TH12841U - กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. orientalis ก่อโรคในปลา - Google Patents

Abstract

แก้ไข 19/02/2559 การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. orientali ในปลาด้วยเทคนิคแลมป์เปลี่ยนสีของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลาย ปฏิกิริยาแลมป์ก่อนเริ่มปฏิกิริยา โดยมีกรรมวิธีในการทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์ เมอร์ที่มีความจำเพาะต่อลำดับเบสบนยีน groEL ของเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. Orientali ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และองค์ประกอบและสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการ ตรวจวินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในปลาเศรษฐกิจมีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ง่ายต่อผู้ใช้ ไม่ต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน -------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. orientali ในปลา ด้วยเทคนิคแลมป์เปลี่ยนสีของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลายปฏิกิริยา แลมป์ก่อนเริ่มปฏิกิริยา โดยมีวิธีในการทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ที่มี ความจำเพาะต่อลำดับเบสบนยีน groEL ของเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. orientali ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และองค์ประกอบและสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการตรวจวินิจฉัย เชื้อแบคทีเรียก่อโรคในปลาเศรษฐกิจมีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ง่ายต่อผู้ใช้ ไม่ต้องใช้ เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน

Claims (2)

แก้ไข 19/2/59 1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. orientalis ก่อในโรคปลา ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ 2 โมล่าร์ สารละลายกัวนิดีนไธโอไซยาเนต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้ จนกว่าน้ำยาสกัดสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน หรือเลือดปลาที่ต้องการตรวจที่ไม่มีสารกันเลือดแข็งปริมาตร 100 ไมโครลิตร บดด้วย น้ำยาสกัดดีเอ็นเอ (สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.025 นอร์มอล และสารละลายโซเดียม โดเดคซิลซัลเฟต 0.0125%) ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยา สกัดดีเอ็นเอสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. นำหลอดตรวจจากข้อ ก. ที่ใส่ตัวอย่างที่บดละเอียดแล้วไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นน้ำหลอดตรวจดังกล่าวไปแช่ในน้ำแข็งอีก 5 นาที ค. นำส่วนใส่ซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอ มาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่ เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใสปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่น ปริมาตร 490 ไมโครลิตร ง. นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลา จากข้อ ค. ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงในสารละลายแลมป์ ประกอบด้วย - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ F3 ลำดับเบส 5’ – TGTTTCTAAGTCAGGTAAAGC-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ B3 ลำดับเบส 5’ – CCTAGATCTTCAGAGATAACTGT-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ FIP ลำดับเบส 5’ – CCTTCACTACACCACGCATATTATTTTTTTGATCATCGCTGAAGATGT-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ BIP ลำดับเบส 5’ – TATGTGCAGTCAAAGCTCCTGGTTTTACGACCTGTTAAGATCGC-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ LF ลำดับเบส 5’-AGAGTGAAGCTTTAGCTAC-3’ 2.0 ไมโครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ FB ลำดับเบส (5’-CGATACGATCTTCTATAG-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ - บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCL 20 มิลลิโมล่าร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิโมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triton X-100 0.1 เปอร์เซ็นต์, pH 8.8) - สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟต 4.0 มิลลิโมล่าร์ - สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ - สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ - เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย - สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ จ. นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาที ฉ. อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. Orientalis สารละลายปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสีม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก) ------------------------------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. orientalis ก่อโรคในปลา ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ 1.1 การเตรียมสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลาที่ต้องการตรวจ ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยาสกัด ดีเอ็นเอ 2 โมล่าร์ ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดสามารถบด ตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. หรือเลือดปลาที่ต้องการตรวจที่ไม่มีสารกันเลือดแข็งปริมาตร 100 ไมโครลิตร บดด้วย น้ำยาสกัดดีเอ็นเอ ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัด สามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ค. นำหลอดตรวจจากข้อ ก. ที่ใส่ตัวอย่างที่บดละเอียดแล้วไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นนำหลอดตรวจดังกล่าวไปแช่ในน้ำแข็งอีก 5 นาที ง. นำส่วนใสซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอ มาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่เหมาะสม ในการทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใส่ปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่นปริมาตร 490 ไมโครลิตร 1.2 นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลา จากข้อ ค. ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงใน สารละลายแลมป์ ที่ประกอบด้วย ก. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ F3 ลำดับเบส (5’-TGTTTCTAAGTCAGGTAAAGC-3’) 0.2 ไมโครโมล่าร์ ข. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ B3 ลำดับเบส (5’- CCTAGATCTTCAGAGATAACTGT-3’) 0.2 ไมโครโมล่าร์ ค. อินเนอร์ไพร์เมอร์ Fno-FIP ลำดับเบส (5’- CCTTCACTACACCACGCATATTATTTTTTTGATCATCGCTGAAGATGT-3’)

2. 0 ไมโครโมล่าร์ ง. อินเนอร์ไพร์เมอร์ Fno-BIP ลำดับเบส (5’ TATGTGCAGTCAAAGCTCCTGGTTTTAGCACCTGTTAAGATCGC-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ จ. ลูปไพร์เมอร์ LF ลำดับเบส (5’-AGAGTGAAGCTTTAGCTAC-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ ฉ. ลูปไพร์เมอร์ Fno-LB ลำดับเบส (5’-CGATACGATCTTCTATAG-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ ช. บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCl 20 มิลลิโมล่าร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิโมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triston X-100 0.1 เปอร์เซ็นต์, pH 8.8) ช. สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟส 4.0 มิลลิโมล่าร์ ฌ.สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ ญ.สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ ฎ. เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย ฏ. สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ 1.3 นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาที 1.4 อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อแบคทีเรีย Francisella noatuensis subsp. orientali สารละลายปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสีม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก) --------------------------------------------------------------