SE454048B - Forfarande for framstellning av ett komplex av streptokinas och en lett plasminkedja med ett serinproteasaktivt centrum - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 454 048 2 människo-och kattplasminogen och den omvandlar icke nötplas- minogen till nötplasmin. Däremot är komplexet av streptokinas och människoplasminogen och komplexet av streptokinas och människoplasmin aktiva vid omvandling av nötplasminogen till nötplasmin.

Det är känt, att plasmin kan delas i en tung kedja (A-kedja) och en lätt kedja (8-kedja) genom spjälkning av plasminmolekylerna vid disulfidbindningarna mellan kedjorna (en eller två disulfidbindningar per molekyl), och det är känt att den tunga kedjan och den lätta kedjan kan separeras från varandra. Rlckli 59, Lun-aa? (1975), au genom adsorption av den tunga kedjan på en adsorbent av och Ûktavasky anger i Eur. J. Bio- chem., fraktionerna kan separeras L-lysinsubstituerad polyakrylamid med eluering av den lätta kedjan. Författarna anger icke några egenskaper hos den eluerade B-kedjefraktionen, men undersökningar har nu visat, att den med deras förfarande framställda B-kedjefraktionen i vid komplexbindning till streptokinas ger ett komplex, som är väsentligen inaktivt för omvandling av plasminogen till plasmin.

Den tunga fraktionen (A-kedjan) kan icke ge något streptokinaskomplex. _ Av säkerhetsskäl kan terapeutiska material, som härrör från människoblod, inklusive plasminogen och plasmin, enär sådan till patientens blodström. Förenta Staternas Food and Drug Admi- icke insprutade i blodströmmen hos en patient, injektion kan överföra virussmitta, t.ex. hepatitvírus, nistration kräver, att allt material, som härrör från män- niskoblod, skall värmas vid 60OC under 10 timmar för inakti- vering av eventuellt hepatitvirus, för att materialet eller ett derivat därav skall kunna godkännas för försäljning som material terapeutiskt för insprutning i blodströmmen.

Um ett komplex av streptokinas och plasmin utsätts för sådan värmebehandling, förändras dess karaktär och blir det inaktivt för omvandling av plasminogen till plasmin.

Om man utsätter plasminogen för sådan värmebehandling, innan det omvandlas till plasmin och komplexbinds med streptokinas, 10 15 ZÜ 25 30 35 454 048 3 förändras även det erhållna komplexets karaktär. Ehuru streptokinaskomplexet alltjämt har aktivitet för omvandling av plasminogen till plasmin, är dess proteinkomponent så denaturerad av värmebehandlingen, att antigena och pyrogena reaktioner kan äga rum, då komplexet insprutas i blodströmmen hos en patient.

På grund härav har man inte använt komplex av strepto- kinas och plasmin som rutinmässig terapeutisk behandling för upplösning av blodproppar hos människor.

Föreliggande uppfinning avser framställning av ett komplex av streptokinas och en lätt plasminkedja med ett att det proteasaktiva katalytiska centrum hos plasminmolekylen finns serinproteasaktivt centrum. Det har visat sig, serin- på molekylens lätta sida (B-sida), men att kända förfaranden för spjälkning av plasminmolekylen och separering av de lätta och den tunga kedjan medför inaktivering av det serin- proteasaktiva centrum på den lätta kedjan, så att denna blir lika inaktiv som den tunga kedjan, vilken icke har något dylikt katalytískt centrum.

Det har vidare visat sig, att kända reversibla inhibi- torer för det serinproteasaktiva centrum, såsom leupeptin, inhiberar desaktiveringen eller förgiftningen av det serin- proteasaktiva centrum i den lätta kedjan och därigenom skyddar' dess aktivitet under reduktions-och separeringsstegen.

Det har också visat sig, att streptokinas skyddar det serinproteasaktiva centrum och att ett komplex av strepto- kinas och plasminogen eller en streptokinas och plasmin kan utsättas för reduktions- och separeringsstegen utan att en reversibel inhibiter för det serinproteasaktiva centrum be- höver förekomma, för framställning av ett komplex av strepto- kinas och den lätta kedjan med fibrinolytisk aktivitet.

