TH11956Y - กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ก่อโรคในปลา - Google Patents

Abstract

แก้ไข 19/2/59 การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย S. agatactiae ในปลา ด้วยเทคนิค แลมป์เปลี่ยนลีของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลายปฏิกิริยาแลมป์ก่อนเริ่มปฏิกิริยา โดยมีกรรมวิธีในการทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ที่มีความจำเพาะต่อลำดับเบส บนยีน superoxide dismutase (sodA) ของเชื้อแบคทีเรีย S. agcdactiae ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และ องค์ประกอบและสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการตรวจวินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียก่อโรคใน สัตว์นํ้าเศรษฐกิจมีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ง่ายต่อผู้ใช้ ไม่ต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยาก ซับซ้อน ------------------------------------------------------------------------------------------------------ คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย S. agalactiae ในปลา ด้วยเทคนิคแลมป์ เปลี่ยนสีของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลายปฏิกิริยาแลมป์ก่อนเริ่มปฏิกิริยา โดยมี กรรมวิธีในการทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ที่มีความจำเพาะต่อลำดับเบสบนยีน superoxide dismutase (sodA) ของเชื้อแบคทีเรีย S.agalactiae ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และองค์ประกอบ และสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการตรวจวินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในสัตว์น้ำเศรษฐกิจ มีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ง่ายต่อผู้ใช้ ไม่ต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน

Claims (1)

แก้ไข 19/2/59 1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ก่อในโรคปลา มีขั้นตอนดังนี้ ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ 2 โม ล่าร์ สารละลายกัวนิดีนไธโอไซยาเนต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่า น้ำยาสกัดสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน หรือตัวอย่างเลือดที่ไม่มีสารกันเลือดแข็งปริมาตร 100 ไมโครลิตร มาบดตัวน้ำยาสกัด ดีเอ็นเอ (สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.025 นอร์มอล และสารละลายโซเดียมโดเดคซิล ซัลเฟต 0.0125%) ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ สามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. นำหลอดตรวจจากข้อ ก. ไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นน้ำหลอดตรวจไปแช่ ในน้ำแข็งอีก 5 นาที จะเห็นตะกอนของเนื้อเยื้อตกลงมาที่ส่วนล่างของหลอดตรวจ ค. นำส่วนใส่ซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอมาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่เหมาะสมใน การทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใสปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่นปริมาตร 490 ไมโครลิตร ง. นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลา จากข้อ ค. ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงในสารละลายแลมป์ ประกอบด้วย - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ F3 ลำดับเบส 5’ – ATAGATGCGCTTGAGCC-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ B3 ลำดับเบส 5’ – ACCACCGTTATTGATGACTG-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ FIP ลำดับเบส 5’ – GAGCAGCATTTGCATTAGCAACATATTTTGATGATGCTGAGACAATGACAC-3’) 2.0 ไมโคร โมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ BIP ลำดับเบส 5’ – ACATCCTGAAATTGGAGAAGACTTTTTTCCTGACGAATATACTTCTGGAAT-3’) 2.0 ไม โครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ LF ลำดับเบส 5’-TGCATGGTGCTTATCATGATGT-3’ 2.0 ไมโครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ FB ลำดับเบส 5’-AGGCGCTCTTAGCTGATGT-3’ 2.0 ไมโครโมล่าร์ - บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCL 20 มิลลิโมล่าร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิโมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triton X-100 0.1 เปอร์เซ็นต์, pH 8.8) - สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟต 4.0 มิลลิโมล่าร์ - สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ - สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ - เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย - สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ จ. นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที ฉ. อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae สารละลายปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสีม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก) ------------------------------------------------------ คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae ก่อโรคในปลา ประกอบด้วย 1.1 การเตรียมสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลาที่ต้องการตรวจ ประกอบด้วย ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจประมาณ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยาสกัดดี เอ็นเอ 2 โมล่าร์ สารละลายกัวนิดีนไธโอไซยาเนต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้ จนกว่าน้ำยาสกัดสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. หรือตัวอย่างเลือดที่ไม่มีสารกันเลือดแข็งปริมาตร 100 ไมโครลิตร มาบดด้วยน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดดีเอ็นเอสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็น เนื้อเดียวกัน ค. นำหลอดตรวจจากข้อ ก หรือ ข ไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นนำหลอดตรวจ ไปแช่ในน้ำแข็งอีก 5 นาที จะเห็นตะกอนของเนื้อเยื่อตกลงมาที่ส่วนล่างของหลอดตรวจ ง. นำส่วนใสซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอมาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่เหมาะสมใน การทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใสปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่นปริมาตร 490 ไมโครลิตร 1.2 นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลา ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงใน สารละลายแลมป์ ประกอบด้วย ก. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ Sa-F3 ลำดับเบส 5'-ATATGATGCGCTTGAGCC-3' 0.2 ไมโครโมล่าร์ ข. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ Sa-B3 ลำดับเบส 5'-ACCACCGTTATTGATGACTG-3' 0.2 ไมโครโมล่าร์ ค. อินเนอร์ไพร์เมอร์ Sa-FIP ลำดับเบส 5'- GAGCAGCATTTGCATTAGCAACATATTTTGATGCTGAGACAATGACAC-3') 2.0 ไมโครโมล่าร์ ง. อินเนอร์ไพร์เมอร์ Sa-BIP ลำดับเบส 5'- ACATCCTGAAATTGGAGAAGACTTTTTTCCTGACGAATATCTTCTGGAAT-3') 2.0 ไมโครโมล่าร์ จ. ลูปไพร์เมอร์ Sa-LF ลำดับเบส 5' -TGCATGGTGCTTATCATGATGT-3' 2.0 ไมโครโมล่าร์ ฉ. ลูปไพร์เมอร์ Sa-LB ลำดับเบส 5'-AGGCGCTCTTAGCTGATGT-3' 2.0 ไมโครโมล่าร์ ช. บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิ โมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triton X-100 0.1 เปอร์เซนต์, pH 8.8) ซ. สารละลายแมกนีเชียมชัลเฟส 4.0 มิลลิโมล่าร์ ฌ. สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ ญ. สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ ฎ. เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย ฏ. สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ 1.3 นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที 1.4 อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อแบคทีเรีย Streptococcus agalactiae สารละลายปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสีม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก)