SE455201B - Forfarande och medel for nukleinsyrahybridisering och kemiluminiscensmerkt nukleinsyraprob - Google Patents
Forfarande och medel for nukleinsyrahybridisering och kemiluminiscensmerkt nukleinsyraprobInfo
- Publication number
- SE455201B SE455201B SE8200479A SE8200479A SE455201B SE 455201 B SE455201 B SE 455201B SE 8200479 A SE8200479 A SE 8200479A SE 8200479 A SE8200479 A SE 8200479A SE 455201 B SE455201 B SE 455201B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- dna
- rna
- specific
- marker
- fragment
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001164374 Calyx Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
455 201 eukaryot ursprung.
Speciellt lämpliga som markörer är luminol och isoluminol, vilka har for- meln NHZ O O NH 25-ZZ IE IE I NH l o o luminol isoluminol där NH2-gruppen avses att kopplas till olika NH2-grupper på DNA- alterna- tivt RNA-molekylen med hjälp av exempelvis glutaraldehyd eller bensokinon.
Efter reaktionen med frisläppt DNA eller RNA från det okända provet och separation av hybridiserad och icke hybridiserad DNA resp RNA, t ex genom filtrering, kan graden av hybridisering uppmätas genom uppmätning av lumi- niscensstyrkan. Då således det märkta DNA- eller RNA-fragmentet är speci- fikt för t ex en given vävnad, cell, mikroorganism eller virus, kan förfa- randet enligt uppfinningen användas för såväl kvalitativ som kvantitativ påvisning av denna vävnad, cell etc.
Genom förfarandet enligt uppfinningen undvikes således de problem, som märkning med radioaktiva isotoper medför.
Inmärkningsproceduren i förfarandet enligt uppfinningen kan emellertid i vissa fall påverka hybridiseringsreaktionen negativt genom att främmande molekyler införs i DNA-strukturen respektive RNA-strukturen. Denna olä- genhet kan emellertid undanröjas, om den artspecifika DNA-sekvensen respektive RNA-sekvensen skyddas under inmärkningsproceduren genom hybri- disering med den homologa sekvensen, varvid markören binds till omgivande, icke-specifika delar av DNA- eller RNA-molekylen.
Uppfinningen kommer nu att närmare åskådliggöras i följande exempel. j! ~.~:nf-'í5dv.\' fw- _ ~:- -..- I-'n-:i 12: 455 201 Exempel 1 Inmärkning av DNA med isoluminol Specifikt DNA (1 pg) resuspenderas i 100 pl 0,1 M fosfatbuffert (pH 6,8), och lösningen upphettas till 95°C i 5 min. Efter avsvalning till rumstem- peratur tillsättes glutaraldehyd (1,25 % slutkonc). Efter 18 tim i rums- temperatur separeras ej DNA-bunden glutaraldehyd genom gelfiltrering, Sephadex G-50 (pasteurpipett) jämviktad med 0,1 M NaCl. Droppvisa frak- tioner (50 pl) tas ut, och fraktion 8-15 hälls samman. Till de sammanför- da fraktionerna 8-15 sätts 25 pg isoluminol och 20 pl av 1 M karbonat- bikarbonat-buffert (pH 9,5). Efter 24 tim i 4°C tillsätts lysin 0,2 M.
DNA-glutaraldehyd-isoluminol-komplexet skiljs ifrån andra komponenter genom ytterligare en gelfiltrering (som ovan). Fraktionerna 8-15 innehål- ler den isoluminolinmärkta DNA-proben, och detta material används sedan direkt vid hybridisering.
Hybridisering på nitrocellulosafilter Nitrocellulosafilter fuktas i destillerat vatten och placeras på ett dubbellager torrt filterpapper (Whatman no 3). Bakterieprovet läggs på som en känd volym av en bakteriesuspension i PBS-buffert (fosfatbuffrad natriumklorid) eller ett direktprov från patient, t ex avföringsprov (frågeställning: närvaro av enterotoxinproducerande E. coli).