Vidare har det visat sig, att en aktiv lättkedje- fraktion kan framställas av ett plasminogenutgångsmalerial, som har värmebehandlats vid GÛÛC under 10 timmar, och att den sålunda framställda fraktionen kan bindas vid streptokinas till ett ligen svagare antigen eller pyrngen reaktion vid insprutning fibrinolytiskt aktivl komplex, som framkallar väsent- 10 15 20 25 50 35 454 048 4 i patientens blodström än ett komplex av streptokinas och en värmebehandlad plasminogen, som icke har fraktionerats.

Det på grund av dessa rön utarbetade förfarandet enligt uppfinningen definieras närmare i kravet 1. förfarandet innefattar företrädesvis den åtgärden, att människoplasminogen utsättes för en inledande värmebehand- ling vid 6008 under 10 timmar för inaktivering av eventuella virusföroreningar. Den värmebehandlade piasminogenen akti- veras sedan till plasmin och blandas med en ungefär ekvi- molär mängd streptokinas för att framställa ett streptokinas- komplex. Komplexet reduceras sedan med ett reduktionsmedel, t.ex. 2-merkaptoetanol eller ditioerytritol, för spjälk- ning av disulfidbindningarna i plasminmolekylerna, så att tunga kedjor (A-kedjor) och komplex av lätta kedjor (B-kedjor) och streptnkinaskomplex erhålles. Sedan alkylerar man pro- dukten med ett alkyleringsmedel, t.ex.natriumjodacetaL, för att hindra disulfidbindningarnas brutna ändar tsulfhydryl- grupper) att förenas på nytt. Den alkylerade produkten ledes genom en affinítetskromatografikolonn, vari A-kedjefrak- tionen adsorberas och B-kedjefraktionen elueras och går genom kolonnen utan att adsorberas. Den lätta kedjan (B-kedjan) fälles med ammoniumsulfat, centrifugeras och löses på nytt 1 ett buffertmedium.

Ett komplex av streptokinas och en lätt plasminkedjá med ett serínproteasaktivt centrum kan även framställas en- 8301794-7.

Det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som ligt vår parallellansökan framställts ur ett plasmin-streptokinaskomplex enligt ovan, har mycket lägre proteolytisk aktivitet än det plasmin-strep- tokinaskomplex varur det erhållits,i allmänhet mindre än omkring 20 mol-% och mindre än omkring 35 vikt-%. Typiskt har det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som framställts ur ett plasmin-streptokinaskomplex, en proteo- lytisk aktivitet, mätt på kaseinsubstrat, av omkring 2 - 3,5 CIA-enheter per mg protein eller omkring 0,14-0,25 CTA-en- Med "CIA-enhter“ avses standardakti- heter per nmol proteuh vitetsenhater enligt Commíltes on ïhrombolytic Agents 10 15 20 25 30 454 048 5 (National Heart and Long Institute) och World Health Orga- nization, såsom beskrives i Johnson m.fl., lhrombosis et Diathesis Haemorrhagica, 21, sid. 2§9-272 (1969).

Det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som har framställts ur plasmin-streptokinaskomplex enligt ovan, har typiskt en aktivitet såsom nötplasminogenaktiva- tor, vilken är omkring 1,6 - 1,8 gånger så stor, räknat på viktbas, som aktiviteten av det plasmin-streptokinaskomplex, varor det är framställt. På molär bas är nötplasminogen- aktiviteten hos komplexet av lätt kedja och streptokinas omkring 0,8 - 1,0 gång så stor som aktiviteten hos det plasmin-streptokinaskomplex, varav det är framställt. Typiska värden på aktiviteten som nötplasminogenaktivator hos komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som är framställda av plasmin~streptokinaskomplex, mätt på kaseinsubstrat, är omkring 3 - 4 CTA-enehter per pg protein eller omkring 200 - 260 CIA-enheter per nmol protein.

