RU2182014C2 - Использование мутеинов цитокинов дикого типа в качестве иммуногенов - Google Patents
Использование мутеинов цитокинов дикого типа в качестве иммуногенов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2182014C2 RU2182014C2 RU98105679/14A RU98105679A RU2182014C2 RU 2182014 C2 RU2182014 C2 RU 2182014C2 RU 98105679/14 A RU98105679/14 A RU 98105679/14A RU 98105679 A RU98105679 A RU 98105679A RU 2182014 C2 RU2182014 C2 RU 2182014C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hil
- wild
- mice
- santl
- immunogenic composition
- Prior art date
Links
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 147
- 229940116886 human interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 140
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 17
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- -1 elixirs Substances 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 2
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims description 2
- 208000001685 postmenopausal osteoporosis Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 claims description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims 2
- 102200110332 rs104894514 Human genes 0.000 claims 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 abstract description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 69
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 43
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 38
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 37
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 34
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 31
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 25
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 23
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 23
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 6
- 101100338243 Caenorhabditis elegans hil-6 gene Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 244000144987 brood Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000940468 Drosophila melanogaster COP9 signalosome complex subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 1
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Noise Elimination (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается применения мутеина интерлейкина-6 (IL-6) человека для предотвращения патологического состояния, вызванного избыточной продукцией IL-6. Сущность изобретения состоит в использовании мутеинов специфического цитокина дикого типа, являющихся также антагонистами рецептора последнего, в качестве иммуногенов для индуцирования образования антител, направленных против этого цитокина дикого типа и способных нейтрализовать его, в заболеваниях, вызываемых его избыточным синтезом. Преимущество изобретения заключается в предотвращении состояний, связанных с избыточной продукцией IL-6. 2 с. и 9 з.п. ф-лы, 11 табл., 6 ил.
Description
Изобретение касается использования мутеинов специфических цитокинов дикого типа, являющихся также антагонистами рецепторов последних, в качестве иммуногенов для извлечения антител против цитокина дикого типа, причем эти антитела способны нейтрализовать биологическую активность цитокина дикого типа в заболеваниях, вызываемых избыточным продуцированием цитокина.
Известно, например, что интерлейкин 6 (hIL-6) человека представляет собой полипептид из 184 аминокислот, относящийся к классу спиральных цитокинов. Интерлейкин 6 является мультифункциональным цитокином, продуцируемым различными типами клеток. Он действует как фактор дифференцировки и роста на клетки различных типов, например, клетки иммунной системы, гепатоциты, почечные клетки, гемопоэтические стволовые клетки, кератиноциты и нейроны. Однако избыточное продуцирование hIL-6 вызывает ряд заболеваний, таких, как хронические аутоиммунные нарушения, системная красная волчанка, миелома/плазмоцитома, постклимактерический остеопороз и раковая кахексия.
Таким образом, существует необходимость в этой специфической области противодействовать избыточному продуцированию цитокина дикого типа в общем и hIL-6, в частности, как в смысле предотвращения, так и в смысле лечения вызываемых нарушений.
Применение данного изобретения позволяет удовлетворить эту потребность и в то же время предоставляет другие преимущества, которые становятся очевидными из следующего далее описания.
Фактически, целью данного изобретения является использование мутантов цитокина дикого типа для приготовления фармацевтических соединений для лечения или предотвращения заболеваний, вызываемых сверхсинтезом этого специфического цитокина дикого типа.
Следующей целью данного изобретения являются фармацевтические соединения для лечения заболеваний, вызываемых избыточным образованием цитокина дикого типа, или вакцины для предотвращения этих заболеваний, содержащие в качестве активного начала по меньшей мере один мутант цитокина дикого типа.
Фармацевтические составы согласно данному изобретению могут быть приготовлены согласно известным способам, которые требуют, например, присутствия фармацевтически приемлемого носителя. Примеры таких носителей и способы приготовления могут быть найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences. Для приготовления фармацевтически приемлемого состава, пригодного для эффективного введения, эти составы должны содержать эффективное количество активного начала в соответствии с данным изобретением. Фармацевтические составы данного изобретения вводят индивидууму в количествах, адекватных для заболевания, веса, пола и возраста данного индивидуума. Другие факторы включают в себя способ введения.
Фармацевтические составы согласно данному изобретению могут вводиться в широком диапазоне способов, например, подкожно, накожно, перорально или внутримышечной инъекцией.
Фармацевтические составы согласно данному изобретению, содержащие в качестве активного ингредиента по меньшей мере один мутеин цитокина дикого типа, могут вводиться при терапевтических дозах в широком разнообразии форм, в общепринятых применяемых для введения носителях.
Например, они могут вводиться в дозах для перорального введения в форме таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул, эликсиров, мазей, растворов, суспензий, сиропов и эмульсий или инъекцией. Таким же образом, составы в соответствии с данным изобретением могут вводиться внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, местно с покрытием или без него, или внутримышечно. Все указанные выше формы лекарства хорошо известны специалистам в области фармацевтики. В любом случае следует использовать эффективное, но нетоксичное количество активного ингредиента в соответствии с данным изобретением.
Суточная доза этого активного ингредиента может меняться в широком диапазоне между 0,01 и 1000 мг на взрослого в день. Эффективное количество активного начала согласно данному изобретению обычно обеспечивается при дозе между приблизительно 0,001 мг/кг и приблизительно 100 мг/кг веса тела в день.
Согласно данному изобретению, активное начало, которое приготовлено из мутеинов специфического цитокина дикого типа, может быть в типичном случае введено в смеси с подходящими разбавителями, наполнителями или фармацевтическими носителями (обычно называемыми общим термином "носители"), выбранными с учетом формы желаемого введения.
Приготовление вакцин в соответствии с данным изобретением известно специалистам в данной области. Как правило, эти вакцины готовят в инъецируемой форме, либо в виде растворов, либо в виде суспензий. Препарат может быть эмульгирован или активная форма препарата может быть инкапсулирована в липосомы. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с фармацевтически приемлемыми наполнителями, которые совместимы с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать небольшие количества дополнительных веществ, таких как, например, смачивающие или эмульгирующие агенты, забуферивающие рН агенты и/или адъюванты, для увеличения эффективности вакцины.
Вакцины согласно данному изобретению предпочтительно вводят парентерально, например, посредством внутримышечной или подкожной инъекции. Другие готовые формы, пригодные для других способов введения, включают суппозитории и пероральные препараты. Эти соединения содержат от 10 до 95% активного ингредиента, предпочтительно между 25 и 70%.
До этого момента давалось общее описание данного изобретения. Теперь при помощи следующих далее примеров будет дано более подробное описание с указанием конкретных ситуаций, на которые может ссылаться данное изобретение и на которые может быть нацелено данное изобретение, что будет способствовать более ясному пониманию целей, особенностей, преимуществ и возможных применений данного изобретения.
Фиг. 1а и 1b показывают результаты эксперимента с иммунизацией нормальных и трансгенных NSE/hIL-6 мышей hIL-6 дикого типа.
Фиг. 2а и 2b показывают результаты эксперимента с иммунизацией мутантной формой, коротко называемой Santl (содержащей мутации Туr 31 Asp, Gly 35 Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gln 175 Ile, Ser 176 Arg, Gln 183 Ala и являющейся антагонистом hIL-6), в нормальных и в трансгенных NSE/hIL-6 мышах.
Фиг. 3 показывает результаты эксперимента, имеющего целью проверку, способны или нет антитела, вырабатываемые в мышах против Santl, узнавать также интерлейкин-6 дикого типа.
Фиг. 4 показывает результаты эксперимента, целью которого была проверка, способны или нет антитела, вырабатываемые в трансгенных NSE/hIL-6 мышах, иммунизированных мутантом Santl интерлейкина-6 дикого типа, нейтрализовать биологическую активность человеческого интерлейкина-6 дикого типа.
Фиг. 5а и 5b показывают результаты экспериментов, проведенных в примере 7.
Фиг. 6а и 6b показывают результаты экспериментов, проведенных в примере 11.
Пример 1
Иммунизация NSE/hIL-6 трансгенных мышей, с иммунной толерантностью в отношении hIL-6, с использованием hIL-6 и Santl
В геном NSE/hIL-6 трансгенных мышей была интегрирована кДНК человеческого интерлейкина-6, находящаяся под контролем промотора гена крысиной нейроспецифической энолазы.
Иммунизация NSE/hIL-6 трансгенных мышей, с иммунной толерантностью в отношении hIL-6, с использованием hIL-6 и Santl
В геном NSE/hIL-6 трансгенных мышей была интегрирована кДНК человеческого интерлейкина-6, находящаяся под контролем промотора гена крысиной нейроспецифической энолазы.
Теория толерантности проверялась попыткой иммунизации вышеупомянутых NSE/hIL-6 трансгенных мышей (группы из 5 мышей) рекомбинантным человеческим IL-6; в качестве контроля использовали сиблингов, рожденных в том же самом выводке, но не имеющих трансгена. Группу из пяти NSE/hIL-6 трансгенных мышей иммунизировали также мутантной формой IL-6, называемой Santl (которая не имеет остаточной биологической активности на клетках человека и ведет себя как антагонист рецептора hIL-6), которая содержала семь указанных ниже мутаций: Туr 31 Asp, Gly 35 Phe, Ser 118 Arg, Val 121 Asp, Gln 175 Ile, Ser 176 Arg, Gln 183 Ala. В этом случае использовали в качестве контроля также пять сиблингов из того же выводка, не содержащих трансген. Протокол иммунизации был следующим: при времени 0 брали пробу крови (предиммунную пробу) последовательно из каждого животного, как трансгенного, так и нетрансгенного, и затем каждое животное иммунизировали внутрибрюшинно (I.P.) 100 мкг антигена (wthIL-6 или Santl), в соответствии с группой мышей в присутствии полного адъюванта Фрейнда (ПАФ). Спустя 10 дней после первой иммунизации, брали пробу крови (пробу 1). Спустя 20 дней после первой иммунизации, проводили вторую иммунизацию (первый бустер), опять с использованием 100 мкг антигена, в присутствии неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) с последующим взятием второй пробы крови (пробы 2) спустя 10 дней (30 дней от первой иммунизации). Наконец, спустя 40 дней после первой иммунизации, проводили третью иммунизацию (второй бустер), опять с использованием 100 мкг антигена, в присутствии НАФ с последующим взятием пробы крови (пробы 3) спустя 10 дней (50 дней от первой иммунизации). Соответствующую сыворотку получали из каждой из проб крови в соответствии с известными в данной области способами.
В этой точке эксперимента использовали способ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) для определения, присутствуют или отсутствуют антитела, направленные против использованного для иммунизации антигена, в сыворотке, полученной из второй и третьей проб. Для этого тот же самый антиген, который использовали для иммунизации, связывали нековалентно с дном лунок в культуральных планшетах, специально производимых для экспериментов такого типа (планшеты ELISA). Иммобилизация антигена происходила при инкубировании 100 мкл раствора антигена, растворенного при концентрации 10 мкл/мл в 1•PBS, в течение 14 часов при комнатной температуре в каждой из лунок, которые должны были быть покрытыми (операция, называемая "покрытие"). После иммобилизации антигена пластик в этих лунках покрывали белками путем инкубирования раствора 0,8% БСА (бычьего сывороточного альбумина) в 1•PBS в течение 4 часов при комнатной температуре в каждой из лунок (операция, называемая "блокирование"). После удаления "блокирующего" раствора 100 мкл каждой сыворотки, разведенной подходящим образом, инкубировали отдельно в каждой лунке в течение 90 минут при комнатной температуре: во время этой стадии, если в сыворотке имеются антитела против антигена, иммобилизованного на дне лунки, они будут связывать сам антиген и, в свою очередь, будут связываться с дном лунки. После инкубационного периода 90 минут сыворотки удаляли из лунок и после достаточного промывания к каждой лунке добавляли 100 мкл 0,8% БСА в 1•PBS, содержащем кроличьи антитела, направленные против мышиных антител, и инкубирование продолжали в течение 50 минут при комнатной температуре. Во время этой стадии, если мышиные антитела узнавали и связывали антиген, иммобилизованный на дне лунки, то эти мышиные антитела будут узнаваться и связываться кроличьими антителами, которые, в свою очередь, будут иммобилизованы на дне лунки. Кроме того, кроличьи антитела, направленные против мышиных антител (используемые в разведенном виде при отношении 1:100 в PBS/БСА для описываемого выше эксперимента), производимые и распределяемые компанией DAKO, ковалентно связаны с ферментом пероксидазой хрена. После инкубирования в течение 50 минут раствор, содержащий кроличьи антитела, удаляли, и лунки достаточно хорошо промывали. В этой точке к каждой лунке добавляли 100 мкл раствора, содержащего субстрат (ТМБ: 3,3; 5,5'-тетраметилбензидин-дихлорид) для пероксидазы хрена. Фермент превращает этот субстрат в продукт, который поглощает видимый свет при 450 нм; таким образом, количество превращения может быть рассчитано посредством спектрофотометрического измерения поглощения света при 450 нм в каждой отдельной лунке с использованием планшет-ридера EL1SA. Если эксперимент проведен точно, поглощение (то есть количество поглощенного света) пропорционально количеству фермента, которое, в свою очередь, пропорционально количеству кроличьих антител, которое, в свою очередь, пропорционально количеству мышиных антител, направленных против антигена, исходно присутствующему в сыворотке. Таким образом, измерение поглощения дает оценку количества мышиного антитела, направленного против антигена, присутствующего в сыворотке. Это верно, если мышиное антитело против этого антигена является фактором, лимитирующим цепь реакций, описанных выше. Таким образом, для получения подходящих условий рекомендуется проведение ряда разведений (от 1:33 до 1:8100) для каждой испытуемой сыворотки, так, чтобы для каждой сыворотки были получены определенные разведения, в которых количество мышиного антитела для антигена, использованного для иммунизации, будет достаточно высоким для точного измерения, но недостаточно высоким для насыщения системы.
Результаты эксперимента с иммунизацией IL-6 дикого типа иллюстрируются на фиг. 1а и 1b для типичной нормальной мыши и для типичной NSE/hIL-6 трансгенной мыши. Как можно видеть из фиг. 1а, нормальная мышь вырабатывала большое количество антител против wtIL-6, так много, что можно было детектировать сигнал, даже когда сыворотка была разведена 1:8100. Напротив, как можно видеть из фиг. 1b, трансгенная мышь вырабатывала гораздо меньшее количество антител: фактически сигнал исчезал, когда сыворотка из второй пробы была разведена в соотношении 1:300 и когда сыворотка из третьей пробы была разведена в соотношении 1:2700. Для проведения объективных измерений, сравнимых для всех животных, разведение сыворотки, которое дает регистрируемый результат 0,5 O.D.450 над самым высоким результатом предиммунной сыворотки из того же самого животного, было названо, как это принято, "титром". Фиг. 1а и 1b показывают, как рассчитывают титр второй и третьей проб для нормальных мышей и для NSE/hIL-6 трансгенных мышей, соответственно.
Фиг. 2а и 2b показывают результаты эксперимента по иммунизации, в котором использовали мутантную форму IL-6, Santl, для иммунизации типичной нормальной мыши и типичной NSE/hlL-6 трансгенной мыши, соответственно. В каждом случае обе мыши вырабатывали большое количество антител против Santl. Фактически, можно детектировать относительно сильный сигнал даже при разведении сыворотки 1: 8100. Фиг. 2а и 2b показывают, как рассчитывают титры второй и третьей проб для нормальной мыши и для трансгенной мыши.
Таблица 1 суммирует данные по титрам (рассчитанные, как описано выше) для второй и третьей проб для всех мышей, инокулированных во время этого эксперимента.
Что касается мышей, инокулированных антигеном wtIL-6, можно видеть, что независимо от вариаций между отдельными животными, в среднем нетрансгенные мыши вырабатывали ответную реакцию в виде образования антител против wtIL-6 в 10-20 раз более сильную, чем реакция, полученная в NSE/IL-6 трансгенных мышах, что является доказательством того факта, что трансгенные мыши развивали иммунную толерантность к hlL-6 человека.
Напротив, что касается мышей, инокулированных антигеном Santl, можно видеть, что, опять независимо от вариаций между отдельными животными, в среднем нетрансгенные мыши вырабатывали ответную реакцию в виде образования антител, равноценную реакции, полученной в NSE/hIL-6 трансгенных мышах, что позволяет предположить, что семь мутаций, которые были введены в полученный из hIL-6 Santl, делали мутант Santl полностью чужеродным белком для иммунной системы, которая в противном случае проявляет толерантность к hIL-6.
Пример 2
Антитела, вырабатываемые в сыворотке NSE/hIL-6 мышей, иммунизированных Santl, способны узнавать не только Santl, но также hIL-6 дикого типа
Проводили испытание, способны ли антитела, вырабатываемые мышами против Santl, узнавать не только сам Santl, но также hIL-6 дикого типа (wthIL-6). Эту гипотезу проверяли также с использованием теста ELISA. После подтверждения факта, что антитела, вырабатываемые в NSE/hIL-6 трансгенных мышах, иммунизированных Santl, способны узнавать и связывать тот же самый Santl, иммобилизованный на дне лунок планшета ELISA, во втором эксперименте IL-6 дикого типа связывали нековалентно со дном лунок планшета ELISA. После стадии, в которой пластик лунок насыщали БСА, к лункам добавляли разведения сыворотки из мышей, иммунизированных Santl, для проверки присутствия или отсутствия антител, способных узнавать wtIL-6. Например, фиг. 3 показывает результаты эксперимента для NSE/hIL-6 трансгенных мышей. Как можно видеть, ответные реакции в виде образования антител, полученные для Santl и для IL-6 дикого типа, являются очень похожими. Другими словами, можно детектировать присутствие антител, связавшихся с wtIL-6, иммобилизованным на дне лунок в сыворотке третьей пробы даже при ее разведении до соотношения 1:8100. Следует отметить, что при иммунизации NSE/hIL-6 трансгенных мышей непосредственно IL-6 дикого типа ответ в виде антител, направленных на сам IL-6 дикого типа, гораздо ниже: фактически невозможно детектировать антитела против wtIL-6 в сыворотке, разведенной до 1:8100 (см. фиг.1). Другие NSE/hIL-6 трансгенные мыши обнаружили ответную реакцию, сходную с ответом мыши, представленным в этом примере.
Антитела, вырабатываемые в сыворотке NSE/hIL-6 мышей, иммунизированных Santl, способны узнавать не только Santl, но также hIL-6 дикого типа
Проводили испытание, способны ли антитела, вырабатываемые мышами против Santl, узнавать не только сам Santl, но также hIL-6 дикого типа (wthIL-6). Эту гипотезу проверяли также с использованием теста ELISA. После подтверждения факта, что антитела, вырабатываемые в NSE/hIL-6 трансгенных мышах, иммунизированных Santl, способны узнавать и связывать тот же самый Santl, иммобилизованный на дне лунок планшета ELISA, во втором эксперименте IL-6 дикого типа связывали нековалентно со дном лунок планшета ELISA. После стадии, в которой пластик лунок насыщали БСА, к лункам добавляли разведения сыворотки из мышей, иммунизированных Santl, для проверки присутствия или отсутствия антител, способных узнавать wtIL-6. Например, фиг. 3 показывает результаты эксперимента для NSE/hIL-6 трансгенных мышей. Как можно видеть, ответные реакции в виде образования антител, полученные для Santl и для IL-6 дикого типа, являются очень похожими. Другими словами, можно детектировать присутствие антител, связавшихся с wtIL-6, иммобилизованным на дне лунок в сыворотке третьей пробы даже при ее разведении до соотношения 1:8100. Следует отметить, что при иммунизации NSE/hIL-6 трансгенных мышей непосредственно IL-6 дикого типа ответ в виде антител, направленных на сам IL-6 дикого типа, гораздо ниже: фактически невозможно детектировать антитела против wtIL-6 в сыворотке, разведенной до 1:8100 (см. фиг.1). Другие NSE/hIL-6 трансгенные мыши обнаружили ответную реакцию, сходную с ответом мыши, представленным в этом примере.
Пример 3
Антитела, вырабатываемые в NSE/hIL-6 мышах, иммунизированных Santl, способны также нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа
Целью было испытание, способны или нет антитела, выработанные NSE/hIL-6 трансгенными мышами, иммунизированными Santl, но способные узнавать IL-6 дикого типа, также нейтрализовать биологическую активность самого IL-6 дикого типа.
Антитела, вырабатываемые в NSE/hIL-6 мышах, иммунизированных Santl, способны также нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа
Целью было испытание, способны или нет антитела, выработанные NSE/hIL-6 трансгенными мышами, иммунизированными Santl, но способные узнавать IL-6 дикого типа, также нейтрализовать биологическую активность самого IL-6 дикого типа.
Биологической активностью IL-6 дикого типа, рассматриваемой здесь, была способность стимулировать транскрипцию промотором гена С-реактивного белка в клетках гепатомы человека Нер3В. Эффективность стимуляции транскрипции измеряли в соответствии с известными способами (Gregory, В., Savino, R. and Ciliberto, G., J. Immunological Methods, 170, 47-56, 1994). Клетки гепатомы человека Нер3В стимулировали 4 нг/мл IL-6 дикого типа в присутствии серийных разведений сыворотки, полученной в третьей пробе из двух NSE/hIL-6; трансгенных мышей 4 и 5 (обеих иммунизировали Santl). Результаты этого эксперимента даны на фиг. 4. Можно видеть, что обе сыворотки, разведенные 1:100, почти полностью ингибируют биологическую активность hIL-6 дикого типа при 4 нг/мл на клетках гепатомы человека.
В этой точке исследования проводили для проверки, способна ли перекрестная реактивность антител против hIL-6 дикого типа изменять уровни hIL-6 дикого типа, измеренные в сыворотке NSE/hIL-6 трансгенных мышей, иммунизированных Santl. Уровни hiL-6 измеряли в соответствии со стандартными способами посредством "сэндвич"-теста ELISA, с применением коммерчески доступного набора, производимого компанией "R and D Systems", в строгом соответствии с инструкциями изготовителя. Уровни hIL-6, найденные как в предиммунной пробе, так и в третьей пробе, измеряли для четырех трансгенных мышей, иммунизированных Santl. Результаты суммированы в таблице 2. Как можно видеть, иммунизация с использованием Santl, вызывающая также появление сильного ответа в виде антител, узнающих как сам Santl, так и wtIL-6, вызывает также среднее уменьшение более чем в 500 раз, уровней hIL-6, которые могут быть детектированы в сыворотке NSE/hIL-6 мышей при помощи "сэндвич"-теста ELISA с набором, производимым R and D Systems.
Пример 4
Антитела, вырабатываемые в NSE/hIL-6 мышах, вакцинированных Santl, способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа также и in vivo
Хорошо известно, что IL-6 индуцирует образование ряда белков (называемых "белками острой фазы") печенью. Сывороточный Амилоид А, здесь называемый SAA, обнаруживает интенсивное и быстрое увеличение во время острых событий.
Антитела, вырабатываемые в NSE/hIL-6 мышах, вакцинированных Santl, способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа также и in vivo
Хорошо известно, что IL-6 индуцирует образование ряда белков (называемых "белками острой фазы") печенью. Сывороточный Амилоид А, здесь называемый SAA, обнаруживает интенсивное и быстрое увеличение во время острых событий.
Целью было испытание, способны ли антитела, вырабатываемые NSE/hIL-6 трансгенными мышами, вакцинированными Santl и способные перекрестно реагировать с wtIL-6, также нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа iv vivo, измеренную как ингибирование увеличения мышиного SAA (mSAA) после инъекции hIL-6. Для этой цели брали пробу крови (называемую прединъекционной пробой) из неиммунизированных (контрольных) мышей NSE/hIL-6, из иммунизированных wtIL-6, из иммунизированных Santl NSE/hlL-6 трансгенных мышей. После восстановления от взятия крови животных инъецировали внутрибрюшинно 10 мкг wthIL-6. Спустя 9 часов после инъекции, брали вторую пробу крови (называемую здесь постинъекционной пробой) из обеих групп животных. Уровни mSAA измеряли как в прединъекционной пробе, так и в постинъекционной пробе в соответствии с известными в данной области способами при помощи "сэндвич"-теста ELISA с применением коммерчески доступного набора, производимого компанией "Biosource International", в строгом соответствии с инструкциями изготовителя. Результаты суммированы в таблице 3. Как можно видеть, независимо от вариаций между отдельными животными, в среднем в неиммунизированных мышах инъекция 10 мкг hIL-6 определила значительное увеличение уровней SAA в сыворотке, увеличение, которое отсутствовало в вакцинированных Santl мышах, инъецированных тем же количеством hIL-6. Таким образом, вакцинация Santl, вызывающая также появление сильной ответной реакции в виде антител, которые узнают как сам Santl, так и wthIL-6 и способны нейтрализовать биологическую активность wthIL-6 in vitro на клетках гепатомы человека, предотвращает in vivo увеличение уровней mSAA, индуцируемое инъекцией hIL-6, другими словами, она нейтрализует биологическую активность hIL-6 также и in vivo. Следует отметить, что иммунизация hIL-6 дикого типа индуцирует образование низкого количества антител против hIL-6 (см. пример 1), и она неспособна предотвращать in vivo увеличение уровней mSAA, индуцируемое инъекцией hIL-6, поскольку мыши, иммунизированные hIL-6 дикого типа, обнаруживают увеличение уровней SAA в сыворотке, сравнимое с увеличением, наблюдаемым в неиммунизированных контрольных мышах.
Пример 5
Иммунизация NSE/hIL-6 трансгенных мышей hiL-6 и Santl, приготовленных в другом адъюванте, гидроксиде алюминия
Хорошо известно, что различные антигены ведут себя по-разному при приготовлении их в различных адъювантах (Gupta, R. К. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). Полный (или неполный) адъювант Фрейнда, использованный в примере 1, не может использоваться в человеке вследствие побочных эффектов, главным образом, местных реакций в месте инъекции, таких, как образование гранулемы и кисты (Gupta, R. К. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). Целью было определение, можно ли выработать сходную иммунную реакцию с высоким титром антител против Santl и также против wthIL-6 в NSE/hIL-6 трансгенных мышах с применением адъюванта, обычно применяемого для вакцинации людей. Для этой цели был выбран гидроксид алюминия, поскольку в настоящее время он является общепринятым адъювантом для использования в случае человека и имеет превосходные зарегистрированные показатели безопасности (Gupta, R. К. and Siber, G.R., accine, 13, 1263-1276, 1995).
Иммунизация NSE/hIL-6 трансгенных мышей hiL-6 и Santl, приготовленных в другом адъюванте, гидроксиде алюминия
Хорошо известно, что различные антигены ведут себя по-разному при приготовлении их в различных адъювантах (Gupta, R. К. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). Полный (или неполный) адъювант Фрейнда, использованный в примере 1, не может использоваться в человеке вследствие побочных эффектов, главным образом, местных реакций в месте инъекции, таких, как образование гранулемы и кисты (Gupta, R. К. and Siber, G. R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). Целью было определение, можно ли выработать сходную иммунную реакцию с высоким титром антител против Santl и также против wthIL-6 в NSE/hIL-6 трансгенных мышах с применением адъюванта, обычно применяемого для вакцинации людей. Для этой цели был выбран гидроксид алюминия, поскольку в настоящее время он является общепринятым адъювантом для использования в случае человека и имеет превосходные зарегистрированные показатели безопасности (Gupta, R. К. and Siber, G.R., accine, 13, 1263-1276, 1995).
Группы по 8-10 NSE/hIL-6 трансгенных мышей (плюс десять нетрансгенных сиблингов, родившихся в тех же самых выводках, использовали в качестве контролей) иммунизировали внутрибрюшинно 100 мкг антигена (либо Santl, либо hIL-6 дикого типа), приготовленного в гидроксиде алюминия при концентрации 1 мг/мл в общем объеме 100 мкл (100 мкг гидроксида алюминия) для каждой инъекции, с применением протокола иммунизации, идентичного описанному в примере 1. Затем вторую пробу крови (взятую после второй инъекции или первого бустера) и третью пробу крови (взятую после третьей инъекции или второго бустера) тестировали на присутствие антител против антигена, использованного для иммунизации, при помощи ELISA, описанного в примере 1.
Для проведения объективных измерений, сравнимых для всех животных, разведение сыворотки, которое дает показатель 0,5 O.D.450 над наивысшим показателем, регистрируемым для предиммунной сыворотки из того же животного, было названо, как принято, "титром". Титр измеряли, как показано на фиг. 1а, 1b, 2а и 2b, для нормальных и трансгенных мышей, иммунизированных hIL-6 дикого типа и Santl. Результаты представлены в таблице 4.
В общем, количество антител против антигена, полученное в этом эксперименте по иммунизации (титр), выше по сравнению с количеством антител, полученным в эксперименте по иммунизации, описанном в примере 1; действительно, в данной области известен факт, что адъюванты с алюминием являются лучшими адъювантами для индукции сывороточных антител (Gupta, R.K. and Siber, G.R., Vaccine, 13, 1263-1276, 1995). Более конкретно, что касается мышей, иммунизированных антигеном wthIL-6, может быть видно опять, что (независимо от вариаций между отдельными животными) в среднем нетрансгенные мыши развивали ответную реакцию в виде образования антител против wthIL-6, в 12-18 раз более сильную, чем реакция, полученная в NSE/hIL-6 трансгенных мышах, что является доказательством того, что трансгенные мыши выработали иммунную толерантность в отношении человеческого IL-6 также и в том случае, когда этот антиген инъецировали в гидроксиде алюминия в качестве адъюванта. В противоположность этому, что касается мышей, иммунизированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, можно видеть, что также и в этом случае в среднем нетрансгенные мыши развивали ответную реакцию в виде антител, равноценную реакции, полученной в NSE/hIL-6 трансгенных мышах, как это было в эксперименте по иммунизации, описанном в примере 1, что позволяет предполагать, что семь мутаций (которые были введены в произведенный из hIL-6 Santl) превращали этот мутант в полностью чужеродный белок и при приготовлении в гидроксиде алюминия.
Пример 6
Антитела, выработанные в сыворотке мышей NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, способны узнавать не только Santl, но также hIL-6 дикого типа
Испытывали, способны ли антитела, выработанные против Santl, в мышах NSE, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, перекрестно реагировать с hIL-6 дикого типа (wthlL-6). Тест также проводили при помощи ELISA с использованием способов, описанных в примере 2. Титр антител рассчитывали, как описано ранее и как показано на фиг. 1а, 1b, 2a и 2b, и полученные результаты представлены в таблице 5.
Антитела, выработанные в сыворотке мышей NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, способны узнавать не только Santl, но также hIL-6 дикого типа
Испытывали, способны ли антитела, выработанные против Santl, в мышах NSE, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, перекрестно реагировать с hIL-6 дикого типа (wthlL-6). Тест также проводили при помощи ELISA с использованием способов, описанных в примере 2. Титр антител рассчитывали, как описано ранее и как показано на фиг. 1а, 1b, 2a и 2b, и полученные результаты представлены в таблице 5.
В этом случае также, если для иммунизации использовали гидроксид алюминия, титры антител против Santl и против hIL-6 дикого типа являются одинаковыми. Следует также отметить, что при иммунизации трансгенных мышей NSE/hlL-6 hIL-6 дикого типа, образование антител против самого hIL -6 дикого типа гораздо ниже: например, в третьей пробе крови средний титр против wthIL-6 равен 737 в группе мышей NSE/hlL-6, иммунизированных wthIL-6 (см. пример 5), в сравнении со средним титром против wthlL-6 22800 (в 13 раз выше) в группе мышей NSE/hIL-6, вакцинированных Santl.
Пример 7
Антитела, выработанные в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, также способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа
Целью было определение, способны ли антитела, выработанные в трансгенных мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, но способные узнавать hIL-6 дикого типа, также нейтрализовать биологическую активность самого hIL-6 дикого типа.
Антитела, выработанные в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, также способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа
Целью было определение, способны ли антитела, выработанные в трансгенных мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, но способные узнавать hIL-6 дикого типа, также нейтрализовать биологическую активность самого hIL-6 дикого типа.
Рассматриваемой биологической активностью IL-6 дикого типа была способность стимулировать транскрипцию промотором гена С-реактивного белка в клетках гепатомы человека Нер3В. Эффективность стимуляции транскрипции измеряли известными в данной области способами (Gregory, В., Savino, R. and Ciliberto, G., J. Immunological Methods, 170, 47-56, 1994). Клетки гепатомы человека Нер3В стимулировали 4 нг/мл hIL-6 дикого типа, и эту степень стимуляции брали за 100% или 4 нг/мл hIL-6 дикого типа в присутствии серийных разведений сыворотки, полученной из третьей пробы крови из мышей NSE/hIL-6, иммунизированных как Santl, так и hIL-6 дикого типа; в последних случаях степень стимуляции транскрипции выражали в виде процента стимуляции, полученной в клетках, инкубированных с 4 нг/мл только hIL-6 дикого типа. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 5а и 5b. Можно видеть, что сыворотка всех мышей, разведенная 1:400, почти полностью ингибирует биологическую активность hlL-6 дикого типа при 4 нг/мл на клетках гепатомы человека. Таким образом, способность нейтрализовать биологическую активность экзогенно добавленного hlL-6 на клетках гепатомы человека была даже более высокой для сывороток животных, иммунизированных с гидроксидом алюминия, чем в случае животных, иммунизированных CFA (см. пример 3 и сравни фиг.5а с фиг. 4). При иммунизации трансгенных мышей NSE/hIL-6 hlL-6 дикого типа очень низкое количество антител против hlL-6, полученное в этом случае, недостаточно для ингибирования биологической активности hlL-6 дикого типа на клетках гепатомы человека (см. фиг.5).
Также и в этом случае проводили исследования для выяснения, способно ли наличие перекрестно реактивного иммунного ответа против hlL-6 дикого типа изменять уровни hlL-6 дикого типа в сыворотке трансгенных мышей NSE/hIL-6, иммунизированных как Santl, так и hlL-6 дикого типа. Уровни hlL-6 измеряли, как описано в примере 3, как в предиммунной пробе, так и в третьей пробе обеих групп мышей. Результаты суммированы в таблице 6. Как можно видеть, вакцинация с использованием Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, в также вызывающим сильное образование антител, которые узнают как сам Santl, так и hlL-6 дикого типа, вызывает также среднее уменьшение приблизительно в 1400 раз уровней hlL-6, которые могут быть определены в сыворотке трансгенных мышей NSE/hIL-6. Иммунизация с использованием самого hlL-6 дикого типа, приготовленного в том же самом адъюванте, вызывает только незначительное уменьшение (в 3 раза по сравнению с 1400-кратным) уровней hIL-6, которые могут быть детектированы в сыворотке.
Пример 8
Антитела, вырабатываемые в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа также и in vivo
Целью было испытание, способны ли также антитела, выработанные в трансгенных мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, но способные узнавать wthIL-6, нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа in vivo, измеренную как увеличение уровней мышиного SAA (mSAA) в сыворотке, индуцируемое в мышах инъекцией hIL-6, как описано в примере 4. Эксперимент проводили, как описано в примере 4, на неиммунизированных (контрольных) мышах NSE/hIL-6 и на мышах NSE/hIL-6, иммунизированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия. Результаты суммированы в таблице 7. Как можно видеть, независимо от вариаций между отдельными животными, в среднем опять в неиммунизированных мышах инъекция 10 мкг hIL-6 определяла 5-6-кратное увеличение уровней SAA в сыворотке.
Антитела, вырабатываемые в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа также и in vivo
Целью было испытание, способны ли также антитела, выработанные в трансгенных мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, но способные узнавать wthIL-6, нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа in vivo, измеренную как увеличение уровней мышиного SAA (mSAA) в сыворотке, индуцируемое в мышах инъекцией hIL-6, как описано в примере 4. Эксперимент проводили, как описано в примере 4, на неиммунизированных (контрольных) мышах NSE/hIL-6 и на мышах NSE/hIL-6, иммунизированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия. Результаты суммированы в таблице 7. Как можно видеть, независимо от вариаций между отдельными животными, в среднем опять в неиммунизированных мышах инъекция 10 мкг hIL-6 определяла 5-6-кратное увеличение уровней SAA в сыворотке.
