SK7702000A3 - Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity - Google Patents

Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity Download PDF

Info

Publication number
SK7702000A3
SK7702000A3 SK770-2000A SK7702000A SK7702000A3 SK 7702000 A3 SK7702000 A3 SK 7702000A3 SK 7702000 A SK7702000 A SK 7702000A SK 7702000 A3 SK7702000 A3 SK 7702000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
promoter
sequence
region
gene
amino acid
Prior art date
Application number
SK770-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Yoko Asakura
Jun Nakamura
Sohei Kanno
Mikiko Suga
Eiichiro Kimura
Hisao Ito
Kazuhiko Matsui
Tsuyoshi Ohsumi
Tsuyoshi Nakamatsu
Osamu Kurahashi
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26549879&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK7702000(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of SK7702000A3 publication Critical patent/SK7702000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Spôsob konštrukcie bakteriálnych kmeňov, ktoré produkujú aminokyseliny a spôsob prípravy aminokyselín fermentáciou skonštruovaných bakteriálnych kmeňov, ktoré produkujú aminokyseliny.
Doterajší stav techniky
Predložený vynález sa týka spôsobu konštrukcie mutantného kmeňa, ktorý je schopný produkovať aminokyseliny s vysokým výťažkom a spôsobu výroby Laminokyselín fermentáciou s týmto mutantom.
Spôsoby konštrukcie mutantných kmeňov použiteľných na výrobu aminokyselín fermentáciou sa môžu zhruba rozdeliť na dve metódy. Jedna z nich zahŕňa zavedenie náhodných mutácií do DNA chemickým mutagénom, a druhá zahŕňa genetickú rekombináciu. Pri druhom spôsobe sa môže vyvinúť kmeň so zlepšenou schopnosťou produkovať zamýšľanú látku prostredníctvom posilnenia génu v metabolickej dráhe týkajúcej sa biosyntézy zamýšľanej látky alebo oslabením génu pre enzým, ktorý sa podieľa na deštrukcii. V tejto spojitosti môže byť na posilnenie zamýšľaného génu použitý najmä plazmid schopný autonómne sa replikovať v bunke, nezávisle od chromozómu.
Avšak spôsob posilnenia zamýšľaného génu plazmidom má problémy. Hlavným je, že stupeň obohatenia o zamýšľaný gén je rôzny, v závislosti na počte kópií samotného plazmidu. Preto je pre niektoré typy zamýšľaných génov počet kópií často príliš vysoký, a následkom toho sa expresia stáva nadmernou, vážne sa inhibuje rast alebo sa znižuje schopnosť produkovať zamýšľanú látku. Vtákom prípade, hoci je možné znížiť stupeň zosilnenia zamýšľaného génu použitím plazmidov s malým počtom kópií, sú v mnohých prípadoch rôzne plazmidy limitované a zamýšľaná kontrola úrovne expresie zamýšľaného génu nie je možná.
-2Ďalším problémom je, že keďže replikácia plazmidu je často nestabilná, plazmid sa eliminuje.
Napríklad, nepreskúmaná zverejnená japonská prihláška vynálezu (tu označovaná ako „J. P. Kokai“) č. 61-268185 opisuje rekombinantnú DNA, ktorá obsahuje DNA fragment zahŕňajúci gén produkujúci glutamátdehydrogenázu (GDH) (glutamátdehydrogenázový gén), ktorý je odvodený od glutamát produkujúcej koryneformnej baktérie a DNA fragment (plazmid), ktorý obsahuje gén nevyhnutný na autonómnu replikáciu v bunke. Tento dokument tiež uvádza, že zavedením rekombinantnej DNA do bunky môže byť GDH-obohatený kmeň pestovaný na zlepšenie produkcie látok (ako aminokyselín a proteínov) mikroorganizmami.
Na druhej strane je v japonskom patente č. 2 520 895 vyššie opísaná DNA zavedená do Corynebacteríum, aby sa získal kmeň, ktorý má zlepšenú enzymatickú aktivitu a fermentáciou s týmto kmeňom je vyrábaná kyselina L-glutámová. Avšak výroba a výťažok L-glutámovej kyseliny ešte neboli uspokojujúce. Takže je tu požiadavka ďalej zlepšiť produktivitu L-glutámovej kyseliny. Publikovalo sa, že táto požiadavka sa dosiahla zavedením rekombinantnej DNA, ktorá obsahuje dva druhy génov, tzn. gén produkujúci glutamátdehydrogenázu odvodený od glutamát produkujúcej koryneformnej baktérie, a gén izocitrátdehydrogenázy (ICDH) do koryneformnej baktérie produkujúcej glutamát.
J.P. Kokai č. 6-502548 ďalej opisuje expresný systém a sekrečný systém Corynebacteríum, ktorý zahŕňa Corynebacteríum kmeň a sekrečnú kazetu, ktorá obsahuje prvú, funkčnú DNA sekvenciu na expresiu v kmeni, druhú DNA sekvenciu kódujúcu aminokyseliny, polypeptidy a/alebo proteíny a tretiu DNA sekvenciu, ktorá je začlenená medzi prvou DNA sekvenciou a druhou DNA sekvenciou, pričom tretia DNA sekvencia kóduje proteínový element vybraný z PS1 a PS2, ktorý garantuje sekréciu aminokyselín, polypeptidov a/alebo proteínov. Konkrétne je tu nárokovaná sekrécia polypeptidov, pričom sa uskutočnila NTG mutagenéza s Corynebacteríum a vybral sa mutant rezistentný voči 4-fluórglutamátu (4FG), ktorý je analógom glutamátu, a tento sa transformoval s PCGL141. V tomto dokumente sa uvádza, že kmeň so zosilnenou expresiou GDH sa môže získať z analogických rezistentných baktérií. Tiež sa tu uvádza, že mutácia bola pozorovaná v nukleotidovej sekvencii č. 251 až č. 266 GDH promótora.
-3Podstata vynálezu
Predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob konštrukcie mutantu, ktorý je schopný vhodne zosilniť alebo riadiť expresiu zamýšľaného génu bez použitia plazmidu, a ktorý je tiež schopný produkovať aminokyseliny s vysokým výťažkom, prostredníctvom génovej rekombinácie alebo mutácie.
Iným predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť promótor pre GDH, ktorý je schopný prepožičiavať schopnosť produkovať kyselinu glutámovú s vysokým výťažkom Corynebacterium kmeňu bez toho, aby sa vážne zvýšilo množstvo kyseliny asparágovej a alaninu ako vedľajších produktov.
Ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť GDH gén, ktorý obsahuje sekvenciu vyššie opísaného promótora pre GDH.
Ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť Corynebacterium kmeň, ktorý obsahuje vyššie opísaný gén, a je schopný produkovať L-glutámovú kyselinu.
Ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob výroby aminokyselín fermentáciou, v ktorom je použitý takto skonštruovaný mikroorganizmus produkujúci aminokyselinu.
Ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob fermentácie na produkciu kyseliny glutámovej s nízkymi nákladmi prostredníctvom zvýšenia výťažku kyseliny glutámovej použitím koryneformnej baktérie produkujúcej glutámovú kyselinu.
Predložený vynález sa dokončil na základe zistenia, že vyššie opísané problémy sa môžu účinnej vyriešiť rôznymi modifikáciami promótora génov pre biosyntézu aminokyselín na chromozóme, aby sa riadil rozsah expresie zamýšľaných génov. Vynález bol skompletovaný najmä na základe zistenia, že vyššie uvedený problém sa môže účinne vyriešiť zavedením špecifickej mutácie do -35 oblasti alebo -10 oblasti, ktoré sú špecifickými oblasťami promótora.
Podstatou vynálezu je spôsob produkcie koryneformných baktérií majúcich zlepšenú produkciu aminokyselín alebo nukleových kyselín, ktorý zahŕňa zavedenie mutácií do promótorovej sekvencie génov pre biosyntézu aminokyselín alebo nukleových kyselín na chromozóme koryneformných baktérií, aby sa priblížila
-4konsenzus sekvencii, alebo zavedenie zmeny do promótorovej sekvencie génov pre biosyntézu aminokyselín alebo nukleových kyselín na chromozóme koryneformných baktérií prostredníctvom génovej rekombinácie, aby sa priblížila konsenzus sekvencii, na získanie mutantov koryneformných mikroorganizmov produkujúcich aminokyseliny alebo nukleové kyseliny, kultiváciu mutantov a výber mutantu, ktorý je schopný produkovať zamýšľanú aminokyselinu alebo nukleovú kyselinu vo veľkom množstve.
Predložený vynález poskytuje aj promótor pre gén na produkciu glutamátdehydrogenázy (GDH), ktorý má sekvenciu (i) najmenej jednej DNA sekvencie vybranej zo skupiny pozostávajúcej z CGGTCA, TTGTCA, TTGACA a TTGCCA v -35 oblasti, (ii) TATAAT sekvenciu alebo rovnakú TATAAT sekvenciu, v ktorej je ale báza ATTAT nahradená inou bázou v -10 oblasti, alebo (iii) kombináciu (i) a (ii), pričom takáto sekvencia neinhibuje funkciu promótora.
Predložený vynález poskytuje aj gén produkujúci glutamátdehydrogenázu, ktorý má vyššie opísaný promótor.
Predložený vynález poskytuje aj spôsob výroby aminokyseliny fermentáciou, ktorý zahŕňa kultiváciu koryneformnej baktérie konštruovanej vyššie opísaným spôsobom, ktorá má zlepšenú schopnosť produkovať aminokyselinu v médiu, na vytvorenie a aj akumuláciu zamýšľanej aminokyseliny v médiu, a izoláciu aminokyseliny z média.
Predložený vynález poskytuje aj spôsob výroby kyseliny L-glutámovej fermentáciou, ktorý zahŕňa kultiváciu koryneformného mikroorganizmu, ktorý produkuje kyselinu L-glutámovú a je rezistentný voči kyseline 4-fluórglutámovej, v kvapalnom médiu, na vytvorenie a aj akumuláciu kyseliny L-glutámovej v médiu, a izoláciu kyseliny L-glutámovej z média.
Najlepší spôsob uskutočnenia vynálezu
Tu používaný termín „koryneformný mikroorganizmus, ktorý produkuje kyselinu glutámovú zahŕňa aj baktérie, ktoré boli predtým zaradené do rodu Brevibacterium, ale teraz sú začlenené do rodu Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)) a aj baktérie rodu Brevibacterium, ktoré sú veľmi príbuzné baktériám z rodu Corynebacterium. Takže mutanty použité v predloženom vynáleze môžu byť odvodené od koryneformných baktérií produkujúcich kyselinu glutámovú nižšie
-5uvedených rodov Brevibacterium alebo Corynebacterium. Baktérie rodov
Corynebacterium a Brevibacterium sa budú kolektívne nazývať ako koryneformné baktérie“, pokiaľ sa nebudú týkať produktivity kyseliny glutámovej.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC13870
ATCC15806
Corynebacterium callunae
ATCC15991
Corynebacterium glutamicum
Brevibacterium divaricatum
Brevibacterium lactofermentum
Corynebacterium lilium Brevibacterium flavum
Corynebacterium melassecola Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium roseum Brevibacterium thiogenitalis Microbacterium ammoniaphilum Corynebacterium thermoaminogenes
ATCC13032
ATCC14020
ATCC13869
ATCC15990
ATCC14067
ATCC 17965
ATCC14066
ATCC14068
ATCC13825
ATCC19240
ATCC15354
AJ12310(FERM 9246)
Aminokyseliny, ktoré sa majú vyrobiť, nie sú konkrétne obmedzené, pokiaľ boli odhalené gény týkajúce sa ich biosyntézy a ich promótory. Príklady účinných enzýmov týkajúcich sa biosyntézy na fermentáciu kyseliny glutámovej zahŕňajú GDH, citrátsyntázu (CS), izocitrátsyntázu (ICDH), pyruvátdehydrogenázu (PDH) a akonitázu (ACO).
Účinné sú aj enzýmy na lyzínovú fermentáciu, ktoré zahŕňajú biosyntetické enzýmy ako asparátkinázu (AK), dihydrodipikolinátsyntázu, dihydrodipikolinátreduktázu, diaminopimelátdehydrogenázu a diaminopimelátdekarboxylázu. Účinný je aj lyzínový ekrinný proteín (lysE gén) týkajúci sa vylučovania lyzínu membránou.
Enzýmy účinné na fermentáciu arginínu zahŕňajú /V-acetylglutamátsyntázu, Nacetylglutamátkinázu, /V-acetylglutamylfosfátreduktázu, acetylornitinaminotransferázu, /V-acetylornitinázu, ornitínkarbamyltransferázu, arginínosukcinát syntázu a .
arginosukcinázu. Arginín sa vytvára reakciou katalyzovanou týmito enzýmami. Tieto
-6enzýmy sú účinné. Tieto enzýmy sú kódované génmi argA, argB, argC, argD, argE, argF, argG, respektíve argH.
Účinné enzýmy na serínovú fermentáciu zahŕňajú dehydrogenázu kyseliny 3fosfoglycerovej, fosfoserín-ŕrans-amylázu, fosfoserínfosfatázu a podobne.
Účinné enzýmy na fenylalanínovú fermentáciu zahŕňajú bio-syntetizujúce enzýmy ako deoxyarabinohepturónfosfátsyntetázu, 3-dehydrokinátsyntetázu, dehydroratázu kyseliny 3-dehydrokínovej, dehydrogenázu kyseliny shikimovej, shikimovú kinázu, 3-fosfát syntetázu kyseliny 5-enol-pyrvilshikimovej, syntetický enzým kyseliny chorizmovej, chorizmátsyntetázu, chorizmátmutázu, prefenátdehydroratázu a podobne. Účinné sú aj sacharidové metabolické enzýmy ako transketoráza, transaldoláza, syntetický enzým kyseliny fosfoenolpyrvovej.
Účinné enzýmy na tryptofánovú fermentáciu zahŕňajú, okrem rôznych enzýmov účinných vo vyššie uvedenej fenylalanínovej fermentácii a okrem rôznych enzýmov účinných vo vyššie uvedenej serínovej fermentácii, enzýmy patriace ku tryptofánovému operónu.
Účinné enzýmy na prolínovú fermentáciu zahŕňajú, okrem rôznych enzýmov účinných vo vyššie uvedenej fermentácii kyseliny glutámovej, γ-glutamylkinázu, γglutamylsemialdehyddehydrogenázu, pyrolín-5-karboxylátreduktázu.
Účinné enzýmy na glutamínovú fermentáciu zahŕňajú, okrem rôznych enzýmov účinných vo vyššie uvedenej fermentácii kyseliny glutámovej, glutamínsyntetázu.
Pri produkcii inozínu sa považuje za užitočné zosilniť expresiu 5-fosforibozyl-1 difosfátsyntetázy, 5-fosforibozyl-1 -difosfátaminotransferázy, fosforibozylaminoimidazolkarboxymidformyltransferázy a podobne.
Pri produkcii guanozínu sa považuje za užitočné zosilniť okrem expresie syntetického enzýmu kyseliny 5-fosforibozyl-1-difosforečnej, aminotransferázy kyseliny 5-fosforibozyl-1 -difosforečnej, fosforibozylaminoimidazolkarboxamidformyltransferázy, aj expresiu dehydrogenázy kyseliny 5'-inozínovej a aminázy kyseliny 5'xantylovej a podobne.
Pri produkcii adenozínu sa považuje za užitočné zosilniť, okrem expresie syntetického enzýmu 5-fosforibozyl-1-difosforečnej kyseliny, aminotransferázy kyseliny 5-fosforibozyl-1 -difosforečnej, fosforibozylaminoimidazolkarboxamidformyltransferázy, aj expresiu adenirosukcinátsyntázy a podobne.
-7Pri produkcii nukleotidu sa považuje za užitočné zosilniť expresiu fosforibozyl transferázy, inozínkinázy, guanozínkinázy a adenozínkinázy.
V predloženom vynáleze sa mutantná koryneformná baktéria, ktorá produkuje aminokyselinu, získa zavedením mutácie do promótorovej sekvencie požadovaných génov na biosyntézu aminokyseliny na chromozóme koryneformnej baktérie, ktorá produkuje aminokyselinu, ako je vyššie opísaná promótorová sekvencia pre GDH, aby sa vytvorila sekvencia podobnejšia s konsenzus sekvenciou, prostredníctvom chemickej látky alebo zavedením mutácie genetickou rekombináciou, aby sa získal mutantný koryneformný mikroorganizmus, ktorý produkuje aminokyselinu.
Výraz „konsenzus sekvencia“ je sekvencia, ktorá sa najčastejšie vyskytuje v rôznych promótorových sekvenciách. Takéto konsenzus sekvencie zahŕňajú napríklad sekvencie E. coli a Bacillus subtilis. Konsenzus sekvencia E. coli je opísaná v Diane K. Hawley a William R. McCIure Nuc. Acid. Res. 11:2237-2255 (1983) a konsenzus sekvencia B. subtilisje opísaná v Charles a iný, Mol. Gen. Genet 186: 339-346 (1982).
Mutácie sa môžu zaviesť buď len do jednej promótorovej sekvencie, ako napríklad pri GDH, alebo do dvoch alebo viacerých promótorových sekvencií, ako napríklad do sekvencií pre GDH, citrátsyntázu (citrát syntetizujúci enzým) (CS) a izocitrátsyntázu (izocitrát syntetizujúci enzým ) (ICDH).
V predloženom vynáleze sa takto získaný mutant kultivuje, aby sa získal mutant schopný produkovať veľké množstvo zamýšľanej aminokyseliny.
Už sa objasnilo, že pri fermentácii glutámovej kyseliny má GDH odvodená od koryneformného mikroorganizmu produkujúceho glutamát svoju vlastnú promótorovú sekvenciu nad oblasťou GDH (Sahm a iný, Molecular Microbiology (1992), 6, 317326).
Napríklad promótor pre GDH podľa predloženého vynálezu; Corynebacterium kmeň, ktorý produkuje GDH a L-glutamát, a má GDH gén s touto promótorovou, sekvenciou sa dá napríklad získať nasledujúcimi spôsobmi.
Konkrétne, kmeň sa podrobí mutagenéze, ako UV žiareniu, X-lúčom alebo ožiareniu, alebo sa ošetrí mutagénom, aby sa získal kmeň odolný voči kyseline 4fluórglutámovej na agarových platniach s kultivačným médiom obsahujúcim kyselinu
4-fluórglutámovú. Mutované bunky sa vysejú na agarové platne s kultivačným médiom obsahujúcim kyselinu 4-fluórglutámovú v takej koncentrácii, že inhibuje rast rodičovských buniek, takže vyrastené mutanty sa izolujú.
Ďalej môže byť promótorova sekvencia GDH génov nahradená rôznymi modifikovanými sekvenciami prostredníctvom miestne špecifickej mutagenézy a skúma sa vzťah medzi zodpovedajúcim sekvenciami a GDH aktivita, aby sa vybrali mutanty s vysokou produktivitou L-glutamátu.
Podľa predloženého vynálezu je výnimočne výhodné, aby DNA sekvencia v oblasti -35 promótora génu produkujúceho GDH bola aspoň jednou DNA sekvenciou vybranou zo skupiny, ktorá pozostáva z CGGTCA, TTGTCA, TTGACA a TTGCCA a/alebo DNA sekvencia v -10 oblasti promótora bola TATAAT, alebo aby boli bázy vATAAT vTATTAT sekvencii -10 oblasti nahradené inými bázami, ktoré neinhibujú funkciu promótora. Dôvodom, prečo môžu byť vybrané kmene, v ktorých sú bázy ATAAT v TATAAT sekvencii v -10 oblasti nahradené inými bázami, a v ktorých nie je inhibovaná funkcia promótora sú nasledovné. Pretože sa pozorovalo značné zvýšenie špecifickej aktivity GDH len výmenou prvého „C v CATAAT za „T“ v divom type -10 sekvencie (pozri p6-4 v tabuľke 1), predpokladá sa, že je možná takáto zámena s inou bázou.
Promótorová sekvencia GDH génu je opísaná napríklad vo vyššie uvedenom Sahm a iný, Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326. Je tu opísaný ako sekv. č. 1. Tak isto samotná sekvencia GDH génu je opísaná v Sahm a iný, Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326 ako sekv. č. 1.
Podobne, mutácia môže byť zavedená do promótora pre citrát-syntetizujúci enzým (CS) alebo izocitrát-syntetizujúci enzým (ICDH).
Takže promótory pre GDH sú promótory, ktoré majú aspoň jednu DNA sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá pozostáva z CGGTCA, TTGTCA, TTGACA a TTGCCA v -35 oblasti a/alebo TATAAT alebo TATAAT sekvenciu, v ktorej je báza z ATAAT nahradená inou bázou v -10 oblasti, pričom neinhibuje funkciu promótora. Poskytnuté sú aj gény na produkciu glutamát dehydrogenázy, ktoré majú vyššie opísaný promótor.
Promótory pre CS sú promótory, ktoré majú TTGACA sekvenciu v -35 oblasti a/alebo TATAAT sekvenciu v -10 oblasti, ktorá neinhibuje funkciu promótora. Poskytnuté sú aj CS gény, ktoré majú vyššie opísaný promótor.
-9Promótory pre ICDH sú promótory, ktoré majú TTGCCA alebo TTGACA sekvenciu v prvom alebo v druhom promótori v -35 oblasti a/alebo TATAAT sekvenciu v prvom alebo v druhom promótori v -10 oblasti, ktorá neinhibuje funkciu promótora. Poskytnuté sú aj /cd gény, ktoré majú vyššie opísaný promótor.
Promótory pre PDH sú promótory, ktoré majú TTGCCA sekvenciu v -35 oblasti a/alebo TATAAT sekvenciu v -10 oblasti, ktorá neinhibuje funkciu promótora. Poskytnuté sú aj PDH gény, ktoré majú vyššie opísaný promótor.
Predložený vynález poskytuje aj koryneformnú baktériu produkujúcu Lglutamát, ktorá má vyššie opísané gény.
Promótory pre arginínosukcinátsyntázu sú promótory, ktoré majú aspoň jednu DNA sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá pozostáva z TTGCCA, TTGCTA a TTGTCA v -35 oblasti a/alebo TATAAT sekvenciu v -10 oblasti, alebo je báza zATAAT vTATTAT sekvencii nahradená inou bázou, pričom neinhibuje funkciu promótora. Poskytnutý je aj gén pre arginínosukcinátsyntázu, ktorý má vyššie opísaný promótor.
Predložený vynález poskytuje aj koryneformnú baktériu produkujúcu arginín, ktorá má vyššie opísané gény.
Aminokyseliny sa môžu získať kultiváciou koryneformnej baktérie podľa predloženého vynálezu, ktorá produkuje aminokyselinu, výhodne kyselinu Lglutámovú, v kvapalnom kultivačnom médiu, na vytvorenie, a tým akumuláciu zamýšľanej aminokyseliny, výhodne kyseliny L-glutámovej, a izoláciou aminokyseliny z kultivačného média.
Kvapalné kultivačné médium používané na kultiváciu vyššie opísaného kmeňa baktérie podľa predloženého vynálezu je bežné nutričné médiu obsahujúce zdroje uhlíka, zdroje dusíka, anorganické soli, rastové faktory, atď.
Zdroje uhlíka zahŕňajú uhľovodíky ako glukózu, fruktózu, sacharózu, melasu a hydrolyzáty škrobu; alkoholy, ako etanol a glycerol; a organické kyseliny ako kyselinu octovú. Zdroje dusíka zahŕňajú síran amónny, dusičnan amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, octan amónny, amoniak, peptón, mäsový extrakt, kvasinkový extrakt a kukuričný destilát. Ak sa použije auxotrofný mutant do média sa pridajú požadované látky ako reakčné činidlá alebo sa pridajú prirodzené látky, ktoré ich obsahujú.
