CZ298540B6 - Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, zpusob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu - Google Patents

Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, zpusob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu Download PDF

Info

Publication number
CZ298540B6
CZ298540B6 CZ0165698A CZ165698A CZ298540B6 CZ 298540 B6 CZ298540 B6 CZ 298540B6 CZ 0165698 A CZ0165698 A CZ 0165698A CZ 165698 A CZ165698 A CZ 165698A CZ 298540 B6 CZ298540 B6 CZ 298540B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
potato
starch
leu
asp
gly
Prior art date
Application number
CZ0165698A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ165698A3 (cs
Inventor
Ek@Bo
Khosnoodi@Jamshid
Larsson@Clas-Tomas
Larsson@Häkan
Rask@Lars
Original Assignee
Amylogene Hb C/O Svalöf Weibull Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9504272A external-priority patent/SE513208C2/sv
Application filed by Amylogene Hb C/O Svalöf Weibull Ab filed Critical Amylogene Hb C/O Svalöf Weibull Ab
Publication of CZ165698A3 publication Critical patent/CZ165698A3/cs
Publication of CZ298540B6 publication Critical patent/CZ298540B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/1048Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1071,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Aminokyselinová sekvence vetvicího enzymu škrobu bramboru II (SBE II) obsahující aminokyselinovou sekvenci znázornenou v SEQ ID No. 1. Izolovaná sekvence DNA kódující vetvicí enzym škrobu bramboru II(SBE II), jehož aminokyselinová sekvence je definována výše, zahrnující nukleotidovou sekvenci znázornenou v SEQ ID No. 1 a její varianty vzniklé degenerací genetického kódu, jakož i její funkcní fragmenty a vektory s obsahem celé této DNA nebo jejího fragmentu. Zpusob produkce transgenního bramboru s bud zvýšeným nebo sníženým stupnem vetvení amylopektinového škrobu, pri nemž se výše uvedený vektor prenáší a vnáší do genomu bunky bramboru a potom se b) z transformovaných bunek regenerují intaktní celé rostliny. Transgenní brambor pripravitelný tímto zpusobem a jeho použití pro výrobu škrobu.

Description

Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, způsob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu (57) Anotace:
Aminokyselinová sekvence větvícího enzymu škrobu bramboru II (SBE II) obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 1. Izolovaná sekvence DNA kódující větvicí enzym škrobu bramboru II (SBE II), jehož aminokyselinová sekvence je definována výše, zahrnující nukleotidovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 1 a její varianty vzniklé degenerací genetického kódu, jakož i její funkční fragmenty a vektory s obsahem celé této DNA nebo jejího fragmentu. Způsob produkce transgenního bramboru s buď zvýšeným nebo sníženým stupněm větvení amylopektinového škrobu, při němž se výše uvedený vektor přenáší a vnáší do genomu buňky bramboru a potom se b) z transformovaných buněk regenerují intaktní celé rostliny. Transgenní brambor připravitelný tímto způsobem a jeho použití pro výrobu škrobu.
Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, způsob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se vztahuje k novému enzymu brambor způsobujícímu větvení škrobu. Konkrétně se předkládaný vynález vztahuje k aminokyselinové sekvenci druhého enzymu způsobujícího větvení bramborového škrobu (SBEII starch branching enzyme) a odpovídající sekvenci DNA a jejím funkčním fragmentům. Dále se vynález vztahuje k vektorům skládajícím se z takových sekvencí DNA, které jsou použitelné k produkci transgenních brambor a k použití těchto brambor k produkci škrobu.
Dosavadní stav techniky
Škrob je složitá směs rozličných molekulových forem, odlišujících se stupněm polarizace a větvení glukózových řetězců. Škrob se skládá z amylózy a amylopektinu, přičemž amylóza je složená z v podstatě lineárního oc-l,4-glukanu a amylopektin je složený z a-l,4-glukanů spojených vzájemně přes a-l,6-můstky, takže vzniká rozvětvený polyglykan. Znamená to, že škrob není jednotný hrubý materiál.
Škrob je syntetizován v nejméně třech enzymatických reakcích, ve kterých jsou zahrnuty ADPglukózofosforyláza (EC 2.7.7.27), syntetáza škrobu (EC 2.4.1.18). Předpokládá se, že enzym větvicí škrob (SBE, také nazývaný Q-enzym či větvicí faktor) má dvě různé enzymatické aktivity. Katalyzuje jednak hydrolýzu a-1,4-glukosidických vazeb a jednak vznik 1,6-glukosidických vazeb vznikajících během syntézy větvených komponent škrobu, například amylopektinu.
Rostlinný škrob je hodnotný zdroj obnovitelné suroviny, používané například v chemickém průmyslu (Visser a Jacobsen, 1993). Kvalita škrobu musí splňovat nároky průmyslových procesů, v kterých je uniformita struktury důležitým kritériem. Pro průmyslové aplikace jsou potřeba rostliny obsahující škrob složený buď jen z amylózy nebo rostliny mající škrob obsahující pouze amylopektin.
Postupy zvyšující poměr amylózy ku amylopektinu ve škrobu byly již navrženy. Například v WO 95/04826 jsou popsány sekvence DNA, kódující enzymy snižující větvení tedy se schopností snížit nebo zvýšit stupeň větvení amylopektinu v trangenních rostlinách, například v bramborech.
V WO 92/14827 jsou popsány plazmidy mající sekvence, které po inzerci do genomů rostlin způsobují měny v koncentraci uhlohydrátů a uhlodrátovém složení regenerovaných rostlin. Tyto změny mohou být získány pomocí sekvence větvícího enzymu, které je umístěna na těchto plazmidech. Předpokládá se, že tento větvicí enzym zvyšuje poměr amylózy ku amylopektinu v rostlinném škrobu, zvláště v komerčně využívaných rostlinách.
WO 12/14827 popisuje pouze dosud známý škrobový větvicí enzym u brambor a není známo ani odborníkům, zdali jsou v procesu syntézy větveného škrobu brambor zahrnuty ještě další enzymy.
V Mol Gen Genet (1991) 225: 286-296, Visser et al., je popsána inhibice exprese genu, pomocí antisence konstruktu, pro granulově vázanou syntetázu škrobu. Inhibice enzymu u škrobu bramborových hlíz byla až 100%, což znamená, že se v těchto případech tvořil bezamylózový škrob. Předcházející způsob nebyl nicméně takto úspěšný v případě inhibice amylopektinu a alternativní metody inhibice amylopektinu je proto stále vysoce žádoucí (Můller-Róber and KoPmann, 1994, Martin a Smith, 1995).
-1 CZ 298540 B6
Podstata vynálezu
Vynález je zaměřen na změnu stupně větvení amylopektinu a poměr amylopektin/amylóza v bramborovém škrobu. Podle předkládaného vynálezu je tento cíl dosažen objevem nově izolované sekvence DNA, kódující druhý enzym větvení škrobu brambor (SBE II), a pomocí fragmentů odvozených od této sekvence, které po inzerci do genomu rostlin způsobují změny ve stupni a poměru větvení škrobu v regenerovaných rostlinách.
Předmětem vynálezu je především aminokyselinová sekvence větvícího enzymu škrobu bramboru II (SBE II) obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 1.
Předmětem vynálezu je dále také izolovaná sekvence DNA kódující větvicí enzym škrobu bramboru II (SBE II), jehož aminokyselinová sekvence je definována výše, zahrnující nukleotidovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 1 a její varianty vzniklé degenerací genetického kódu.