Увеличения не получали в мышах, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, инъецированных тем же количеством hIL-6.
Таким образом, вакцинация Santl, также вызывающая появление сильного гуморального ответа, образования антител, которые узнают как сам Santl, так и wthIL-6 и которые способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 in vitro на клетках гепатомы человека, предотвращает in vivo увеличение уровней mSAA, индуцируемое инъекцией hIL-6, другими словами, она нейтрализует биологическую активность hIL-6 также и in vivo.
Пример 9
Вакцинация трансгенных мышей NSE/hIL-6 hIL-6 и Santl, приготовленными в гидроксиде алюминия, через интрадермальный путь введения
Примеры 5, 6, 7 и 8, приведенные выше, показывают, что можно получить в животных, в противном случае толерантных к wthIL-6, сильный гуморальный ответ в виде образования антител против самого hIL-6, которые способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 как in vitro, так и in vivo, путем использования мутантной формы hIL-6 (Santl), приготовленной в адъюванте (гидроксиде алюминия), совместимом с применением для человека. Однако в эксперименте по иммунизации, описанном в примере 5, антиген инъецировали внутрибрюшинно, т. е. способом, который не является обычным способом для иммунизации человека. Следующей целью было выяснение, можно ли подобный иммунный ответ, с высоким титром антител против Santl и также против wthIL-6 получить в трансгенных мышах NSE/hIL-6 с использованием пути введения, применяемого для вакцинации человека.
Вакцинация трансгенных мышей NSE/hIL-6 hIL-6 и Santl, приготовленными в гидроксиде алюминия, через интрадермальный путь введения
Примеры 5, 6, 7 и 8, приведенные выше, показывают, что можно получить в животных, в противном случае толерантных к wthIL-6, сильный гуморальный ответ в виде образования антител против самого hIL-6, которые способны нейтрализовать биологическую активность hIL-6 как in vitro, так и in vivo, путем использования мутантной формы hIL-6 (Santl), приготовленной в адъюванте (гидроксиде алюминия), совместимом с применением для человека. Однако в эксперименте по иммунизации, описанном в примере 5, антиген инъецировали внутрибрюшинно, т. е. способом, который не является обычным способом для иммунизации человека. Следующей целью было выяснение, можно ли подобный иммунный ответ, с высоким титром антител против Santl и также против wthIL-6 получить в трансгенных мышах NSE/hIL-6 с использованием пути введения, применяемого для вакцинации человека.
Группы из 8-9 трансгенных мышей NSE/hIL-6 (плюс десять нетрансгенных сиблингов, родившихся в тех же самых выводках, используемых в качестве контролей) иммунизировали интрадермально (I. D.), способом введения, который соответствует подкожному (S.C.) способу введения, применяемому для человека в настоящее время для введения различных вакцин, как описано в современной литературе в данной области знаний. Для каждой инъекции опять использовали 100 мкг антигена (либо Santl, либо hIL-6 дикого типа), приготовленного в гидроксиде алюминия при концентрации 1 мг/мл в общем объеме 100 мкл (100 мкг гидроксида алюминия), с применением протокола иммунизации, идентичного протоколу, описанному в примере 1. Затем вторую пробу (взятую после второй инъекции или первого бустера) и третью пробу крови (взятую после третьей инъекции или второго бустера) тестировали на присутствие антител против антигена, использованного для иммунизации, при помощи способа ELISA, идентичного уже описанному в примере 1.
Для проведения объективных измерений, сравнимых для всех животных, разведение сыворотки, которое дает регистрируемый показатель 0,5 O.D.450 над наивысшим показателем предиммунной сыворотки из того же животного, называли титром, как это принято. Титр измеряли, как показано на фиг. 1a, 1b, 2а и 2b, как для нормальных, так и для трансгенных мышей, иммунизированных Santl. Результаты представлены в таблице 8.
Что касается мышей, иммунизированных антигеном hIL-6 дикого типа, опять можно видеть, что (независимо от вариаций между отдельными животными) в среднем нетрансгенные мыши развивали гуморальный ответ против wthIL-6, в 40-50 раз более высокий, чем ответ, полученный в трансгенных мышах NSE/hlL-6, что является доказательством того, что трансгенные мыши выработали иммунную толерантность к IL-6 человека также при инъекции этого антигена, приготовленного в гидроксиде алюминия, интрадермальной инъекцией. В противоположность этому, что касается мышей, иммунизированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, можно видеть, что также и в этом случае в среднем нетрансгенные мыши вырабатывали гуморальный ответ, равноценный ответу, полученному в трансгенных мышах NSE/hlL-6, как это было в экспериментах по иммунизации, описанных в примерах 1 и 5, что позволяет предположить, что семь замен (которые при введении в hIL-6 давали Santl) делали этот мутантный белок полностью чужеродным белком также и при приготовлении в гидроксиде и инъекции интрадермальным путем.
Пример 10
Антитела, выработанные в сыворотке мышей NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, способны узнавать не только Santl, но также hIL-6 дикого типа
В этом примере определяли, способны ли антитела, выработанные в мышах NSE, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, перекрестно реагировать с hIL-6 дикого типа (wthIL-6). Испытание проводили также при помощи ELISA с использованием способов, описанных в примере 2. Титр антител рассчитывали, как описано ранее и как показано на фиг. 1а, 1b, 2а и 2b, и полученные данные представлены в таблице 9.
Антитела, выработанные в сыворотке мышей NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия, способны узнавать не только Santl, но также hIL-6 дикого типа
В этом примере определяли, способны ли антитела, выработанные в мышах NSE, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, перекрестно реагировать с hIL-6 дикого типа (wthIL-6). Испытание проводили также при помощи ELISA с использованием способов, описанных в примере 2. Титр антител рассчитывали, как описано ранее и как показано на фиг. 1а, 1b, 2а и 2b, и полученные данные представлены в таблице 9.
В этом случае также при использовании гидроксида алюминия в качестве адъюванта для иммунизации через интрадермальный путь введения титры антител против Santl и hIL-6 дикого типа были очень сходными. Следует еще раз отметить, что при иммунизации трансгенных NSE/hIL-6 мышей hIL-6 дикого типа образование антител, направленных против самого hIL-6 дикого типа, гораздо ниже: например, в третьей пробе крови средний титр против wthIL-6 равен 139 в группе мышей NSE/hIL-6, иммунизированных wthIL-6 (см. пример 9), по сравнению со средним титром против wthIL-6, равным 9400 (в 70 раз более высоким), в группе мышей NSE/hIL-6, иммунизированных Santl.
Пример 11
Антитела, выработанные в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным внутридермально, способны также нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа
Целью было выяснение, способны ли также антитела, выработанные в трансгенных мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, нейтрализовать биологическую активность самого hIL-6 дикого типа.
Антитела, выработанные в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным внутридермально, способны также нейтрализовать биологическую активность hIL-6 дикого типа
Целью было выяснение, способны ли также антитела, выработанные в трансгенных мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, нейтрализовать биологическую активность самого hIL-6 дикого типа.
В этом примере биологической активностью IL-6 дикого типа также была способность стимулировать транскрипцию промотором гена С-реактивного белка в клетках гепатомы человека Нер3В. Эффективность стимуляции транскрипции измеряли известными в данной области способами (Gregory. В., Savino, R., and Ciliberto, G., J. Immunological Methods, 170, 47-56, 1994). Как и в примере 7, клетки гепатомы человека Нер3В стимулировали 4 нг/мл hIL-6 дикого типа, и эту степень стимуляции брали за 100%, или 4 нг/мл hIL-6 дикого типа в присутствии серийных разведений сыворотки, полученной из третьей пробы крови из мышей NSE/hIL-6, иммунизированных интрадермально как Santl, так и hIL-6 дикого типа; в последних случаях степень стимуляции транскрипции выражали в виде процента стимуляции, полученной в клетках, инкубированных с 4 нг/мл только hIL-6 дикого типа. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 6а и 6b. Можно видеть, что сыворотка всех мышей, разведенная 1:400, ингибирует более 80% биологической активности hIL-6 дикого типа при 4 нг/мл на клетках гепатомы человека. Следует опять отметить, что при иммунизации трансгенных NSE/hIL-6 мышей hIL-6 дикого типа очень низкое количество полученных антител против hIL-6 является недостаточным для ингибирования биологической активности hIL-6 на клетках гепатомы человека (см. фиг.6b).
Также и в этом случае проводили исследования для выяснения, способен ли перекрестно-реактивный иммунный ответ против hIL-6 дикого типа изменять уровни hIL-6 дикого типа, измеренные в сыворотке трансгенных мышей NSE/hIL-6, иммунизированных как Santl, так и hIL-6 дикого типа. Уровни hIL-6 измеряли, как описано в примере 3, как в предиммунной пробе, так и в третьей пробе обеих групп мышей. Результаты суммированы в таблице 10. Как можно видеть, вакцинация с использованием Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, также вызывающая появление сильного гуморального ответа в виде образования антител, которые узнают как сам Santl, так и hIL-6 дикого типа, вызывает также среднее уменьшение приблизительно в 350 раз уровней hIL-6, которые могут быть обнаружены в сыворотке трансгенных мышей NSE/hIL-6. Напротив, иммунизация с использованием самого hIL-6, приготовленного в том же самом адъюванте, вызывала лишь маргинальное уменьшение (в 2,4 раза в сравнении с 350-кратным) уровней hIL-6, которое можно было обнаружить в сыворотке.
Пример 12
Антитела, выработанные в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, способны нейтрализовать биологическую активность wthIL-6 также и in vivo.
Антитела, выработанные в мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, способны нейтрализовать биологическую активность wthIL-6 также и in vivo.
Целью было испытание, способны ли также антитела, вырабатываемые трансгенными мышами NSE/hIL-6, вакцинированными Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально, нейтрализовать одну из биологических активностей hIL-6 дикого типа in vivo, т.е. увеличение уровней мышиного SAA (mSAA), нормально индуцируемое в мышах инъекцией hIL-6, как описано в примере 4. Эксперимент проводили, как описано в примере 4, на мышах NSE/hIL-6, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально. Полученные величины сравнивали с контрольными неиммунизированными мышами экспериментов, описанных в примерах 4 (таблица 3) и 8 (таблица 7). Результаты суммированы в таблице 11. Как можно видеть, независимо от вариаций между отдельными животными, в среднем опять 7-кратное увеличение уровней SAA, индуцируемое инъекций hIL-6 в неиммунизированных мышах, отсутствовало в мышах, вакцинированных Santl, приготовленным в гидроксиде алюминия и инъецированным интрадермально.
Таким образом, вакцинация Santl, проводимая с адъювантом и путем введения, совместимыми с использованием для человека, а также вызывающая появление сильного гуморального ответа в виде образования антител, которые узнают как сам Santl, так и wthIL-6 и которые способны нейтрализовать биологическую активность wthIL-6 in vitro на клетках гепатомы человека, предотвращает in vivo увеличение уровней mSAA, индуцируемое инъекцией hIL-6, другими словами, нейтрализует биологическую активность hIL-6 in vivo.
Claims (11)
1. Применение мутеина интерлейкина-6 (IL-6) человека, имеющего в аминокислотной последовательности IL-6 человека семь аминокислотных замен, Tyr31Asp, Gly35Phe, Ser118Arg, Vall21Asp, Glnl7511e, Serl76Arg и Glnl83Ala, в качестве активного начала при лечении или предотвращении патологического состояния, вызванного избыточной продукцией IL-6 человека.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное патологическое состояние выбирается из группы, состоящей из хронических аутоиммунных заболеваний, системной красной волчанки, миеломы/плазмацитомы, постклимактерического остеопороза и раковой кахексии.
3. Иммуногенная композиция, содержащая иммунногенное эффективное количество мутеина интерлейкина-6 (IL-6) человека, имеющего в аминокислотной последовательности IL-6 человека семь аминокислотных замен, Tyr31Asp, Gly35Phe, Ser118Arg, Vall21Asp, Glnl7511e, Serl76Arg и Glnl83Ala, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или вспомогательный агент.
4. Иммуногенная композиция по п. 3, отличающаяся тем, что дополнительно содержит добавки, выбранные из группы, состоящей из увлажняющих агентов, эмульгирующих агентов, буферных рН-агентов и адъювантов, повышающих эффективность иммуногенной композиции.
5. Иммуногенная композиция по п. 3 или 4, отличающаяся тем, что эффективное количество мутеина интерлейкина-6 составляет от 0,1 до 100 мг.
6. Иммуногенная композиция по любому из пп. 3-5, отличающаяся тем, что иммуноген приготовлен в гидроксиде алюминия в концентрации 1 мг/мл.
7. Иммуногенная композиция по любому из пп. 3-6, отличающаяся тем, что композиция приготовлена в форме, выбираемой из группы, состоящей из таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул, эликсиров, мазей, растворов, суспензий, сиропов, суппозиториев и эмульсий.
8. Иммуногенная композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанная форма представляет собой инъецируемую форму.
9. Иммуногенная композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанная форма представляет собой пероральную форму.
10. Иммуногенная композиция по любому из пп. 5-9, отличающаяся тем, что содержание иммуногена составляет от 10 до 95% композиции.
11. Иммуногенная композиция по п. 10, отличающаяся тем, что содержание иммуногена составляет от 25 до 70% композиции.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM95A000589 | 1995-09-01 | ||
| IT95RM000589A IT1277926B1 (it) | 1995-09-01 | 1995-09-01 | Uso di muteine di citochine naturali come immunogeni per la preparazione di composizioni farmaceutiche per curare o prevenire |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98105679A RU98105679A (ru) | 2000-02-20 |
| RU2182014C2 true RU2182014C2 (ru) | 2002-05-10 |
Family
ID=11403544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98105679/14A RU2182014C2 (ru) | 1995-09-01 | 1996-08-22 | Использование мутеинов цитокинов дикого типа в качестве иммуногенов |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6706261B1 (ru) |
| EP (1) | EP0858345B1 (ru) |
| JP (1) | JP3157837B2 (ru) |
| KR (1) | KR100279539B1 (ru) |
| CN (1) | CN1138562C (ru) |
| AT (1) | ATE226446T1 (ru) |
| AU (1) | AU703300B2 (ru) |
| CA (1) | CA2229045C (ru) |
| DE (1) | DE69624498T2 (ru) |
| DK (1) | DK0858345T3 (ru) |
| ES (1) | ES2183007T3 (ru) |
| IT (1) | IT1277926B1 (ru) |
| MX (1) | MX9801550A (ru) |
| PT (1) | PT858345E (ru) |
| RU (1) | RU2182014C2 (ru) |
| WO (1) | WO1997009064A1 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001025277A1 (en) * | 1999-10-07 | 2001-04-12 | Maxygen Aps | Single-chain antagonist polypeptides |
| FR2812813B1 (fr) * | 2000-08-09 | 2004-11-26 | Neovacs | Utilisation d'immunogenes pour traiter ou prevenir au sein des tumeurs malignes les dereglements immunitaires induits par des facteurs extracellulaires |
| FR2838444B1 (fr) * | 2002-04-10 | 2016-01-01 | Neovacs | Nouveaux peptides et leur application en therapeutique |
| IL161672A0 (en) * | 2004-04-29 | 2004-09-27 | Yeda Res & Dev | Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy |
| FR2978964B1 (fr) | 2011-08-09 | 2015-02-20 | Conservatoire Nat Arts | Composition vaccinale anti-il-6 |
| WO2015024148A1 (zh) * | 2013-08-23 | 2015-02-26 | 中国科学院微生物研究所 | 异源动物细胞因子突变体疫苗 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994002512A1 (en) * | 1992-07-23 | 1994-02-03 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Carboxy terminal il-6 muteins |
| WO1994011402A1 (en) * | 1992-11-06 | 1994-05-26 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | Mutant interleukin 6 with improved biological activity over wild interleukin 6 |
| WO1995000852A2 (en) * | 1993-06-23 | 1995-01-05 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | A methodology for selecting superagonists, antagonists and superantagonists of hormones whose receptor complex includes gp 130 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2677654B1 (fr) | 1991-06-17 | 1995-11-17 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Composes a effet immunogene anti-cytokine, a effet immunogene anticytostatique ou a effet vaccinal anti-infection a hiv. |
| WO1997010338A1 (en) | 1995-09-12 | 1997-03-20 | Chiron Corporation | Improved interleukin-6 receptor antagonist |
-
1995
- 1995-09-01 IT IT95RM000589A patent/IT1277926B1/it active IP Right Grant
-
1996
- 1996-08-22 CA CA002229045A patent/CA2229045C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-22 RU RU98105679/14A patent/RU2182014C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-08-22 DE DE69624498T patent/DE69624498T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-22 WO PCT/IT1996/000164 patent/WO1997009064A1/en not_active Ceased
- 1996-08-22 DK DK96930345T patent/DK0858345T3/da active
- 1996-08-22 AT AT96930345T patent/ATE226446T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-22 KR KR1019980701561A patent/KR100279539B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-22 JP JP51104897A patent/JP3157837B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-22 ES ES96930345T patent/ES2183007T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-22 PT PT96930345T patent/PT858345E/pt unknown
- 1996-08-22 CN CNB961972955A patent/CN1138562C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-22 AU AU69428/96A patent/AU703300B2/en not_active Ceased
- 1996-08-22 MX MX9801550A patent/MX9801550A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-08-22 EP EP96930345A patent/EP0858345B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-04-27 US US09/559,950 patent/US6706261B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994002512A1 (en) * | 1992-07-23 | 1994-02-03 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Carboxy terminal il-6 muteins |
| WO1994011402A1 (en) * | 1992-11-06 | 1994-05-26 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | Mutant interleukin 6 with improved biological activity over wild interleukin 6 |
| WO1995000852A2 (en) * | 1993-06-23 | 1995-01-05 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | A methodology for selecting superagonists, antagonists and superantagonists of hormones whose receptor complex includes gp 130 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEEBEEK et al.. Identification of receptor binging site in the carboxyl terminus of human Unterleikin-6, J. Biol. chem. , 1992, v.267, № 21, pp. 14832-38. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6706261B1 (en) | 2004-03-16 |
| EP0858345A1 (en) | 1998-08-19 |
| CA2229045A1 (en) | 1997-03-13 |
| DE69624498T2 (de) | 2003-06-18 |
| JP3157837B2 (ja) | 2001-04-16 |
| DK0858345T3 (da) | 2003-02-24 |
| PT858345E (pt) | 2003-02-28 |
| DE69624498D1 (de) | 2002-11-28 |
| ITRM950589A1 (it) | 1997-03-01 |
| ES2183007T3 (es) | 2003-03-16 |
| HK1015708A1 (en) | 1999-10-22 |
| CN1138562C (zh) | 2004-02-18 |
| EP0858345B1 (en) | 2002-10-23 |
| KR19990044321A (ko) | 1999-06-25 |
| AU6942896A (en) | 1997-03-27 |
| ITRM950589A0 (it) | 1995-09-01 |
| JPH10511111A (ja) | 1998-10-27 |
| CA2229045C (en) | 2005-10-25 |
| MX9801550A (es) | 1998-05-31 |
| AU703300B2 (en) | 1999-03-25 |
| IT1277926B1 (it) | 1997-11-12 |
| CN1198098A (zh) | 1998-11-04 |
| WO1997009064A1 (en) | 1997-03-13 |
| ATE226446T1 (de) | 2002-11-15 |
| KR100279539B1 (ko) | 2001-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100697120B1 (ko) | Ｉｌ-18 매개 질환의 치료에 유용한 재조합 ｉｌ-18 길항제 | |
| US20020090379A1 (en) | Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign t-cell epitopes | |
| US9394362B2 (en) | IL-21 antibodies and methods of making or using the antibodies | |
| JPH10503749A (ja) | ＩｇＥアンタゴニストを用いる寄生虫感染症の治療法 | |
| JP2646114B2 (ja) | ガンマインターフェロンに対する拮抗物質を用いるｍｈｃ関連自己免疫疾患を制御するための方法および投与形態 | |
| KR20090056537A (ko) | Ｂ형 간염 바이러스 중화능을 갖는 항체를 유효성분으로포함하는 ｂ형 간염 바이러스 감염의 예방 또는 치료용조성물 | |
| RU2182014C2 (ru) | Использование мутеинов цитокинов дикого типа в качестве иммуногенов | |
| US12595300B2 (en) | Anti-human P40 protein domain antibody and use thereof | |
| Argiro et al. | Induction of a protective immunity against Schistosoma mansoni with ovalbumin-coupled Sm37-5 coadsorbed with granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) or IL-12 on alum | |
| JP3910635B2 (ja) | Ｈｄｌコレステロールレベルを増大する方法 | |
| KR100834383B1 (ko) | 전환 성장 인자 알파를 함유하는 백신 조성물 | |
| US6645486B1 (en) | Method of treatment with IL-9 conjugate | |
| KR100587944B1 (ko) | 보강제 및 ＨＢＶ 백신 성분인 Ｂ형 간염 바이러스의ｐｒｅ Ｓ단백질 | |
| EP1198246B1 (en) | Methods for preventing or attenuating pathoangiogenic conditions by using the gbs-toxin (cm101) receptor as a vaccine | |
| US6355256B1 (en) | Compositions containing a p53 derived protein or peptide, an adjuvant, and interleukin-12 and uses thereof | |
| US20080187536A1 (en) | Immunological modulation of insulin-like growth factor 1 for cancer prevention/treatment and prolonging longevity | |
| US20030235891A1 (en) | Method for generating monoclonal antibodies | |
| AU715410C (en) | Method for increasing HDL cholesterol level | |
| US20080118524A1 (en) | Anti-IgE Vaccines | |
| VENN et al. | Clonal repertoire analysis of murine B cells specific for repeat sequence antigens of Plasmodium falciparum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090823 |