RU2201962C2 - Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека - Google Patents
Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2201962C2 RU2201962C2 RU2001107330/13A RU2001107330A RU2201962C2 RU 2201962 C2 RU2201962 C2 RU 2201962C2 RU 2001107330/13 A RU2001107330/13 A RU 2001107330/13A RU 2001107330 A RU2001107330 A RU 2001107330A RU 2201962 C2 RU2201962 C2 RU 2201962C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- csf
- protein
- rhg
- carried out
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 title abstract 3
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 title abstract 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 17
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims abstract description 12
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 3
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 201000010000 Agranulocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010018687 Granulocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- BTURAGWYSMTVOW-UHFFFAOYSA-M sodium dodecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC([O-])=O BTURAGWYSMTVOW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940082004 sodium laurate Drugs 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для выделения и очистки физиологически активного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (рчГ-КСФ). рчГ-КСФ получают из трансформированных клеток Escherichia coli. Тела включения, содержащие рекомбинантный фактор, растворяют мочевиной, восстановление проводят 10 мМ 2-меркаптоэтанолом. Ренатурацию осуществляют разбавлением раствора нейтральным буфером, содержащим ЭДТА, до концентрации мочевины 0,8 М. Хроматографическую очистку рч Г-КСФ проводят на двух последовательно соединенных колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и SP-сефадексом с последующим элюированием целевого белка с колонки с SP-сефадексом в линейном градиенте хлористого натрия в 0,02 М натрий ацетатном буфере при рН 4,4-4,5. Изобретение позволяет увеличить выход продукта с сохранением его биологической активности и чистоты. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 ил.
Description
Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и представляет собой способ выделения и очистки физиологически активного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (рчГ-КСФ), пригодного для научно-исследовательских работ и в качестве медицинского препарата.
Г-КСФ относится к группе клеточных факторов роста и играет важную роль в стимулировании пролиферации, дифференциации и функциональной активности гранулоцитсодержащих лейкоцитов крови [1], рчГ-КСФ снижает продолжительность нейтропении при химиотерапии злокачественных опухолей и трансплантации костного мозга [2, 3], укорачивает период гранулоцитопении, индуцируемой облучением [4]. Все это делает перспективным его применение в медицине.
Е. coli-продуцированный рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор - это 174-аминокислотная последовательность, содержащая дополнительный Met на N-конце. Молекулярная масса белка, определенная электрофорезом в денатурирующих условиях, составляет 18800 Д [5]. Молекула содержит свободный цистеин в положении 17 и две внутримолекулярные дисульфидные связи Cys36-Sys42 и Sys64-Sys74 [5]. Для восстановления биологической активности рчГ-КСФ, экспрессированного в Е.coli в виде нерастворимых тел включения, требуется ренатурация [6].
Известен способ получения Г-КСФ из клеток карциномы мочевого пузыря (линия 5737) [7, 8]. Метод включает концентрирование культуральной жидкости сульфатом аммония, диализ, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрацию на Ультрагеле АсА-54 и обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Приведенный метод позволил получить препарат с содержанием Г-КСФ более 95% (по результатам гель-электрофореза в полиакриламидном геле). Данные о выходе и содержании примесей отсутствуют.
Недостатки способа: использование соматических клеток влечет за собой повышенную трудоемкость по их сохранению и культивированию, процесс включает три хроматографические очистки, что также повышает трудоемкость процесса и понижает выход продукта. Кроме того, использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии требует специального оборудования.
Описан способ [7] получения рчГ-КСФ из E.coli, трансформированной плазмидой p536hG-CSF2. Клетки суспендируют в воде, и суспензию несколько раз продавливают в френч-прессе. Осадок отделяют центрифугированием и ресуспендируют в воде до концентрации белка 5-6 мг/мл. Осадок отделяют центрифугированием и материал осадка растворяют в 1% лаурате натрия, содержащем 50 мМ трис, рН 8,5 и 5% этанол. Нерастворимый материал отделяют центрифугированием, а супернатант наносят на колонку (С4) ВЭЖХ. Колонку промывают 100 мМ ацетатом аммония, рН 6,0-7,0 и элюируют рчГ-КСФ градиентом изопропанола в ацетате аммония. Чистота препарата по результатам гель-электрофореза в полиакриламидном геле более 95%. Недостатком способа является использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, что требует специального дорогостоящего оборудования. Данных о выходе рчГ-КСФ нет.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения рекомбинантного Г-КСФ человека из клеток Escherichia coli, содержащих плазмиду pCfBD28 [9] (прототип). Клетки разрушают ультразвуком в трис-НСl буфере. Тела включения отделяют центрифугированием и промывают.
Отмытые тела включения растворяют в 20 мМ трис-НСl буфере, рН 8,0, содержащем 8 М мочевину.
К полученному раствору добавляют дитиотреит до концентрации 0,1 мМ и инкубируют в течение 5 ч при температуре 4oС.
К раствору восстановленного белка для ренатурации добавляют окисленный глутатион до концентрации 0,1 мМ и инкубируют в течение ночи при температуре 4oС.
Раствор ренатурированного белка наносят на колонку ДЭАЭ-Тойоперл, уравновешенную 10 мМ трис-НCl буфером, рН 8,0. рчГ-КСФ элюируют линейным градиентом хлористого натрия.
К элюату, содержащему рчГ-КСФ, добавляют сульфат аммония до концентрации 0,25 М, и раствор наносят на колонку Бутил-Тойоперл, уравновешенную 10 мМ трис-НCl буфером, рН 8,0, содержащим 0,25 М сульфат аммония. рчГ-КСФ элюируют раствором буфера с понижающейся концентрацией сульфата аммония.
Фракции, содержащие рчГ-КСФ, объединяют и обессоливают на колонке с сефадексом G-25 в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,2.
Электрофоретическая чистота получаемого рчГ-КСФ при нагрузке на гель 8 мкг препарата составила более 99%. Выход очищенного рчГ-КСФ составил 33% по отношению к количеству рчГ-КСФ в телах включения.
Недостатками способа-прототипа являются:
- использование для ренатурации специального окислителя - окисленного глутатиона;
- использование для получения очищенного рчГ-КСФ трех стадий хроматографии.
- использование для ренатурации специального окислителя - окисленного глутатиона;
- использование для получения очищенного рчГ-КСФ трех стадий хроматографии.
Технической задачей данного изобретения является упрощение способа, снижение потерь целевого продукта и получение препарата рчГ-КСФ с низким содержанием примесей ДНК, липополисахаридов и белков штамма-продуцента, пригодного для использования не только в научно-исследовательских работах, но и в качестве основы для создания нового лекарственного препарата [10].
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: биомассу рекомбинантного штамма E. coli SG 20050/pGGF8 [11], выращенную как описано ранее [12] и собранную центрифугированием, суспендируют в 10 мМ трис-НCl буфере, рН 8,0. Суспензию клеток обрабатывают ультразвуком в течение 5 мин и центрифугируют в течение 20 мин.
Полученный осадок тел включения отмывают известным способом [9].
Отмытый осадок тел включения растворяют в 10 мМ трис-НСl буфере, рН 8,0, содержащем 8 М мочевину.
К раствору добавляют 2-меркаптоэтанол до концентрации 10 мМ и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре.
рчГ-КСФ ренатурируют путем разбавления полученного белкового раствора 10 мМ натрий фосфатным буфером, рН 8,0, содержащим 10 мМ ЭДТА и выдерживанием раствора при температуре 4-6oС в течение 20-24 ч.
К смеси ренатурированных белков добавляют уксусную кислоту до рН 4,4-4,5, разбавляют в два раза водой.
Полученный раствор ренатурированного белка наносят на две, соединенные последовательно и уравновешенные 20 мМ натрий ацетатным буфером, рН 4,4-4,5 (буфер "А"), колонки с ДЭАЭ-целлюлозой и SP-сефадексом (С-25). После нанесения всего раствора колонки промывают буфером "А". Колонку с ДЭАЭ-целлюлозой отсоединяют и элюируют рчГ-КСФ с SP-сефадекса линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,4 М в буфере "А". Фракции, содержащие рчГ-КСФ, объединяют.
Полученный элюат диализуют против 0,05 М натрий ацетатного буфера, рН 4,4-4,5, содержащего 0,1 М хлористый натрий.
Выход электрофоретически гомогенного рчГ-КСФ составляет 24-30 мг из 1 л культуры клеток E. coli SG 20050/pGGF8 (57% от количества рчГ-КСФ в телах включения). Специфическая активность, определенная по образованию колоний нейтрофилов из клеток предшественников костного мозга мыши [13, 15], составляет 107-108 МЕ/мг белка. Содержание примесей липополисахаридов, ДНК и белков штамма-продуцента соответствует требованиям Фармкомитета к качеству генно-инженерных препаратов медицинского назначения [10].
Предлагаемая схема позволяет получать препараты рчГ-КСФ с высоким выходом и необходимой чистотой, что позволяет использовать их в качестве субстанции для создания лекарственного препарата нового поколения.
Новым по сравнению со способом-прототипом является:
- ренатурация рчГ-КСФ разбавлением раствора тел включения нейтральным буфером, содержащим ЭДТА (вместо использования дорогостоящего окисленного глутатиона в способе-прототипе);
- одностадийная хроматографическая очистка рчГ-КСФ на двух последовательно соединенных колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и SP-сефадексом в градиенте концентрации соли (вместо трехстадийной в способе-прототипе).
- ренатурация рчГ-КСФ разбавлением раствора тел включения нейтральным буфером, содержащим ЭДТА (вместо использования дорогостоящего окисленного глутатиона в способе-прототипе);
- одностадийная хроматографическая очистка рчГ-КСФ на двух последовательно соединенных колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и SP-сефадексом в градиенте концентрации соли (вместо трехстадийной в способе-прототипе).
Все это позволяет упростить способ получения рчГ-КСФ и повысить выход конечного продукта с 33% в способе-прототипе до 57%.
Предлагаемый способ осуществлен с использованием штамма-продуцента, полученного трансформацией клеток E.coli SG20050 плазмидой pGGF8 [11]. Биомасса клеток получена, как описано ранее [12].
Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и осадок тел включения отмывают известным способом. Растворение тел включения происходит в буферном растворе, содержащем 8 М мочевину.
По результатам электрофореза полученного материала в ПААГ в присутствии SDS без обработки 2-меркаптоэтанолом нерастворимый и неактивный белок в телах включения представляет собой олигомеры, где полипептиды соединены дисульфидными связями. Для разрушения дисульфидных связей и получения мономерного белка используют восстановление 2-меркаптоэтанолом.
Полученный раствор белка для ренатурации разбавляют фосфатным буфером до концентрации мочевины 0,8 М и выдерживают раствор при температуре 4-6oC в течение 18-20 ч. В результате понижения концентрации мочевины происходит сворачивание (ренатурация) полипептидных молекул, а за счет растворенного кислорода происходит образование внутримолекулярных дисульфидных связей. Для минимизации образования межмолекулярных связей процесс проводят при температуре 4-6oС.
Для остановки процесса ренатурации и снижения количества олигомеров используют закисление смеси уксусной кислотой до рН 4,4-4,5.
Для очистки белка используют одностадийную хроматографию на двух колонках: первая с ДЭАЭ-целлюлозой, вторая с SP-сефадексом. Использование ДЭАЭ-целлюлозы позволяет сорбировать из раствора липополисахариды, нуклеиновые кислоты и белки штамма-продуцента. При этом рчГ-КСФ на первой колонке не сорбируется. На второй колонке происходит сорбция рчГ-КСФ, при этом если часть липополисахаридов и нуклеиновых кислот не сорбировалась на ДЭАЭ-целлюлозе, то они не сорбируются и на SP-сефадексе и элюируются при промывке колонки. рчГ-КСФ элюируют с SP-сефадекса градиентом концентрации хлористого натрия (0-0,4 М) в 0,02 М натрий ацетатном буфере, рН 4,4-4,5. Использование приведенного способа позволяет снизить потери при хроматографической очистке рчГ-КСФ примерно на 20% по сравнению со способом-прототипом и получать рчГ-КСФ с высоким выходом 24-30 мг/л культуры и незначительным содержанием липополисахаридов, белков штамма-продуцента, ДНК.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурами графического изображения, где представлены:
Фиг.1. Электрофоретический анализ белков в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS в ходе получения нерастворимых тел включения:
дорожка 1 - разрушенные клетки штамма-продуцента;
дорожка 2 - супернатант после отделения тел включения;
дорожка 3 - супернатант после промывки 1 М LiCl с мочевиной;
дорожка 4 - супернатант после промывки буферным раствором;
дорожки 5, 6 - отмытые тела включения в мочевине (5 и 10 мкг белка);
дорожка 7 - белки-стандарты.
Фиг.1. Электрофоретический анализ белков в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS в ходе получения нерастворимых тел включения:
дорожка 1 - разрушенные клетки штамма-продуцента;
дорожка 2 - супернатант после отделения тел включения;
дорожка 3 - супернатант после промывки 1 М LiCl с мочевиной;
дорожка 4 - супернатант после промывки буферным раствором;
дорожки 5, 6 - отмытые тела включения в мочевине (5 и 10 мкг белка);
дорожка 7 - белки-стандарты.
Фиг.2. Профиль элюции рчГ-КСФ с колонки с SP-сефадексом.
Фиг.3. Электрофоретический анализ очищенного рчГ-КСФ:
дорожки 1, 2 - препараты рчГ-КСФ (по 40 мкг/гель): подготовка проб в присутствии 2-меркаптоэтанола;
дорожка 3 - белки-стандарты;
дорожки 4, 5 - препараты рчГ-КСФ (по 40 мкг/гель): подготовка проб в отсутствие 2-меркаптоэтанола.
дорожки 1, 2 - препараты рчГ-КСФ (по 40 мкг/гель): подготовка проб в присутствии 2-меркаптоэтанола;
дорожка 3 - белки-стандарты;
дорожки 4, 5 - препараты рчГ-КСФ (по 40 мкг/гель): подготовка проб в отсутствие 2-меркаптоэтанола.
Примеры конкретного выполнения способа приведены ниже.
Пример 1. Разрушение клеток и получение тел включения
10 г биомассы штамма-продуцента E.coli SO 20050/pGGF8 суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Клетки разрушают ультразвуком и суспензию центрифугируют 20 мин при температуре 4oС. Осадок тел включения отмывают раствором соли в буфере. Промывочный раствор содержит набор солюбилизированных низкомолекулярных белков, но не содержит рчГ-КСФ (фиг.1, дорожки 3, 4). Количество белка в полученном осадке 100-120 мг (табл.2) (фиг.1, дорожки 5, 6).
10 г биомассы штамма-продуцента E.coli SO 20050/pGGF8 суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Клетки разрушают ультразвуком и суспензию центрифугируют 20 мин при температуре 4oС. Осадок тел включения отмывают раствором соли в буфере. Промывочный раствор содержит набор солюбилизированных низкомолекулярных белков, но не содержит рчГ-КСФ (фиг.1, дорожки 3, 4). Количество белка в полученном осадке 100-120 мг (табл.2) (фиг.1, дорожки 5, 6).
Пример 2. Растворение тел включения в мочевине и восстановление белка
К полученному в примере 1 осадку добавляют 50 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, содержащего 8 М мочевину и интенсивно перемешивают до прозрачности. В растворе определяют концентрацию белка. К раствору добавляют 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, содержащего 8 М мочевину до концентрации белка 1-2 мг/мл. Для восстановления белка добавляют 2-меркаптоэтанол до концентрации 10 мМ и смесь оставляют на 18-20 ч при комнатной температуре (18-23oС).
К полученному в примере 1 осадку добавляют 50 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, содержащего 8 М мочевину и интенсивно перемешивают до прозрачности. В растворе определяют концентрацию белка. К раствору добавляют 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, содержащего 8 М мочевину до концентрации белка 1-2 мг/мл. Для восстановления белка добавляют 2-меркаптоэтанол до концентрации 10 мМ и смесь оставляют на 18-20 ч при комнатной температуре (18-23oС).
Пример 3. Ренатурация рчГ-КСФ
Раствор восстановленного белка, полученного в предыдущем примере, охлаждают до температуры 4-6oС и добавляют 9 объемов 10 мМ натрий фосфатного буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА, охлажденного до указанной температуры. Полученную смесь выдерживают при температуре 4-6oC в течение 20-24 ч. К раствору ренатурированного белка при перемешивании добавляют уксусную кислоту до рН 4,4-4,5.
Раствор восстановленного белка, полученного в предыдущем примере, охлаждают до температуры 4-6oС и добавляют 9 объемов 10 мМ натрий фосфатного буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА, охлажденного до указанной температуры. Полученную смесь выдерживают при температуре 4-6oC в течение 20-24 ч. К раствору ренатурированного белка при перемешивании добавляют уксусную кислоту до рН 4,4-4,5.
Пример 4. Очистка ренатурированного рчГ-КСФ
Раствор ренатурированного белка, полученный в примере 3, разбавляют в два раза дистиллированной водой и наносят на две колонки, соединенные последовательно 1-ая 100 мл ДЭАЭ-целлюлозы, 2-ая 300 мл SP-сефадекса, уравновешенные 20 мМ натрий ацетатным буфером, рН 4,4 (буфер "А"). После нанесения колонки промывают буфером "А", колонку с ДЭАЭ-целлюлозой отсоединяют и элюируют сорбированные на SP-сефадексе белки линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,4 М в буфере "А".
Раствор ренатурированного белка, полученный в примере 3, разбавляют в два раза дистиллированной водой и наносят на две колонки, соединенные последовательно 1-ая 100 мл ДЭАЭ-целлюлозы, 2-ая 300 мл SP-сефадекса, уравновешенные 20 мМ натрий ацетатным буфером, рН 4,4 (буфер "А"). После нанесения колонки промывают буфером "А", колонку с ДЭАЭ-целлюлозой отсоединяют и элюируют сорбированные на SP-сефадексе белки линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,4 М в буфере "А".
Фракции анализируют электрофорезом в денатурирующих условиях в 12% ПААГ. Фракции, содержащие белок с молекулярной массой 18800, объединяют.
Полученный элюат очищенного рчГ-КСФ диализуют против 50 мМ натрий ацетатного буфера, содержащего 0,1 М хлористый натрий. Конечный объем полученного препарата составил 157 мл, концентрация белка 0,557 мг/мл.
Суммарные данные по очистке рчГ-КСФ из 10 г биомассы приведены в таблице 1.
Электрофоретическая чистота полученного белка рчГ-КСФ при нагрузке на лунку 40 мкг составляет более 95% (Фиг.3).
Пример 5. Определение биологической активности препарата рчГ-КСФ
Суспензию клеток костного мозга добавляют во флаконы, содержащие полную обогащенную среду, из расчета 105 клеток на 1 мл, после чего во флаконы вносят 20 мкл разбавленного раствора рчГ-КСФ. Контрольный образец получают добавлением к суспензии клеток костного мозга в обогащенной среде 20 мкл раствора хлористого натрия с концентрацией 0,15 М. Полученные смеси разносят в лунки 24-луночного планшета в объеме 0,5 мл, используя по две лунки на каждое разведение препарата рчГ-КСФ (от 1 до 50 нг/мл как тестируемого образца, так и стандартного препарата). Планшет с клетками инкубируют при 37oС и 100% влажности в течение 7-8 суток в атмосфере с 5% углекислого газа. По окончании инкубации проводят учет колониестимулирующей активности препаратов, подсчитывая под микроскопом число выросших в лунках колоний. Под колониями подразумевают образовавшиеся в результате культивирования очаги гемопоэза, содержащие более 50 клеток.
Суспензию клеток костного мозга добавляют во флаконы, содержащие полную обогащенную среду, из расчета 105 клеток на 1 мл, после чего во флаконы вносят 20 мкл разбавленного раствора рчГ-КСФ. Контрольный образец получают добавлением к суспензии клеток костного мозга в обогащенной среде 20 мкл раствора хлористого натрия с концентрацией 0,15 М. Полученные смеси разносят в лунки 24-луночного планшета в объеме 0,5 мл, используя по две лунки на каждое разведение препарата рчГ-КСФ (от 1 до 50 нг/мл как тестируемого образца, так и стандартного препарата). Планшет с клетками инкубируют при 37oС и 100% влажности в течение 7-8 суток в атмосфере с 5% углекислого газа. По окончании инкубации проводят учет колониестимулирующей активности препаратов, подсчитывая под микроскопом число выросших в лунках колоний. Под колониями подразумевают образовавшиеся в результате культивирования очаги гемопоэза, содержащие более 50 клеток.
За 50 единиц активности принимают количество рчГ-КСФ, которое стимулирует образование 50% от максимального количества колоний [13].
Биологическая активность полученных препаратов рчГ-КСФ составляет 107-108 МЕ/мг белка.
Пример 6. Подбор концентрации раствора мочевины для растворения тел включения рчГ-КСФ
40 мл равномерной суспензии тел включения в трис-НСl буфере рН 8,0 разливают по 10 мл в центрифужные пробирки и осадки отделяют центрифугированием. К полученным осадкам добавляют по 10 мл трис-НСl буфера, рН 8,0, содержащего различные концентрации мочевины. Осадки растворяют перемешиванием в течение 20 мин и центрифугируют. В супернатантах определяют концентрацию белка, общий белок, содержание рчГ-КСФ, общее количество рчГ-КСФ и выход рчГ-КСФ относительно количества целевого белка в телах включения. Полученные результаты сведены в таблицу 2.
40 мл равномерной суспензии тел включения в трис-НСl буфере рН 8,0 разливают по 10 мл в центрифужные пробирки и осадки отделяют центрифугированием. К полученным осадкам добавляют по 10 мл трис-НСl буфера, рН 8,0, содержащего различные концентрации мочевины. Осадки растворяют перемешиванием в течение 20 мин и центрифугируют. В супернатантах определяют концентрацию белка, общий белок, содержание рчГ-КСФ, общее количество рчГ-КСФ и выход рчГ-КСФ относительно количества целевого белка в телах включения. Полученные результаты сведены в таблицу 2.
Исходя из полученных данных видно, что наибольшее извлечение целевого белка происходит при концентрации мочевины 8 М.
Пример 7. Определение количества примесей в конечном продукте
Примеси липополисахаридов определяли как описано ранее [14].
Примеси липополисахаридов определяли как описано ранее [14].
Примеси белков штамма-продуцента (Е.coli SG20050/pGGF8) определяли иммуноферментным анализом с использованием поликлональных антител к белкам Е. coli SG20050 [16].
Примеси ДНК определяли гибридизацией [10]. Результаты представлены в таблице 3.
Полученные данные указывают на то, что содержание примесей в рчГ-КСФ незначительно и соответствует требованиям, предъявляемым Минздравом к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методами генетической инженерии [17].
Таким образом, использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет упростить метод очистки целевого продукта (провести ренатурацию без использования специального окисляющего агента; осуществить хроматографическую очистку на двух сорбентах одностадийно (соединив колонки последовательно); увеличить относительный выход целевого продукта на 20% (с 33% в прототипе до 57% в предлагаемом способе) и при этом не снижается чистота продукта.
ЛИТЕРАТУРА
1. Metcalf D. Blood, 1986, v. 67, No. 2, p. 257-267.
1. Metcalf D. Blood, 1986, v. 67, No. 2, p. 257-267.
2. Morstin G., Souza L.M., Keech J., The Lancet, 1988, No. 26, p. 667-671.
3. Bronchud, M. H. , Scarffe, J.H., Thatcher, N. et al. Br. J. Cancer, 1987, v. 56, No. 6, p. 809-813.
4. Groopman, J.E., Molina, J.-M., Scadden, D.T.N. Engl. J. Med., 1989, v. 321, No. 21, p. 1449-1459.
5. Lu, H. S. , Souza, L.M., Boone, Т.С., Lai, P.-H. Arch. Biochem. Biophys., 1989, v. 268, No. 1, p. 81-92.
6. Lu, H.S., Clogston, C.L., Narhi, L.O. et al. J. Biol. Chem., 1992, v. 267, No. 13, p. 8770-8777.
7. Souza, L.M., Boone, T.C., Gabrilove, J., Lai, P.H. Science, 1987, v. 232, p. 61-65.
8. Welte, K. , Platzer, E., Lu, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v. 82, No. 5, p. 1526-1530.
9. Motoo Yamasaki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1998, v.62, N 8, p.1528-1534.
10. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания, МУК 4.1/4.2/588-96, М., 1998.
11. Патент РФ 2113483, кл. C 12 N 15/27, опубл. БИ 17, 1998 г.
12. Патент РФ 2158303, кл. С 12 N 1/21, опубл. БИ 30, 2000 г.
13. Nomura H., Imazeki I., Oheda M., Kubota M., Tamura M., Ono M., Ueyama Y., Asano S., EMBO J., 1986, v. 5, No. 5, p. 891-896.
14. Денисова Л.Я., Батурина И.И., Закабунин А.И., Афиногенова Г.H., Пустошилова Н.М. ЖМЭИ, 1999, 5, с.109-112.
15. Гольдберг Е. Д. , Дыгай А.М., Жданов В.В. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1999, т. 128, 8, с.194-199.
16. Афиногенова Г.Н., Гладченко Т.Н., Веревкина К.Н., Пустошилова Н.М. Сборник трудов научных сотрудников НИКТИ БАВ, Бердск, 1999 г.
17. Общие требования к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методами генной инженерии. РД 42-68-9-89, М., 1989.
Claims (2)
1. Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (рч Г-КСФ) из трансформированных клеток Escherichia coli, содержащих рч Г-КСФ в виде нерастворимых тел включения, предусматривающий разрушение клеток продуцента, отделение, отмывку и растворение тел включения с использованием мочевины, восстановление, ренатурацию и хроматографическую очистку целевого белка, отличающийся тем, что восстановление проводят 10 мМ 2-меркаптоэтанолом, ренатурацию рч Г-КСФ проводят разбавлением раствора восстановленного белка нейтральным буфером, содержащим ЭДТА, до концентрации мочевины 0,8 М, а хроматографическую очистку рч Г-КСФ осуществляют нанесением раствора ренатурированного белка на две последовательно соединенные колонки с ДЭАЭ-целлюлозой и SP-сефадексом с последующим элюированием целевого белка с колонки с SP-сефадексом в линейном градиенте хлористого натрия (от 0 до 0,4 М) в 0,02 М натрий ацетатном буфере при рН 4,4-4,5.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ренатурацию рч Г-КСФ осуществляют разбавлением раствора восстановленного белка фосфатным буфером при температуре 4-6oС в течение 18-20 ч.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001107330/13A RU2201962C2 (ru) | 2001-03-19 | 2001-03-19 | Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001107330/13A RU2201962C2 (ru) | 2001-03-19 | 2001-03-19 | Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001107330A RU2001107330A (ru) | 2003-02-20 |
| RU2201962C2 true RU2201962C2 (ru) | 2003-04-10 |
Family
ID=20247292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001107330/13A RU2201962C2 (ru) | 2001-03-19 | 2001-03-19 | Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2201962C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2278870C2 (ru) * | 2004-08-30 | 2006-06-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе |
| RU2313361C1 (ru) * | 2006-05-22 | 2007-12-27 | ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) | Средство, обладающее антидиабетической активностью |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5047504A (en) * | 1987-04-28 | 1991-09-10 | Amgen, Inc. | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| RU2091488C1 (ru) * | 1994-03-16 | 1997-09-27 | Научно-производственное объединение "Вектор" | Рекомбинатная плазмидная днк р 280 gm, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. штамм escherichia coli sg20050/р 280 gm - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека |
| RU2108386C1 (ru) * | 1990-02-03 | 1998-04-10 | Макс-Планк-Гезельшафт Цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.ф. | Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (g - csf) без дополнительного остатка метионина на n-конце |
| US5908763A (en) * | 1984-07-06 | 1999-06-01 | Novartis Corporation | DNA encoding GM-CSF and a method of producing GM-CSF protein |
-
2001
- 2001-03-19 RU RU2001107330/13A patent/RU2201962C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5908763A (en) * | 1984-07-06 | 1999-06-01 | Novartis Corporation | DNA encoding GM-CSF and a method of producing GM-CSF protein |
| US5047504A (en) * | 1987-04-28 | 1991-09-10 | Amgen, Inc. | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| RU2108386C1 (ru) * | 1990-02-03 | 1998-04-10 | Макс-Планк-Гезельшафт Цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.ф. | Рекомбинантный гранулоцит-колониестимулирующий фактор (g - csf) без дополнительного остатка метионина на n-конце |
| RU2091488C1 (ru) * | 1994-03-16 | 1997-09-27 | Научно-производственное объединение "Вектор" | Рекомбинатная плазмидная днк р 280 gm, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. штамм escherichia coli sg20050/р 280 gm - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MOTOO YAMASAKI et al., Purification and Characterization of Recombinant Human Granulocyte Colonystimulating Factor (rhG-CSF) Derivatives: KW-2228 and other Derivatives, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1998, v.68, n.8, р.1528-1534. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2278870C2 (ru) * | 2004-08-30 | 2006-06-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе |
| RU2313361C1 (ru) * | 2006-05-22 | 2007-12-27 | ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) | Средство, обладающее антидиабетической активностью |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0209539B1 (en) | Homogeneous erythropoietin | |
| KR927002375A (ko) | 거핵구 형성 인자 | |
| RU2358980C2 (ru) | Способ очистки и/или выделения биологически активного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора | |
| US5792450A (en) | Purified human CSF-1 | |
| US4675383A (en) | Purification of T-cell growth factor | |
| RU2201962C2 (ru) | Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека | |
| TWI758285B (zh) | 一種重組人粒細胞刺激因子的復性及純化方法 | |
| RU2278870C2 (ru) | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе | |
| EP0132359A2 (en) | Natural human interleukin-2 and production thereof | |
| US5322837A (en) | Homogeneous erythropoietin compositions and methods of using same | |
| US5391706A (en) | Purification of GM-CSF | |
| CN101045742B (zh) | 重组人粒细胞集落刺激因子的复性纯化工艺 | |
| KR100531670B1 (ko) | 인체 인터페론 알파의 제조방법 | |
| CN1142281C (zh) | 重组人红细胞生成素制剂的制备生产方法 | |
| JPH0779709B2 (ja) | Ｇｍ‐ｃｓｆの精製 | |
| RU2039823C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного лимфотоксина человека | |
| CN101045923B (zh) | 生产一种白细胞介素类似物的方法 | |
| JPH02138224A (ja) | 血小板減少症治療剤 | |
| AU650532B2 (en) | Yeast derived mitogen | |
| KR0160934B1 (ko) | 효모에서 봉입체로 발현된 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법 | |
| CN1062274C (zh) | 人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法 | |
| JPH022390A (ja) | 新規なヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 | |
| JPH0761999A (ja) | 糖修飾蛋白質の製造法 | |
| RU2487885C2 (ru) | Способ крупномасштабного получения, выделения и очистки рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека | |
| RU2440417C1 (ru) | Способ очистки рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20060201 |
|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20100416 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20060201 Effective date: 20140805 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20141017 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |