 sata, u razmaku od oko 1 sata, u razmaku od oko 1 sata do oko 2 sata, u razmaku od oko 2 sata do oko 3 sata, u razmaku od oko 3 sata do oko 4 sata, u razmaku od oko 4 sata do oko 5 sati, u razmaku od oko 5 sati do oko 6 sati, u razmaku od oko 6 sati do oko 7 sati, u razmaku od oko 7 sati do oko 8 sati, u razmaku od oko 8 sati do oko 9 sati, u razmaku od oko 9 sati do oko 10 sati, u razmaku od oko 10 sati do oko 11 sati, u razmaku od oko 11 sati do oko 12 sati, u razmaku ne većem od 24 sata ili ne većem od 48 sati. U drugim primerima, jedinjenje i dodatni aktivni agensi se primenjuju istovremeno putem ko-formulacije.

[0144] U drugim primerima, jedinjenje i dodatni aktivni agensi se primenjuju u razmaku od oko 2 do 4 dana, u razmaku od oko 4 do 6 dana, u razmaku od oko 1 nedelje, u razmaku od oko 1 do 2 nedelje ili u razmaku većem od 2 nedelje.

[0145] U određenim primerima, inventivno jedinjenje i opciono dodatni aktivni agensi se ciklično primenjuju kod subjekta. Ciklična terapija podrazumeva primenu prvog agensa tokom određenog vremenskog perioda, nakon čega sledi primena drugog agensa i/ili trećeg agensa tokom određenog vremenskog perioda i ponavljanje ove sekvencijalne primene. Ciklična terapija može da pruži niz prednosti, npr. da smanji razvoj rezistencije na jednu ili više terapija, omogući da se izbegnu ili smanje neželjeni efekti jedne ili više terapija i/ili da poboljša efikasnost lečenja.

[0146] U drugim primerima, jedno ili više jedinjenja nekih primera izvođenja ovog pronalaska i opciono dodatni aktivni agens se primenjuju u ciklusu kraćem od oko 3 nedelje, otprilike jednom u dve nedelje, otprilike jednom u 10 dana ili otprilike jednom nedeljno. Jedan ciklus može da obuhvati primenu inovativnog jedinjenja i opciono drugog aktivnog agensa infuzijom tokom oko 90 minuta svakog ciklusa, oko 1 sata svakog ciklusa, oko 45 minuta svakog ciklusa, oko 30 minuta svakog ciklusa ili oko 15 minuta svakog ciklusa. Svaki ciklus može da obuhvati najmanje 1 nedelju odmora, najmanje 2 nedelje odmora, najmanje 3 nedelje odmora. Broj primenjenih ciklusa je od oko 1 do oko 12 ciklusa, tipičnije od oko 2 do oko 10 ciklusa, a tipičnije od oko 2 do oko 8 ciklusa. Terapijski ciklusi mogu da se primenjuju istovremeno kod subjekta, tj. pojedinačne doze dodatnih aktivnih agenasa se primenjuju odvojeno, ali u takvom vremenskom intervalu da inovativno jedinjenje može da deluje zajedno sa dodatnim aktivnim agensima. Na primer, jedna komponenta se može primenjivati jednom nedeljno u kombinaciji sa ostalim komponentama koje se mogu primenjivati jednom svake dve nedelje ili jednom svake tri nedelje. Drugim rečima, režimi doziranja se sprovode istovremeno čak i ako se terapija ne primenjuje istovremeno ili tokom istog dana.

[0147] [0112] Dodatni aktivni agensi mogu da deluju aditivno ili, tipičnije, sinergistički sa jedinjenjem (jedinjenjima) pronalaska. U jednom primeru, jedno ili više jedinjenja pronalaska se primenjuje istovremeno sa jednim ili više drugih aktivnih agenasa u istoj farmaceutskoj kompoziciji. U drugom primeru, jedno ili više jedinjenja pronalaska se primenjuje istovremeno sa jednim ili više drugih aktivnih agenasa u odvojenim farmaceutskim kompozicijama. U još jednom primeru, jedno ili više jedinjenja pronalaska se primenjuje pre ili nakon primene drugog aktivnog agensa. Ovo otkriće razmatra primenu jedinjenja pronalaska i drugog aktivnog agensa istim ili različitim putevima primene, npr. oralno i parenteralno. U određenim primerima izvođenja, kada se jedinjenje pronalaska primenjuje istovremeno sa drugim aktivnim agensom koji potencijalno proizvodi neželjene sporedne efekte, uključujući, ali ne ograničavajući se na, toksičnost, drugi aktivni agens može povoljno da se primenjuje u dozi koja pada ispod praga pri kojem se izaziva neželjeni sporedni efekat.

[0148] [0113] Varijante IgG mogu da budu usmerene na praktično bilo koji antigen, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteine, podjedinice, domene, motive i/ili epitope koji pripadaju sledećoj listi ciljnih antigena, koja uključuje i rastvorljive faktore kao što su citokini i faktore vezane za membranu, uključujući transmembranske receptore: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-izo-PGF2a, 8-oksodG, A1 adenozinski receptor, A33, ACE, ACE-2, aktivin, aktivin A, aktivin AB, aktivin B, aktivin C, aktivin RIA, aktivin RIA ALK-2, aktivin RIB ALK-4, aktivin RIIA, aktivin RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adresini, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsin, alfa-V/beta-1 antagonist, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemin, anti-Id, ASPARTIC, atrijalni natriuretički faktor, av/b3 integrin, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-limfocitni stimulator (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 osteogenin, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, BOK, bombezin, koštani neurotrofički faktor, BPDE, BPDE-DNA, BTC, faktor 3 komplementa (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, kalcitonin, cAMP, karcinoembrionski antigen (CEA), antigen povezan sa karcinomom, katepsin A, katepsin B, katepsin C/DPPI, katepsin D, katepsin E, katepsin H, katepsin L, katepsin O, katepsin S, katepsin V, katepsin X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 proteini), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toksin Clostridium botulinum, toksin Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, citokeratinski tumorski antigen, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, faktor ubrzanja razgradnje, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 mozga), Dhh, digoksin, DNAM-1, Dnaze, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor endotelina, enkefalinaza, eNOS, Eot, eotaksin1, EpCAM, efrin B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selektin, ET-1, faktor IIa, faktor VII, faktor VIIIc, faktor IX, protein aktivacije fibroblasta (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, feritin, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrin, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, folikulo-stimulirajući hormon, fraktalkin, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatin), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glukagon, Glut 4, glikoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, faktor oslobađanja hormona rasta, hapten (NP-cap ili NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB glikoprotein omotača, HCMV) gH glikoprotein omotača, HCMV UL, hematopoetski faktor rasta (HGF), Hep B gp120, heparanaza, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), virus herpes simpleks (HSV) gB glikoprotein, HSV gD glikoprotein, HGFA, antigen velike molekulske težine povezan sa melanomom (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 petlja, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, humani srčani miozin, humani citomegalovirus (HCMV), humani hormon rasta (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA receptor, IgE, IGF, IGF vezujući proteini, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF-gama, inhibin, iNOS, A-lanac insulina, B-lanac insulina, faktor 1 rasta sličan insulinu, integrin alfa2, integrin alfa3, integrin alfa4, integrin alfa4/beta7, integrin alfa4/beta7, integrin alfa5 (alfaV), integrin alfa5/beta1, integrin alfa5/beta3, integrin alfa6, integrin beta1, integrin beta2, interferon gama, IP-10, I-TAC, JE, kalikrein 2, kalikrein 5, kalikrein 6, kalikrein 11, kalikrein 12, kalikrein 14, kalikrein 15, kalikrein L1, kalikrein L2, kalikrein L3, kalikrein L4, KC, KDR, faktor rasta keratinocita (KGF), laminin 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), latentni TGF-1, latentni TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, Lewis-Y antigen, Lewis-Y-srodni antigen, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteini, LIX, LKN, Lptn, L-selektin, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, plućni surfaktant, luteinizirajući hormon, receptor limfotoksina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, metaloproteaze, MGDF receptor, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucin (Muc1), MUC18, Milerova inhibitorna supstanca, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-kadherin, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisin, neurotrofin-3, -4, ili -6, neurturin, faktor rasta neurona (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, paratiroidni hormon, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-kadherin, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, alkalna fosfataza placente (PLAP), PIGF, PLP, PP14, proinsulin, prorelaksin, protein C, PS, PSA, PSCA, specifični membranski antigen prostate (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, A-lanac relaksina, B-lanac relaksina, renin, respiratorni sincicijalni virus (RSV) F, RSV Fgp, Ret, reumatoidni faktori, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, serumski albumin, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glikoprotein 72 povezan sa tumorom), TARC, TCA-3, T-ćelijski receptori (npr. T-ćelijski receptor alfa/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, PLAP-u slična testikularna alkalna fosfataza, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, pan-specifični TGF-beta, TGF-beta R1 (ALK-5), TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombin, timus Ck-1, tiroidni stimulatorni hormon, Tie, TIMP, TIQ, tkivni faktor, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R3Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF R1CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 ligand, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK ligand ODF, OPG ligand), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 ligand, DR3 ligand), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM ligand, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR ligand AITR ligand, TL6), TNFSF1A (TNF-a konektin, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligand gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 ligand CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas ligand Apo-1 ligand, APT1 ligand), TNFSF7 (CD27 ligand CD70), TNFSF8 (CD30 ligand CD153), TNFSF9 (4-1BB ligand CD137 ligand), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, transferinski receptor, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antigen CA 125 povezan sa tumorom, antigen povezan sa tumorom koji eksprimira Lewis Y-srodni ugljeni hidrat, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urokinaza, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-kadherin, VE-kadherin-2, VEFGR-1 (fit-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, virusni antigeni, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrin, fon Vilebrandov faktor, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, i receptori za hormone i faktore rasta.

[0149] Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da se gore pomenuta lista ciljnih molekula ne odnosi samo na specifične proteine i biomolekule, već i na biohemijski put ili puteve koji ih čine. Na primer, pozivanje na CTLA-4 kao ciljni antigen podrazumeva da ligandi i receptori koji čine kostimulatorni put T ćelija, uključujući CTLA-4, B7-1, B7-2, CD28 i bilo koji drugi neotkriveni ligandi ili receptori koji se vezuju za ove proteine, takođe predstavljaju ciljne molekule. Stoga se ciljni molekul, kako se ovde koristi, ne odnosi samo na specifični biomolekul, već i na skup proteina koji interaguju sa navedenim ciljnim molekulom i članovima biohemijskog puta kojem navedeni ciljni molekul pripada. Stručnjak u ovoj oblasti će dalje razumeti da bilo koji od gore pomenutih ciljnih antigena, ligandi ili receptori koji se za njih vezuju, ili drugi članovi njihovog odgovarajućeg biohemijskog puta, mogu da budu funkcionalno vezani za Fc varijante ovog pronalaska kako bi nastala Fc fuzija. Tako, na primer, Fc fuzija usmerena na EGFR mogla bi da se konstruiše funkcionalnim povezivanjem varijante Fc sa EGF, TGF-b ili bilo kojim drugim ligandom, otkrivenim ili neotkrivenim, koji se vezuje za EGFR. Shodno tome, varijanta Fc ovog pronalaska mogla bi da se funkcionalno poveže sa EGFR kako bi nastala Fc fuzija koja se vezuje za EGF, TGF-b ili bilo koji drugi ligand, otkriven ili neotkriven, koji se vezuje za EGFR. Dakle, praktično svaki polipeptid, bilo da je ligand, receptor ili neki drugi protein ili proteinski domen, uključujući, ali ne ograničavajući se na gore pomenute ciljne molekule i proteine koji čine njihove odgovarajuće biohemijske puteve, može funkcionalno da se poveže sa varijantama Fc ovog pronalaska da bi se dobila Fc fuzija.

[0150] Izbor odgovarajućeg antigena zavisi od željene primene. Za antikancerske terapije poželjno je imati ciljni molekul čija je ekspresija ograničena na ćelije kancera. Neki ciljni molekuli koji su se pokazali posebno pogodnim za terapiju antitelima su oni sa signalnim funkcijama. Druga terapijska antitela ostvaruju svoje efekte blokiranjem signalizacije receptora inhibiranjem vezivanja između receptora i njegovog srodnog liganda. Drugi mehanizam delovanja terapijskih antitela je nishodna regulacije receptora. Druga antitela ne deluju signaliziranjem preko svog ciljnog antigena. U nekim slučajevima se koriste antitela usmerena protiv agenasa infektivnih bolesti.

[0151] U jednom primeru izvođenja, Fc varijante ovog pronalaska su inkorporisane u antitelo protiv citokina. Alternativno, Fc varijante su fuzionisane ili konjugovane sa citokinom. Pod „citokinom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se generički termin za proteine koje oslobađa jedna ćelijska populacija, a koji deluju na drugu ćeliju kao međućelijski medijatori. Na primer, kao što je opisano u Penichet et al., 2001, J Immunol Methods 248:91‑101, citokini mogu da budu fuzionisani sa antitelom kako bi se obezbedio niz poželjnih svojstava. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini i tradicionalni polipeptidni hormoni. Među citokinima su hormon rasta kao što je humani hormon rasta, N-metionil humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relaksin; prorelaksin; glikoproteinski hormoni kao što su folikulostimulirajući hormon (FSH), tiroidni stimulatorni hormon (TSH) i luteinizirajući hormon (LH); hepatični faktor rasta; faktor rasta fibroblasta; prolaktin; placentarni laktogen; faktor tumorske nekroze-alfa i -beta; Milerova inhibitorna supstanca; mišji gonadotropin-asocirani peptid; inhibin; aktivin; vaskularni endotelni faktor rasta; integrin; trombopoetin (TPO); faktori rasta nerava kao što je NGF-beta; faktor rasta trombocita; transformišući faktori rasta (TGF) kao što su TGF-alfa i TGF-beta; insulinu slični faktor rasta-I i -II; eritropoetin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni kao što su interferon-alfa, beta i -gama; faktori koji stimulišu kolonije (CSF) kao što je makrofagni-CSF (M-CSF); granulocitnomakrofagni-CSF (GM-CSF); i granulocitni-CSF (G-CSF); interleukini (IL) kao što su IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, faktor nekroze tumora kao što je TNF-alfa ili TNF-beta; C5a; i drugi polipeptidni faktori, uključujući LIF i kit ligand (KL). Kako se ovde koristi, termin citokin obuhvata proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture i biološki aktivne ekvivalente citokina nativne sekvence.

[0152] [0117] Citokini i rastvorljivi ciljni molekuli, kao što su članovi TNF superfamilije, su poželjni ciljni molekuli za upotrebu sa varijantama ovog pronalaska. Na primer, anti-VEGF, anti-CTLA-4 i anti-TNF antitela, ili njihovi fragmenti, su posebno dobra antitela za upotrebu Fc varijanti koje povećavaju vezivanje FcRn. Terapeutici protiv ovih ciljnih molekula su često uključeni u lečenje autoimunih bolesti i zahtevaju višestruko injektovanje tokom dužih vremenskih perioda. Stoga su duži poluživot u serumu i ređa primena terapije, koji su omogućeni varijantama ovog pronalaska, posebno poželjni.

[0153] Fc varijante ovog pronalaska mogu da budu korisne za brojna antitela i Fc fuzije koje su odobrene za upotrebu, koje se proučavaju u kliničkim ispitivanjima ili su u razvoju. Ova antitela i Fc fuzije se ovde nazivaju „klinički proizvodi i kandidati“. Stoga, u poželjnom primeru izvođenja, Fc polipeptidi ovog pronalaska mogu pronaći upotrebu u brojnim kliničkim proizvodima i kandidatima. Na primer, brojna antitela koja su usmerena na CD20 mogu imati koristi od Fc polipeptida ovog pronalaska. Na primer, Fc polipeptidi ovog pronalaska mogu pronaći upotrebu u antitelu koje je suštinski slično rituksimabu (Rituxan<®>, IDEC/Genentech/Roche) (videti na primer SAD pat. br.

