SE513208C2 - Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse - Google Patents
Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelseInfo
- Publication number
- SE513208C2 SE513208C2 SE9504272A SE9504272A SE513208C2 SE 513208 C2 SE513208 C2 SE 513208C2 SE 9504272 A SE9504272 A SE 9504272A SE 9504272 A SE9504272 A SE 9504272A SE 513208 C2 SE513208 C2 SE 513208C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- starch
- potato
- vector
- enzyme
- potatoes
- Prior art date
Links
- 108010031092 starch-branching enzyme II Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 title claims description 20
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims abstract description 41
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims abstract description 36
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims abstract description 27
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims abstract 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 11
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000007323 disproportionation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010023236 starch synthase II Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 abstract 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 101710124145 1,4-alpha-glucan-branching enzyme 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 2
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVYLLZQTGLZFBW-ZBFHGGJFSA-N (R,R)-tramadol Chemical compound COC1=CC=CC([C@]2(O)[C@H](CCCC2)CN(C)C)=C1 TVYLLZQTGLZFBW-ZBFHGGJFSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710177361 Soluble starch synthase 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940075933 dithionate Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 108010004047 granule-bound starch synthase I Proteins 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
15 20 25 30 35 513 208 2 av förgrening av amylopektin i transgena växter, t ex potatis.
I WO95/14827 beskrivs plasmider som har DNA-sekven- ser som efter insättning i genomet i växterna förorsakar förändringar av kolhydratkoncentrationen och kolhydrat- sammansättningen i regenererade växter. Dessa föränd- ringar kan erhållas från en sekvens av ett förgrenings- enzym som är beläget på dessa plasmider. Detta förgre- ningsenzym föreslås förändra amylos/amylopektinförhål- landet i stärkelse hos växter, särskilt i kommersiellt använda växter.
WO92/14827 beskriver det hittills enda kända stärk- elseförgreningsenzymet i potatis och inom tekniken är det inte känt om andra stärkelseförgreningsenzym är inbegrip- na i syntesen av förgrenad stärkelse i potatis.
I Mol Gen Genet (1991) 225:289-296, Visser et al, beskrivs inhibering av expression av genen för granul- bundet stärkelsesyntas i potatis med antisenskonstruktio- ner. Inhibering av enzymet i potatisknölstärkelse var upp till 100%, Emellertid har de tidigare kända metoderna för inhi- i vilket fall amylosfri stärkelse erhölls. bering av amylopektin inte varit framgångsrika och därför är alternativa metoder för inhibering av amylopektin fortfarande i hög grad önskvärda (Müller-Röber och Koßmann, 1994; 1995). Ändamålet med föreliggande uppfinning är att möjlig- Martin och Smith, göra förändring av graden av amylopektinförgrening och amylopektin/amylosförhàllandet i potatisstärkelse.
Enligt föreliggande uppfinning uppnås detta ändamål genom att använda en DNA-sekvens som kodar för ett andra stärkelseförgreningsenzym, SBE II, vilket efter insättning i växternas genom förorsakar förändringar av nämnda förgreningsgrad och förhållande i regenererade växter.
Inom föreliggande uppfinnings omfång beskrivs också aminosyrasekvensen av SBE II och varianter av ovanstående 10 15 20 25 30 35 513 208 DNA-sekvens som är resultatet av den genetiska kodens degeneration.
Vidare beskrivs en vektor som omfattar nämnda DNA-sekvens och reglerelemept som är aktiva i potatis.
Enligt uppfinningen àsïadkommes ett förfarande för framställning av transgena potatisar med en reducerad grad av förgrening av amylopektinstärkelse, omfattande följande steg: É a) överföring och införlivande av en vektor enligt uppfinningen i genomet i en potatiscell och b) regenerering av intakta, hela plantor från de transformerade cellerna.
Slutligen åstadkommer hppfinningen användning av nämnda transgena potatisar för produktion av stärkelse.
Uppfinningen kommer att beskrivas mer i detalj nedan i förbindelse med en experimentell del och åtföljande ritningar, vari J Fig 1 visar SDS-polyakrylamidelektrofores av pro- teiner extraherade från stärkelse fràn normal potatis (spår A) och transgen potatis (spàr B). Utskurna protein- band är markerade med pilari Spàr M: molekylviktsmarkör- proteiner (kDa). f Fig 2 visar fyra peptidsekvenser härledda från spjälkade proteiner fràn potatisknölstärkelse.
