SK8242000A3 - Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates - Google Patents
Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates Download PDFInfo
- Publication number
- SK8242000A3 SK8242000A3 SK824-2000A SK8242000A SK8242000A3 SK 8242000 A3 SK8242000 A3 SK 8242000A3 SK 8242000 A SK8242000 A SK 8242000A SK 8242000 A3 SK8242000 A3 SK 8242000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- hgrf
- peg
- lys
- conjugates
- peptide
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- -1 polyethylene Polymers 0.000 title description 11
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 title 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 claims description 39
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 24
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 24
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 7
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 143
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 91
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 80
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 31
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 20
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 2-[di(propan-2-yl)amino]ethylsulfanyl-methylphosphinic acid Chemical compound CC(C)N(C(C)C)CCSP(C)(O)=O UOXJNGFFPMOZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 101001075370 Rattus norvegicus Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 6-amino-2-[[(e)-(3-formylphenyl)methylideneamino]carbamoylamino]-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1NC(=O)N\N=C\C1=CC=CC(C=O)=C1 SFHYNDMGZXWXBU-LIMNOBDPSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N sermorelin Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N 0.000 description 2
- 229960002758 sermorelin Drugs 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(C#N)=CC1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N 0.000 description 1
- OJBNDXHENJDCBA-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-(prop-2-enoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OCC=C)C(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 OJBNDXHENJDCBA-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- AWNXKZVIZARMME-UHFFFAOYSA-N 1-[[5-[2-[(2-chloropyridin-4-yl)amino]pyrimidin-4-yl]-4-(cyclopropylmethyl)pyrimidin-2-yl]amino]-2-methylpropan-2-ol Chemical compound N=1C(NCC(C)(O)C)=NC=C(C=2N=C(NC=3C=C(Cl)N=CC=3)N=CC=2)C=1CC1CC1 AWNXKZVIZARMME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 4,5,6-trichlorotriazine Chemical compound ClC1=NN=NC(Cl)=C1Cl LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002375 Peptide(-Tyr) Polymers 0.000 description 1
- JHSRGEODDALISP-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JHSRGEODDALISP-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 229920000361 Poly(styrene)-block-poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100030676 Rho GTPase-activating protein 35 Human genes 0.000 description 1
- FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N ornithyl group Chemical group N[C@@H](CCCN)C(=O)O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 108010065206 ras-GRF1 Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- JAHCMOSSKRAPEL-IBFVROBCSA-N somatorelin Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAHCMOSSKRAPEL-IBFVROBCSA-N 0.000 description 1
- 229960002090 somatorelin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Birds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka spôsobu miestne špecifickej prípravy hGRF-PEG konjugátov, ktoré obsahujú jednu alebo viac ako jednu PEG jednotku na jeden mol hGRF, ktorá je kovalentne naviazaná na Lys12 a/alebo Lys21 a/alebo N“, pričom je charakteristický tým, že konjugačná reakcia medzi hGRF peptidom a aktivovaným PEG sa uskutočňuje v roztoku a požadovaný hGRF-PEG konjugát sa purifikuje chromatografickými metódami. Predložený vynález opisuje aj konjugáty pripravené týmto spôsobom, ako aj ich použitie na liečbu, prevenciu alebo diagnostiku ochorení súvisiacich s rastovým hormónom.
Doterajší stav techniky
Začiatkom 80-tych rokov niekoľko skupín izolovalo a charakterizovalo faktor týkajúci sa vylučovania rastového hormónu (GRF). GRF (tiež nazývaný Somatorelín) je peptid vylučovaný hypotalamom, ktorý funguje ako jeho receptor a môže napomáhať vylučovaniu rastového hormónu (GH) z prednej hypofýzy. Existuje ako peptid s dĺžkou 44, 40 alebo 37 aminokyselín, pričom 44aminokyselinová forma sa môže fyziologicky konvertovať na kratšie formy. Bolo publikované, že všetky tri formy sú aktívne, pričom aktivita je spojená najmä s prvými 29 aminokyselinovými zvyškami. Technikami rekombinantnej DNA bol pripravený peptid zodpovedajúci 1-29 aminokyselinovej sekvencii ľudského GRF [hGRF(1-29)j, tiež nazývaný sermorelín, čo je opísané v európskom patente EP 105 759.
Sermorelín bol použitý na vytvorenie acetátu na diagnostiku a liečbu nedostatku rastového hormónu.
Samozrejme, že GRF má terapeutickú hodnotu z hľadiska liečby určitých porúch vzťahujúcich sa k rastovému hormónu. Použitie GRF na stimuláciu
-2vylučovania GH je fyziologickým spôsobom napomáhania rastu dlhých kostí alebo napomáhania proteínovému anabolizmu.
Jeden problém, ktorý je spojený s používaním GRF, sa týka krátkeho biologického polčasu rozpadu (približne 12 až 30 minút). HGRF(1-29)-NH2 podlieha enzymatickej degradácii a rýchlo sa odbúrava v plazme prostredníctvom štiepenia dipeptidylpeptidázou IV (DPP-IV) medzi zvyškami Ala2 a Asp3.
Je preto výhodné vyvinúť biologicky stabilné, dlho-aktívne GRF analógy použitím špecifickej chemickej modifikácie GRF, aby sa zabránilo enzymatickej degradácii, alebo aby sa spomalila enzymatická degradácia.
Polyetylénglykol (PEG) je hydrofilný, biokompatibilný a netoxický polymér všeobecného vzorca H(OCH2CH2)nOH, kde n > 4. Jeho molekulová hmotnosť môže byť v rozmedzí od 200 do 20 000 daltonov.
Ukázalo sa, že chemická konjugácia PEG v jeho monometoxylovanej forme s proteínmi a/alebo peptidmi významne zvyšuje trvanie ich biologickej aktivity. Podobne ako uhľovodíkové časti v glykoproteíne, poskytuje PEG ochranný obal a zväčšuje veľkosť molekuly, a tým znižuje jeho metabolickú degradáciu a rýchlosť jeho odstraňovania obličkami.
PEG konjugácia je už zavedenou metódou pre peptidy a proteíny, ktorá bola po prvý raz použitá na základné štúdie podľa Davisa a Abuchowskeho (Abuchowski a iný, I977a a 1977b). Výsledkom PEG konjugácie s peptidmi alebo proteínmi je vo všeobecnosti nešpecifické chemické pripojenie PEG na viac ako jeden aminokyselinový zvyšok. Preto je jedným z hlavných problémov tejto technológie nájdenie príslušných chemických metód na kovalentnú konjugáciu PEG molekuly(molekúl) so špecifickými aminokyselinovými zvyškami.
Napríklad, trichlórtriazínom-aktivovaný PEG, o ktorom sa zistilo, že je toxický a reaguje nešpecifickým spôsobom, bol neskôr nahradzovaný rôznymi PEG reakčnými činidlami s chemickými spojovníkmi, ktoré mohli špecificky reagovať s aminoskupinami (Benchamp a iný, 1983; Veronese a iný, 1985; Zalipsky a iný, 1983; Zalipski a iný, 1990; a Delgado a iný, 1990), so sulfhydrylovými skupinami (Sartore a iný, 1991; a Morpurgo a iný, I996) alebo s guanidínovými zvyškami (Pande a iný, 1980).
-3Našli sa rôzne konjugáty PEG-proteín, ktoré sú chránené pred proteolýzou a/alebo majú zníženú imunogénnosť (Monfardini a iný, 1995; a Yamsuki a iný, 1988).
Iný technický problém pri pegylácii proteínov vyplýva zo skutočnosti, že konjugáty PEG a proteínu majú zvyčajne rôzny počet pripojených PEG molekúl, a výsledkom je zmes konjugátov s rôznymi stechiometriami PEG.proteín. Miestne špecifická pegylácia ostáva výzvou pre chemikov. Konjugácia PEG s GH predstavuje typický príklad takéhoto problému (Clark a iný, 1996). Ukázalo sa, že Lys-zvyšky GH boli pegylované v náhodných polohách.
Aby sa zabránilo strate enzymatickej aktivity, alebo aby sa táto strata znížila, môže byť aktívne miesto vopred chránené, čím sa umožni, aby enzýmová pegylácia nastala na neaktívnom mieste (miestach) (Caliceti a iný, 1993).
V súčasnosti bol navrhnutý ďalší postup na miestne-špecifickú konjugáciu PEG s peptidmi s nízkou molekulovou hmotnosťou, akým je GRF, ktorý bol pripravený peptidovou syntézou na tuhej fáze. V týchto konjugátoch sa vopred pripravená pegylovaná aminokyselina zaviedla do peptidovej sekvencie počas syntézy na tuhej fáze. Tento postup však dramaticky komplikuje purifikáciu produktu, o ktorej je známe, že je kritickým krokom syntézy na tuhej fáze. V prípade prítomnosti PEG je kvôli jeho vysokej molekulovej hmotnosti a polydisperzivite, pravdepodobné, že výsledný produkt bude získaný s neprijateľnými nečistotami a/alebo, že produktom budú chýbať aminokyseliny, pričom produkty s chýbajúcimi aminokyselinami sa považujú za bežne sa vyskytujúce pri Merrifield postupe.
V súčasnosti bola v literatúre publikovaná mono-pegylácia, čo znamená, že je použitím syntézy na tuhej fáze pripojená len jedna PEG molekula na špecifické aminokyselinové zvyšky [Ala15]-hGRF(1-29)-NH2 (Felix a iný, 1995). V tejto štúdii bolo dokázané, že [Ala15]-hGRF(1-29)-NH2 pegylovaný na zvyškoch 21 alebo 25 si zachováva úplný in vitro potenciál rodičovského [Ala15]-hGRF(1-29)-NH2. Nie sú však uvedené žiadne in vivo údaje, ktoré by ukázali, či tieto pegylované konjugáty vykazujú dlhšie trvajúci účinok v porovnaní s nepegylovaným náprotivkom.
Neskoršie sa demonštrovalo (Campbell a iný, 1997), že pripojenie, opäť prostredníctvom syntézy na tuhej fáze, PEG s rôznymi molekulovými hmotnosťami na C-koniec rôznych analógov hGRF, predĺžilo trvanie účinku tak v prasačom, ako aj v myšom modeli, v porovnaní s nepegylovaným náprotivkom.
Na rozdiel od prípravy mono-pegylovaného hGRF, ktorá bola uvedená vyššie, predložený vynález sa týka miestne špecifickej pegylácie hGRF vo fáze roztoku.
Zistilo sa, že hGRF má nízku rozpustnosť v neutrálnom/alkalickom tlmivom roztoku, a zistili sa tiež chemické podmienky, pri ktorých nastáva najúčinnejšia pegylačná reakcia. V nariedenom hGRF roztoku má hydrolýza aktivovaného PEG (ako PEG esteru) tendenciu znižovať výťažok pegylačnej reakcie.
Prihlasovatelia zistili, že vo vhodnom rozpúšťadle, v ktorom má hGRF vysokú rozpustnosť, je možné uskutočňovať miestne-špecifickú pegylačnú reakciu vo fáze roztoku.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob miestne špecifickej prípravy hGRF-PEG konjugátov, ktoré obsahujú jednu alebo viac ako jednu PEG jednotku na jeden mol hGRF kovalentne naviazanú na Lys12 a/alebo Lys21 a/alebo N“, v ktorom sa konjugačná reakcia medzi hGRF peptidom a aktivovaným PEG uskutočňuje v roztoku a požadovaný hGRF-PEG konjugát sa izoluje z reakčnej zmesi a purifikuje sa.
Ak nie je východiskový hGRF peptid chránený, sa PEG reťazce budú viazať s vysokými výťažkami a väčšinou výhradne na primárne aminoskupiny (ε-aminoskupiny) Lys12, Lys21 a/alebo N“, v závislosti na reakčných podmienkach. Získali sa nasledujúce štyri konjugáty, ktoré spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Stechiometrický pomer hGRF:PEG v konjugátoch závisí najmä na molárnom pomere PEG ku hGRF: hGRF-PEG konjugát, v ktorom je 1 PEG molekula kovalentne naviazaná na Lys12, hGRF-PEG konjugát, v ktorom je 1 PEG molekula kovalentne naviazaná na Lys21, hGRF-2PEG konjugát, v ktorom sú 2 PEG molekuly kovalentne naviazané tak na Lys12, ako aj na Lys21, a hGRF-3PEG konjugát, v ktorom sú 3 PEG molekuly kovalentne naviazané tak na Ls12, ako aj na Lys21, a aj na N“.
N“ v predloženom vynáleze znamená aminoskupinu na N-konci peptidu (Tyr).
-5Okrem tohto kroku je možné uskutočniť jednoduchú chromatografickú frakcionalizáciu konjugátov získaných v reakcii, buď gélovou filtráciou alebo priamym nanesením na C18 HPLC kolónu s eluovaním v gradiente voda/acetonitril. Druhý spôsob je výhodný, keďže je ho možné použiť na prípravu a purifikáciu produktov vo veľkých množstvách.
Takže hlavným uskutočnením predloženého vynálezu je spôsob miestnešpecifickej prípravy rôznych hGRF-PEG konjugátov, ktoré obsahujú jednu alebo viac ako jednu PEG jednotku (na jeden mol hGRF), ktorá je kovalentne naviazaná na Lys12 a/alebo Lys21 a/alebo Na, ktorý spočíva v tom, že sa pegylačná reakcia uskutočňuje v roztoku a požadovaný hGRF-PEG konjugát sa purifikuje napríklad chromato-grafickými metódami.
HGRF-PEG obsahujúce jednu alebo viacero PEG jednotiek (na jeden mol hGRF), ktoré sú kovalentne naviazané na Lys12 a/alebo Lys21 a/alebo N“, taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Výhodnými produktami podľa predloženého vynálezu sú hGRF-PEG konjugáty, v ktorých je 1 PEG molekula kovalentne naviazaná na Lys12 alebo na Lys21.
V súlade s iným uskutočnením podľa predloženého vynálezu, ak je jedna lebo viacero z týchto troch aminoskupín, na ktoré sa viažu PEG reťazce, reverzibilne chránená určitými chemickými skupinami proti pegylácia, bude výsledkom pegylačnej reakcie priamo požadovaný konjugát so špecifickými pegylačnými miestami, ktorý je možné z reakčnej zmesi izolovať napríklad ultrafiltráciou alebo inými chromatografickými spôsobmi. Vtákom prípade môže spôsob prípravy voliteľne navyše zahŕňať aj odstraňovanie ochranných skupín.
Odstraňovanie ochranných skupín sa výhodne uskutočňuje známymi postupmi, ktoré závisia od toho aká chemická ochranná skupina sa má odstrániť.
Podľa tohto vynálezu znamená výraz „hGRF“, ak nie je uvedené inak, akékoľvek ľudské GRF peptidy, najmä 1-44,1-40,1-29 peptidy a ich zodpovedajúce amidy (obsahujúce amidovú skupinu na N-konci alebo na C-konci). Výhodným hGRF peptidom je hGRF(1-29)-NH2, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená ako sekv. č. 1.
„Aktivovaný PEG“ (alebo pegylačné činidlo) je akýkoľvek PEG derivát, ktorý môže byť použitý ako proteínový modifikátor, pretože obsahuje funkčnú skupinu
-6schopnú reagovať s nejakou funkčnou skupinou v proteíne/peptide, a tým vytvoriť PEG-proteín/peptid konjugáty. Zhrnutie PEG derivátov užitočných ako proteínové modifikátory sa nachádza v publikácii Harris (1985). Aktivovaný PEG môže byť alkylačné činidlo, ako PEG aldehyd, PEG epoxid alebo PEG trezylát, alebo môže byť acylačným činidlom, ako PEG ester.
Aktivovaný PEG sa výhodne používa vo svojej monometoxylovanej forme. Výhodne má molekulovú hmotnosť medzi 2000 a 20 000. Na prípravu aktivovaného PEG podľa predloženého vynálezu je výhodný najmä monometoxylovaný PEG5000·
Ak je PEG acylačným činidlom, výhodne obsahuje buď norleucínový alebo ornitínový zvyšok naviazaný na PEG časť prostredníctvom amidovej väzby. Tieto zvyšky umožňujú presné stanovenie naviazania PEG jednotiek na mol peptidu (pozri napríklad Sartore a iný, 1991). Preto je výhodnejším aktivovaným PEG najmä monometoxylovaný PEG5000 pripojený prostredníctvom amidovej väzby na alfa aminoskupinu norleucínu, ktorý je aktivovaný na karboxyskupine ako sukcínimidylester.
Bežne používanými sú aj rozvetvené PEG. Rozvetvené PEG môžu byť vyjadrené ako R(-PEG-OH)m, kde R znamená centrálnu jadrovú časť, ako pentaerytritol alebo glycerol, a m znamená počet vetviacich sa ramien. Počet vetviacich sa ramien (m) môže byť v rozsahu od troch do sto alebo viac. Hydroxylové skupiny sú chemicky modifikované.
Iná rozvetvená forma, ako napríklad forma opísaná v PCT prihláške vynálezu WO96/21469, má jeden koniec, ktorý sa chemicky modifikuje. Tento typ PEG je možné vyjadriť ako (CH3O-PEG-)pR-X, kde p sa rovná 2 alebo 3, R znamená centrálne jadro ako lyzín alebo glycerol, a X predstavuje funkčnú skupinu ako karboxy, ktorá je predmetom chemickej aktivácie. Ešte ďalšia rozvetvená forma, „príveskový PEG“, má reaktívne skupiny, ako napríklad karboxy, pozdĺž PEG reťazca, a nie na konci PEG reťazcov.
Všetky tieto rozvetvené PEG je možné „aktivovať“, ako bolo uvedené vyššie.
„Chromatografické metódy“ znamenajú akúkoľvek techniku, ktorá je použitá na separáciu zložiek zmesi, prostredníctvom ich nanesenia na podklad (stacionárna fáza), cez ktorý prúdi rozpúšťadlo (mobilná fáza). Separačné princípy chromatografie sú založené na odlišnej fyzikálnej povahe stacionárnej a mobilnej fázy.
-7Niektoré konkrétne typy chromatografických metód, ktoré sú dobre známe z literatúry, zahŕňajú: kvapalnú, vysokotlakovú kvapalnú, iónovo-výmennú, absorpčnú, afinitnú, rozdeľovaciu, hydrofóbnu, reverznú fázovú, gélovú filtračnú, ultrafiltračnú chromatografiu, alebo chromatografiu na tenkej vrstve.
„Pegylácia“ je reakcia, ktorou sa získa konjugát PEG-proteín/peptid, vychádzajúc z aktivovaného PEG a zodpovedajúceho proteínu/peptidu.
Molárny pomer PEG:hGRF môže byť 1:1, 2:1 alebo 3:1, v závislosti od toho, aký konjugát sa má získať s vysokým výťažkom.
Rozpúšťadlo pegylačnej reakcie je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa vysokokoncentrovaný nikotínamidový vodný roztok, tlmivý vodný roztok rozkladacieho činidla (ako napríklad močoviny) alebo polárny organický roztok vybraný spomedzi dimetylsulfoxidu, dimetylformamid/tlmivého roztoku alebo acetonitril/tlmivého roztoku.
pH roztoku sa zvyčajne udržiava medzi 7 a 9.
Neobmedzujúci zoznam ochranných chemických skupín pre Lys12 a Lys21 zahŕňa: Alloc (alyloxykarbonyl), Dde (1-(4,4-dimetyl-2,6-dioxocyklohex-1-ylidén)etyl), Adpoc (1-(1‘-adamantyl)-1-metyl-etoxykarbonyl) alebo 2-CI-Z (2-chlórbenzyloxykarbonyl). Alloc je výhodnou ochrannou skupinou pre lyzínovú skupinu.
Po pegylácii je Alloc možné odstrániť podľa jednej z metód opísaných v Greene T.W. a iný, 1991. Dde je možné odstrániť 2% hydrazínom v DMF (pozri W.C. Chán a iný, 1995). Adpoc je možné odstrániť podobne ako Alloc (pozri aj Diek F. a iný, 1997). 2-CI-Z môže vyžadovať silnejšiu kyslú deprotekciu (HF, TFMSA, HBr) alebo hydrogenáciu (pozri aj Tam a iný, 1987).
Ochrannými skupinami pre Na môžu byť alkylová skupina, ako metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, ŕerc-butyl, benzyl alebo cyklohexyl. Výhodnou skupinou je izopropyl. Tieto alkylové skupiny môžu byť zavádzané redukčnou alkyláciou (pozri Murphy a iný, 1988 alebo Hocart a iný, 1987).
Predložený vynález poskytuje aj [Na-izopropyl-Tyr1,Lys(Alloc)12]-hGRF a [Lys(Alloc)12,21]-hGRF ako nové medziprodukty na pegylačnú reakciu.
Zistilo sa tiež, že pegylácia podľa predloženého vynálezu:
1. nemodifikuje konformáciu peptidu,
2. zvyšuje odolnosť voči proteolytickej degradácii,
3. neovplyvňuje, alebo len mierne znižuje biologický účinok v závislosti na rozsahu pegylácie a
4. umožňuje získať produkty (konjugáty), ktoré sú rozpustnejšie vo vodných tlmivých roztokoch.
Predložený vynález ďalej poskytuje hGRF-PEG konjugáty v v podstate purifikovanej forme, aby boli vhodné na použitie vo farmaceutických prostriedkoch ako účinné zložky.
Ďalej predložený vynález poskytuje použitie konjugátov podľa vynálezu na výrobu liečiva na liečbu, prevenciu alebo diagnostiku porúch vzťahujúci sa k rastovému hormónu, ako napríklad nedostatku rastového hormónu (GHD), najmä na pediatrickú nedostatočnosť rastového hormónu.
Liečivo je výhodne vo forme farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje konjugáty podľa vynálezu spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo vehikulami. Takéto farmaceutické prostriedky predstavujú ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu.
Uskutočnením vynálezu je podávanie farmakologicky účinného množstva konjugátov podľa vynálezu subjektom, u ktorých je riziko vývoja choroby vzťahujúcej sa ku rastovému hormónu, alebo subjektom, ktoré už vykazujú takúto patológiu.
Ďalej vynález poskytuje spôsob liečby, prevencie alebo diagnostiky ochorení týkajúcich sa rastového hormónu, ktoré zahŕňajú podávanie účinného množstva konjugátov podľa vynálezu v prítomnosti jedného alebo viacerých farmaceutický prijateľných vehikúl.
„Účinné množstvo“ znamená množstvo účinných zložiek, ktoré je dostatočné na ovplyvnenie priebehu a vážnosti porúch opísaných vyššie, ktoré vedie k redukcii alebo k vymiznutiu takejto patológie. Účinné množstvo bude závisieť na spôsobe podávania a na stave pacienta.
„Farmaceutický prijateľný“ zahŕňa akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity účinnej zložky, a ktorý nie je toxický pre hostiteľa, ktorému sa podáva. Napríklad na parenterálne podanie môžu byť vyššie uvedené zložky formulované do dávkovej formy na injektovanie vo vehikulách ako fyziologický roztok, dextrózový roztok, sérový albumín a Ringerov roztok.
-9Okrem farmaceutický prijateľného nosiča môžu prostriedky podľa vynálezu obsahovať aj minoritné množstvá aditív, ako sú stabilizátory, vehikulá, tlmivé roztoky a konzervačné látky.
Môže byť použitý akýkoľvek spôsob podávania kompatibilný s aktívnym princípom. Výhodné je parenterálne podanie, ako podkožná, svalová alebo vnútrožilová injekcia. Dávka účinnej zložky, ktorá má byť podaná, závisí na lekárskom predpise v súlade s vekom, hmotnosťou a individuálnou reakciou pacienta.
Dávka účinnej zložky na humánnu terapiu môže byť medzi 5 a 6000 pg/kg telesnej hmotnosti a výhodne je dávka medzi 10 a 300 pg/kg telesnej hmotnosti.
Predložený vynález bol opísaný s odvolaním sa na špecifické uskutočnenia, ale obsah opisu zahŕňa všetky modifikácie a substitúcie, ktoré môžu byť vnesené priemerným odborníkov v oblasti, bez toho, aby sa prekročil rozsah nárokov.
Vynález bude ďalej opísaný prostredníctvom nasledujúcich príkladoch, ktoré žiadnym spôsobom neohraničujú predložený vynález. Príklady sa budú odvolávať na obrázky opísané nižšie.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje aminokyselinový sekvenciu hGRF(1-29)-NH2. Šípky označujú možné miesto (miesta) pegylácie.
Obrázok 2 znázorňuje reverznú fázovú HPLC chromatografiu zmesi získanej po pegylačnej reakcii v DMSO, ktorá sa uskutočňovala ako je opísané v príklade 1. Prvé dva hlavné vrcholy sú konjugáty, ktoré obsahujú 1 PEG reťazec na mol hGRF. Nasledujúci malý vrchol je konjugát hGRF:2PEG a posledný malý vrchol je konjugát hGRF:3PEG.
Obrázok 3a znázorňuje degradáciu hGRF(1-29) a PEG konjugátov podľa predloženého vynálezu subtilizínom.
Obrázok 3b znázorňuje degradáciu hGRF(1-29) a PEG konjugátov podľa predloženého vynálezu chymotrypsínom.
Obrázok 4 znázorňuje spektroskopickú charakterizáciu [Lys(MPEG5Ooo-CH2CO-Nle-CO)12,21-hGRF(1-29)-NH2] uskutočnenú cirkulárnym dichroizmom. Spektrá sú superimpozibilné so spektrami „prirodzeného“ hGRF.
-10Obrázok 5 znázorňuje biologický účinok rôznych hGRF-PEG konjugátov (z 1. DMSO prípravy) v CHO-hGRFR-LUC in vitro teste. Údaje predstavujú priemer troch nezávislých experimentov.
Obrázok 6 znázorňuje biologický účinok rôznych hGRF-PEG konjugátov (z 2. DMSO prípravy) v CHO-hGRFR-LUC in vitro teste. Údaje predstavujú priemer troch nezávislých experimentov.
Obrázok 7 znázorňuje biologický účinok rôznych hGRF-PEG konjugátov (z nikotínamidovej prípravy) v CHO-hGRFR-LUC in vitro teste. Údaje predstavujú priemer troch nezávislých experimentov.
Obrázok 8 znázorňuje biologický účinok rôznych hGRF-PEG konjugátov (z 1. DMSO prípravy) na vylučovanie GH z potkanej hypofýzy in vitro.
Obrázok 9 znázorňuje biologický účinok rôznych hGRF-PEG konjugátov (z 2. DMSO prípravy) na vylučovanie GH z potkanej hypofýzy in vitro.
Obrázok 10 znázorňuje časovú krivku odpovede plazmovej hGRF a sérovej GH hladiny po hGRF (400 pg/potkana) i.v. injekcii u samčekov potkanov. Každý bod predstavuje ± SEM hodnotu získanú z deviatich potkanov.
Obrázok 11a (pozri prvý graf na danej strane) predstavuje časovú krivku odpovede sérových GH hladín po i.v. injekcii, 400 pg/potkana, hGRF-PEG konjugátov (DMSO príprava) u samčekov potkanov. Každý bod predstavuje priemernú hodnotu získanú z troch potkanov.
Obrázok 11b (pozri druhý graf na danej strane) predstavuje časovú krivku odpovede plazmových hGRF hladín po i.v. injekcii, 400 pg/potkana, hGRF-PEG konjugátov (DMSO príprava) u samčekov potkanov. Každý bod predstavuje priemernú hodnotu získanú z troch potkanov.
Obrázok 12 znázorňuje reštrikčnú mapu plazmidu pcDNA3-hGRF-R, ktorý bol použitý v reportérovom génovom teste na stanovenie GRF aktivity.
Obrázok 13 znázorňuje reštrikčnú mapu plazmidu pTF5-53 LUC použitého v reportérovom génovom teste na stanovenie GRF aktivity.
-11 Príklady uskutočnenia vynálezu
Skratky
Acetonitril (ACN), alyloxykarbonyl (Alloc), berizyl (BZL), ŕerc-butyloxykarbonyl (Boe), dichlórmetán (DCM), diizopropyletylamín (DIEA), dimetylformamid (DMF), dimetylsulfoxid (DMSO), 9-fluorenylmetyloxykarbonyl (FMOC), 2-[1H-benzotriazol-1yl]-1,1,3,3-tetrametylurónium hexafluórfosfát (HBTU), 1-hydroxybenzotriazol (HOBt), metyl-ŕerc-butyléter (MTBE), norleucín (Nie), M-metylpyrolidón (NMP), 2,2,5,7,8pentametyl-chróman-6-sulfonyl (Pmc), terc-butyl (tBu), kyselina trifluóroctová (TFA), trifenylmetyl (Trt), Mw - molekulová hmotnosť.
Príklad 1
Pegylácia hGRF vo fáze roztoku
V týchto experimentoch bol ako pegylačné činidlo použitý monometoxylovaný PEG5Ooo (MPEG5ooo), ktorý je prostredníctvom amidovej väzby pripojený na alfa aminoskupinu norleucinu, ktorý je aktivovaný na karboxyskupine ako sukcínimidylový ester. Môže byť pripravený spôsobom ako je opísaný napríklad v Lu a iný,
1994.
Ľudský GRFi-29 hGRF(1-29)-NH2, dodávaný firmou Bachem, bol použitý ako hGRF peptid.
Použité boli alternatívne reakčné podmienky A až E, ktoré zabezpečili nízku rozpustnosť hGRF(1-29) vo vodnom roztoku pri neutrálnom alebo mierne alkalickom pH, ktoré je potrebné na pegyláciu.
A. Dimetylsulfoxid: 20 mg peptidu sa rozpustilo v 1 ml DMSO a naraz sa pridali potrebné množstvá pegylačného činidla.
B. Dimetylformamid/0,2 M borátový tlmivý roztok: pH 8,0, v objemovom pomere 1:1 sa naraz pridali príslušné množstvá pegylačného činidla.
C. Vysokokoncentrovaný nikotínamidový vodný roztok (200 mg/ml): 20 mg nikotínamidu sa pridalo do roztoku 40 mg hGRF(1-29) v 1 ml 10mM kyseliny octovej. Do roztoku kyseliny sa pridal 1 ml 0,2M borátového tlmivého roztoku, pri ρΗ 8,0, aby sa dosiahlo požadované pH, pred pridaním príslušných množstiev pegylačného činidla.
D. Acetonitrilový/0,2 M borátový tlmivý roztok: pH 8,0, v objemovom pomere 1:1 sa naraz pridali príslušné množstvá pegylačného činidla.
E. 0,2M borátový tlmivý roztok, 5M močovina, pH 8,0, a naraz sa pridali príslušné množstvá pegylačného činidla.
Za stáleho miešania sa pridávalo PEG reakčné činidlo, aby sa dosiahli konečné PEG:hGRF molárne pomery 1:1, 2:1 alebo 3:1. Výhodným pomerom je pomer 2:1.
Použitie rôznych PEG:hGRF molárnych pomerov umožňuje prípravu reakčnej zmesi, v ktorej je predominantným konjugátom požadovaný konjugát.
Reakčný roztok sa pred purifikáciou môže nechať stáť 5 hodín.
Získali sa nasledujúce 4 hGRF-PEG konjugáty (A1 a A4):
A1: [Lys(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1-29)-NH2], A2: [Lys(MPEG50oo-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2], A3: [Lys(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)12'21-hGRF(1-29-NH2] a
A4: N“-(MPEG50oo-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)12'21-hGRF(129-NH2],
Nadbytok DMSO, dimetylformamidu, acetonitrilu a močoviny a vedľajší produkt reakcie (hydroxysukcínimid) sa odstránili gélovou ultrafiltráciou použitím 1000 D odstrihnutej membrány. Objem sa nastavil na 10 ml 10 mM kyselinou octovou a potom sa znížil na 1 ml. Tento postup sa opakoval trikrát.
HGRF-PEG konjugáty sa izolovali gélovou filtračnou chromatografiou alebo alternatívne reverznou fázovou chromatografiou.
Príklad 2
Gélová filtračná chromatografia
Gélovou filtračnou chromatografiou sa produkty rozdelili na frakcie na základe rozličnej molekulovej hmotnosti zložiek (v tomto prípade konjugáty hGRFPEG 1:1, Mw = 8358; hGRF-PEG 1:2, Mw = 13358 a hGRF-PEG 1:3, Mw = 18358.
Nekonjugovaný hGRF, Mw = 3358). Separácia sa uskutočňovala použitím série
-13systému kolón Superdex 75-Superose 12 resin (Biotech, Pharmacia), pričom eluovanie prebiehalo s 10 ml kyseliny octovej pri rýchlosti prietoku 15 ml/min.
Nazhromaždené 1ml frakcie sa analyzovali pri OD 280 nm na stanovenie obsahu proteínu a jódovým testom na stanovenie obsahu PEG (Sims a iný, 1980).
Po pegylácii v DMSO sa použitím hGRF:PEG molárneho pomeru 1:1 získali tri vrcholy: hGRF-PEG konjugát pri elučnom objeme 132 ml (hlavný vrchol); hGRF-PEG konjugát pri elučnom objeme 108 ml (malý vrchol); a nekonjugovaný hGRF pri elučnom objeme 108 ml (malý vrchol).
Po pegylácii v DMSO sa použitím hGRF:PEG molárneho pomeru 1:2 získali tri vrcholy: hGRF-PEG konjugát pri elučnom objeme 108 ml (hlavný vrchol); hGRF-PEG konjugát pri elučnom objeme 132 ml (malý vrchol); a hGRF-PEG konjugát pri elučnom objeme 73 ml (malý vrchol).
Po pegylácii v DMSO sa použitím hGRF:PEG molárneho pomeru 1:3 získali dva vrcholy: hGRF-PEG konjugát pri elučnom objeme 73 ml (hlavný vrchol); a hGRF-PEG konjugát pri elučnom objeme 108 ml (malý vrchol).
Eluované vrcholy sa zhromaždili, zakoncentrovali ultrafiltráciou použitím 1000 D zostrihnutej membrány, lyofilizovali sa, rozpustili sa v 10mM kyseline octovej a charakterizovali sa, ako je uvedené nižšie, aby sa identifikovali a kvantifikovali.
Zistilo sa, že vrchol pri elučnom objeme 73 ml zodpovedá zlúčenine A4. Zistilo sa, že vrchol pri elučnom objeme 132 ml zodpovedá zlúčenine A3.
Zistilo sa, že vrchol pri elučnom objeme 10 ml zodpovedá zmesi zlúčenín A2 aA1.
Zistilo sa, že vrchol eluovaný pri 232 ml je nekonjugovaný hGRF.
Tento spôsob purifikácie však neumožňuje separáciu hGRF-PEG konjugátov s rovnakou molekulovou hmotnosťou, ale rôznym pegylačným miestom (pozičné izoméry).
Príklad 3
Reverzná fázová chromatografia
-14Špecifickejšia frakcionalizácia sa uskutočnila prostredníctvom hydrofóbnej chromatografie použitím RP-HPLC C18 kolóny. Týmto postupom je možné oddeliť eventuálne izoméry, ktoré majú rovnakú molekulovú hmotnosť. V skutočnosti sa zistilo, že pri tomto spôsobe sa rozdelil jeden vrchol zodpovedajúci konjugátom s 1 kovalentne naviazaným PEG, ktorý sa získal gélovou filtráciou, na dva vrcholy.
Reverzná fázová chromatografia sa uskutočňovala použitím RP-HPLC C18 preparatívnej kolóny (Vydac), ktorá sa eluovala gradientom H20/0,05%TFA (elučné činidlo A) a acetonitril/0,05% TFA (elučné činidlo B), nasledovne:
až 5 min až 35 min až 38 min až 40 min
35% A
35% A 2% A
2% A
2% A -> 35% A rýchlosť prietoku: 10 ml/min; slučka 1 μΙ; UV-Vis. Detektor pri 280 nm.
Po pegylácii v DMSO, použitím hGRF:PEG molárneho pomeru 1:1, sa získali
| 4 vrcholy: | ||
| 1 | 13,2 min | hlavný vrchol; |
| 2 | 13,7 min | hlavný vrchol; |
| 3 | 14,4 min | malý vrchol; a |
| 4 | 8,9 min | malý vrchol. |
Po pegylácii v DMSO, použitím hGRF:PEG molárneho pomeru 1:2, sa získali vrcholy:
| 1 | 13,2 min | malý vrchol; |
| 2 | 13,7 min | hlavný vrchol; |
| 3 | 14,4 min | hlavný vrchol; a |
| 4 | 15,5 min | malý vrchol. |
Po pegylácii v DMSO, použitím hGRF:PEG molárneho pomeru 1:3, sa získali vrcholy:
| 1 | 14,4 min | malý vrchol; a |
| 2 | 15,5 min | hlavný vrchol. |
Eluované vrcholy sa zhromaždili, evaporovali sa, aby sa eliminoval acetonitril a TFA, a potom sa lyofilizovali. Suchý produkt sa rozpustil v 10mM roztoku kyseliny octovej a analyzoval sa, ako je uvedené nižšie, aby sa identifikovali a kvantifikovali izolované druhy.
Zistilo sa, že hGRF-PEG konjugát, ktorý eluoval v 13,2 min, je zlúčenina A1 (GFR-1PEG, 1. vrchol).
Zistilo sa, že hGRF-PEG konjugát, ktorý eluoval v 13,7 min, je zlúčenina A2 (GFR-1PEG, 2. vrchol).
Zistilo sa, že hGRF-PEG konjugát, ktorý eluoval v 14,4 min, je zlúčenina A3 (GFR-2PEG).
Zistilo sa, že hGRF-PEG konjugát, ktorý eluoval v 15,5 min, je zlúčenina A4 (GFR-3PEG).
Zistilo sa, že vrchol eluovaný v 8,9 min, je nekonjugovaný hGFR.
Typický príklad reverznej fázovej chromatografie pegylovaných produktov získaných použitím 2:1 PEG:hGRF molárneho pomeru je ilustrovaný na obrázku 2.
Suché produkty sa získali evaporáciou/lyofilizáciou produktu.
Príklad 3a
Pegylácia hGRF použitím PEG10000 vo fáze roztoku
V tomto príklade bol použitý rozvetvený monometoxylovaný PEG s molekulovou hmotnosťou 10 000 Daltonov s lyzinom ako oddeľovačom (dodávaný firmou Shearwater Polymers, Inc.). Tento rozvetvený PEG sa získal pripojením PEG5000 ku každej lyží novej aminoskupine.
Karboxylová skupina oddeľovacieho lyzínu, aktivovaná ako sukcinimidylester reagovala v DMSO s aminoskupinami peptidu hGRF(1-29)-NH2 použitím molárneho pomeru 0,9 mol PEG ku 1 mol GRF.
Rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa frakcionoval gélovou vylučovacou chromatografiou v preparatívnej kolóne Superose 12 TM. Eluovali sa dva vrcholy zodpovedajúce dvom hGRF-PEG konjugátom. Prvý, malý vrchol, zodpovedal konjugátu, ktorý mal dve PEG10000 jednotky naviazané na hGRF, druhý, hlavný vrchol, zodpovedal konjugátu, ktorý obsahoval jednu PEG10000 jednotku na hGRF.
-16Príklad 3a
Pegylácia hGRF použitím PEG20000 vo fáze roztoku
V tomto príklade bol použitý rozvetvený monometoxylovaný PEG s molekulovou hmotnosťou 20 000 Daltonov s lyzínom ako oddeľovačom (dodávaný firmou Shearwater Polymers, Inc.).
Tento rozvetvený PEG sa získal pripojením PEG10000 ku každej lyzínovej aminoskupine.
Karboxylová skupina oddeľovacieho lyzínu, aktivovaná ako sukcinimidylester reagovala v DMSO s aminoskupinami peptidu hGRF(1-29)-NH2 použitím molárneho pomeru 0,9 mol PEG ku 1 mol GRF.
Rozpúšťadlo sa odstránilo lyofylizáciou a zvyšok sa frakcionoval gélovou vylučovacou chromatografiou v preparatívnej kolóne Superose 12 TM. Získaný bol jeden vrchol zodpovedajúci konjugátu, ktorý obsahuje jednu PEG2oooo jednotku na hGRF.
Príklad 4
Analytická charakterizácia hGRF-PEG konjugátov
Produkty získané, ako bolo uvedené vyššie, sa skúmali z hľadiska naviazania PEG reťazcov, na základe nasledujúcich testov:
1. Na stanovenie voľných aminoskupín sa použila kolorimetrická metóda založená na trinitrobenzénsulfonáte (ako je opísané v Habeed a iný, 1966);
2. Na stanovenie obsahu PEG sa použila kolorimetrická metóda založená na jódovom teste (ako je opísané v Sartore a iný, 1980);
3. Pri aminokyselinovej analýze bol použitý počet PEG reťazcov na základe norleucínu ako reportérových reťazcov (oko je opísané v Sartore a iný, 1991),
4. Na stanovenie molekulovej hmotnosti konjugátov bola použitá hmotnostná spektroskopia.
MALDI hmotnostná spektrometria bola použitá na stanovenie molekulovej hmotnosti konjugátov a na stanovenie ich polydisperzivity, ktorá bola výsledkom polydisperzivity východiskového PEG.
Miesta pripojenia PEG na hGRF-PEG konjugáty boli analyzované prostredníctvom aminokyselinovej sekvencie. Každá vzorka sa 100 krát nariedila. Potom sa 10 μΙ tohto roztoku (približne 50 pmol) nanieslo na sekvenátor.
Čistota výsledného produktu sa potvrdila aj RP-HPLC analytickou chromatografiou.
Analýza sa uskutočňovala použitím C18 analytickej kolóny (Vydac) s eluovaním s gradientom H20/0,05% TFA (eluent A) a acetónitrilom/0,05% TFA (eluent B) nasledovne:
| 0 až 5 min | 80% A |
| 6 až 50 min | 80% A -> 5% A |
| 50 až 52 min | 5% A |
| 52 až 54 min | 5% A 80% A. |
Rýchlosť prietoku 1 ml/min, slučka 20 μΙ, UV-Vis Detektor pri 226 nm. Nekonjugovaný hGRF sa eluoval pri 20,7 min.
Zlúčenina A1 sa eluovala v 22,9 min, zlúčenia A2 sa eluovala v 23,4 min, zlúčenina A3 v 24,4 min a zlúčenina A4 v 25,5 min.
Cirkulárnym dichroizmom sa uskutočnila konformačná charakterizácia prirodzených peptidov a peptidov s naviazaným polymérom.
Spektroskopická charakterizácia nekonjugovaného hGRF a hGRF-PEG konjugátov sa uskutočňovala cirkulárnym dichroizmom v rozsahu od 190 do 300 nm. Vzorky (50 μg/ml) sa rozpustili v 10mM kyseline octovej alebo v zmesi metanol/10mM kyselina octová v molárnych pomeroch 30:70 a 60:40. Vo všetkých vyššie uvedených roztokoch sa nekonjugovaný hGRF a hGRF-PEG konjugáty správali superimpozabilne, ako je znázornené na obrázku 4 pre zlúčeninu A3. V roztoku kyseliny octovej zaujímali peptidy náhodnú konfomáciu, zatiaľ čo pri zvyšujúcom sa obsahu metanolu zaujímali peptidy α-helix štruktúru.
Z výsledkov vyplýva, že PEG konjugácia významne nemení štrukturálne vlastnosti peptidu.
Príklad 5
Stanovenie stability hGRF-PEG konjugátov
-18Proteolytická stabilita hGRF a hGRF-PEG konjugátov sa skúmala použitím proteolytických enzýmov, ako subtilizínu a chymotrypsínu.
Štúdia so subtilizínom sa uskutočňovala inkubovaním 0,297mM peptidového roztoku pri 4 °C v 0,1 M Tris-HCI, 0,05M CaCh, pH 8,0, pričom molárny pomer peptidu ku proteáze bol 1:50 000.
Degradačné správanie sa sledovalo analytickou RP-HPLC použitím C18 kolóny s eluovaním v rovnakých podmienkach ako bolo uvedené v príklade 4. Výška zodpovedajúceho vrcholu východiskovej zlúčeniny sa vypočítala pred inkubovaním s proteolytickým enzýmom a po plánovanom čase inkubovania. Stanovilo sa percento zvyšnej výšky v naplánovanom čase a je uvedené na obrázkoch 3a a b.
Príklad 6
Pegylácia s alkalickým PEG
HGRF sa konjugoval s monometoxylovaným PEG aktivovaným rôznymi acylačnými skupinami, ako aj alkylačnými skupinami.
Alkylačný PEG je výhodný, keďže výsledkom sú konjugáty, ktoré si zachovávajú pozitívny náboj na lyzínovom zvyšku.
Izolácia a charakterizácia sa uskutočňovali ako bolo opísané v príkladoch 1 až 4.
Príklad 7
Zhodnotenie aktivity hGRF-PEG konjugátov
Materiály
Testované zlúčeniny ľudský GRFi-29 hGRF(1-29)-NH2, vzorka 1299201, dodávané firmou Bachem; ľudský GRF3.29 hGRF(3-29), dodávané firmou Bachem;
ľudský GRF3.29, dodávané firmou ISL; a hGRF-PEG konjugáty pripravené ako bolo opísané vyššie
-19Reakčné činidlá
CHO-hGRFR-LUC in vitro test
MEM alfa médium s ribonukleozidmi a deoxyribinukleozidmi (Gibco) doplnenými s 10% fetálnym hovädzím sérom (Gibco) plus 600 pg/ml geneticín-G418 sulfátu (Gibco);
Lyzačné činidlá pre bunkové kultúry (Promega);
Reakčné činidlo pre luciferázový test (Promega); a
Luclite (Packard).
In vitro biotest s potkaními bunkami hypofýzy
Earle vyvážené soli (EBSS) (Gibco) obohatené o 50 pg/ml gentamycínsulfátu (Sigma).
Médium 199 (M199) s EBSS (Gibco) s 12,5% fetálnym hovädzím sérom (FBS) (Gibco) a 50 pg/ml gentamycínsulfátu.
Potkaní GH testovací kit dodávaný firmou Amersham.
Enzymatický roztok na štiepenie tkaniva (doplnené do 30 ml s EBSS).
120 mg kolagenázy (Sigma) mg hyaluronidázy (Sigma) mg Dnázy I (Sigma)
900 mg BSA (Sigma)
Po rekonštitúcii sa roztok filtroval sterilizáciou a umiestnil sa na 37 °C.
In vivo biotest
Potkaní GH rádioimunotestovací kit dodávaný firmou Amersham.
Humánny GRF(1-44) rádioimunotestovací kit dodávaný firmou Phoenix Pharmaceutical.
Zvieratá
Použité boli SPF dospelé samčeky Sprague-Dawley potkanov, s telesnou hmotnosťou 200 až 250 g, dodávané firmou Charles River, po aklimatizáčnej dobe najmenej 7 dní.
-20Metódy
CHO-hGRFR-LUC in vitro test
CHO-hGRFR-LUC (kloň 1-11-20) je klonovaná bunková línia, ktorá sa získala kotransfekciou pcDNA3-hGRF a pTF5-53 LUC vektorov do CHO-DUKX bunkovej línie.
Plazmid pcDNA3-hGRF-R sa skonštruoval zavedením cDNA receptora pre faktor podieľajúci sa na vylučovaní ľudského rastového hormónu (hGRF-R) do pcDNA3 expresného vektora. Bluescript plazmid obsahujúci hGRF-R cDNA láskavo poskytol Dr. B. Gaylinn (University of Virginia) a pcDNA3 cicavčí expresný vektor bol získaný od firmy Invitrogen. HGRF-R kódujúca sekvencia bola riadená ľudským cytomegalovírusovým (CMV) promótorom. Reštrikčná mapa je uvedená na obrázku
12.
Plazmid pTF5-53LUC sa skonštruoval zavedením c-fos cAMP responzívneho elementu spolu s jeho endogénnym promótorom pred sekvenciu kódujúcu luciferázu do plazmidu poLuc. CAMP responzívny element a c-fos promótor sa získali z plazmidu pTF5-53 (opísaný vo Fish a iný, 1989). Reporterový génový vektor bez promótora (poLuc) s viacnásobnými klonovacími miestami pred sekvenciou kódujúcou luciferázu sa získal od Dr. Brasiera (University of Texas.Galveston). Jeho reštrikčná mapa je uvedená na obrázku 13.
Tieto CHO-DUKX bunky získané vyššie uvedenou kontransfekciou rutinne rástli v MEM alfa médiu obsahujúcom ribonukleozidy a deoxyribonukleozidy, ktoré bolo obohatené o 10% fetálne hovädzie sérum a 600 pg/ml gentacín G418 sulfátu.
Bunky sa vysiali (40 000 buniek/jamku) na biele 96-jamkové platne (Dynatech) a inkubovali sa 16 až 18 hodín v 200 μΙ rastovom médiu pred testom.
Na nasledujúci deň sa médium odstránilo a nahradilo sa médiom obsahujúcim rôzne koncentrácie hGRF(1-29) (Bachem) alebo rôzne hGRF-PEG konjugáty pred inkuboavím platní pri 37 °C, 3 % CO2 počas dvoch hodín. Na konci inkubovania sa CHO-hGRFR-LUC bunky dvakrát premyli s 200 μΙ PBS (Sigma) a potom sa lyžovali pridaním 50 pl bunkového kultivačného lyzátového reakčného činidla (Promega) do každej jamky. Po ďalšej 15 minútovej inkubácii pri laboratórnej
-21 teplote sa platne odčítali na luminometri (Dynatech) po zavedení 150 pl luciferázového testovacieho činidla (Promega).
Ako alternatívny spôsob sa CHO-hGRFR-LUC bunky vysiali v koncentrácii 50 000 buniek na jamku na konci inkubácie s rôznymi hGRF-PEG konjugátmi, premyli sa s PBS ako bolo uvedené vyššie. Do každej jamky sa pridalo 100 μΙ PBS s obsahom vápenatých a horečnatých iónov pred pridaním 100 μΙ Luclitu (Packard). Po 10 minútovej inkubácii pri laboratórnej teplote sa platne odčítali na luminometri (Lumicount - Packard). Výsledky sú vyjadrené v relatívnych svetelných jednotkách (RLU).
In vitro potkaní hypofýzny bunkový biotest pre hGRF(1-29)
Zvieratá (SPF samčeky SpraSue-Dawley potkanov s telesnou hmotnosťou 200 g) sa usmrtili inhalovaním ΟΟ2 a odobrali sa hypofýzy. Tkanivo sa jemne rozkrájalo a umiestnilo sa do fľaše s enzymatickým roztokom na poštiepenie tkaniva. Fľaša sa umiestnila do inkubátora na 37 °C na 1 hodinu.
Poštiepené tkanivo sa izolovalo a bunky sa dva krát premyli, spočítali sa a upravili sa na koncentráciu 5x105/ml. Bunky sa vysiali na 48-jamkové platne (200 μΙ/jamku) a platne sa umiestnili do inkubátora na 72 hodín. Po 72 hodinách sa bunky inkubovali s rôznymi koncentráciami hGRF 4 hodiny. Na konci inkubačnej doby sa zozbierali supernatanty a uskladnili sa pri -80 °C.
Obsah GH sa v každej vzorke analyzoval komerčným potkaním GH rádioimunotestovacím kitom.
In vivo test
Zvieratám sa i.v. injektoval hGRF(1-29) (400 pg/potkana). Niekoľko minút pred odobratím krvi sa zvieratá podrobili anestéze (ketamín-xylazín). Z každého potkana sa odobrali dva ml krvi z dolnej dutej žili. Vzorky sa rozdelili na dve alikvoty:
ml sa izoloval ako taký a po inkubačnej dobe približne 3 hodiny pri 37 °C a následnej centrifugácii sa získalo sérum; zvyšný 1 ml sa zhromaždil v liekovke s obsahom 50 μΙ 4mg/ml heparínového roztoku, okamžite sa uložil na ľad a plazma sa získala po centrifugácii pri 4 °C.
-22Vzorky krvi: izolovali sa v rôznych časových bodoch od injekcie testovanej zlúčeniny použitím rôznych zvierat. V každej experimentálnej sérii boli v každom časovom bode použité tri potkany.
Vzorky plazmy a séra sa okamžite zmrazili a uskladnili pri -20 °C.
GH sérové hladiny sa merali komerčným RIA kitom; hladiny hGRF v plazme sa merali komerčným RIA kitom pre hGRF(1-44).
Výsledky
Poznámka
V tejto časti a v zodpovedajúcich obrázkoch znamená GRF-1PEG 1. vrchol [Lys(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)21-hGRF(1-29)-NH2], GRF-1PEG 2. vrchol zodpovedá [Lys(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)12-hGRF(1 -29)-NH2], GRF-2PEG zodpovedá [Lys(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)12’21-hGRF(1-29)-NH2] a GRF-3PEG zodpovedá N“-(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)[Lys(MPEG5ooo-CH2-CO-Nle-CO)12·21hGRF( 1-29)-NH2],
CHO-hGRFR-LUC in vitro test
Účinky dvoch odlišných vzoriek hGRF-PEG konjugátov pripravených tak použitím DMSO, ako aj použitím CHO-hGRFR-LUC in vitro testu boli znázornené na obrázkoch 5 a 6.
Zistilo sa, že všetky prípravky sú aktívne hoci v menšom rozsahu v porovnaní s „prirodzeným“ hGRF (hGRF sa podrobil rovnakým purifikačným krokom, ktoré boli použité pre pegylované zlúčeniny), pričom GRF-1PEG (tak 1., ako aj 2. vrchol) boli účinnejšie ako GRF-2PEG a GRF-3PEG. Žiadny rozdiel nebol pozorovaný medzi hGRF a „prirodzeným“ hGRF (údaje nie sú uvedené).
Podobný in vitro biologický účinok hGRF-PEG konjugátov bol pozorovaný v oboch v DMSO pripravených vzorkách (obrázok 5 vs obrázok 6), ako aj pri konjugátoch zo vzorky pripravenej použitím nikotinamidového roztoku (obrázok 7). Obrázok 6 znázorňuje aj dva rozličné hGRF(3-29) prípravky, ktoré nemajú významný in vitro účinok v porovnaní s hGRF(1-29).
-23In vitro potkaní hypofýzny bunkový biologický test pre hGRFi.2g
V oboch uskutočnených testoch s hGRF-PEG konjugátmi z dvoch DMSO príprav, sa zistilo, že GRF-1PEG 1. vrchol je najaktívnejšou zlúčeninou, potom nasleduje GRF-1PEG 2. vrchol, GRF-2PEG a potom GRF-3PEG (obrázky 8 a 9). Tieto zistenia sú v dobrom súlade s výsledkami získanými v reportérovom génovom teste.
In vivo test
V predbežných experimentoch sa stanovili hladiny GH v sére a hladiny hGRF v plazme u potkanov po i.v. injekcii 400 pg hGRF. Relevantné výsledky sú ilustrované na obrázku 10. Ako je znázornené, tak GH, ako aj hGRF vrcholia v 10. minúte po injekcii hGRF. Potom koncentrácie GH v sére rýchlo klesajú a vracajú sa na základné hladiny po 60 minútach, zatiaľ čo koncentrácie hGRF v plazme ostávajú v rovnakom časovom intervale v konštantnej hladine.
Na obrázku 11a a 11b sú uvedené krvné hladiny GH a GRF v rôznych časových bodoch až do 48 hodiny u potkanov ošetrených 400 pg i.v. podanými GRF-1PEG 1. a 2., GRF-2PEG a GRF-3PEG (DMSO prípravky).
Všetky pegylované prípravky indukujú GH sérový vrchol po 10 minútach po ich i.v. injekcii podobne ako hGRFi.2g. Avšak, zatiaľ čo GRF-1PEG 1. a 2. vrchol a GRF-2PEG indukujú GH hladiny porovnateľné s hladinami získanými s hGRFi_2g, GRF-3PEG potvrdil svoj nižší účinok, ako bol zistený in vitro.
čo sa týka GRF plazmatických hladín, pozoroval sa úplne iný vzor pre GRF1 PEG 1. a 2. vrchol v porovnaní s GRF-2PEG a GRF-3PEG pripravené použitím DMSO alebo nikotínamidu. 48 hodín po injekcii GRF-1PEG 1. a 2. vrcholu sa koncentrácie GRF v plazme vrátili na základnú hodnotu, zatiaľ čo trvalejšie hladiny boli získané s GRF-2PEG a GRF-3PEG.
Príklad 8
Syntéza miestne chránených hGRF(1-29)-NH2 derivátov na tuhej fáze ako východiskových zlúčenín pre pegylačnú metódu
-24Uskutočnila sa syntéza hGRF(1-29)NH2 derivátov obsahujúcich špecifickú ochrannú skupinu (N-alyloxykarbonylovú skupinu) na primárnych aminoskupinách tak lyzíne 12, ako aj 21, na tuhej fáze. Účelom bolo umožniť miestne špecifickú pegyláciu na N“-konci. Iný amino-chránený derivát sa pripravil blokovaním N“-konca prostredníctvom acylácie lyzínu 12 N-alyloxykarbonylovou skupinou. Tento derivát bol použitý na miestne špecifickú pegyláciu lyzínu 21.
Materiál a metódy
Spôsoby syntézy peptidov
Všetky hGRF derivátové peptidové živice sa najprv spojili použitím Fmoc chemických postupov na Applied Biosystems Inc. model 431A peptidovom syntetizéry použitím nízko substituovanej (0,16 mmol/g) PAL-PEG-PS živice a dvojitého spájacieho a krycieho protokolu pre každý zvyšok, na optimalizáciu množstva a čistoty surového produktu. Ďalej sa [N-izopropyl-Tyr1, Lys(Alloc)12)hGRF(1-29)-NH2 peptidová živica manuálne ošetrila redukčným alkylačným postupom, aby sa pridala N-koncová izopropylová skupina.
Všetky peptidové živice sa štiepili zo zmesou TFA/1,2-etánditiol/tioanizol/voda [10:0,5:0,5:0,5 (objemový pomer)] počas 2 hodín a surové peptidy sa izolovali precipitáciou v MTBE a centrifugáciou. Lyofilizované surové peptidy sa purifikovali reverznou fázovou gradientovou HPLC použitím Vydac C 18 preparatívnej kolóny s 0,1% TFA/voda/acetonitrilovým tlmivým systémom. Všetky purifikované peptidy sa charakterizovali analytickou reverznou fázovou HPLC a MALD1-TOF hmotnostnou spektrometriou.
Materiály
Fmoc-L-aminokyseliny (Bachem Bioscience, Perseptive Biosystems, NovaBiochem); DMF, 20 litrový sud (J.T. Baker); Piperidín (Applied Biosystems, ChemImpex), HBTU (Rainin, Richelieu Biotechnoloties), NMM (Aldrich), anhydrid kyseliny octovej (Applied Biosystems), živice (Perseptive Biosystems, NovaBiochem); kyselina a-kyano-4-hydroxy-škoricová (Sigma), kyselina sinapová (Aldrich);
-25acetonitril (J .T. Baker), TFA (Sigma, Pierce), deinizovaná H2O (Millipore Milli-Q Water Systém). Ďalšie rozpúšťadlá a reakčné činidlá sú uvedené nižšie:
Reakčné činidlá/rozpúšťadlá
NMP
HBTU
0,5M HOBtvDMF
2,0M DIEAvNMP
Piperidín
Dichlórmetán
Anhydrid kyseliny octovej
Dodávateľ
Applied Biosystems Inc., J.T Baker
Applied Biosystems Inc.,
Richelieu Biotechnologies Inc.
Applied Biosystems Inc.,
Applied Biosystems Inc.,
Applied Biosystems Inc.,
Applied Biosystems Inc.,
Applied Biosystems Inc.,
Aminokyseliny: väčšina FMOC aminokyselín použitých νΑΒΙ 431A syntetizátore bola nakúpená od Applied Biosystems ako vopred navážené 1,0 mmol náplne. FMOC-Lys(Alloc)-OH bola kúpená vo veľkom od Perseptive Biosystems (FraminSham, MA) a náplne boli pripravené v laboratóriu. Všetky použité aminokyseliny mali L-konfiguráciu.
Živice: primárnymi živicami použitými pre hGRF analógy boli PAL-PEG-PS (peptidovoamidový spojovník - polyetylénglykol - polystyrén) živice. PAL-PEG-PS podklady, kúpené od PerSeptive Biosystems, trvalo poskytujú vynikajúce výsledky čo sa týka čistoty a výťažku surového produktu. Pre všetky deriváty bola použitá málo substituovaná živica 0,16 mmol/g. Málo substituované živice sa bežne používajú pre dlhé, ťažké sekvencie, aby sa zaistilo lepšie spájanie tým, že sa redukuje priestorová zábrana a vytváranie štruktúry β-skladaného listu v rastúcich peptidových reťazcoch.
Metódy
Zostavovanie reťazca - Applied Biosystems Inc. Model 431A peptidový syntezátor
Chránené preptidové reťazce sa najprv zostavili použitím FMOC stratégie na
Applied Biosystem Inc. Model 431 A peptidovom syntezátore, ktorý využíva programované rýchle FMOC cykly (FastMoc™). HBTU je použitý na aktiváciu
-26spájania, 20% piperidín na odstránenie ochranných skupín a NMP ako hlavné rozpúšťadlo používané na odstraňovanie ochranných skupín, na rozpustenie aminokyselín a na premytie živíc. Aminokyseliny sa zavádzajú vo vopred odvážených 1,0 mmol náplniach. 0,25mmol FastMoc™ cykly používajú 1,0mmol náplne a 40ml reakčné nádoby.
Zostavovanie reťazcov - postup
Kroky pre 0,25mmol programované cykly je možné zhrnúť nasledovne:
1. Odstránenie ochrannej skupiny z piperidínu - Živica sa najprv premyje s NMP, potom sa pridá 18% roztok piperidín/NMP a ochranná skupina sa odstraňuje 3 minúty. Reakčná nádoba sa vysuší a pridá sa 20% piperidínový roztok a odstraňovanie ochrannej skupiny pokračuje približne 8 hodín.
2. Rozpustenie aminokyseliny -NMP (2,1 g) a 0,9 mmol 0,45M HBTU/HOBt v DMF (2,0 g) sa pridalo do zásobníka a miešalo sa 6 minút.
3. NMP premývania - Reakčná nádoba sa vysušila a živica sa premývala 5 krát s NMP.
4. Aktivácia aminokyseliny a transfer do reakčnej nádoby (RV) - 1 ml 2M DIEA v NMP sa pridal do náplne, aby sa začala aktivácia rozpustenej aminokyseliny, potom sa táto preniesla zo zásobníka do RV.
5. Spájanie a finálne premývanie - Párovacia reakcia medzi aktivovanou aminokyselinou a N-koncovou peptidovou živicou bez ochrannej skupiny trvá približne 20 minút a potom sa RV vysuší a živica sa premyje s NMP.
6. Ukončenie (ak je potrebné) - Približne 12 ml 0,5M anhydridu kyseliny octovej, 0.125M DIEA a 0.015M HOBt v NMP roztoku sa pridá do reakčnej nádoby a vortexuje sa 5 minút. To by malo acetylovať akékoľvek nespárované miesta živice, čoho výsledkom sú skrátené, skôr ako delečné sekvencie, ktoré uľahčujú purifikačné kroky.
Kompletný protokol pre tieto cykly je možné nájsť v Applied Biosystems Bulletine pre používateľov č. 33 (FastMoc™, 0,25 a 0,10 na Model 431 A). Štandardné kroky protokolu pre typickú syntézu:
Krok 1 - Premývanie živice 3x s DMF
-27Krok 2 - Odstraňovanie ochrannej skupiny 2x5 minút s 20% zmesou piperidín/DMF
Krok 3 - premývanie živice 6 x s DMF
Krok 4 - Párovanie s aminokyselinou aktivovanou s HBTU/NMM v DMF počas 45 minút.
Krok 5 - premývanie živice 3x s DMF
Pre zložité sekvencie môže byť zaradený extra ukončovací krok po párovaní použitím 70% anhydridu kyseliny octovej v DMF počas 20 minút na acetyláciu akýchkoľvek nespárovaných miest na peptidovej živici, čoho výsledkom sú skrátené sekvencie, skôr ako delečné sekvencie v konečnom surovom produkte.
Štiepenie/Extrakcia
Štiepiaca zmes použitá na odstránenie bočných reťazcov ochranných skupín a na oddelenie peptidu od živice je štandardnou zmesou používanou pre peptidy obsahujúce arginín a/alebo metionín. Na 0,1 až 1,5 g peptidovej živice je použitá zmes zahŕňajúca 10 ml kyseliny trifluóroctovej, 0,5 ml D.l. vody, 0,5 ml tioanizolu, 0,5 ml etánditiolu (87% kyselina trifluóroctová, 4,3% D.l. voda, 4,3% tioanizol, 4,3% etánditiol).
Postup štiepenia
100 mg až 1 g peptidovej živice sa dá do 20ml sklenenej nádoby a ochladí sa v ľadovom kúpeli. Pripraví sa štiepiaca zmes a tiež sa ochladí v ľadovom kúpeli, potom sa pridá peptidová živica do konečného objemu približne 10 ml.
Nádoba sa vyberie z ľadového kúpeľa a nechá sa ohriať na laboratórnu teplotu. Nádoba sa prikryje a reakčná zmes sa mieša pri laboratórnej teplote 2 hodiny.
Po 2 hodinách sa roztok vákuovo prefiltruje cez filter so strednou až priebehovou porozitou do približne 30 ml MTBE. Reakčná nádoba sa premyje s 1 ml TFA a prefiltruje sa cez rovnaný filtračný lievik do studeného MTBE. Celá suspenzia sa potom prenesie do 50ml centrifugačnej skúmavky a centrifuguje sa približne 10 minút pri 2 000 otáčkach za minútu, pri laboratórnej teplote. Supernatant sa odsaje a precipitát sa znova rozsuspenduje v 40 ml studeného MTBE a znova sa
-28centrifuguje. Tento krok sa opakuje ešte raz. Konečný supernatant sa odsaje a precipitát sa prečistí dusíkom, aby sa evaporovala väčšina ostávajúceho éteru.
Peptid sa potom rozpustí v 20 až 30 ml vodnej 1 až 10% kyseline octovej nariedenej na približne 100 až 150 ml v deionizovanej vode, zamrazí sa a lyofilizuje.
Purifikácia
RP-HPLC metódy
Systém - Waters Delta Prep 4000 Kolóna - Vydac reversed-phase C18, 10 pm, 2,2 x 25 cm (katalógové č. 218TP1022)
Tlmivé roztoky - A: voda/0,1 % TFA B: acetonitril/0,1 % TFA Prietoková rýchlosť -15 ml/minútu
Detekcia -Waters 484 UV detektor, 220 nm
Gradient - variabilný, zvyčajne 0,2% B/min až 1,0% B/min
Pripravili sa lyofilizované surové peptidy rozpustením 50 až 100 mg peptidu v 200 ml vodnej 0,1% TFA. Peptidový roztok sa potom priamo naniesol na preparatívnu kolónu cez rezervoárovú líniu tlmivého roztoku „A“ a začal sa gradientový program.
Zozbierané frakcie bežali cez noc na automatickom vzorkovom analytickom HPLC systéme. Prekrývajúce sa frakcie, o ktorých sa integrovaním vrcholov usúdilo že sú viac ako na 92 % čisté, sa nariedili v pomere 4:1 D.l. vodou, zmrazili sa a potom sa lyofilizovali na Virtis 25 SL Freezedryer.
Charakterizácia
Reverzná fázová HPLC
Podmienky:
Systém - Waters 510 čerpadlá, 717 Autosampler, 490 Multivlnový UV detektor Kolóna - Vydac reversed-phase C18, 5 pm, 0,46 x 25 cm (katalógové č. 218TP54) Tlmivé roztoky - A: voda/0,1 % TFA B: ACN/0,1 % TFA
Prietoková rýchlosť - 1 ml/minútu
-29Detekcia - UV, 214 nm, 280 nm
Gradient - 2% B/min
Pripravia sa vzorky purifikovaného lyofilzovaného peptidu rozpustením 0,2 až
1,0 mg peptidu vo vodnej 0,1% TFA na koncentráciu 0,5 až 1,0 mg/ml.
až 18 pi sa nanesie na kolónu a eluuje sa s gradientovým programom 0 až 50% ACN 25 minút. Chromatogramové údaje sa zhromažďujú a uskladňujú použitím Waters Expert-Ease softwarového systému.
Hmotnostná spektrometria
Type: MALDI-TOF (Matricou podporený laserový desorpčný/ionizačný čas prieletu Systém: Perseptive Biosystems Voyager Elite
Matrice: kyselina a-kyano-4-hydroxy-škoricová, 10 mg/ml v 67% ACN/0,1% TFA alebo kyseline sinapovej, 10 mg/ml v 50% ACN/0,1% TFA
Vzorky peptidu sa pripravia v 1 až 20 pmol koncentrácii v 50% ACN/0,1% TFA. 0,5 μΙ matricového roztoku a následne 0,5 μΙ peptidovej vzorky sa nanesie do jamiek platne a nechá sa vysušiť. Analyzačné platne sa naložia do prístroja a vzorky sa skenujú a analyzujú použitím Reflector Delayed-Extraction metódy optimalizovanej pre peptidy. Pre každú vzorku sa spojí a analyzuje kumulatívny údajový signál z 32 až 128 laserových impulzov. Každé kolo zahŕňa jamku so štandardným peptidom na kalibráciu.
Špecifická syntéza
Príprava [Lys(Alloc)12’21]-hGRF(1-29)-NH2 [Lys(Alloc)12,21]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS-živica sa najprv zostavila prostredníctvom Fmoc chemických techník na Applied Biosystems 431A peptidovom syntezátore (pozri metódy syntézy vyššie), vrátane odstránenia ochrannej skupiny z N-koncového zvyšku na Fmoc skupine.
Peptidová živica sa poštiepila zo zmesou TFA/1,2-etánditiol/tioanizol/voda [10:0,5:0,5:0,5 (objemový pomer)] počas 2 hodín a peptid sa izoloval precipitáciou v MTBE, čím vzniklo 240 mg surového peptidu. Výsledkom purifikácie preparatívnou
-30reverznou fázovou HPLC sVydac C18 kolónou (22 x 250 mm) bolo 60 mg purifikovaného produktu (>95 % analytickou HPLC). MALDI-TOF hmotnostná spektrometria: vypočítané: 3523,8, zistené: 3524,2
Príprava [N“-izopropyl-Tyr1,Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)NH2 Zostavenie iniciačnej [N“-izopropyl-Tyr1,Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PSživice [Lys(Alloc)12]-hGRF(1-29)-PAL-PEG-PS-živica sa najprv zostavila prostredníctvom Fmoc chemických techník na Applied Biosystems 431A peptidovom syntezátore (pozri metódy syntézy vyššie), vrátane odstránenia ochrannej skupiny z N-koncového zvyšku na Fmoc skupine.
N“-izopropylácia prostredníctvom redukčnej alkylácie
Na-izopropylová skupina sa pridala redukčnou alkyláciou peptidovej živice použitím kyanoborohydridu sodného a zodpovedajúceho ketónu (acetónu) ako je opísané v publikácii Hocart a spol., 1987. 880 mg peptidovej živice (približne 70 pmol) napučiavalo v 5 ml DCM 30 minút, potom sa pridalo 10 mmol (174 μΙ) acetónu v 7 ml MeOH/1% HOAc a zmes sa prerušovane vírila 2 hodiny pri teplote okolia. Potom sa pridali 2 mmol (129 mg) kyanoborohydridu sodného v 12 ml MeOH/1% HOAc, zmes sa prerušovane vírila 2 hodiny a potom sa cez noc nechala usadiť (15 hodín). Kvalitatívny monitoring ninhydrínu indikoval ukončenú reakciu (žiadna modrá farba). Peptidová živica sa poštiepila zo zmesou TFA/1,2-etánditiol/tioanizol/voda [10:0,5:0,5:0,5 (objemový pomer)] počas 2 hodín a peptid sa izoloval precipitáciou v MTBE, čím vzniklo približne 200 mg surového peptidu. Výsledkom purifikácie preparatívnou reverznou fázovou HPLC s rozpúšťadlami voda/acetonitril/0,1% TFA na Vydac C18 kolóne (22 x 250 mm) bolo 50 mg čistého produktu (>95 % analytickou HPLC). MALDI-TOF hmotnostná spektrometria: vypočítané: 3481,9; zistené: 3481,8.
Príklad 9 Pegylácia chráneného hGRF(1-29)
-31 hGRF deriváty pripravené ako bolo opísané vyššie v príklade 8 sa konjugovali s aktivovaným PEG ako bolo opísané v príkladoch 1 a 6.
V tomto prípade purifikácia zahŕňala len oddelenie od nadbytku reakčných činidiel a vedľajších produktov, pričom nebolo potrebné uskutočňovať postup opísaný v príklade 2 a 3.
T
-32Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) Prihlasovateľ:
(A) Meno: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
(B) Ulica: 14 JOHN B. GORSIRAWEG (C) Mesto: CURACAO (E) Krajina: HOLANDSKÉ ANTILY (F) Poštové smerovacie číslo: žiadne (G) Telefón: 639300 (H) Telefax: 614129 (ii) Názov vynálezu: Miestne špecifická príprava GRF-PEG konjugátov na tuhej fáze (iii) Počet sekvencií: 1 (iv) Počítačom spracovateľná forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentin Release #1.0, Verzia #1.30 (EPO) (2) Informácie o sekv. č. 1 :
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 29 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien:
(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-sense: nie (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 1:
Tyr Ala Asp Ala íle Phe Thr Asn
Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp íle Met Ser Arg
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob miestne špecifickej prípravy hGRF-PEG konjugátov, ktoré obsahujú jednu alebo viac ako jednu PEG jednotku na jeden mol hGRF kovalentne naviazanú na Lys12 a/alebo Lys21 a/alebo N“, vyznačujúci sa tým, že sa konjugačná reakcia medzi hGRF peptidom a aktivovaným PEG uskutočňuje v roztoku a požadovaný hGRF-PEG konjugát sa izoluje z reakčnej zmesi a purifikuje sa.
- 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že roztok je koncentrovaný vodný nikotínamidový roztok alebo tlmivý vodný roztok rozkladacieho činidla.
- 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že rozpúšťadlo je polárne organické rozpúšťadlo vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa dimetylsulfoxid, zmes formamid/tlmivý roztok alebo zmes acetonitril/tlmivý roztok.
- 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že hGRF-PEG konjugát sa izoluje z reakčnej zmesi a purifikuje chromatografickými metódami.
- 5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tý m , že hGRF peptidom je h-GRF(1-29)-NH2.
- 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že pred tým, ako nastane pegylačná reakcia je hGRF peptid chránený na jednej alebo viacerých z uvedených polôh: N“, Lys12 a Lys21.
- 7. Spôsob podľa nároku 1 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že po pegylácii zahŕňa odstránenie ochranných skupín.
- 8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že aktivovaným PEG je alkylačný alebo acylačný PEG v jeho monometoxylovanej forme.
- 9. hGRF-PEG konjugát, ktorý obsahuje jednu alebo viac ako jednu PEG jednotku na jeden mol hGRF kovalentne naviazanú na Lys12 a/alebo Lys21 a/alebo N“.
- 10. hGRF-PEG konjugát podľa nároku 9, kovalentne naviazaná na Lys12.v ktorom jePEG jednotka
- 11. hGRF-PEG konjugát podľa nároku 9, v ktorom je kovalentne naviazaná na Lys21.
- 12. hGRF-PEG konjugát podľa nároku 9, v ktorom je kovalentne naviazaná na Lys12, ako aj Lys21.
- 13. hGRF-PEG konjugát podľa nároku 9, v ktorom je kovalentne naviazaná na každý z Lys12, Lys21, N“.PEG jednotkaPEG jednotkaPEG jednotka
- 14. [Lys(Alloc)12,21]-hGRF ako medziprodukt pre pegylačnú reakciu podľa nároku 1.
- 15. [N“-izopropyl-Tyr1,Lys(Alloc)12]-hGRF ako medziprodukt pre pegylačnú reakciu podľa nároku 1.
- 16. Použitie hGRF-PEG konjugátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 13 ako liečiva.
- 17. Použitie hGRF-PEG konjugátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 13 na výrobu liečiva na liečbu, prevenciu alebo diagnostiku porúch týkajúcich sa rastového hormónu.
- 18. Použitie podľa nároku 17 na výrobu liečiva na liečbu alebo diagnostiku nedostatku rastového hormónu (GDH).
- 19. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje konjugáty podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 13 spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo vehikulami.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121264A EP0922446A1 (en) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates |
| PCT/EP1998/007748 WO1999027897A1 (en) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK8242000A3 true SK8242000A3 (en) | 2001-01-18 |
Family
ID=8227732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK824-2000A SK8242000A3 (en) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6528485B1 (sk) |
| EP (2) | EP0922446A1 (sk) |
| JP (2) | JP2001524505A (sk) |
| KR (1) | KR100561768B1 (sk) |
| CN (1) | CN1149967C (sk) |
| AR (1) | AR017780A1 (sk) |
| AT (1) | ATE236607T1 (sk) |
| AU (1) | AU755285B2 (sk) |
| BG (1) | BG64815B1 (sk) |
| BR (1) | BR9815159A (sk) |
| CA (1) | CA2312004C (sk) |
| DE (1) | DE69813291T2 (sk) |
| DK (1) | DK1037587T3 (sk) |
| EA (1) | EA004269B1 (sk) |
| EE (1) | EE200000319A (sk) |
| ES (1) | ES2194376T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0100507A3 (sk) |
| IL (2) | IL136551A0 (sk) |
| NO (1) | NO327238B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ504570A (sk) |
| PL (1) | PL192082B1 (sk) |
| PT (1) | PT1037587E (sk) |
| SI (1) | SI1037587T1 (sk) |
| SK (1) | SK8242000A3 (sk) |
| TR (1) | TR200001615T2 (sk) |
| TW (1) | TWI254641B (sk) |
| UA (1) | UA73716C2 (sk) |
| WO (1) | WO1999027897A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA9811068B (sk) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010055581A1 (en) | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US7229841B2 (en) * | 2001-04-30 | 2007-06-12 | Cytimmune Sciences, Inc. | Colloidal metal compositions and methods |
| US6407218B1 (en) * | 1997-11-10 | 2002-06-18 | Cytimmune Sciences, Inc. | Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs |
| AU9558901A (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-15 | Ares Trading Sa | Regioselective liquid phase pegylation |
| EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| US20030171285A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-11 | Finn Rory F. | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
| ATE371680T1 (de) | 2002-01-16 | 2007-09-15 | Biocompatibles Uk Ltd | Polymerkonjugate |
| US7998705B2 (en) * | 2002-08-06 | 2011-08-16 | FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U.S.A., Inc | Increased dynamic binding capacity in ion exchange chromatography by addition of polyethylene glycol |
| WO2004027064A2 (en) * | 2002-09-18 | 2004-04-01 | Centre Hospitalier De L'universite De Montreal (Chum) | Ghrh analogues |
| GB0301014D0 (en) * | 2003-01-16 | 2003-02-19 | Biocompatibles Ltd | Conjugation reactions |
| CN100357313C (zh) * | 2003-01-18 | 2007-12-26 | 派格斯菲尔有限公司 | 非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法 |
| EP1644408A1 (en) * | 2003-07-15 | 2006-04-12 | Barros Research Institute | Eimeria tenella antigen for immunotherapy of coccidiosis |
| US20050058658A1 (en) * | 2003-07-15 | 2005-03-17 | Barros Research Institute | Compositions and methods for immunotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) |
| AU2004311630A1 (en) * | 2003-12-02 | 2005-07-21 | Cytimmune Sciences, Inc. | Methods and compositions for the production of monoclonal antibodies |
| EP1715971A4 (en) * | 2004-01-28 | 2010-10-13 | Cytimmune Sciences Inc | FUNCTIONALIZED COLLOIDAL METAL COMPOSITIONS AND METHODS |
| CN100355784C (zh) * | 2004-02-12 | 2007-12-19 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法 |
| US20050261475A1 (en) * | 2004-02-13 | 2005-11-24 | Harvard Medical School | Solid-phase capture-release-tag methods for phosphoproteomic analyses |
| US6986264B1 (en) * | 2004-07-15 | 2006-01-17 | Carrier Corporation | Economized dehumidification system |
| KR101468345B1 (ko) | 2004-11-12 | 2014-12-03 | 바이엘 헬스케어 엘엘씨 | Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형 |
| KR101353365B1 (ko) | 2005-07-26 | 2014-01-20 | 로디아 인코포레이티드 | 펜던트 폴리(알킬렌옥시) 치환기를 가지는 폴리머 및 그의퍼스널 케어용 용도 |
| US20070238656A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-11 | Eastman Kodak Company | Functionalized poly(ethylene glycol) |
| EP2444499A3 (en) | 2006-05-02 | 2012-05-09 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| US20080096819A1 (en) * | 2006-05-02 | 2008-04-24 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| PL2054074T3 (pl) * | 2006-08-04 | 2015-03-31 | Prolong Pharmaceuticals Llc | Zmodyfikowana erytropoetyna |
| US20080083154A1 (en) * | 2006-10-05 | 2008-04-10 | Timothy M Gregory | Bait retention fish hook |
| RU2345608C2 (ru) * | 2007-01-09 | 2009-02-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Кавказский государственный технический университет" | Вареная колбаса с использованием pse свинины и способ ее производства |
| CA2707840A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| US20110014118A1 (en) * | 2007-09-21 | 2011-01-20 | Lawrence Tamarkin | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods |
| US20090104114A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-04-23 | Cytimmune Sciences, Inc. | Nanotherapeutic Colloidal Metal Compositions and Methods |
| CA2706700A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Compositions and methods for generating antibodies |
| SG171957A1 (en) * | 2008-11-04 | 2011-07-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | Crhr2 peptide agonists and uses thereof |
| BRPI1013626B8 (pt) * | 2009-03-20 | 2021-05-25 | Hanmi Holdings Co Ltd | método para preparar conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico |
| US20100267636A1 (en) * | 2009-04-20 | 2010-10-21 | Theratechnologies Inc. | Use of cytochrome p450-metabolized drugs and grf molecules in combination therapy |
| WO2010121351A1 (en) * | 2009-04-20 | 2010-10-28 | Theratechnologies Inc. | Use of (hexenoyl trans-3)hgrf(1-44)nh2 and ritonavir in combination therapy |
| CN102869384B (zh) | 2009-06-22 | 2016-01-13 | 伯纳姆医学研究所 | 使用带有c-端元件的肽和蛋白质的方法和组合物 |
| US20110105397A1 (en) | 2009-11-04 | 2011-05-05 | Gengo Peter J | Method for treating heart failure with stresscopin-like peptides |
| WO2012118778A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated car peptides and methods and compositions using truncated car peptides |
| CN103547591A (zh) | 2011-04-21 | 2014-01-29 | 瑟瑞技术公司 | 生长激素释放因子(grf)类似物及其用途 |
| EP2715291A4 (en) | 2011-05-31 | 2015-10-21 | Airware Inc | RECALIBRATION OF AB-NDIR GAS SENSORS |
| US10179801B2 (en) | 2011-08-26 | 2019-01-15 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated LYP-1 peptides and methods and compositions using truncated LYP-1 peptides |
| WO2013190520A2 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-27 | The General Hospital Corporation | Gh-releasing agents in the treatment of vascular stenosis and associated conditions |
| US10064940B2 (en) | 2013-12-11 | 2018-09-04 | Siva Therapeutics Inc. | Multifunctional radiation delivery apparatus and method |
| CA2986927C (en) | 2015-05-28 | 2023-12-19 | Institut National De La Recherche Scientifique | Inhibitors of prototypic galectin dimerization and uses thereof |
| CN109153712B (zh) * | 2016-04-19 | 2022-09-16 | 格里芬制药国际公司 | Peg化生物活性肽及其用途 |
| CN110317826B (zh) * | 2019-05-22 | 2020-11-10 | 中国农业大学 | 调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用 |
| WO2021119827A1 (en) | 2019-12-19 | 2021-06-24 | Transfert Plus, Société En Commandite | Use of glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) for the treatment of enteric neuropathies |
| WO2021133407A1 (en) | 2019-12-27 | 2021-07-01 | Compagnie Generale Des Etablissements Michelin | Rubber mix with high specific surface area and high structure acetylene carbon black |
| EP4284828A1 (en) | 2021-01-28 | 2023-12-06 | Talem Therapeutics LLC | Anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies and the therapeutic use thereof |
| US20260092121A1 (en) | 2022-10-14 | 2026-04-02 | Talem Therapeutics Llc | Anti-trkb/cd3 antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| DE69026306T2 (de) * | 1989-05-27 | 1996-10-17 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine. |
| JPH06500311A (ja) * | 1990-06-29 | 1994-01-13 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | ヒスチジン置換されたヒト成長ホルモン放出因子類縁体 |
| JP3051145B2 (ja) * | 1990-08-28 | 2000-06-12 | 住友製薬株式会社 | 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド |
| AU662731B2 (en) * | 1991-04-09 | 1995-09-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogs |
| EP0518295A3 (en) * | 1991-06-14 | 1993-09-01 | Millipore Corporation | Allyl side chain protection in peptide synthesis |
| FR2687681B1 (fr) * | 1992-02-20 | 1995-10-13 | Transgene Sa | Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses. |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| WO1997017367A1 (en) * | 1995-11-03 | 1997-05-15 | Theratechnologies Inc. | Method of grf peptides synthesis |
-
1997
- 1997-12-03 EP EP97121264A patent/EP0922446A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-01-12 UA UA2000063885A patent/UA73716C2/uk unknown
- 1998-12-01 DK DK98959898T patent/DK1037587T3/da active
- 1998-12-01 EP EP98959898A patent/EP1037587B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 CA CA002312004A patent/CA2312004C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 WO PCT/EP1998/007748 patent/WO1999027897A1/en not_active Ceased
- 1998-12-01 PL PL341139A patent/PL192082B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-12-01 KR KR1020007005736A patent/KR100561768B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-01 EE EEP200000319A patent/EE200000319A/xx unknown
- 1998-12-01 SK SK824-2000A patent/SK8242000A3/sk unknown
- 1998-12-01 ES ES98959898T patent/ES2194376T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 HU HU0100507A patent/HUP0100507A3/hu unknown
- 1998-12-01 JP JP2000522885A patent/JP2001524505A/ja active Pending
- 1998-12-01 DE DE69813291T patent/DE69813291T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 IL IL13655198A patent/IL136551A0/xx unknown
- 1998-12-01 AT AT98959898T patent/ATE236607T1/de active
- 1998-12-01 AU AU15633/99A patent/AU755285B2/en not_active Expired
- 1998-12-01 TR TR2000/01615T patent/TR200001615T2/xx unknown
- 1998-12-01 CN CNB988117592A patent/CN1149967C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-01 BR BR9815159-2A patent/BR9815159A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-01 SI SI9830400T patent/SI1037587T1/xx unknown
- 1998-12-01 PT PT98959898T patent/PT1037587E/pt unknown
- 1998-12-01 EA EA200000601A patent/EA004269B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-12-01 NZ NZ504570A patent/NZ504570A/en unknown
- 1998-12-02 AR ARP980106098A patent/AR017780A1/es active IP Right Grant
- 1998-12-03 ZA ZA9811068A patent/ZA9811068B/xx unknown
-
1999
- 1999-01-26 TW TW088101139A patent/TWI254641B/zh not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-24 NO NO20002664A patent/NO327238B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-05-29 BG BG10448A patent/BG64815B1/bg unknown
- 2000-06-04 IL IL136551A patent/IL136551A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-05 US US09/587,460 patent/US6528485B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-11-20 US US10/299,790 patent/US6869932B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-12-15 US US11/011,617 patent/US7317002B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-10-30 JP JP2009251100A patent/JP5431874B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK8242000A3 (en) | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates | |
| US7256258B2 (en) | Regioselective liquid phase pegylation | |
| US20080085860A1 (en) | Selective Vpac2 Receptor Peptide Agonists | |
| AU2001295589A1 (en) | Regioselective liquid phase pegylation | |
| US20100048460A1 (en) | Selective vpac2 receptor peptide agonists | |
| US20090082276A1 (en) | Selective vpac2 receptor peptide agonists | |
| US7332473B2 (en) | Peptides and medicinal compositions containing the same | |
| US20090118167A1 (en) | Selective Vpac2 Receptor Peptide Agonists | |
| CZ20002055A3 (cs) | Způsob selektivní přípravy specifických konjugátů polyethylenglykol - GRF | |
| MXPA00005138A (en) | Site-specific preparation of polyethylene glycol-grf conjugates | |
| HK1079222A (en) | Peptides and medicinal compositions containing the same |