När proven torkat in, placeras varje filter på ett dubbellager filterpap-1 per, som mättats med 0,5 M Na0H, och inkuberas 10 min i rumstemperatur.
Därefter överförs filtren med 1-minuters intervaller till tre successiva neutraliseringar på filterpapper mättade med 1 M Tris (trishydroximetyl- aminometan), pH 7. Slutligen placeras filtren 10 min på filterpapper, som mättas med 1 M Tris, pH 7 och 1,5 M NaCl och lufttorkas därefter. Filtren bakas 2 tim i 80°C under vakuum. Under 15 min prehybridiseras filtren i en lösning bestående av 50 % formamid, 0,75 M NaCl, 0,075 M Na-citrat, 0,1 % SDS (natriumdodecylsulfat), 1 mM EDTA (etylendiamintetraacetat), 0,02 % Ficoll (polymer) (molvikt = 400 000), 0,02 % polyvinylpyrrolidon (molvikt = 360 000) samt 0,02 % bovint serumalbumin. Prehybridiseringen sker i 42°c.
Filtren placeras på dubbla filterpapper, som mättats med hybridiserings-' buffert (identisk med prehybridiseringslösningen frånsett att värmedenatu- 455 201 e rerat kaïvtymus DNA 75 pg/m1 tiiïsatts. Detta DNA har sonikerats för att ge DNA-fragment av medeïstorïek 2,5 x 105 daïton). Märkta DNA, s k prob- DNA, denatureras genom inkubering i 95°C under 10 min. Proben (50 P1) späds sedan i 42-gradig hybridiserings1ösning, och ca 100 ui probïösning appiiceras ti11 varje prov på fiïtren. Hybridisering får pågå under 1 tim vid 42°C. Slutïigen tvättas filtren två gånger vid 42°C (30 min/tvätt) i en buffert bestående av 0,75 M NaC1, 0,075 M Na-citrat samt 0,1 % SDS och två gånger i rumstemperatur (15 min/tvätt) med 0,3 M NaC1; 0,03 M Na- citrat. Sedan filtren Iufttorkats, räknas mängden märkt DNA som bundits ti11 provens DNA genom konventioneii kemiïuminiscensanaïys. Typiska re- suïtat ses i tabe11 1.
Exempel 2 Skydd vid inmärkning av det aktiva stäiiet för hybridisering 1 pg - fag M13 DNA innehåïiande 200 bp (baspar) specifikt probfragment biandas med 1 pg 200 bp renat probfragment i 0,1 M fosfatbuffert (pH 6,8).
Lösningen upphettas tiil 9506 i 5 min och får sedan stå i rumstemperatur 10 tim. Proceduren fortsättes enïigt exempei 1. Typiska resu1tat kan ses i tabeii 2.
Tabe11 1 Bunden prob Isoiuminoï (mV) cpm (3H) Antaï bakt/m1 preiiminära värden (jämf) Y. pseudotubercuïosis pan 322 108 670 2400 106 30 323 Y. pseudotubercuïosis koneroii 108 25 168 Tamm 2 Enterotoxinproducerande e. C011' (Brac) 108 045 i 2163 Ej :Tec e. em konmm 108 ss 316 455 201 5 Jämföreïse har skett med märkning med radioaktiva isotoper (3H), och där- vid erhåiïna resuïtat framgår av tabeïierna 1 och 2. Därvid framgår att märkning med kemiïuminiscerande ämnen ger vä1 så goda resul tat, vilket visar att förfarandet enïigt uppfinningen utgör ett gott a1 ternativ tiH den hittiHs använda, radioaktiva metoden utan att vara behäftad med de oïägenheter som den radioaktiva märkningen medför.
Claims (3)
1. Förfarande vid diagnostik med hjäïp av DNA-hybridiseringsteknik, exem- peivis för specifik påvisning av vävnader, ceïier, mikroorganismer e11er virus, k ä n n e t e c k n a t a v att ett artspecifikt fragment av deoxiribonukleinsyra (DNA) e11er ribonukïeinsyra (RNA) förses med en mar- kör och bringas att baspara e11er hybrídisera med ett homoiogt fragment hos det okända ämnet, varvid man som markör använder ett ämne som kan de- tekteras genom en kemiïuminiscensreaktion.
2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att man under inmärkningsförfarandet skyddar den artspecifika DNA-sekvensen resp RNA- sekvensen genom hybridisering med den homoioga sekvensen, varefter markö- ren koppias tili omgivande, icke-specifika de1ar av DNA e11er RNA-mo1eky- 1en och DNA-fragmentet ånyo denatureras, exempeïvis i a1ka1isk miïjö eiier genom upphettning, och sammanföres med det ämne som skaii diagnostiseras.
3. Mede1 för genomförande av förfarandet enïigt krav 1, k ä n n e - t e c k n a t a v att det utgöres av ett artspecifikt fragment av deoxiribonukieinsyra (DNA) eiler ribonukïeinsyra (RNA), vilket försetts med ett ämne som kan detekteras genom en kemiïuminiscensreaktion.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8200479A SE455201B (sv) | 1982-01-28 | 1982-01-28 | Forfarande och medel for nukleinsyrahybridisering och kemiluminiscensmerkt nukleinsyraprob |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8200479A SE455201B (sv) | 1982-01-28 | 1982-01-28 | Forfarande och medel for nukleinsyrahybridisering och kemiluminiscensmerkt nukleinsyraprob |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8200479L SE8200479L (sv) | 1983-07-29 |
| SE455201B true SE455201B (sv) | 1988-06-27 |
Family
ID=20345857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8200479A SE455201B (sv) | 1982-01-28 | 1982-01-28 | Forfarande och medel for nukleinsyrahybridisering och kemiluminiscensmerkt nukleinsyraprob |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SE (1) | SE455201B (sv) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0210449A2 (en) | 1985-07-10 | 1987-02-04 | Miles Inc. | Prolonged chemiluminescence |
-
1982
- 1982-01-28 SE SE8200479A patent/SE455201B/sv not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0210449A2 (en) | 1985-07-10 | 1987-02-04 | Miles Inc. | Prolonged chemiluminescence |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8200479L (sv) | 1983-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4994373A (en) | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes | |
| EP0420260B1 (en) | Method and kit for detecting a target nucleic acid using a capture probe bound to a polystyrene support via an intermediary protein. | |
| US5856092A (en) | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein | |
| CA2044591C (en) | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein | |
| JP2618381B2 (ja) | 核酸ハイブリダイゼーシヨン検定を行うための方法およびキツト | |
| CA1338207C (en) | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore | |
| US4751177A (en) | Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays | |
| JP3436538B2 (ja) | 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体 | |
| US6060242A (en) | PNA diagnostic methods | |
| US5273882A (en) | Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays | |
| US5641630A (en) | Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays | |
| JPH07246100A (ja) | 核酸の検出方法 | |
| JPH0678289B2 (ja) | 非放射性生物学的プロ−ブ | |
| JPH03103199A (ja) | 核酸の検出方法 | |
| EP0405913A2 (en) | Hydrophobic nucleic acid probe | |
| CN107937490A (zh) | 一种非对称pcr的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒 | |
| EP0211229B1 (de) | Mit Überzügen versehene Formkörper zur Bindung von bioaffinen Substanzen | |
| DE102009032502A1 (de) | Detektion von Antigenen | |
| JP3607327B2 (ja) | 単一微生物細胞の迅速検出法 | |
| EP0797778B1 (en) | A method for preparing non-proteinaceous strongly negatively charged macrobiomolecules, which are linked to plastic | |
| JP2651317B2 (ja) | 核酸の検出法 | |
| US4775631A (en) | Method of localizing nucleic acids bound to polyamide supports | |
| JPH03123500A (ja) | 核酸の分別方法 | |
| US5328827A (en) | Specific DNA molecular probes for Bos-type male genome | |
| AU723602B2 (en) | Biotin-labelled DNA by polymerase chain reaction and detection thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8200479-7 Effective date: 19920806 Format of ref document f/p: F |