Aktiviteten som människoplasminogenaktivator hos det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som Fram- ställts av plasmin-streptokinaskomplexet enligt ovan, är i allmänhet omkring 1,8-2,2 gånger (pâ viktbas) aktiviteten hos det plasminstreptokinaskomplex, varur detär framställt. På molbas är aktiviteten som människoplasminogenáktivator hos komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas omkring 1,0 - 1,2 gånger aktiviteten hos det plasminstreptokinas- komplex, varor det är framställt.

Typiska värden på aktiviteten som människoplasminogen- aktivator hos komplexet av lätt plasminkedja och strepto- kinas, mätt på kaseinsubstrat, är omkring 8 - 12 CTA-enheter per uq protein eller omkring SÉU - 800 CIA-enheter per nmol protein. -w De väsentligt höga värdena på aktiviteten som män- niskoplasminogenaktivator hos komplexet av lätt plasmin- Förhållande till aktiviteten hos att kedja och slreptokinas, 1 plasminstreptokinaskomplcxet gör det möjligt använda lägre intravenös dosering av komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas för uppnäende av en viss fibrinolytisk 10 15 20 25 30 35 454 048 6 verkan än vid användning av plasmin-streptokinaskomplexct.

Dessutom har försök in vitro visat, att komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas är väsentligt verk- sammare än plasmin-streptokinaskomplexet för minskning eller upplösning av blodproppar även vid doser, som är jämförbara vad avser aktiviteten som människoplasminogenaktiviator.

Troligen beror denna höjda effekt på att komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas har mindre molekylvikt än plasmin-streptokinaskomplexet och därmed större förmåga att tränga in i och verka på det inre i en blodproppsstruktur.

När man vill säkerställa frånvaro av virusföroreningaar i komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas värmebe- handlar man plasminogenutgångsmaterialet för att inaktivera eventuella virusföroreningar före omvandlingen till plasmín eller komplexbindningen med streptokinas. Vid vanlig värme- behandling enligt United States Food and Drug Admidistration, såsom anges ovan, hålles plasminogenen vid en temperatur av minst 6000 under minst 10 timmar. Det har visat sig att den lätta plasminkedjan och komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas enlüfl uppfinningen bibehåller i huvudsak all sin aktivitet, även när dessa produkter framställes av värme- behandlad plasminogen som utgångsmaterial.

När ett plasmin-streptokinaskomplex framställes av värmebehandlat ptasminogenutgângsmaterial, bibehåller även detta komplex väsentligen all aktivitet. Inverkan av värme på plasminogenmolekylen medför emellertid förändring eller denaturering av dennas struktur på ett antal ställen, och den erhållna relativt stora plasminmolekylen är också väsentligen denaturerad, så att den och dess komplex har be- nägenhet att bliantigena och pyrogena vid införing i blod- strömmen hos en patient.

När plasmin, som framställts av värmebehandlad plasmino- gen, reduceras och klyvs i en A-kedjefraktion och en B-kedje- fraktion och den tunga fraktionen förkastas, förkastas även många av de denaturerade ställena, vilka finns på A-kedje- fraktionen, varvid en nativ lättkedjefraktion erhålles, som kan vara väsentligen mindre antigen och mindre pyrogen än den 'v 1-1 10 15 20 25 30 55 454 048 7 totakidenautmerade plasminen. Likaledos kan komplex av en sådan lättkedjefraktion, såsom streptokinaskomplex, vara väsentligen mindre antigena och mindre pyrogena än liknande komplex av den totala denaturerade plasminen. det ty även råa streptokinasfraktioner kan Det har visat sig att icke är nödvändigt att använda högrenad streptokinas, användas för framställning av komplexen. I praktiken tjänar kopplingen av streptokinasen med lältkedjefraktionen eller med den totala plasminen till att separera streptokinasen från dess föroreningar i råform.

Exempel 1 150 g leupeptin sättes till 10 ml människoplasmin (25 - 30 CIA-enheter per mg protein) i lösning i ett vatten- 0,04 m/mol tristhydroxymctyllaminometan (nedan kallad “trls"). 0,92 mol/l haltigt buffertmedium innefattande 25 % glycerol, lysin och 0,08 mot/l natriumklorid vid pH 9 och en koncentra- tion av 5 mg/ml protein. Plasminen var framställd av värme- behandlad människoplasminogen. Under tillsatsen av leupeptin hölls plasminlösningen i ett DOC isbad, och slutkoncentra- tionen av leupeptin 1 lösningen var 0,04 mol/l.

Till denna blandning av plasmin och leupeptin sattes 0,072 ml koncentrerad 2-merkaptoetanol (slutkoncentration 0,1 M) och blandningen av plasmin och leupeotin reducerades under 20 minuter i ett 2000 vattenbad. Den reducerade plasminen anbringades sedan i ett 000 isbad, och 0,29 ml 4 M natriumjod- acetat tillsattes för alkyleringen av de sulfhydrylgrupper, som bildats genom brott av disuflidbindningarna i plasmin- molekylerna under reduktíonen. Alkyleringsreaktionen fortgick under 30 minuter vid 000.

Den reducerade och alkylerade plasminen leddes sedan (1 x 20 cm), som ekvilibrerats och eiuerats med en 0,1 M natriumfosfat- buffert vid pH 7,4 och vid ZOC. Elueringen fortskred vid ett flöde av 60 ml/h, separat. Den lätta kedjan (B-kedjan) gick genom kolumnen genom en kolonn av L-lysinsubstltuerad "Sepharose" och fraktioner av 3 ml volym uppsamlades oadsorberad och övervakadea genom absorbansmätningar vid 280 nm. Då absorbansen har gått ned till 0, sammanfördes 10 15 20 25 50 35 454 048 8 de fraktioner, som innehöll den lätta kedjan, och 0,31 9/ml ammoniumsulfat tillsattes vid ÛOC för utfällning av den lätta kedjan under kvarlämnande av leupeptin i vätskefasen. De sammanslagna fraktïonerna, som innehöll aluminiumsulfat, fick stå över natten vid AOC för fullständig utfällning av den lätta kedjan, varpå ring vid 6000 r/min Fällningen av fällningen avskildes genom centrifuge- under 1 timme vid ZOC. den lätta kedjan löstes till en koncen- (gt % = 16) 1 ett vattenhaltigt buffert- 1 cm som användes för upplösning av plasminen. tration av 10 mg/ml medium liknande det, Den lätta kedjan klarades vid 3000 r/min under 1 timme vid ZOC och lagrades vid -ZÜOC.

Typiskt har den sålunda erhållna lätta plasminked- jan en proteolytisk aktivitet på kaseinsubstrat av 0,07 CTA- enheter per nmol protein eller 2,6 CTA-enheter per mg protein gentemotßfl-proteolytisk aktivitet av 2,63 CTA-enheter per nmol protein eller 27,2 CTA-enheter per mg protein för den plas- min, varur den lätta kedjan erhållits. Typiskt kan den sålunda erhållna lätta plasmínkedjan upptaga 0,09 mol tritterat di- isopropylfosforofluoridat per mol protein gentemot 0,95 mol protein för plasminutgångsmaterialet.

Exempel 2 Ett ekvimolärt komplex av lätt plasminkedja och streptokinas framställdes genom tillsats av 0,5 ml strepto- kinas (32 mg/ml) kedjan. Det ekvimolära komplexet inkuberades vid 2508 Under tiJlÜ,9 ml av den i exempel 1 framställda 10 minuter och lagrades sedan vid -ZOOC.