Fig 3 visar en cDNA-sekvens sàväl som aminosyrasek- vensen i enbokstavskod av det nya stärkelseförgreningsen- zymet II enligt föreliggande uppfinning, omfattande 1393 nukleotider respektive 464 aminosyror.
EXPERIMENTELL DEL Å Isolering av stärkelse frånfpotatisknölar Potatisplantor (Solanum tuberosum) odlades pà fält.
Skalade knölar fràn antingen cv. Early Puritan eller fràn en transgen potatislinje som i huvudsak saknar granulbun- det stärkelsesyntas I (Svalöf Weibull AB, internationella patentansökan PCT/SE9l/OO89å), homogeniserades vid 4°C i en fruktpress. Till "saftfraktionen", som innehöll en stor fraktion av stärkelsen, sattes omedelbart Tris-HCl, lll) i H. l 10 15 20 25 30 35 513 208 pH 7,5, till 50 mM, Na-ditionat till 30 mM och etylendi- nitrilotetraättiksyra (EDTA) till 10 mM. Stärkelsegranu- lerna fick sedimentera i 30 min och tvättades 4x med 10 bäddvolymer tvättbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Stårkelsen som lämnades på bänken vid +4°C i 30 min för att sedimentera mellan varje tvättning, tvät- tades slutligen med 3 X 3 bäddvolymer aceton, lufttorka- des över natten och lagrades vid -20°C.
Extraktion av proteiner från knölstärkelse Lagrad stärkelse (20 g) landades kontinuerligt med 200 ml extraktionsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2% (vikt/vol) natriumdodecylsulfat (SDS), 5 mM EDTA) genom aspiration med en pipett vid 85°C tills stärkelsen var gelatiniserad. Proverna frystes därefter vid -70°C i l h.
Efter upptining vid 50°C centrifugerades proverna i 20 min vid 12000xg vid 10°C. Supernatanterna uppsamlades och àtercentrifugerades vid 3000xg i 15 min. De slutliga supernatanterna filtrerades genom 0,45 pm filter och 2,25 volymer iskall aceton tillsattes. Efter 30 min inkubation vid 4°C uppsamlades proteinfällningarna genom centrifuge- ring (3000xg i 30 min vid 4°C) och löstes i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. En alikvot av varje beredning analyse- rades med SDS-polyakrylamidgelelektrofores enligt Laemmli (1970) (fig 1). Proteinerna i de återstående delarna av beredningarna koncentrerades genom utfällning med tri- kloràttiksyra (10%) och proteinerna separerades på en 8% SDS-polyakrylamidgel Laemmli (1970). Proteinerna i gelen färgades med Coomassie Brilliant Blue R-250 (0,2% i 20% metanol, 0,5% ättiksyra, 79,5% Hffi.
Spjälkning i gel och sekvenering av peptider De färgade banden som markerats med pilar i fig 1, motsvarande en skenbar molekylvikt av 100 kDa, skars ut och tvättades två gånger med 0,2 M NHJfiXg i 50% aceto- nitril under kontinuerlig omröring vid 35°C i 20 min.
Efter varje tvättning avlägsnades vätskan och gelbitarna fick torka genom indunstning i ett dragskåp. De fullstän- digt torkade gelbitarna placerades därefter separat på 10 15 20 25 30 35 513 208 parafilm och 2 pl 0,2 M NHÅI5, 0,02% Tween-20 tillsattes.
Modifierat trypsin (Promega) Madison, WI, USA) (0,25 pg i 2 ul) sögs in i gelbitarna, varefter 0,2 M NH;CO3tillsat- tes i 5 pl portioner tills de hade ätertagit sina ur- sprungliga storlekar. Gelbitarna delades ytterligare i tre bitar och överfördes till ett Eppendorf-rör. 0,2 M NELCO3 (200 pl) tillsattes och proteinerna i gelbitarna spjälkades över natten vid B7°C (Rosenfeld et al 1992).
Efter avslutad spjälkning tillsattes trifluorättiksyra till 1% och supernatanterna avlägsnades och sparades.