V souvislosti s tím je předmětem vynálezu i fragment izolované sekvence DNA podle předchozího odstavce, který kóduje větvicí enzym škrobu bramboru II (SBE II), jehož aminokyselinová sekvence je definována výše. Tento fragment přednostně obsahuje nukleotidovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 2.
Dále je předmětem vynálezu také vektor obsahující celou nebo funkčně aktivní část izolované sekvence DNA uvedené výše a regulační prvky aktivní v bramboru. V tomto vektoru je sekvence DNA přednostně v obrácené (antisense) orientaci vůči promotoru bezprostředně jí předcházejícímu.
Předmětem vynálezu je dále také způsob produkce transgenního bramboru s buď zvýšeným nebo sníženým stupněm větvení amylopektinového škrobu, při němž se a) výše uvedený vektor přenáší a vnáší do genomu buňky bramboru a potom se b) z transformovaných buněk regenerují intaktní celé rostliny.
Předmětem vynálezu je dále také způsob produkce transgenního bramboru se sníženým stupněm větvení amylopektinového škrobu, při němž se a) vektor, v němž je sekvence DNA přednostně v obrácené (antisense) orientaci vůči promotoru bezprostředněji předcházejícímu přenáší a vnáší do genomu buňky bramboru a potom se b) z transformovaných buněk regenerují intaktní celé rostliny. Přitom vektor výhodně také obsahuje antisense konstrukt větvícího enzymu škrobu bramboru I (SBE I) a/nebo antisense konstrukt granulově vázané syntetázy škrobu bramboru II a/nebo antisense konstrukt rozpustné syntetázy škrobu bramboru II a III a/nebo antisense konstrukt disproporcionačního enzymu škrobu bramboru (D-enzymu) a/nebo antisense konstrukt odvětvovacího enzymu škrobu bramboru.
Konečně je předmětem vynálezu také transgenní brambor připravitelný výše uvedeným způsobem a jeho použití pro výrobu škrobu.
Nová sekvence DNA kódující SBE II, obsahující 3074 nukleotidů a také korespondující aminokyselinová sekvence obsahující 878 aminokyselin je ukázána v SEQ ID No. 1. Jeden fragment o délce 1393 nukleotidů výše uvedené sekvence DNA, korespondující s nukleotidy 1007 až 2399 DNA sekvence v SEQ ID No.l. a také korespondující aminokyselinová sekvence obsahující 464 aminokyselin jsou ukázány v SEQ ID No. 2.
Dále jsou poskytovány vektory obsahující výše zmíněnou sekvenci izolované DNA a regulační části DNA aktivní v bramborách. Sekvence DNA může být vložena ve vektorech v orientaci „sense“ nebo „antisense“ (obráceně ve vztahu k promotoru, který následuje bezprostředně před touto sekvencí DNA.
-2CZ 298540 B6
V následující části je vynález popsán detailněji. V této části je popsána také experimentální část a doprovodné obrázky.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje SDS polyakrylamidovou elektroforézu proteinů extrahovaných ze škrobu normálních brambor (linie A) a transgenních brambor (linie B). Chybějící proteinové skvrny jsou označeny šipkami. Linie M jsou markéry molekulových hmotností (kDa).
Obr. 2 ukazuje 4 peptidové sekvence odvozené znaštěpených proteinů škrobu bramborových hlíz.
Příklady provedení vynálezu
Izolace škrobu z bramborových hlíz
Rostliny brambor (Solanum tuberosum) byly pěstovány na poli. Oloupané hlízy kultivaru Early Puritán nebo transgenní linie brambor prakticky postrádající syntetázu škrobu I vázanou na granule (Svalof Weibull AB, mezinárodní přihláška PCT/SE91/00892) byly homogenizovány při 4 °C. Do frakce zbavené hrubých částic (juice fraction), obsahující velkou část škrobu, byly ihned přidány: Tris - HCL pufr, pH 7,5 tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 50 mM Na4P2O7 (Na-dithionit) tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 30 mM a EDTA tak, aby výsledná koncentrace byla 10 mM. Škrobové granule sedimentovaly během 30 minut, poté byly 4x promyty desetinásobným množstvím promývacího pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM EDTA). Škrob, který mezi každým promytím sedimentoval 30 minut při 4 °C byl nakonec třikrát promyt třemi objemy acetonu, usušen přes noc volně na vzduchu a skladován při -20 °C.
Extrakce proteinů bramborového škrobu
Skladovaný škrob (20 g) byl kontinuálně smíchán s 200 ml extrakčního pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2% (hm./obj.) sodiumdodecylsulfát (SDS), 5 mM EDTA) postupným přidáváním pipetou při 85 °C tak dlouho, dokud škrob neželatinoval. Vzorky byly poté na jednu hodinu zmraženy při -70 °C. Po rozmražení při 50 °C byly vzorky centrifugovány 20 minut při 12 000 x g a 10 °C. Supernatant byl shromažďován a znovu centrifugován 15 minut při 3000 x g. Výsledný supernatant byl zfiltrován přes filtry 0,45 pm a k němu byly následně přidány 2,25 objemy ledového acetonu. Po 30 minutách inkubace při 4 °C byla sraženina proteinů oddělena centrifugací (3000 x g po 30 minut při 4 °C) rozpouštěna v 50mM Tris-HCl, pH 7,5. Část každé preparace byla analyzována pomocí SDS polyakrylamidové elektroforézy podle Leammliho (1970) (Obr. 1). Proteiny ve zbylé části preparace byly zkoncentrovány vysrážením trichloroctovou kyselinou (10%) a poté rozděleny na 8% SDS polyakrylamidovém gelu dle Laemmliho (1970). proteiny v gelu byly obarveny Commassier Brilliant Blue R-250 (0,2% v roztoku 20% metanolu, 0,5 % octové kyseliny a 79,5 % H2O).
Štěpení proteinů v gelu a sekvenování peptidů
Obarvené proužky proteinů označené šipkami (Obr. 1), korespondující s molekulovou hmotností okolo 100 kDa, byly vyříznuty a dvakrát promyty v 0,2 M roztoku NH4HCO3 v 50% acetonitrilu za stálého míchání při 35 °C. Doba každého promývání byla 20 minut. Po každém promytí byl roztok odstraněn a kousky gelu byly vysušeny odpařením v digestoři. Dobře vysušené kousky gelu byly poté každý zvlášť položeny na parafín a k nim byly přidány 2 μΐ roztoku 0,2 M NH4CO3, 0,02% Tween-20. Poté byly na kousky gelu naneseny 2 μΐ (25 μg) modifikovaného trypsinu (Promega, Madison, Wi,USA). Po jejich vsáknutí byly nanášeny 5μ1 objemy 0,2 M NH4CO3 tak dlouho, dokud gely nenabyly svých původních velikostí. Kousky gelu byly dále
-3 CZ 298540 B6 rozděleny na tři části a přeneseny do ependorfek. To každé bylo přidáno 200 μΐ 0,2 M NH4CO3. Proteiny obsažené v kouscích gelu se poté rozkládaly přes noc při 37 °C (Rosenfeld et al. 1992). Po úplném rozkladu byla přidána trifluoroctová kyselina tak, aby výsledná koncentrace byla 1%. Supematant byl odebrán a uschován. Kousky gelu byly dále extrahovány dvakrát 200 μΐ směsi obsahující 60% acetonitril, 0,1% trifluroctovou kyselinu a 0,02% Tween - 20. Tyto supernatanty byly spojeny s ostatními supernatanty a jejich objem byl redukován na 50 μΐ odpařením. Extrahované peptidy byly rozděleny na chromatografíckém systému SMART (Pharmacia, Uppsala, Sweden) s kolonou pRPC C2/C18 SC2.1/10. Peptidy byly eluovány 0-60% gradientem acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině. Separace trvala 60 minut při průtoku 100 μΙ/min. Peptidy byly sekvenovány na sekvenátoru Applied Biosystems 470A s plynou fází a s on-line PTH aminoanalyzátorem (120A) nebo na modelu 476A dle návodu výrobce (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Čtyři ze sekvenovaných peptidů daly jednoduše interpretovatelné sekvence (Obr. 2). Prohledání databází ukázalo, že tyto čtyři peptidy vykazují podobnost se škrobovými větvícími enzymy. Zajímavé bylo zjištění, že tyto peptidy byly více příbuzné škrobovému větvícímu enzymu II z jiných rostlinných druhů než škrobovému větvícímu enzymu I z brambor.