Typiskt har det sålunda framställda ekvimolära kom- plexet en proteolytisk aktivitet på kaseinsubstrat av 0,16 CTA-enheter per nmol protein eller 2,3CTA-enheter per mg i jämförelse med en proteolytisk aktivitet av 11,6 CIA-enheter per ekvimolekylära komplex, protein, 1,52 ETA-enheter per nmol protein eller mg protein för de som framställts av plasminutgångsmaterialet.

Typiska värden på aktiviteten som nötplasminogen- aktivator hos det ekvimolära komplexet 1 exempel 2 på kasein- substrat är 2,6 CIA-enheter per ug protein eller 175 CTA- 10 20 25 30 35 454 048 9 enheter per mol protein, i jämförelse med 2,1 CIA-enheter per ug protein eller 26fi CIA-enheter per nmol protein för det ekvimolëra strcptokinaskomplexetnæd plasminutgångsmaterialet_ typiska värden på aktiviteten som människoplasmino- genaktivator hos det ekvimolära komplexet i exempel 2 på kaseinsubstrat 9,3 CTA-eheter per ug protein eller 636 CïA-en- heter per nmol protein, i jämförelse med &,9 CTA-enheter per ug protein eller 622 ETA-enheter per nmol protein för det ekvi- molära streptokinaskomplexet av plasminutgângsmnterialet.

Typiskt kan det ekvimolära komplexet i exempel 2 upp- ta 0,50 mot tritierat diisopropylfosforofluoridat per mol protein i jämförelse med 0,90 mol per mol protein för ett ekvimolärt komplex av streptokinas och plasminutgångsmate- rialet.

Exempel 3 Värmebehandlad männískoplasminogen (25-30 ETA-enheter per mg protein) löstes i ett vattenhaltigt buffertmedium innehållande 0,05 mni/1 tris, 0,02 mni/1 iysin och 0,1 mot/1 natriumklorid med pH 9 Lill en koncentration av 22 mg/ml protein. till 3 ml av denna plasminogenlösning i ett OOC vattenbad sattes 1 ml streptokinas (100 000 enheter per mg protein) vid en koncentration av 32 mg/ml protein i en 0,067 M natriumfosfatbuffert vid pH 7,4. Blandningen inkube- rades i ett ZSOC vattenbad under 10 minuter för omvandling till ett plasmin-streptokinaskomplex. Sedan kyldes komplexet i ett OOC isbad och späddes till 12 ml genom tillsats av 8 ml sv den i exempel 1 beskrivna buffertlösningen med 25 % glycerol.

Till 12 ml av det enligt ovan framställda plasmin- streptokinaskomplexet sattes 0,07 ml koncentrerad 2-merkapto~ etanol till en slutkoncentration av 0,1 M. Komplexet redu- cerades under 20 minuter i ett 20oC vattenbad, kyldes sedan till OOC och alkylerades genom tillsats av 0,35 ml 4 M natrium- Sedan det komplexet fått stå 50 minuter vid OOC reducerade och alkylerade streptokinas- leddes det jodoacetat. genom en kolonn av L-lysinsubstituerad "Sepharose" (1 x 20 cm), så- exempel som beskrives i 1 för_den reducerade och alkyleradc 10 15 20 25 30 35 454 048 10 plasminen. Kumplexet av lätt kedja och streptokinas gick utan adsorption genom kolonnen och övervakades, uppsamlades, fälldes, centrifugerades, löstes och klarades på samma sätt som den lätta kedjan i exempel 1.

Typiskt har komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas i exempel 3 en proteolytísk aktivitet på kasein- substrat av 0,21 CIA-enheter per nmol protein eller 2,9 CTA-enheter permg protein, i jämförelse med en proteolytisk aktivitet av 1,52 CIA-enheter per nmol protein eller 11,6 CTA-enheter per mg protein för det ekvimolära streptokinas- komplexet av plasminutgångsmaterialet.

Typiska värden på aktiviteten hos nötplasminogen- aktivator hos komplexet i exempel 3'på kaseinsubstrat är 3,6 CTA-enheter per pg protein eller 237 ETA-enheter per nmol protein, i jämförelse med 2,1 CIA-enheter per pg protein eller 260 ETA-enheter per nmol protein för det ekvimolära streptokinaskomplexet av plasminutgångsmaterialet.

Typiska värden på aktiviteten som människoplasmino- genaktivatorer hos komplexet i exempel 3 på kaseinsubstrat är 10,0 CTA-enheter per pg protein eller 685 CTA-enheter per nmol protein, i jämförelse med 4,9 CTA-enheter per pg protein eller 622 CTA-enheter per nmol protein för det ekvimolära streptokinas- komplexet av plasminutgângsmateríalet.

Typiskt kan komplexet i exempel 3 uppta 0,70 mol tritierat diisopropylfosforofluoridat per mol protein i jämförelse med 0,90 mol per mol protein för ett ekvimolärt komplex av streptokinas med plasminutgångsmaterialet.

Exempel a I exempel 1 beskrivs plasminutgångsmaterialet som "framställt av värmebehandlat människoplasminogen" och i exempel 3 beskrivs plasminogenutgångsmaterialet som "värme- behandlat". l båda fallen lnställdes människoplasminogen vid en koncentration av 20 mg/ml i av 0,05 M tris, 0,02 M lysin och 0,1 M NaC| med pH 9,0 och vid OOC på pH 3,0 med 1N HC! av 0,15 M glycin en buffert och dialyscradcs sedan grundligt mot en buffert och 0,001 M HC! vid pH 5,0. efter dialysen späddes protein- 10 15 20 25 30 35 454 048 11 lösningen med bufferten av 0,15 M glycin och 0,001 M HCI till en slutkoncentration av 1 mg/ml protein och värmdes i en sluten kolv på vattenbad vid 60OC under 10 timmar.*Sedan kyldes plasminogenen i ett isbad och fälldes genom en tillsats av fast ammoniumsulfat (0,31 g/ml lösning). Den värmebehandlade plasminogenen tillvaratogs genom centrifugering vid 6000 r/min under 1 timme, och fällningen löstes till en koncentration av 10 mg/ml i bufferten av 0,05 M tris, 0,02 M lysin och 0,10 M NaCl vid pH 9,0. Det värmebehandlade plasminogenkoncentra- tet klarades vid 3000 r/min under 1 timme, och olösligt protein avskildes och förkastades. Plasminogenen renades ytterligare med en affinitetskromatografikolonn av L-lysinsubstituerad "Sepharose" och tillvaratogs efter eluering med e~amino¿ kapronsyra genom fällning med ammoniumsulfat. Ungefär 7A % av det ursprungliga proteinet och 7 % av den ursprungliga g proteolytiska aktiviteten tillvaratogs efter värmebehand- ' lingen med praktiskt taget ingen förändring i plasminogenens , specifika aktivitet.

Andra reversibla inhibitorer för serinproteasaktiva centra, såsom bensamidin och derivat därav, kan användas i stället för leupeptin. Inhibitorn användes lämpligen vid till- räcklig koncentration för att ge omkring 90 % plasmininhi- bition. Med bensamidin som inhibitor blir den proteolytiska aktiviteten hos den lätta kedjan ochd ess streptokinaskomplex icke så låg som hos produkter,vilk8 erhållits vid användning av leupeptininhibitor, men lägre än his streptokinaskomplexet med helplasmin. Aktiviteten som plasminogenaktivator är också högre hos produkter framställda under användning av bensamidin såsom inhibitor, nämligen upp till omkring 8 CTA-enheter per pg protein eller 600 CTA-enheter per nmol för aktiviteten som nötplasminogenaktivator eller upp till omkring 25 CIA- enheter per pg protein eller 1500 CIA-enheter per nmol för aktiviteten som människoplasminogenaktivator.

I stället reduktionsmedel, såsom ditioerytritol eller ditiotreitol, för 2-merkaptoetanol kan man använda andra för att klyva disulfidbindnihgarna i plasminmolekylerna. 10 15 ZÛ 25 30 35 454 048 12 Alkyleringsmedlet kan utgöras av natriumjodoacetat, såsom visas i exempel 1 och 3, men även av jodoacetamid eller annat känt alkyleringsmedel, som ger en skyddsgrupp vid en fri sulfhydrylgrupp.