[0154] 5,736,137), himernom anti-CD20 antitelu odobrenom za lečenje ne-Hočkinovog limfoma; HuMax-CD20, antitelu protiv CD20 koje trenutno razvija Genmab, anti-CD20 antitelu opisanom u SAD pat. br. 5,500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) i PRO70769 (PCT/US2003/040426, pod nazivom „Immunoglobulin Variants and Uses Thereof“). Brojna antitela koja su usmerena na članove porodice receptora epidermalnog faktora rasta, uključujući EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), mogu imati koristi od Fc polipeptida ovog pronalaska. Na primer, Fc polipeptidi ovog pronalaska mogu pronaći upotrebu u antitelu koje je suštinski slično trastuzumabu (Herceptin<®>, Genentech) (videti na primer SAD pat. br. 5,677,171), humanizovanom anti-Her2/neu antitelu odobrenom za lečenje kancera dojke; pertuzumabu (rhuMab-2C4, Omnitarg<™>), koji trenutno razvija kompanija Genentech; anti-Her2 antitelu opisanom u SAD pat. br. 4,753,894; cetuksimabu (Erbitux<®>, Imclone) (SAD pat. br.

[0155] 4,943,533; PCT WO 96/40210), himernom anti-EGFR antitelu koje se ispituje u kliničkim studijama za lečenje raznih vrsta kancera; ABX-EGF (SAD pat. br.6,235,883), koji trenutno razvijaju Abgenix-Immunex-Amgen; HuMax-EGFr (SAD ser. br. 10/172,317), koje trenutno razvija Genmab; 425, EMD55900, EMD62000 i EMD72000 (Merck KGaA) (SAD pat. br.5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549‑60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315‑20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773‑83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1‑3):129‑46; Modjtahedi et al., 1993, Br J. Cancer. 1993, 67(2):247‑53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228‑35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273‑80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (SAD pat. br.5,891,996; SAD pat. br.6,506,883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71‑81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639‑44); KSB‑102 (KS Biomedix); MR1‑1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); i SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138). U drugom poželjnom primeru izvođenja, Fc polipeptidi ovog pronalaska mogu se koristiti u alemtuzumabu (Campath<®>, Millenium), humanizovanom monoklonskom antitelu trenutno odobrenom za lečenje hronične limfocitne leukemije B-ćelija. Fc polipeptidi ovog pronalaska mogu da se koriste u različitim antitelima ili Fc fuzijama koje su suštinski slične drugim kliničkim proizvodima i kandidatima, uključujući, ali ne ograničavajući se na muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3<®>), anti-CD3 antitelo koje je razvila kompanija Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuksetan (Zevalin<®>), anti-CD20 antitelo koje je razvila kompanija IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg<®>), anti-CD33 (p67 protein) antitelo koje je razvila kompanija Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive<®>), fuziju anti-LFA-3 i Fc koju je razvio Biogen), abciksimab (ReoPro<®>), razvijen od strane Centocor/Lilly, baziliksimab (Simulect<®>), koji je razvio Novartis, palivizumab (Synagis<®>), koji je razvila kompanija Med immune, infliksimab (Remicade<®>), anti-TNFalfa antitelo koje je razvio Centocor, adalimumab (Humira<®>), anti-TNFalfa antitelo koje je razvio Abbott, Humicade<™>, anti-TNFalfa antitelo koje je razvio Celltech, etanercept (Enbrel<®>), fuziju anti-TNFalfa i Fc koju su razvili Immunex/Amgen, ABX-CBL, anti-CD147 antitelo koje razvija Abgenix, ABX-IL8, anti-IL8 antitelo koje razvija Abgenix, ABX-MA1, anti-MUC18 antitelo koje razvija Abgenix, pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1), anti-MUC1 koje razvija Antisoma, tereks (R1550), anti-MUC1 antitelo koje razvija Antisoma, AngioMab (AS1405), koji razvija Antisoma, HuBC-1, koji razvija Antisoma, tioplatin (AS1407) koji razvija Antisoma, Antegren<®>(natalizumab), anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) i alfa-4-beta-7 antitelo koje razvija Biogen, VLA-1 mAb, anti-VLA-1 integrin antitelo koje razvija Biogen, LTBR mAb, antitelo protiv receptora limfotoksina beta (LTBR) koje razvija Biogen, CAT-152, antitelo protiv TGF-β2 koje razvija Cambridge Antibody Technology, J695, antitelo protiv IL-12 koje razvijaju Cambridge Antibody Technology i Abbott, CAT-192, antitelo protiv TGFβ1 koje razvijaju Cambridge Antibody Technology i Genzyme, CAT-213, anti-eotaksin1 antitelo koje razvija Cambridge Antibody Technology, LimfoStat-B<™>, anti-Blys antitelo koje razvijaju Cambridge Antibody Technology i Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1 mAb, anti-TRAIL-R1 antitelo koje razvijaju Cambridge Antibody Technology i Human Genome Sciences, Inc., Avastin<™>(bevacizumab, rhuMAb-VEGF), anti-VEGF antitelo koje razvija Genentech, antitelo protiv porodice HER receptora koje razvija Genentech, antitkivni faktor (ATF), antitelo protiv tkivnog faktora koje razvija Genentech, Xolair<™>(omalizumab), anti-IgE antitelo koje razvija Genenteh, Raptiva<™>(efalizumab), anti-CD11a antitelo koje razvijaju Genentech i Xoma, MLN-02 antitelo (ranije LDP-02), koje razvijaju Genentech i Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, anti-CD4 antitelo koje razvija Genmab, HuMax-IL 15, anti-IL 15 antitelo koje razvijaju Genmab i Amgen, HuMax-Inflam, koji razvijaju Genmab i Medarex, HuMax-Cancer, antitelo protiv heparanaze I koje razvijaju Genmab i Medarex i Oxford GcoSciences, HuMax-Lymphoma, koji razvijaju Genmab i Amgen, HuMax-TAC, koji razvija Genmab, IDEC-131, anti-CD40L antitelo koje razvija IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (klenoliksimab), anti-CD4 antitelo koje razvija IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, anti-CD80 antitelo koje razvija IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, anti-CD23 koje razvija IDEC Pharmaceuticals, antitela protiv faktora migracije makrofaga (MIF) koja razvija IDEC Pharmaceuticals, BEC2, antiidiotipsko antitelo koje razvija Imclone, IMC-1C11, anti-KDR antitelo koje razvija Imclone, DC101, anti-flk-1 antitelo koje razvija Imclone, anti-VE kadherin antitela koja razvija Imclone, CEA-Cide<™>(labetuzumab), antitelo protiv karcinoembrionskog antigena (CEA) koje razvija Immunomedics, LymphoCide<™>(epratuzumab), anti-CD22 antitelo koje razvija Immunomedics, AFP-Cide, koje razvija Immunomedics, MyelomaCide, koje razvija Immunomedics, LkoCide, koje razvija Immunomedics, ProstaCide, koje razvija Immunomedics, MDX-010, anti-CTLA4 antitelo koje razvija Medarex, MDX-060, anti-CD30 antitelo koje razvija Medarex, MDX-070 koji razvija Medarex, MDX-018 koji razvija Medarex, Osidem<™>(IDM-1) i anti-Her2 antitelo koje razvijaju Medarex i Immuno-Designed Molecules, HuMax<™>-CD4, anti-CD4 antitelo koje razvijaju Medarex i Genmab, HuMax-IL 15, anti-IL 15 antitelo koje razvijaju Medarex i Genmab, CNTO 148, anti-TNFα antitelo koje razvijaju Medarex i Centocor/J&J, CNTO 1275, anti-citokinsko antitelo koje razvija Centocor/J&J, MOR101 i MOR102, antitela protiv intercelularnog adhezionog molekula-1 (ICAM-1) (CD54) koja razvija MorphoSys, MOR201, antitelo protiv receptora 3 faktora rasta fibroblasta (FGFR-3) koje razvija MorphoSys, Nuvion<®>(visilizumab), anti-CD3 antitelo koje razvija Protein Design Labs, HuZAF<™>, antitelo protiv gama interferona koje razvija Protein Design Labs, Anti-α5β1 integrin, koji razvija Protein Design Labs, anti-IL-12, koji razvija Protein Design Labs, ING-1, anti-EpCAM antitelo koje razvija Xoma, i MLN01, antitelo protiv integrina Beta2 koje razvija Xoma.

[0156] Fc polipeptidi ovog pronalaska mogu da budu inkorporirani u gore pomenute kliničke kandidate i proizvode, ili u antitela i Fc fuzije koje su im suštinski slične. Fc polipeptidi ovog pronalaska mogu da budu inkorporirani u verzije gore pomenutih kliničkih kandidata i proizvoda koje su humanizovane, afinitetno sazrele, genetski modifikovane ili modifikovane na neki drugi način.

[0157] [0120] U jednom primeru izvođenja, Fc polipeptidi ovog pronalaska se koriste za lečenje autoimunih, inflamatornih ili transplantacionih indikacija. Ciljni antigeni i klinički proizvodi i kandidati koji su relevantni za takve bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na antitela protiv integrina α4β7 kao što je LDP-02, antitela protiv integrina beta2 kao što je LDP-01, antitela protiv komplementa (C5) kao što je 5G1.1, anti-CD2 antitela kao što su BTI-322, MEDI-507, anti-CD3 antitela kao što su OKT3, SMART anti-CD3, anti-CD4 antitela kao što su IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A, anti-CD11a antitela, anti-CD14 antitela kao što je IC14, anti-CD18 antitela, anti-CD23 antitela kao što je IDEC 152, anti-CD25 antitela kao što je zenapaks, anti-CD40L antitela kao što su 5c8, antova, IDEC-131, anti-CD64 antitela kao što je MDX-33, anti-CD80 antitela kao što je IDEC-114, anti-CD147 antitela kao što je ABX-CBL, anti-E-selektin antitela kao što je CDP850, anti-gpIIb/IIIa antitela kao što je ReoPro/abciksima, anti-ICAM-3 antitela kao što je ICM3, anti-ICE antitela kao što je VX-740, anti-FcR1 antitela kao što je MDX-33, anti-IgE antitela kao što je rhuMab-E25, anti-IL-4 antitela kao što je SB-240683, anti-IL-5 antitela kao što su SB-240563, SCH55700, anti-IL-8 antitela kao što je ABX-IL8, anti-interferon gama antitela, anti-TNF (TNF, TNFa, TNFa, TNF-alfa) antitela kao što su CDP571, CDP870, D2E7, infliksimab, MAK-195F i anti-VLA-4 antitela kao što je antegren.

[0158] Fc varijante ovog pronalaska, kao što su one sa povećanim vezivanjem za FcRn, mogu da se koriste u molekulima inhibitora TNF kako bi se obezbedila poboljšana svojstva. Korisni molekuli inhibitora TNF uključuju bilo koji molekul koji inhibira dejstvo TNF-alfa kod sisara. Pogodni primeri uključuju Fc fuziju Enbrel<®>(etanercept) i antitela Humira<®>(adalimumab) i Remicade<®>(infliksimab). Monoklonska antitela (kao što su Remicade i Humira) dobijena genetskim inženjeringom korišćenjem Fc varijanti ovog pronalaska za povećanje vezivanja za FcFn, mogu da pruže poboljšanu efikasnost zbog produženog poluživota.

[0159] U nekim primerima izvođenja, koriste se antitela protiv infektivnih bolesti. Antitela protiv eukariotskih ćelija uključuju antitela usmerena na ćelije kvasca, uključujući, ali ne ograničavajući se na Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis i K. lactis, Pichia guillerimondii i P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Plasmodium falciparium i Yarrowia lipolytica.

[0160] Antitela protiv dodatnih gljivičnih ćelija su takođe korisna, uključujući ciljne antigene povezane sa sojevima Candida, uključujući Candida glabrata, Candida albicans, C. krusei, C. lusitaniae i C. maltosa, kao i vrste rodova Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces i Penicillium, između ostalih.

[0161] Antitela usmerena protiv ciljnih antigena povezanih sa protozoama uključuju, ali nisu ograničena na, antitela povezana sa Trypanosoma, vrstama roda Leishmania, uključujući Leishmania donovanii; Plasmodium spp., Pneumocystis carinii, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica i Cyclospora cayetanensis.

[0162] Antitela protiv prokariotskih antigena su takođe korisna, uključujući antitela protiv odgovarajućih bakterija kao što su patogeni i nepatogeni prokarioti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Bacillus, uključujući Bacillus anthracis; Vibrio, npr. V. cholerae; Escherichia, npr. enterotoksigena E. coli, Shigella, npr. S. dysenteriae; Salmonella, npr. S. typhi; Mycobacterium npr. M. tuberculosis, M. leprae; Clostridium, npr. C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens; Cornyebacterium, npr. C. diphtheriae; Streptococcus, S. pyogenes, S. pneumoniae; Staphylococcus, npr. S. aureus; Haemophilus, npr. H. influenzae; Neisseria, npr. N. meningitidis, N. gonorrhoeae; Yersinia, npr. Y. lamblia, Y. pestis, Pseudomonas, npr. P. aeruginosa, P. putida; Chlamydia, npr. C. trachomatis; Bordetella, npr. B. pertussis; Treponema, npr. T. palladium; B. anthracis, Y. pestis, Brucella spp., F. tularensis, B. mallei, B. pseudomallei, B. mallei, B. pseudomallei, C. botulinum, Salmonella spp., SEB toksin B V. cholerae, E. coli O157:H7, Listeria spp., Trichosporon beigelii, vrste roda Rhodotorula, Hansenula anomala, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Listeria sp., Mycoplasma sp. i slično.

[0163] U nekim aspektima, antitela su usmerena protiv virusnih infekcija; ovi virusi uključuju, ali nisu ograničeni na, ortomiksoviruse (npr. virus gripa), paramiksoviruse (npr. respiratorni sincicijalni virus, virus zauški, virus malih boginja), adenoviruse, rinoviruse, koronaviruse, reoviruse, togaviruse (npr. virus rubeole), parvoviruse, poksviruse (npr. virus variole, virus vakcinije), enteroviruse (npr. poliovirus, koksakivirus), viruse hepatitisa (uključujući A, B i C), herpesviruse (npr. virus herpes simpleksa, virus varičele-zoster, citomegalovirus, virus Epštajn-Bar), rotaviruse, Norvok viruse, hantavirus, arenavirus, rabdovirus (npr. virus besnila), retroviruse (uključujući HIV, HTLV-I i -II), papovaviruse (npr. papilomavirus), poliomaviruse i pikornaviruse, i slično.

[0165] Eksperimentalni deo

[0167] Primer 1

[0169] Proizvodnja Fc genetskim inženjeringom za poboljšano vezivanje FcRn

[0171] Neonatalni Fc receptor (FcRn) reguliše poluživot IgG kod humanog IgG, koji traje 3 nedelje. Proizvodnja IgG antitela genetskim inženjeringom za poboljšano pH zavisno vezivanje za FcRn rezultovalo je primerima antitela sa produženim poluživotom/izmenjenom farmakokinetikom i svojstvima ćelijskog transporta.

[0172] Materijali i metode

[0173] Ćelijska kultura. Ćelijska linija HEK293E je održavana u medijumu DMEM dopunjenom sa 10% FBS, 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina na 37 °C u vlažnoj sredini inkubatora sa 5% CO<2>, 95% vazduha.

[0174] Proizvodnja rastvorljivog rekombinantnog humanog FcRn. Konstruisanje eukariotskog vektora pcDNA3 koji kodira rekombinantni skraćeni oblik divljeg tipa humanog FcRn, koji sadrži cDNA koja kodira tri ekstracelularna domena (α1-α3) C-terminalno spojena sa cDNA koja kodira glutation S-transferazu (GST) iz Schistosoma japonicum je opisano (Berntzen, G., et al., J Immunol Methods, 2005.298(1‑2): p.93‑104; Andersen, J.T., et al., FEBS J, 2008.275(16): p.4097‑110. Vektor takođe sadrži cDNA koja kodira humani β<2>-mikroglobulin i sekvencu početka replikacije iz virusa Epštajn-Bar. GST-označen hFcRn je proizveden prolaznom transfekcijom ćelija humanog embrionalnog bubrega 293E (HEK293E) korišćenjem polietilenimina Max (Polysciences), a receptor je prečišćen iz sakupljenog supernatanta korišćenjem kolone GSTrap FF kao što je opisano (Berntzen et al., iznad; Andersen et al., iznad).