-10Koryneformné baktérie zvyčajne produkujú kyselinu L-glutámovú v podmienkach zníženého množstva biotínu. Takže v médiu je obmedzené množstvo biotínu alebo sa pridáva látka inhibujúca účinok biotínu, ako surfaktant alebo penicilín.
Fermentácia sa výhodne uskutočňuje premiešavaním kultúry alebo pretrepávaním kultúry spolu s prevzdušňovaním, pričom pH kultivačnej kvapaliny sa udržiava v rozsahu od 5 do 9, 2 až 7 dní. pH sa výhodne riadi močovinou, uhličitanom vápenatým, plynným amoniakom, amónnou vodou alebo podobne. Kultivačná teplota je výhodne 24 až 37 °C.
Takto vyprodukovaná a akumulovaná kyselina L-glutámová v kultivačnej kvapaline sa izoluje bežným spôsobom ako iono-meničovou živicovou metódou alebo kryštalizačnou metódou. Konkrétne sa kyselina L-glutámová oddeľuje adsorpciou na aniónovú výmennú živicu alebo neutralizačnou kryštalizáciou.
Podľa predloženého vynálezu sa môže zamýšľaná aminokyselina získať s vysokým výťažkom zavedením mutácie do promótorovej oblasti aminokyselinových biosyntetických génov koryneformnej baktérie, ktorá produkuje aminokyselinu, aby sa riadila expresia zamýšľaných génov. Navyše, keďže, na rozdiel od prípadov využívajúcich plazmid, nenastáva eliminácia cieľových génov z baktérií podľa predloženého vynálezu, môže sa zamýšľaná aminokyselina získavať stabilne s vysokým výťažkom. Takže priemyselná hodnota vynálezu je vysoká.
Predložený vynález poskytuje rôzne promótory, konkrétne promótory pre GDH, ktoré sú schopné posilniť produkovanie aminokyselín, najmä kyseliny glutámovej, s vysokým výťažkom v Corynebacterium kmeňoch bez toho, aby zvýšili množstvá vedľajších produktov, kyseliny asparágovej a alanínu.
Podľa predloženého vynálezu sa koryneformná baktéria, ktorá produkuje Lglutamát, mutuje, kmeň, do ktorého bola zavedená mutácia v promótorovej oblasti GDH génu, a ktorý je rezistentný na kyselinu 4-fluórglutámovú, sa izoluje, a tento kmeň sa kultivuje za účelom získania kyseliny glutámovej s vysokým výťažkom. Takže predložený vynález je priemyselne veľmi výhodný.
Nasledujúce príklady budú ďalej ilustrovať predložený vynález.
-11 Stručný prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje postup konštrukcie GDH génu s mutantným promótorom.
Obrázok 2 znázorňuje postup konštrukcie CS génu s mutantným promótorom.
Obrázok 3 znázorňuje postup konštrukcie kyvadlového (shuttle) vektora nesúceho lacZ ako reporterový gén.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Výroba mutantného GDH promótora
Mutantný GDH promótor sa pripravil spôsobom miestne špecifickej mutagenézy nasledovne:
(1) Príprava GDH génov, ktoré majú rôzne mutantné promótory
Divý typ sekvencie v -35 oblasti a v -10 oblasti promótora GDH génu koryneformných baktérií je znázornený ako sekvencia č. 1. Promótorová sekvencia divého typu už bola publikovaná (Molecular Microbiology (1992), 6, 317-326).
Spôsob prípravy plazmidu nesúceho GDH gén, ktorý má mutantný promótor je nasledovný:
Ako je znázornené na obrázku 1, ako templát pre PCR bol použitý chromozomálny gén divého typu kmeňa koryneformnej baktérie ATCC13896, ktorý bol pripravený Bakteriálnym genómovým DNA purifikačným kitom (Advanced Genetic Technologies Corp.). Génová manipulácia sa uskutočnila prostredníctvom PCR, použitím protismerných a priamych sekvencií GDH génu. Oba konce sa zatupili. Takto získaný produkt sa začlenil do Smal miesta plazmidu pHSG399 (produkt Takara Shuzo Co., Ltd.). Potom sa zaviedol počiatok replikácie z plazmidu pSAK4, ktorý má počiatok replikácie schopný replikovať sa v koryneformnej baktérii, do Sali miesta plazmidu, čím sa získal plazmid pGDH. Týmto spôsobom sa môžu
-12získať GDH gény, z ktorých každý má vyššie opísanú promótorovu sekvenciu, použitím primera, ktorý má každú zo sekvencií sekv. č. 1 až sekv. č. 6 zobrazených v Zozname sekvencií, ako protismerného primeru pre zodpovedajúci GDH gén. Sekvenovaním PCR amplifikovaného fragmentu sa potvrdilo, že okrem mutácie zavedenej do promótorovej sekvencie neobsahuje amplifikovaný fragment žiadnu inú mutáciu. pSAK4 sa konštruuje nasledovne: predtým získaný plazmid pHK4 (J.P. Kokai č. 5-7491), ktorý má autonómny počiatok replikácie odvodený od plazmidu pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), ktorý je schopný autonómne sa replikovať v Corynebacterium mikroorganizme, sa poštiepi reštrikčnými enzýmami BamHI a Kpnl, aby sa získal DNA fragment s počiatkom replikácie. Takto získanému fragmentu sa zatupia konce s DNA-zatupovacím kitom (Blunting kit od Takara Shuzo Co., Ltd.). Po ligácii so Sali spojovníkom sa takto získaný produkt začlení do Sali miesta pHSG299 (produkt od Takara Shuzo Co., Ltd.), čím sa získa plazmid pSAK4.
(2) Porovnanie stupňa expresie GDH s rozdielnymi promótorovými sekvenciami
Každý plazmid pripravený ako bolo opísané vyššie, sa zaviedol do divého kmeňa koryneformnej baktérie ATCC13869 elektroporáciou (pozri J.P. Kokai č. 2207791). Na porovnanie stupňa expresie GDH v týchto kmeňoch sa stanovovala špecifická aktivita GDH prostredníctvom vyššie opísaného spôsobu podľa Sahm a iný. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Kmeň Promótorova sekvencia Spec. aktivita GDH Relatívna hodnota
ATCC13869 TGGTCA CATAAT 7,7 0,1
/pGDH TGGTCA CATAAT 82,7 1,0
/p6-2 CGGTCA CATAAT 33,1 0,4
/p6-4 TGGTCA TATAAT 225,9 2,7
/p6-3 TTGACA TATAAT 327,2 4,0
/p6-7 TTGCCA TATAAT 407,0 4,9
/p6-8 TTGTCA TATAAT 401,3 4,9
-13ATCC 13869/p6-2 až ATCC 13869/p6-8 zodpovedajú sekvencii sekv. č. 2 až sekv. č. 6. Tieto sekvencie sú rovnaké ako sekv. č. 1 (divý typ) s výnimkou podčiarknutých častí, ktoré sa zmenili nasledovne:
Sekvencia
Č. 1 5'- TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGC CATAATTTGAACGT-3'
2 CGGTAC CATAAT
* 3 TGGTCA TATAAT
4 TTGACA TATAAT
- 5 TTGCCA TATAAT
6. TTGTCA TATAAT
Tieto sekvencie sú lineárne dvojvláknové DNA.
Príklad 2
Príprava mutantných kmeňov (1) Príprava mutantných kmeňov rezistentných voči kyseline 4-fluórglutámovej
AJ 13029 je mutantný kmeň produkujúci kyselinu glutámovú a je opísaný vo WO 96/06180. Hoci neprodukuje kyselinu glutámovú pri kultivačnej teplote 31,5 °C, produkuje ju aj v neprítomnosti inhibítora biotínu pri zvýšení kultivačnej teploty na 37 °C. V tomto príklade bol použitý kmeň Brevibacterium lactofermentum AJ 13029 ako rodičovský kmeň na prípravu mutantných kmeňov. V skutočnosti môžu byť ako rodičovský kmeň na prípravu mutantných kmeňov rezistentných voči kyseline 4fluórglutámovej použité akékoľvek iné kmene produkujúce kyselinu glutámovú.
AJ 13029 sa kultivoval na CM2B agarovom médiu (tabuľka 2) pri teplote 31,5 °C 24 hodín, aby sa získali bakteriálne bunky. Na bunky sa pôsobilo 250 μg/ml vodného roztoku A/-metyl-N'-nitro-/\/-nitrózoguanidínu pri 30 °C, 30 minút. Potom sa suspenzia buniek s 1% prežívaním vysiala na agarové platne s kultivačným médiom (tabuľka 3) obsahujúcim kyselinu 4-fluórglutámovú (4FG). Kolónie sa vytvorili po 20 až 30 hodinovom inkubovaní platní pri 31,5 °C. V tomto experimente sa najprv pripravilo šikmé médium s obsahom 1 mg/ml 4FG, a potom sa na ňom vytvorila
-14horizontálna vrstva rovnakého média bez 4FG. Takže na povrchu agarového média sa získal koncentračný gradient 4FG. Keď sa platne inokulovali mutantnými bunkami, ktoré sa získali vyššie opísaným postupom, vytvorila sa hraničná línia na hranici rastového limitu kmeňa. Odobrali sa bakteriálne kmene, ktoré vytvorili kolónie v oblasti obsahujúcej vyššiu 4FG koncentráciu ako bola koncentrácia v hraničnej línii. Tak sa získalo približne 50 kmeňov rezistentných na 4FG z približne 10 000 mutovaných buniek.
Tabuľka 2 - CM2B agarové médium
Zložka Koncentrácia
Polypeptón (Nippon Seiyaku Co.) Kvasinkový extrakt (Difco Co.) NaCI 1,0% 1,0% 0,5 %
d-Biotín 10 gg/l
Agar pH 7,2: nastavené s KOH 1,5%
Tabuľka 3 - Agarové médium
Zložka Množstvo v 1 litri vody
Glukóza 10g
MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O MnSO4.4-6H2O Hydrochlorid tiamínu d-Biotín ig 0,01 g 0,01 g 0,2 mg 0,05 mg
(NH4)2SO4 Na2HPO4.12H2O KH2PO4 Agar 5g 7,1 g 1,36 g 15g
(2) Potvrdenie schopnosti 4FG-rezistentných mutantných kmeňov produkovať kyselinu L-glutámovú
Schopnosť približne 50 mutantných kmeňov, ktoré sa získali v kroku (1), a rodičovského kmeňa AJ13029 produkovať kyselinu glutámovú sa potvrdila ako je opísané nižšie.
AJ13029 a každý z mutantných kmeňov sa kultivovali na CM2B agarovom médiu pri 31,5 °C 20 až 30 hodín. Kvapalné médium so zložením uvedeným ako médium A v tabuľke 4 sa inokulovalo takto získanými bunkami a kultúra sa začala premiešavať pri 31,5 °C. Po približne 22 hodinách sa pridalo čerstvé médium, tak aby finálna koncentrácia bola rovnaká ako médium B uvedené v tabuľke 4. Teplota sa zvýšila na 37 °C a kultivácia potom pokračovala ďalších približne 24 hodín. Po ukončení kultivácie sa kultúra skúmala prístrojom Biotic Analyzer (produkt firmy Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), aby sa stanovilo či sa produkuje kyselina L-glutámová alebo nie. Takto sa zistilo, že keď sa kultivovalo 50 kmeňov, u dvoch kmeňov bol výťažok kyseliny glutámovej vyšší ako výťažok získaný z rodičovského kmeňa a kmene s vysokou aktivitou GDH sa oddelili (kmeň A a kmeň B). Stanovila sa GDH aktivita každého z nich, a zistilo sa že oba majú zvýšenú špecifickú aktivitu GDH (tabuľka 5). GDH aktivita sa stanovila spôsobom podľa E.R. Bormann a iný (Molecular Microbiol, 6, 317-326 (1996)). Sekvenovaním GDH génov sa zistilo, že miesta mutácií sa nachádzajú len v promótorovej oblasti GDH (tabuľka 6).
Tabuľka 4
Zložka Médium A Médium B
Glukóza 3 g/dl 5 g/dl
KH2PO4 0,14 g/dl 0,14 g/dl
MgSO4.7H2O 0,04 g/dl 0,04 g/dl
FeSO4.7H2O 0,001 g/dl 0,001 g/dl
MnSO4.4H2O 0,001 g/dl 0,001 g/dl
(NH4)2SO4 1,5 g/dl 2,5 g/dl
-16Roztok sójového proteínového
hydrolyzátu 1,4 ml/dl 0,38 ml/dl
Hydrochlorid tiamínu 0,2 mg/l 0,2 mg/l
Biotín 0,3 mg/l 0,3 mg/l
Protipenivé činidlo 0,05 ml/l 0,05 ml/l
CaCO3 5 g/dl 5 g/dl
pH 7,0 (upravované s KOH)
Tabuľka 5
Vytváranie kyseliny glutámovej a GDH aktivita mutantných kmeňov
Kmeň Glu (g/dl) GDH špec. aktivita Relatívna hodnota
AJ 13029 2,6 7,7 1.0
FGR1 2,9 23,1 3,0
FGR2 3,0 25,9 3,4
Tabuľka 6
DNA sekvencie v GDH promótorovej oblasti mutantných kmeňov
Kmeň
GDH promótorová sekvencia
AJ 13029
TGGTCA
TTCTGTGCGACACTGC
CATAAT
FRG1
TGGTCA
TTCTGTGCGACACTGC
TATAAT
FRG2
TTGTCA
T-CTGTGCGACACTGC
TATAAT
Príklad 3
Zavedenie mutácie do
CS génovej promótorovej oblasti koryneformnej baktérie produkujúcej glutamát
V tomto príklade sa pripravil kmeň, ktorý má zosilnený promótor pre gény, ktoré kódujú glutamátdehydrogenázu (GDH) a enzým syntetizujúci citrát (CS).
(1) Klonovanie gltA génu
Sekvencia gltA génu koryneformnej baktérie, ktorá kóduje enzým syntetizujúci citrát, už bola objasnená (Microbial. 140, 1817-1828 (1994)). Na základe tejto sekvencie sa syntetizovali primery znázornené ako sekv. č. 7 a sekv. č. 8. Na druhej strane sa pripravila chromozomálna DNA z kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 použitím Bakteriálneho genómového DNA purifikačného kitu (Advanced Genetic Technologies Corp.). Ku zmesi 0,5 pg chromozomálnej DNA, 10 pmol každého z oligonukleotidov, 8 μΙ dNTP zmesi (2,5 mM z každého), 5 μΙ 10 x La Taq tlmivého roztoku (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 2 U La Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) sa pridala sterilizovaná voda, aby vznikol 50μΙ PCR reakčná zmes. Reakčná zmes sa podrobila PCR. PCR podmienky boli 30 cyklov denaturácie pri 94 °C 30 sekúnd, anelácia pri 55 °C 15 sekúnd a predlžovanie pri 72 °C 3 sekundy použitím Thermal Cycler TP240 (Takara Shuzo Co., Ltd.), aby sa amplifikovali približne 3 kb DNA fragmenty obsahujúce gltA gén a jeho promótor. Takto získané fragmenty sa purifikovali so SUPRECO2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a potom sa zatupili ich konce. Zatupovanie sa uskutočňovalo zatupovacím kitom od Takara Shuzo Co., Ltd. Fragment so zatupenými koncami sa zmiešal s pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.)., ktorý bol úplne poštiepený so Smal, a uskutočnila sa ligácia. Ligačná reakcia sa uskutočňovala s DNA ligačným kitom ver 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Po ukončení ligácie sa uskutočnila transformácia kompetentných buniek E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Bunky sa vysiali na platne s L médiom (s obsahom 10 g/l baktotryptónu, 5 g/l baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI a 15 g/l agaru; pH 7,2), ktoré obsahoval 10 μg/ml IPTG (izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid), 40 pg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galaktozid) a 40 μς/ΓηΙ chloramfenikolu. Po kultivácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformované kmene po izolácii z jednotlivých kolónii.
Z transformovaných kmeňov sa pripravili plazmidy alkalickou metódou (Seibutsu Kogaku Jikken-sho, editované Nippon Seibutsu Kogaku-kai a publikované
Baifukan, str. 105, 1992). Pripravili sa reštrikčné mapy, a plazmid, ktorý mal rovnakú reštrikčnú mapu ako je mapa znázornená na obrázku 2 sa označil pHSG399CS.
(2) Zavedenie mutácií do gltA promótora
Mutant-Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.) sa použil na zavedenie mutácie do gltA promótorovej oblasti. Spôsob je konkrétne opísaný nižšie. PHSG399CS sa úplne poštiepil s EcoRI a Sali, aby sa získal EcoRI-Sall fragment obsahujúci gltA gény, ktoré sa ligovali do fragmentu získaného úplným poštiepením pKF19kM (Takara Shuzo Co., Ltd.) s EcoRI a Sali. Po ukončení ligácie sa uskutočnila transformácia kompetentných E. coli JM109 buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.). Bunky sa vysiali na platne s L médiom s obsahom 10 pg/ml IPTG, 40 pg/ml XGal a 25 pg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónii. Z transformantov sa pripravili plazmidy a plazmid obsahujúci gltA gén sa označil ako pKF19CS.
PCR sa uskutočňovala použitím pKF19CS ako templátu a s 5'-fosforylovanými syntetickými DNA znázornenými ako sekv. č. 9, sekv. č. 10 a sekv. č. 11, spolu so selekčným primerom od Mutant super Express Km. Transformácia sa uskutočnila s kompetentnými E. coli MV1184 (Takara Shuzo Co., Ltd.) bunkami použitím PCR produktu. Bunky sa vysiali na platne s L-médiom s obsahom 25 pg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformantov sa pripravila plazmidová DNA. Sekvencia gltA promótorovej oblasti sa stanovila metódou podľa Sangera (J. Mol. Biol., 143-161 (1980)) použitím syntetickej DNA so sekvenciou č. 12. Konkrétne sa sekvencia určila použitím Dye Terminátor sekvenčného kitu (Applied Biosystems). Plazmidy, v ktorých bola gltA promótorová oblasť nahradená sekvenciou uvedenou v tabuľke 7 sa označili ako pKF19CS1, pKF19CS2, respektíve pKF19CS4.
Tabuľka 7
-35 oblasť -10 oblasť pKF19CS pKF19CSl pKF19CS2 pKF19CS4
TATAGC
TATAAC
TATAAT
TATAAT
ATGGCT
ATGGCT
ATGGCT
TTGACA (3) Konštrukcia mutantného gltA plazmidu pKF19CS, pKF19CS1, pKF19CS2 a pKF19CS4 skonštruované v kroku (2) sa úplne poštiepili so Sali a EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.). Na druhej strane sa plazmid pSFK6 (japonská prihláška vynálezu č. 11-69896), ktorý má počiatok replikácie odvodený od plazmidu pAM330, ktorý sa môže autonómne replikovať v koryneformnej baktérii (japonský zverejnený patent (tu označovaný ako J.P. Kokai) č. 58-67699) sa úplne poštiepil s EcoRI a Sali. Získaný fragment sa ligoval s približne 2,5kb fragmentom obsahujúcim gltA. Po ukončení ligácie sa transformácia uskutočnila s kompetentnými bunkami E. coli JM109. Bunky sa vysiali na platne s Lmédiom s obsahom 10 pg/ml IPTG, 40 g/ml X-Gal a 25 pg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformantov sa pripravili plazmidy. Plazmidy obsahujúce gltA gén sa označili pSFKC, pSFKCI, pSFKC2, respektíve pSFKC4.
(4) Stanovenie CS expresie z mutantného gltA plazmidu v koryneformnej baktérii
Plazmid skonštruovaný vo vyššie uvedenom kroku (3) sa zaviedol do Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. Konkrétne sa toto zavedenie uskutočnilo elektroporáciou (J. P. Kokai č. 2-07791). Transformanty sa vyberali pri 31 °C na platniach s CM2B médiom (s obsahom 10 g/l baktotryptónu, 10 g/l baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI, 10 pg/l biotínu a 15 g/l agaru; pH 7,0), ktoré obsahovali 25 gg/ml kanamycínu. Po dvojdňovej inkubácii sa odobrali kolónie a transformanty obsahujúce pSFKC, pSFKCI, pSFKC2 a pSFKC4 sa označili ako BLCS, BLCS1, BĽCS2, respektíve BLCS4, po izolácii z jednotlivých kolónií. Médium so zložením uvedeným v tabuľke 8 sa inokulovalo transformantom. Kultivácia pokračovala pri 31 °C a ukončila sa pred tým, ako bola úplne spotrebovaná glukóza. Kultivačné médium sa scentrifugovalo, aby sa oddelili bunky. Bunky sa premyli s 50mM tris tlmivým roztokom (pH 7,5) s obsahom 200M glutamátu sodného a potom sa rozsuspendovali v rovnakom tlmivom roztoku. Po sonifikácii na UD-201 (TOMY) nasledovala centrifugácia (10 000), bunky ktoré ostali nerozbité sa odstránili a získal sa surový enzýmový roztok. Aktivita citrátsyntázy sa môže stanoviť podľa Methods
-20Enzymol. 13, 3-11 (1969). Konkrétne, surový enzýmový roztok sa pridal do reakčnej zmesi obsahujúcej 100 mM TrisHCI (pH 8), 0,1 mM DTNB, 200 mM glutamátu sodného a 0,3 mM acetyl CoA a pozadie sa stanovilo ako zvýšenie absorbancie pri 412 nm, pri 30 °C prostredníctvom Hitachi spektrofotometra U-3210. Ďalej sa pridala kyselina oxalooctová v takom množstve, aby finálna koncentrácia bola 0,5 mM. Stanovilo sa zvýšenie absorbancie pri 412 nm, z ktorého sa odvodila hodnota pozadia, aby sa stanovila aktivita citrátsyntázy. Koncentrácia proteínu v surovom enzýmovom roztoku sa stanovila proteínovým testom (BIO-RAD). Ako štandardný proteín bol použitý hovädzí sérový albumín. Výsledky sú uvedené v tabuľke 9. Potvrdilo sa, že citrátsyntázová aktivita mutantných gltA promótorov je vyššia v porovnaní s divým typom gltA promótora.
