ES2268362T3

ES2268362T3 - Metodo para purificacion de albumina.

Info

Publication number: ES2268362T3
Application number: ES03725953T
Authority: ES
Inventors: Makonnen Amersham Biosciences AB BELEW; Mei Yan North China Pharmaceutical Group Corp LI; Wei North China Pharmaceutical Group Corp. ZHANG
Original assignee: North China Pharmaceutical Group; NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP Corp; GE Healthcare Bio Sciences Corp
Current assignee: North China Pharmaceutical Group; NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP Corp; Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 2002-05-15
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2023-05-09
Also published as: CN100463921C; US20050215765A1; DE60307262T2; JP2006512283A; SE526227C2; SE0201518D0; WO2003097693A1; IL164844A; IL164844A0; JP2006502098A; US7351801B2; CA2483616A1; CA2483612A1; BR0309992A; BRPI0309992B1; US20050214902A1; BRPI0309992B8; AU2003232704A1; AU2003228193A1; DE60307262D1

Abstract

Un método para purificar seroalbúmina humana recombinante (HSAr) a partir de una solución, comprendiendo el método someter al sobrenadante de un cultivo celular (CCS) que comprende HSAr a las siguientes etapas cromatográficas: (a) intercambio catiónico en una matriz bimodal tolerante a altas concentraciones salinas, en la que cada ligando comprende dos grupos capaces de interaccionar con la sustancia a aislar; (b) cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y (c) intercambio aniónico.

Description

Método para la purificación de albúmina.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la purificación de proteínas, y especialmente a la purificación de seroalbúmina humana. El método utiliza una serie de etapas cromatográficas, que producen una purificación eficaz adecuada para su uso en operaciones a gran escala.

Antecedentes

La seroalbúmina humana (HSA) es la proteína más abundante presente en el plasma sanguíneo, en el que su papel es contribuir al mantenimiento de la presión osmótica y unirse a nutrientes y metabolitos, para de este modo posibilitar el transporte de los mismos. Existe un gran interés científico y farmacéutico en la HSA, por ejemplo como un fármaco para tratar la hipoalbuminemia causada por una pérdida de albúmina o una reducción en la síntesis de albúmina, en shocks hemorrágicos, etc. En los primeros métodos disponibles, la HSA se purificaba a partir de la sangre. Sin embargo, tales métodos provocaban problemas, por ejemplo un suministro de sangre esporádico, desventajas económicas y contaminación con sustancias indeseables tales como el virus de la hepatitis y nada menos que el virus del SIDA. Para evitar estos problemas, se han desarrollado recientemente métodos alternativos basados en técnicas de ADN recombinante para producir HSA recombinante (HSAr). Incluso aunque se han sugerido varios métodos recombinantes, se ha demostrado que la purificación de la HSAr a partir del caldo de fermentación es una etapa crucial y existe una necesidad en curso de mejoras para este fin.

El documento EP 0 612 761 describe un método para producir seroalbúmina humana recombinante de alta pureza, que no contiene contaminantes libres no antigénicos. El método utiliza la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en condiciones especificadas combinada con otras etapas tales como cromatografía de intercambio iónico, tratamiento con ácido bórico o una sal del mismo seguido por ultrafiltración y tratamiento con calor. Sin embargo, una serie de tantas etapas es todavía demasiado compleja y consiguientemente demasiado cara para un uso satisfactorio en operaciones a gran escala en la industria.

El documento EP 0 570 916 también describe un proceso para producir seroalbúmina humana recombinante por técnicas de manipulación genética, en el que la purificación es por una combinación de etapas en las que el sobrenadante de un cultivo se somete a ultrafiltración, tratamiento con calor, tratamiento con ácido y otra ultrafiltración, seguido por tratamientos posteriores con un intercambiador catiónico, un vehículo de cromatografía hidrófoba y un intercambiador aniónico y precipitación por salado. Sin embargo, de forma similar a la patente mencionada anteriormente, este esquema de purificación es demasiado complejo, consume mucho tiempo y consiguientemente es demasiado caro para proporcionar un procedimiento eficaz para su uso en operaciones a gran escala.

El documento EP 0 699 687 describe un método de purificación de HSAr en el que el medio de cultivo se trata con calor para inactivar las proteasas y después se pone en contacto con un lecho fluidizado de partículas de intercambio catiónico. El eluyente puede someterse posteriormente a ultrafiltración, HIC y cromatografía de intercambio aniónico. Sin embargo, el uso de un lecho fluidizado requerirá un equipamiento diferente a la etapa cromatográfica convencional de lecho compactado. Por consiguiente, existe todavía una necesidad de procedimientos más eficaces y económicamente atractivos para la purificación de HSAr a partir de un caldo de cultivo.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método de purificación de HSA recombinante que se adapte fácilmente a operaciones a gran escala. Esto se logra con un método que comprende someter al sobrenadante de un cultivo celular (CCS) que comprende HSAr a las siguientes etapas:

(a): cromatografía de intercambio catiónico en una matriz bimodal tolerante a alta salinidad, en la que cada ligando comprende dos grupos capaces de interactuar con la sustancia a aislar;

(b): cromatografía de interacción hidrófoba (HIC);

(c): cromatografía de intercambio aniónico.

El método de acuerdo con la invención comprende menos etapas de proceso que los métodos discutidos anteriormente. Además, la matriz bimodal de intercambio catiónico tolerante a alta salinidad usada en la etapa (a) permite el uso de un sobrenadante de un cultivo celular sin ninguna dilución más, lo que es una característica ventajosa ya que reduce enormemente el volumen total y por lo tanto los costes comparado con los métodos de la técnica ante-
rior.

Otro objetivo de la invención es mejorar la capacidad de adsorción de las etapas cromatográficas usadas en la purificación de HSAr. Esto se puede conseguir por el método descrito anteriormente en el cual se usa un intercambiador catiónico en la etapa (a), que comprende ligandos conocidos como ligandos de alta salinidad (HSL). Dichos ligandos son bimodales en el sentido de que comprenden al menos dos sitios que interaccionan con la sustancia a aislar, proporcionando uno una interacción cargada y proporcionando otro una interacción basada en enlaces de hidrógeno y/o interacción hidrófoba.

Otro objetivo de la invención es además disminuir el contenido en color, y más específicamente aumentar además la pureza del producto final. Esto puede lograrse por el uso del método descrito anteriormente, en el que se usa un intercambiador aniónico débil.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-D ilustra los posibles materiales de matriz adecuados para su uso en las diferentes etapas de intercambio catiónico, interacción hidrófoba y cromatografía de intercambio aniónico de acuerdo con la invención.

La Figura 2 muestra los resultados de la cromatografía de intercambio catiónico de acuerdo con la etapa (a) del método de acuerdo con la invención de un sobrenadante de cultivo celular no diluido (CCS). La fracción 2B contiene la HSAr.

La Figura 3 muestra los resultados de HIC de la fracción 2B de la Fig. 2. La HSAr se eluye en la fracción 3A.

La Figura 4 muestra los resultados de la cromatografía de intercambio aniónico de la fracción 3A de la Fig. 3. La HSAr purificada se eluye en la fracción 4B.

La Figura 5 muestra los análisis de electroforesis de las fracciones principales obtenidas usando el protocolo de purificación de tres etapas de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la presente invención es un método para purificar seroalbúmina humana recombinante (HSAr) a partir de una solución, comprendiendo el método someter un sobrenadante de un cultivo celular (CCS) que comprende HSAr a las siguientes etapas cromatográficas:

(a) intercambio catiónico en una matriz bimodal tolerante a alta salinidad;

(b) cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y

(c) intercambio aniónico.

En una realización específica del presente método, la conductividad del CCS está por encima de aproximadamente 10 mS/cm, tal como por encima de aproximadamente 15 y preferiblemente por encima de aproximadamente 20, por ejemplo aproximadamente 20-25, o más específicamente 25-30 mS/cm, cuando se aplica a la etapa (a), lo que es posible debido al tipo de intercambiador catiónico usado, que comprende ligandos del tipo conocido como ligandos de alta salinidad (HSL). Por consiguiente, una ventaja importante del método presente es que evita la necesidad de diluir el CCS, y de este modo permite el uso de volúmenes de muestra muy reducidos durante la etapa de intercambio catiónico comparado con los métodos descritos previamente para la purificación de HSAr.

El CCS puede ser cualquier caldo de fermentación del que preferiblemente se han eliminado las células, por ejemplo por centrifugación. Por consiguiente, el origen de la HSAr aislada de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier hospedador adecuado, tal como células microbianas, tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc, células de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, etc, o líneas celulares animales. En una realización ventajosa, la célula hospedadora es Pichia pastoris. Los métodos para producir una célula hospedadora recombinante y las condiciones para expresar una proteína tal como HSAr en su interior se conocen bien, véase por ejemplo el documento EP 0 612 761 descrito anteriormente para una referencia a diversas solicitudes de patente dentro de este campo.

El propósito principal de la etapa (a) es eliminar sustancias coloreadas de bajo peso molecular tales como pigmentos y que están cargadas de forma negativa. Por lo tanto, la etapa (a) utiliza un intercambiador catiónico, que comprende ligandos del tipo conocido como ligandos de alta salinidad (HSL). En este contexto, "alta salinidad" se refiere a la propiedad mencionada anteriormente de tolerancia a altas concentraciones de sales que es característica de esta clase de intercambiadores iónicos. Esta propiedad se proporciona por la naturaleza de los ligandos, que es bimodal en el sentido de que cada ligando comprende dos grupos capaces de interaccionar con la sustancia a aislar, en el caso presente la HSAr. El modo de unión principal lo proporciona un grupo de unión cargado, es decir, un grupo intercambiador iónico, de ahí la clasificación de las matrices del tipo HSL como intercambiadores iónicos. Un segundo modo de unión lo proporciona un grupo de unión secundario, que proporciona una interacción adicional con la sustancia a aislar. Normalmente, el grupo de unión secundario proporciona un enlace de hidrógeno o una interacción hidrófoba, pero se pueden prever otras interacciones, como se discutirán con más detalle a continuación. En este contexto, hay que indicar que el término "bimodal" se usa en este documento para definir que están implicados dos o más modos de unión, y por lo tanto no está limitado a sólo dos modos de unión. En la presente aplicación, se utilizan intercambiadores catiónicos del tipo HSL, y tales intercambiadores catiónicos se han descrito con detalle, véase por ejemplo el documento PCT/EPO1/08203 (Amersham Pharmacia Biotech AB). Sin embargo, a continuación seguirá una descripción general de los mismos.

El grupo de unión cargado presente en un ligando catiónico de alta salinidad (HSL) puede seleccionarse entre el grupo compuesto por sulfonato (-SO_{3}^{-}/-SO_{3}H), sulfato (-OSO_{3}^{-}/-OSO_{3}H), carboxilato (-COO^{-}/-COOH), fosfato (-OPO_{3}^{2-}/-OPO_{3}H^{-}/-OPO_{3}H_{2}) y fosfonato (-PO_{3}^{2-}/-PO_{3}^{-}H/-PO_{3}H_{2}). En una realización ventajosa, el intercambiador catiónico del tipo HSL es un intercambiador catiónico débil, es decir, intercambiadores catiónicos que tienen una pKa por encima de 3. En una realización alternativa, hay intercambiadores catiónicos fuertes que tienen una pKa por debajo de 3. Son ejemplos típicos de tales intercambiadores catiónicos débiles carboxilato (-COO^{-}/-COOH), fosfato (-OPO_{3}^{2-}/-OPO_{3}H^{-}/-OPO_{3}H_{2}) y fosfonato (-PO_{3}^{2-}/-PO_{3}^{-}H/-PO_{3}H_{2}).

El grupo de unión secundario comprende el menos un átomo de unión a hidrógeno, que se localiza a una distancia de 1-7 átomos del grupo intercambiador catiónico. Un átomo de unión a hidrógeno es un átomo capaz de participar en un enlace de hidrógeno (excepto el hidrógeno), véase Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973) página 42. El átomo de unión a hidrógeno se puede seleccionar entre el grupo que consiste en heteroátomos, tales como oxígenos (oxígeno de carbonilo, oxígeno de éter, oxígeno de éster, oxígeno de hidroxilo, oxígeno de sulfona, oxígeno de sulfona amida, oxígeno de sulfóxido, oxígeno de anillos aromáticos, etc), nitrógenos (nitrógeno de amida, nitrógeno de anillos aromáticos, etc), azufres (azufre de tioéter, azufre de anillos aromáticos, etc); y carbonos hibridados sp y sp^{2}; y grupos halógeno tales como flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor. El se-
gundo grupo de unión contiene típicamente átomos no cargados o átomos que se pueden cargar por un cambio de pH.

La estabilidad de los ligandos de intercambio catiónico usados en la etapa (a) puede definirse en términos generales como la capacidad de resistir al NaOH 0,1 ó 1 M en agua durante al menos 40 horas. Como ejemplos ilustrativos de estructuras químicas de ligandos adecuadas de los intercambiadores catiónicos útiles en la etapa (a) del presente método, véase el documento mencionado anteriormente PCT/EP01/08203. En una realización específica del presente método, la etapa (a) utiliza el ligando de intercambio catiónico HSL ilustrado en la Fig. 1A de la presente memoria descriptiva.

Definido en términos funcionales, el intercambiador catiónico usado en la etapa (a) del método presente es capaz de

(a) unirse a la HSAr por intercambio catiónico en un líquido acuoso de referencia a una fuerza iónica correspondiente a NaCl 0,3 M y,

(b) permitir una capacidad de rotura de la sustancia \geq 200%, tal como \geq 300% ó \geq 500% ó 1000% de la capacidad de rotura de la sustancia de un intercambiador catiónico de referencia que contiene grupos sulfopropilo -CH_{2}CH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-} a las fuerzas iónicas mostradas anteriormente.

El documento PCT/EP01/08203 describe un intercambiador iónico de referencia similar con más detalle. El nivel de ligandos de intercambio catiónico en los intercambiadores catiónicos usados en el método de la invención se selecciona normalmente en el intervalo de 1-4000 \mumol/ml de la matriz, tal como 2-500 \mumol/ de la matriz, con preferencia por 5-300 \mumol/ml de la matriz. Los intervalos posibles y preferidos se determinan, entre otras cosas, por la naturaleza de la matriz, de los ligandos, etc. Por lo tanto, el nivel de ligandos de intercambio catiónico está normalmente dentro del intervalo de 10-300 para matrices basadas en agarosa. Para matrices basadas en dextrano, el intervalo es típicamente 10-600 \mumol/ml de la matriz.

El documento PCT/EP01/08203 mencionado anteriormente comprende también un análisis extenso de materiales de matriz útiles para intercambiadores catiónicos del tipo HSL. En resumen, tales matrices pueden basarse en material orgánico o inorgánico. Preferiblemente, es hidrófilo y está en forma de un polímero, que es insoluble y más o menos hinchable en agua. Se incluyen en esta definición los polímeros hidrófobos que se han derivatizado para volverse hidrófilos. Son polímeros adecuados polímeros polihidroxi, por ejemplo, basados en polisacáridos tales como agarosa, dextrano, celulosa, almidón, pululano, etc. y polímeros completamente sintéticos tales como poliacrilamida, polimetacrilamida, poli(hidroxialquilvinil éteres), poli(hidroxialquil-acrilatos) y polimetacrilatos (por ejemplo poliglicidilmetacrilato), polivinilalcoholes y polímeros basados en estirenos y divinilbencenos, y copolímeros en los que se incluyen dos o más de los monómeros correspondientes a los polímeros mencionados anteriormente. Los polímeros que son solubles en agua pueden derivatizarse para convertirse en insolubles, por ejemplo por reticulación o por acoplamiento a un cuerpo insoluble por medio de adsorción o unión covalente. Pueden introducirse grupos hidrófilos en polímeros hidrófobos (por ejemplo en copolímeros de monovinilo y divinilbencenos) por polimerización de monómeros que muestran grupos que se pueden convertir en OH, o por hidrofilización del polímero final, por ejemplo por adsorción de compuestos adecuados, tales como polímeros hidrófilos. Un ejemplo ilustrativo de una matriz adecuada es Sepharose en perlas disponible en el mercado, que se basa en agarosa y está disponible en Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden. Son materiales inorgánicos adecuados para su uso como matrices de soporte la sílice, óxido de circonio, grafito, óxido de tántalo, etc.