Plasminogenutgångsmaterialetbehöver icke vara rent.

Råmaterial 1 form avplasmafraktioner eller t.o.m. total plasma kan användas, enär rening sker under materialets fortsatta bearbetning.

I stället för L-lysinsubstituerad "Sepharose" i affi- nitetskromatografikolonnen kan man använda andra selektiva adsorbenter, såsom L-lysinsubstituerad polyakrylamid eller L-lysinsubstituerad agaros eller "Sepharose", polykarylamid eller agaros substituerad med L-arginin eller D-lysin. Den kromatografiska separeringen kan vid behov utföras satsvis i stället för i en kolonn.

Ehuru uppfinningen beskrivs i samband med ett ekvi- molärt komplex av den lätta plasminkedjan och streptokinas, är det givet, att den lätta plasminkedjan även bildar använd- barakomplex med alla andra substanser, som bildar ekvimolära komplex med människoplasminogen under bildning av en aktivator, t.ex. stafylokinas. Sådana komplex framställes på samma sätt som ovan beskrivs för komplexen med streptokinas och använd- barapå liknande sätt för sin fibrinolytiska aktivitet.

Dessa ekvimolära komplex tillföres företrädesvis intravenöst för fibrinolytísk effekt. De kan tillföras gradvis under en längre tid i utspädd form i en fysiologisk glykos-saltlösning, ensamma eller blandade med andra mate- rial, såsom människoalbumin. Doserna kan variera beroende på patientens tillstånd, men ligger i allmänhet vid 0,01-1,0 mg/kg kroppsvikt per dygn.

Komplexen kan förpackas i vätskeform, i ampuller, såsom en lösning i fysiologisk glykos-saltlösning eller albuminhaltig saltlösning. De kan även packas i torr form, såsom ett pulver i blandning med människnalbumin, vilket fram- ställts genom lyofylisering av en lösning av komplexet med albumin.

Claims (6)

10 15 20 25 30 454 048 13 PATENTKRAV

1. Förfarande För framställning av ett komplex av strepto- kinas och en lätt plasminkedja med ett serinproteasaktivt k n a t substans, bestående av människoplasminogen, som har värme- centrum, k ä n n e t e c av att man reagerar en behandlats vid lägst GOOC under minst 10 timmar, eller plasmin framställt ur människoplasminugen, som har värmebehandlats vid lägst BOOC under minst 10 timmar, med en ungefär ekvi- molär mängd streptokínas,För.att framställa ett streptokinas- komplex, reducerar reaktíonsprodukten vid plasminmolekyler- nas disulfidbindningar mellan kedjorna För att bilda en tung kedja och ett komplex av lätt kedja och streptokinaskomplex och därpå separerar det bildade komplexet från den tunga kedjan.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e- t e c k n a t av att blandningen av tung kedja och komplex av lätt kedja och streptokinaskomplex alkyleras före separe- ringen.

3. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e - t e c k n a t av att alkyleringen genomföras med ett alkyle- ringsmedel, som består av natríumjodoacetat eller jodoacetamid.

4. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att separeringen genomföras genom affini- É tetskromatografisk adsorption. [

5. , Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - I t e c k n a t av att affinitetskromatografiadsorptionen I genomföres på ett L-lysinsubstituerat adsorptionsmaterial och ' att komplexet av lätt kedja och streptokinas icke adsorberas. g

6. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e - U t e c k n a t av att affinitetskromatografiadsorptíonsmate- rialet består av L-lysinsubstituerad polyakrylamid, L-lysin- ; substituerad agaros, L~argininsubstituerad polyakrylamid, E L-argininsubstituerad agaros, D-lysinsubstituerad polyakryl- I amíd eller D-lysinsubstituerad agaros. .