[0175] Monomerni humani FcRn obeležen His-oznakom je proizveden korišćenjem bakulovirusnog ekspresionog vektorskog sistema (Kim, J.K., et al., FcRn. Eur J Immunol, 1999.29(9): p. 2819‑25). Virusni stok koji kodira humani FcRn obeležen His-oznakom bio je ljubazan poklon dr. Sally Ward (Jugozapadni medicinski centar Univerziteta u Teksasu; Dalas, Teksas, SAD). Ukratko, humani FcRn je prečišćen korišćenjem kolone HisTrap HP snabdevene jonima Ni<2+>(GE Healthcare). Kolona je prethodno uravnotežena pomoću 1 x PBS sa 0,05% natrijum azida, a pH vrednost supernatanta je podešena sa 1 x PBS, 0,05% natrijum azida (pH 10,9) na pH 7,2 pre nego što je nanet na kolonu HisTrap HP pri brzini protoka od 5 ml/min. Kolona je isprana sa 200 ml 1 x PBS, a zatim sa 50 ml 25 mM imidazola, 1 x PBS (pH 7,3), a humani FcRn je eluiran sa 250 mM imidazola, 1 x PBS (pH 7,4). Sakupljenom proteinu je izmenjen pufer u 1 x PBS korišćenjem filterskih jedinica Amicron Ultra-10 (Millipore), nakon čega je izolovana monomerna frakcija. Za izolovanje monomerne frakcije korišćena je kolona HiLoad 26/600 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare) pre nego što je protein koncentrovan korišćenjem kolona Amicon Ultra (Millipore) i čuvan na 4 °C.

[0176] Konstruisanje i proizvodnja varijanti IgG1 sa Fc dobijenim genetskim inženjeringom.

[0177] Vektori koji kodiraju humanizovane 9C12 varijante IgG1 bili su zasnovani na ekspresionom sistemu pLNOH2/pLNOk (Norderhaug, L., et al., J Immunol Methods, 1997.204(1): p. 77‑87). Konkretno, varijabilni geni (V) teških (H) i lakih (L) lanaca poreklom iz ćelijske linije hibridoma TC31-9C12.C9 (Banka razvojnih studija hibridoma, Univerzitet u Ajovi) (Varghese, R., et al., J Virol, 2004.78(22): p. 12320‑32) su sintetizovani kao kaseta za kloniranje okružena restrikcionim mestima koje prepoznaju endonukleaze BsmI/BsiWI. Genski fragmenti su zatim subklonirani u pLNOH2-<NIP>hIgG1-WT-oriP i<NIP>pLNOk-oriP, dajući pLNOH2-<Hexon>hIgG1-WT-oriP i<Hexon>pLNOk-oriP koji kodiraju himerni humani H lanac, odnosno L lanac. Vektor pLNOH2-<Hexon>hIgG1-WT-oriP koji kodira H lanac je dalje korišćen za generisanje varijanti h9C12 zamenom fragmenata gena C<H>2 i C<H>3 fragmentima koji sadrže željene mutacije. Fragmenti C<H>2 su zamenjeni korišćenjem jedinstvenih restrikcionih mesta koja prepoznaju endonukleaze AgeI i SfiI, dok su fragmenti C<H>3 zamenjeni korišćenjem SfiI i BamHI (sve iz New England Biolabs). Nakon kotransfekcije vektora H lanca i L lanca u ćelije HEK293E korišćenjem Lipofectamine 2000 (Life Technologies), h9C12 varijante IgG1 su prečišćene iz sakupljenog supernatanta korišćenjem CaptureSelect kolone specifične za C<H>1 (Life Technologies). Monomerne frakcije su izolovane SEC hromatografijom korišćenjem kolone Superdex 200 (GE Healthcare). Integritet proteina je verifikovan pomoću neredukujuće SDS-PAGE (Life Technologies).

[0178] ELISA. Ploče sa 96 bunarčića (Nunc) su obložene rekombinantnim heksonom AdV5 (Abd Serotech) (razblaženim do 1 µg/ml u PBS) i inkubirane preko noći na 4 °C. Preostala površina je blokirana pomoću PBS/4% obranog mleka (S) (Acumedia), pre ispiranja četiri puta sa PBS/0,005% Tween 20 (T). Titrirane količine h9C12 varijanti razblaženih u PBS/T/S su dodate u bunarčiće i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja kao gore navedeno, rastvorljivi GST-obeleženi humani FcRn razblažen u PBS/S/T je dodat u bunarčiće i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja kao što je gore navedeno, HRP-konjugovano anti GST antitelo (1:8000) je razblaženo u dodatom PBS/S/T (Rockland Immunochemicals, SAD), a zatim inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja kao što je gore navedeno, vezani humani FcRn je vizualizovan dodavanjem rastvora tetrametilbenzidina (TMB) (CalBiochem). Reakcija je prekinuta dodavanjem 100 µl 1 M HCl, a apsorpcija na 450 nm je zabeležena pomoću čitača ploča SUNRISE (TECAN). ELISA je izvedena korišćenjem PBS sa pH 6,0 ili pH 7,4.

[0179] SPR. Za sva kinetička merenja korišćen je instrument Biacore 3000 (GE Healthcare). Humanizovane 9C12 varijante IgG1 su imobilizovane aminskim kuplovanjem na CM5 senzorskim čipovima prema uputstvima proizvođača. Kuplovanje je izvršeno ubrizgavanjem 1-2,5 µg/ml varijanti IgG1 rastvorenih u 10 mM natrijum acetatu, pH 4,5 (GE Healthcare). Pufer HBS-P (0,01 M HEPES, 0,15 NaCl, 0,005% surfaktanta P20, pH 7,4) je korišćen kao radni pufer i pufer za razblaživanje. Nakon toga, ubrizgan je rastvorljivi monomerni humani FcRn u nizu različitih koncentracija. Kinetička analiza je izvršena korišćenjem softvera BIAevaluation, a podaci vezivanja su aproksimirani korišćenjem jednostavnog Langmuirovog modela biomolekularnih interakcija prvog reda (1:1).

[0180] Rezultati

[0181] Ovde su opisana IgG antitela sa Fc dobijenim genetskim inženjeringom sa izmenjenim vezivanjem za humani FcRn kao što sledi. Trostruki mutant pronalaska, Q311R/N434W/M428E, pokazuje poboljšano vezivanje zavisno od pH vrednosti u odnosu na objavljene primere.

[0182]

[0183]

[0184]

[0186] Primer 2

[0188] Ovaj primer opisuje dodatne varijante IgG1 i IgG3 sa izmenjenim vezivanjem za humani FcRn.

[0190] Materijali i metode

[0192] Studije in vivo - Miševi Tg32-Alb-/- na genetskoj osnovi C57BL/6J nose nulte alele FcRn HC (Fcgrt<tm1Dcr)>i albumina (Alb<em12Mvw>), i eksprimiraju genomski transgen hFcRn HC (FCGRT) pod kontrolom nativnog promotora hFcRn. Miševi Tg32-Alb-/- (ženskog pola, starosti 7-9 nedelja, težine između 17 i 27 g, 5 miševa/grupi) primili su intraperitonealnom injekcijom 5 mg/kg varijanti IgG1. Uzorci krvi (25 µl) su uzeti iz retroorbitalnog sinusa 1, 3, 5, 7, 10, 12, 16, 19, 23, 30 i 37 dana nakon injekcije. Nakon sakupljanja uzoraka, krv je odmah pomešana sa 1 µl 1% K3-EDTA da bi se sprečila koagulacija, a zatim centrifugirana na 17000 x g tokom 5 minuta na 4 °C. Plazma je izdvojena, razblažena 1:10 u 50% rastvoru glicerola/PBS, a zatim čuvana na -20 °C do analize ELISA metodom. Studije in vivo su sprovedene u The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Mejn, SAD).

[0193] [0137] Površinska plazmonska rezonancija - Za sva kinetička merenja korišćen je Biacore T200 instrument (GE Healthcare). Varijante h9C12 su imobilizovane aminskim kuplovanjem na CM5 senzorskim čipovima prema uputstvima proizvođača. Za sve eksperimente, fosfatni pufer (67 mM fosfat, 0,15 M NaCl, 0,005% Tween20) na pH 6,0, ili HBS-P pufer (0,1 M HEPES, 0,15 NaCl, 0,005% surfaktanta P20) na pH 7,4 korišćeni su kao radni pufer, odnosno pufer za regeneraciju. Rekombinantni humani FcRn (1000,0-15,6) nM je ubrizgan u nizu različitih koncentracija pri brzini protoka od 50 µl/min na 25 °C. Kinetička analiza je izvršena korišćenjem softvera BIAevaluation, a podaci vezivanja su aproksimirani korišćenjem jednostavnog Langmuirovog modela biomolekularnih interakcija prvog reda (1:1).

[0194] ELISA - Izvedena je kao što je opisano u primeru 1.

[0196] Tabela 2

[0199]

[0201] Rezultati

[0203] Rezultati su prikazani na slikama 5-7 i u tabelama 3-5.

[0206]

[0207]

[0208]

[0209]

[0211] Tabela 5. Poluživot (dani) kod Tg32 miševa hemizigotnih za humani FcRn.

[0212]

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži imunoglobulin koji ima mutacije Q311R, N434W i M428E u regionu humanog IgG1Fc divljeg tipa, gde navedeni imunoglobulin ima izmenjeno vezivanje za FcRn, pri čemu je navedeni imunoglobulin humanizovani IgG1-Q311R/N434W/M428E, gde navedene mutacije produžavaju serumski poluživot imunoglobulina u poređenju sa humanim IgG1 divljeg tipa, i gde se numeracija odnosi na EU indeks.

2. Kompozicija prema zahtevu 1, gde konstantni region navedenog imunoglobulina sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2 i 7.

3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili 2, gde se navedeni imunoglobulin vezuje za ciljni molekul izabran iz grupe koja se sastoji od markera kancera, citokina, markera infektivne bolesti i faktora rasta.

4. Imunoglobulin, kako je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 3, za upotrebu u terapiji.

5. Fc fuzioni protein koji sadrži Fc region imunoglobulina kako je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 3.

6. Fuzioni protein koji sadrži imunoglobulin, kako je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 3, ili Fc region imunoglobulina, kako je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 3, fuzionisan sa imunogenom.

7. Kompozicija vakcine koja sadrži fuzioni protein prema zahtevu 6.