Gelbitarna extraherades vidare två gånger med 60% aceto- nitril, 0,l% trifluorättiksyra (200 ul) under kontinuer- lig skakning vid 37°C i 20 min. De tvà supernatanterna fràn dessa extraktioner kombinerades med den första supernatanten. Gelbitarna tvättades slutligen med 60% acetonitril, 0,l% trifluoràttiksyra, 0,02% Tween-20 (200 ul). Även dessa supernatanter kombinerades med de andra supernatanterna och volymen reducerades till 50 ul genom indunstning. De extraherade peptiderna separerades pà ett SMART® kromatografisystem (Pharmacia, Uppsala, Sverige) försett med en uRPC C2/C18 SC2.l/10 kolonn. Pep- tider eluerades med en gradient av 0-60% acetonitril i vatten/0,1% trifluorättiksyfa över 60 min med en flödes- hastighet av 100 ul/min. Peptiderna sekvenerades antingen pà en Applied Biosystems 470A gasfassekvenator med en on line PTH-aminosyraanalysapparat (l20A) eller pà en modell 476A enligt instruktionerna fràn tillverkaren (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Fyra av de sekvenerade peptiderna gav lätt tolkbara sekvenser (fig 2). En databässökning avslöjade att dessa fyra peptider uppvisade likfiet med stärkelseförgrenings- enzymer och det var intressant att notera att peptiderna var mer besläktade med stärkelseförgreningsenzym II från andra växtarter än med stäráelseförgreningsenzym I fràn potatis. I 10 l5 20 25 30 35 513 208 Konstruktion av oligonukleotider som kodar för peptiderna 1 och 2 Degenererade oligonukleotider som kodar för peptid 1 och peptid 2 syntetiserades sàsom framàtriktade respek- tive omvända primersekvenser: Oligonukleotid 1: 5'-gtaaaacgacggccagt-TTYGGNGTNTGGGARATHTT-3' (resterna 1-8 i peptid 1) Oligonukleotid 2: 5'-aattaaccctcactaaaggg-CKRTCRAAYTCYTGIARNCC-3' (resterna 2-8 i peptid 2, omvänd sträng) vari H är A, C eller T, C, G eller T; R är A eller G; Y är C eller T; baser med I är inosin; K är G eller T; N är A, små bokstäver tillades som märkningssekvenser.
Rening av mRNA från potatisknöl, syntes av cDNA och PCR- -amplifiering av ett cDNA-fragment motsvarande potatis- stärkelseförgreningsenzym II Totalt RNA från mogna potatisknölar (S. tuberosum cv. Amanda) isolerades såsom beskrivits (Logemann et al 1987). ning av 2 pg totalt RNA och 60 pmol oligo-dT” som ned- Första strängens CDNA syntetiserades med använd- ströms primersekvenser. Primersekvensen hybridiserades till polyA i mRNA vid 60°C i 5 min. Förlängningen av cDNA genomfördes enligt den tekniska manualen fràn tillverka- ren med användning av Riboclone® cDNA Synthesis System M-MLV (H-) CDNA som kodar för det nya stärkelseförgreningsen- (Promega). zymet II enligt uppfinningen amplifierades i en Perkin- -Elmer GeneAmp® 9600 PCR thermocycler (Perkin-Elmer Cetus Instruments, CT, USA) med användning av tvà degenererade primersekvenser konstruerade fràn peptiderna 1 och 2 (se ovan) under följande betingelser: l mM dNTP, 1 pM av var- dera primersekvensen och en alikvot av cDNA beskrivet 10 l5 20 25 30 35 513 208 ovan i en total reaktionsvolym av 20 pl med lx AmpliTaq® buffert och 0,8 enheter AmpliTaq® (Perkin-Elmer Cetus).
Cykliseringsbetingelserna var: 96°C i 1 min, 80°C medan enzymet tillsattes som en “hotstart" (ungefär 15 min), en: oavsiktlig: fall till 25%, s cykler vid 94°c i 20 s, 45°C i 1 min, höjning till 72°C under 1 min och bibehål- lande vid 72°C i 2 min, och 30 cykler av 94°C i 5 s, 45°C i 30 s och 72°C i (2 min + 2 s per cykel) och komplet- terat med 72°C i 10 min före kylning till 4°C.
Ett prov av denna reaktion (0,1 pl) omamplifierades med användning av cykliserihgsbetingelserna: 96°C i 1 min, 80°C medan enzymet tillsattes som en "hotstart" (ungefär 5 min), 5 cykler av 94°C i 20 s, 45°C i 1 min och 72°C i 2 min, och 25 cyklerfav 94°C i 5 s, 45°C i 30 s och 72°C i 10 min före kylning till 4°G. Efter avslutad PCR-ampli- (2 min + 2 s per cykel) och avslutad med 72°C i fiering satsades reaktionsblandningen pä en 1,5% Seakem® agarosgel (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). Efter elektrofores och färgning med etidiumbromid skars ett huvudband ut med en synbar storlek av 1500 bp och frag- mentet eluerades genom skakning i vatten (200 pl) i 1 h.
Detta fragment användes som mall i sekveneringsreaktioner efter omamplifiering med användning av primersekvenser motsvarande märkningssekvenserna (i oligonukleotiderna 1 och 2), rening med agarosgelelektrofores som ovan och extraktion fràn gelen med användning av Qiaex® gelext- raktionssats enligt tillverkarens instruktioner (DIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland). Sekveneringsreaktionerna gjordes med användning av DyeDeoxy®:Terminator Cycle Sequencing kits (Perker-Elmer Cetus Indtruments) med användning av märkningssekvenser och intefina primersekvenser. Sekvene- ringsreaktionen analyseradeš pà en Applied Biosystems 373A DNA-sekvenerare enligt;tillverkarens protokoll. Sek- vensen redigerades och gav än sekvens omfattande 1393 bp (fig 3), exklusive nukleotiderna 1 och 2. Jämförelser av konsensussekvensen med EMBL¿ och GenBank-databaserna visade ca 80% identitet med stärkelseförgreningsenzym II 10 15 20 25 30 35 513 208 från andra växtarter. Föreliggande uppfinnare betecknar därför enzymet som kodas av den nya förgreningsenzymsek- vensen för potatisstärkelseförgreningsenzym II ("potato starch branching enzyme II").
Transformation av potatisplantor Det isolerade fullängds-cDNA fràn potatisstärkelse- förgreningsenzym II och andra funktionellt aktiva frag- ment i området 50-2700 bp från fullängds-cDNA (se nedan) klonas i omvänd orientering efter promotorer som är akti- va i potatisknölar. Med uttrycket "funktionellt aktiva" menas fragment som kommer att pàverka amylos/amylopektin- förhållandet i potatisstärkelse. Den för närvarande till- gängliga DNA- och aminosyrasekvensen av SBE II enligt uppfinningen visas i fig 3. Promotorerna är valda bland t ex patatinpromotorn, promotorn fràn genen för granul- bundet potatisstärkelsesyntas I eller promotorer isolera- de från generna för potatisstärkelseförgreningsenzymerna I och II. Konstruktionen klonas antingen i en binär Ti-plasmidvektor lämplig för transformation av potatis medierad av Agrobacterium tumefaciens, eller i en vektor, lämplig för direkt transformation med användning av bal- listiska tekniker eller elektroporering. Det inses att sens- (se nedan) och antisens-konstruktionerna màste innehålla alla nödvändiga reglerelement. Transgena pota- tisplantor transkriberar specifikt den omvända stärkel- seförgreningsenzym II-konstruktionen i knölarna, vilket leder till antisensinhibering av enzymet. En reduktion av och ett förändrat mönster för förgreningen av amylopektin såväl som ett ändrat amylos/amylopektinförhällande bör därvid uppträda i potatisknölstärkelse.
Antisenskonstruktionen för potatisstärkelseförgre- ningsenzym II används också i kombination med antisens- konstruktioner för potatisstärkelseförgreningsenzym I, för granulbundet potatisstärkelsesyntas II, för lösliga potatisstärkelsesyntaser II och III, för potatisstärkel- sedisproportioneringsenzym (D-enzym) eller för potatis- stärkelseavförgreningsenzym för att transformera potatis 10 15 20 513 208 till att ändra graden av förgrening av amylopektin och amylos/amylopektinförhällandet. Detta kommer att ge nya och värdefulla material till stärkelseprocessindustrin.
Det isolerade potatisstärkelseförgreningsenzymet II enligt uppfinningen kommer öcksà att användas för att isolera ett fullängds-CDNA som kodar för enzymet antingen genom amplifiering, såsom med PCR-teknologin, eller genom undersökning av CDNA-bibliotek eller genom en kombination av dessa tillvägagångssätt.ÄFullängds-CDNA-sekvensen som kodar för enzymet klonas i sensorientering efter en eller flera av de ovan nämnda promotorerna, och konstruktioner- na överföres till lämpliga transformationsvektorer, såsom beskrivs ovan, och används för transformation av potatis.
Regenererade transformerade potatisplantor förväntas producera ett överskott av stärkelseförgreningsenzym II i knölarna, vilket leder till en ökad grad och förändrat mönster av förgrening av amylopektin eller till inhibe- ring av transkription av endogen stärkelseförgreningsen- zym II-transkription beroende pà sam-suppression, vilket resulterar i en minskad förgrening av amylopektin. lO l5 20 25 513 208 10 Referenser Mülle-Röber, B., Koßmann, J., (1994) Approaches to in- fluence starch quantity and starch quality in transgenic plants. Plant Cell Environm. 17, 601-613.
Martin, C., Smith, A. (1995) Starch Biosynthesis. Plant Cell 7, 971-985.
Laemmli, U.K. (1979) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Logemann, J., Schell, J. och Willmitzer, L. (1987) Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163, 16-20.
Rosenfeld, J., Capdeville, J., Guillemot, J.C., Ferrara, P. (1992) In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, 173-179.
Visser, R.G F., Jacobsen, E. (1993) Towards modifying plants for altered starch content and composition.
TibTech 11, 63-68.
Claims (8)
1. l. Förfarande för prodflktion av transgena potatisar med antingen en ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse, k å n n e t e c k n a t av att det omfattar följande stegzf J a) överföring och inföflivande av en vektor omfat- tande hela eller en funktionellt aktiv del av den DNA- sekvens som kodar för stärkelseförgreningsenzym II (SBE II) fràn potatis omfattande nukleotidsekvensen som visas i fig 3 i de bifogadeäritningarna, eller varianter därav som är resultatet av den genetiska kodens degenera- tion, och reglerelement som är aktiva i potatis in i ge- nomet i en potatiscell och b) regenerering av intakta, hela plantor fràn de transformerade cellerna.
2. Förfarande för produktion av transgena potatisar med reducerad grad av förgrening av amylopektinstärkelse, k ä n n e t e c k n a t av att det omfattar följande Steg: a) överföring och införlivande av en vektor omfat- tande hela eller en funktionellt aktiv del av den DNA- sekvens som kodar för stärkelseförgreningsenzym II (SBE II) från potatis omfattande nukleotidsekvensen som visas i fig 3 i de bifogade ritningarna och reglerelement som är aktiva i potatis, vilken DNA-sekvens är insatt i antisensriktning (omvänd orientering), in i genomet i en potatiscell och I b) regenerering av intakta, hela plantor frán de transformerade cellerna.
3. Förfarande enligt krav 2, vari vektorn också om- fattar en antisenskonstruktipn av stärkelseförgrenings- (SBE I).
4. Förfarande enligt krav 2 eller 3, vari vektorn enzym I ,.ocksà omfattar en antisenskonstruktion av granulbundet potatisstärkelsesyntas-II;~-ß»-+« -1----'=~~=~i f-'~~~=~=»~*-- HA.1L||.n|\xm|.|.|..||l.\i|..|u|m..\.|.|\ m. 10 513 208 12
5. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 2-4, vari vektorn också omfattar en antisenskonstruktion av lösliga potatisstärkelsesyntaser II och III.
6. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 2-5, vari vektorn också omfattar en antisenskonstruktion av potatisstàrkelsedisproportioneringsenzym (D-enzym). _
7. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 2-6, vari vektorn också omfattar en antisenskonstruktion av potatisstârkelseförgreningsenzym.
8. Användning av transgena potatisar framställda en- ligt ett eller flera av kraven 1-7 för produktion av stärkelse. ï
Priority Applications (17)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9504272A SE513208C2 (sv) | 1995-11-29 | 1995-11-29 | Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse |
| SE9601506A SE513209C2 (sv) | 1995-11-29 | 1996-04-19 | Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse |
| JP9520417A JP2000500978A (ja) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | ポテトのデンプン分枝酵素▲ｉｉ▼ |
| PL96326975A PL186381B1 (pl) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Wyizolowana sekwencja DNA kodująca sieciujący skrobię enzym II (SBE II) ziemniaka, sekwencja aminokwasowa sieciującego skrobię enzymu II (SBE II) ziemniaka, wektor oraz sposób otrzymywania transgenicznych ziemniaków |
| HU9901306A HU222651B1 (hu) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Burgonya II. típusú, keményítżt elágaztató enzimje |
| CA002238948A CA2238948C (en) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Starch branching enzyme ii of potato |
| KR1019980704030A KR100540824B1 (ko) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | 감자의 전분 분지형성 효소 ⅱ |
| EP96940226A EP0863983A2 (en) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Starch branching enzyme ii of potato |
| AU77165/96A AU7716596A (en) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Starch branching enzyme ii of potato |
| SK726-98A SK284999B6 (sk) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Aminokyselinová sekvencia, sekvencia DNA, ich fragmenty, vektory, spôsob produkcie transgénnych zemiakov s modifikovaným stupňom vetvenia amylopektínového škrobu a ich použitie na výrobu škrobu |
| PCT/SE1996/001558 WO1997020040A1 (en) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Starch branching enzyme ii of potato |
| CZ0165698A CZ298540B6 (cs) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, zpusob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu |
| CN96199514A CN1112443C (zh) | 1995-11-29 | 1996-11-28 | 马铃薯淀粉分支酶ⅱ |
| NO982443A NO982443L (no) | 1995-11-29 | 1998-05-28 | Stivelsesforgrenende enzym II fra potet |
| US09/087,277 US6169226B1 (en) | 1995-11-29 | 1998-05-29 | Starch branching enzyme II of potato |
| US09/658,499 US6469231B1 (en) | 1995-11-29 | 2000-09-08 | Starch branching enzyme II of potato |
| US10/254,534 US20030046730A1 (en) | 1995-11-29 | 2002-09-26 | Starch branching enzyme II of potato |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9504272A SE513208C2 (sv) | 1995-11-29 | 1995-11-29 | Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE9504272D0 SE9504272D0 (sv) | 1995-11-29 |
| SE9504272L SE9504272L (sv) | 1997-05-30 |
| SE513208C2 true SE513208C2 (sv) | 2000-07-31 |
Family
ID=20400410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE9504272A SE513208C2 (sv) | 1995-11-29 | 1995-11-29 | Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SE (1) | SE513208C2 (sv) |
-
1995
- 1995-11-29 SE SE9504272A patent/SE513208C2/sv not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE9504272L (sv) | 1997-05-30 |
| SE9504272D0 (sv) | 1995-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SE513209C2 (sv) | Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse | |
| Stiefel et al. | Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation | |
| US4886878A (en) | Modified zein genes containing lysine | |
| Kobayashi et al. | Myb-related genes of the Kyoho grape (Vitis labruscana) regulate anthocyanin biosynthesis | |
| US4885357A (en) | Modified zein proteins containing lysine | |
| ES2321347T3 (es) | Nuevos almidones obtenidos para la modificacion de la expresion de genes de enzimas biosinteticas de almidon. | |
| Loopstra et al. | Xylem-specific gene expression in loblolly pine | |
| EP0542929A1 (en) | Glycogen biosynthetic enzymes in plants | |
| US8563687B2 (en) | Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline rich glycoproteins | |
| JP2003525030A (ja) | 亜麻種子特異的プロモーター | |
| CN114836437B (zh) | 牡丹PsMYB4基因在改变植物花瓣色斑颜色和大小方面的应用 | |
| KR102254956B1 (ko) | 백색 구피색 양파를 판별할 수 있는 분자 마커 및 그 용도 | |
| Qiu et al. | Development of a wheat material with improved bread-making quality by overexpressing HMW-GS 1Slx2. 3* from Aegilops longissima | |
| CA1304025C (en) | Modified zein | |
| SE513208C2 (sv) | Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse | |
| JP3357907B2 (ja) | ペチュニアの転写因子ＰｅｔＳＰＬ２の遺伝子の導入によって花序の節間を短縮させる方法 | |
| AU732422B2 (en) | Method for expressing foreign genes and vectors therefor | |
| KR20110006323A (ko) | 식물의 뿌리털 발달 조절 유전자 ｒｈｓ1 및 이를 이용한 식물의 뿌리털 발달 조절 방법 | |
| JP3054687B2 (ja) | Ｌ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子 | |
| Bartels et al. | Isolation and Characterization of Plant Genes | |
| US6831168B1 (en) | Aldehyde oxidase gene derived from plant and utilization thereof | |
| JP5266489B2 (ja) | ジーンサイレンシング抑制技術 | |
| JP2775405B2 (ja) | 新規チオニン | |
| EP1869189A2 (en) | Alteration of plant embryo/endosperm size during seed development | |
| CN121249740A (zh) | 一种Gb-miR858a—GbMYBs在调控银杏类黄酮合成中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |