SU1554766A3 - Способ получени человеческого инсулина формулы I @ -Т @ -ОН или его производных - Google Patents
Способ получени человеческого инсулина формулы I @ -Т @ -ОН или его производных Download PDFInfo
- Publication number
- SU1554766A3 SU1554766A3 SU823414346A SU3414346A SU1554766A3 SU 1554766 A3 SU1554766 A3 SU 1554766A3 SU 823414346 A SU823414346 A SU 823414346A SU 3414346 A SU3414346 A SU 3414346A SU 1554766 A3 SU1554766 A3 SU 1554766A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- insulin
- ins
- thr
- reaction
- carboxypeptidase
- Prior art date
Links
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 138
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 40
- -1 amino, hydroxy Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 20
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 66
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 41
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 19
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 claims description 14
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 claims description 14
- PZUOEYPTQJILHP-GBXIJSLDSA-N (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanamide Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(N)=O PZUOEYPTQJILHP-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 claims description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108010059841 serine carboxypeptidase Proteins 0.000 claims description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 3
- 108090000201 Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003847 Carboxypeptidase B2 Human genes 0.000 claims description 2
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 claims 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 claims 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 abstract description 22
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 abstract description 12
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 abstract description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 abstract 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 abstract 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 abstract 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 abstract 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 abstract 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 abstract 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 11
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 8
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 5
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101710180012 Protease 7 Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011188 deamidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 4-(3-phosphonopropyl)piperazine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CN(CCCP(O)(O)=O)CCN1 CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000978265 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Carboxypeptidase Y Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 108010054847 carboxypeptidase P Proteins 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 229920002616 peptidyl amide Polymers 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229940119528 pork insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биохимии. Цель изобретени - повышение выхода целевого продукта за счет избежани предварительного отщеплени аминокислоты В-30 в свином инсулине. Способ предусматривает введение свиного инсулина в реакцию ферментативного замещени с водным раствором или дисперсией, содержащей амид треопина или сложный эфир треопина формулы H-TR-OR3, где R3 вл етс C1-C6-алкилом, при PH 7,0 - 9,5 при исходных концентраци х свиного инсулина и амида треопина или от 0,05 до 3 М соответственно. В качестве фермента используют сериновую карбоксипептидазу микробного происхождени специфическую дл субстратов, имеющих C-концевую Z-аминокислоту. В результате образуетс одно из производных инсулина. Дл получени человеческого инсулина отщепл ют одну из групп -NH2, - THR-NH2 и OR3 путем взаимодестви той же самой или иной 4 - специфической карбоксипептидазы в водном растворе или дисперсии при PH от 9 до 10,5. Выход инсулина повышаетс до 75%. 3 табл. 3 ил.
Description
Изобретение относитс к биотехнологии и касаетс получени человеческого инсулина или его производных. 1 Цель изобретени - повышение выхода целевого продукта за счет избе
см
жани предварительного отщеплени В-30 Ala.
Изобретение заключаетс в том, что осуществл ют процесс ферментативного замещени В-30 аминокислоты в
свином инсулине формулы Ins - Ala - ОН с помощью сериновой карбоксипепти- дазы микробного происхождени , специфической дл субстратов, имеющих С-концевую L-аминокислоту, водном растворе или дисперсии, содержащей амид треопина или сложный эфир треопина формулы Н - Thr - OR, где R 5 С - С6 -алкил, и представл ет со бой, например, метильный, этильный, пропильный, изопропильный, бутильный изобутильный, трет-бутильный, амиль- ный, гексильный и им подобные радикалы , в которых дл получени человеческого инсулина в качестве целевого продукта отщепл ют одну из групп производных инсулина -NH4, -Thr - NH и OR3, использу ту же самую или иную L - специфическую се- риновую карбоксипептидазу.
Указанные группы могут быть замещены заместител ми, которые вл ютс инертными по отношению к энзиму, например атомами галогена (фтора, хло- ра, брома, иода), нитрогруппой, ал- коксильной группой (метоксильной, этоксильной и т.д.) или алкильной группой (метильной, этильной и т.д.)
Так, в случае типов сложных эфи- ров группа ORj предпочтительно принадлежит к р ду, состо щему из ал- коксильных групп, например метоксильной , этоксильной или трет-бутоксиль- ной, фенилоксильной группы к бензил- оксильной группы. Указанные группы могут быть замещены инертными растворител ми , например нитрогруппами (п-нитробензилоксигруппа).
Первоначально свиной инсулин ввод т в реакционный водный раствор или дисперсии, содержащей амид треопина или сложный эфир треопина указанной формулы, после чего добавл ют энзим сериновой карбоксипептидазы. Предпочтительным энзимом вл етс CPD-Y из пекарских дрожжей, но может также использоватьс пеницилло- карбоксипептидаза или серинова карбоксипептидаза из Aspergillus sp. прорастающего чмен или других источников .
Предлагаемый способ осуществл ют при значени х рН 7,0-10,5, предпочтительно 7,5-10,5„ Предпочтительное значение рН, которое часто лежит в очень узком диапазоне значений, зависит от оптимального и минимального значений рН соответственно дл раз
0
Q
5
5
5
0
0
5
0
личных видов энзиматической активности используемого энзима. Значение рН следует выбирать таким образом , чтобы активности были уравновешены .
В том случае, когда в качестве энзима используют карбоксипептидаэу У, предпочтительные значени рН 7,5-10,5, более предпочтительные 9,0-10,5. Наиболее предпочтительным вл етс нижнее значение рН из указанного предпочтительного диапазона в тех случа х, когда требуетс проводить выделение промежуточных инсу- линамидов.
Выбранное предпочтительное значение рН следует поддерживать в ходе реакции сочетани , затем его можно изменить при осаждении продукта реакции , отщеплении защитных групп и т.д. Значение рН может быть выбрано таким образом, чтобы энзим про вл л амидаэную активность, в результате чего предотвращаетс осаждение образующегос инсулинамида и создаетс возможность дл образовани желаемого инсулина в одну стадию. Можно также выбрать значение рН, при котором энзим про вл ет преимущественно пептидазную активность, в результате чего осуществл етс режим, способствующий образованию стабильных промежуточных продуктов - инсу- линамидов.
Контроль над рН осуществл ют введением стабильного буферного раствора дл соответствующего диапазона рН в реакционную среду (например дл этой цели можно использовать би- карбонатный буфер).
Значение рН поддерживают добавлением кислоты, например сол ной, или основани , например гидрата окиси натри , в процессе реакции. Это может быть осуществлено с использованием рН-стата.
Реакцию провод т в водной среде, котора может содержать до 50 об.% органического растворител алкано- лы, например метанол и этанол, гли- коли, например этиленгликоль или пропиленгликоль, диметилформамид, диметилсульфоксид, тетрагидрофуран, диоксан и диметоксиэтан.
Выбор состава реакционной среды зависит, в частности, от растворимости , температуры и значени рН дл компонентов реакционной среды и
получающегос инсулина, а также от стабильности энзима.
Реакционна среда может также включать компоненты, которые делают энзим нерастворимым, но сохран ют при этом значительную долю его энзи- матической активности, например ионообменные смолы.
В альтернативном варианте энзим может быть иммобилизован, например, в результате св зывани в матрице, например в сшитом декстране или агарозе, или в двуокиси кремни , полиамиде или целлюлозе, или же путе капсулировани в полиакриламиде, альгинатах или волокнистых материалах . Кроме того, возможна модификаци энзима химическими методами, предпочтительно сол ми ртути, с цель увеличени его стабильности или улучшени его энзиматических свойств
В том случае, когда желательно подавить какое-либо осаждение промежуточно образующихс инсулиамидов, реакционна среда содержит мочевину или хлоргидрат гуацидина в концентрации до 3 моль/л. Это может быть также предпочтительным при рН в среде, в который используемый в качестве субстрата инсулин имеет ограниченную растворимость.
Предпочтительна исходна концентраци дл используемого в качестве субстрата инсулина лежит в пределах 0,002-0,5 моль/л, а аминного компонента- в пределах 0,05-3 ммоль/л.
Энзиматическа активность может мен тьс сама по себе, но концентраци энзима предпочтительно должна составл ть величину 10 -10 моль/л наиболее предпочтительно - моль/л Наиболее пригодное значение активности зависит от концентрации субстрата , от концентрации амина и времени проведени реакции.
Согласно изобретению температура, при которой проводитс реакци , предпочтительно лежит в пределах 20- 40°С. Наиболее удобна температура в услови х данного синтеза может быть определена экспериментально. В частности , она зависит от используемого в качестве аминного компонента вещества и от концентрации энзима. Пригодные температуры лежат обычно в пределах 20-30 С, предпочтительно 25°С. При температурах ниже 20 С врем проведени реакции обычно слишком
1554766
велико,
а использование температур
0
5
выше 40 С часто вызывает проблемы, св занные со стабильностью энзимов и/или реагентов или продуктов реакции .
Аналогичные варианты возможны и дл времени проведени реакции, которое очень сильно зависит от прочих параметров реакции, в особенности от концентрации энзима. Стандартное врем проведени реакции согласно изобретению составл ет примерно 2-6 ч.
При использовании в качестве аминного компонента амида или замещенного амина желательно специальное разложение амидной группы в получаемом инсулинамиде. Б этом отношении карбоксипептидазы, в особенности карбоксипептидаза Y, вл ютс весьма пригодными, поскольку указанна карбоксипептидаза Y про вл ет ами- дазную активность при рН выше 9, в 5 то врем как ее карбоксипептидазна активность становитс незначительной
Указанна карбоксипептидаза может быть вообще использована дл разложени сложноэфирных групп
0
0
0
5
OR
,, в промежуточно образующихс
сложных эфирах инсулина с получением готового инсулина, не содержа- щего С-конечной защищенной группы.
Исходные материалы.
Свиной инсулин был представлен 5 лабораторией инсулина Нордиск, Копенгаген. Карбоксипептидазу Y из пекарских дрожжей (промышленного производства Карлсбергских пекарен) выдел ли модифицированным методом афинной хроматографии, получа в результате лиофилнзированный порошок , содержащий 10% энзима в цитрате натри . Перед употреблением энзим подвергают обессоливанию на колонке 1,5-25 см с Сефадексом Г-25, примен в качестве растворител и элюен- та воду. Концентрацию энзима определ ют спектрофотометр.ически, исполь0
5
зу 14,8. Используемый энзим не содержит протеазу А.
L - Треонинамид поставл ла фирма Вега-4 окс,Аризона, США, метиловый эфир L-треонина - фирма Фулка, Швейцари , а L-треонин, дансилхлорид, карбоксипептидазу А и трипсин - фирма Сигма, США. Хроматографические материалы поставл лись фирмой 1 Фармаци , Швеци . Все прочие peaгенты и растворители марки Аналитически чистый поставл лись фирмой Мерк, ФРГ.
Анализ аминокислот. Образцы дл анализа аминокислот получали в результате гидролиза 6 М НС1 при в вакууме в течение 24 ч. Анализ проводилс на анализаторе аминокислот Дюррум Д-500. Состав аминокислот определ лс из расчета на известное количество ас- парагиновой кислоты и глицина. Единственными аминокислотами, на которы оказывают вли ние проводимые реакции , вл ютс треонин, лизин и ала- нин. Соответствующие значени дл указанных аминокислот, содержащихс в свином инсулине (инсулине человека ), составл ют: треонин 1,93 (2,87 лизин 0,97 (0,98) и аланин 2,00 (1,05). Количество непревращенного свиного инсулина в реакционной смеси определ лось анализом аланина в инсулине хроматографическим методом на Сефадексе Г-50. Выход реакции сочетани определ лс как количеств получаемого - продукта, поделенное на все количество инсулина, израсходованного в ходе реакции.
Приготовление карбоксипептидазы (пример 2 и 3).
К 100 мкл раствора инсулина или производных инсулина (0,7 мг/мл) в 0,1 М трис-HCl (рН 7,5) добавл ют 10 мкг карбоксипептидаэы А После выдерживани при комнатной температре в течение 6 ч реакцию останавливают добавлением эквивалентного объ ема 0,5 М НС1, и количество освобожденных аминокислот определ ют в результате проведени анализа аминокислот .
Энзиматическа обработка производных инсулина (пример 4).
Обработка различных производных инсулина карбоксипептидазами А и Y проводилась в 0,05 М трис-буфере (рН 7,5) при комнатной температуре с использованием инсулина в количестве , составл ющем примерно 1,5 мМ, и карбоксипептидазы - 5 мкМ Врем реакции 3 ч в случае карбоксипептидазы Аи 1,5 часа в случае карбоксипептидазы Y. При указанных услови х достигалось наибольшее количество освобожденных С-конечньгх аминокислот. После подкислени НС1 аликвоты брались непосредственно
дл проведени анализа аминокислот на анализаторе.
Последовательность С-конечной части в различных производных инсулина определ лась после обработки трипсином и реакции продукта этой обработки с дансилхлоридом с последующей идентификацией дансилпептиQ дов. Обработка производных инсулина трипсином производилась в 0,1 М кислого карбоната натри при рН 8,2 с использованием 1 мМ инсулина, 40 мкМ ДРСС-трипсина и при времени
5 инкубировани 1 ч. Предварительные эксперименты со свиным инсулином показали, что эти услови пригодны дл полного освобождени С-конеч- ного аланильного остатка из
Q В-цепи. Освобождаемые аминокислоты или дипептиды подвергались данси- лированию согласно следующему способу . Образец в 100 мкл продукта обработки трипсином гас т добавлени5 ем 100 мкл 0,5 М сол ной кислоты, аликвоты разгон ют досуха и снова раствор ют в 100 мкл 0,1 М кислого карбоната натри (рН 3,2), после чего добавл ют 10 мкл дансилхлорио |Да (5 мг/мл) в ацетоне и инкубируют реакционную смесь в течение 2 ч при 37°С. Затем реакционную смесь анализируют методом жидкостной хроматографии под высоким давлением, использу систему дл жидкостной хроматографии фирмы Уотерс, состо щую из инжектора (Мод.бЮ, двух насосов (Мод.бОООА), программного устройства дл раствора (Мод.660),
детектора-УФ (Мод 450), устройства дл обработки данных Уотерс) и устройства радиального сжати (Уотерс, РСМ-100), оборудованного колонкой радиального наполнени Уотерс -А (обратна фаза С-18). Были синтезированы следующие стандартные соединении: Днс-Ала-ОН, Днс-тре-ОН, Днс-Ала-Тре-ОН, Днс-Тре- Тре-ОН, Днс-Тре-Ш2, Днс-Tpe-Tpe-NHi |И Днс-Ала-Тре-МН. Все 7 дансильных производных могут быть легко разделены методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с использованием двух различных программ.
На фиг.1 изображено протекание реакции между свиным инсулином и L-треонинамидом с использованием в качестве катализатора карбоксипептидазы Y (результаты анализа
5
5
аминокислот приведены в зависимости от времени проведени реакции.) ; на фиг.2 - протекание аналогичной реакции, в которой в качестве аминного компонента используетс метиловый эфир L-треонина} на фиг.З - профиль элюиронани дл ионообменной хроматографии продукта реакции между свиным инсулином и треонинамидом.
Пример 1. (исследовани проводили согласно имеющемус уровню техники)„
Свиной инсулин инокулируют с карбоксипептидазон Y при 25 С и рН 5-7 (в диапазоне рН, в котором указанный энзим про вл ет максимальную пептидазную активность). В результате обработки из С-конца В-цепи освобоадаютс следующие аминокислоты: аланин 1,0 лизин 1,0; пролин 1,0; треонин 1,0 тирозин 1,0 и фенилаланин 2,0. В положении В-23 (глицин) карбоксипептидаза Y прекращает свое воздействие, следовательно , можно освободить первые 7 аминокислот в В-цепи инсулина. Неожиданным вл етс тот факт, что С-конечный аспарагин (A-2U цепи А вообще не освобождаетс . При рН 9,5 С-конечный аланин в цепи В освобождаетс значительно быстрее последующих аминокислот. Важным вл етс тот факт, что св зь лейцин - тира- зин (В-15-16) не подвергалась гидролизу вообще, когда использовалась очищенна карбоксипептидаза Y, не содержаща протеазы А (эндопептида- зы), в противоположность препаратам поставл емым промышленностью из других источников.
Пример 2. Превращение свиного инсулина в инсулин человека с использованием треонинамида в качесве аминного компонента без выделени промежуточного инсулинамида.
К 2 мМ раствору свиного инсулина не содержащему цинк, в 10 мМ ЭДТА добавл ют раствор 0,1 М КС1, содержащий 0,5 М L-треонинамида, а при рН 9,5 и температуре 25 С ввод т 50 мкМ карбоксипептидазы Y. рН реакционной смеси поддерживают на посто нном уровне в результате введени 0,5 М раствора гидрата окиси натри , использу дл этой цели рН-стат. От реакционной смеси в разное врем отбирают аликвоты, а
10
15
20
25
0
5
0
5
0
5
в конце реакцию останавливают в результате введени 6 М раствора сол ной кислоты, в результате чего рН доходит до 1-2. Образцы подвергают хроматографированию на колонне 1чЗО см, наполненной Сефадексом Г-50 с использованием в качестве растворител 1 М уксусной кислоты дл отделени инсулина от энзима и свободных аминокислот. Фракции, содержащие инсулин, лиофилизируют и определ ют состав аминокислот согласно описанному способу.
Протекание реакции показано на фиг.1. Из анализа аминокислот рассчитано , что содержание треонина увеличиваетс до 0,7 моль на 1 моль инсупина, в то врем как 0,8 моль аланина и 0,2 моль лизина исчезают (фиг.1). Эти результаты подтверждают тот факт, что спуст 6,5 ч проведени реакции 20% свиного инсулина остаетс в непрореагировавшем состо нии, в то врем как 20% инсулина нар ду с аланином тер ет также аминокислоту лизин Потери 0,8 моль аланина сопровождаютс введением 0,7 моль треонина.
Продукты реакции подвергают дальнейшему анализу при обработке кар- боксипептидазой А, котора освобождает только аминокислоты, содержащие свободные L-карбоксильные группы , и не освобождает лизин. В результате обработки карбоксипепти- даэой А свиного инсулина освобождаютс только аланин и аспарагин из С-концов цепей В и А соответственно. В результате инкубировани образцов инсулина, полученных после проведени реакции в течение 6,5 ч (фиг.U, следует ожидать освобождени нар ду с аспарагином еще только ана- лина в количестве, соответствующем доле непрореагировавшегос свиного инсулина. Однако неожиданно помимо аланина освобождаетс также треонин в количествах, эквивалентных количеству треонинамида, вошедшего с образованием промежуточного инсулинамида человека. Это должно быть обусловлено тем, что в дополнение к пептидаэной и экстераэной активности карбоксипептидаза Y обладает также гидролаз- ной активностью по отношению к пепти- дамидам. Очевидно в процессе реакции свиного инсулина в присутствии карбоксипептидазы Y С-конечный аланин первоначально обмениваетс с треонинамидом в реакции транспепти- дировани с образованием инсулинамид человека, который затем гидролизует- с карбоксипептидазой Y с получением инсулина человека с общим выходом около 60%,а 20% непрореагировавшего свиного инсулина и 20% других продуктов составл ют остальное. Другие опыты подтверждают указанную последовательность реакций. Использу меньшие количества энзима или более короткое врем реакции, после обработки карбоксипептидазой А продуктов реакции можно наблюдать, что количество освободившегос треонина меньше количества вошедшего треонина, т.е. в основном образуетс инсулинамид человека.
Дл отделени продуктов реакции образец, полученный после проведени реакции в течение 6,5 ч (фиг.1), подвергают жидкостной хроматографии с использованием колонки с обратной фазой Ликросорб РР-18 (5 мкм, 0, см), насоса Уотерс (мод. 6000А) и детектора (Мод. 750-УФ), функционирующего при 220 нм. В качестве элюента используют смесь, содержащую 28,75% CHNC и 5 мМ тартрат- ного буфера (рН 3), содержащего 5 мМ н-бут S03Na и 50 мМ сульфата натри . Скорость потока 1,0 мл/мин. С использованием этой системы нельз разделить инсулин человека и свиной инсулин, однако все остальные побочные продукты удал ютс . Результат анализа аминокислот материала, полученного после хроматографировани , приведены в табл.1. Результаты анализа хорошо согласуютс с теоретическими предпосылками. Наличие 2,6 моль треонина и 1,3 моль аланина предполагает наличие в образце примерно 70% инсулина человека и 30% свиного инсулина.
Пример 3. Превращение свиного инсулина в инсулин человека с использованием в качестве аминного компонента метилового эфира треонина без выделени промежуточных продуктов .
К раствору не содержащего цинк свиного инсулина (8 мМ) в 10 мл ЭДТА 0,1 М КС1, содержащему 0,5 М метилового эфира L-треонина, при рН 9,5 и при 25°С, добавл ют 60 мкМ карбок- сипептидазы Y. Значени рН в ходе реакции поддерживают в результате
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
введени 0,5 М раствора гидрата окиси натри с использованием рН-стата. В различное врем отбирают аликвоты реакционной смеси, а саму реакцию останавливают в результате введени 6 М раствора сол ной кислоты, в результате чего рН становитс равным 1-2. Затем образец хроматографируют на колонке см, заполненной Сефадексом Г-50, с использованием в качестве растворител 1 М раствор уксусной кислоты дл отделени инсулина от инзима и свободных аминокислот . Фракции, содержащие инсулин, лиофилизируют и определ ют состав аминокислот согласно описанному способу .
Ход реакции показан на фиг.2„ Результаты, полученные при проведении этой реакции, аналогичны описанным при использовании треонинамида: треонин вводитс одновременно с освобождением аланина и небольшого количества лизина. В результате обработки карбоксипептидаэой А образца, полученного после проведени реакции в течение 17 ч, освобождаютс как ала- нин, так и треонин, что приводит к предположению, что С-конечный аланин цепи В первоначально обмениваетс с метиловым эфиром треонина с образованием монометилового эфира инсулина человека, который затем гидролизуетс карбоксипептидазой У с получением инсулина человека. Хот количественные соотношени в реакции те же, что и в реакции с участием треонинамида, конечна реакционна смесь содержит только 40% инсулина человека, 40% свиного инсулина, не подвергшегос превращению, и 20% других продуктов гидролиза.
Пример 4. Превращение свиного инсулина в инсулин человека с использованием в качестве аминного компонента треонинамина и с изол цией промежуточных инсулинамидов.
К раствору не содержащего цинк свиного инсулина (2 мМ) в 2 мМ ЭДТА, 0,1 М КС1 и 1,5 М хлоргидрата гуани- дина, содержащего 0,5 М треонинамида (Ь-тре-МНг) при рН 7,5 и температуре 25 С добавл ют карбоксипептидаэу У (15 мкМ). Значение рН в ходе реакции поддерживают в результате добавлени 0,5 М гидрата окиси натри с использованием рН-стата. В ходе реакции отбирают аликвоты реакционной смеси в
чества ннсулиновой пробы. В процессе реакции превращаетс примерно 75% исходного свиного инсулина. Однако хот содержание треонина в пике I (3,65) больше 3,0 (соответствует инсулину человека), очевидно, что пер- воначальньй продукт транспептиднрова- нн (-I1PO-J H3-TPK-NH2) не вл етс достаточно стабильным дл того, чтобы не происходила олигомеризаци с образованием -ПРО-ЛИЗ-ТРЕ-ЫН4.
На первый взгл д образование смеси промежуточных амидов говорит о го состава лиофнлизированного инсулн--| ; том, что в результате описанной старлзное врем , а саму реакцию оста- навминают в результате гашени спуст 2 ч доведением pll до 1,0-2,0 добавлением 1 М расгвора сол ной кислоты. Фракцию, содержащую инсулин, отдел ют от энзима и низкомслекулчрных компонентов в результате хроматографнро- вани на колонке 1 t30 см, заполненной Сефадексом Г-50 мепким с использованием в качестве растворител 1 М раствора уксусной кислоты, и лнофилн- знруют ее. Проведенный согласно описанному способу анализ аминокислотно10
на показывает, что 78/ свиного инсулина расходуетс в ходе реакции.
Дл дальнейшего анализа реагентов, содержащихс в инсулнновон пробе провод т хроматографнрованис на ионообменном Сефадексе-К -ДЕЛИ Л-25 согласно способу, описанному Морихара и др. Образец лиофилизированного инсулина (75 мг) раствор ют в 0,01 М ТРИС, 2,5 М мочевине, 0,05 М NaCl при рН 7,5 и хроматографируют на колонке, заполненной Сефадексом
R-ДЕЛЕ Л-25 (2,5x25 см) с использованием в качестве растворител того же самого буферного раствора. Инсулин злюируют растворами хлористого натри с градиентом концентраций от 0,05 до 0,30 М в том же буфере, собирают фракции по 8 мл на колонке, заполненной Сефадексом Г-25 и лиофили- зируют их.
Профиль элюировани изображен на фиг.З, на котором наблюдаютс три пика. Кроме того, определ ютс составы аминокислот и состав веществ пиков в результате обработки карбокси- пептидазами Y и Л согласно описанному способу. Поскольку в указанных реакци х участвует только С-конец В-цепи инсулина, в качестве модели свиного инсулина используетс последовательность -ПРО-ЛИЗ-Л. 1А-ОН. Аналогичным образом сокращени дл других производных инсулина будут представл ть собой: -ПРО-ЛИЗ-ТРК-ОН - дл инсулина человека, -ПРО-ЛИЗ-ТРЕ- -МНг - дл инсулинамида человека и т.д. При рН 7,5, используемом в ходе реакции, при котором амидазна активность карбоксипептидазы У обычно ниже ее пептидазной активности, образующейс пептидамид в значительной мере стабилен, поскольку пик I соответствует примерно 20% всего коли20
25
30
35
40
45
50
55
дни дезамидировани посредством карбоксипептидазы Y не образуетс чистый инсчпин человека, поскольку в результате дезлмидиоованил очевидно следует ожидать получение смеси -НРО-ЛИЗ-ТРК-ОН и -ПРО-ЛИХ-ТРЕ-ТРЕ-ОН Однако при обработке вещества пика I с целью дезамидировани 10 мкМ карбоксипептидлзы У при рН 10,0 в 0,1 М НС1, 2 мМ ЭДТА в течение 20 мин получают неожиданно практически чистьп инсулин человека. Этот опыт протекал следующим образом.
После отделени прореагировавшего инсулина от знзима и низкомолекул рных продуктов хроматографированием на Сефадексе Г-50 полученный продукт хроматографируют на ДЕАЕ-Сефадексе А-25 с использованием способа, аналогичного описанному на фиг.З. Продукт реакции элюируетс в пике II (что ожидалось), тогда как непроре- агировавшнй продукт (менее 10%) элюируетс в пике I. Пик III вообще отсутствует , т.е. производные инсулина, не содержание лиэин;не образуютс в ходе реакции. Как следует из результатов , приведенных в табл.2, полученных при обработке карбоксипептида- зами А и У и трипсином, указанна реакци вли ет только на содержание треонина в сколько-нибудь значительной степени, что находитс в соответствии с ожидаемым отсутствием пепти- даэной активности карбоксипептидазы У при данном значении рН.
Состав аминокислот дл пика II, полученного при реакции дезамидировани , близок к составу инсулина человека: ТРЕ 2,87; АЛА 1,05; ЛИЗ 0,98. Обработка продукта деэамидировани карбоксипептидазами Y и А трипсином показывает, что образец содержит 90-95% чистого инсулина человека.Это
10
20
5
0
5
0
5
0
5
дни дезамидировани посредством карбоксипептидазы Y не образуетс чистый инсчпин человека, поскольку в результате дезлмидиоованил очевидно следует ожидать получение смеси -НРО-ЛИЗ-ТРК-ОН и -ПРО-ЛИХ-ТРЕ-ТРЕ-ОН Однако при обработке вещества пика I с целью дезамидировани 10 мкМ карбоксипептидлзы У при рН 10,0 в 0,1 М НС1, 2 мМ ЭДТА в течение 20 мин получают неожиданно практически чистьп инсулин человека. Этот опыт протекал следующим образом.
После отделени прореагировавшего инсулина от знзима и низкомолекул рных продуктов хроматографированием на Сефадексе Г-50 полученный продукт хроматографируют на ДЕАЕ-Сефадексе А-25 с использованием способа, аналогичного описанному на фиг.З. Продукт реакции элюируетс в пике II (что ожидалось), тогда как непроре- агировавшнй продукт (менее 10%) элюируетс в пике I. Пик III вообще отсутствует , т.е. производные инсулина, не содержание лиэин;не образуютс в ходе реакции. Как следует из результатов , приведенных в табл.2, полученных при обработке карбоксипептида- зами А и У и трипсином, указанна реакци вли ет только на содержание треонина в сколько-нибудь значительной степени, что находитс в соответствии с ожидаемым отсутствием пепти- даэной активности карбоксипептидазы У при данном значении рН.
Состав аминокислот дл пика II, полученного при реакции дезамидировани , близок к составу инсулина человека: ТРЕ 2,87; АЛА 1,05; ЛИЗ 0,98. Обработка продукта деэамидировани карбоксипептидазами Y и А трипсином показывает, что образец содержит 90-95% чистого инсулина человека.Это
утверждение сделано в предположении, что производное инсулина -ПРО-ЛИЗ-ТРЕ -ТРЕ-ЫНг реагирует практически только при наличии гидролазной активности и пептидиламида аминокислоты, а -ПРО-ЛИЗ-ТРК-Ш2 реагирует главным образом при наличии амидазной активности . Общий выход дл превращени свиного инсулина в инсулин человека составл ет примерно 30% из расчета на превращенный инсулин.
Пример 5. К раствору свиного Zn-инсулина (7 мг/мл) в О,1 М растворе треонинамида при рН 6,9 добавл ют карбоксипептидазу Р из Penicillum jauthenellum (СРД-Р) до тех пор, пока концентраци не станет равной 0,42 мг/мл. После этого реакци идет в течение 2,5 ч при 25 С. 50% евино- го инсулина превращаетс в человеческий инсулин, что определ етс при помощи тонкослойной хроматографии.
Примеры 6-14. Получение человеческого инсулина с помощью модифи- цированной СРД-V. Методы.
Аминокислотный анализ. Образцы дл аминокислотного анализа гидролизуют в 5,7 М НС1 при 110°С в вакууме в течение 24 ч и анализируют на аминокислотном анализаторе Дуррум-Д-500.
Анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Превращение свиного инсулина в амид человеческого инсулина может быть прослежено с помощью жидкостной хроматографии при высоком давлении (HPLC) на обратимой фазе.
Используют радиально заполненную С8 колонку от Вотерс Асе., элюирова- ние достигаетс с помощью 0,1 М раствора сульфата аммони , содержащего 30% ацетонитрила. Образцы (30 мкл) из реакционной смеси разбавл ют 1 М уксусной кислоты перед инжектированием в Дюррум Д-500.
Диск-ПЭГ электрофорез. Превращение свиного инсулина в амид человеческого инсулина также может быть прослежено с помощью Диск-ПЭГ электрофореза на 12,5%-ном полиакриламидном геле в буфере, состо щем из 0,005 М Трис - 0,04 М глицина при рН 8,3. Амид человеческого инсулина мигрирует медленнее свиного инсулина, соответству потере одного отрицательного зар да.
Q
5
,-
0
5
0
0
5
С-Конценой анализ.
СРД-У гидролиз используют дл опрен1 лочи С-концевой последовательности И--Ц1Т1И инсулина. 500 мкг инсулина в 0,05 М ES буфере при рН 6,75 переваривают 30 мкг СРД-У при 37°С в течение 1 ч. Высвободившиес аминокислоты определ ют па аминокислотном анализаторе.
Препаративна хроматографи на ДЕАЕ-Сефарозе.