Konstrukce oligonukleotidů kódujících peptidy 1 a 2
Degenerované oligonukleotidy kódující peptid 1 a 2 byly syntetizovány jako primery (v oboru směrech):
Oligonukleotid 1: 5'-gtaaaacgacggccagt - TTYGGNGTNTGGGARATHTT - 3' (rezidua 2 až 8 peptidu 1)
Oligonukleotid 2: 5'-aattaaccctcactaaaggg - CKRTCRAAYTCYTGIARNCC - 3' (rezidua 2 až 8 peptidu 2, obrácený řetězec), kde
H a A, C nebo T, I je inosin, K je G nebo T. N je A, C, G nebo T, R je A nebo G, Y je C nebo T. Báze označené malými písmeny byly přidány jako připojovací (tag) sekvence.
Purifíkace mRNA z bramborových hlíz, syntéza cDNA a PCR amplifikace cDNA fragmentů korespondujících se škrobovým větvicím enzymem brambor II pomocí PCR.
Celková RNA ze zralých bramborových hlíz (S.tuberosum cn. Amanda) byla izolována podle Logemanna et al. (1987). První řetězec cDNA byl syntetizován s použitím 2 pg celkové RNA a 60 pmolů oligo-dT3o jako primer pro kódující řetězec. Primer byl připojen na polyA mRNA při 60 °C po dobu 5 minut. Prodloužení cDNA bylo provedeno pomocí systému Riboclone cDNA Synthesis Systém M-MLV (H-) (Promega) dle technického manuálu výrobce.
cDNA kódující nový škrobový větvicí enzym II (dle vynálezu) byl aplikován na přístroji PerkinElmer GeneAmp 9600 PCR thermocycler (Perkin-Elmer Cetus Instruments, CT, USA) s použitím dvou degenerovaných primerů odvozených od peptidů 1 a 2 (viz výše) za následujících podmínek: 1 mM dNTP, 1 μΜ primery a příslušné množství cDNA popsané výše. Celkový objem reakční směsi byl 20 μΐ a obsahoval 1 x pufr AmpliTaq a 0,8 u AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus). Podmínky v cykleru byly následující: 96 °C po dobu jedné minuty, 80 °C ve chvíli, kdy byl enzym přidán do reakční směsi (tím byla spuštěna rekce). Při této teplotě byla reakce udržována po dobu cca 15 minut. Následoval nezamýšlený pokud teploty na 25 °C, pět cyklů při 94 °C po dobu 20 sekund, 1 min při 45 °C, jednominutový vzrůst na 72 °C, dvě minuty při 72 °C, 30 cyklů: 5 sekund při 94 °C, 20 sekund při 45 °C a 2 min+2sek. při 72 °C. Teplota 72 °C byla nakonec udržována po následujících 10 minut před ochlazením na 4 °C.
Vzorek z této reakce (0,1 μΐ) byl reamplifikován za následujících podmínek: 96 °C po dobu 1 min., 80 °C ve chvíli, kdy byl enzym přidán do reakční směsi (tím byla spuštěna reakce), při této teplotě byla reakce udržována podobu cca 5 minut. Následovalo pět cyklů: 20 sekund při 94 °C, 1
-4CZ 298540 B6 minuta při 45 °C, 2 minuty při 72 °C a 25 cyklů: 5 sekund při 94 °C. 30 sekund při 45 °C, 2 min. + 2 sek. při 72 °C. Teplota 72 °C byla nakonec udržována po následujících 10 minut před ochlazením na 4 °C. Po dokončení PCR amplifikace byla reakce nanesena na 1,5% agarózový gel Seakem (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). Po elektroforéze a obarvení gelu etidiumbromidem byl nejsilnější proužek o velikosti 1500 bp vyříznut a fragmenty byly eluovány třepáním ve vodě (200 μΐ) po dobu jedné hodiny. Tento fragment byl po reamplifikaci s použitím primerů korespondujících s tag sekvencemi (v oligonukleotidem 1 a 2) a purifikací pomocí elektroforézy na agarozovém gelu tak, jak byla popsána výše a následné extrakci z gelu s použitím extrakčního kitu Qiaex (DIAGEN GmbH, Hilden, Germany), dle instrukcí výrobce, použit jako templát pro sekvenování. Sekvenování bylo prováděno s použitím kitů DeyDeoxy Terminátor Cycle Sequences kit (Prkin-Elmer Cetus Instruments) a s použitím tag sekvencí a interních primerů. Sekvenování bylo analyzováno na přístroji Applied Biosystem 373A DNA sequencer podle národu výrobce. Sekvence byla poté sestavena a obsahovala 1393 bp.
K dokončení stanovení sekvence škrobového větvícího enzymu II, byly 5' a 3' konce úplné DNA amplifikovány ze stejné celkové RNA jako v předchozím případě s použitím techniky „rapid amplification od cDNA ends“ (RACE) při které byly použity specifické primery odvozené ze sekvence dlouhé 1393 bp. V případě amplifikace 3' - konce byl použit primer T29G proti polyA konci a v případě 5' konce byl použiti kit 573' RACE kit od firmy Boehringer Mannheim (Cat. No. 1734792). Fragmenty z těchto amplifikací byly opět stejným způsobem sekvenovány s použitím interních a koncových primerů. Sekvence z těchto dvou konců byly přidány k 1393 párům bází tak, že nám dala složenou celou délku sekvence cDNA. Z této sekvence byly odvozené primery tak, aby bylo možné amplifikovat celou kódující část v jednom kuse. Částečné sekvenování amplifikované kódující cDNA potvrdilo přítomnost cDNA korespondující se složenou sekvencí. Celková délka cDNA je 3074 bp a translatovaná sekvence se skládala z 878 aminokyselin. Protein v konečné formě obsahuje 830 aminokyselin.
Porovnání takto zjištěné sekvence s údaji v databankách EMBL a GenBank ukázalo 68% identitu se škrobovým větvicím enzymem I z brambor a asi 80% identitu se škrobovým větvicím enzymem II zjiných rostlinných druhů. Vynálezci proti pojmenovali enzym kódovaný novou sekvencí větvícího enzymu „škrobový větvicí enzym brambor II“ (potato starch branching enzyme II).
Transformace rostlin brambor
Izolovaná úplná cDNA škrobového větvícího enzymu brambor II a další funkčně aktivní fragmenty v rozmezí 50 - 3074 párů bází byly klonovány v obrácené orientaci za promotory aktivními v bramborových hlízách. Termínem „funkčně aktivní“ jsou označovány fragmenty, které ovlivní poměr amylózy ku amylopektinu v bramborovém škrobu. Aminokyselinová sekvence a sekvence DNA SBE II a dále jeden fragment DNA a jemu odpovídající aminokyselinová sekvence, (které jsou předmětem vynálezu) jsou ukázány v SEQ ID No. 1 a 2.
Jako promotory byly vybrány například: papatin promotor, promotor genu kódujícího vázanou škrobsyntázu I nebo promotory izolované z genů kódujících větvicí enzym brambor I a II.
Konstrukty byly klonovány známými technikami buď pomocí Ti-plazmidu, vektoru vhodného pro transformaci brambor zprostředkovanou Agrobacterium trumefaciens, nebo pomocí vektoru vhodného k použití balistickými technikami či elektroporací. „Sence“ i „antisence“ konstrukty obsahovaly všechny potřebné regulační elementy.
Transgenní rostliny brambor poté transkribují specificky v hlízách konstrukt - inverzní škrobový větvicí enzym II - což vede k antisence inhibici enzymu. Dále ke snížení a změně způsobu větvení amylopektinu a také ke změně poměru amylózy ku amylopektinu, což se poté projeví u jejich bramborového škrobu.
-5CZ 298540 B6
Antisence konstrukt pro škrobový větvicí enzym II byl také použit v kombinaci s antisence konstrukty pro škrobový větvicí enzym I, pro škrobsyntázu II vázanou na granule, pro rozpustnou bramborovou škrobsyntázu II a III, pro škrobový D-enzym a pro enzym způsobující snížené větvení (debranching enzyme) bramborového škrobu. Tyto konstrukty byly vytvořeny s cílem transformovat brambory a změnit stupeň větvení amylopektinu a poměr amylózy ku amylopektinu. To poskytne novou a hodnotnou surovinu pro procesy v průmyslu škrobu.
Kompletní sekvence cDNA kódující tento enzym jev odlišných konstruktech klonována v „sence“ orientaci pod jedním či více promotory výše uvedenými. Tyto konstrukty jsou přeneseny do vhodných transformačních vektorů popsaných výše a tyto jsou poté použity k transformaci brambor. Regenerované transformované brambory produkují nadbytek škrobového větvícího enzymu II v hlízách, což vede k zvýšenému stupni a změně větvení amylopektinu či inhibici transkripce endogenního škrobového větvícího enzynu II působením kosuprese. Výsledkem je poté snížení větvení amylopektinu.
Literatura
Můller-Róber, B., Kosmann, J., (1994) Approaches to influence starch quantity and starch quality in transgenic plantss. Plant Cell environm. 17, 601-613.
Martin, C., Smith, A. (1995) Starch Biosynnthesis. Plant. Cell 7, 971-985
Laemmli, U.K. (1979) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nátuře 227, 680-685.
Logemann, J., Schell, J. and Willmitzer, L. (1987). Improver method for the isolation of RNA from planttissues. Anal. Biochem. 163, 16-20
Rosenfeld, J., Capdeville, J. Guillemont, J.C. Ferrara, P. (1992). In-gel digestion of proteins for intemal sequence analysis afiter one - or two - dimension gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, 173-179.
Visser, R.G.F., Jacobsen, E. (1993) Towards modifying plants for altered starch content and composition. TibTech 11, 63-68
-6CZ 298540 B6
SEQIDNo: 1
Sekvenovaná molekula: cDNA
Jméno: bell (branching enzyme II - větvicí enzym) ze Solanum tuberosum (brambor)
Délka sekvence: 3074 bp
MACCTCCTC, CACTCACTCT TTGTTTCICT CTCTCTTCAC GCTTCTCTTG GCGCCTTGAA 60 CTCACTAATT TGACACTCAG TTAGTTACAC THCCATCACT TATCAGATCT CTATTTTTTC 120 TCTTAMTCC AACCAAGGAA TGAATAAAAA GATAGATTIG TAAAAACCCT AAGGAGAGAA 1B0 GJAGAAAG ASG CTG TAT ACA CTC TCT GGA GIT CCT TTT CCT ACT GTT CCA 230
Met Val Tyx Thr-Leu Ser Gly Val Axg Phe Pro Thr Val Pro
-45 -40-35
TCA GTG TAC AAA TCT AAT GGA TTC ACT AGT AAT GGT GAT CGG AGG AAT278
Ser Val Tyr Lys Ser Asn Gly Phe Ser Ser Asn Gly Asp Arg Arg Asn
-30 -25-20
GCT AAT KTT TCT CTA TTC TTG AAA AAG CAC TCT CTT TCA CGG AAG ATC326
Ala Aaa Xaa Ser Val Phe Leu Lys lys His Ser Leu Ses Arg LysIle
-15 -10—S
TTG GCT GAA AAG TCT TCT TAC AAT TCC GAA TCC CGA CCT TCT ACA GTT374
Leu Ala Glu Lys Ser Ser Tyr Asn Ser Glu Ser Arg Pro Ser ThrVal
1510
GCA GCA TCG GGG AAA GTC CTT GTG CCT GGA ACC CAG ACT GAT AGC TCC422
Ala Ala Ser Gly lys Val Leu Val Pro Gly Thr Gin Ser Asp SerSex
20 25 ’30
TCA TCC TCA ACA GAC CAA TTT GAG TTC ACT GAG ACA TCT CCA GAA AAT470
Ser Ser Ser Thr Asp Gin Phe Glu Phe Thr Glu Thr Sex Pro Glu Asn
4045
TCC CCA GCA TCA ACT GAT GTA GAT AGT TCA ACA ATG GAA CAC GCT ACT518
Ser Pro Ala Ser Thr Asp Val Asp Ser Ser Thr Met Glu His Ala Ser
5560
CAG ATT AAA ACT GAG AAC GAT GAC GTT GAG CCG TCA AGT GAT CTT ACA566
Gin Ile Lys Thr Glu Asn Asp Asp Val Glu Pro Ser Ser Asp LeuThr
7075
GGA AGT CTT GAA GAG CTG GAT TTT GCT TCA TCA CTA CAA CIA CAA GAA614
Gly Sex Val Glu Glu Leu Asp Phe Ala Ser Sex Leu Gin Leu GinGlu
8590
GCT GGT AAA CTG GAG GAG TCT AAA ACA TTA AAT ACT TCT GAA GAG ACA662
Gly Gly Lys Leu Glu Glu Sex Lys Thr Leu Asn Thr Sex Glu Glu Thr
100 10511Ó
ATT ACT GAT GAA TCT GAT AGG ATC AGA GAG AGG GCT ATC CCT CCA CCT710
Ile Ile Asp Glu Ser Asp Axg Ile Arg Glu Arg Gly Ile Pro Pro Pro
115 120125
GGA CTT GGT CAG AN3 ATT TAT GAA ATA GAC CCC CTT TTG ACA AAC TAT758
Gly Leu Gly Gin Lys Ile Tyr Glu Ile Asp Pro Leu Leu Thr Asn Tyr
130 135140
CCT CAA CAC CTT GAT TAC AGG TAT TCA CAG TAC AAG AAA CTG AGG GAG806
Axg Gin Sis Leu Asp Tyr Arg Tyr Ser Gin Tyr Lys Lye Leu Arg Glu
145 150155
-7CZ 298540 B6
GCA ACT GAC AAG TAT GAG GGT GGT CTG GAA GCT TTT TCT CGT GCT TAT
Ala XI· Asp Ly* Tyr Glu Gly Gly Leu Glu Ala Ph« Ser Arg Gly Tyr 160 16S170
GAA AAA ATG GCT TTC ACT CGT AGT GCT ACA GGT ATC ACT TAC CGT GAG Glu Lys Met Gly Phe Thr Arg Ser Al* Thr Gly Ile Thr Tyr Arg Glu 175 180 185 190
TGG GCT CCT GCT GCC CAG TCA GCT GCC CTG ATT GGA GAT TTC. AAC AAT Trp Ala Pro Gly Ala Gin Ser Ala Ala Leu Xle Gly Asp Phe Asn Asn 195 200205
TGG GAC GCA AAT GCT GAC ATT Trp Asp Ala Asn Ala Asp Xle 210
ATG ACT CGG AAT GAA TTT GGT GTC TGG Met Thr Arg Asn Glu Phe Gly Val Trp 215220
GAG ACT TCT CTG CCA Αλί AAT GTG GAT GGT TCT CCT GCA ATT CCT CAT Glu Ile Phe Leu Pro Asn Asn Val Asp Gly Ser Pro Ala Xle Pro Bis 225 230235
B54
902
950
998
1048
GGG TCC AGA CTG AAG ATA CGT ATG GAC ACT CCA TCA GCT GCT AAG GAT 1094
Gly Ser Arg Val Lys Ile Arg Met Asp Th* Pro Ser Gly Val Lys Asp
240 245 250
TCC ACT CCT GCT TGG ATC AAC CAC TCT CTA CAG CCT CCT GAT GAA ATT 1142
Ser Ile Pro Ala Trp Ile Asn Tyr Ser Leu Gin Leu Pro Asp Glu Xle
255 260 26S 270
CCA TAT AAT GGA ATA “AT TAT GAT CCA CCC GAA GAG GAG AGG TAT ATC 1190
Prc Tyr Asn Gly Ile Tyr Tyr Asp Pru Pro Glu Glu Glu Arg Tyr Ile
275 280 285
TTC CAA CAC CCA CTG CCA AAG AAA CCA AAG TCG CTG AGA ATA TAT GAA 1238
Phe Gin His Pro Arg Pro Lys lys Pra Lys Ser Leu Arg Zle Tys Glu
290 295 300
TCT CAT ACT GGA ATG AGT AGT COS GAG CCT AAA ACT AAC TCA TAC CTG 1286
Ser His Ile Gly Met Ser Ser Pra Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Val
305 310 315
AAT CTT AGA GAT GAA GCT CCT CCT CGC
Asn Dhe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg
320 325
CTG CTG CAA ATT ATG GCT ACT CAA GAG
Ala Val Gin Ile Mat Ala Ile Gin G1U
335 340
GGT TAT CAT GTC ACA AAT TCT CTN GCA
Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Xaa Al*
1478
CCC GAC GAC CTT AAG TCT CTG ATT GAT AAA GCT CAT GAG CIA GGA ACT
Pro Asp Asp Leu Ly* Ser Leu Xle Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Ile
370 375380
GCT GTT CTC ATG GAC ACT GCT CAC AGC CAT GCA TCA AAT AAT ACT TTA 1526
Vil Val Τ.Λ·· yah As? Tle Val His Sas His Ala ?rr. A Líc
335 39C 35«
GAT GCA CTG AAC ATG CTT GAC GGC ACA GAT AGT TCT TAC TCT CAC TCT 1574
Asp Gly Leu Asn Mat Phe Aap Gly Thr Asp Ses Cys Tyr Phe His Se:
400 403 410
-8CZ 298540 B6
1622
450
TGG ATG TGG GAT TCC CGC CTC TTT AAC TAX
Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyž
425 430
AGG TAT CTT CTC TCA AAT GCG AGA TGG TGG
Arg Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Arg Txp Txp
440 445
GAT GGA ΓΣΤ AGA TTT GAT GGT GTC ACA TCA
Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser
455 460
1670
1718
ATG ATG TAT ACT CAC
Met Mst Tyr Thr His
465
CAC GGA TTA TCG CTG
His Gly Leu Ser Val
470
GGA TTC ACT GGG AAC TAC
Gly Phe Thr Gly Asn Tyr
475
1766
GAG GAA TAC TTT GGA CTC GCA ACT GAT GIG GAT GCT GIT GTG TAT CTG
Glu Glu Tyr Phe Gly Leu Ala Thr Asp Val Asp Al* Val Val Tyr Leu 480 485490
1814
ATG CTG GTC AAC GAT CTT ATT CAT GGG CTT TTC CCA GAT GCA ATT ACC1862
Met Leu Val Asn Asp Leu Ile Hia Gly Leu Phe Pro Asp ALa II*Thr
495 500 505510
ATT GGT GAA GAT GIT AGC GGA ATG CCG ACA TTT TNT ATT CCC GIT CAA1910
Ile Gly Glu Asp Val Bar Gly Met Pro Thr Phe Xaa Ile Pro ValGin
515 520525
GAT GGG GGT GTT GGC TTT 'GAG TAT CGG CTC CAT ATG GCA ATT GCT GAT 1959
Asp Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu Eis Met Ala Ile Ala Asp
530 535 540
AAA TGG ATT GAG TTG CTC AAG AAA CGG GAT GAG GAT TGG AGA GTG GGT 2006
xya Txp 11« Glu Zeu Leu ty» Lys Arg Asp G1U Asp Trp Arg Val Gly
545 550 553
GAT ATT GTT CAT ACA CTG ACA AAT AGA AGA TGG TCG GAA AAG TGT GTT 2054
Asp Zle Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Txp Ses Glu Lys cys Val
560 565 570
TCA TAC GCT GAA ACT CAT GAT CAA GCT CTA GTC GGT GAT AAA ACT ΑΤΆ 2102
Ser Tyr Al* Glu Ser His Asp Gin Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile
SIS 580 S8S 590
GCA TTC TGG CTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TCT ATG GCT CTG GAT2150
Ala Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met, Ala Leu Ásp
595 600605
AGA COi TCA ACA TCA TTA AZA GAT CGT GGG ΑΤΆ GCA TTG CAC AAG ATG2198 ňsg Pro Ser Thr Ser Leu Xle Asp Arg Gly Zle Ala Leu His Lys Met
610 613620
ATT AGG CIT GTA ACT ATG GGA ΠΆ GGA GGA GAA GGG IAC CIA AAT TTC2246
Ile Ásg Leu Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe
625 63063S
ATG GGA AAT GAA TTC GGC CAC CCT GAG TGG ATT GAT TTC CCT AGG GCT2294
Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Zle Asp Phe Pra Arg Ala
410 Lii íí:
GAA CAA CAC CTC TCT GAT GGC TCA GTA ATT CCC GGA AAC CAA TTC AGT Glu Gin His Leu Ser Asp Gly Ser Val Ile Pro Gly Asn Gin Phe Ses 655 660 665 670
2342
-9CZ 298540 B6
IAT GAT ASA TGC AGA CGG AGA TTT GAC CTC GGA GAT GGA GAA TAT TTA2390
Tyx Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu GXy Asp Ala Glu Tyr Leu «75 «80«85
AGA TAC CGT GGG ITO CAA GAA TCT GAC CGG GCT ATG CAG TAT CTT GAA2438
Arg Tyr Arg Gly Leu Gin Glu Phe Asp Arg Ala Met Gin Tyr LeuGlu
690 695700
CST AAA TAT GAG TTT ATC ACT TCA GAA CAC CAG TTC ASA TCA CGA AAG2486
Asp Lys Tyr Glu Phe Met Thr Ser Glu His Gin Phe II· Ser ArgLys
105 710715
GAT GAA GGA GAT tóG ATC ATT GTA TTT GAA AAA GGA AAG CLA GTT TTT2534
Asp Glu Gly Asp Arg Met Xle Val Phe Glu Lys Gly Asn Leu Val Phe
720 725730
GTC TTT AAT TTT CAC TGG ACA AAA AGC ΤΚΓ TCA GAC TAT CGC ΛΪΑ GGC2582
Val Phe Asn Phe His Trp Thr Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Arg Ile Gly
735 740 745750
TGC CTG AAG CCT GGA AAA TAC AAG GTT GCC TTG GAC TCA GAT GAT CCA2630
Cys Leu Lya Pro Gly Lys Tyr Lys Val Ala Leu Asp Ser Asp AspPro
755 760765
CTT TTT GGT GGC TTC GGG AGA ATT GAT CAT AAT GCC GAA TAX TTC ACC2678
Leu Phe Gly Gly Phe Gly Arg Ile As? His Asn Ala Glu Tyr PheThr
770 775780
TTT GAA GGA TGG TAT GAT GAT CGT CCT CGT TCA ATT ATG GTC TAT GCA2721
Phe Glu Gly Trp Tyr Asp Asp Arg Pro Arg Ser Ile Met Val TyrAla
785 790795
OCT AGT AGA ACA GCA GTC GTC TAT GCA CIA GTA GAC AAA GAA GAA GAA2774
Pro Ser Arg Thr Ala Val Val Tyr Ala Leu Val Asp Lys Glu GluGlu
800 805810
GAA GAA GAA GAA GTA GCA GTA GTA C5& GAA GTA GTA GTA GAA GAA GAA2822
Glu Glu Glu Glu Val Ala Val Val Glu Glu Val Val Val Glu GluGlu
815 820 82S830
TCA ACGAA CTTGTGKTCG CGTTGAAAGA TTTCAAGGCT ACATAGAGCT TCTTGACGTA 2880 *«»
TCIGGOASA TTGCATCAGT CTTGGCGGAA TTTCATGTGA CAAAAGGTTT GCAATTCTCT 2940 CCACTATTAG TAGTGCAACG ATATACGCAG AGATGAAGTG CTGCACAAAC ATATGTAAAA 3000
TCGATGAATT TATGTCGAAT GCTGGGACGG GCTTCAGCAG GTTTTGCTTA GTGAGTTCTC 3060
TMATTGTCA TCTC 3074
- 10CZ 298540 B6
SEQ ID No: 2
Sekvenovaná molekula: cDNA
Jméno: fragment genu bell (branching enzyme II - větvicí enzym) ze Solanum tuberosum (bram5 bor)
Délka sekvence: 1393 bp
T CTG CCA. AAT AAT GTG GAT GGT TCT CCT GCA ATT CCT CAT GGG TCC AGA Leu Pro Asn Asn Val Asp Gly Sex Pro Ala Ile Pro His Gly Ser Arg 15 10
GTG AAG ATA CGT ATG GAC ACT CCA TCA GOT GTT AAG GAT TCC ATT CCT 97
Val Lys Ile Arg Met Asp Ttar Pro Sex Gly Val Lys Asp Sex Ile Pro
20 25 30
GCT TGG ATC AAC TAC TCT TTA CAG CTT CCT GAT GAA ATT CCA TAT AAT 145
Ala Trp Ile Asn syx Ser Leu Gin Leu Pro Asp Glu η» Pro Tyr Asn
35 40 45
GGA ATA TAT TAT GAT CCA ΌΧ. GAA GAG GAG AGC TAT ATC TTC CAA CAC 193
Gly 11« Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Arg Tyr Ile Phe Gin His
50 55 60
CCA CTC CCA AAG AAA CCA AAG TCG CTG AGA ATA TAT GAA TCT CAT ATT 241
Pro Arg Pro Lys Lys Pro Lya Sex Leu Arg Ile Tyr Glu Ser His Ile
65 70 75 80
GGA ATG AGT ACT CCG GAG CCT AAA ATT AAC TCA TAC GTG AAT TTT AGA 289
Gly Met ser Pro G1U Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Val Asn Phe Axg
85 90 95
GAT GAA GTT crr CCT CGC ATA AAA AAG CTT GGG TAC AAT GCG GTG CAA 337
Asp Glu Val Leu Pra Axg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gin
1Q0 105 110
ATT ATG GCT ATT CAA GAG CAT TCT TAT TAT GCT ACT TTT GCT TAT CAT 385
Ile Met Ala Ile Gin Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr His
115 120 125
CTC ACA AAT TTT TTN GCA CCA AGC AGC CGT TTT GGA ACŘ CCC GAC GAC 433
Val Thr Asn Phe Xaa Ala Pro Ser Sex Axg Phe Gly Thr Pro Asp Asp
130 135 140
CIT AAG TCT TTG AIT GAT AAA GCT CAT GAG CTA GGA ATT GIT GIT CTC 481
Leu Lys Ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Ile Val Val Leu
145 150 155 160
ATG GAC ATT GTT CAC AGC CAT GCA TCA AAT AAT ACT TTA GAT GGA CTG 529
Met Asp Ile Val His Ser His Ala Ser Asn Asn Thr Leu Asp Gly Leu
165 170 175
AAC ATG TTT GAC GGC ACA GAT ACT
Asn Met. Ph® Asp Gly Thr Asp Ser
180
TGT
Cys
185
TAC Tyr
TTT CAC TCT Ph* His
Ser
GGA GCT CGT Gly Ala Arg
190
577
CGC
GGT TAT CAT TGG ATG TGG GAT TCC
Gly Tyr His Trp Met Trp Asp Ser Arg
195 200
TTT AAC
CTC
Leu Pha Asn
TAT iyx 205
GGA AAC TGG
Gly Asn Trp
625
GOG AGA TTC TCG TTC GAT GAG
GAG CTA CTT AGG TAT CTT CTC TCA AAT
Glu Val Leu Arg Tyr Leu Lau Ser Aan Ala Arg Trp Trp Leu Asp Glu 210 215 220
673
- 11 CZ 298540 B6
TTC AAA TTT GAT GGA TTT AGA TTT GAT GCT GTG ACA TCA ATG ATG TAT
Phe Ly* Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr
225 230 235240
ACT CAC CAC GGA CTA TCG GTG GGA TTC ACT GGG AAC TAC GAG GAATAC
Thr His His Gly Leu Ser Val Gly Phe Thr Gly Asn Tyr Glu GluTyr
245 250255
TTT GGA CTC GCA ACT GAT GTG GAT GCT GTT GTG TAT CTG ATG CTGGTC
Phe Gly Leu Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met LeuVal
260 265270
AAC GAT CIT ACT CAT GGG 'CIT TTC CCA GAT GCA ACT ACC ACT GCT GAA
Asn Asp Leu Ile Hi· Pile P-° Asp Ala Zle Thr Tle GlyGlu
275 2S0285
GAT GTT AGC GGA ATG CCG ACA CTT CTT ACT CCC GTT CAA GAT GGG GGT
Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Xaa Ile Pro Val Gin Asp Gly Gly
290 295300
CTT GGC TTT GAC TAT CGG CTG CAT ATG GCA ACT GCT GAT AAA TGG ACT
Val Gly 305 Phe Asp Tyr Arg Leu His 310 Met Ala Ile Ala Asp Lys Trp Ile
315 320
GAG CTG CTC AAG AAA CGG GAT GAG GAT TGG AGA CTG GCT GAT ACT GCT
Glu Leu Leu Lys Lys Arg Asp Glu Asp Trp Arg Val Gly Asp Ile Val
325 330 335
CAT ACA CTG ACA AAT AGA ACA TGG TCG GAA AAG TCT CTT TCA TAC GCT
His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Val Ser Tyr Ala
340 345 350
GAA ACT CAT GAT CAA GCT CTA CTC GCT GAX AAA ACT ATA GCA TTC TGG
Glu Ser His Asp Gin Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Zla Ala Phe Trp
355 360 365
CTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT CTI ATG GCT CTG GAT AGA CCT TCA
Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ses
370 375 390
ACA TCA TTA ATA GAT CCT GGG ATA GCA TTG CAC AAG ATG ACT AGG CTT
Thr Ser Leu Tle Asp Arg Gly Zle Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu
3Θ3 390 395 400
CTA ACT ATG GGA TTA GGA GGA GAA GGG TAC CTA AAT CTC ATG GGA AAT
Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyt Leu Asn Phe Met Gly Asn
405 410 415
GAA TTC GGC CAC CCT GAG TGG ACT GAT TTC CCT AGG GCT GAA CAA CAC Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Ala Glu Gin His 420 425430
CTC TCT GAT GGC TCA CTA ACT CCC GGA AAC CAA CTC ACT TAT GATAAA
Leu Sex Asp Gly Ses Val lla Pro Gly Asn Gin Phe Ser Tyr AspLys
435 440445
TGC AGA CGG AGA TCT GAC CTG GGA GAT GCA GAA TAT TTA AGA TAC CGT
Cys Arg Arg Arg Pha Asp Leu Gly Asp Ala. Glu Tyr Leu Arg Tyr Arg
45C 435 4íí
721
763
812
865
913
961
1019
1057
1105
1153
1201
1249
1297
1345
1393
- 12CZ 298540 B6
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (15)

1. Aminokyselinová sekvence větvícího enzymu škrobu bramboru II (SBE II) obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 1.
2. Izolovaná sekvence DNA kódující větvicí enzym škrobu bramboru II (SBE II), jehož aminokyselinová sekvence je definována v nároku 1, zahrnující nukleotidovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 1 a její varianty vzniklé degenerací genetického kódu.
3. Fragment izolované sekvence DNA podle nároku 2, který kóduje větvicí enzym škrobu bramboru II (SBE II), jehož aminokyselinová sekvence je definována v nároku 1.
4. Fragment podle nároku 3 obsahující nukleotidovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID No. 2.
5. Vektor obsahující celou nebo funkční aktivní část izolované sekvence DNA podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4 a regulační prvky aktivní v bramboru.
6. Vektor podle nároku 5, ve kterém je sekvence DNA v obrácené orientaci vůči promotoru bezprostředně jí předcházejícímu.
7. Způsob produkce transgenního bramboru s buď zvýšeným nebo sníženým stupněm větvení amylopektinového škrobu, vyznačující se tím, že se a) vektor podle nároku 5 přenáší a vnáší do genornu buňky bramboru a potom se b) z transformovaných buněk regenerují intaktní celé rostliny.
8. Způsob produkce transgenního bramboru se sníženým stupněm větvení amylopektinového škrobu, vyznačující se tím, že se a) vektor podle nároku 6 přenáší a vnáší do genornu buňky bramboru a potom se b) z transformovaných buněk regenerují intaktní celé rostliny.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že vektor obsahuje také antisence konstrukt větvícího enzymu škrobu bramboru I (SBE I).
10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznač u j í cí se t í m , že vektor obsahuje také antisense konstrukt granulově vázané syntetázy škrobu bramboru II.
11. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 8 až 10, vy z n a č uj í c í se tím, že vektor obsahuje také antisense konstrukt rozpustné syntetázy škrobu bramboru II a III.
12. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 8 až 11, vy z n a č uj í c í se tím, že vektor obsahuje také antisense konstrukt disproporcionačního enzymu škrobu bramboru (D-enzymu).
13. Způsob podle jednoho nebo více z nároků 8 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje také antisense konstrukt odvětvovacího enzymu škrobu bramboru.
14. Transgenní brambor připravitelný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 7 až 13.
15. Použití transgenního bramboru podle nároku 14 pro výrobu škrobu.
2 výkresy
- 13CZ 298540 B6
CZ0165698A 1995-11-29 1996-11-28 Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, zpusob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu CZ298540B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9504272A SE513208C2 (sv) 1995-11-29 1995-11-29 Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse
SE9601506A SE513209C2 (sv) 1995-11-29 1996-04-19 Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ165698A3 CZ165698A3 (cs) 1999-04-14
CZ298540B6 true CZ298540B6 (cs) 2007-10-31

Family

ID=26662437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0165698A CZ298540B6 (cs) 1995-11-29 1996-11-28 Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, zpusob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6169226B1 (cs)
EP (1) EP0863983A2 (cs)
JP (1) JP2000500978A (cs)
KR (1) KR100540824B1 (cs)
CN (1) CN1112443C (cs)
AU (1) AU7716596A (cs)
CA (1) CA2238948C (cs)
CZ (1) CZ298540B6 (cs)
HU (1) HU222651B1 (cs)
NO (1) NO982443L (cs)
PL (1) PL186381B1 (cs)
SE (1) SE513209C2 (cs)
SK (1) SK284999B6 (cs)
WO (1) WO1997020040A1 (cs)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT826061E (pt) 1995-05-05 2007-10-16 Brunob Ii Bv ''melhoramentos na composição de amido vegetal ou relacionados com o mesmo''
DE59611362D1 (de) 1995-09-19 2006-08-17 Bayer Bioscience Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte stärke synthetisieren, verfahren zu ihrer herstellung sowie modifizierte stärke
GB9623095D0 (en) * 1996-11-05 1997-01-08 Nat Starch Chem Invest Improvements in or relating to starch content of plants
NZ503137A (en) 1997-09-12 2000-10-27 Groupe Limagrain Pacific Pty L Sequence and promoters for starch branching enzyme I, starch branching enzyme II, soluble starch synthase I and starch debranching enzyme derived from Triticum tauschii to modulate gene expression
JP2002518015A (ja) 1998-06-15 2002-06-25 ナショナル スターチ アンド ケミカル インベストメント ホールディング コーポレイション 植物および植物製品の改良またはそれらに関する改良
DE19836098A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
AU779814B2 (en) * 1999-03-29 2005-02-10 Novozymes A/S Polypeptides having branching enzyme activity and nucleic acids encoding same
US7052697B1 (en) 1999-05-13 2006-05-30 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses
DE19937643A1 (de) * 1999-08-12 2001-02-22 Aventis Cropscience Gmbh Transgene Zellen und Pflanzen mit veränderter Aktivität des GBSSI- und des BE-Proteins
GB9921830D0 (en) * 1999-09-15 1999-11-17 Nat Starch Chem Invest Plants having reduced activity in two or more starch-modifying enzymes
AUPR138100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp
WO2002101059A2 (en) * 2001-06-12 2002-12-19 Bayer Cropscience Gmbh Transgenic plants synthesising high amylose starch
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
DE60331652D1 (de) 2002-07-09 2010-04-22 Basf Plant Science Gmbh Verwendung von mutierten ahas genen als selektionsmarker bei der kartoffeltransformation
EP1431393A1 (de) * 2002-12-19 2004-06-23 Bayer CropScience GmbH Pflanzen, die eine Stärke mit erhöhter Endviskosität synthetisieren
CA2505776C (en) * 2002-12-19 2013-04-02 Bayer Cropscience Gmbh Plant cells and plants which synthesize a starch with an increased final viscosity
WO2005001098A1 (en) 2003-06-30 2005-01-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived thereform
CN1938389A (zh) * 2004-03-31 2007-03-28 巴斯福植物科学有限公司 羟丙基化高直链淀粉含量马铃薯淀粉实现高抗油脂数的用途
JP2007530809A (ja) * 2004-04-01 2007-11-01 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー 織物用糸のためのサイジング剤としてのアミロースデンプン生成物
EP2421976B1 (en) 2009-04-22 2015-09-16 BASF Plant Science Company GmbH Whole seed specific promoter
CN104017829A (zh) * 2011-12-06 2014-09-03 中国科学院上海生命科学研究院 提高植物直链淀粉含量的方法
DE202012104218U1 (de) 2012-11-02 2014-02-06 Emsland-Stärke GmbH Pflanzliches Nahrungsmittelprodukt
DE102014107610A1 (de) 2014-05-28 2015-12-03 Emsland-Stärke GmbH Verwendung eines Nahrungsmittelprodukts aus stärkehaltigen Pflanzenteilen
CN110760532B (zh) * 2019-11-18 2022-08-12 南京农业大学 一种淀粉分支酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用
CN112391365B (zh) * 2020-11-30 2022-04-15 江南大学 一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用
CN113151318B (zh) * 2021-03-17 2022-08-16 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草淀粉分支酶基因NtGBE1及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE467160B (sv) * 1990-12-21 1992-06-01 Amylogene Hb Genetisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylostyp
WO1992014827A1 (en) * 1991-02-13 1992-09-03 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Plasmids containing dna-sequences that cause changes in the carbohydrate concentration and the carbohydrate composition in plants, as well as plant cells and plants containing these plasmids
WO1995004826A1 (en) * 1993-08-09 1995-02-16 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE467358B (sv) 1990-12-21 1992-07-06 Amylogene Hb Genteknisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylopektintyp
WO1995007355A1 (en) 1993-09-09 1995-03-16 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Combination of dna sequences which enable the formation of modified starch in plant cells and plants, processes for the production of these plants and the modified starch obtainable therefrom
PT826061E (pt) 1995-05-05 2007-10-16 Brunob Ii Bv ''melhoramentos na composição de amido vegetal ou relacionados com o mesmo''

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE467160B (sv) * 1990-12-21 1992-06-01 Amylogene Hb Genetisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylostyp
WO1992014827A1 (en) * 1991-02-13 1992-09-03 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Plasmids containing dna-sequences that cause changes in the carbohydrate concentration and the carbohydrate composition in plants, as well as plant cells and plants containing these plasmids
WO1995004826A1 (en) * 1993-08-09 1995-02-16 Institut Für Genbiologische Forschung Berlin Gmbh Debranching enzymes and dna sequences coding them, suitable for changing the degree of branching of amylopectin starch in plants

Also Published As

Publication number Publication date
EP0863983A2 (en) 1998-09-16
SE9601506D0 (sv) 1996-04-19
SE9601506L (sv) 1997-05-30
US20030046730A1 (en) 2003-03-06
NO982443D0 (no) 1998-05-28
CN1207125A (zh) 1999-02-03
PL326975A1 (en) 1998-11-09
WO1997020040A1 (en) 1997-06-05
AU7716596A (en) 1997-06-19
CA2238948A1 (en) 1997-06-05
PL186381B1 (pl) 2003-12-31
US6469231B1 (en) 2002-10-22
CZ165698A3 (cs) 1999-04-14
JP2000500978A (ja) 2000-02-02
HUP9901306A3 (en) 2001-11-28
HUP9901306A1 (hu) 1999-07-28
HU222651B1 (hu) 2003-09-29
US6169226B1 (en) 2001-01-02
KR100540824B1 (ko) 2006-05-26
NO982443L (no) 1998-07-24
SE513209C2 (sv) 2000-07-31
CA2238948C (en) 2008-11-18
SK284999B6 (sk) 2006-04-06
SK72698A3 (en) 1999-06-11
CN1112443C (zh) 2003-06-25
KR19990071752A (ko) 1999-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ298540B6 (cs) Aminokyselinová sekvence, sekvence DNA a její fragmenty a vektory, transgenní brambor, zpusob jeho produkce a použití pro výrobu škrobu
AU713978B2 (en) DNA molecules that code for enzymes involved in starch synthesis,vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing these molecules
Jones et al. The UDP-glucose: p-hydroxymandelonitrile-O-glucosyltransferase that catalyzes the last step in synthesis of the cyanogenic glucoside dhurrin in Sorghum bicolor: isolation, cloning, heterologous expression, and substrate specificity
US6462256B1 (en) Nucleic acid molecules from wheat, transgenic plant cells and plants and the thereof for the production of modified starch
AU730900B2 (en) Improvements in or relating to starch content of plants
US6590141B1 (en) Nucleic acid molecules from plants encoding enzymes which participate in starch synthesis
CZ20001680A3 (cs) Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají fruktosyltransferázovou aktivitu, a způsoby přípravy inulinu s dlouhým řetězcem
PT1786908E (pt) Plantas com um aumento da actividade da enzima de fosforilação do amido r3 nos plastídeos
CA2272844A1 (en) Novel nucleic acid molecules from maize and their use for the production of modified starch
WO1997027303A1 (en) Alpha-1-6 fucosyltransferases
JPH06197756A (ja) 新規糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該酵素の製造方法
JPH10502521A (ja) 植物アラビノガラクタン蛋白質(agp)遺伝子
WO1995011979A1 (en) Dna coding for carbonic anhydrase
ES2283412T3 (es) La mananasa del cafe.
JP3054687B2 (ja) L−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子
AU2002314061B2 (en) DNA molecules that code for enzymes involved in starch synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules
JPH0638770A (ja) システイン合成酵素をコードする遺伝子
AU725197B2 (en) Nucleic acid molecules encoding soluble starch synthases from maize
SE513208C2 (sv) Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse
JPH06245773A (ja) システイン合成酵素をコードする遺伝子
JP2000166562A (ja) ラフィノース合成酵素遺伝子
AU8967098A (en) Regulation of gene expression in plants

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20101128