SU716524A3 - Способ получени веществ, обладающих антипаразитарной активностью - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИПАРАЗИТАРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

номер NRRZ 8165. Образец NRRZ 8165 был также депонирован в посто нной коллекции Американской коллекции типовых культур в Парклаун Драйв Мериленд 20852 и получил пор дковый номер АТСС 31, 267.

Морфологические и культуральные характеристики следуюмие. Морфолог спорофоры образуют спирали в виде боковых ветвей воздушного мицели . Спирали компактные, но делаютс  более открытыми по мере старени  культуры. Споры-цепочками не более чем в 15 спор, обычно имеют сферическую или овальную форму (при увеличении в 970 раз). Спорообразован наблюдаетс  в агаое с овс ной му;кой , с глицерином-аспарагином, с сол ми, крахмалом и с  ичным альбумином . Поверхность спор гладка . Агар с овс ной мукой; обратна  сторона - темно-коричнева . Воздушный мицелий: порошковый коричневато-серый (41) ,(обоз .начени  номера,цвета вз ты из Co2pr Hermany Митеов, 1б5в/1-th tdftion Conteiner ot АгпеНсд, Chlcogo, OU. смешанный с белым. Растворимый пигмент; коричневый Лапек Доке агар (сахароза-нитрат). Вегетативный рост; плохой,

бесцветный.

Воздушный мицелий скудный,

сероватый.

Растворимый пигмент; сероватокоричневый светлого тона. Яично-альбуминный агар: вегетативный рост умеренный, светло-серовато-желтовато-коричневый (В оеГГ смешанный с белым.

Растворимый пигмент: светло-сервато-коричневый .

Глицерино-аспарагиновый агар, веге .тативный рост; обратна  сторона желтовато-коричнева . ,

Воздушный мииелий; порошковый коричневато-серый (411), смешанный о белым.

Растворимый пигмент: светлый, желтовато-коричневый.

Неорганические соли - крахмал.

Вегетативный рост: обратна  сторона серовато-желтовато-коричнева .

Воздушный мицелий: порошковый, светлый, коричневато-серый (411) по кра м более темно-коричневатосерый (4li }.

Растворимый пигмент: светложелтовато-коричневый .

Агар с дрожжевым экстрактом-декстровой-соли .

Вегетативный рост: обратна  сторона темно-коричнева .

Воздушный мицелий: умеренный, коричневато-белый.

Растворимый пигмент: коричневый Агар с пентоно-железо-дрожжевым экстрактом.

Вегетативный рост; темно-коричневый .

Воздушный мицелий: нет.

Растворимый пигмент; от темнокоричневого до черного.

Миланин: положительна  реакци .

Выделение положительна  ре .акци .

0

Агар с дрожжевым экстрактом мальтэкстрактом .

Вегетативный рост: обратна  сторона темно-коричнева .

Воздушный мицелий: умеренный,

5 коричневато-белый.

Растворимый пигмент; коричневый. Питательный ага.р.

Вегетативный рост: коричневый.

Воздушный мицелий: скудный, 0 сероватый.

Растворимый пигмент; светло-коричневый ..

Питательный крахмальный агар. .

Вегетативный рост: коричневый. 5Воздушный мицелий; скудный, серовато-белый .

Растворимый пигмент-; светло-коричневый .

0Гидролиз крахмала; хороший.

Картофельна  масса.

Вегетативный рост: коричневый.

Воздушный ьетцелий: коричневый, смешанный с серовато-белым. 5 Сыворотка крови Лефлера.

Вегетативный рост: сероватокоричневый .

Воздушный мицелий: нет.

Растворимый пигмент: некторое , потемнение среды.

0

Разжижение: нет. Питательный тирозиновый агар.

Вегетативный рост:- обратна  сторона от темно-коричневой до черной.

5Воздушный мицелий: скудный,

сероватый.

Растворимый пигмент: темно-коричневый .

Разложение тирозина; нет. Q Усвоение - углерода.

Основна  среда Придгема Готтлиба 1 1% источника углерода -f (+ рост, - нет роста, в сравнении с контрольной без источника углерода ) .

5

Глюкоза +маннитон +

Арабиноза +манноза +

Пеллюлоза - ФаЛиноза + Фруктоза +рамноза +

Лактоза +сахароза +

0 Мальтоза +ксилоза +

Инозитол + Питательный желатиновый агар.

Вегетативный рост: KopHiHeBFjA.

Воздучный мицелий: скудгый, 5 серовато-белый. Растворимый пигмент: светло-ко невый. Разжижение желатины: хорошее, Желатина (посев уколом). Вегетативный рост: коричневое кольцо. Воздушный мицелий: нет. Растворимый пигмент: зеленоват коричневый , Разжижение желатины: полное. Агар-сн тое молоко. Вегетативный рост: темно-корич невый. Воздушный мицелий: нет. Растворимый пигмент: темно-коричневый . Гидролиз казеина: хороший. Лакмусовое молоко. Вегетативный рост: темно-корич вое кольцо роста. Воздушный мицелий: нет. Цвет - темно-коричневый. Коагул ци  и/или пептонизаци : полна , делаетс  щелочной (рН 8,1 Сн тое молоко. Вегетативный рост: темно-корич вое кольцо роста. Воздушный мицелий: нет. Растворимый пигмент: темно-кори невый. Коагул ци  и/или пептонизаци : полна  пептонизаци , делаетс  щело ным (рН 8). Температура: (агар с дрожжевым трактом + соли): - хороший вегетативный рос и воздушный мицелий, - хороший вегетативный рос ;и воздушный мицели-й, - роста нет. Потребность в кислороде: (культ уколом в агаре с.дрожжевым экстрак том + соли). Аэробна  культура. Все определени  производились через три недели при , если Не оговорено иначе. Значени  рН йсех сред почти нейтральные (6,8-7 При ттательном сравнении этих.д ных с опубликованными описани ми, включа  Руководство по определен ной бактериологии Берке  (8 издани известных микроорганизмов, обнаруживаютс  значительные различи , указываюиие ,что данный микрооргани должен быть классифицирован как но вид. На этом основании он был назван Streptomvces C(vermUi is. С-076-соединени  получают при ферментации подход щей водной пита тельной средн штаммом Streptomvces c в описываемых далее услови  водные среды, примен емые дл  получени  многих антибиотиков,  вл ютс  также пригодными дл  данного процесса получени  С-076-соединеНи Такие питательные среды содержа Источники углерода и азота, ассими лируемые микроорганизмами и неболь 1ише количества неорганических солей. Кроме того, ферментационные среды могут содержать следы металлов, необходимых дл  роста микроорганизма . Они обычно присутствуют в виде комплексных соединений источников углерода и азота, примен ем-ix в качестве источника питани , но их можао добавл ть к среде отдельно. Такие углеводы как сахар, например декстроза, сахароза, мальтоза, лактоза, декстран, церелоза, и т.п. и крахмалы  вл ютс  хорошими источниками ассимилируемого микроорганизмами углерода в питательных средах. Количество источника углерода, примен емого в среде, частично зависит от количеств других компонентов среды и обычно составл ет 0,5-5вес.% от количества средыи считаетс  достаточным . Источники углерода можно примен ть отдельйо,или их можно комбинировать в среды с другими компонентами . При образовании С-076-соединений легко ассимилируемых штаммом 5trep omvces civermitiPis примен ют такие различные источники азота, как дрожжевые гидролизаты, дрожжевые автолизатн , соева  мука, гидролизат ы казеина , дрожжевые -экстракты, жидкости дл  замочки кукурузы, кукурузна  барда, мука хлопковых сем н, м сные экстракты и т.п. Можно примен ть или один источник, азота, или в комбинации с другими соединени ми в количестве 0,2-6 вес.% среды. Из питательных неорганических солей,которые можно вводить в культуральные -среды, можно назвать обычные соли, способные давать ионы нати , кали , магни , аммони ,кальци , фосфата, сульфата, хлорида, -карбоната и т.п. Ввод тс  в соеду также леды таких металлов, как кобальт, арганец, железо и т.п. Далее приедены примеры сред, поиголннх пл  выра11ивани  штаммов siceptomvces ovcrmitiPis с целью получени  С-П76. соеинений Среда А. Кукурузна  мука, г20,0 Соева  мука,г15,0 Барда,г10,0 Цитрат натри , г4,0 . , г0,5 Полигликоль Р 2000,мл2,5 , г0,1 СаС12бН„0, г0,01 FeSO. , г0,01 Дистиллированна  вода, мл рН 6,51000 Среда В Растворимый крахмал,г20,0 ХСидкость от замочки кукурузы, г15,0 Перелоза, г5,0 Соева  мука, г4,0 ( N H)SO , г4,0 Кукурузна  мука, г1,0 Соевое масло, мл2., 5 КН РО , г0,3 CaCOj, г6,0 Дистиллированна  вода, млрН6,71000 Среда С Томатна  паста, г40,0 Ова на  мука, г15,0 Дистиллированна  вода, мл рН 6,01000 Овс на  мука, г20.,0 Томатна  паст.а, г20,0 Дистиллированна  вода, мл рН 5,5 .1000 Среда Е Декстроза, г10,0 Пептон (фирг-ы ДИЛко Лабораториз Детройт), г 5,0 Дрожжевой автолизат, г 3,0 ( Ардамин оН Лирмы Ист Продактс Инк, Патерсон) NaCJ, КСЬ, г0.72 FeSO ( SO 6Н,О. 0,035 МдС1г-бНг.О/г5,32 СаС2. 2 Н,0, гО/73 Дистиллированна  вода, мл рН.7,41000 Ферментацию с применением микро организмов, образующих С-07б-соеди нени ,можно проводить при 20-40 С Дп  получени  оптимальных результа наиболее целесообразно проводить эти ферментации при температурах 2 4-30°С, Наиболее предпочтительны температуры 27-28 С. рН питательно среды, пригодной дл  получени  С-0 соединений, можно мен ть в предела 5,0-9,0 предпочтительно 6,0-7,5. Ферментации в небольших коли-, чествах удобно проводить в колбе в стерильных услови х, заража  пита тельную среду спорами или вегетати ными клетками штамма Slt-eptomvces av miWis образующего С-076-соединени Колбу затыкают ватой и выдерживаю при посто нной температуре и взбалтывании в течение 3-10 дней. При работе с большими количествам ферментацию рекомендуетс  проводи в сосуде, снабженном мешалкой и у тройством дл  аэрировани  питател ной среды. Питательную среду гото в т в сосуде, стерилизуют и затем зар жаиот источником вегетативного клеточного материала штамма Strepto ces Qvermitieisобразуго его С-0 соединени . Ферментацию продолжаю 1-8 дней при перемешивании и/или аэрировании питательной среды при температуре 24-37°с, скорости перемешивани 95-125 об/мин и при подаче воздуха 1,8-18 . Получаемые по изобретению новые вешества, называемые здесь С-076вешествами , наход тс  по окончании ферментации главным образом в мицелии и могут быть извлечены и отделены как описано выше. Выдел ют четыре главных и четыре второстепенных компонента С-07б-соединениГ, образуемых Streptomvces overmUieis .Идентифицировано восемь различных соединений С-076, Ala, А1в, А2а, А2в, В1а, В1в, te2a, В2в. Главные компоненты обозначены 1буквой1 а, второстепенные буквой в. Структурные различи  между соединени ми айв должны быть одинаковыми дл  каждой из четырех пар. Как и следовало ожидать, даже главные С-076-соединени  не образуютс  в одинаковых количествах при описанных здесь услови х ферментации . Так, А1 соединени  составл ют 20-30 вес.% от общего количества получающегос  комплекса С-076, соединени  А2 составл ют 1-20 вес.%-, соединени  В1 и В2 каждое 25-35%. Весовое соотношение р дасоединений к р ду соединений в равно 85-15 - 99:1. Отделение соединений С-076 от всей Ферментационной массы и извлечение индивидуальных компонентов . производитс  экстракцией растйорителем и хроматографическим фракционированием различными хроматографическими методами и с различными системами растворителей. С-076-соединени  слабо раствор ютс  в воде и хорошо в органических растворител х. Это свойство используют дл  извлечени  их из ферментационной среды. Так, по одному способу извлечени  всю ферментационную массу отфильтровывают и водный фильтрат выбрасывают. Затем отжатый влажный фильтровальный остаток мицели  экстрагируют подход щим растворителем . Хот  и можно примен ть любой органический растворитель, лучше примен ть растворитель, смешиваюшийс  с водой, например ацетон, метанол, этанол и т.д. Дл  достижени  максимального извлечени  рекомендуетс  многократна  экстракци . Растворителем извлекаютс  активные компоненты С-076,а также вещества, не обладающие антипаразитической активностью соединени  С-076. Если растворитель смешиваетс  с водой, то воду также удал ют из влажного мицели .Экстрагированный мицелий можно отбросить.Экстракты упариваот дл  удалени  органического растворител  и экстракцию повтор ют несколько раз с другим растворителем. Если

при первой экстракции примен ют. сМ5 шивающийс  с водой растворитель, то при второй экстракции предпочтительнее примен ть не смешиваю1цийс  с водой растворитель, например хлороформ, хлористый метилен, четыреххлористый углерод, этилацетат, метилэтилкетон, метилизо(;утилкетон и т.п. Полученные экстракты высушивают и концентрируют обычными методами . Получают остатки, содержащие G-076-соединени  с примес ми других соединений. Затем эту фракцию хроматографируют дл  отделени  активных . С-07б-соединений от прочего материала и также дл  выделени  индивидуальных С-076-соединений . Хроматографируют на колонке с применением таких сред, как силикагель , окись алюмини , гели декстрана и т.п. и элюирование производ  или различными растворител ми и/или комбинацией двух или более раствори-

телей, вз тых в различных соотношенк х . идкостную хроматографию примен ют дл  открыти  С-07Я-соединений и жидкостную1 хроматографию высокого давлени  можно примен ть дл  выделе ни  очищенных фракций, содержащих одно или более соединении. Аналогично храматографию в тонком слое можно примен ть дл  обнаружени  и выделени  индивидуальных С-0 76-соединений. Присутствие активных С-076-соединений

0 определ етс  испытанием различных хроматографических фракций на антипаразитическую активность и также спектральными характеристиками этих соединений.

5

Спектральные и другие физико-химические характеристики индивидуальных G-076-срединений приведены в табл.1. Эти соединени  хорошо растворимы в большинстве;обычных органи0 ческих растворителей и обладают минимальной растворимостью в воде,

таблица i

Молекул рна  ,, О,,с Н.О формула +48, 8° ±2° Оптическое +68,5 ±2 вращение {d} () (,77)

Молекул рна  масса

(определена масс-спектрометрически ).886

Ультрафиолетовые спектральные данные были получены с помошью ультрафиолетового спектрометра Кери, модель 15 в метанольных р-гствооах в кварцевых  чейках , площадью 1 см, Хот  ультрафиолетовое поглощение представлено как поглощение р да а, фактически оно  вл етс  поглощением соединений р да а, содержащих ( ,64)

876

890

858

872

.примеси соединений р да в. Р ды а и в различаютс  только числом -СН в. низкоалкильном заместителе и эта 60 .разница не св зана с хромофором. Ультрафиолетовое поглощение в первую очередь характеризует степень и природу ненасыщенноети в соедине|Нии , Оптические врашени  определ ют, .имен   стандартные методы и пол С , Н,, Н О,С Н, , Ч. СдтНггО,; +55.°±2 ..+38,. (,06)(,87)

11716524. 12

оиметр Гейсса. Фактор концентрацииприменении тетраметилсилана в ка (с) даетс  как количество соедине-честве внутреннего стандарта. Обьем

ни  в данном растворителе, выражен-раствора и концентрации образцов

нов в процентах..указаны в каждом случае с последуюДанные ЯМР-спектра 13С дл  С-076 5 но тетраметилсилана дл  каждого соеА1а , А2а: В1аИ В2в приведены в табл.2. динени , данными в част х на миллион. Спектры получены с помощью спектро-Химические сдвиги даютс  дл  отдельметра  дерного магнитного резонанса.ного атома углерода, если не оговореВариант модели СЕТ-20 в дейтерирован- но иначе, в скобках после химического ном хлороформном растворителе при.Q , 11,612,413,815,1 .17,7

щими химз ческими сдвигами относительТаблица218 ,4, 19,920,227,3 Характеристики масс-спектральных пиков восьми С-076-соединений приво,д тс  в табл.3. В первой строке та(5лицы представлено отношение массы к 1 за|5 ду. (м/е) молекул рного иона, каждого соответствующего соединени  и остальные цифры дают отношение массы к зар ду главных фрагментов каждого соеданени . Отношени  масс к зар ду наход щихс  в одном горизонтальном р ду, указывают аналогичные фрагмен;ТЫ каждого соединени . ,Основыва сь на экспериментальных данных,исследовани х и измерени х, описанных здесь, считаетс , что ;С-П76-соединени  должны иметь следующую структурную формулу: R-0 LLJ

Продолжение табл,2 .( Лз где R- у- -олендрозил- JT -1 -олеандрозид структуры «Нз НО и где пунктирна  лини  указывает простую или двойную св зь; R - оксигруппа , котора  присутствует только тогда, пунктирна  лини  указывает на простую св зь, R - бутил или пропил и R- -метокси- или оксигруппа . Индивидуальные соединени , вхо щие в эту структурную Лормулу, оивол тс  ниже: 15 Соединени , в которых Rj -бутил (соед иени  р да а) и соответствующие соединени , в которых- П. пропил (соединени  р да в) ведут себ  одинаково в большинстве процессов извлечени , например при экс тракции растворителем, В каждой паре соеда1нений а и в соединение а находитс  в большем количестве и обычно составл ет 85-99% смеси соединений а-и в . Присутстви пропиловых соединений подтверждаетс  .масс-спектрами соединений, где пики представл ют собой Фрагменты, содержащие бутильную группу, имеют парные пики с массой на 14 единиц (или одну -CHj) меньше. В дополнение следует отметить, что дл  отделени  компонен тов В1в от компонентов Ala примен ли жидкостную хроматографию высокого давлени  и масс-спектр такого А1в-со динечи  подтверждалс  масс-спектроме рией высокого разрешени  (см.табл.3) : Новые соединени ,полученные по изобретению, имеют значительную паразитицидную активность, как антигель мнты , инсектицидь и акарициды, д1л  животных и в сельском хоз йстве Как готовые препараты эти соединени  можно назначить внутрь, например в виде капсуль больших пилюль или таблеток в виде -жидких обильных доз антигельминтов дл  млекопитающих . Такие .отдельные дозы могут широко измен тьс  по общему весу и содержанию антипаразитического агент в зависимости от таких факторов, ка паразит, подлежащий уничтожению, силы и типа инфекции и веса тела жи вотного. Примен ть предлагаемые соединени можно или как очищенные индивидуаль ные С-076-компоненты, или в виде примесей двух или трех индивидуальны компонентов, поэтому нет необходимо ти тщательно раздел ть различные С-076-соединени , полученные после очистки ферментационной среды. Обыч но дл  предупреждени  переносимых паразитами заболеваний примен ют смесь, содержащую два или более С-076-соединений, но без примесей других соединений. Така  смесь обычно содержит С-07б-соединени  в произвольных соотношени х, но все они обладают значительной активностью . Антипаразитическа  активность может быть точно определена. В част ности, необ зательно отдел ть компоненты в от родственного компонента в. Такие соединени  отличаютс  только длиной 25-ой боковой цепи. Разделение таких родственных соединений оРычно не производитс , так как соелинение в присутству ет лишь в виде примеси. С-076-соединени  при добавлении к корму животнмх можно использовать в виде жмыхов мицели  Лермснтационной среды. Поскольку мицелий достаточно активный и уровень активности мицели  можно определить, его можно добавл ть непосредственно к корму животных, Пример 1, Среда 1 Томатна  паста20 г/л Дрожжи10 г/л Крахмал модифицированный , СоСд,а. г/л Полигликоль 20000,321 мп/л Дистиллированна Достаточвода рН 7,2-7,4ное количество Стади . А. 50 MJI среды 1, пометенной в колбу Эрленмайера емкостью 250 мл, инокуируют замороженной ампулой Streptomvces overmitiPis MA 4680. Колбу йнкубируют при при вращении взбалтывател  со скоростью 160 об/мин по кругу диаметром 50 мм в течение 24 ч. Стади  В. 500 мл среды 1, содержащейс  в вухлитровой колбе Эрленмайера, инокулируют 10 мл содержимого колбы стаии А. Среду инкубируют при при вращении взбалтывател со скоростью 150 об/мин по кругу диаметром 50 мм в течение 24 ч. Стади  С. В бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 189 л заливают 160 л среды 2 и добавл ют 500 .мл посевного материала, полученного на стадии В. Чан инкубируют при 28°С при вращающейс  со скоростью 150 об/мин мешалке в течение 24 и скоростью аэрировани  2,7 м/мин. Среда 2. Декстроза, г/л 1 Крахмал кукурузный, 10 г/л М сной экстракт, г/л Автолизированные дрожжи, г/л MgSO -7H2O, г/л . 0,05 г/л О,10 , О, 182 Достаточное Дистиллированна  вода рН 7,0-7,2 количество . Стади  Д. В бродильный чан из нержавеюшей стали емкостью 756 л заливают 457 л среды 6 и добавл ют 43 л материала прививки, полученного по стадии С. Чан инкубировали при 28°С при перемешивании и скорости вращени  мешалки 114 об/мин и аэрирование при скорости потока воздуха 9 . Стади  3. Крахмал продажный, СРС, г Модифицированный (фирмы СРС Корп, г 40,0 Барда, г7,0 A ВТ о ли зиро в энные дрожжи (фирмы Ист5,0 продактс инк), г CoCijj-SHjO, мг50 Дистиллированна 1000 вода, мл рН 7,3 Стади  Е. По окончании этого всю культура ную среду отфильтровывают и оставш с  на фильтре жмых, содержавши С-0 . соединени  , промывают водой. Затем его взмучивают в 120 л ацетона в течение 30 мин, отфильтровывают и промывают 30 л ацетона. Ацетоновые экстракты объедин ют и выпариваю: п пониженном давлении до объема 40 л Разбавленной сол ной кислотой рН концентрата довод т до 4,0. Концент экстрагируют 3 раза произвольными количествами хлороформа. Хлороформные экстракты высушивают пропускаТш емчерез слой инфузорной земли (Сап Сел) . Объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлении до 4 л. Хлороформный концентрат фил . труют и загружают в колонку, заполненную 2,9 кг сйликагел  в хлорофор ме. Колонку элюируют хлороформом, собира  восемь фракций по 3,5 л кажда . Затем колонку элгоируют смес ;хлороформ: метанол-(49:1) , собира  еще восемь фракций по 3,5 л; (Фракции 9-16). Фракцию 3 упаривают досу ха и получают 76 г масл нистого Bee ства, содержащего главным образом С-076-соединени . 97% этого продукта раствор ют в 685 мл хлористого метилена и хроматографируют на 600 г кремнекислотн . Колонку (диаметр 7,3 мм,длина 36см) про вл ют 7,5 л смеси хлористого метилена и бензола (7:3) и зат 2,26 л смеси хлористый метилен бензол-7:3 с добавкой 5% изопропанола. Фракци , элюированна  смесью хлорис ;го метилена с бензолом с добавкой 5 изопропанола,имеет четко окрашенную полосу и содержит фактически весь материал С-076, как это РЫЛО определено хроматографией в тонком слое (см.пример 5). Эту фракцию объемом (500 мл) упаривают и снова хроматографируют на 105 г кремнекислоты (диаметр колонки 3,7 см, длина 18 см) в хлористом метилене. Колонку про вл ют трем  порци ми хлорист го метилена по 100 мл, содержащего 4,10 и 20% эфира. Дальнейшее элюиро ние хлористыг/1 метиленом с содержани ем 20% эфира дает 2 окрашенных полосы . Фракци  между двум  полосами фактически содержит весь С 076-материал , как это установлено с помощ хроматографии в торжом слое. Фракцию, содйржащчто С-076, хроматографируют на 59 г коемнекислоты 1 (дламетр колонки 3,7 см, длина 11 см в хлористом метилене.. Колонку промывают хлористым метиленом, содержащим 10% эфира. В начале элюирован   отбирают фракции по 70 мл и затем отбирают 26 фракций по 5-6 мл. Фракции 3-26 объедин ют и получают 1,35 г материала, его анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевые пластинки Аналтак G F 254, про вленные хлористым метиленом, содержащим 5% изопропанола. Веществом, имеющим Rf 0,28  вл етс  С-076 А1. : Колонку элюируют хлористым метиленом , содержащим 20% эфира (200 мл), затем хлористым метиленом, содержащим 50% эфира (800 мл). Получают небольшое количество смеси С-076 А1 и А2 и все остальное количество С-076 А2. Вес С-076 А2 800 мг. При дальнейшем элюировании хлористым метиленом, содержащим 5% изопропанола , получают 135 мг С-076 В1. Разделение производ т по ультрафиолетовому поглощению элюата.С-07Р В1 и А2.имеют очень близкие величины Rf на силикагелевых пластинках хрома-, тограмм в тонком слое (аналтак G F 254) и хлористом метилене с 5% изопропанола . Однако оба компонента  сно различигфй на -тех же пластинках, про вленных гексаном, содержарщм 10% изопропанола. Всю фракцию С-076 А1 нанос т на 14 силикагелевых пластинок (аналтак CF 254, 20 X 20 см, толщина 500 мкм). Пластинки про вл ют гексаном с 10% изопропанола. Полосу, содержащую С-076 А1, удал ют с пластинок, экс- трагируют эфиром и снова нанос т на 6 пластинок и 5 раз про вл ют гексаном , содержащим 5% изопропанола. С-076 А1 удал ют с пластинок, снова хроматографируют, про вл ют чистым эфиром и получают 270 мг почти чистого С-076 А1. ИК- и ЯМ -спектры этого образца приведены в табл.2. Фракцию С-076 А2 хроматограФируют на 10 силикагелевых пластинках (аналтак HF 254), про вл ют 5 раз гексаном, содержащим 15% изопропанола и получают 265 мг почти чистого С-076 А2, ИК- и ЯМР-спектры образца этого вещества приведены в табл.2. , Фракцию С-076 В1 хроматограЛируют на 2 силикагелевых пластинках (как казано вьлие) гексаном, содержащим 15% изопропанола и получают 55 мл почти чистого С-076 В1. ЯМР-спектр того образца приведен в та«л,2. Пример 2. Ферментацию, опианную в примере 1, повтор ют дважы и обе среды объедин ют. Ферментаионную среду обрабатывают та.к,-клкписано в примере 2, получа  3,3 л ервоначального хлпроЛормпого экстр ка , который содержит 60 мг/л всех вердых веществ и по даннмм хромаографии в .тонком слоо О, Т,-со1 -л;+ени{ С-076 .

3 л этого хлороформного раствора хроматографируют на 2400 г силикагел  (Девидсон, сорт 62) в хлороформе . Колонку (.9,5x122 см) про вл ют восемью порци ми по 3800 мл хлороформа (фракции 1-3), затем восемью порци ми по 3800 мл смеси хлороформ: метанол-49:1 (фракци  9-16). Индивидуальные фракции анализируют хроматграфией в тонком слое (силикагелевые пластинки Кванта/Грамм 01Г), про вленные хлороформом: метаноломз el9:l. Каждую из фракций 9-11, 12-13 и 14 выпаривают досуха- и получают 6,63 г твердых веществ, содержащих С-076А компоненты,во фракци х 9-11 24,9 г твердых веществ,содержащих С-076В компоненты,во фракци х 2-13 и 4,7 г твердых веществ,содержащих С-07бВ-компоненты во фракции 14.

Фракции 12-14 объедин ют (29,62г) раствор ют в 100 мл хлористого метилена и хроматографируют на 400 г силкагел  (Девидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонку элюируют iSOQ мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-99:1, 1500 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-49:1, 2000 мл смеси хлористый метилен:. 2-пропанол-19:1 и 1000 мл смеси хлористый метилен: 2-пропан6л-9:1. 2,56 г вещества, выделенного из элюата объемом 5500 мл, и 5,09 г, выделенного из элюста; объемом 60006500 мл, раствор ют в 25 мл хлористого метилена и хроматографируют на 60 г силикагел  в гексане. Собирают головные фракции из 70 мл гексана и 100 мл смеси диэтиловый эфирг4:1 и затем колонку про вл ют 600 мл смеси гексан: диэтиловый ,. отбира  фракции по 20 мл и затем элюиру  700 мл эфира и отбира  фракции по 100 мл. Из элюатов объемом 400600 МП получают1,035 г твердых веществ, содержаищх В1-компоненты С-076; из объемов. 600-1000 мл получают 0,881 г твердых веществ, со- ... держащих см.эсь компонентов В1 ,В2 0-076, и из объемов 1100-1500 мл получают 0,381 г твердых веществ, содержащих В2-компоненты С-076.

Смесь компонентов В1 и В2 затем раствор ют в 4,2 мл смеси метанол: и хроматографируют на Порасиле С18 (Бонданак 37-75 мкм в том же растворителе. Из обратнофазной колонки высокого давлени  (сначала элюируютс  более пол рные компоненты ) размером 1,2 м х 16 мм элюируют . вещество со скоростью 800 мл/ч и отбирают фракции по 21,3 мл. Присутствие компонентов С-076 подтверждаетс  наб.людением УФ-поглощени  фракций. С-076 В2 весом 137 мг извлекают во фракци х 24-37 и С-076 В1 весом 195,4 г во фракци х 51-70, Затем каждый образец отдельно хроматографируют на колонках, заполненных 4 г силикагел  (Девидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонки элюируют 35 мл смеси хлористый метилен: метанол 9:1. Последние 20 мл элюата из каждой колонки собирают, выпаривают досуха и получают 155,8 мг С-076 82 и 90 мг С-076 В1.

Затем 50 мл С-076 В1 и 100 мл С-076 В2 хроматографируют на препа0 Рэтивных силикагелевых пластинках

(Аналтак HF 254) извлекают гексаном, содержащим 12% изопропанола с последующим извлечением эфиром и получают почти чистые С-076 В1 и С-076 В2. Пример 3. 50 мл среды,

наход щейс  в колбе Эрленмэйера ем костью 25 мл, состава, вес.%:

Лактоза2,0

Барда.1,5

Автолизированные0,5

0дрожжи

рН перед стерилизацией 7,0 было инокулировано содержимым замороженной ампулы Streptomvces avermiti is MA 4848 и инкубировано во 5 вращающемс  взбалтывателе при 28с в течение 24 ч при скорости вращени  150 об/мин.

. 10 мл этой ферментационной среды используют дл  инокул ции такой же 0 среды в двухлитровой колбе Эрленмейера . Ферментационна  среда инкубировалась при 24 ч при 50 об/мин во вращающемс  взбалтывателе .

Все эти среды затем примен ют дл 

инокулировани  467 л соеды в бродильном чане емкостью 756 л состава,вес,%: Лактоза2,0

Барда .1,5

Автолизированные 0,5

дрожжи

Полигликоль 2000 мл,л. 0,32 рН перед стерилизацией 7,0 Ферментационную среду инкубируют при 40 ч пропусканием воздуха 5 (9 мЭ/мин) при перемешивании со скоростью 130 об/мин.

230 л этой среды используют дл  инокулировани  наход щейс  в бродильном чане из нержавеющей стали емкостью 5760 л среды следующего состава,

вес.%:

Декстроза 4,5, Пептонизированное молоко .

f Автолизированные

дрожжи0,25

Полигликоль, мл/л 2,5 рН перед стерилизацией 7,0 Ферментацию продолжают 144 ч при 26°С путем пропускани  воздуха 60 49 и перемешивании со скоростью вращени  мешалки 120 об/мин.

Ферментационную среду отфильтровывают , фильтровальный жмых мицели.ч промывают 550 л воды и Фильтрат и $5 ;промывные воды, отбрасывают, Фильттровальный жмых взмучивают в тече ние 1 ч с 500 л ацетона и отфильтровывают . Отфильтрованный жмых про вают 150 л ацетона и 40 л воды и по лучают около 2000 л экстракта. Ферментацию и экстракцию повтор ют в тех же количествах и получают еще 2000 л ацетонового экстракта, который затем объедин ют с первым экстрактом и упаривают до 800 л с помощью концентрированной сол ной кислоты; рН концентрата устанавливают 4,7 и добавл ют 800 л хлористо го метилена. Объединенные растворители перемешивают 4 ч и слои раздел ют , К водному слою добавл ют еще 600 л хлористого метилена и перемешивают 4 ч. Слои раздел ют и каждый экстракт отдельно обрабатывают . Оба экстракта упаривают до общего объема 60 л. Пример 4. 60 л раствора из предыдущего примера упаривают досуха в вакууме дл  удалени  остат ного хлористого метилена и к остатк 3 раза добавл ют по 60 л метанола. Конечный объем метанольного концентрата 36 л. Метанольный раствор выд живают ночь и отфильтровывают. Филь ровальный жмых промывают 40 л свеже го метанола и фильтраты и промывные воды объедин ют. Затем в метанольны раствор добавл ют 95 л этиленгликол и 130 л гептана. Двухслойны раство промывают смесью 20 л этиленгликол  и 6,3 л метанола. Спуст  5 мин после перемешивани  .нижний слойот:дел ют и объедин ют с первым этиленгликоль-метаноловым экстрактом. К этому экстракту добавл ют равный объем воды (около 150 л), содержа щей 79 г соли на 1 л. Полученный раствор экстрагируют 150 л эфира и перемешивают в течение 5 мин. Эфирный слой промывают 75 л воды . (1/2 объема), перемешивают 5 мин и слои раздел ют. Этот процесс повтор ют еще 2 раза (npONHBHafl вода содержит 20 г соли на 1 л). Эфирный слой упаривают в вакууме до мини мгшьного объема при температуре менее . К остатку добавл ют 40 л хлористого метилена и раствор выпаривают досуха. Этот процесс повтор ют и конечный остаток концен трируют в вакууме досуха. Пример 5. В колонку.диамет ром 20 см загружают слой 34 кг активированного глинозема и затем слой 34 кг активированного угл  в хлористом метилене. Остаток из предыду цего примера раствор ют в хлористом метилене довод  объем до 34 л, заливают в колонку и элюируют 34 л i хлористого метилена и эти фракции отбрасывают . В колонку подают 3%-ный раствор изопропанола в хлористом метилене (20,8 л изопропанола и 660 л хлористого метилена) и элюируют, отбира  фракции-200 л. Эти лракции упаривают в вакууме на бане, нагретой до , до объема 20 л. Затем снижают температуру бани до 45°С, экстракт выпаривают в вакууме досуха. Остаток раствор ют в 10 ч хлористого метилена, 10 ч гексана и 1 ч метанола до конечного объема 15 л. Этот раствор загружают непосредственно в колонку с Сефадексом Н-20. Пример 6. В колонку диаметром 30 см загружают 36. кг Сефадекса Н-20 и промывают смесью хлористый метилен: гексан: метанолгЮ: 10:1. В колонку заливают 0,25 раствора С-076 и элюируют со скоростью 250 мл/мин. Отбирают две первые фракции по 20 л, которые отбрасывают и затем 20 фракций также по 20 л. Последнюю фракцию .также выбрасывают . Выло найдено, что фракции 1-8 содержат С-076-соединени  А- и фракции 9-10 В-соединенй . 680 г этого образца раствор ют в 2 л хлористого метилена, загружают в 22-лйтровую трехгорловуй круглодонную колбу и добавл ют 13,6 л метанола. Затем хлористый метилен отгон ют в вакууме, одновременно дббавл   13,6 л этилацетата . Скорость отгонки регулируют так, чтобы температура раствора была не ниже 65.°С. После добавлени  этилацетата раствор остывает при -16 ч. Кристаллы отфильтровывают и промывают 1 л холодного этилейгликол . Затем кристаллы снова раствор ют в 2 л хлористого метил.ена . и раствор загружают в 22-литровую трехгорловую круглодонную колбу,Эту процедуру повтор ют дважды, В -первый раз примен ют по 12,5 л метанола и этиленгликол  и во второй раз по 13,5 л. Полученные в конце кристаллы промывают I л холодного этиленгликол  и 1 л воды. Кристаллы раствор ют в 4 .л воды и высушивают фильтрованием через сульфат натри . Бензольный раствор концентрируют до 2 л, лиофилизируют и получают 341,2 г белого порошка, состо щего на 98% из С-076-В1 и 1% С-076-В2. Маточные растворы после -кристаллизации объедин ют и разбавл ют 22. л воды. Водный раствор экстрагируют 60 л толуола и снова ,15 л толуола, Толуольный экстракт затем промывают 48 л воды. Органи.ческую фазу фильтуют дл  удалени  остатков воды, упаривают и получают 336 г твердого атериала, состо щего на 79 % из -076-В2 и на 16% из 0-07 В1-соедиЧений . .Пример 7. В четьтрех колонах , заполненных Сефадексом У. К-20, ак в примере 6, получают Фракции -8 и их объедин ют. По данным, олученным с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени , было найдено, что смесь содерЛсит 252 г С-076 А2а, 16 г А2В, 94 г Ala и 24 г А1в, Полученный продукт растбор ют в смеси растворителей гексан толуол: метанол - 6:1:1 и загружают в колонку со Сефадексом Н-20 такихt ;же размеров, как в примере 2. Фракц собирают при скорости элюировани  250 мл/мин, причем первые 20 л отбр сывают. Затем элюированием получают еще две 20-литровых первичных фрак ции , которые также отбрасывают и 50 фракций по 4 л, которые содержат С:;07б А-соединени . Было найдено, что | 1ракции 3-8 содержат преимус ественно ;А1 компоненты ( г Ala и 6,7 г А1в) и фракции 29-36 С-076 А2 соеди нени  (117,2 г А2а и 7,35 г А2в). Фракции содержали смесь С-076 ,А1 и Л2 соединений. Пример 8. Образец С-076 :В1 из примера 7 весом 150 г раствор ют в 3 л смеси гексан:толуол;метанолгЗ:1:1 . Раствор пропускают через колонку с Сефадексом Х Н-20 ((таких же размеров, как в примере 6) и отбирают фракции со скоростью 250 мл/мин. Две первые 2О-литровые фракции отбирают и. отбрасывают. Отбрасывают также головную фракцию объемом 10 л Затем собирают 30 богатых фракций объемом 2 л. Фракции 1-13./И 2.5-30 отбрасывают. Фракции 14-16 объедин ют . Они сс5держат 80 г преимус естченНр С-076 Й1в. Фракции 22-24 объедин ют. Они содержат 6,7 г преимущественно С-076 Харсжтеристики м . В1в. Фракции 17-21 содержат смесь С-076 В1а и В1в Фракции 17-21 объедин ют, концентрируют и пропускают через колонку, заполненную Сефадексом ЛН-20, пользу сь тем же растворителем. Три первых фракции по 20 л отбрасывают. Затем отбирают следующие богатые фракции: 5 фракций по 2.л (фракции 1-5) 20 фракций по 1 л (фракции 6-25) и 10 фракций по 2 л (фракции 26-35) ..Фракции 1-5 отбрасывают. Фракции 16-21 содержат 13,5 г C-G76 В1в и 0,4 г С-076 В2в, фракции 22-26 содержат 44 г С-076 В1а и 0,13 В1в, фракции 27-30 содержат 10,2 г В1в и 0,8 С-076 В1в. Отделение компонентов в от компонентов а производ т с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени . 30 мкл смеси С-076 В1а и А1в В абсолютном метаноле, содержащей 30 мкл С-076 А1в загружают в колонку дл  жидкостной хроматографии высокого давлени , содержащую Сфери-Сорб 5 мкм ОД8 ( Спектра Физике) в качестве насадки. Колонку элюируют смесью метанол:вода 85:15 со скоростью 15 мл/мин. Элюирование контролируют по УФ- поглощению элюата и индивидуальные компоненты собирают на выходе из УФ-прибора. Извлекают 30 мкг С-076 и анализируют в массспектрометре . Масс-спектр этого образца приведен во второй колонке абл.3. В табл.4 и 5 приводитс  антипаразитарна  активность полученных соеинений . ектральных пмков Т а б л и ц а

Вид организма Обработку не произво70 .442- 1421 дили 1.-676, 895, )( -ООР07 9698 95 «(j « 9699 94 - л 9696 t-676, 90 0 L-676, 89700604 87 0-71 0,05 3 o,025 3 90085

59

73

0,1

Продолжение табл.3

100

«

IOC

18

72

69 1137;. 2852 -4110. .193 1761. .61 )((«-«ifjljivtf-X lf 9899999794 99 99 93 4986 j,), . 9999999895 99 999335 к X titiKf, 9999 999294 С-076 А2 i--676, 89396 99 9 -00X03-.0,1 3 0,05 3 83 88 .14 0,025 3 46 1 72 1 кл -Снижение количества образцом, вызванное

Аитипаразитарна  активность С-076 при нслыта ии на искусственно зараженном крупном рогатом скоте

Вид организма

ф -Значительное снижение эффективности по сравнению с эффективностью при овравотке други1«1 соедииеин м С-76, .

& -Наружное применение.

Таблица 5 99 , 36 87 46 46 53 О 69 11 5 23 О паразитов по сравнению с контрольным обработкой ,05,,01 0,001 соответственно .

Claims (3)

1.Способ получени  веществ, обладаю цих антипаразитарной активностью, отличающийс  тем, что штамм Streptomyces aventiitilis NRRZ 8165 (АТТС 31267) выращивают на пи-. тательной среде, содержашей ассимилируеьые источники углерода, азота

и неорганические соли в аэробных

услови х с последуюищм выделением

из среды выращивани  целевого продукта .

2.Способ- ПОП.1, отличающийс  тем, что вырагтщвание указанного штамма микроорганизма провод  при температуре 20-40°С, рН среды 6,0-7,5 в течение 1-8 дней..

3.Способ по пп.1 и 2, о т л ичающийс   тем, что выращивание указанного штамма микроорганизм провод т на среде, содержащей 0,55% источников углерода и 0,2-6,0% источников азота.

4,Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что целевой продукт выдел ют путем фильтровани  среды выращивани  с последующим экстрагированием образовавшегос  на фильтре остатка мицели  смешивающимис  с водой органическими растворител ми, выпариванием органического растворител  и экстрагированием остатка на смешивающимс  с водой органическим растворителем.