TH11955Y - กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila ก่อโรคในปลา - Google Patents

Abstract

แก้ไขบทสรุปการประดิษฐ์ 19/02/2559 การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila ในปลา ด้วยเทคนิคแลมป์เปลี่ยนสีของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลายปฏิกิริยาแลมป์ก่อนทำ ปฏิกิริยา โดยมีกรรมวิธีในการทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ที่มีความจำเพาะต่อ ลำดับเบสบนยีน aerA ของเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และ องค์ประกอบและสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการตรวจวินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียก่อโรคใน ปลาเศรษฐกิจมีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ง่ายต่อผู้ใช้ ไม่ต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน ------------------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila ในปลา ด้วยเทคนิคแลมป์เปลี่ยนสีของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลายปฏิกิริยาแลมป์ก่อนทำ ปฏิกิริยา โดยมีกรรมวิธีในการทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ที่มีความจำเพาะต่อ ลำดับเบสบนยีน aerA ของเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และ องค์ประกอบและสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการตรวจวินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียก่อโรคใน ปลาเศรษฐกิจมีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ง่ายต่อผู้ใช้ ไม่ต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน

Claims (1)

แก้ไข 19/02/2559 1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila ก่อโรคในปลา ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ 2 โมล่าร์ สารละลายกัวนิดีนไธโอไซยาเนต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัด สามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน หรือตัวอย่างเลือดที่ไม่ได้ใส่สารกันเลือดแข็ง ปริมาตร 100 ไมโครลิตร มาบดด้วยน้ำยา สกัดดีเอ็นเอ (สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.025 นอร์มอล และสารละลายโซเดียมโดเดคซิล ซัลเฟต 0.0125%) ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ สามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. นำหลอดตรวจจากข้อ ก. ไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นน้ำหลอดตรวจไปแช่ใน น้ำแข็งอีก 5 นาที จะเห็นตะกอนของเนื้อเยื้อตกลงมาที่ส่วนล่างของหลอดตรวจ ค. นำส่วนใส่ซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอมาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่เหมาะสมในการ ทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใสปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่นปริมาตร 490 ไมโครลิตร ง. นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากปลาจากข้อ ค. ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงใน สารละลายแลมป์ ที่ประกอบด้วย - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ F3 ลำดับเบส 5’ – GCCATCAAGGTCAGCAACTT-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ B3 ลำดับเบส 5’ – TCTCGCTCAGGCCATAGG-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ ลำดับเบส FIP 5’ – TTGACCAGCTGGCGATCAGCTTTTTTACAACCTGGACCCTGACAG-3’ 2 ไมโครโมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ BIP ลำดับเบส 5’ – CTGGGCGATCAACGACAGCGTTTTGTGGCAGTATCGTAACGCAG-3’ 2 ไมโครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ LF ลำดับเบส 5’-CAAACATGGTGATGTAAC-3’ 2 ไมโครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ LB ลำดับเบส 5’-GTGGGGCGTTAGGCCAATAC-3’ 2 ไมโครโมล่าร์ - บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCL 20 มิลลิโมล่าร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิโมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triton X-100 0.1 เปอร์เซนต์, pH 8.8) - สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟต 4.0 มิลลิโมล่าร์ - สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ - สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ - เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย - สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ จ. นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที ฉ. อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila สารละลายปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสีม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก) -------------------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila ก่อโรคในปลา ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ 1.1 การเตรียมสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากปลาที่ต้องการตรวจ ที่ประกอบด้วย ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจประมาณ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยา สกัดดีเอ็นเอ 2 โมล่าร์ สารละลายกัวนิดีนไธโอไซยาเนต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือ สามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. หรือตัวอย่างเลือดที่ไม่ได้ใส่สารกันเลือดแข็ง ปริมาตร 100 ไมโครลิตร มาบดด้วยน้ำยา สกัดดีเอ็นเอ ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ สามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ค. นำหลอดตรวจจากข้อ ก หรือ ข ไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นนำหลอด ตรวจไปแช่ในน้ำแข็งอีก 5 นาที จะเห็นตะกอนของเนื้อเยื่อตกลงมาที่ส่วนล่างของหลอด ตรวจ ง. นำส่วนใสซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอมาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่ เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใสปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่น ปริมาตร 490 ไมโครลิตร 1.2 นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลา ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงใน สารละลายแลมป์ ประกอบด้วย ก. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ aer-F3 ลำดับเบส 5'-GCCATCAAGGTCAGCAACTT-3' 0.2 ไมโครโมล่าร์ ข. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ aer-B3 ลำดับเบส 5'-TCTCGCTCAGGCCATAGG-3' 0.2 ไมโครโมล่าร์ ค. อินเนอร์ไพร์เมอร์ ลำดับเบส aer-FIP 5'- TTGACCAGCTGGCGATCAGACTTTTTTACAACCTGGACCCTGACAG-3' 2 ไมโครโมล่าร์ ง. อินเนอร์ไพร์เมอร์ aer-BIP ลำดับเบส 5'- CTGGGCGATCAACGACAGCGTTTTGTGGCAGTATCGTAACGCAG-3' 2 ไมโครโมล่าร์ จ. ลูปไพร์เมอร์ aer-LF ลำดับเบส 5' -CAAACATGGTGATGTAAC-3' 2 ไมโครโมล่าร์ ฉ. ลูปไพร์เมอร์ aer-LB ลำดับเบส 5'-GTGGGGCGTTAGGCCAATAC-3' 2 ไมโครโมล่าร์ ช. บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิ โมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triton X-100 0.1 เปอร์เซนต์, pH 8.8) ซ. สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟส 4.0 มิลลิโมล่าร์ ฌ. สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ ญ. สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ ฎ. เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย ฏ. สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ 1.3 นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที 1.4 อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อแบคทีเรีย Aeromonas hydrophila สารละลายปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสีม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก)