TH3619B - มิวแตนท์ของ วิบริโอ คอเลอรี ที่ไม่มีพิษ - Google Patents

Abstract

การประดิษฐ์นี้เปิดเผย ถึงเชื้อ วิบริโอ คอเลอรี (Vibrio Cholerae) สายพันธุ์ Ogawa 395 ในรูปที่มีพันธุกรรมไม่มีพิษที่เสถียร ซึ่งเกิดจากการกลายพันธุ์แบบขาดหายของยีน (deletion mutation) ทั้ง 2 ซ้ำซึ่งเป็นรหัสของ A1 เพพไทด์สายพันธุ์ดังกล่าวจึงขาดลำดับยีนที่จะถอดรหัสให้ A1 เพพไทด์ที่มีพิษ นอกจากนั้นยังกล่าวถึงพลาสมิด และกรรมวิธีในการเตรียมสายพันธุ์ดังกล่าว สายพันธุ์นี้มีประโยชน์มากในการนำมาเตรียมเป็นวัคซีนในรูป รับประทานโดยใช้ได้ทั้งในรูปของเซลที่มีชีวิต หรือไม่มีชีวิต

Claims (3)

1. Vibrio cholerae ogawa 395 ซึ่งไม่มีพิษและมีพันธุกรรมที่เสถียรที่อนุพัทธ์จาก เชื้อ V.cholerae สายพันธุ์เริ่มตันที่มียีน ctx A ซึ่งประมวลรหัสของเพพไทด์ A1 ที่เป็นพิษอย่างน้อย 2 ชุด ทั้งนี้สายพันธุ์นี้จะได้รับการกลายพันธุ์โดยการนำส่วนบางส่วนออกด้วยวิธีพันธุวิศวกรรม ซึ่งยังผลให้สูญเสียอย่างน้อยส่วนหนึ่งของยีน ctx A ที่จำเป็นก่อการถอดรหัสของเพพไทด์ A1 ที่เป็นพิษ 2. สายพันธุ์ของข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ได้รับการแสดงสมบัติเพิ่มเติมว่าสายพันธุ์นี้ขาดส่วนของยีน ctx A ของ V.cholerae สายพันธุ์เริ่มต้นที่ประมวลรหัสของกรดอะมิโนอนุมูลที่ 10-164 3. สายพันธุ์ของข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ได้รับการแสดงสมบัติเพิ่มเติมว่าสายพันธุ์นี้ขาดลำดับของยีน ctx A ของ V.cholerae สายพันธุ์เริ่มต้นอย่างน้อย 80% 4. สายพันธุ์ของข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ได้รับการแสดงสมบัติเพิ่มเติมว่าประกอบด้วยยีน ctx B ที่ประมวลรหัสของเพพไทด์หน่วยย่อย B 5. สายพันธุ์ของข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ได้รับการแสดงสมบัติเพิ่มเติมว่าสายพันธุ์นั้นๆ มีจีโนมของ V.cholerae สายพันธุ์เริ่มต้นอยู่ครบถ้วน ยกเว้นส่วนที่ขาดหายจากการกลายพันธุ์นั้นๆ 6. สายพันธุ์ของข้อถือสิทธิที่ 1 V.cholerae สายพันธุ์เริ่มต้นจะประกอบด้วย ยีน ctx B ที่ประมวลรหัสของเพพไทด์หน่วยย่อย B และการกลายพันธุ์นั้นอย่างน้อยมีการนำส่วนของยีน ctx B ที่จำเป็นต่อการถอดรหัสให้ได้หน่วยย่อย B ที่สมบูรณ์ออก 7. สายพันธุ์ของแบคทีเรียที่มีสมบัติพร้อมมูลของสายพันธุ์หมายเลขการเก็บรักษา ATCC ที่ 39346 หรือ หมายเลขการเก็บรักษา ATCC 39347 8. วิธีการสร้างสายพันธุ์ที่เสถียรของ vibrio cholerae Ogawa 39525 ซึ่งไม่สามารถถอดรหัสของเพพไทด์ A1 ที่มีพิษอันประกอบด้วย ให้ได้ซึ่งสายพันธุ์แม่ (wild type) ของ Vibrio cholerae Ogawa 395 ที่มียีน ctx A อย่างน้อย 2 ซ้ำบนโครโมโซมและสามารถที่จะอยู่เป็นกลุ่มในลำไส้ตลอดจนมีความสามารถในการกระตุ้นการเกิดภูมิคุ้มกัน การกลายพันธุ์โดยการนำส่วนบางส่วนของยีน ctx A ออกด้วยวิธีทางพันธุวิศวกรรมทำให้ลำดับของดีเอนเอที่จำเป็นสำหรับการถอดรหัสให้เพพไทด์ A1 ที่มีพิษขาดหายไป และเลี้ยง V.eholerae ที่แปรเปลี่ยนไปนี้หลายชั่วอายุเพื่อให้เกิดการส่งผ่านโดยตัวมันเองของการเกิดการกลายพันธุ์ชนิดนำส่วนบางส่วนออกเข้าไปในยีน ctx A ซ้ำที่สองบนโครโมโซม 9. วิธีการสำหรับสร้างสายพันธุ์ที่เสถียรของ Vibrio cholerae Ogawa 395 ที่ไม่สามารถถอดรหัสของเพพไทด์ A1 ที่มีพิษอันประกอบด้วย ให้ได้พลาสมิดแรกที่มีดีเอนเอของ V.cholerae อันประกอบด้วยยีน ctx A 1 ตัว ยีน ctx B 1 ตัว และเซกเมนต์ที่คลุมทั้งสองข้างของยีน ctx A และของยีน ctx B การสร้างพลาสมิดที่สองจากพลาสมิดแรก โดยที่พลาสมิดที่สองได้รับการแปรเปลี่ยนโดยนำเซกเมนต์ของยีน ctx A ที่จำเป็นต่อการถอดรหัสของเพพไทด์ A1 ที่มีพิษออก และ การรวมเซกเมนต์ของพลาสมิดที่สองซึ่งรวมถึงเซกเมนต์ ดีเอนเอส่วนคลุมเข้าไปในโครโมโซมของ V.cholerae Ogawa 395 สายพันธุ์ตั้งต้นซึ่งมียีน ctx A บนโครโมโซมอย่างน้อย 2 ซ้ำและเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถอยู่เป็นกลุ่มในลำไส้ตลอดจนสามารถกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันได้ ดังนั้นผลที่ได้จึงเป็นการแทนที่ยีน ctx A บนโครโมโซมของ V.cholerae Ogawa 395 และเลี้ยง V.eholerae ที่แปรเปลี่ยนที่หลายๆ ชั่วอายุเพื่อให้เกิดการส่งผ่านโดยตัวมันเองของการเกิดการกลายพันธุ์ชนิดนำส่วนบางส่วนออกเข้าไปในยีน ctx A ซ้ำที่สอง 1 0. วิธีตามข้อถือสิทธิที่ 9 ที่พลาสมิดที่สองมีเครื่องหมาย (marker) สำหรับใช้เพื่อติดตามขั้นตอนการเกิดรีคอมบิเนชัน 1

1. วิธีตามข้อถือสิทธิที่ 9 โดยที่เซกเมนต์ที่ขาดหายไปจากพลาสมิดที่สองประกอบด้วยอย่างน้อยส่วนหนึ่งของลำดับของยีน ctx A ที่ประมวลรหัสของกรดอะมิโนอนุมูลที่ 10 ถึง 164 1

2. วิธีตามข้อถือสิทธิที่ 9 ที่เซกเมนต์ที่ขาดหายไปจากพลาสมิดที่สองประกอบด้วยอย่างน้อย 80% ของลำดับที่ใช้สำหรับถอดรหัสเพพไทด์ A1 นั้นๆ 1

3. vibrio cholerae Ogawa 395 สายพันธุ์ที่ไม่มีพิษและมีพันธุกรรมที่เสถียร ซึ่งอนุพันธ์จากสายพันธุ์เริ่มต้นของV.cholerae Ogawa 395 ที่ประกอบด้วยยีน ctx A ยีน ctx B และยีนที่ทำให้สามารถจับเกาะเป็นหมู่ในลำไส้ของคนอย่างน้อยสองซ้ำ โดยที่สายพันธุอนุพันธ์โดยวิธีทางพันธุวิศวกรรมให้กลายพันธุ์โดยการนำส่วนบางส่วนออก จากยีน ctx A ทั้งสองซ้ำของสายพันธุ์ตั้งต้น ซึ่งยังผลให้มีการสูญเสียลำดับของยีนที่ต้องใช้สำหรับถอดรหัสของเพพไทด์ A1 ที่เป็นพิษจากแต่ละซ้ำของยีน ctx A สายพันธุ์ที่ได้นี้ประกอบด้วยยีน ctx B และยีนของสายพันธุ์ตั้งต้นที่ทำให้สามารถจับเกาะเป็นหมู่ในลำไส้ของคน