Амид человеческого инсулина отдел ют от непрореагировавшего свиного инсулина ионообменной хроматографией на ДКАК-Сефароэе. Лиофилизированный образец инсулина раствор ют в 0,01 М Трис - 0,05 М NaCl - 2,5 М мочевине , при рН 7,5 и нанос т на колонку, уравновешенную тем же самым буфером. Инсулины элюируют с градиентом NaCl от 0,05 до 0,30 М в том же самом буфере.
Получение модифицированной карбок- сипептидазы У (СРД-УМ).
К 1 мл водного раствора СРД-У (9,9 мг/мл, 150 мкмоль) прибавл ют 100 мкл 0,5 М НЕРК S (рН 7,5) и последовательно 25 мкл водного раствора М HgCl.. Смесь оставл ют при комнатной температуре на 10 мин, после чего она готова дл использовани . Обычно используют стехиометри- ческие количества фермента и ртути, но избыток ртути может быть легко удален гель-фильтрацией или диализом. Может быть приготовлена СРД-У, модифицированна метил-Нр, или этил-Hg, по аналогичной методике с использованием метил-HgCl или этил-Hgd соответственно .
Тест на возможное высвобождение ртути из СРД-УМ.
Поскольку специфическа экстераз- па активность нативной СРД-У по отношению к субстрату В L - Lys - OMe практически равна нулю, тогда как СРД-УМ имеет очень высокую активность, это различие может быть использовано дл определени возможного высвобождени ртути, которое будет приводить к снижению экстеразной активности. Однако ни добавление 10 мМ ЕДТА, ни гель-Фильтраци не привод т даже к малейшему снижению активности, показыва , что нет высвобождени ртути.
Результаты.
Пример Ь. Раствор ют 80 мг свободного от цинка инсулина в 6,5 мл
1,1 M Thr - NHa, 0,05 M HEPE S, 1,0 KC1 при рН 7,0 и прибавл ют 12,7 мг СРД-УМ в 2,5 мл 0,05 M HEPES при рН 7,0. Реакцию ведут при 20°С, затем провод т Н L С и гель-электрофорез . HLC показывает превращение 78% после 21 ч реакции. Гель-электрофорез показывает подобную глубину конверсии.
После 21 ч реакции устанавливают рН 2 с помощью 1 M HC1 и обессоливают образец на Сефадексе R -G50 в 1 М уксусной кислоте, а затем лио- филизируют. Хроматографи на ДЕАЕ-Се- фарозе показывает профиль элюции с ,двум пиками. Гель-элек -рофорез показывает , что два пика вл ютс очевидно чистыми. Пик I содержит 41,5 мг амида человеческого инсулина. Амино- кислотный анализ пика I (табл.3) показывает, что аланин обмениваетс на треонин. Пик II содержит 40% непрореагировавшего свиного инсулина, который может быть рециклизован.
Пример 7. Раствор ют 70 мг кристаллизованного цитрата сырого инсулина в 2 мл 1,5 M Thr - NH2, 0,05 M HEPE S, 1,0 M HC1 при pll 7,0. Реакцию провод т при 20°С в присут- ствии 15 мкМ СРД-УМ. После 72 ч реакции HPLC показывает конверсию 77%. Гель-электрофорез показывает подобную глубину конверсии. Реакционную смесь анализируют, как описано в примере А. Хроматографи на ДЕАЕ-Сефарозе показывает профиль элюции с двум пиками в соотношении 2:1 дл амида человеческого инсулина и свиного инсулина
соответственно. Аминокислотный анализ
пика I показан в табл.30 Пик II содержит 40% непрореагировавшего свиного инсулина.
Пример 8. Раствор ют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 мл 1,0 M Thr - NH4, 1M мочевины при рН 7,5 (рН устанавливают НВг). Прибавл ют 2,3 г СРД-УМ. Реакцию провод т при 32°С, затем провод т HPLC. После 2ч 10 ми 75% свиного инсулина превращаетс
в амид человеческого инсулина.
Пример 9. Раствор ют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 t-л 1,0 М Thr-NHj, 1 М мочевины, рН 7,75 (рН устанавливают НВг). Добавл ют 2,7 мг СРД-УМ. Реакцию провод т при 32°С, затем провод т HPLC. После 2 ч 10 мин 73% свиного инсулина поеQ
5 0 5
0
5
0
0
вращаетс в амид человеческого инсулина .
Пример 10. Раствор ют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 мл 1,0 М Thr-NH, 1 М мочевины, рН 6,0 (рН устанавливают НВг). Прибавл ют 3,6 мг СРД-УМ. Провод т реакцию при 32 С, затем провод т HPZC. После 1 ч 40 мин 75% свиного инсулина превращаетс в амид человеческого инсулина.
Пример 11. Раствор ют 100 мг свиного Zn-инсулина в 6,7 мл 1,0 Н Thr-NHt, 1 М мочевины, рН 8,25 (рН устанавливают НВг). Прибавл ют 3,6 мг СРД-УМ. Реакцию провод т при 32°С, а затем провод т HPLC. После 1 ч 20 мин 68% свиного инсулина.превращаетс в амид человеческого инсулина .
Пример 12. Раствор ют 100 мл свиного Zn-инсулина в 6,7 мл 1,0 М Thr-NH2, 10 МКУ, 1 М мочевины , рН 8,0 -(рН устанавливают HNOj). Прибавл ют 3,6 мг СРД-УМ. Реакцию провод т при 32 С, затем провод т HPLC. После 2 ч 5 мин 73% свиного инсулина превращаетс в амид человеческого инсулина.
Пример 13, Повтор ют процедуру примера С, но используют 3 мг СРД-УМ, иммобилизованного на силнка- геле. После 2 ч получают 75% конверсии .
HPLC, Диск-ПЭГ и аминокислотный анализ продуктов, полученных в примерах , показывает, что они действительно вл ютс амидом человеческого инсулина.
Последующее деамидирование человеческого инсулина может быть проведено по примеру 4.
Пример 14„ Деамидирование амида человеческого инсулина на немодифицированной СРД-У и модифицированной СРД-У.
А. Немодифицированна СРД-У.
К раствору 15 мг/мл человеческого инсулина в 1 мМ ЕДТА при рН 8,0 и температуре 25°С прибавл ют СРД-У до конечной концентрации 7,2 мкМ. После 22 мин реакции 74% амида превращаетс , как определено HPLC. После разделени на ДЕАЕ-Сефарозе HPLC анализ и аминокислотный анализ показывают , что человеческий инсулин вл етс чистым.
19
B.СРД-У, модифицированна ме- тил-Hg.
Аналогично примеру А, но с 4,9 мкМ метил-Не-СРД-У, рН 8,0. Пос- ле 39 мин реакции 61% амида инсулина превращаетс в человеческий инсулин .
C.СРД-У, модифицированна этил-Hg.
Аналогично примеру А, но с 7,2 мкМ этил-Н8-СРД-У, рН 8,0. После 36 мин реакции 74% конверсии наблюдаетс по данным HPLC.
Д. СРД-У, модифицированна ме- тил-Hg.
Аналогично примеру А, но с 19 мкМ метил-Нв-СРД-У, рН 7,5. После 2 ч реакции по данным HPLC наблюдаетс 90% конверсии.
Claims (5)
1. Способ получени человеческого инсулина формулы Ins - Thr - ОН или его производных, имеющих формулы Ins - Thr - NHj,Ins - Thr - NH2 или Ins - Thr - OR3 ,
где Ins - DeS - Thr (.30) человеческого инсулина R 3 - С,-С6-алкил,
путем ферментативного замещени В-30 аминокислоты в свином инсулине формулы
Ins - Ala - ОН
с помощью карбоксипептидазы при оптимальной температуре процесса с последующим выделением целевого про- дукта, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода целевого продукта за счет избежани предварительного отщеплени В-30 Ala, свиной инсулин ввод т в реак- цию с водным раствором или дисперсией , содержащей амид треонина или сложный эфир треонина общей формулы
1554766
20 Н - Thr - OR:
5
0
5
0
5
„ -
где RJ имеет указанные значени , при рН 7-9,5, причем исходные концентрации свиного инсулина и амида треонина или его сложного эфира устанавливают от 0,002 до 0,5 М И от 0,05 до 3 М соответственно, в качестве карбоксипептидазы используют сериновую карбоксипептидазу микробного происхождени , специфическую дл субстратов, имеющих С-концевую L-аминокислоту с образованием при -этом одного из производных инсулина формул Ins-Thr-NH2, Ins - Thr - Thr - Ins - Thr - OR3, n которой дл получени человеческого инсулина в качестве целевого продукта отщепл ют одну из групп -NH2, -Thr-МЦ и -OR з путем взаимодействи той же самой или иной L-специ- фичнон серинопой карбоксипептидазы в водном растворе или дисперсии при рН 9 - 10,5.
2.Способ по п.1, отлича ю- щ и и с тем, что используют не- модифицировэнную или модифицированную карбоксипептидаэу Y из пекарских дрожжей или карбоксипептидазу Р ич Penicilium jouthenellum.
3.Способ по п.1, отлича ю- щ и и с тем, что используют карбоксипептидазу Y, модифицированную сол ми ртути или иммобилизованную.
4.Способ по п.1, отлича ю- щ и и с тем, что до 50% органического растворител используют этанол или метанол, или этнленгликоль, или пропиленгликоль, или диметил- формамид, или диметилсульфоксид, или тетрагидрофуран, или дноксан, или диметоксиэтан.
5.Способ по п.1, отлича ю- щ и и с тем, что используют водный раствор или дисперсию, содержащую мочевину, или гидрохлорид гуани- дина в концентрации до 3 М.
21
155476622
Таблица 1 Аминокислотный состав инсулина
Низкие значени ввиду неполного гидролиза.
Таблица 2
Аминокислотный состав пиков I, II, III на фиг.З и пика II, полученного после дезамидировани фракции соответствующей
пику I
Аспарагинова
кислота2,992,993,01
Треонин3,622,522,50
Серии2,932,922,92 Глютаминова
кислота6,887,167,17
Пролин1,000,980,71
Глицин4,004,004,00
Алании1,161,521,03
Изолейцин0,941,041,09
Валин2,422,822,81
Лейцин5,806,216,18
Тирозин3,803,863,67
Фенилаланин2,742,822,65
Гистидин 1,961,901,93
Лизин0,990,741,06
Аргинин0,961,000,98
3,01 2,79 2,93
7,01 0,87 4,00 1,09 1,19 2,50 6,10 4,02 2,64 1,89 1,01 0,89
23155476624
Таблица 3 Аминокислотный анализ инсулина
Пг
1 ч 68 ю it Фиг. г
чо всюилт тн 0w.j
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK319780A DK319780A (da) | 1980-07-24 | 1980-07-24 | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1554766A3 true SU1554766A3 (ru) | 1990-03-30 |
Family
ID=8120166
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU823414346A SU1554766A3 (ru) | 1980-07-24 | 1982-03-23 | Способ получени человеческого инсулина формулы I @ -Т @ -ОН или его производных |
| SU843825251A SU1611217A3 (ru) | 1980-07-24 | 1984-12-18 | Способ получени инсулина человека |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU843825251A SU1611217A3 (ru) | 1980-07-24 | 1984-12-18 | Способ получени инсулина человека |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4645740A (ru) |
| EP (1) | EP0045187B1 (ru) |
| JP (1) | JPS642360B2 (ru) |
| AT (1) | ATE9820T1 (ru) |
| AU (1) | AU543687B2 (ru) |
| CA (1) | CA1175372A (ru) |
| DE (1) | DE3166608D1 (ru) |
| DK (1) | DK319780A (ru) |
| ES (2) | ES8300858A1 (ru) |
| HU (1) | HU185668B (ru) |
| IE (1) | IE51620B1 (ru) |
| SU (2) | SU1554766A3 (ru) |
| WO (1) | WO1982000301A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA815066B (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998004731A1 (fr) * | 1996-07-25 | 1998-02-05 | Firma 'nika-Universal' | Techniques binaires de production de peptides biologiquement actifs |
| RU2164520C2 (ru) * | 1993-09-17 | 2001-03-27 | Ново Нордиск А/С | Производное инсулина, растворимая пролонгированная фармацевтическая композиция, способ пролонгирования гипогликемического действия при лечении диабета |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| EP0088117B1 (en) * | 1981-09-15 | 1986-09-24 | Nordisk Insulinlaboratorium | Process for preparing human insulin or b-30 esters thereof |
| EP0079362A1 (en) * | 1981-05-20 | 1983-05-25 | Nordisk Insulinlaboratorium | A process for the preparation of insulin derivatives |
| DK353781A (da) * | 1981-08-10 | 1983-02-11 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af insulinderivater |
| WO1983002772A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3327709A1 (de) * | 1983-07-29 | 1985-02-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Insulin-derivat-kristallsuspensionen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| DK113585D0 (da) * | 1985-03-12 | 1985-03-12 | Novo Industri As | Nye peptider |
| DK119785D0 (da) * | 1985-03-15 | 1985-03-15 | Nordisk Gentofte | Insulinpraeparat |
| PH25772A (en) * | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| US5580751A (en) * | 1990-09-14 | 1996-12-03 | Carlsberg A/S | Process for the preparation of C-terminally amidated peptides |
| DK220890D0 (da) * | 1990-09-14 | 1990-09-14 | Ole Buchardt | Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider |
| US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| US6011007A (en) * | 1993-09-17 | 2000-01-04 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| US6323311B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
| US4182654A (en) * | 1974-09-18 | 1980-01-08 | Pierce Chemical Company | Production of polypeptides using polynucleotides |
| WO1980002157A1 (en) * | 1979-04-06 | 1980-10-16 | Forenede Bryggerier As | A process for enzymatic production of peptides |
| NO153061C (no) * | 1979-04-13 | 1986-01-08 | Shionogi & Co | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin |
| JPS55138391A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | New synthetic method of peptide derivative |
| US4343898A (en) * | 1980-02-11 | 1982-08-10 | Novo Industri A/S | Process for preparing esters of human insulin |
-
1980
- 1980-07-24 DK DK319780A patent/DK319780A/da unknown
-
1981
- 1981-07-23 ES ES504462A patent/ES8300858A1/es not_active Expired
- 1981-07-23 IE IE1660/81A patent/IE51620B1/en unknown
- 1981-07-23 ZA ZA815066A patent/ZA815066B/xx unknown
- 1981-07-23 EP EP81303383A patent/EP0045187B1/en not_active Expired
- 1981-07-23 DE DE8181303383T patent/DE3166608D1/de not_active Expired
- 1981-07-23 HU HU813205A patent/HU185668B/hu not_active IP Right Cessation
- 1981-07-23 AU AU74508/81A patent/AU543687B2/en not_active Ceased
- 1981-07-23 AT AT81303383T patent/ATE9820T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-07-23 JP JP56502653A patent/JPS642360B2/ja not_active Expired
- 1981-07-23 WO PCT/DK1981/000074 patent/WO1982000301A1/en not_active Ceased
- 1981-07-23 US US06/364,856 patent/US4645740A/en not_active Expired - Fee Related
- 1981-07-23 CA CA000382347A patent/CA1175372A/en not_active Expired
-
1982
- 1982-03-23 SU SU823414346A patent/SU1554766A3/ru active
- 1982-07-28 ES ES514463A patent/ES8306182A1/es not_active Expired
-
1984
- 1984-12-18 SU SU843825251A patent/SU1611217A3/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Видмер Ф., Йохансен И.Т0 Энзи- матический пептидный синтез: катализируемое карбоксипептидазой-У образование пептидных св зей о - Carls- berg Res Commun. т.44, 1979, № 4, с. 37-46, Морихара В. Способ полусинтеэа инсулина человека в результате катализируемой трипсином замены АЛА-В-30 на ТРЕ свином инсулине. - Nature, т. 280, 1979, № 5721, с. 412-413. Морихара В0 и др„ Превращение свиного инсулина в инсулин человека, катализируемое Ахром-бактерпротеа- эой-1. - Biochem. and Bioph, Res. Comm., т„ 92, 1980, № 2, c. 396-402. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2164520C2 (ru) * | 1993-09-17 | 2001-03-27 | Ново Нордиск А/С | Производное инсулина, растворимая пролонгированная фармацевтическая композиция, способ пролонгирования гипогликемического действия при лечении диабета |
| WO1998004731A1 (fr) * | 1996-07-25 | 1998-02-05 | Firma 'nika-Universal' | Techniques binaires de production de peptides biologiquement actifs |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES504462A0 (es) | 1982-12-01 |
| US4645740A (en) | 1987-02-24 |
| IE811660L (en) | 1982-01-24 |
| DE3166608D1 (en) | 1984-11-15 |
| ES8300858A1 (es) | 1982-12-01 |
| HU185668B (en) | 1985-03-28 |
| WO1982000301A1 (en) | 1982-02-04 |
| ATE9820T1 (de) | 1984-10-15 |
| ES514463A0 (es) | 1983-06-01 |
| ES8306182A1 (es) | 1983-06-01 |
| JPS57501161A (ru) | 1982-07-08 |
| JPS642360B2 (ru) | 1989-01-17 |
| IE51620B1 (en) | 1987-01-21 |
| AU7450881A (en) | 1982-02-16 |
| SU1611217A3 (ru) | 1990-11-30 |
| DK319780A (da) | 1982-01-25 |
| EP0045187A1 (en) | 1982-02-03 |
| CA1175372A (en) | 1984-10-02 |
| ZA815066B (en) | 1983-03-30 |
| EP0045187B1 (en) | 1984-10-10 |
| AU543687B2 (en) | 1985-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4339534A (en) | Process for enzymatic production of peptides | |
| US4645740A (en) | Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins | |
| US4543329A (en) | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins | |
| EP0278787B1 (en) | A process for enzymatic production of dipeptides | |
| JPH0211240B2 (ru) | ||
| EP0017938B1 (en) | Process for preparing a b30-threonine insulin | |
| CA2092721C (en) | Process for the preparation of c-terminally amidated peptides | |
| CA1174973A (en) | Process for preparing polypeptide derivatives | |
| Breddam | Chemically modified carboxypeptidase Y with increased amidase activity | |
| US4029642A (en) | Process for the manufacture of human insulin | |
| IE841995L (en) | Preparing an insulin derivative | |
| US4579820A (en) | Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins | |
| FI78119C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. | |
| IE54605B1 (en) | A process for converting preproinsulin analogs into insulins | |
| KR20010099668A (ko) | 펩타이드의 효소적 아미드화 | |
| NO156654B (no) | Fremgangsmaate for enzymatisk erstatning av b-30-aminosyren i insuliner. | |
| US4596675A (en) | Novel thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase | |
| A Holt et al. | Reactions of I, I-Diacetoxyiodobenzene with Proteins: Conversion of Amide Side-Chains to Amines | |
| Itoh et al. | Methyltrypsin-catalyzed peptide coupling: comparison of alkyl ester and guanidinophenyl ester derivatives as acyl donor component | |
| DK148714B (da) | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner | |
| CS209740B1 (cs) | Syntetické substráty pro proteolytické enzymy | |
| JPS6244920B2 (ru) | ||
| NO157706B (no) | Fremgangsmÿte for enzymatisk fremstilling av peptider. | |
| JPS60190794A (ja) | トリペプチドおよびその製法 |