Tabuľka 8
Zložka
Koncentrácia
Glukóza 50 g/l
KH2PO4 1 g/l
MnSO4.7H2O 0,4 mg/l
FeSO4.7H2O 10 mg/l
Sójové proteínové hydrolyzáty 20 ml/l
Biotín 0,5 mg/l
Hydrochloríd tiamínu mg/l
Tabuľka 9
Kmeň dABS/min/mg Relatívna aktivita Relatívna hodnota
Divý typ 4 6,8 1,0
BLCS00 38,8 5,7 1,0
BLCS01 57,1 8,4 1,21
BLCS02 92,5 13,6 1.9
blcs04 239,5 35,2 4,8
(5) Zavedenie mutantného gltA génu do teplotné senzitívneho plazmidu
Na zavedenie mutantných gltA promótorových sekvencii do chromozómu je známy spôsob, v ktorom sa používa plazmid, ktorého replikácia v koryneformnej baktérii je citlivá na zmenu teploty (J. P. Kokai č. 5-7491). pSFKT2 (japonská prihláška vynálezu č. 11-81693) sa použil ako plazmidový vektor, ktorého replikácia v koryneformnej baktérii je citlivá na zmenu teploty. pKFCSI, pKFCS2 a pKFCS3 sa úplne poštiepili so Sali a BstPI a so zatupenými koncami boli použité ako mutantné gltA promótorové sekvencie. Ligovali sa do pSFKT2, ktorý bol úplne poštiepený so Smal. Po ukončení ligácie sa transformácia uskutočnila s kompetentnými bunkami E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Bunky sa vysiali na platne s L-médiom s obsahom 10 pg/ml IPTG, 40 g/ml X-Gal a 25 pg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformantov sa pripravili plazmidy. Kyvadlové vektory citlivé na zmenu teploty, obsahujúce gltA gén, sa označili pSFKTCI, pSFKTC2, respektíve pSFKTC4.
t (6) Zavedenie mutantného gltA promótora do chromozómu pSFKTCI, pSFKTC2 a pSFKTC4 sa každý samostatne zaviedli do kmeňa Brevibacteríum lactofermentum FGR2 elektroporáciou. Transformanty sa vyselektovali na platniach s CM2B médiom s obsahom 25 pg/ml kanamycínu pri 25 °C. Po zavedení každého z plazmidov sa každý kmeň kultivoval v CM2B kvapalnom médiu, po nariedení na koncentráciu 103 až 106 cfu na platňu sa vysial na CM2B platne s obsahom 25 pg/ml kanamycínu a kultivoval sa pri 34 °C. Kmene z plazmidom citlivým na zmenu teploty sa stali citlivými na kanamycin, pretože replikácia plazmidu sa pri tejto teplote inhibovala, a preto nemohli vytvárať kolónie. Na druhej strane môže byť vyselektovaný kmeň, ktorý má plazmidovú DNA integrovanú do chromozómu, pretože vytváral kolónie. Z kmeňa sa extrahovala chromozomálna DNA. PCR sa uskutočňovala použitím chromozomálnej DNA ako templátu a použili sa priméry so sekvenciou uvedenou ako sekv. č. 8 a sekv. č. 13. Potvrdené boli približne 3kb amplifikované fragmenty. Takto sa potvrdilo, že mutantný gltA gén odvodený od plazmidu citlivého na zmenu teploty, sa integroval neďaleko gltA génu v hostiteľskom
-22chromozóme homologickou rekombináciou. Kmene odvodené od pSFKTCI, 2 a 4 sa označili ako BLCS11, BLCS12, respektíve BLCS14.
(7) Príprava gltA promótorov
Najprv sa získali kmene citlivé na kanamycín z kmeňov BLCS11, BLCS12 a BLCS14, ktoré majú mutantný gltA gén integrovaný prostredníctvom homologickej rekombinácie. Kmene s integrovaným plazmidom sa nariedili a vysiali na CMM2B platne a potom sa kultivovali pri 34 °C. Po sformovaní kolónií sa vytvorili repliky platní použitím CM2B platní s obsahom 25 pg/ml kanamycínu a kultivovali sa pri 34 °C. Tak sa získali kmene citlivé na kanamycín.
Z kmeňa citlivého na kanamycín sa extrahoval chromozóm a na prípravu gltA génových fragmentov sa uskutočňovala PCR s primermi so sekvenciou č. 7 a sekvenciou č. 8. Takto získané amplifikované fragmenty sa purifikovali so SUPRECO2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a podrobili sa sekvenovacej reakcii použitím primeru so sekv. č. 13, aby sa stanovila sekvencia v ich promótorovej oblasti. Výsledný kmeň, ktorý mal rovnakú promótorovú sekvenciu ako promótorova sekvencia pKF19CS1 v tabuľke 7, sa označil GB01, kmeň s rovnakou promótorovou sekvenciou ako v pKF19CS2 sa označil ako GB02 a kmeň s rovnakou promótorovou sekvenciou ako v pKF19CS4 sa označil ako GB03.V týchto kmeňoch bol gltA gén divého typu, pôvodne umiestnený na chromozóme, spolu s vektorovým plazmidom vystrihnutý, zatiaľ čo mutantný gltA gén zavedený plazmidom ostal na chromozóme, keď sa plazmid a duplikovaný gltA gén vystrihli z chromozómu.
(8) Stanovenie aktivity citrátsyntázy kmeňov s mutantným gltA promótorom
Aktivita citrátsyntázy sa stanovila ošetrením kmeňov FGR2, GB01, GB02, GB03 a FGR2/pSFKC, získaných v kroku (7), rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené v kroku (4). Výsledky sú uvedené v tabuľke 10. Potvrdilo sa, že aktivita citrátsyntázy kmeňov so substituovaným gltA promótorom bola vyššia ako aktivita v ich rodičovských kmeňoch.
-23Tabuľka 10
Kmeň dABS/min/mg Relatívna aktivita
FRG2 7,9 1.0
GB01 9,5 1.2
GB02 15,0 1.9
GB03 31,6 4.0
FGR2/pSFKC 61,6 7,8
(9) Výsledky kultivácie kmeňov so substituovaným gltA promótorom
Každý z kmeňov získaných vo vyššie opísanom kroku (7) sa inokuloval do očkovacieho kultivačného média so zložením uvedeným v tabuľke 11, a kultúra sa pretrepávala pri 31,5 °C 24 hodín. 300 ml hlavného kultivačného média so zložením uvedeným v tabuľke 11 sa umiestnilo do 500ml sklenených fermentorov a sterilizovalo sa teplom a inokulovalo sa 40 ml očkovacej kultúry opísanej vyššie. Kultivácia začala pri kultivačnej teplote 31,5 °C, zatiaľ čo rýchlosť miešania a rýchlosť prevzdušňovania bola kontrolovaná na 800 až 1300 ot./minútu, respektíve 1/2 až 1/1 vvm (prevzdušňovači pomer). pH kultivačnej kvapaliny sa udržiavalo na 7,5 plynným amoniakom. 8 hodín po začiatku kultivácie sa teplota zvýšila na 37 °C. Kultivácia sa ukončila, keď sa úplne spotrebovala glukóza, po 20 až 40 hodinách, a stanovilo sa množstvo vytvorenej kyseliny L-glutámovej, ktorá sa akumulovala v kvapalnej kultúre.
Výsledkom bolo potvrdenie, že sa značne zlepšil výťažok kyseliny Lglutámovej, keď za použil jeden z kmeňov GB02 a GB03, v porovnaní z GB01 a FGR2/pSFKC, ako je uvedené v tabuľke 12. Na základe týchto faktov sa zistilo, že boli získané dobré výsledky zavedením mutácie do gltA promótora na zvýšenie CS aktivity 2 až 4 krát, na zvýšenie výťažku produkcie kyseliny glutámovej týmito kmeňmi.
-24Zložka Koncentrácia
Tabuľka 11
Očkovacia kultúra Hlavná kultúra
Glukóza 50 g/l 150 g/l
KH2PO4 1 g/l 2 g/l
MgSO4.7H2O 0,4 mg/l 1,5 g/l
FeSO4.7H2O 10 mg/l 15 mg/l
MnSO4.4H2O 10 mg/l 15 mg/l
Sójové proteínové hydrolyzáty 20 ml/l 50 ml/l
Biotín 0,5 mg/l 2 mg/l
Hydrochlorid tiamínu 2 mg/l 3 mg/l
Tabuľka 12
Kmeň Kyselina L-glutámová (g/l)
FRG2 8,9
GB01 9,1
GB02 9,4
GB03 9,4
FGR2/pSFKC 9,1
Príklad 4
Zavedenie mutácie do ICDH génovej promótorovej oblasti koryneformnej baktérie produkujúcej glutamát
V tomto príklade sa pripravili kmene, ktoré má zosilnené promótory pre gény, ktoré kódujú glutamát dehydrogenázu, citrátsyntázu a izocitrátdehydrogenázu.
(1) Klonovanie icd génu
-25DNA sekvencia icd génu koryneformnej baktérie, ktorá kóduje izocitrátdehydrogenázu, už bola objasnená (J. Bacteriol. 177, 774-782 (1995)). Na základe tejto sekvencie sa syntetizovali primery znázornené ako sekv. č. 14 a sekv. č. 15. PCR sa uskutočňovala použitím chromozomálnej DNA z kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 ako templátu na amplifikovanie približne 3 kbp DNA fragmentu, ktorý obsahuje icd gén a jeho promótor. Takto získané amplifikované fragmenty sa úplne poštiepili s EcoRI a zmiešali sa s úplne EcoRI poštiepeným pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a uskutočnila sa ligácia. Po ukončení ligácie sa uskutočnila transformácia použitím kompetentných buniek E. coli JM109. Bunky sa vysiali na platne s L médiom, ktoré obsahovalo 10 pg/ml IPTG, 40 pg/ml X-Gal a 40 pg/ml chloramfenikolu. Po kultivácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónií.
Plazmid nesúci icd gén sa označil pHSG399icd.
(2) Zavedenie mutácií do icd promótora
Presná lokalizácia promótora icd génu ešte nebola stanovená. Možnosť zvýšenia mRNA transkripčnej hladiny icd génu sa prehľadávala prostredníctvom umelo modifikovanej sekvencie predchádzajúcej génu, ktorý kóduje ICDH, v sekvencií podobnej promótoru. Konkrétne, mutácie boli zavedené do -10 podobnej oblasti, ktorá existuje v DNA sekvencií približne 190 bp smerom k 5' (prvý promótor) a približne 70 bp smerom k 5' (druhý promótor) od prvého ATG ICDH proteínu.
Mutant-Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.) sa použil na zavedenie mutácie do hornej oblasti icd génu. Spôsob je konkrétne opísaný nižšie. PHSG39icd sa úplne poštiepil s Pstl, aby sa získal Pstl fragment obsahujúci promótor icd génu. Fragmenty sa ligovali do fragmentu získaného úplným poštiepením pKF18kM (Takara Shuzo Co., Ltd.) s Pstl. Po ukončení ligácie sa uskutočnila transformácia kompetentných E. coli JM109 buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.). Bunky sa vysiali na platne s L médiom s obsahom 10 pg/ml IPTG, 40 pg/ml X-Gal a 25 pg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformantov sa pripravili plazmidy a plazmid obsahujúci promótor icd génu sa označil ako pKF18icd.
-26PCR sa uskutočňovala použitím pKF18icd ako templátu a s 5'-fosforylovanými syntetickými DNA znázornenými ako sekv. č. 16, sekv. č. 17, sekv. č. 18, sekv. č. 19, sekv. č. 20 a sekv. č. 20, spolu so selekčným primerom. Tieto PCR produkty sa použili na transformáciu kompetentných buniek E. coli JM109. Bunky sa vysiali na platne s L-médiom s obsahom 25 μο/ΓηΙ kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali vytvorené kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformantov sa pripravila plazmidová DNA a stanovila sa sekvencia icd promótorovej oblasti použitím syntetickej DNA, uvedenej ako sekv. č. 22, metódou podľa Sangera (J. Mol. Biol., 143-161 (1980)). Konkrétne sa sekvencia určila použitím Dye Terminátor sekvenčného kitu (Applied Biosystems) a analyzovala sa Genetickým Analyzátorom ABI310 (Applied Biosystems). Takto získané plazmidy, v ktorých bola icd promótorová oblasť nahradená sekvenciou uvedenou v tabuľke 7 sa označili ako pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, respektíve pKF18ICD6m. Z pomedzi nich sa pKF18ICD2 úplne poštiepil s PstI, aby sa získal PstI fragment, ktorý obsahuje promótor icd génu. Fragment sa ligoval s fragmentom získaným úplným poštiepením pKF18kM (Takara Shuzo Co., Ltd.) s PstI. Po ukončení ligácie sa uskutočnila transformácia kompetentných E. coli JM109 buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.). Bunky sa vysiali na platne s L médiom s obsahom 10 pg/ml IPTG, 40 gg/ml X-Gal a 25 pg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali biele kolónie, aby sa získali transformanty izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformovaných kmeňov sa pripravili plazmidy a plazmid obsahujúci promótor icd génu sa označil pKF18ICDM2. PCR sa uskutočňovala použitím pKF18ICDM2 ako templátu a s 5'-fosforylovanými syntetickými DNA znázornenými ako sekv. č. 20 a sekv. č. 21, spolu so selekčným primerom. Transformácia kompetentných E. coli JM109 buniek sa uskutočnila použitím PCR produktu. Bunky sa vysiali na platne s Lmédiom s obsahom 25 gg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali takto vytvorené kolónie, a transformanty sa získali izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformantov sa pripravila plazmidová DNA a sekvencia icd promótorovej oblasti sa stanovila použitím syntetickej DNA so sekvenciou č. 12. Takto získané plazmidy, v ktorých bola icd promótorová oblasť nahradená sekvenciou uvedenou v tabuľke 13 sa označili ako pKF19ICD25, respektíve pKF19ICD26.
-27Tabuľka 13
1. promótor 2. promótor
-35 -10 -35 -10
pKF18ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCAT
pKF18ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA CACCAT
pKF18ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA CACCAT
pKF18lCD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA CACCAT
pKF18ICD04 GCGACT GAAAGT TTTCCA TATAAT
pKF18ICD05 GCGACT GAAAGT TTGCCA TATAAT
pKF18ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAAT
pKF18ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAAT
pKF18lCD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT
(3) Konštrukcia plazmidu na stanovenie promótorovej aktivity
Možným spôsobom na jednoduché stanovenie promótorovej aktivity je nepriame stanovenie promótorovej aktivity použitím reporterového génu. Požadovanými vlastnosťami potrebnými pre reporterový gén sú: aktivita sa má stanovovať jednoducho, aktivita sa vážne nezníži, ak je na N-koniec pridaná aminokyselina, nenastáva reakcia v pozadí a reporterový gén obsahuje miesta reštrikčného štiepenia vhodné na génovú manipuláciu. Keďže β-galaktozidáza (LacZ) E. coli je široko rozšíreným reportérovým génom a rod Corynebacterium neasimiluje laktózu (J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 399-416 (1972)), bol LacZ vybraný ako optimálny reporterový gén. Potom sa skonštruoval plazmid pNEOL nesúci LacZ ako reporterový gén (pozri obr. 3). Spôsob konštrukcie je podrobne opísaný nižšie. PCR sa uskutočňovala použitím chromozomálnej DNA z E. coli ME8459 uloženej v National Inštitúte of Genetics (Japan)) ako templátu a použitím DNA so sekvenciou č. 23 a sekvenciou 24 ako primerov. PCR produkt sa úplne poštiepil so Smal a BamHI a potom sa ligoval s fragmentárni získanými poštiepením pKF3 (Takara Shuzo Co., Ltd.) s Hindlll, ktorým sa zatupili konce. Po ukončení ligácie sa uskutočnila transformácia kompetentných E. coli JM109 buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.). Bunky sa vysiali na platne s L médiom s obsahom 25 pg/ml kanamycinu. Po inkubácii cez
-28noc sa odobrali takto vytvorené kolónie a separovali sa do príslušných kolónií, aby sa získal transformovaný kmeň. Z transformantov sa pripravili plazmidy a plazmid obsahujúci promótor icd génu sa označil ako pKF18icd. Plazmid získaný z transformovaného kmeňa sa označil pKF3nptll. Potom sa tento plazmid poštiepil so Sali. Na druhej strane sa pSAK4, opísaný v príklade 1(1) úplne poštiepil so Smal a Sal a zatupili sa mu konce. Tieto fragmenty sa spolu zligovali, čím sa skonštruoval kyvadlový vektor pNEO, ktorý sa môže replikovať v koryneformnej baktérii. Tento plazmid bol schopný vniesť do hostiteľov odolnosť voči chloramfenikolu a kanamycínu. Ďalej sa pNEO úplne poštiepil so Smal a Sse83871. Výsledné fragmenty sa ligovali s fragmentárni získanými úplným Pstl štiepením pMC1871 (Farmacia Biotech.). Tak sa skonštruoval kyvadlový vektor pNEOL, ktorý sa môže replikovať v koryneformnej baktérii a má LacZ bez 8 aminokyselín na N-konci ako reporterový gén (obr. 3).
(4) Stanovenie aktivity mutantného icd promótora
Plazmidy s mutantným icd promótorom skonštruované vo vyššie uvedenom kroku (2), tzn. pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25, pKF18ICD26 a pKF18ICD, sa úplne poštiepili so Sacll a Pstl a potom sa im zatupili konce. Ligovali sa s fragmentom získaným štiepením pNEOL so Smal. Po ukončení ligácie sa transformácia uskutočňovala s kompetentnými bunkami E. coli JM109. Bunky sa vysiali na platne s L-médiom, ktoré obsahovalo IPTG, X-Gal a 40 gg/ml chloramfenikolu. Po inkubácii cez noc sa odobrali modré kolónie a transformované kmene sa získali izoláciou z jednotlivých kolónií.
Z transformovaných kmeňov sa pripravili plazmidy. Plazmidy so štruktúrou, ktorá je schopná produkovať fúzovaný proteín ICDH a LacZ sa označili ako pNEOlCDI, pNEOlCDI, pNEOICD2, pNEOICD3, pNEOICD4, pNEOICD5, pNEOICD6, pNEOICD25, pNEOICD26, respektíve pNEOlCD. Každý z týchto plazmidov alebo pNEOL sa zaviedol elektroporáciou do Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. Transformanty sa selektovali použitím platní s CM2B médiom (s obsahom 10 g/l baktotryptónu, 10 g/l baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI, 10 pg/l biotínu a 15 g/l agaru; pH 7,0), ktoré obsahovali 25 pg/ml kanamycínu a
-2940 gg/ml X-Gal pri 31 °C dva dni. Po ukončení zavádzania sa odobrali takto vytvorené kolónie a izolovali sa ako jednotlivé kolónie. Transformanty obsahujúce pNEOlCDI, pNEOlCDI, pNEOICD2, pNEOICD3, pNEOICD4, pNEOICD5, pNEOICD6, pNEOICD25, pNEOICD26 a pNEOlCD sa označili ako BLAC1, BLAC2, BLAC3, BLAC4, BLAC5, BLAC6, BLAC25, BLAC26, respektíve BNEOL. Všetky transformanty okrem BNEOL vytvárali modré kolónie. Z transformantov sa pripravili surové enzýmové roztoky rovnakým spôsobom ako v kroku (4) v príklade 3, s tým rozdielom, že ako premývací a suspenzný tlmivý roztok bol použitý Z-tlmivý roztok (s obsahom 10 mM KCI, 1 mM MgSO4, 270 gg/100 mM 2-ME a NaPi s pH7,5). Aktivita LacZ sa stanovila nasledovne: Z-tlmivý roztok sa zmiešal so surovým enzýmovým roztokom, do výslednej zmesi sa pridal ONPG v Z-tlmivom roztoku s končenou koncentráciou 0,8 mg/ml a Hitachi spektrofotometrom U-3210 sa stanovovala absorbancia pri 420 nm, pri 30 °C, ako aktivita LacZ. Proteínovým testom (BIO-RAD) sa stanovila koncentrácia proteínu v surovom enzýmovom roztoku. Ako štandardný proteín bol použitý hovädzí sérový albumín. Výsledky sú uvedené v tabuľke 14. Potvrdilo sa, že LacZ aktivita kmeňa, ktorý má mutáciu v icd promótore a exprimuje ICDH-LacZ fúzovaný proteín, je vyššia ako aktivita kmeňa, ktorý exprimuje divý typ ICDH-LacZ fúzovaného proteínu.
Tabuľka 14
Kmeň dABS/min/mg Relatívna aktivita
BNEOL nestanovené 0,0
BNEOLI 42 1,0
BNEOLI-1 84 2,0
BNEOLI-2 168 4,0
BNEOLI-3 80 1,9
BNEOLI-4 126 3,0
BNEOLI-5 139 3,3
BNEOLI-6 84 2,0
BNEOLI-25 168 4,0
BNEOLI-26 170 4,0
(5) Zavedenie mutantného icd génu do teplotné senzitívneho plazmidu pSFKT2 (japonská prihláška vynálezu č. 11-81693) sa použil ako plazmidový vektor, ktorého replikácia v koryneformnej baktérii je citlivá na zmenu teploty. pKF18ICD1, pKF18ICD2, pKF18ICD3, pKF18ICD4, pKF18ICD5, pKF18ICD6, pKF18ICD25 a pKF18ICD26 sa úplne poštiepili s Pstl a získané fragmenty boli použité ako mutantné icd promótorové sekvencie. Takto získané fragmenty sa ligovali do pSFKT2, ktorý bol úplne poštiepený s Pstl. Po ukončení ligácie sa transformácia uskutočnila s kompetentnými bunkami E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Bunky sa vysiali na platne s L-médiom s obsahom 10 pg/ml IPTG, 40 g/ml X-Gal a 25 pg/ml kanamycínu. Po inkubácii cez noc sa odobrali biele kolónie, a transformanty sa získali izoláciou z jednotlivých kolónií. Z transformovaných kmeňov sa pripravili plazmidy. Kyvadlové vektory citlivé na zmenu teploty, obsahujúce icd promótor, sa označili pSFKTH, pSFKTI2, pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25, respektíve pSFKTC26.
(6) Zavedenie mutantného gltA promótora do chromozómu
Plazmidy skonštruované vo vyššie opísanom kroku (5) sa každý samostatne zaviedli do kmeňa Brevibacterium lactofermentum GB02 elektroporáciou. Transformanty sa vyselektovali na platniach s CM2B médiom (10 g/l baktotryptónu, 10 g/l baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI, 10 gg/l biotínu a 15 g/l agaru; pH 7,0) s obsahom 25 μg/ml kanamycínu pri 25 °C. Po ukončení zavádzania sa získané kmene kultivovali v CM2B kvapalnom médiu, po nariedení na koncentráciu 103 až 105 cfu na platňu sa vysiali na CM2B platne s obsahom 25 pg/ml kanamycínu a kultivovali sa pri 34 °C. Kmene z plazmidom citlivým na zmenu teploty sa stali citlivými na kanamycín, pretože replikácia plazmidu sa pri tejto teplote inhibovala, a preto nemohli vytvárať kolónie. Na druhej strane mohol byť vyselektovaný kmeň, ktorý mal plazmidovú DNA integrovanú do chromozómu, pretože mohol vytvárať kolónie. Takto získané kolónie sa odobrali a oddelili sa do izolovaných kolónií. Z kmeňa sa extrahovala chromozomálna DNA. PCR sa uskutočňovala použitím chromozomálnej DNA ako templátu a použili sa primery so sekvenciou uvedenou ako sekv. č. 13 a sekv. č. 15.
-31 Potvrdené boli približne 3kb amplifikované fragmenty. Takto sa potvrdilo, že mutantný icd gén odvodený od plazmidu citlivého na zmenu teploty, sa integroval neďaleko icd génu v hostiteľskom chromozóme homologickou rekombináciou.
(7) Príprava kmeňov so substituovaným icd promótorom
Najprv sa získali kmene citlivé na kanamycín z kmeňov, ktoré majú mutantný icd gén integrovaný homologickou rekombináciou ako bolo opísané v kroku (6). Kmene s integrovaným plazmidom sa nariedili a vysiali na CMM2B platne a potom sa kultivovali pri 34 °C. Po sformovaní kolónií sa vytvorili repliky platní použitím CM2B platni s obsahom 25 pg/ml kanamycínu a kultivovali sa pri 34 °C. Tak sa získali kmene citlivé na kanamycín.
Z kmeňa citlivého na kanamycín sa extrahoval chromozóm a na prípravu icd génových fragmentov sa uskutočňovala PCR s primermi so sekvenciou č. 14 a sekvenciou č. 15. Takto získané amplifikované fragmenty sa purifikovali so SUPRECO2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a podrobili sa sekvenovacej reakcii použitím primeru so sekv. č. 22, aby sa stanovila sekvencia v ich promótorovej oblasti. Výsledné kmene, ktoré mali rovnaké icd promótorové sekvencie ako promótorové sekvencie odvodené od pSFKTH, pSFKTI2, pSFKTI3, pSFKTI4, pSFKTI5, pSFKTI6, pSFKTI25 a pSFKTI26, sa označili ako GC01, GC02, GC03, GC04, GC05, GC06, GC25, respektíve GC26. V týchto kmeňoch bol icd gén divého typu, pôvodne umiestnený na chromozóme, spolu s vektorovým plazmidom vystrihnutý, zatiaľ čo mutantný icd gén zavedený plazmidom ostal na chromozóme, keď sa plazmid a duplikovaný icd gén vystrihli z chromozómu.
(8) Stanovenie izocitrát-dehydroenázovej aktivity v mutantných kmeňoch, ktoré majú mutantný icd promótor
ICDH surový enzýmový roztok sa pripravil použitím každého z 8 kmeňov získaných vo vyššie opísanom kroku (7) a použitím GB02 kmeňa, rovnakým spôsobom ako v kroku (7) v príklade 3. ICDH aktivita sa stanovila nasledovne: Surový enzýmový roztok sa pridal do reakčného roztoku, ktorý obsahoval 35 mM
-32TrisHCI (pH 7,5), 1,5 mM MnS04, 0,1 mM NADP a 1,3 mM kyseliny izocitrónovej a zvýšenie absorbancie pri 340 nm, pri 30 °C sa stanovovalo Hitachi spektrofotometrom U-3210 ako aktivita ICDH. Proteínovým testom (BIO-RAD) sa stanovila koncentrácia proteinu v surovom enzýmovom roztoku. Ako štandardný proteín bol použitý hovädzí sérový albumín. Výsledky sú uvedené v tabuľke 15. Potvrdilo sa, že izocitrát-dehydrogenázová aktivita kmeňov so substituovaným icd promótorom je vyššia ako aktivita rodičovského kmeňa.
Tabuľka 15
Kmeň dABS/min/mg Relatívna aktivita
GB02 3,9 1,0
GC01 8,2 2,1
GC02 19,1 4,9
GC03 7,0 1,8
GC04 12,5 3,2
GC05 19,1 4,9
GC06 10,5 2,7
GC25 30,4 7,8
GC26 24,2 6,2
(9) Výsledky kultivácie kmeňov, ktoré obsahujú substituovaný icd promótor
Každý z 8 kmeňov získaných vyššie opísaným krokom (7) sa kultivoval rovnakým spôsobom ako v kroku (9) v príklade 3. Výsledkom bolo, že sa potvrdilo zlepšenie výťažku kyseliny L-glutámovej, keď sa použil ktorýkoľvek z kmeňov GC02, GC04, GC05, GC25 a GC26, ako je uvedené v tabuľke 16. Zistilo sa, že dobré výsledky sa získajú zavedením mutácie do icd promótora, čím sa zvýši ICDH aktivita najmenej 3 krát.
-33Tabuľka 16
Kmeň
GBÔ2
GC01
GC02
GC03
GC04
GC05
GC06
GC25
GC26
Kyselina L-glutámová (g/dl) “9^
9.0
9.5
9.1
9.4
9.6
9.2
9,9
9,8
Príklad 5
Zavedenie mutácie do PDH génovej promótorovej oblasti koryneformnej baktérie, ktorá produkuje glutamát (1) Klonovanie pdhA génu z koryneformných baktérií
Primery uvedené ako sekv. č. 25 a sekv. č.26 sa syntetizovali výberom oblastí, ktoré majú vysokú homológiu medzi E1 podjednotkami pyruvátdehydrogenázy (PDH) Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Mycobacterium tuberculosis. PCR sa uskutočňovala použitím chromozómu z Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, ktorý sa pripravil bakteriálnym genomickým DNA purifikačným kitom (Advanced Genetic Technologies Corp.), ako templátu, v štandardných reakčných podmienkach opísaných na strane 8 v PCR Technology (editor H. Erlich a vydaná Stockton Press, 1989). Reakčný roztok sa podrobil elektroforéze na agarózovom géli, a zistilo sa, že sa amplifikovali približne 1,3 kilobázové DNA fragmenty. Sekvencia oboch koncov získanej DNA sa stanovila so syntetickými DNA so sekvenciou č. 25 a sekvenciou č.
26. Sekvencia sa stanovila metódou podľa Sangera (J. Mol. Biol., 143-161 (1980)) s DNA sekvenačným kitom (Applied Biosystems Co.). Zo stanovenej sekvencie sa odvodila aminokyselinová sekvencia, ktorá sa porovnala s E1 podjednotkami pyruvátdehydrogenázy odvodenými od Escheríchia coli, Pseudomonas aeruginosa a Mycobacterium tuberculosis, a zistilo sa že sú navzájom vysoko homologické. Z toho vyplynulo, že DNA fragment amplifikovaný prostredníctvom PCR bol časťou phdA génovej rodiny, ktorá kóduje E1 podjednotku pyruvátdehydrogenázy Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. Uskutočnilo sa klonovanie upstream a downstream oblastí génu. Spôsob klonovania bol nasledovný: Chromozóm Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 reštrikčnými enzýmami EcoRI, BamHI, Hindlll, Pstl, Sali a Xbal (Takara Shuzo Co., Ltd.), aby sa získali DNA fragmenty. Na klonovanie bol použitý LA PCR in vitro klonovací kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Sekvencie 27 a 28 boli použité ako primery na klonovanie upstream oblasti a sekvencie 29 a 30 boli požité ako primery na klonovanie downstream oblasti. Po použití PCR kitu boli DNA fragmenty s dĺžkou približne 0,5, 2,5, 3,0, 1,5 a 1,8 kilobáz amplifikované pre downstream oblasť z fragmentov získaných štiepením s EcoRI, Hindlll, Pstl, Sali, respektíve Xbal a DNA fragmenty s dĺžkou približne 1,5, 3,5 a 1,0 kilobáz boli amplifikované pre upstream oblasť z fragmentov získaných štiepením s BamHI, Hindlll, respektíve s Pstl. Sekvencie týchto DNA fragmentov sa stanovili rovnakým spôsobom ako bolo opísané vyššie. Zistilo sa, že amplifikované DNA fragmenty ďalej obsahujú otvorený čítací rámec s dĺžkou približne 920 aminokoselín a aj oblasť, o ktorej sa predpokladá, že je promótorovou oblasťou, a nachádza sa v upstream oblasti. Pretože aminokyselinová sekvencia odvodená od DNA sekvencie otvoreného Čítacieho rámca je vysokohomologická so známou E1 podjednotkou DNA pyruvátdehydrogenázy, ako je E1 podjednotka v E. coli, je zrejmé, že otvoreným čítacím rámcom bol pdhA gén, ktorý kóduje E1 podjednotku pyruvátdehydrogenázy Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. DNA sekvencia otvoreného čítacieho rámca je v Zozname sekvencií uvedená ako sekv. č. 31. V Zozname sekvencií je v sekv. č. 31 znázornená aj aminokyselinová sekvencia odvodená od DNA sekvencie. Keďže metionínový zvyšok na N-konci proteínu je odvodený od ATG, ktorý je iniciačným kodónom, zvyčajne sa netýka základnej funkcie proteínu, a je dobre známe, že metionínový zvyšok na N-konci sa odstraňuje po translácii pôsobením peptidázy. Preto je vo vyššie uvedenom proteíne možné, že metionínový zvyšok na N-konci bol odstránený. Avšak v sekv. č. 31 v Zozname sekvencií sa 6 báz pred ATG nachádza GTG sekvencia, a je tiež možné, že aminokyseliny sa translatujú z tohto
-35bodu. Pyruvátdehydrogenáza iných mikroorganizmov ako E. coli sa skladá z troch podjednotiek E1, E2 a E3, v mnohých prípadoch sú gény, ktoré ich kódujú, tvoria operón. Avšak približne 3 kilobázy downstream od pdhA génu sa nenachádza žiadny otvorený čítací rámec pre E2 a E3 podjednotky pyruvátdehydrogenázy. V skutočnosti sa ukázalo, že sekvencia, o ktorej sa predpokladá, že je terminátorom, sa nachádza downstream od otvoreného čítacieho rámca. Na základe týchto faktov sa predpokladá, že E2 a E3 podjednotky pyruvátdehydrogenázy Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 sa nachádzajú v inej oblasti chromozómu.
(2) Konštrukcia plazmidu na amplifikáciu pdhA:
Už bolo zrejmé, že kmeň získaný zavedením génu, ktorý kóduje tri podjednotky tvoriace PDH E. coli do Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 poskytuje zlepšený výťažok kyseliny glutámovej (JP č. 10-360619). Avšak v PDH Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 bol klonovaný len pdhA gén, ktorý kóduje E1 podjednotku, a neuskutočnili sa žiadne prieskumy, aby sa zistilo, či amplifikácia samotného génu je efektívna na zlepšenie výťažku kyseliny glutámovej. Za týchto okolností sa skúmalo, či je alebo nie je amplifikácia samotného pdhA génu účinná na zlepšenie výťažku kyseliny glutámovej.
Na základe predtým syntetizovaných DNA sekvencií sa syntetizovali primery so sekv. č. 33 a sekv. č. 34. PCR sa uskutočňovala použitím chromozómu Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, ktorý sa pripravil Bakteriálnym Genomickým DNA purifikačným kitom (Advanced Genetic Technologies Corp.), ako templátu, v štandardných reakčných podmienkach opísaných na strane 8 PCR Technology (editovaná H. Erlich a publikovaná Stockton Press, 1989), aby sa amplifikoval pdhA gén. Spomedzi takto syntetizovaných primerov, sekv. č. 33 zodpovedá sekvencii od bázy č. 1397 po bázu 1416 v pdhA géne, ktorá je uvedená ako sekv. č. 32 v Zozname sekvencií. Sekv. č. 34 bolo komplementárne vlákno k DNA sekvencii, ktorá zodpovedá sekvencii od bázy č. 5355 po bázu č. 5374 v sekv. č. 32 v Zozname sekvencii, ktorá je zobrazená od 5' konca.
Takto získaný PCR produkt sa purifikoval bežným spôsobom a pôsobilo sa naň reštrikčnými enzýmami Sali a EcoT22l. Fragment sa ligoval s pSFK (prihláška
-36vynálezu č. 11-69896), ktorý bol poštiepený s reštrikčnými enzýmami Sali a Pstl, ligačným kitom (Takara Shuzo Co., Ltd.). Po transformácii kompetentných buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.) E. coli JM109 sa bunky vysiali na stredné platne s Lmédiom (s obsahom 10 g/l baktotryptónu, 5 g/l baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI a 15 g/l agaru; pH 7,2), ktoré obsahoval 10 pg/ml IPTG (izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid), 40 pg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galaktozid) a 25 pg/ml kanamycínu. Po kultivácii cez noc sa odobrali biele kolónie, a získali sa transformované kmene po izolácii z jednotlivých kolónií.
Alkalickou metódou boli z transformovaných kmeňov pripravené plazmidy (Seibutsu Kogaku Jikken-sho editované Nippon Sibutsu Kogaku kai a vydané Baifukan, str. 105, 1992). Pripravili sa reštrikčné mapy DNA fragmentov začlenených do vektorov a porovnali sa s reštrikčnou mapou pdhA génu znázorneného v sekvencii č. 32 v Zozname sekvencii. Plazmid, ktorý obsahoval DNA fragmenty, ktoré mali rovnakú reštrikčnú mapu ako phdA gén, sa označil pSFKBPDHA.
(3) Zavedenie pASFKBPDHA do Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a GC25 a zhodnotenie fermentačných experimentov
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a GC25 sa transformovali plazmidom pSFKBPDHA elektroporáciou (J.P.Kokai č. 2-207791), aby sa získali transformované kmene. Kultivácia na produkciu kyseliny L-glutámovej sa uskutočňovala s transformovanými kmeňmi ATCC13869/pSFKBPDHA a GC25/pSFKBPDHA, ktoré sa získali zavedením plazrnidu pSFKBPDHA do Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a GC25, nasledovne: Bunky ATCC13869/pSFKBPDHA a GC25/pSFKBPDHA získané kultiváciou na CM2B platniach s obsahom 25 pg/ml kanamycínu, sa inokulovali do média (obsahovalo 1 liter čistej vody s obsahom 80 g glukózy, 1 g KH2PO4, 0,4 g MgSO4.7H2O, 30 g (NH4)2SO41 0,01 g FeSO4.7H2O, 0,01 g MnSO4.7H2O, 15 ml sójového proteínového hydrolyzátu, 200 pg tiamínhydrochloridu, 60 pg biotínu, 25 mg kanamycínu a 50 g CaCO3, pričom pH bolo nastavené na 8,0 s KOH). Potom sa kultúra miešala pri 31,5 °C pokiaľ sa nespotreboval sacharid v médiu. Získané produkty sa inokulovali do
-37média s rovnakým zložením ako bolo opísané vyššie (pre GC25/-SF26 a GC25SF2BDHA) alebo do média s vyššie opísaným zložením, ale bez biotínu (pre ATCC1o869/pSFK6 a ATCC13869/pSFKBPDHA) v množstve 5 % a miešanie kultúry sa uskutočňovalo pri 37 °C pokiaľ sa nespotreboval sacharid v médiu. Ako kontrola sa kmene získané transformáciou elektroporáciou Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869 a GC25 s predtým získaným plazmidom pSFK6, ktorý je schopný autonómne sa replikovať v koryneformnej baktérii (J. P. Kokai č. 2-207791), kultivovali rovnakým spôsobom ako bolo opísané vyššie. Po ukončení kultivácie sa stanovilo množstvo kyseliny L-glutámovej v kultivačnom médiu použitím Biotic Analyzéra AS-210 (produkt firmy Asahi Chemical Industry Co., Ltd.). Výsledky sú uvedené v tabuľke 17.
Tabuľka 17
Kmeň Výťažok kyseliny L-glutámovej (g/dl)
ATCC13869/pSFK 3,6
ATCC13869/pSFKBPDHA 3,8
GC25/pSFK6 5,1
GC25/pSFKBPDHA 5,3
Z týchto výsledkov bolo zrejmé, že aj amplifikácia samostatného pdhA génu je dostatočne účinná na zlepšenie výťažku Glu v Brevibacteríum lactofermentum ATCC 13869 a GC25.
(4) Konštrukcia plazmidov na stanovenie aktivity mutovaného pdhA promótora
Na vytvorenie promótorového mutantu pyruvátdehydrogenázy (PDH), uskutočnilo sa zhodnotenie predtým klonovanej promótorovej oblasti pdhA génu Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869 a uskutočnilo sa aj zhodnotenie rozdielu v expresii, ktorý bol spôsobený modifikáciou promótorovej oblasti, prostredníctvom stanovenia aktivity β-galaktozidázy.
-38Promótorová oblasť pdhA génu sa odhadla na základe DNA sekvencie, ktorá už bola objasnená klonovanim. Výsledkom bolo, že sa predpokladalo, že je možné, že bázy č. 2252 až č. 2257 a č. 2279 až č. 2284 v sekvencii č. 32 v Zozname sekvencii zodpovedajú -35 oblasti, respektíve -10 oblasti. Preto sa syntetizovali plazmidy uvedené ako sekv. č. 35 a sekv. č. 36 v Zozname sekvencii, a DNA fragmenty obsahujúce promótorovú oblasť pdhA génu sa amplifikovali PCR metódou použitím chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 ako templátu. Z týchto syntetizovaných primerov sekv. č. 35 zodpovedá sekvencii v rozsahu od bázy č. 2194 po bázu č. 2221 v sekvencii č. 32, pričom báza č. 2198 bola nahradená cysteínom a bázy č. 2200 a č. 2202 boli nahradené guanínom a bola zavedené sekvencia rozoznávaná Smal reštrikčnou endonukleázou. Sekv. č. 36 zodpovedá sekvencii v rozsahu od bázy č. 2372 po bázu č. 2398 v sekvencii č. 32, pričom báza č. 2393 a č. 2394 bola nahradená guanínom a komplementárne vlákno DNA sekvencie má sekvenciu rozoznávanú reštrikčným enzýmom Smal, ktorá je zavedená na 5'konci. PCR sa uskutočňovala použitím chromozómu Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, ktorý sa pripravil Bakteriálnym Genomickým DNA purifikačným kitom (Advanced Genetic Technologies Corp.), ako templátu, v štandardných reakčných podmienkach opísaných na strane 8 PCR Technology (editor H. Erlich a publikovaná Stockton Press, 1989), aby sa amplifikoval pdhA gén. Takto získaný PCR produkt sa purifikoval bežným spôsobom a reagoval s reštrikčným enzýmom Smal. Fragmenty, sa ligovali s pNEOL, ktorému chýba promótorová oblasť lacZ génu, ktorý sa môže replikovať v koryneformnej baktérii, a ktorý sa poštiepil reštrikčnými enzýmami Smal (Príklad 4 (3) s ligačným kitom (Takara Shuzo Co., Ltd.). Po transformácii kompetentných buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.) E. coli JM109, sa bunky vysiali na platne s L-médiom (s obsahom 10 g/l baktotryptónu, 5 g/l baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI a 15 g/l agaru; pH 7,2), ktoré obsahovalo 40 pg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galaktozid) a 25 μg/ml kanamycínu. Po kultivácii cez noc sa odobrali modré kolónie, a získali sa transformované kmene po izolácii z jednotlivých kolónií. Z transformovaných kmeňov sa pripravili plazmidy alkalickou metódou (Seibutsu Kogaku Jikken-sho, editované Nippon Seibutsu Kogaku-kai a publikované Baifukan, str. 105,1992). Po sekvenovaní
-39DNA fragmentov, ktoré boli do vektora zavedené zvyčajným spôsobom, sa označil plazmid, ktorý obsahuje začlenený DNA fragment, ako pNEOLBPDHAprol.
Ďalšie primery označené ako sekv. č. 37, sekv. 38 a sekv. č. 39 v Zozname sekvencií sa syntetizovali na konštrukciu plazmidov, kde bola oblasť, o ktorej sa predpokladalo, že je promótorové miesto, zamenená za konsenzus sekvenciu promótorov koryneformných baktérií. Použitím týchto primerov a primeru uvedeného ako sekv. č. 36 sa prostredníctvom PCR amplifikovali DNA fragmenty, v ktorých bola promótorové oblasť pdhA génu zamenená za konsenzus sekvenciu, použitím chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 ako templátu. Z týchto syntetizovaných primerov zodpovedá sekv. č. 37 sekvencií siahajúcej od bázy č. 2244 po bázu č. 2273 v sekv. č. 32, pričom báza č. 2255 bola nahradená cytozínom a báza č. 2257 bola nahradená adeninom, takže iba -35 oblasť bola zamenená za konsenzus sekvenciu koryneformných baktérií. Sekv. č. 38 zodpovedá sekvencií v rozsahu od bázy č. 2249 po bázu č. 2288 v sekvencií č. 32, pričom bázy č. 2279 a č. 2281 boli nahradené tymínom, takže iba -10 oblasť bola zamenená za konsenzus sekvenciu koryneformných baktérií. Sekv. č. 39 zodpovedá sekvencií v rozsahu od bázy č. 2249 po bázu č. 2288 v sekvencií č. 32, pričom báza č. 2255 bola nahradená cytozínom, báza č. 2257 bola nahradená adeninom a bázy č. 2279 a č. 2281 boli nahradené tymínom, takže tak -35 oblasť, ako aj -10 oblasť boli zamenené za konsenzus sekvenciu koryneformných baktérií. PCR sa uskutočňovala použitím chromozómu Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, ktorý sa pripravil Bakteriálnym Genomickým DNA purifikačným kitom (Advanced Genetic Technologies Corp.), ako templátu, v štandardných reakčných podmienkach opísaných na strane 8 PCR Technology (editor H. Erlich a publikovaná Stockton Press, 1989), aby sa amplifikovala promótorová oblasť pdhA génu s týmito primermi, aby bola promótorová oblasť zamenená za konsenzus sekvenciu. Takto získaný PCR produkt sa purifikoval bežným spôsobom a reagoval s reštrikčným enzýmom Smal. Fragmenty sa ligovali s pNEOL, ktorému chýba promótorová oblasť lacZ génu, ktorý sa môže replikovať v koryneformnej baktérii, a ktorý sa poštiepil reštrikčnými enzýmami Smal, s ligačným kitom (Takara Shuzo Co., Ltd.). Po transformácii kompetentných buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.) E. coli JM109, sa bunky vysiali na platne s L-médiom (s obsahom 10 g/l baktotryptónu, 5 g/l baktokvasinkového
-40extraktu, 5 g/l NaCI a 15 g/l agaru; pH 7,2), ktoré obsahovalo 40 μg/ml X-Gal (5bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galaktozid) a 25 μg/ml kanamycinu. Po kultivácii cez noc sa odobrali modré kolónie, a získali sa transformované kmene po izolácii z jednotlivých kolónii. Z transformovaných kmeňov sa pripravili plazmidy alkalickou metódou (Seibutsu Kogaku Jikken-sho, editované Nippon Seibutsu Kogaku-kai a publikované Baifukan, str. 105,1992). Po sekvenovaní DNA fragmentov, ktoré boli do vektora zavedené zvyčajným spôsobom, sa označil plazmid, ktorý obsahuje začlenený DNA fragment, kde bola len sekvencia v -35 oblasti zamenená za konsenzus sekvenciu, ako pNEOLBPDHApro35; plazmid obsahujúci začlenené DNA fragmenty, kde bola len -10 oblasť zamenená za konsenzus sekvenciu, sa označil ako pNEOLBPDHAprolO; a plazmid obsahujúci začlenené DNA fragmenty, kde bola tak -35, ako aj -10 oblasť zamenená za konsenzus sekvenciu, sa označil ako pNEOLBPDHApro3510.
(5) Zhodnotenie aktivity mutantného pdhA promótora
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 sa transformoval plazmidmi označenými ako pNEOLBPDHAprol, pNEOLBPDHAprolO a pNEOLBPDHApro3510 elektroporáciou (J.P. Kokai č. 2-207791), aby sa získali transformované kmene, βgalaktozidázová aktivita získaných transformantov sa stanovila spôsobom opísaným v príklade 4(4). V tabuľke 18 sú uvedené β-galaktozidázové aktivity po zámene sekvencie v promótorovej oblasti za konsenzus sekvenciu, pričom enzymatická aktivita β-galaktozidázy v prípade, kde ide o promótorovú oblasť pdhA génu, je uvedená ako 1.
Tabuľka 18
Kmeň β-galaktozidázová aktivita (relatívna hodnota)
ATCC13869/pNEOLBPDHAprol
ATCC13869/pNEOLBPDHApro10
ATCC13869/pNEOLBPDHApro3510
7,5
-41 Z výsledkov vyplýva, že predpokladaná promótorová oblasť bola promótorom pdhA génu, a že expresia PdhA sa môže meniť (zosilniť) zmenou sekvencie v tejto oblasti za konsenzus sekvenciu. Z tejto skutočnosti vyplýva, že je možné zmeniť expresiu bez použitia plazmidu, prostredníctvom zmeny promótorovej oblasti pdhA génu.
(6) Konštrukcia plazmidu na prípravu kmeňa s rôznymi promótormi
Keďže sa potvrdilo, že expresia pdhA sa môže meniť zavedením mutácií do promótora, skonštruovali sa plazmidy na prípravu kmeňov s modifikovaným pdhA promótormi. Skonštruovali sa tri plazmidy pre kmene s modifikovanými promótormi. Pripravili sa plazmidy, kde -35 oblasť, -10 oblasť a aj obe tieto oblasti sa zamenili za konsenzus sekvenciu.
Primery uvedené ako sekv. č. 40 a sekv. č. 41 sa novo syntetizovali na základe DNA sekvencie, ktorá už bola klonovaná. Zo syntetizovaných primerov bola sekv. č. 40 komplementárnym vláknom DNA sekvencie zodpovedajúcej sekvencií v rozsahu od bázy č. 2491 po bázu 2521 v sekv. č. 32, ktorá bola znázornená od 5'konca, a do ktorej bola zavedená sekvencia troch adenínov a následne štyroch tymínov na 5' konci. Sekv. č. 33 bola komplementárnym vláknom ku DNA sekvencií zodpovedajúcej sekvencií v rozsahu od bázy č. 5020 po bázu č. 5039 pdhA génu v sekv. č. 32, ktorá bola uvedená od 5'konca. PCR sa uskutočňovala použitím sekv. č. 33 a sekv. č. 40 ako primerov a chromozómu Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869, ktorý sa pripravil Bakteriálnym genomickým DNA purifikačným kitom (Advanced Genetic Technologies Corp.), ako templátu v štandardných reakčných podmienkach opísaných na strane 8 PCR Technology (editor H. Erlich a publikovaná Stockton Press, 1989). Ďalej sa PCR uskutočňovala použitím sekv. č. 39 a sekv. č. 41 a chromozómu Brevibacteríum lactofermentum ATCC13869 ako templátu. Takto získané PCR produkty sa purifikovali zvyčajným spôsobom. PCR sa uskutočňovala použitím PCR produktov získaných použitím sekv. č. 33 a sekv. č. 40, použitím PCR produktov získaných použitím sekv. č. 39 a sekv. č. 41 a sekv. č. 33 a sekv. č. 41 ako primerov. PCR podmienky boli nasledovné: Koncentrácia týchto štyroch DNA bola 10 μΜ v reakčnej zmesi a bola použitá La taql (Takara Shuzo Co., Ltd.) bez templátu.
-42PCR produkty sa purifikovali zvyčajným spôsobom a reagovali s reštrikčnými enzýmami Sal I a Xho I. Takto získané fragmenty sa ligovali s fragmentárni získanými poštiepením teplotné senzitívneho plazmidu pSFKT2, ktorý sa môže replikovať v koryneformných baktériách, so Sal I, použitím ligačného kitu (Takara Shuzo Co., Ltd.). Po transformácii kompetentných buniek (Takara Shuzo Co., Ltd.) E. coli JM109, sa bunky vysiali na platne s L-médiom (s obsahom 10 g/l baktotryptónu, 5 g/l baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI a 15 g/l agaru; pH 7,2), ktoré obsahovalo 10 pg/ml IPTG (izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid), 40 pg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3indolyl-p-D-galaktozid) a 25 pg/ml kanamycínu. Po kultivácii cez noc sa odobrali biele kolónie, a získali sa transformované kmene po izolácii z jednotlivých kolónií. Z transformovaných kmeňov sa pripravili plazmidy alkalickou metódou (Seibutsu Kogaku Jikken-sho, editované Nippon Seibutsu Kogaku-kai a publikované Baifukan, str. 105, 1992). Po sekvenovaní DNA fragmentov, ktoré boli do vektora zavedené sa porovnala bázová sekvencia so sekvenciou pdhA génu uvedenou ako sekv. č. 32. Plazmid obsahujúci DNA fragmenty, v ktorých boli sekvencie v -35 oblasti a -10 oblasti promótora zamenené za konsenzus sekvencie koryneformných baktérií, sa označili ako pSFKTPDHApro3510.
Plazmid, kde bola -35 oblasť promótora pdhA génu zamenená za konsenzus sekvenciu koryneformných baktérií, a aj plazmid, kde bola -10 oblasť promótora pdhA génu zamenená za konsenzus sekvenciu koryneformných baktérií, sa skonštruovali rovnakým spôsobom ako bolo opísané vyššie, s výnimkou toho, že namiesto sekv. č. 39 zo Zoznamu sekvencii sa použila sekv. č. 37, respektíve sekv. č. 38. Tieto plazmidy boli označené ako pSFKTPDHApro35, respektíve pSFKTPDHAprolO.
(7) Príprava kmeňov s modifikovanými promótormi
Kmene s modifikovaným pdhA génovým promótorom sa pripravili homologickou rekombináciou použitím plazmidu na prípravu kmeňov s rôznymi promótormi, ktoré boli skonštruované vo vyššie opísanom kroku (6).
Najprv sa GC25 transformovali plazmidom pSFKTPDHApro3510 na prípravu kmeňa s modifikovaným promótorom, elektroporáciou (pozri J. P. Kokai č. 2-207791). Bunky sa vysiali na platne s CM2B médiom (obsahovalo 10 g/l polypeptónu, 10 g/l
-43baktokvasinkového extraktu, 5 g/l NaCI, 10 gg/ml biotínu a 15 g/l agaru, pH bolo 7,2) a kultivovali sa pri 25 °C, aby sa získali transformované kmene. Tieto transformaty sa kultivovali v CM2B tekutom médiu v skúmavke cez noc, a potom sa vysiali na platne s CM2B médiom, ktoré obsahovali 25 pg/ml kanamycinu a kultivovali sa pri 34 °C, aby sa získal kmeň vzniknutý jednou rekombináciou, ktorý obsahuje plazmid pSFKTPDHApro3510 zavedený do jeho chromozómu prostredníctvom homologickej rekombinácie. Po izolácii z jednotlivých kolónií sa tento kmeň kultivoval v CM2B kvapalnom médiu v skúmavke cez noc. Po vhodnom nariedení sa vysial na platne s CM2B médiom a kultivoval sa pri 31,5 °C. Po tom, ako sa začali objavovať kolónie sa vytvorili repliky na platne s CM2B médiom, ktoré obsahovali 25 μg/ml kanamycinu, aby sa získali kanamycín senzitívne kmene. Keďže sa mohli vyskytnúť dva druhy kmeňov, tzn. kmene, ktoré majú sekvenciu divého typu kmeňa v promótorovej oblasti pdhA génu a iné kmene, ktoré majú v tejto oblasti zavedenú mutáciu, táto oblasť sa sekvenovala. Tak sa získal kmeň s modifikovaným promótorom, v ktorom bola zavedená mutácia do promótorovej oblasti pdhA génu. V tomto kmeni bola -35 oblasť a -10 oblasť promótora pdhA génu nahradená konsenzus sekvenciou koryneformenej baktérie. Tento kmeň sa označil ako GD3510.
Kmene, kde bola -35 oblasť alebo -10 oblasť promótora pdhA génu zamenená za konsenzus sekvenciu koryneformných baktérií, sa získali rovnakým spôsobom ako bolo opísané vyššie, s výnimkou toho, že vyššie opísaný plazmid pSFKTPDHApro3510 na prípravu kmeňa s modifikovaným promótorom, bol nahradený plazmidmi pSFKTPDHApro35 a pSFKTPDHAprolO na výrobu kmeňov s modifikovanými promótormi, a tieto boli označené GD35, respektíve GD10.
(8) Zhodnotenie výsledkov kultivovania kmeňov s modifikovaným pdhA génovým promótorom v bankách
Kultivácia v bankách na produkciu kyseliny L-glutámovej sa uskutočňovala s troma druhmi kmeňov, v ktorých boli modifikované pdhA génové promótory, ktoré sa získali ako bolo opísané vyššie. Každá z buniek kmeňov GD3510, GD35, GD10 a GC25, ktoré majú modifikovaný promótor, a ktoré boli získané kultiváciou na platniach s CM2B médiom, sa inokulovali do média (obsahovalo 11 čistej vody s obsa
-44hom 30 g glukózy, 1 g KH2PO4, 0,4 g MgSO4.7H2O, 30 g (NH4)2SO4, 0,01 g FeSO4.7H2O, 0,01 g MnSO4.7H2O, 15 ml sójového proteínového hydrolyzátu, 200 pg tiamínhydrochloridu, 60 pg biotínu a 50 g CaCO3, pričom pH bolo nastavené na 8,0 s KOH). Potom sa kultúra miešala pri 31,5 °C pokiaľ sa nespotreboval sacharid v médiu. Získané produkty sa inokulovali do média s rovnakým zložením ako bolo opísané v množstve 5 % a miešanie kultúry sa uskutočňovalo pri 37 °C pokiaľ sa nespotreboval sacharid v médiu. Po ukončení kultivácie sa stanovilo množstvo kyseliny L-glutámovej naakumulované v kultivačnom médiu použitím Biotic Analyzéra AS-210 (produkt firmy Asahi Chemical Industry Co., Ltd.). Výsledky sú uvedené v tabuľke 19.
Tabuľka 19
Kmeň Výťažok kyseliny L-glutámovej (g/dl)
GČ25L9
GD352,0
GD102,0
GD35102,1
Z výsledkov bolo zrejmé, že získané kmene s modifikovanými promótormi poskytujú zlepšené Glu výťažky.
Príklad 6
Zavedenie mutácie do promótorovej oblasti génu pre arginosukcinátsyntázu (1) Stanovenie DNA sekvencie nad argG génom
Aby sa amplifikoval argG gén Brevibacterium flavum prostredníctvom PCR, stanovili sa DNA sekvencie v upstream a downstream oblastiach ORF. Stanovenie DNA sekvencií sa uskutočňovalo prostredníctvom syntetizovania primeru založeného na známej DNA sekvencií (GenBank AF030520) ORF argG génu Corynebacterium giutamicom a použitím in vitro LA PCR klonovacieho kitu (Takara Shuzo Co., Ltd.) v
-45súlade s inštrukciou podľa manuálu priloženému ku kitu. Ako primery boli špecificky použité oligonukleotídy (primery 1 a 2), ktoré majú DNA sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 42 a sekv. č. 43 pre upstream oblasť a oligonukleotídy (primery 3 a 4), ktoré majú DNA sekvencie uvedené ako sekv. č. 44 a sekv. č. 45 pre downstream oblasť. DNA sekvencie v upstream a downstream oblasti argG sa stanovili kompletným štiepením chromozomálnej DNA kmeňa 2247 (ATCC14067), tzn. divého typu kmeňa Brevibacterium flavum, reštrikčným enzýmom EcoRI, pričom sa prvá PCR uskutočňovala s primermi 2 alebo 3 (so sekvenciou č. 43 alebo 44) a druhá PCR s primermi 1 alebo 2 (so sekvenciou č. 42 alebo 45).
(2) Odhadnutie promótorovej oblasti
Sekvencia podobná promótoru v upstream ORF argG génu sa prehľadávala z hľadiska vyššie opísaných sekvencií komerčne dostupným softwarom (GENETYX). Do oblasti s najvyšším skóre sa zaviedla mutácia (približne 120 bp upstream od prvého ATG). Potom sa merala promótorová aktivita.
(3) Zavedenie mutácií do promótorovej sekvencie a stanovenie aktivity mutantných promótorov
Pre oblasť s najvyšším skóre boli použité primery zavádzajúce mutáciu 9, 10, 11, 12 alebo 13 a 17 (so sekvenciou č. 50, 51, 52, 53, 54 alebo 48) a PCR sa uskutočňovala s chromozomálnou DNA kmeňa AJ 12092 ako templátom. Druhá PCR sa uskutočňovala s rovnakou chromozomálnou DNA ako templátom, použitím PCR produktu ako primeru pre 3'-koniec a aj použitím primeru 8 so sekvenciou č. 49 ako primeru pre 5'-koniec, aby sa získali DNA fragmenty s mutáciou zavedenou do zamýšľanej promótorovej oblasti. Na stanovenie aktivity mutantných promótorov sa tieto DNA fragmenty zaviedli do Smal miesta promótorového sondového vektora pNEOL, tak, aby boli v rovnakom smere ako lacZ reporterový gén, čím sa získali plazmidy pNEOL-1, pNEOL-2, pNEOL-3, pNEOL-4 a pNEOL-7. Ako kontrola sa skonštruoval plazmid pNEOL-Ο zavedením DNA fragmentu získaného prostred
-46níctvom PCR použitím chromozomálnej DNA kmeňa AJ12092 a primerov 7 a 8, do upstream oblasti lacZ génu pNEOL.
Každý z pNEOL-1, pNEOL-2, pNEOL-3, pNEOL-4 a pNEOL-7 sa zaviedol do AJ12092. Plazmidy sa zaviedli elektroporáciou (J. P. Kokai č. 2-207791). Transformanty sa selektovali na platniach s CM2G médiom (obsahovalo 1 I čistej vody s 10 g polypeptónu, 10 g kvasinkového extraktu, 5 g glukózy, 5 g NaCI a 15 g agaru a malo pH 7,2) s obsahom 4 pg/ml chloramfenikolu, ako chloramfenikol rezistentné kmene.
Každý z kmeňov sa vysial na agarové médium (obsahovalo 0,5 g/dl glukózy, 1 g/dl polypeptónu, 1 g/dl kvasinkového extraktu, 0,5 g/dl NaCI a 5 pg/l chloramfenikolu) a kultivoval sa pri 31,5 °C 20 hodín. Jeden diel takto získaných buniek sa inokulovalo do média (obsahovalo 3 g/dl glukózy, 1,5 g/dl síranu amónneho, 0,1 g/dl KH2PO4, 0,04 g/dl MgSO4, 0,001 g/dl FeSO4, 0,01 g/dl MnSCl·», 5 pg/dl VB1t 5 pg/dl biotínu a 45 mg/dl (vzhľadom na N) sójového hydrolyzátu). Po kultivácii pri 31,5 °C počas 18 hodín sa stanovila β-galaktozidázová aktivita získaných buniek, ako bolo opísané v príklade 4(4).
Keďže, ako je uvedené v tabuľke 20, bola detegovaná β-galaktozidázová aktivita pri AJ12092/pNEOL-0, zistilo sa, že DNA fragment začlenený do upstream oblasti génu lacZ, funguje ako promótor. Navyše, β-galaktozidázová aktivita každého kmeňa, do ktorého bol zavedený plazmid, bola vyššia ako aktivita AJ12092/pNEOL-0. Takže sa zistilo, že transkripčná aktivita sa zvyšuje zavedením mutácie do sekvencie podobnej promótoru, ako je uvedené v tabuľke 20.
Tabuľka 20
Relatívna aktivita (AJ12092/pNEOL-0=1)
AJ 12092 nd
AJ12092/pNEOL-0 1,0
AJ12092/pNEOL-1 2,8
AJ12092/pNEOL-2 2,7
AJ12092/pNEOL-3 1,8
AJ12092/pNEOL-4 0,8
AJ12092/pNEOL-7 3,0
(4) Konštrukcia plazmidu na zavedenie mutácie
PCR sa uskutočňovala použitím primerov 14 a 15 (ktoré majú sekvenciu sekv. č. 55 a sekv. č. 56), s chromozomálnou DNA kmeňa AJ 12092 ako templátu. Takto získané DNA fragmenty sa začlenili do Smal miesta v polyklonovacom mieste klonovacieho vektora pHSG398 (produkt firmy TaKaRa), čím sa skonštruoval plazmid pO. Potom sa pO poštiepil s reštrikčnými enzýmami EcoRV a BspHI a aj pNEOL-3 a pNEOL-7 sa poštiepili s reštrikčnými enzýmami EcoRV a BspHI. Takto získané DNA fragmenty sa ligovali, aby sa získali plazmidy so zavedenou mutáciou p3 (mutant bol odvodený od primeru zavádzajúceho mutáciu č. 11) a p7 (mutant bol odvodený od primeru zavádzajúceho mutáciu č. 13).
(5) Zavedenie plazmidov zavádzajúcich mutáciu do Arg-produkujúcej baktérie
Každý z takto získaných plazmidov sa zaviedol do Arg-produkujúcej baktérie kmeňa Brevibacterium lactofermentum AJ 12092 elektroporáciou (J. P. Kokai č. 2207791). Keďže sa tieto plazmidy nemohli autonómne replikovať v Brevibacterium, mohli byť ako Cm-rezistentné kmene selektované len kmene, ktoré sa získali zavedením týchto plazmidov do chromozómu homologickou rekombináciou. Kmene, v ktorých sa plazmid zavádzajúci mutáciu zaviedol do chromozómu, sa vyselektovali ako chloramfenikol-rezistentné kmene na platniach s CM2G médiom (obsahovalo 1 liter čistej vody s obsahom 10 g polypeptónu, 10 g kvasinkového extraktu, 5 g glukózy, 5 g NaCI a 15 g agaru, a malo pH 7,2), ktoré obsahovalo 5 pg/ml chloramfenikolu. Potom sa vybrali tie Cm-senzitívne kmene, v ktorých bola promótorova oblasť argG génu nahradená zamýšľanou modifikovanou sekvenciou.
Ako výsledok sa získal kmeň substituovaný s P3 sekvenciou (AJ12092-P3) a kmeň substituovaný s P7 sekvenciou (AJ12092-P7).
(6) Klonovanie argG génu
Na základe DNA sekvencie, ktorá bola stanovená ako bolo opísané v bode (1), sa syntetizovali oligonukleotidy (primery 5 a 6), ktoré majú DNA sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 46, respektíve sekv. č. 47, na uskutočňovanie PCR použitím DNA Brevibacteríum flavum ako templátu. PCR reakcia sa uskutočňovala v 25 cykloch, pričom každý cyklus pozostával s 94 °C počas 30 sekúnd, 55 °C počas jednej sekundy a 72 °C počas 2 minút a 30 sekúnd. Takto získaný DNA fragment sa klonoval do Smal miesta v polyklonovacom mieste klonovacieho vektora pSTV29 (Takara Shuzo Co., Ltd.), čím sa získal pSTVargG. Navyše sa pripravil pargG zavedením fragmentu, ktorý obsahuje počiatok replikácie, a ktorý sa získal ošetrením pSAK4 so Sali, ako je uvedené v príklade 1, do Sali miesta pSTVargG.
(7) Zavedenie pargG do Brav.
pargG sa zaviedol do kmeňa Brevibacteríum lactofermentum AJ 12092. Plazmid sa zaviedol elektroporáciou (J. P. Kokai č. 2-207791). Transformanty sa selektovali ako chloramfenikol rezistentné kmene na platniach s CM2G médiom (obsahovalo 1 liter čistej vody s obsahom 10 g polypeptónu, 10 g kvasinkového extraktu, 5 g glukózy, 5 g NaCI a 15 g agaru, a malo pH 7,2), ktoré obsahovalo 4 pg/ml chloramfenikolu.
(8) ArgG aktivita kmeňov s modifikovanými promótormi
Stanovovali sa ArgG aktivity vyššie opísaných dvoch druhov kmeňov s modifikovanými argG promótormi a kmeňa získaného amplifikáciou argG s plazmidom (AJ12092/pargG). Každý z týchto kmeňov sa vysial na agarové médium (obsahovalo 0,5 g/dl glukózy, 1 g/dl polypeptónu, 1 g/dl kvasinkového extraktu, 0,5 g/dl NaCI a 5 pg/l chloramfenikolu) a kultivovali sa pri 31,5 °C 20 hodín. Jeden diel takto získaných buniek sa inokulovalo do média (obsahovalo 3 g/dl glukózy, 1,5 g/dl síranu amónneho, 0,1 g/dl ΚΗζΡΟλ, 0,04 g/dl MgSO4, 0,001 g/dl FeSO4, 0,01 g/dl MnSO4, 5pg/dl VBi, 5 μ g/dl biotínu a 45 mg/dl (vzhľadom na N) sójového hydrolyzátu). Po kultivácii pri 31,5 °C počas 18 hodín sa stanovila ArgG aktivita takto získaných buniek spôsobom opísaným vyššie (Journal of Generál Microbiology (1990), 136, 1177-1183). ArgG aktivity dvoch vyššie opísaných druhov kmeňov s modifikovaným argG promótorom a kmeňa (AJ12092/pargG), ktorý sa získal
-49amplifikáciou argG s plazmidom, sú uvedené v tabuľke 21. Z tabuľky 21 je zrejmé, že zavedením mutácie do promótora sa ArgG aktivita AJ12092-P3 zvýšila približne dvakrát v porovnaní s aktivitou rodičovského kmeňa, a aktivita AJ12092-P7 sa zvýšila približne tri krát v porovnaní s aktivitou rodičovského kmeňa. ArgG aktivita AJ12092/pargG bola približne 4,5 krát vyššia ako aktivita rodičovského kmeňa.
Tabuľka 21
Relatívna aktivita (AJ 12092=1)
AJ/120921,0
AJ/12092-P32,1
AJ/12092-P72,9
AJ/12092/pargG4,4
Príklad 7
Zavedenie mutácie do GDH génovej promótorovej oblasti koryneformnej baktérie, ktorá produkuje glutamát (1) Konštrukcia mutantných gdh plazmidov
Miestne špecifickou mutagenézou sa skonštruovali plazmidy, ktoré mali GDH promótorovú sekvenciu FGR1 kmeňa a FGR2 kmeňa opísaných v príklade 2. Na získanie GDH promótorovej sekvencie FGR1 kmeňa sa uskutočňovala PCR použitím syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 57 a syntetickej DNA uvedenej ako sekvencia č. 60 ako primerov a použitím chromozomálnej DNA ATCC13869 ako templátu. Na druhej strane sa uskutočňovala PCR použitím syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 58 a syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 59 ako primerov, a použitím chromozomálnej DNA ATCC13869 ako templátu. Ďalej sa uskutočňovala PCR použitím syntetických DNA uvedených ako sekv. č. 57 a sekv. č. 58 ako primerov, so zmesou týchto PCR produktov ako templátu. Takto získaný PCR produkt sa začlenil do Smal miesta pSFT2 (japonská prihláška vynálezu č. 11-69896), aby sa skonštruoval pSFKTGH. Na získanie GDH promótorovej sekvencie FGR2 kmeňa sa
-50uskutočňovala PCR použitím syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 57 a syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 62 ako primerov a použitím chromozomálnej DNA ATCC13869 ako templátu. Na druhej strane sa uskutočňovala PCR použitím syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 58 a syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 61 ako primerov a použitím chromozomálnej DNA ATCC13869 ako templátu. Ďalej sa uskutočňovala PCR použitím syntetickej DNA uvedenej ako sekv. č. 57 a sekv. č. 58 ako primerov a použitím zmesi týchto PCR produktov ako templátu. Takto získaný PCR produkt sa začlenil do Smal miesta pSFKT2 japonská prihláška vynálezu č. 1169896), čím sa skonštruoval pSFKTG07. Stanovili sa DNA sekvencie fragmentov zavedených do Smal miest pSFKTGH a pSFKTG07, aby sa potvrdilo že sa nezaviedla žiadna mutácia do iných oblastí, ako do promótorovej oblasti v GDH.
(2) Konštrukcia kmeňov s modifikovaným gdh promótorom
Potom sa pSFKTGH a pSFKTG07 zaviedli elektroporáciou do kmeňa AJ13029 a selektovali sa transformanty, ktoré rástli na CM2B platniach s obsahom 25 pg/ml kanamycínu pri 25 °C. Transformanty sa kultivovali pri 34 °C, aby sa vyselektovali kmene, ktoré sú rezistentné voči kanamycínu pri 34 °C. Skutočnosť, že kmeň je rezistentný na kanamycín pri 34 °C indikuje, že pSFKTG11 alebo pSFKTG07 sa integrovali do chromozómu kmeňa AJ13029. Kanamycín senzitívne kmene sa získali z kmeňov, v ktorých sa plazmid integroval do chromozómu. Stanovili sa GDH promótorové sekvencie týchto kmeňov. Kmene, ktoré mali rovnaké gdh promótorové sekvencie ako sekvencie pSFKTG11 a pSFKTG07, sa zonačili ako GA01, respektíve GA02.
(3) Potvrdenie produktivity kyseliny L-glutámovej kmeňov s modifikovaným gdh promótorom
Produktivita kyseliny glutámovej kmeňmi GA01 a GA02 a rodičovského kmeňa AJ 13029 sa potvrdzovala rovnakým spôsobom ako v príklade 2(2) uvedenom vyššie. Výsledkom bolo značné zlepšenie akumulácie kyseliny glutámovej pri kmeňoch GA01 a GA02, ako je uvedené v tabuľke 23.
-51 Tabuľka 23
Kmeň Glu (g/dl) Špecifická aktivita GDH Relatívna hodnota
AJ 13029 2,6 7,7 1,0
GA01 3,0 22,3 2,9
GA02 2,9 27,0 3,5
(4) Konštrukcia samoklonovacieho typu gdh plazmidu
Najprv sa skonštruoval samoklonovací vektor pAJ220. pAJ226 (J. P. Kokai č. 61-152289) sa ošetril s EcoRV a PstI, aby sa pripravil fragment, ktorý obsahoval oblasť, ktorá sa mohla autonómne replikovať v koryneformnej baktérii. Fragment sa ligoval s približne 0,7 kb DNA fragmentom, ktorý sa získal ošetrením pAJ224 (J. P. Kokai č. Sho 61-152289) s EcoRV a PstI, čím sa získal plazmid pAJ220. Tento plazmid sa mohol autonómne replikovať v koryneformnej baktérii a mohol poskytnúť hostiteľovi rezistenciu voči trimetoprimu.
PCR reakcia sa uskutočňovala použitím syntetických DNA so sekv. č. 63 a sekv. č. 64 ako primerov a použitím chromozomálnej DNA divého typu koryneformnej baktérie kmeňa ATCC13869 ako templátu. Takto získaný gdh génový fragment sa zaviedol do Balí miesta pAJ220, čím sa skonštruoval pAJ220G. Promótor sa umiestnil neďaleko Balí miesta pAJ200 a expresia zavedeného génu bola zvýšená v závislosti od smeru zavedenia génu do Balí miesta. PAJ220G a pGDH sa zaviedli do ATCC13869 kmeňa elektroporáciou. GDH aktivity takto skonštruovaných kmeňov sa stanovili spôsobom uvedeným vo vyššie opísanom kroku (1). Výsledkom bolo, že GDH aktivita kmeňa, do ktorého bol zavedený pAJ220G bola približne 1,5 krát vyššia ako aktivita kmeňa, do ktorého bol zavedený dGDH, ako je uvedené v tabuľke 24.
Tabuľka 24
Kmeň Špecifická aktivita GDH Relatívna hodnota
ATCC13869 7,7 1,0
ATCC13869/pGDH 82,7 10,7
ATCC13869/pAJ220G 120,1 15,6
-52(5) Prieskum vplyvu gdh aktivity na výťažok vedľajšieho produktu - Asp pGDH a pJ220G sa zaviedli do AJ13029 elektroporáciou. Každý z týchto kmeňov a kmeňov získaných v kroku (2) sa inokuloval do očkovacieho kultivačného média, ktoré malo zloženie uvedené v tabuľke 25 a kultúra sa pretrepávala pri 31,5 °C počas 24 hodín, aby sa získala očkovacia kultúra. 300 ml média na hlavnú kultiváciu, ktoré malo zloženie uvedené v tabuľke 25 sa nalialo do 500ml sklenených nádob na fermentáciu a potom sa sterilizovalo zahrievaním. Do média sa inokulovalo 40 ml očkovacej kultúry, ktorá bola opísaná vyššie. Kultivácia začala pri teplote 31,5 °C, pričom rýchlosť premiešavania bola udržiavaná medzi 800 a 1300 rpm a prevzdušňovači pomer medzi 1/2 a 1/1. pH tekutej kultúry sa udržiavalo plynným amoniakom na 7,5. 8 hodín po začiatku kultivácie sa teplota zvýšila na 37 °C. Kultivácia sa zastavila, keď sa úplne spotrebovala glukóza, po 20 až 40 hodinách, a stanovilo sa množstvo kyseliny L-glutámovej akumulovanej v tekutom médiu (tabuľka 26). GDH aktivita pri najvyššom výťažku bola približne trojnásobná. Keď sa ďalej zvyšovala GDH aktivita, znižoval sa stupeň zlepšenia výťažku. Aminokyseliny produkované ako vedľajšie produkty sa analyzovali Hitachi aminokyselinovým analyzátorom L-8500, pričom sa zistilo, že so zvyšovaním GDH aktivity sa zvyšuje množstvo akumulovanej kyseliny asparágovej a alanínu. Tieto výsledky potvrdili nasledujúce fakty: Na zvýšenie výťažku kyseliny glutámovej je nevyhnutné vhodne zvýšiť GDH aktivitu, tak, aby sa nespôsobil značný pokles množstva kyselina asparágovej a alanínu. Jedna z účinných metód zahŕňa zavedenie rôznych mutácií do gdh promótora na riadenie GDH aktivity tak, aby bola približne trojnásobne zvýšená v porovnaní s rodičovským kmeňom.
Tabuľka 25
Koncentrácia
Zložka Očkovacia kultúra Hlavná kultúra
Glukóza 50 g/l 150 g/l
KH2PO4 1 g/l 2 g/l
MgSO4.7H2O 0,4 g/l 1.5 g/l
FeSO4.7H2O 10 mg/l 15 mg/l
MnSO4.4H2O 10 mg/l 15 mg/l
Sójový proteínový hydrolyzát 20 mg/l 50 mg/l
Biotín 0,5 mg/ml 2 mg/l
Hydrochlorid tiamínu 2 mg/l 3 mg/l
Tabuľka 26
Kmeň Glu (9/dl) Asp Ala (mg/dl) Relatívna aktivita GDH Relatívna hodnota
AJ 13029 8,3 49 60 7,7 1,0
GA01 9,0 145 152 22,3 2,9
GA02 8,9 153 155 27,0 3,5
AJ13029/pGDH 8,8 201 190 82,7 10,7
AJ13029/pAJ220G 7,5 290 590 120,12 15,6
-54Zoznam sekvencii <110> Ajinomoto Co. Inc.
<120> Spôsob konštrukcie baktérií, ktoré produkujú aminokyseliny a spôsob prípravy aminokyselín fermentáciou skonštruovaných baktérií, ktoré produkujú aminokyseliny <130> OP 99052 <150> JP 10-271786 <151> 1998-9-25 <150> JP 10-271787 <151> 1998-9-25 <160>6 <210> 1 <211 >46 <212> nukleová kyselina <400> 1 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt <210>2 <211 >46 <212> nukleová kyselina <400> 2 ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt <210> 3 <211 >46 <212> nukleová kyselina <400> 3 ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210>4 <211 >46 <212> nukleová kyselina <400> 4
-55ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210 5 <211 >46 <212> nukleová kyselina <400 5 ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210>6 <211 >46 <212> nukleová kyselina <400> 6 ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt <210>7 <211> 30 <212> nukleová kyselina <220> primér A na klonovanie gltA z Brevibacterium lactofermentum <400 7 gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg <210>8 <211>30 <212> nukleová kyselina <220> primér B na klonovanie gltA z Brevibacterium lactofermentum <400> 8 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt <210>9 <211 >20 <212> nukleová kyselina <220> primér 1 na zavedenie mutácie do gltA promótora <400> 9 atcggtataa cgtgttaacc
-56<210> 10 <211 >20 <212> nukleová kyselina <220> primér 2 na zavedenie mutácie do gltA promótora <400> 10 atcggtataa tgtgttaacc <210> 11 <211 >40 <212> nukleová kyselina <220> primér 4 na zavedenie mutácie do gltA promótor <400> 11 gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc <210> 12 <211> 28 <212> nukleová kyselina <220> gltA promótorový sekvenčný primér <400> 12 agggatccgt ccagtctcag acagcatc <210> 13 <211> 17 <212> nukleová kyselina <220> univerzálny primér M13RV <400> 13 caggaaacag ctatgac <210> 14 <211> 20 <212> nukleová kyselina <220> primér A na klonovanie ICDH <400> 14
-57gaattcgctc ccggtgcagc <210> 15 <211 >20 <212> nukleová kyselina <220> primer B na klonovanie ICDH <400> 15 gatgcagaat tccttgtcgg <210> 16 <211>28 <212> nukleová kyselina <220> primer 1 na zavedenie mutácie do ICD promótora <400> 16 tggattgctg gctataatgg tgtcgtga <210> 17 <211> 53 <212> nukleová kyselina <220> primer 2 na zavedenie mutácie do ICD promótora <400>17 caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga <210> 18 <211 >53 <212> nukleová kyselina <220> primer 3 na zavedenie mutácie do ICD promótora <400> 18 caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga <210> 19 <211 >28 <212> nukleová kyselina <220> primer 4 na zavedenie mutácie do ICD promótora
-58<400> 19 ggctgaaact gctataatag gcgccagc <210> 20 <211> 51 <212> nukleová kyselina <220> primér 5 na zavedenie mutácie do ICD promótora <400> 20 ggaaacacgg cgttgccatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c <210> 21 <211> 51 <212> nukleová kyselina <220> primér 6 na zavedenie mutácie do ICD promótora <400> 21 ggaaacacgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c <210> 22 <211 >22 <212> nukleová kyselina <220> ICD promótorový sekvenčný primér <400> 22 gtgcgggtcc agatgatctt ag <210> 23 <211 >20 <212> nukleová kyselina <220> primér A na amplifikáciu nptll <400> 23 gggatcccgg atgaatgtca <400> 24 <211 >23 <212> nukleová kyselina
-59<220> primer B na amplifikáciu nptll <400> 24 gcccggggtg ggcgaagaac tcc <210> 25 <211> 23 <212> nukleová kyselina <220> primer amplifikáciu Brevibacterium lactofermentum pdhA génu LA <400> 25 aci gti tci atg ggi cti ggi cc <210> 26 <211> 23 <212> nukleová kyselina <220> primer amplifikáciu Brevibacterium lactofermentum pdhA génu LA <400> 26 cct tci ccg tti agi gti gti cg <210> 27 <211 >30 <212> nukleová kyselina <220> primer na in vitro klonovanie Brevibacterium lactofermentum pdhA génu LA <400> 27 ttg cag tta acc acg aag gtc agg ttg tcc <210> 28 <211> 30 <212> nukleová kyselina <220> primer na in vitro klonovanie Brevibacterium lactofermentum pdhA génu LA <400> 28 tgg atg aga cca cgt gat tet ggc tcg tcc <210> 29 <211 >30
-60<212> nukleová kyselina <220> primer na in vitro klonovanie Brevibacterium lactofermentum pdhA génu LA <400> 29 aca gat cct gca ega agg cat caa ega ggc <210> 30 <211> 30 <212> nukleová kyselina <220> primer na in vitro klonovanie Brevibacterium lactofermentum pdhA génu LA <400>
tca tcg ctg cgg gta cct cct acg cca ccc <210> 31 <211> 2766 <212> nukleová kyselina <213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 <220> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 pdhA gén LA <400> 31
atg gcc gat caa gca Ala 5 aaa Lys ctt ggt ggt aag ccc tcg gat gac tet aac Ser Asn 48
Met Ala 1 Asp Gin Leu Gly Gly Lys 10 Pro Ser Asp Asp 15
ttc gcg atg atc ege gat ggc gtg gca tet tat ttg aac gac tca gat 96
Phe Ala Met íle Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp
20 25 30
ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tca ctc gac gga tta ctc cag 144
Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gin
35 40 45
gag tet tet cca gaa cgt get cgt tac ctc atg ctt cgt ttg ctt gag 192
Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu
50 55 60
cgt gca Arg Ala 65 tct Ser gca aag cgc gta tct ctt ccc cca atg acg tca acc gac 240
Ala Lys Arg 70 Val Ser Leu Pro Pro 75 Met Thr Ser Thr Asp 80
tac gtc aac acc att cca acc tct atg gaa cct gaa ttc cca ggc gat 288
Tyr Val Asn Thr íle Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp
85 90 95
gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att cgc tgg aac gca gcc 336
Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp íle Arg Trp Asn Ala Ala
100 105 110
atc atg gtt cac cgc get cag ega cca ggc atc ggc gtc ggc gga cac 384
íle Met Val His Arg Ala Gin Arg Pro Gly íle Gly Val Gly Gly His
115 120 125
att tcc act tac gca ggc gca gcc cct ctg tac gaa gtt ggc ttc aac 432
íle Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn
130 135 140
cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc ggc gac cag atc ttc 480
His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gin íle Phe
145 150 155 160
ttc cag ggc cac gca tca cca ggt atg tac gca cgt gca ttc atg gag 528
Phe Gin Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu
165 170 175
ggt cgc ctt tct gaa gac gat ctc gat ggc ttc cgt cag gaa gtt tcc 576
Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gin Glu Val Ser
180 185 190
cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac cca cac ggt atg aag 624
Arg Glu Gin Gly Gly íle Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys
195 200 205
gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt ctt ggc cca atg gat 672
Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp
210 215 220
gcc Ala 225 att íle tac cag gca cgt ttc aac cgc tac ctc gaa aac cgt ggc atc 720
Tyr Gin Ala Arg 230 Phe Asn Arg Tyr Leu 235 Glu Asn Arg Gly íle 240
aag gac acc tct gac cag cac gtc tgg gcc ttc ctt ggc gac ggc gaa 768
Lys Asp Thr Ser Asp Gin His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu
245 250 255
atg gac gag cca gaa tca cgt ggt ctc atc cag cag get gca ctg aac 816
Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu íle Gin Gin Ala Ala Leu Asn
260 265 270
aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc aac ctg cag cgt ctc 864
Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gin Arg Leu
275 280 285
gac gga cct gtc cgc ggt aac acc aag atc atc cag gaa ctc gag tcc 912
Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys íle íle Gin Glu Leu Glu Ser
290 295 300
ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tct gtg atc aag gtt gtt tgg ggt cgc 960
Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val íle Lys Val Val Trp Gly Arg
305 310 315 320
gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat ggt gca ctt gtt gag 1008
Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp Gly Ala Leu Val Glu
325 330 335
atc atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag acc ttc aag get aac 1056
íle Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin Thr Phe Lys Ala Asn
340 345 350
gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga cgt gac cca cgc acc 1104
Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr
355 360 365
gca aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa atc tgg aag ctg cca 1152
Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu íle Trp Lys Leu Pro
370 375 380
cgt ggc ggc cac gat tac cgc aag gtt tac gca gcc tac aag ega get 1200
Arg 385 Gly Gly His Asp Tyr 390 Arg Lys Val Tyr Ala 395 Ala Tyr Lys Arg Ala 400
ctt gag acc aag gat cgc cca acc gtc atc ctt get eac acc att aag 1248
Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val íle Leu Ala His Thr íle Lys
405 410 415
ggc tac gga ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt aac gca acc cac cag 1296
Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gin
420 425 430
atg aag aag ctg acg ctt gat gat ctg aag ttg ttc cgc gac aag cag 1344
Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gin
435 440 445
ggc atc cca atc acc gat gag cag ctg gag aag gat cct tac ctt cct 1392
Gly íle Pro íle Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro
450 455 460
cct tac tac cac cca ggt gaa gac get cct gaa atc aag tac atg aag 1440
Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu íle Lys Tyr Met Lys
465 470 475 480
gaa cgt cgc gca gcg ctc ggt ggc tac ctg cca gag cgt cgt gag aac 1488
Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn
485 490 495
TAC GAT CCA ATT CAG GTT CCA CCA CTG GAT AAG CTT CGC TCT GTC CGT 1536
Tyr Asp Pro íle Gin Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Val Arg
500 505 510
aag ggc tcc ggc aag cag cag atc get acc act atg gcg act gtt cgt 1584
Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin íle Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg
515 520 525
acc ttc aag gaa ctg atg cgc gat aag ggc ttg get gat cgc ctt gtc 1632
Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val
530 535 540
cca atc att cct gat Asp gag gca Glu Ala 550 cgt acc ttc ggt ctt gac tet tgg ttc 1680
Pro 545 íle íle Pro Arg Thr Phe Gly 555 Leu Asp Ser Trp Phe 560
cca acc ttg aag atc tac aac ccg cac ggt cag aac tac gtg cct gtt 1728
Pro Thr Leu Lys íle Tyr Asn Pro His Gly Gin Asn Tyr Val Pro Val
565 570 575
gac cac gac ctg atg ctc tcc tac cgt gag gca cct gaa gga cag atc 1776
Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gin íle
580 585 590
ctg cac gaa ggc atc aac gag get ggt tcc gtg gca tcg ttc atc get 1824
Leu His Glu Gly íle Asn Glu Ala Gly Ser Val Ala Ser Phe íle Ala
595 600 605
gcg ggt acc tcc tac gcc acc cac ggc aag gcc atg att ccg ctg tac 1872
Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met íle Pro Leu Tyr
610 615 620
atc ttc tac tcg atg ttc gga ttc cag cgc acc ggt gac tcc atc tgg 1920
íle Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gin Arg Thr Gly Asp Ser íle Trp
625 630 635 640
gca gca gcc gat cag atg gca cgt ggc ttc ctc ttg ggc get acc gca 1968
Ala Ala Ala Asp Gin Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala
645 650 655
ggt cgc acc acc ctg acc ggt gaa ggc ctc cag cac atg gat gga cac 2016
Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin His Met Asp Gly His
660 665 670
tcc cct gtc ttg get tcc acc aac gag ggt gtc gag acc tac gac cca 2064
Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro
675 680 685
tcc ttt gcg tac gag atc gca cac ctg gtt cac cgt ggc atc gac cgc 2112
Ser Phe Ala Tyr Glu íle Ala His Leu Val His Arg Gly íle Asp Arg
690 695 700
atg tac ggc cca ggc Pro Gly aag ggt Lys Gly 710 gaa gat gtt atc tac tac atc acc atc íle 720 2160
Met 705 Tyr Gly Glu Asp Val íle Tyr 715 Tyr íle Thr
tac aac gag cca acc cca cag cca get gag cca gaa gga ctg gac gta 2208
Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gin Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val
725 730 735
gaa ggc ctg cac aag ggc atc tac ctc tac tcc ege ggt gaa ggc acc 2256
Glu Gly Leu His Lys Gly íle Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr
740 745 750
ggc cat gag gca aac atc ttg get tcc ggt gtt ggt atg cag tgg get 2304
Gly His Glu Ala Asn íle Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gin Trp Ala
755 760 765
ctc aag get gca tcc atc ctt gag get gac tac gga gtt cgt gcc aac 2352
Leu Lys Ala Ala Ser íle Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn
770 775 780
att tac tcc get act tct tgg gtt aac ttg get ege gat ggc get get 2400
íle Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala
785 790 795 800
cgt aac aag gca cag ctg ege aac cca ggt gca gat get ggc gag gca 2448
Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala
805 810 815
ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc cca tac gtt gca gtg 2496
Phe Val Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val
820 825 830
tct gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag atc cgt gaa tgg gtc cca 2544
Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin íle Arg Glu Trp Val Pro
835 840 845
ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc ggt ttc tct gat acc 2592
Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr
850 855 860
cgc cca Arg Pro get Ala get cgt cgc ttc ttc aac Asn atc íle gac get gag tcc att gtt 2640
Ala Arg Arg Phe 870 Phe Asp 875 Ala Glu Ser íle Val 880
865
gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc aag atc gac gtc tcc 2688
Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys íle Asp Val Ser
885 890 895
gtt get get cag get get gag aag ttc aag ttg gat gat cct acg agt 2736
Val Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser
900 905 910
gtt tcc gta gat cca aac get cct gag gaa 2766
Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu
<210> 32 <211> 8556 <212> nukleová kyselina <213> Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 <400> 32 tcacgttacg cgcttctaag tcatgccact ttgcgctaga taggccattt ccgaatccac tcatcgacgc tcaaagaaag tagtagcgga tcaaagagac atcctcgtca tcgcctaatg tcgcgcaaga tecttggggt caacgcaacg aggttetgac taatttcgaa gcgatcaaca cccgtctcat atcttggggt cactaattac tgatgtggtg atcgtctaaa aactttacgg cggagtggca agctttagat cttgattgat gcgatttcgc gaattcacat aaaaggccaa gttttattac atgcagagaa gaggtgcgaa gtgctgggtt ccgcaaccac tttgcacctg tctcggtatt ggcaccgctt tagatcatat aggcctgggc ctcatcgaca cgtgcagcgg gccgggcgag gggctgttta aaacggctcg gtgaagagac atccgggcgg caatcggtcg gccttggagg gcaagttgtc ttctcgcgca tacgagaaga ccattctgtg agatcttctg aagcatggtc tgacgtcaat gaccacgtaa gcaatcgtcc tttatcgacg ctccagttga caaatcaggc agttggtgat gtcgagaagc atctagacat cgcgtggagt tgatctggca gcgcgccgca tacccaatgc tctccaaacg aggatatggc ataaaaaccc gtgacacgta gaatgaagtg agacgggcac cgtcacggtc ctggcccagg aatagatacc gaaaaccact gtcagatcaa aaatattcgc cgaggcgtgc aaatttcacc tggaatggaa cctcagtatc gtaccgatgt agaccaagag aggtgctttt gatagttttc aaacctgact actaactccg gacgagaaga aatgcagttg ctagtggatc ccaggggaca ggagtctcct gaattacagc gcgctgcaag ctcgatgcaa gaccaaggta ccttaaattc cggatcaact gcccatgagc
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
gaaaaacagg ccacgataag tttcttaaaa cttatcgtgg cctgcttcta tatttgtgcg 1080
ccctgacggg ctcgaaccgc cgacctgctg ggtgtaaacc agctgctctt ccagctgagc 1140
taaaggcgcg cacgtgcttt tctagaacca ccttggtggc ctcgaaagca acgagtgaaa 1200
tactaacaca caatctccac agacctaaaa tcgctgctca ggccgtggaa attagcgatt 1260
gttaaggctt cttgtttcca cgctggacga ggcaagaacc ttgccaatta ccgagacgtt 1320
ccgccttggt ctgcacgaga cctgccagtt gtgctgattc agagataact ccaggagcca 1380
gggctccttc tttaccaatg ccaggagtca acacccagat acgaccattc tcagcgaggg 1440
agcggatgga atccacaagt ccgtcgacga gatcgccgtc atcctcgcgc caccagagca 1500
gcacgacatc gcacagctcg tcggtttctt catcgagtag ttcctcaccg attgcatctt 1560
cgatggactc gctgatcagc gtgtcggaat cttcatccca tccaatttct tgaacgatat 1620
gacccgattg aatgccgagt agttgagcat aatcctgggc accttgcttg actgcgcccg 1680
gagcgtcggc cactttaata atcctcctcg tgtgggcccc gatgtgtttt tcgattacat 1740
ggattcaaca tgaaaccgcg gggctattga tatatccgaa ttgcacatta ccgtccaacc 1800
ggtactttga accacctttc cctggaattt tttccttttc ctcccccttt acgctcaaga 1860
atcaatgaat tcaatcactg gccagcgatt aacttttcga gttttcagtc ttggatttcc 1920
acaattctct tcaaaataat ggtggctaga tttttcatca aaccctcacc aaaaggacat 1980
cagacctgta gttttatgcg attcgcgtca aacgtgagag aaacatcaca tctcacggga 2040
aactacccga taattctttg caaaactttg caaagggtaa tgaacatgca gctagtttcc 2100
gtagaaatgt tctttaaaaa atccacaaca attgccagga agcacaccga ttgatggata 2160
cctgaaatcc cagtgagcgc accactcccc ttacgtcaca gtctgtaaaa caaatcttcg 2220
gtgttgcgta tccttgttaa taacttatgc gttgacccat tcgtgcactt cggtgtgcca 2280
caattaggta cgaccaagaa tgggaccggg aaaccgggac gtataaacga aataaaacat 2340
tccaacagga ggtgtggaa atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc 2392
Met Ala Asp Gin Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro t
• tcg Ser 5 10
gat Asp gac Asp tct aac ttc Phe gcg atg atc cgc gat ggc gtg gca tct tat 2440
Ser 15 Asn Ala Met íle Arg 20 Asp Gly Val Ala 25 Ser Tyr
ttg aac gac tca gat ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tca ctc 2488
Leu Asn Asp Ser Asp Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu
30 35 40
gac gga tta ctc cag gag tct tct cca gaa cgt get cgt tac ctc atg 2536
Asp Gly Leu Leu Gin Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met
45 50 55
ctt cgt ttg ctt gag cgt gca tct gca aag cgc gta tct ctt ccc cca 2584
Leu 60 Arg Leu Leu Glu 65 Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val 70 Ser Leu Pro 75 Pro
atg acg tca acc gac tac gtc aac acc att cca acc tct atg gaa cct 2632
Met Thr Ser Thr Asp Tyr Val Asn Thr íle Pro Thr Ser Met Glu Pro
Θ0 85 90
gaa ttc cca ggc gat gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att 2680
Glu Phe Pro Gly Asp Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp íle
95 100 105
cgc tgg aac gca gcc atc atg gtt cac cgc get cag ega cca ggc atc 2728
Arg Trp Asn Ala Ala íle Met Val His Arg Ala Gin Arg Pro Gly íle
110 115 120
ggc gtc ggc gga cac att tcc act tac gca ggc gca gcc cct ctg tac 2776
Gly Val Gly Gly His íle Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr
125 130 135
gaa gtt ggc ttc aac cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc 2824
Glu Val Gly Phe Asn His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly
140 145 150 155
ggc gac cag atc ttc ttc cag gga cac gca tca cca ggt atg tac gca 2872
Gly Asp Gin íle Phe Phe Gin Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala
160 165 170
cgt gca ttc atg gag ggt cgc ctt tct gaa gac gat ctc gat ggc ttc 2920
Arg Ala Phe Met Glu Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe
175 180 185
cgt cag gaa gtt tcc cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac 2968
Arg Gin Glu Val Ser Arg Glu Gin Gly Gly íle Pro Ser Tyr Pro His
190 195 200
cca cac ggt atg aag gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt 3016
Pro His Gly Met Lys Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly
205 210 215
ctt Leu 220 ggc cca Gly Pro atg gat gcc att Ala íle 225 tac cag gca cgt ttc aac ege tac ctc 3064
Met Asp Tyr Gin Ala Arg 230 Phe Asn Arg Tyr Leu 235
gaa aac cgt ggc atc aag gac acc tet gac cag cac gtc tgg gcc ttc 3112
Glu Asn Arg Gly íle Lys Asp Thr Ser Asp Gin His Val Trp Ala Phe
240 245 250
ctt ggc gac ggc gaa atg gac gag cca gaa tca cgt ggt ctc atc cag 3160
Leu Gly Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu íle Gin
255 260 265
cag get gca ctg aac aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc 3208
Gin Ala Ala Leu Asn Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys
270 275 280
aac ctg cag cgt ctc gac gga cct gtc ege ggt aac acc aag atc atc 3256
Asn Leu Gin Arg Leu Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys íle íle
• 285 290 295
cag gaa ctc gag tcc ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tet gtg atc aag 3304
Gin Glu Leu Glu Ser Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val íle Lys
300 305 310 315
gtt gtt tgg ggt ege gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat 3352
Val Val Trp Gly Arg Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gin Asp
320 325 330
ggt gca ctt gtt gag atc atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag 3400
Gly Ala Leu Val Glu íle Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gin
335 340 345
acc ttc aag get aac gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga 3448
Thr Phe Lys Ala Asn Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly
350 355 360
cgt gac cca ege acc gca aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa 3496
Arg Asp Pro Arg Thr Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu
365 370 375
atc íle 380 tgg Trp aag ctg cca cgt ggc ggc cac gat tac ege aag gtt tac gca 3544
Lys Leu Pro Arg 385 Gly Gly His Asp Tyr 390 Arg Lys Val Tyr Ala 395
gcc ta c aag ega get ctt gag acc aag gat ege cca acc gtc atc ctt 3592
Ala Tyr Lys Arg Ala Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val íle Leu
400 405 410
get cac acc att aag ggc tac gga ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt 3640
Ala His Thr íle Lys Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg
415 420 425
aac gca acc cac cag atg aag aag ctg acg ctt gat gat ctg aag ttg 3688
Asn Ala Thr His Gin Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu
430 435 440
ttc ege gac aag cag ggc atc cca atc acc gat gag cag ctg gag aag 3736
Phe Arg Asp Lys Gin Gly íle Pro íle Thr Asp Glu Gin Leu Glu Lys
445 450 455
gat cct tac ctt cct cct tac tac cac cca ggt gaa gac get cct gaa 3784
Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu
460 465 470 475
atc aag tac atg aag gaa cgt ege gca gcg ctc ggt ggc tac ctg cca 3832
íle Lys Tyr Met Lys Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro
480 485 490
gag cgt cgt gag aac tac gat cca att cag gtt cca cca ctg gat aag 3880
Glu Arg Arg Glu Asn Tyr Asp Pro íle Gin Val Pro Pro Leu Asp Lys
495 500 505
ctt ege tet gtc cgt aag ggc tcc ggc aag cag cag atc get acc act 3928
Leu Arg Ser Val Arg Lys Gly Ser Gly Lys Gin Gin íle Ala Thr Thr
510 515 520
atg gcg act gtt cgt acc ttc aag gaa ctg atg ege gat aag ggc ttg 3976
Met Ala Thr Val Arg Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu
525 530 535
get Ala 540 gat ega ctt gtc cca atc íle att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt Gly 555 4024
Asp Arg Leu Val Pro 545 íle Pro Asp Glu 550 Ala Arg Thr Phe
ctt gac tet tgg ttc cca acc ttg aag atc tac aac ccg cac ggt cag 4072
Leu Asp Ser Trp Phe Pro Thr Leu Lys íle Tyr Asn Pro His Gly Gin
560 565 570
aac tac gtg cct gtt gac cac gac ctg atg ctc tcc tac cgt gag gca 4120
Asn Tyr Val Pro Val Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala
575 580 585
act gaa gga cag atc ctg cac gaa ggc atc aac gag get ggt tcc gtg 4168
Pro Glu Gly Gin íle Leu His Glu Gly íle Asn Glu Ala Gly Ser Val
590 595 600
gca tcg ttc atc get gcg ggt acc tcc tac gcc acc cac ggc aag gcc 4216
Ala Ser Phe íle Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala
605 610 615
atg att ccg ctg tac atc ttc tac tcg atg ttc gga ttc cag ege acc 4264
Met íle Pro Leu Tyr íle Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gin Arg Thr
620 625 630 635
ggt gac tcc atc tgg gca gca gcc gat cag atg gca cgt ggc ttc ctc 4312
Gly Asp Ser íle Trp Ala Ala Ala Asp Gin Met Ala Arg Gly Phe Leu
640 645 650
ttg ggc get acc gca ggt ege acc acc ctg acc ggt gaa ggc ctc cag 4360
Leu Gly Ala Thr Ala Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gin
655 660 665
cac atg gat gga cac tcc cct gtc ttg get tcc acc aac gag ggt gtc 4408
His Met Asp Gly His Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val
670 675 680
gag acc tac gac cca tcc ttt gcg tac gag atc gca cac ctg gtt cac 4456
Glu Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Ala Tyr Glu íle Ala His Leu Val His
685
690
695
cgt ggc atc gac cgc atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt atc 4504
Arg 700 Gly íle Asp Arg Met Tyr 705 Gly Pro Gly Lys 710 Gly Glu Asp Val íle 715
tac tac atc acc atc tac aac gag cca acc cca cag cca get gag cca 4552
Tyr Tyr íle Thr íle Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gin Pro Ala Glu Pro
720 725 730
gaa gga ctg gac gta gaa ggc ctg cac aag ggc atc tac ctc tac tcc 4600
Glu Gly Leu Asp Val Glu Gly Leu His Lys Gly íle Tyr Leu Tyr Ser
735 740 745
cgc ggt gaa ggc acc ggc cat gag gca aac atc ttg get tcc ggt gtt 4648
Arg Gly Glu Gly Thr Gly His Glu Ala Asn íle Leu Ala Ser Gly Val
750 755 760
ggt atg cag tgg get ctc aag get gca tcc atc ctt gag get gac tac 4696
Gly Met Gin Trp Ala Leu Lys Ala Ala Ser íle Leu Glu Ala Asp Tyr
765 770 775
gga gtt cgt gcc aac att tac tcc get act tet tgg gtt aac ttg get 4744
Gly Val Arg Ala Asn íle Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala
780 785 790 795
cgc gat ggc get get cgt aac aag gca cag ctg cgc aac cca ggt gca 4792
Arg Asp Gly Ala Ala Arg Asn Lys Ala Gin Leu Arg Asn Pro Gly Ala
800 805 810
gat get ggc gag gca ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc 4840
Asp Ala Gly Glu Ala Phe Val Thr Thr Gin Leu Lys Gin Thr Ser Gly
815 820 825
cca tac gtt gca gtg tet gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag atc 4888
Pro Tyr Val Ala Val Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gin íle
830 835 840
cgt gaa tgg gtc cca ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc 4936
Arg Glu Trp Val Pro Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe
845 850 855
ggt Gly 860 ttc tet gat acc ege cca get get cgt ege ttc ttc aac atc gac 4984
Phe Ser Asp Thr Arg 865 Pro Ala Ala Arg Arg 870 Phe Phe Asn íle Asp 875
get gag tcc att gtt gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca ege gaa ggc 5032
Ala Glu Ser íle Val Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly
880 885 890
aag atc gac gtc tcc gtt get get cag get get gag aag ttc aag ttg 5080
Lys íle Asp Val Ser Val Ala Ala Gin Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu
895 900 905
gat gat cct acg agt gtt tcc gta gat cca aac get cct gag gaa taaat 5130
Asp Asp Pro Thr Ser Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu
910 915 920
cacctcaagg gacagataaa tcccgccgcc agacgttagt ctggcggcgg gattcgtcgt 5190
aaagcaagct ctttttagcc gagaaacgcc ttgtcagaca atgttgcgcc cttgatattg 5250
gcgaactcct gcagcaaatc gcgcacagtc aacttcgact tggtagcctg atctgcctgg 5310
tagacaatct ggccttcatg catcatgatc aggcgattgc ccaggcgaat tgcctgttcc 5370
atgttgtgcg tgaccataag cgtagtcaga gttccatctg ccacgatctt ttcggtcaag 5430
gtggtcacaa gctctgcacg ctgtggatca agcgctgcgg tgtgctcatc caacagcatg 5490
attttaggtt gagtaaaacc agccatcagc agggacaatg cctgacgctg accgccagag 5550
agcaaaccaa ctttggcagt gagcctgttt tccagaccca gctcaaggcg ctcaagttcc 5610
tgcttgaatt gctcacggcg cttcgaggtc agtgcaaagc ccaatccacg gcgcttgccg 5670
cgcagcaacg cgatggccag attctcttca atggtgagat tcggcgcggt gcctgccaaa 5730
ggatcctgaa aaacgcggcc gatgtagcgg gcacgcttgt gctctgacat cttgtttacc 5790
ttgttgccgt cgatggaaat ctcgccggaa tcaacaagca aacggccaga aacagcgttg 5850
agcagggtgg atttacccgc accgttagaa ccgatgacgg tgacaaaatc gccctcagcc 5910
atatcgagtt tgagctgctg caacgcgcgg cgctcattca cagtgccggg gaagaaggtt 5970
ttggaaattc cgttgatgga taacatgtct taagcctcca ctgctactgg ttgcttaggc 6030
ttcggtgcct tggagaactt cgcacgccac ctcggcagca gcatggcgac aaccaccaag 6090
atcgcagaaa ttgccttcat atcgttgggg tcaaggccaa cgcgcagtgc tgcgaaaatg 6150
atcaggcggt acgcgatggc accgacgatg acagccaaca cagccaacca cacgcgacgc 6210
tgaccgaaga tggcctggcc ccaaaataac cgatgcgaga ccgatcacga tgaggccaat 6270
acccatcgaa atatctgcga agccctggta ctgagcgatg agtgcaccgg caagaccaac 6330
agaaccattg gacagggaga tggtgaggat tttggtgaaa tccgttgaaa caccaaagga 6390
ctgcaccatc ggcccgttgt cgccggtgga tcgcagcgac agtccgatat cagtgttgag 6450
gaaccagatg acgatgagtc ccaaaaatcc cactgcaacg gcgaggatcg ccgggcctgc 6510
ccatgtgccg aggaggccgg cgtcgcgaag cggggtgaag aggttatcgg tgcgcaacaa 6570
tggcacgttc gcgccaccca tgatgcgcaa gttaaccgac cacaacgcaa tcatggtcaa 6630
aatacctgcg agcaaaccat cgatcttgcc cttggtgtgc agcaaaccgg tgatcatgcc 6690
agcgataaag ccagtaacga aaccagcggc agtagccata agaggaggcc agccagacat 6750
aagagctgtc gcagctgttg ccgcgccagt ggtcaggctg ccgtcaacgg tgaggtcggg 6810
aaagttgagc acacggaacg tcaaatagac gcccaatgcg acaactccgt acaacaatcc 6870
gaactcaaaa gcgccgatca tacgcgttcg gccttatcca aaatctcttg agggatctcc 6930
acgccctggc gctctgctgc atcttcgttg atcacgtagg tgaactaagt tgcagtctcc 6990
acaggcatgg ttgctgggtc ttcgccgtcc tgcagaatac gcagagccat ctcgccagtc 7050
tggcggccaa gctcggtgta atcgataccc agggttgcca gtgcgccacc ctcaacagtg 7110
ccggactcag caccgatcac agggatctgc ttctgctcag caacctgaac cagagaagaa 7170
ataccggaaa caaccatgtt gtcagttgga acgtagatga catcaacatc gccgagagat 7230
tcaacagcct gctgaatctc gttcacggta gtgacagtct gagtattaac ggacagcccc 7290
agtggctcag cagccttggt gacctcatcg acctgcacct gagagttgac ctcaccagac 7350
gcgtagacga tgccgatgga ctttgcgtca ggaaccagct gctgcaaaag ctccaactgc 7410
tgctcaatcg gtgcgatatc agaagtaccg gtgacgtttc cgccaggtgc ttcattagaa 7470
tccaccagct ctgccgacac tgcatcggta actgcggtga acaggactgg gatatcagtg 7530
atattctgcg cagttgcctg tgctgctgga gttgcaacag ccaacacgag atccaaattg 7590
tcagaagcga actgctgaga aatagtcagt gcagtgccct gctcgccgtt agcgttttgc 7650
tcatcaaagg tgacgtcaac gcctgcctct tcaaaagctt ccttgaaacc agtggtcgct 7710
gcatcaagtg cagggtgctg aacaagctgg ttgatgccaa ctcggtaaga gtcgccacct 7770
gcagcatcag tggaggtgga gctgtcactg gaatcgcttg agcacgaagc caacgccaag 7830
gcgccaacag taaagatgct tgcgagtacc ttcgaacggg aagaaaacat agcacatctc 7890
cttaaagtgt tattttcaaa aaggggcaga cagcgtcaac acatgtctcg gataaagaac 7950
catatgtgaa atgtctcatg atttaaacta cttgttctac cagtcatatg cgcaattccc 8010
cctggatatc ccgcaggaca tggacaaaat gggtggatag cgggtgcacc aattcaatct 8070
tttaaaggcc ctagacaccg cgatttcctt aatcgatcat taaagaggga tcctctcccc 8130
taacaaacct ccaaagacta gagtggggaa caccatgaac gtttcctcaa ataaacccag 8190
tgactctgac cgcgaatatc ttcaatcaga actcacccgg ctcgttggcc aggggcgact 8250
cgatctagat acttaccaag acgtggttga taccgtttgg tctactgatg atctaggcga 8310
gttgatgagg atccgtgccc gcttcctggg agggccgcag gtttcgcagc agcggcccca 8370
gcagccgcag caaccacatc agcggccgca acagcaaccg ccacagcatt atggacaacc 8430
cggctacggc caatcacctc aatatccacc gcagcagcct ccgcataatc agcccggcta 8490
ttaccccgat cccggccctg gccagcagca accaccgatg caccagccac caacgcgtcc 8550
aaatca
<210> 33 <211> 20
-75<212> nukleová kyselina <220> primér na konštrukciu Brevibacteríum lactofermentum pdhA génového LA amplifikačného plazmidu <400> 33 aat gcc agg agt caa cac cc <210> 34 <211>20 <212> nukleová kyselina , <220> primér na konštrukciu Brevibacteríum lactofermentum pdhA génového LA amplifikačného plazmidu <400> 34 aca tgg aac agg caa ttc gc <210> 35 <211 >28 <212> nukleová kyselina <220> primér na zavedenie mutácie do Brevibacteríum lactofermentum pdhA génového LA promótora <400> 35 v cgt ccc ggg ctg taa aac aaa tct tcg g <210> 36 <211 >27 <212> nukleová kyselina <220> primér na zavedenie mutácie do Brevibacteríum lactofermentum pdhA génového LA promótora <400> 36 atc ccc ggg ctt acc acc aag ttt tgc <210> 37 <211> 30 <212> nukleová kyselina
-76<220> primér na zavedenie mutácie do Brevibacterium lactofermentum pdhA génového LA promótora <400> 37 ctt atg cgt tgc cac att cgt gca ctt cgg <210> 38 <211 >40 <212> nukleová kyselina <220> primér na zavedenie mutácie do Brevibacterium lactofermentum pdhA génového LA promótora <400> 38 gcg ttg acc cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g <210> 39 <211>40 <212> nukleová kyselina <220> primér na zavedenie mutácie do Brevibacterium lactofermentum pdhA génového LA promótora <400> 39 gcg ttg cca cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g <210> 40 <211> 38 <212> nukleová kyselina <220> primér na zavedenie mutácie do Brevibacterium lactofermentum pdhA génového LA promótora <400> 40 ttt taa aac gtt ctg gag aag act cat gga gta atc cg <210>41 <211> 20 <212> nukleová kyselina
-77 <220> primer na zavedenie mutácie do Brevibacteríum lactofermentum pdhA génového LA promótora <400> 41 ega tet tgc ctt ege gtg cc <210> 42 <211 >30 <212> nukleová kyselina <400> 42 agaccgccgg agtatgcaag aacgatgcgg <210> 43 <211 >30 <212> nukleová kyselina <400> 43 gacttcacca tcaatcatct tcttcaggta <210> 44 <211 >30 <212> nukleová kyselina <400> 44 accttcgacc agaccctggc taagggcttt <210> 45 <211 >30 <212> nukleová kyselina <400> 45 gctaacaagc gegategega agctggcaac <210> 46 <211 >25 <212> nukleová kyselina <400> 46 gcgatgacac cgtttttgtt ctcgc
-78<210> 47 <211 >25 <212> nukleová kyselina <400> 47 ggcgacatcc ttgcccagat gatca <210> 48 <211 >25 <212> nukleová kyselina <400> 48 gacttcacca tcaatcatct tcttc <210> 49 <211 >24 <212> nukleová kyselina <400> 49 gccaggtaca actgtctgaa ttgc <210> 50 <211> 40 <212> nukleová kyselina <220> primér na zavedenie mutácie <400> 50 gttaatcgct tgccaatgca ggcaggtaag gtataacccg <210> 51 <211 >40 <212> nukleová kyselina <400> 51 gttaatcgct tgctaatgca ggcaggtaag gtataacccg <210> 52 <211 >40
-79<212> nukleová kyselina <400> 52 gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataacccg <210> 53 <211 >40 <212> nukleová kyselina <400> 53 gttaatcgct tgttaatgca ggcaggtaag gtataatccg <210>54 <211 >40 <212> nukleová kyselina <400> 54 gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataatccg <210> 55 <211> 30 <212> nukleová kyselina <400> 55 gggttccagc ctcgtgcgga attcgtggag <210> 56 <211 >25 <212> nukleová kyselina <400> 56 gcgttaccca gagctggatc ctcgg <210> 57 <211> 16 <212> nukleová kyselina <400> 57 cagttgtggc tgatcg
-80<210> 58 <211> 17 <212> nukleová kyselina <400> 58 ctttcccaga ctctggc <210> 59 <211> 21 <212> nukleová kyselina <400> 59 gctataattt gacgtgagca t <210> 60 <211> 25 <212> nukleová kyselina <400> 60 gctcacgtca aattatagca gtgtc <210> 61 <211> 54 <212> nukleová kyselina <400> 61 ttgttgtcat tctgtgcgac actgctataa tttgaacgtg agcagttaac agcc <210> 62 <211 >63 <212> nukleová kyselina <400> 62 gttaactgct cacgttcaaa ttatagcaft gtcgcacaga atgacaacaa agaattaaaa ttg <210> 63 <211>25 <212> nukleová kyselina <400> 63
-81 gctagcctcg ggagctctct aggag
Λ <210> 64 <211>25 <212> nukleová kyselina <400> 64 gatctttccc agactctggc cacgc

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob výroby koryneformných baktérií, ktoré majú zlepšenú produktivitu aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa zavedenie mutácie do promótorovej sekvencie génov na biosyntézu aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny na chromozóme koryneformnej baktérie na ich priblíženie sa konsenzus sekvencií alebo zahŕňa zavedenie zmeny do promótorovej sekvencie génov na biosyntézu aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny na chromozóme koryneformnej baktérie prostredníctvom génovej rekombinácie na ich priblíženie sa konsenzus sekvencií, na získanie mutantu koryneformného mikroorganizmu, ktorý produkuje aminokyselinu alebo nukleovú kyselinu, kultiváciu mutantu a selekciu mutantu, ktorý je schopný produkovať zamýšľanú aminokyselinu alebo nukleovú kyselinu vo veľkom množstve.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že aminokyselina je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z kyseliny glutámovej, lyzínu, arginínu, serínu, fenylalanínu, prolínu a glutamínu a nukleová kyselina je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z inozínu, guanozínu, adenozínu a nukleotidu.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že aminokyselina je kyselina glutámová a promótor biosyntetického génu je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z promótora pre gén glutamátdehydrogenázy - GDH, promótora pre gén citrátsyntázy - CS, promótora pre gén izocitrátsyntázy - ICDH, promótora pre gén pyruvátdehydrogenázy - PDH a promótora pre gén na produkciu akonitázy - ACO.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že promótor pre gén glutamátdehydrogenázy - GDH má DNA sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej z (i) najmenej jednej DNA sekvencie vybranej zo skupiny pozostávajúcej z CGGTCA, TTGTCA, TTGACA a TTGCCA v -35 oblasti, (ii) TATAAT sekvencie alebo rovnakej TATAAT sekvencie v ktorej je báza v ATAAT nahradená inou bázou v -10 oblasti a (iii) kombinácie (i) a (ii), pričom sekvencia neinhibuje funkciu promótora.
  5. 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že GDH má sekvenciu v TGGTCA v -35 oblasti a sekvenciu TATAAT v -10 oblasti; alebo TTGTCA v -35 oblasti a TATAAT v -10 oblasti.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že promótor pre CS má (i) sekvenciu TTGACA v -35 oblasti, (ii) TATAAT sekvenciu v -10 oblasti alebo (iii) kombináciu sekvencií (i) a (ii), pričom sekvencia neinhibuje funkciu promótora.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že najmenej jeden z prvého a druhého promótora pre ICDH má (i) sekvenciu TTGCCA alebo TTGACA sekvenciu v -35 oblasti, (ii) TATAAT sekvenciu v -10 oblasti alebo (iii) kombináciu sekvencií (i) a (ii), pričom sekvencia neinhibuje funkciu promótora.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že promótor pre PDH má (i) sekvenciu TTGCCA v -35 oblasti, (ii) TATAAT sekvenciu v -10 oblasti alebo (iii) kombináciu sekvencií (i) a (ii), pričom sekvencia neinhibuje funkciu promótora.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že aminokyselinou je arginín a promótorom pre biosyntetický gén je promótor pre arginínsukcinátsyntázu.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že promótor pre gén arginínsukcinátsyntázy má DNA sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej z (i) najmenej jednej DNA sekvencie vybranej zo skupiny pozostávajúcej z TTGCCA, TTGCTA a TTGTCA v -35 oblasti, (ii) TATAAT sekvencie alebo TATAAT sekvencie, v ktorej je báza v ATAAC nahradená inou bázou v -10 oblasti a (iii) kombinácie (i) a (ii), pričom sekvencia neinhibuje funkciu promótora.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že promótor pre arginínsukcinátsyntázu má DNA sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej zo (i) sekvencie TTGTCA v -35 oblasti, (ii) TATAAT sekvencie v -10 oblasti a (iii) kombinácie (i) a (ii).
  12. 12. Gén na syntézu kyseliny glutámovej, ktorý má promótor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 až 8.
  13. 13. Arginínsyntetázový gén, ktorý má promótor podľa nároku 10.
  14. 14. Koryneformná baktéria produkujúca kyselinu glutámovú, ktorá má glutamátsyntetázový gén podľa nároku 12.
  15. 15. Koryneformná baktéria produkujúca arginín, ktorá má arginínsyntetázový gén podľa nároku 13.
  16. 16. Spôsob výroby aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny fermentáciou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu koryneformnej baktérie skonštruovanej spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, ktorá má zlepšenú produktivitu aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny, alebo kultiváciu koryneformnej baktérie podľa nárokov 14 alebo 15, v kultivačnom médiu, na vytvorenie a tým akumuláciu zamýšľanej aminokyseliny alebo nukleovej kyseliny v kultivačnom médiu a jej izoláciu z kultivačného média.
  17. 17. Spôsob výroby kyseliny L-glutámovej fermentáciou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultivovanie koryneformnej baktérie, ktorá produkuje kyselinu Lglutámovú, a ktorá je rezistentná voči kyseline 4-fluórglutámovej, v tekutom médiu, na výrobu, a tým akumulovanie kyseliny L-glutámovej v kultivačnom médiu a jej izoláciu z kultivačného média.
SK770-2000A 1998-09-25 1999-09-22 Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity SK7702000A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP27178698 1998-09-25
JP27178798 1998-09-25
PCT/JP1999/005175 WO2000018935A1 (en) 1998-09-25 1999-09-22 Process for constructing amino acid-producing bacterium and process for producing amino acid by fermentation method with the use of the thus constructed amino acid-producing bacterium

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK7702000A3 true SK7702000A3 (en) 2000-10-09

Family

ID=26549879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK770-2000A SK7702000A3 (en) 1998-09-25 1999-09-22 Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6962805B2 (sk)
EP (1) EP1033407B1 (sk)
KR (1) KR100630604B1 (sk)
CN (1) CN1170938C (sk)
AT (1) ATE447039T1 (sk)
BR (2) BR9917880B1 (sk)
DE (1) DE69941594D1 (sk)
ES (1) ES2335828T3 (sk)
HU (2) HU224975B1 (sk)
ID (1) ID25513A (sk)
MY (1) MY130756A (sk)
PE (1) PE20001111A1 (sk)
RU (1) RU2214456C2 (sk)
SK (1) SK7702000A3 (sk)
TW (4) TWI247805B (sk)
WO (1) WO2000018935A1 (sk)

Families Citing this family (153)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU705550B2 (en) 1995-06-07 1999-05-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine
RU2214456C2 (ru) 1998-09-25 2003-10-20 Адзиномото Ко., Инк. Способ конструирования бактериальных штаммов, продуцирующих аминокислоты (варианты), и способ получения аминокислоты путем ферментации с использованием сконструированных бактериальных штаммов, продуцирующих аминокислоты
AU2001285833A1 (en) * 2000-07-24 2002-02-05 Degussa A.G. Process for the fermentative preparation of l-glutamic acid using coryneform bacteria
DK1334176T3 (da) * 2000-11-17 2008-07-14 Cj Cheiljedang Corp Mikroorganismer, der producerer L-glutamin, og fremgangsmåder til produktion af L-glutamin under anvendelse af samme
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
DE60335774D1 (de) * 2002-11-26 2011-03-03 Ajinomoto Kk Methode für die Produktion von L-Glutamin und L-Glutamin-produzierendes Bakterium
RU2268305C2 (ru) * 2003-12-18 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий с оптимизированным уровнем генной экспрессии
DE10359594A1 (de) * 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
CN101243177B (zh) * 2004-01-30 2012-12-05 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和生产l-氨基酸的方法
BRPI0509056A (pt) 2004-03-31 2007-08-21 Ajinomoto Kk bactéria pertencendo ao gênero bacillus ou ao gênero escherichia, e, métodos para produzir um nucleosìdeo de purina, para produzir um nucleotìdeo de purina e para produzir ácido 5'-guanìlico
DE102004035065A1 (de) * 2004-07-20 2006-02-16 Basf Ag P-ET-TS-Expressionseinheiten
JP2006063002A (ja) * 2004-08-25 2006-03-09 Ajinomoto Co Inc 反芻動物用のメタン生成抑制剤および飼料用組成物
WO2006041143A1 (ja) * 2004-10-13 2006-04-20 Mitsui Chemicals, Inc. 新規なｄ－セリン合成活性を有する酵素をコードするｄｎａ、該酵素の製造方法、及びこれを利用したｄ－セリンの製造方法
JP4595506B2 (ja) 2004-11-25 2010-12-08 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
KR100620092B1 (ko) * 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
BRPI0519410B1 (pt) 2004-12-28 2020-12-22 Ajinomoto Co., Inc método para produzir ácido l-glutâmico
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7326546B2 (en) 2005-03-10 2008-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance
US20070029252A1 (en) * 2005-04-12 2007-02-08 Dunson James B Jr System and process for biomass treatment
BRPI0612944B1 (pt) * 2005-04-12 2017-11-28 E.I.Du Pont De Nemours And Company Method of production of target substance
US7781191B2 (en) * 2005-04-12 2010-08-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
TWI361834B (en) 2005-04-12 2012-04-11 Kyowa Hakko Bio Co Ltd A method for producing amino acids
JP2008283863A (ja) * 2005-08-26 2008-11-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
EP1947190B1 (en) 2005-10-18 2017-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Process for production of succinic acid
CN101432417B (zh) 2006-04-24 2014-05-28 味之素株式会社 能够产生嘌呤物质的细菌和用于产生嘌呤物质的方法
JP5251505B2 (ja) 2006-04-24 2013-07-31 味の素株式会社 プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
WO2007136133A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
WO2008044614A1 (en) 2006-09-28 2008-04-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing 4-hydroxy-l-isoleucine
KR100822041B1 (ko) 2006-12-21 2008-04-15 씨제이제일제당 (주) 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 에이 코딩 유전자의 발현이강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한엘-라이신 생산방법
KR100882418B1 (ko) 2007-01-15 2009-02-05 씨제이제일제당 (주) 이노신을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 이노신 제조방법
WO2008090770A1 (ja) 2007-01-22 2008-07-31 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
JP2010088301A (ja) * 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010130899A (ja) 2007-03-14 2010-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
WO2008133131A1 (ja) 2007-04-16 2008-11-06 Ajinomoto Co., Inc. 有機酸の製造方法
WO2008133161A1 (ja) 2007-04-17 2008-11-06 Ajinomoto Co., Inc. カルボキシル基を有する酸性物質の製造法
US7807419B2 (en) * 2007-08-22 2010-10-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for concentrated biomass saccharification
US8445236B2 (en) * 2007-08-22 2013-05-21 Alliance For Sustainable Energy Llc Biomass pretreatment
US20090053800A1 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Julie Friend Biomass Treatment Apparatus
US7819976B2 (en) * 2007-08-22 2010-10-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Biomass treatment method
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
RU2396336C2 (ru) 2007-09-27 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
WO2009072562A1 (ja) 2007-12-06 2009-06-11 Ajinomoto Co., Inc. 有機酸の製造方法
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
KR20100120663A (ko) 2008-01-23 2010-11-16 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-아미노산의 제조법
WO2009154280A1 (ja) * 2008-06-19 2009-12-23 味の素株式会社 過食防止剤
JP5488467B2 (ja) 2008-09-05 2014-05-14 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
PE20110369A1 (es) 2008-09-08 2011-06-24 Ajinomoto Kk Un microorganismo que produce l-aminoacido y un metodo para producir un l-aminoacido
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JPWO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2013-01-10 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP5636648B2 (ja) 2009-08-10 2014-12-10 味の素株式会社 ５’−グアニル酸の製造法
JP2012223091A (ja) 2009-08-25 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
KR101226384B1 (ko) 2010-03-05 2013-01-25 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
US8721794B2 (en) 2010-04-28 2014-05-13 E I Du Pont De Nemours And Company Production of high solids syrup from lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
US8906235B2 (en) 2010-04-28 2014-12-09 E I Du Pont De Nemours And Company Process for liquid/solid separation of lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
CN103097530B (zh) 2010-09-08 2016-11-09 绿色苯酚开发株式会社 棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
JP5803927B2 (ja) 2010-09-14 2015-11-04 味の素株式会社 含硫アミノ酸生産菌及び含硫アミノ酸の製造法
KR101972556B1 (ko) 2010-11-10 2019-04-25 그린 케미칼즈 가부시키가이샤 코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2014087259A (ja) 2011-02-22 2014-05-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
WO2012128231A1 (ja) 2011-03-18 2012-09-27 三菱化学株式会社 ポリマーの製造方法、有機酸の製造方法及び有機酸生産菌
EP2695940B1 (en) 2011-04-01 2016-11-30 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-cysteine
DE102011006716A1 (de) 2011-04-04 2012-10-04 Evonik Degussa Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung
JP2014131487A (ja) 2011-04-18 2014-07-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システインの製造法
RU2496867C2 (ru) 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
EP2774982B1 (en) 2011-11-02 2017-06-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for secreting and producing proteins
PH12014501063A1 (en) 2011-11-11 2014-06-30 Ajinomoto Kk A method for producing a target substance by fermentation
RU2012129311A (ru) 2012-07-11 2014-01-20 Закрытое акционерное общество " Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Днк, кодирующая дипептид-синтезирующий фермер (варианты), бактерия рода escherichia и способ получения дипептидов с ее использованием
RU2550269C2 (ru) 2012-08-17 2015-05-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, СОДЕРЖАЩЕЙ N-АЦЕТИЛОРНИТИНДЕАЦЕТИЛАЗУ С НАРУШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
CA2900580C (en) 2013-02-08 2022-05-31 Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd Method for producing l-lysine by modifying aconitase gene and/or regulatory elements thereof
US20140273105A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 E I Du Pont De Nemours And Company Gradient pretreatment of lignocellulosic biomass
WO2014160262A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abengoa Bioenergy New Technologies, Llc Methods for converting cellulosic waste to bioproducts
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
RU2013119826A (ru) 2013-04-29 2014-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Коринеформная бактерия и способ получения гетерологичных гибридных белков
CN105008532B (zh) 2013-05-13 2017-07-21 味之素株式会社 L‑氨基酸的制造方法
AU2014265243B2 (en) * 2013-05-17 2018-04-26 Xyleco, Inc. Processing Biomass
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
BR112016007286B1 (pt) 2013-10-02 2021-07-20 Ajinomoto Co., Inc Métodos de controle de amônia e para produção de uma substância alvo, e, aparelho para controle de amônia
EP3054005B1 (en) 2013-10-02 2019-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Heparosan-producing bacterium and heparosan manufacturing method
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP6519476B2 (ja) 2013-10-23 2019-05-29 味の素株式会社 目的物質の製造法
US10227623B2 (en) 2013-11-24 2019-03-12 E I Du Pont De Nemours And Company High force and high stress destructuring of cellulosic biomass
JP6582997B2 (ja) 2014-01-31 2019-10-02 味の素株式会社 変異型グルタミン酸−システインリガーゼ、及び、γ−グルタミルバリルグリシンの製造法
WO2016007350A1 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Danisco Us Inc. Preconditioning of lignocellulosic biomass
WO2016069849A1 (en) * 2014-10-30 2016-05-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered fungi for itaconic acid production
CN104513830B (zh) * 2015-01-27 2017-08-11 华东理工大学 一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用
JP7203496B2 (ja) 2015-05-19 2023-01-13 ミツビシ ケミカル ユーケー リミテッド メタクリル酸およびその誘導体の生物学的製造方法
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
CN108350412B (zh) 2015-10-27 2022-02-11 味之素株式会社 用于生产醛的方法
JP6623690B2 (ja) 2015-10-30 2019-12-25 味の素株式会社 グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法
CN108463555A (zh) 2016-01-12 2018-08-28 味之素株式会社 生产苯甲醛的方法
JP7021639B2 (ja) 2016-10-21 2022-02-17 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
CN109937257B (zh) 2016-10-26 2023-06-30 味之素株式会社 生产目标物质的方法
EP3532626B1 (en) 2016-10-26 2023-08-30 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
GB201619827D0 (en) 2016-11-23 2017-01-04 Lucite Int Uk Ltd Process for the production of methyl methacrylate
KR102801726B1 (ko) 2017-09-25 2025-05-07 아지노모토 가부시키가이샤 단백질의 제조법 및 2당의 제조법
WO2019078095A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR PRODUCTION OF PROTEIN HAVING ALPHA-HYDROXYLANTIC PEPTIDYLGLYCIN MONOOXYGENASE ACTIVITY
US11680279B2 (en) 2017-11-29 2023-06-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
JP7226449B2 (ja) 2017-12-26 2023-02-21 味の素株式会社 発酵によるグリシンの製造方法
JP7367667B2 (ja) 2018-02-20 2023-10-24 味の素株式会社 Ｒｎａサイレンシングを誘導する方法
JP7124338B2 (ja) 2018-02-27 2022-08-24 味の素株式会社 変異型グルタチオン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法
JP7424320B2 (ja) 2018-07-11 2024-01-30 味の素株式会社 腸内細菌科の細菌を用いてアルコール類およびアミン類を酵素によりスルフリル化する方法
WO2020027251A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
WO2020067487A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-methionine using a bacterium
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
JP7375767B2 (ja) 2018-10-25 2023-11-08 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
KR102075160B1 (ko) 2018-12-13 2020-02-10 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
WO2020138178A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium
JP7491314B2 (ja) 2019-02-22 2024-05-28 味の素株式会社 ｙｄｉＪ遺伝子を過剰発現する腸内細菌科に属する細菌を用いたＬ－アミノ酸の製造方法
JP7524909B2 (ja) 2019-04-05 2024-07-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造方法
WO2021060337A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing 2-methyl-butyric acid by bacterial fermentation
JP7655312B2 (ja) 2019-09-25 2025-04-02 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
WO2021085405A1 (ja) 2019-10-28 2021-05-06 味の素株式会社 ベンズアルデヒドの製造方法
CN110951662B (zh) * 2019-12-26 2024-03-12 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用
KR102269639B1 (ko) 2020-02-12 2021-06-25 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
CN111334535B (zh) * 2020-03-26 2021-11-30 廊坊梅花生物技术开发有限公司 生产l-氨基酸的重组菌株及其应用
CN113201535B (zh) * 2020-07-20 2022-02-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体及其应用
CN113201536B (zh) * 2020-08-19 2022-09-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用
CN116456832A (zh) 2020-09-29 2023-07-18 味之素株式会社 变异型谷氨酰胺转氨酶
WO2022092018A1 (ja) 2020-10-28 2022-05-05 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
CN112695036B (zh) * 2021-03-23 2021-07-06 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用
CN117157394A (zh) 2021-04-16 2023-12-01 因比奥斯公司 发酵生产
AU2022258874A1 (en) 2021-04-16 2023-11-30 Inbiose N.V. Cellular production of sialylated di- and/or oligosaccharides
KR102377745B1 (ko) * 2021-05-12 2022-03-23 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이의 용도
CN113308426B (zh) * 2021-05-27 2022-10-18 齐鲁工业大学 一种改造tk基因5′端序列的重组棒状杆菌及其应用
AU2022306337A1 (en) 2021-07-07 2024-02-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for secretory production of unnatural-amino-acid-containing protein
JPWO2023063314A1 (sk) 2021-10-11 2023-04-20
CN116904452A (zh) * 2021-10-28 2023-10-20 冯波 一种启动子及其在提高谷氨酸脱氢酶活性或氨基酸产量、糖酸转化率上的应用
WO2023200008A1 (ja) 2022-04-15 2023-10-19 味の素株式会社 培養肉の製造方法
KR102636674B1 (ko) 2022-07-11 2024-02-15 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
KR102792507B1 (ko) 2022-07-11 2025-04-09 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
KR102572850B1 (ko) 2022-07-11 2023-08-31 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
KR102572849B1 (ko) 2022-07-11 2023-08-31 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
GB2621337A (en) 2022-08-08 2024-02-14 Mitsubishi Chemical Uk Ltd Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof
US20240117393A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
KR102636672B1 (ko) 2022-10-31 2024-02-15 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
KR102905116B1 (ko) 2022-10-31 2025-12-31 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
KR102546734B1 (ko) 2022-10-31 2023-06-23 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
EP4667580A1 (en) 2023-02-16 2025-12-24 Ajinomoto Co., Inc. Method for secretory production of proteins
KR102843469B1 (ko) 2023-04-28 2025-08-12 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
CN121532500A (zh) 2023-06-16 2026-02-13 大象株式会社 烷基氢过氧化物还原酶ahpd家族核心结构域新型变体及利用其的l-谷氨酸的生产方法
KR102918999B1 (ko) 2023-11-23 2026-01-29 대상 주식회사 GlnH 단백질 신규 변이체 및 이를 이용한 L-글루탐산의 생산 방법
JP7716823B1 (ja) 2023-12-28 2025-08-01 味の素株式会社 Ｌ－グルタミン酸生産菌およびｌ－グルタミン酸の製造方法
JP7716166B1 (ja) 2023-12-28 2025-07-31 味の素株式会社 Ｌ－グルタミン酸生産菌およびｌ－グルタミン酸の製造方法
CN120505260A (zh) * 2024-02-19 2025-08-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种生产l-谷氨酸的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LU81207A1 (fr) 1979-04-30 1980-12-16 Arbed Procede d'affinage d'un bain de metal contenant des matieres refroidissantes solides
JPS61104790A (ja) 1984-10-29 1986-05-23 Showa Denko Kk Ｌ−トリプトフアンの生合成に関与する遺伝情報を有する新規組換え体ｄｎａ
JP2520895B2 (ja) * 1987-03-04 1996-07-31 旭化成工業株式会社 Ｌ―グルタミン酸の製造方法
JP2708168B2 (ja) 1988-02-23 1998-02-04 昭和電工株式会社 微生物の改良
WO1993003158A1 (fr) 1991-07-30 1993-02-18 Orsan Systeme d'expression et de secretion de proteines utilisables en particulier chez les corynebacteries
EP0771879B1 (en) * 1994-06-14 2001-09-12 Ajinomoto Co., Inc. alpha-ketoglutaric dehydrogenase gen
DE69739121D1 (de) 1996-08-23 2009-01-02 Peter Ruhdal Jensen Künstliche promotorbibliotheken für ausgewählte organismen sowie daraus entstammende promotoren
RU2214456C2 (ru) 1998-09-25 2003-10-20 Адзиномото Ко., Инк. Способ конструирования бактериальных штаммов, продуцирующих аминокислоты (варианты), и способ получения аминокислоты путем ферментации с использованием сконструированных бактериальных штаммов, продуцирующих аминокислоты
MY127948A (en) * 1998-10-19 2007-01-31 Ajinomoto Kk L-glutamic acid producing bacterium and process for producing l-glutamic acid
US6255086B1 (en) * 1999-02-01 2001-07-03 Ajinomoto Co., Inc. Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing L-arginine
US7160705B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine

Also Published As

Publication number Publication date
US20040002143A1 (en) 2004-01-01
HUP0100045A3 (en) 2003-01-28
BR9917880B1 (pt) 2014-02-18
WO2000018935A1 (en) 2000-04-06
US7608437B2 (en) 2009-10-27
TW200504214A (en) 2005-02-01
EP1033407A1 (en) 2000-09-06
EP1033407B1 (en) 2009-10-28
CN1170938C (zh) 2004-10-13
ES2335828T3 (es) 2010-04-05
ID25513A (id) 2000-10-05
RU2214456C2 (ru) 2003-10-20
HU225541B1 (en) 2007-03-28
CN1289368A (zh) 2001-03-28
US20060003424A1 (en) 2006-01-05
TWI247808B (en) 2006-01-21
HUP0100045A2 (hu) 2001-05-28
PE20001111A1 (es) 2000-10-31
HU224975B1 (en) 2006-04-28
KR20010032426A (ko) 2001-04-16
DE69941594D1 (de) 2009-12-10
TWI247806B (en) 2006-01-21
TWI247805B (en) 2006-01-21
BRPI9909409B1 (pt) 2016-03-22
MY130756A (en) 2007-07-31
TW200504213A (en) 2005-02-01
TWI247807B (en) 2006-01-21
ATE447039T1 (de) 2009-11-15
US6962805B2 (en) 2005-11-08
TW200504215A (en) 2005-02-01
EP1033407A4 (en) 2004-08-18
KR100630604B1 (ko) 2006-10-04
BR9909409A (pt) 2000-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7608437B2 (en) Method of constructing amino acid producing bacterial strains, and method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacterial strains
RU2197528C2 (ru) Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты)
JP4595506B2 (ja) Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
JP4035855B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
EP0857784B1 (en) Method for producing L-lysine
JPWO1996040934A1 (ja) Ｌ−リジンの製造法
US20070172932A1 (en) L-Glutamic Acid-Producing Microorganism and a Method for Producing L-Glutamic Acid
JP3937726B2 (ja) 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
JPWO1999007853A1 (ja) 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
JP2000197490A (ja) Ｌ―アルギニンの製造法
JP3651002B2 (ja) アミノ酸生産菌の構築方法及び構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法
AU737421B2 (en) Process for constructing amino acid-producing bacterium and process for producing amino acid by fermentation method with the use of the thus constructed amino acid-producing bacterium
AU757594B2 (en) Process for constructing amino acid-producing bacterium and process for producing amino acid by fermentation method with the use of the thus constructed amino acid-producing bacterium
JPH1087A (ja) 発酵法による目的物質の製造法
JP2000232890A (ja) 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
MXPA00005186A (en) Process for constructing amino acid-producing bacterium and process for producing amino acid by fermentation method with the use of the thus constructed amino acid-producing bacterium
JPWO2000018935A1 (ja) アミノ酸生産菌の構築方法及び構築されたアミノ酸生産菌を用いる醗酵法によるアミノ酸の製造法