El documento PCT/EP01/08203 mencionado anteriormente comprende una descripción extensa de la preparación de intercambiadores catiónicos del tipo HSL. También se da una evaluación de los métodos para inmovilizar en superficies compuestos que forman ligandos en Hermanson, G.T., Mallia, A.K. & Smith, P.K., (Eds), Immobilisation Affinity Ligand Techniques, Academic Press, INC, 1992.

Como se ha mencionado anteriormente, uno de los beneficios de los intercambiadores catiónicos del tipo HSL es que es posible ejecutar adsorción en la columna, es decir, la unión de la HSAr con el ligando a elevadas fuerzas iónicas comparado con lo que se ha hecho normalmente con intercambiadores catiónicos convencionales, por ejemplo el intercambiador de cationes sulfopropilo de referencia discutido anteriormente. La fuerza iónica exacta a usar durante la unión depende de la naturaleza de la proteína y el tipo y concentración de ligando en la matriz. Las fuerzas iónicas útiles se corresponden a menudo con concentraciones de NaCl (agua pura) \geq 0,1 M, tales como \geq 0,3 M o incluso \geq 0,5 M. La desorción puede realizarse, por ejemplo, aumentando la fuerza iónica y/o cambiando el pH. Las sales típicas a usar para cambiar la fuerza iónica se seleccionan entre amonio soluble o sales metálicas de fosfatos, sulfatos, etc, en particular sales de metales alcalinos y/o sales de metales alcalinotérreos. Las mismas sales pueden usarse también en las etapas de adsorción, pero a menudo a concentraciones inferiores.

En una realización del presente método, la cantidad de matriz de intercambio catiónico usada en la etapa (a) es aproximadamente la mitad de la cantidad de matriz HIC usada en la etapa (b). Por consiguiente, una ventaja de la presente invención es la excepcional capacidad de unión de la matriz bimodal de intercambio catiónico que permite una reducción en volumen y por lo tanto en los costes operacionales comparado con intercambiadores catiónicos convencionales. En presencia de una alta concentración salina, tal como una conductividad de aproximadamente 25-30 mS/cm, la adsorción de la SP Sepharose disponible en el mercado para la HSAr es aproximadamente de 2-4 mg/ml de gel compactado, mientras que la del prototipo de ligando de alta salinidad (Fig 1A) se ha demostrado que es de al menos 50 mg/ml. Por consiguiente, el uso del ligando bimodal de alta salinidad (HSL) simplifica y mejora claramente los procesos de purificación de forma significativa y reduce el coste de la operación a gran
escala.

Una realización del presente método comprende tratamiento con calor del CCS antes de la etapa (a). El calentamiento puede realizarse directamente, es decir, mientras las células hospedadoras están presentes todavía o después de la eliminación de las mismas, tal como por centrifugación, ultrafiltración o cualquier otro método adecuado. El calentamiento puede realizarse a 50-100ºC durante un periodo de tiempo de 1 minuto hasta varias horas, preferiblemente a 60-75ºC durante 20 minutos a 3 horas y más preferiblemente a aproximadamente 68ºC durante aproximadamente 30 minutos. El calentamiento se realiza convenientemente es un baño de agua equipado con termostato. En una realización, se añade un estabilizador antes del calentamiento, tal como caprilato sódico a un pH de aproximadamente 6,0. Se pueden utilizar otros estabilizadores, tales como acetiltriptófano, ácidos carboxílicos orgánicos, etc. Después del calentamiento, el pH del CCS se ajusta preferiblemente a un valor más bajo adecuado para la adsorción posterior en un intercambiador catiónico, tal como pH 4,5.

En otra realización del presente método, el producto de la etapa (a), es decir, la fracción unida a la columna que comprende la matriz de tipo HSL, se trata con calor antes de la etapa (b). Preferiblemente, se añade un agente reductor, tal como cisteína. Otros ejemplos de agentes reductores útiles incluyen mercaptoetanol, glutatión reducido, etc. El propósito de esto es facilitar la eliminación de sustancias coloreadas durante la etapa (b). Este tratamiento con calor se realiza en general como se ha descrito anteriormente, incluso aunque en la realización preferida se usa una temperatura ligeramente inferior tal como aproximadamente 60ºC durante un periodo de tiempo ligeramente más largo tal como aproximadamente 60 minutos.

Como se ha mencionado anteriormente, la etapa (b) del presente método utiliza una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). El propósito principal de la etapa (b) es eliminar productos de degradación proteolítica de HSAr, productos que son normalmente de un tamaño de aproximadamente 10-50 kDa. La HIC es un principio bien conocido en la técnica de la cromatografía, y proporciona una herramienta versátil para la separación en base a diferencias en la hidrofobicidad de superficie. Muchas biomoléculas que se consideran hidrófilas han mostrado que todavía exponen suficientes grupos hidrófobos para permitir una interacción con los ligandos hidrófobos pegados a la matriz cromatográfica. Ya se ha sugerido la HIC para la purificación de HSAr, véase por ejemplo el documento EP 0 699 687. Comparado con otros principios de separación bien conocidos, a saber la cromatografía en fase inversa, la HIC utiliza una densidad de ligando en la matriz mucho más baja. Este hecho promueve un mayor grado de selectividad, mientras que permite unas condiciones de elución moderadas para ayudar a preservar la actividad biológica de la proteína de interés. En el presente contexto, la etapa de HIC se usa para adsorber los productos de degradación proteolítica de HSAr mencionados anteriormente de HSAr, mientras que la HSAr de longitud completa se eluye en la fracción no unida. La interacción hidrófoba entre la HSAr y el ligando inmovilizado en la matriz se potencia con un pequeño aumento en la fuerza iónica de los tampones usados. Existen actualmente muchos materiales de separación disponibles en el mercado para la HIC, y la presente invención no está limitada a ninguna matriz y/o ligando específicos. Por lo tanto, en términos generales, la matriz usada en la etapa (b) puede basarse en un material orgánico o inorgánico. En el caso de materiales orgánicos, puede ser por ejemplo un polímero nativo, tal como agarosa, dextrano, celulosa, almidón, etc, o un polímero sintético, tal como divinilbenceno, estireno, etc. En el caso de materiales de matriz inorgánicos, la sílice es un material bien conocido y usado comúnmente. En una realización ventajosa, la matriz es agarosa reticulada, que está disponible en el mercado en varias compañías, tal como Sepharose™ de Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden). En una realización, la matriz de HIC usada en la etapa (b) muestra uno o más ligandos hidrófobos capaces de interaccionar con la HSAr, seleccionados entre el grupo que consiste en fenilo, butilo, tal como n-butilo, octilo, tal como n-octilo, etc, preferiblemente en una matriz de agarosa. Como alternativa, en una matriz de divinilbenceno, tal como Source™ de Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden) están presentes ligandos hidrófobos tales como éteres, isopropilo o fenilo. En la realización más preferida, se usan para la etapa (b) ligandos de fenilo en una matriz de agarosa reticulada. La matriz está compuesta preferiblemente por perlas porosas, que pueden tener un contenido en agua por encima de aproximadamente el 90%, preferiblemente aproximadamente el 94%. El tamaño de partículas promedio puede estar, por ejemplo, entre 10 y 150 \mum medido en una perla húmeda, preferiblemente por debajo de 100, tal como aproximadamente 90 \mum. La densidad del ligando en la matriz puede estar, por ejemplo, entre 20 y 60, tal como aproximadamente 40 \mumol/ml de gel. Como un ejemplo específico, la matriz usada es Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow de Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden). En este caso específico, la denotación Fast Flow se usa para una matriz cuyo reticulado se ha optimizado para dar características de flujo adaptadas al proceso con caudales típicos de 300-400 cm/h a través de un lecho de 15 cm de altura a una presión de 1 bar. Sin embargo, la persona especialista en este campo puede adaptar fácilmente tales parámetros del proceso dependiendo de la escala de la operación. Esta etapa puede realizarse a un pH de aproximadamente 4-8, tal como 6,5-7, y a una concentración de sal de aproximadamente 0,01 a 0,5 M, tal como de 0,05 a 0,2 M.

Como se ha mencionado también anteriormente, la etapa (c) del presente método utiliza un intercambiador aniónico, preferiblemente un intercambiador aniónico débil, para eliminar impurezas minoritarias de la etapa (b), y especialmente para eliminar compuestos no deseados, tales como pigmentos de bajo peso molecular. La invención no se limita al uso de ningún material intercambiador aniónico específico, siempre que muestre una cantidad suficiente de ligandos capaces de unirse a compuestos de carga negativa que son indeseables en el producto final de HSAr. La etapa cromatográfica de intercambio aniónico puede realizarse, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 5,0-8,0 y a una concentración de sales de 0,01 a 0,2 M para la eliminación de las impurezas. Con respecto al material de la matriz, puede ser de cualquier material orgánico o inorgánico, como se ha discutido anteriormente. En una realización preferida, la matriz comprende perlas porosas de agarosa reticulada, tal como Sepharose™ de Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden). Los ligandos pegados a ella son intercambiadores aniónicos débiles cuyo grupo de unión es por ejemplo una amina primaria o secundaria. Tal grupo de unión puede pegarse a la matriz, por ejemplo, por medio de una cadena alquilo con un grupo éter próximo a la matriz. La bibliografía describe muchas formas de pegar un grupo de unión a una matriz por medio de espaciadores, brazos, etc, y como se ha mencionado anteriormente la presente invención no se limita a ninguna estructura específica. En una realización ilustrativa, se usa una perla de agarosa que tiene ligandos de acuerdo con la siguiente fórmula -O-CH_{2}-CH_{2}-N^{+}(C_{2}H_{5})_{2}H, por ejemplo DEAE Sepharose™ de Amersham Biosciences. Esta realización producirá HSAr eluida de la columna en la fracción unida y no unida lo que, para algunas aplicaciones, es satisfactorio.

Sin embargo, una realización alternativa, que es más ventajosa en lo que se refiere a la pureza del producto final, usa una perla de agarosa que tiene ligandos que comprenden dos grupos éster, y preferiblemente también dos grupos hidroxilo. El grupo de unión es preferiblemente una amina primaria. La ventaja de esta realización es que la HSAr estará presente sólo en la fracción que se une moderadamente a la matriz, produciendo una pureza muy mejorada y comodidad operacional. En la Fig. 1 se presenta una fórmula general ilustrativa para esta última realización mencionada, sin embargo se entiende que la presente invención comprende también un método en el que se usan estructuras similares en la etapa (c).

Sin embargo, debe entenderse que la presente invención abarca el uso de matrices similares a la anterior, que se basan en la misma estructura de ligando general. También se entiende que la denotación "Gel" en la fórmula de la Fig 1A incluye cualquier matriz, como se ha discutido anteriormente en relación con la etapa (b). Un ejemplo disponible en el mercado de una matriz que comprende los ligandos descritos anteriormente es ButylSepharose™ (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). En los experimentos presentados a continuación, se usó un ligando con una densidad de 160 \mumoles/ml. Por consiguiente, parece ser que se pueden conseguir resultados especialmente ventajosos optimizando la densidad del ligando en la matriz. Parece ser también que cuando se usa el primer tipo de intercambiadores aniónicos mencionado, es decir, matrices del tipo DEAE, se requiere un volumen mayor, tal como aproximadamente tres veces el volumen, cuando se compara con el último medio de Butyl-Sepharose mencionado. Por consiguiente, la realización preferida del presente método utiliza una amina secundaria como grupo de intercambio aniónico durante la etapa (c) y una densidad de ligando de al menos aproximadamente 100 \mumoles/ml.

En una realización preferida, la densidad de ligando del intercambiador aniónico está en el intervalo de 50-300, tal como 100-200 y preferiblemente aproximadamente 160 \mumoles/ml. Una ventaja es que la HSAr purificada puede recuperarse después sólo de la fracción unida de la etapa (c), comparado por ejemplo con DEAE, en la que puede estar presente tanto en la fracción unida como en la no unida.

Descripción detallada de los dibujos

La Figura 1A-D ilustra posibles estructuras de ligandos adecuados para su uso en el presente método. Más específicamente, la Fig. 1A muestra un intercambiador catiónico del tipo ligando de alta salinidad (HSL), la Fig. 1B muestra una matriz de cromatografía de interacción hidrófoba, a saber Phenyl Sepharose, y las Fig 1C y 1D muestran dos intercambiadores aniónicos alternativos, a saber una fórmula generalizada que incluye la estructura de la DEAE Sepharose disponible en el mercado (Fig. 1C cuando n=0) y la butyl-Sepharose modificada, que comprende una densidad de ligando aumentada, como se describe a continuación.

La Figura 2 muestra los resultados de la etapa (a), es decir, de la cromatografía de intercambio catiónico de 147 ml de sobrenadante del cultivo celular no diluido (CCS) en una columna de 20 ml que comprende una matriz de intercambio catiónico con la estructura de ligando ilustrada en la Fig. 1A. La fracción 1B contiene la HSAr, que se separa claramente de las impurezas representadas por la fracción 2A.

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La Figura 3 muestra los resultados de la etapa (b), es decir, de la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) de la fracción 2B de la Fig. 2 en una columna de 40 ml que comprende Phenyl Sepharose como se ilustra en la Fig. 1B. La fracción A representa la HSAr.

La Figura 4 muestra los resultados de la etapa (c), es decir, de la cromatografía aniónica de la fracción 3A de la Fig. 3 en una columna de 40 ml que comprende la butyl-Sepharose modificada como se describe en la parte experimental a continuación. La HSAr purificada está en la fracción 4B.

La Figura 5 muestra los análisis de PAGE nativa (8-25%) y de SDS-PAGE (10-15%) de las fracciones principales obtenidas usando el método de tres etapas de acuerdo con la invención. Para la PAGE nativa visualizada por tinción con plata (5A), se aplicaron aproximadamente 3,3 \mug de proteína por punto. Para la SDS-PAGE visualizada por tinción con plata (5B), se aplicaron aproximadamente 2 \mug de proteína por punto. Para la SDS-PAGE visualizada por tinción de Coomassie (5C), se aplicaron aproximadamente 10 \mug de proteína por punto. 1: CCS; 2: Intercambio Catiónico HSL (no unido); 3: Intercambio Catiónico HSL (unido); 4: Fenil (no unido); 5: Fenil (unido); 6: HiSub. Butil; 7: HiSub. Butil (unido); 8: HSA (control). Las flechas muestran las posiciones de la HSAr.

Parte experimental Materiales y métodos

El sobrenadante del cultivo celular (CCS) que contenía HSAr se preparó fermentando células de P. pastoris genéticamente modificadas durante 2 semanas o más, seguido de la separación de las células por filtración. El CCS, que era de color verde, se dividió en alícuotas de aproximadamente 200 ml y se almacenó a -20ºC hasta su uso. La calidad del CCS se determinó por exclusión molecular en una columna analítica de Superdex™ 200 HR 10/30 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Este análisis dio las cantidades relativas de impurezas de alto peso molecular (HMW) y bajo peso molecular (LMW) en el CCS así como el contenido aproximado de la forma monomérica de
HSAr.

El caprilato sódico (ácido octanoico, sal de Na) y la L-cisteína se compraron en SIGMA Chemical Co. La HSA purificada cromatográficamente a partir de plasma humano la proporcionó amablemente I. Andersson de la unidad de procesamiento de plasma de Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden. La concentración de proteínas en diversas muestras se determinó usando el kit de ensayo de Proteínas Bio-Rad (conocido como método Bradford). Se usó albúmina de suero bovino (BSA) para construir la curva patrón. Las mediciones de absorción UV/Vis se hicieron usando un espectrofotómetro registrador Shimadzu UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan). Todos los demás productos químicos usados eran de grado analítico o reactivo.

La electroforesis analítica se realizó usando un sistema de electroforesis Phastgel y medios de Phastgel apropiados y tiras tampón (todo de Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Los análisis electroforéticos se realizaron usando geles PAGE nativos (8-25%) o SDS-PAGE (no reducidos, 10-15%) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La cantidad de muestra aplicada por punto fue como sigue: aproximadamente 3,3 \mug para muestras nativas y 2 \mug para las muestras tratadas con SDS, ambas se tiñeron con un kit de tinción de plata (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden); se aplicaron 10 \mug de las muestras tratadas con SDS y que se tiñeron con azul brillante de Coomassie (CBB).

Los análisis de espectrometría de masas (dirigidos a determinar la masa de HSAr purificada y de HSA derivada del plasma) se realizaron por el Dr. J. Flensgur en Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden, usando un instrumento MALDI-TOF. El mapeado de los péptidos de la digestión con tripsina de la HSA nativa y recombinante se hizo también usando este instrumento. Los resultados obtenidos de los últimos análisis sirven para establecer la secuencia primaria más probable de la HSAr en referencia a las secuencias conocidas de los péptidos trípticos generados a partir de HSA purificada.

Sistema de matrices y cromatografía

Los experimentos cromatográficos se realizaron a temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC) usando un sistema AKTA™ Explorer 100 controlado por el software UNICORN™ (versión 3.1) (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). La matriz de separación usada para la etapa (b) es Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (high sub), un producto habitual de Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden. Para la etapa (c), se usó DEAE Sepharose™ Fast Flow disponible en el mercado (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) o una matriz modificada: se produjo Butyl Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) con una densidad de ligando aumentada (lote U238025: 160 \mumol/ml) comparada con el producto comercial (20-40 \mumol/ml de gel). Esta matriz modificada se denominará en este documento "Butyl-Sepharose modificada". Además, la etapa (a) utilizó una matriz prototipo de intercambiador catiónico de tipo HSL, véase la Fig. 1A. Este medio se compactó en una columna de vidrio XK26/20 como una suspensión espesa en etanol al 20% para obtener un volumen de lecho de 40 ml. Se usó un caudal lineal de 300 cm/h. La columna compactada se lavó con aproximadamente 2 volúmenes del lecho de agua desionizada para eluir la mayoría del etanol y después se equilibró con la solución tampón apropiada previamente a la aplicación de la muestra. En la Tabla 1 a continuación se muestra la cantidad de tampón requerida para cada etapa cromatográfica usando los diversos
medios.

Tampones

Tampón A: Acetato de sodio 25mM, pH 4,5.

Mezclar 25 ml de acetato de sodio 1 M y 40 ml de ácido acético 1M y diluir a 1 l con agua desionizada. Conductividad: aproximadamente 2 mS/cm a temperatura ambiente (RT).

Tampón B: Fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0,1 M y caprilato sódico 10 mM, pH 7,0.

Mezclar 155 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M + 95 ml de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M + 5,8 g de NaCl + 1,66 g de caprilato sódico y diluir a 1 l con agua desionizada. Conductividad: aproximadamente 16 mS/cm a RT.

Tampón C: Fosfato sódico 50 mM, NaCl 0,1 M, pH 6,0.

Mezclar 212 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M + 38 ml de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M + 5,8 g de NaCl y diluir a 1 l con agua desionizada. Conductividad: 14 mS/cm a RT.

Tampón D: Fosfato sódico 50 mM, NaCl 0,2 M, pH 6,0.

Mezclar 212 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M + 38 ml de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M + 11,7 g de NaCl y diluir a 1 l con agua desionizada. Conductividad: 22 mS/cm a RT.

Tampón E: Solución de lavado en el lugar (CIP).

Disolver isopropanol al 30% en solución de NaOH 1 M.

Ejemplo Purificación de HSAr Tratamiento con calor del sobrenadante del cultivo celular (CCS)

Antes de la cromatografía de intercambio catiónico, el CCS se trató con calor principalmente para inactivar las enzimas proteolíticas producidas durante la fermentación de P. pastoris. Esto se realizó como sigue:

La muestra congelada de CCS se descongeló y se disolvió Na-caprilato 10 mM. El pH se ajustó a 6,0 y se calentó durante 30 minutos en un baño de agua (mantenido a 68ºC por un termostato). La muestra se enfrió a temperatura ambiente y su pH se ajustó a 4,5. Si se utilizara para la etapa (a) un medio de intercambio catiónico convencional, tal como SP Sepharose BB, se requeriría diluir el CCS 2-8 veces, dependiendo de la conductividad original de la solución, con agua desionizada para alcanzar una conductividad de aproximadamente 5-10 mS/cm (aproximadamente una concentración salina de 0,1 M).

Sin embargo, la matriz de tipo HSL usada de acuerdo con la presente invención es mucho más tolerante a concentraciones salinas aumentadas, y por lo tanto el CCS tratado con calor puede aplicarse normalmente a la etapa (a) sin más dilución, con tal de que la conductividad del mismo sea menor de aproximadamente 30 mS/cm.

La HSAr parcialmente purificada obtenida después del intercambio catiónico de acuerdo con la etapa (a) (es decir, la fracción unida a la matriz de tipo HSL) se trató también con calor previamente a la etapa (b) como sigue: el pH de la muestra se ajustó a 6,0 con NaOH 1 M y se disolvió cisteína allí a una concentración de 5 mM para servir como un agente reductor. Esta solución se trató después durante 60 minutos en un baño de agua mantenido a 60ºC. El propósito principal de esta operación es facilitar la eliminación de sustancias coloreadas por la matriz
HIC.

Etapa (a)

Captura usando cromatografía de intercambio catiónico

El medio de intercambio catiónico se compactó en una columna XK 16/20 (volumen del lecho compactado 20 ml) y se lavó con 2 volúmenes de la columna (CV) de tampón A para equilibrar. El CCS tratado con calor se aplicó a la columna por medio de 150 ml de Superloop™ (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) a un caudal de 300 ml/h (150 cm/h). La cantidad de HSAr aplicada fue aproximadamente 1 g (es decir, 50 mg de HSAr/ml de gel compactado). Después de la aplicación de la muestra, el material no unido se eluyó con 3 CV de tampón A seguido de la elución de la HSAr unida con 5 CV de tampón B. Las dos fracciones se recolectaron de forma separada y el pH de la fracción unida se ajustó a 6,0 con una solución de NaOH 1 M. La solución se calentó después como se ha descrito anteriormente, se enfrió a temperatura ambiente y además se purificó en una columna HIC como se describe a continuación. Se guardó una alícuota de 1 ml de cada fracción recolectada para propósitos de análisis (es decir, para determinar el contenido en proteína, la proporción A_{350}/A_{280} y análisis electroforético).

Regeneración: La columna se lavó con 2 CV de tampón E para eluir sustancias muy fuertemente unidas y restaurar la función del gel. Se dejó en reposo la columna toda la noche con la misma solución y después se lavó con 4 CV de agua desionizada para eluir la mayoría del NaOH e iso-propanol. La columna regenerada se reequilibró con 4 CV de tampón A previamente al próximo ciclo del proceso de adsorción/desorción.

Etapa (b)

Etapa de purificación usando HIC

La fracción que contiene HSAr de la etapa previa se transfirió a 150 ml de Superloop™ y se aplicó a una columna XK26/20 compactada con Phenyl Sepharore™ Fast Flow (high sub), con un volumen de lecho compactado de 40 ml. La columna se pre-equilibró con 3 CV de tampón C. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó con 2 CV de tampón C para eluir el material no unido que contiene la HSAr. El material unido (que contiene principalmente la forma degradada de 45 kDa de la HSAr) se eluyó con 2 CV de agua desionizada.

Regeneración: El mismo procedimiento que anteriormente.

Etapa (c)

Pulido usando un intercambiador aniónico débil

Se recolectaron las dos fracciones obtenidas en la etapa previa de HIC y se guardaron alícuotas de 1 ml de cada una para determinaciones analíticas (véase anteriormente). Se empaquetó una columna (XK26/20) con DEAE Sepharose™ Fast Flow o la descrita anteriormente Butyl-Sepharose modificada para obtener un volumen de lecho compactado de 40 ml. Cada uno de los medios compactados se lavó con 2 CV de agua desionizada y después con aproximadamente 5 CV de tampón C para equilibrarlos. La fracción no unida obtenida de la etapa HIC se transfirió a 150 ml de Superloop y se aplicó a una u otra de las dos columnas anteriores. La fracción no unida se eluyó con 6 CV de tampón C (de la columna DEAE Sepharose Fast Flow) o con 2 CV de la columna de Butyl-Sepharose modificada. La fracción unida se eluyó con 2 CV de una solución de NaCl 2 M (para la columna DEAE) o con 5 CV de tampón D para la columna de Butyl-Sepharose modificada. El caudal se mantuvo a 90 cm/h durante todo el proceso.

Regeneración: El mismo procedimiento que anteriormente.

Los protocolos de elución optimizados de acuerdo con la invención para cada medio usado se resumen en la Tabla 1. La persona especialista en este campo puede aumentar a escala fácilmente los procesos descritos anteriormente para operaciones a escala piloto o de producción.

TABLA 1

1

Resultados

Debido a que el proceso de purificación en tres etapas se basa en elución etapa a etapa, se puede adaptar fácilmente a operaciones a gran escala. El uso de un ligando superior de ButylSepharose para la etapa (c) produce una eliminación eficaz de las impurezas LMW que eluyen como un grupo en la fracción no unida. El uso de un ligando superior de la ButylSepharose también produce una mejor proporción A_{350}/A_{280} que el uso de una matriz del tipo DEAE para la etapa (c).

Claims

1. Un método para purificar seroalbúmina humana recombinante (HSAr) a partir de una solución, comprendiendo el método someter al sobrenadante de un cultivo celular (CCS) que comprende HSAr a las siguientes etapas cromatográficas:

(a): intercambio catiónico en una matriz bimodal tolerante a altas concentraciones salinas, en la que cada ligando comprende dos grupos capaces de interaccionar con la sustancia a aislar;

(b): cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y

(c): intercambio aniónico.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la conductividad del CCS está por encima de aproximadamente 10, tal como por encima de aproximadamente 15 y preferiblemente por encima de aproximadamente 20, por ejemplo aproximadamente 25-50 mS/cm, cuando se aplica a la etapa (a).

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la matriz bimodal de intercambio catiónico es capaz de interaccionar con la HSAr por interacción de carga y por enlace de hidrógeno y/o interacción hidrófoba.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que también comprende tratamiento con calor del CCS antes de la etapa (a).

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que también comprende tratamiento con calor del CCS antes de la etapa (b) en presencia de un agente reductor.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (b) utiliza una matriz HIC que comprende ligandos fenilo, alifáticos y/o heterocíclicos.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cantidad de matriz de intercambio catiónico usada en la etapa (a) es aproximadamente la mitad de la cantidad de matriz HIC usada en la etapa (b).

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (c) es una etapa de intercambio aniónico débil.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la densidad de ligando del intercambiador aniónico débil es > 50 \mumol/ml de gel/matriz, preferiblemente > 100 \mumol/ml de gel/matriz y aún más preferiblemente aproximadamente 160 \mumol/ml de gel/matriz.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la HSAr purificada se recupera sólo a partir de la fracción unida de la etapa (c).