TR201809455T4 - Köpek ve i̇nsanlardaki̇ layşmanyaz tedavi̇si̇ i̇çi̇n bi̇leşi̇k - Google Patents

Abstract

Buluş, köpek ve insanlardaki layşmanyaz tedavisi için geleneksel kemoterapötik ajanlarla kombinasyon halinde kullanılan immün-terapötik maddeleri içeren bileşimlere ilişkindir. Bu immün-kemoterapötik maddeler arasında, kemoterapiyle kombinasyon halinde saponin ile desteklenen ?Fucose Mannose Ligand? (FML) olarak adlandırılan Layşmanya promastigot veya amastigot fraksiyonları bulunmaktadır. Kemoterapötik ajanlar arasında antibakteriyel antibiyotikler, antiparazitik ve/veya antifungal ve/veya antiviral ve/veya nükleotitler ya da nükleositlerin analogları bulunmaktadır.

Description

TEKNIK ALAN Bu bulus, köpek ve insanlardaki Iaysmanyaz tedavisi için geleneksel kemoterapötik ajanlarla kombinasyon halinde kullanilan immün-terapötik maddeleri içeren bilesimlere iliskindir. Bu immün-kemoterapötik maddeler arasinda, kemoterapiyle kombinasyon halinde saponin ile desteklenen “Fucose Mannose Ligand” (FML) olarak adlandirilan Laysmanya promastigot veya amastigot fraksiyonlari bulunmaktadir. Kemoterapötik ajanlar arasinda antibakteriyel antibiyotikler, antiparazitik ve/veya antifungal ve/veya antiviral ve/veya nükleotitler ya da nükleositlerin analoglari bulunmaktadir.

Bu proses ve kompozisyonlar, hem hayvanlarda hem de insanlarda Iaysmanyazin tedavi edilmesi için kullanilan formülasyonlarin hazirlanmasinda kullanilabilir.

TEKNIGIN BILINEN DURUMU Amerika kitasi ve Akdenizde, viseral insan Iaysmanyazi veya “kala-azar”, bilinen bir köpek zoonozudur. Kan emen böcekler, etiyolojik ajani, yabani canitlerden beslenerek kaparlar ve sonrasinda bu ajani, evcil köpeklere ileterek bulastirirlar.

Insanlara kum sinegi ile bulasmasi, uygun sekilde tedavi edilmezse ölümcül hale gelebilen ciddi bir hastalik olan viseral insan laysmanyazina neden olur.

Dünya çapinda her yil yaklasik 500.000 yeni insan kala-azar vakasi bildirilmektedir.

Insan hastaligina karsi koruyucu bir profilaktik asi henüz mevcut degildir. Bugüne kadarki en iyi performans, asilama tamamlandiktan sonra Laysmanya (lDR) deneysel birinci kusak asi ile saglanmistir. Simdiye kadar. kala-azar'a karsi kemoterapinin oldukça toksik oldugu ve herzaman etkili olmadigi kanitlanmistir.

Dogu ve Asya'da insan viseral laysmanyazinin (HVL) etiyolojik ajanlaridir.

Semptomlarin baslamasindan kisa bir süre sonra tedavi edilmezse ciddi ve siklikla ölümcül bir hastaliktir. Bu bölgelerde hastalik, bir köpek zoonozudur. Parazitler, köpeklerin, tilkilerin ve vahsi köpeklerin derisinde mevcuttur ve böcekler ile kum sineklerini içeren bir iletim döngüsü yoluyla insanlara aktarilmaktadir.

Zoonotik Viseral Laysmanyaz (ZVL), epidemiyolojik kontrolü seropozitif-enfekte köpeklerin katledilmesini, domestik ve peridomestik ortamlarin böcek ilaci ile tedavisini ve insan vakalarinin tedavisini sistematik olarak Içeren yeniden ortaya çikan bir köpek zoonozudur. Brezilya, insan vakalarinin %90'inin meydana geldigi dört `ülkeden biridir. Kontrol yöntemi olarak Brezilya ve Çin'de seropozitif köpekler katledilmektedir, ancak bu yöntem, Avrupa'da kabul edilmemektedir. Köpek kontrol programlari son derece zor ve maliyetlidir, ayrica etkili olmasi için sürekli gözetim ve hassas serolojik tani yöntemleri gerektirir. Ayrica, çogu seropozitif köpek asemptomatik oldugundan, vektör böcekler için asemptomatik köpeklerin enfeksiyözlügü gösterilmis olmasina ragmen, kampanya karmasiktir.

Evlerde böcek ilaci kullanimi ve insanlar ile köpeklerin viseral laysmanyaza karsi önleyici asilanmasi, hastaligin kontrol altina alinmasi ve ortadan kaldirilmasi ile hem insan hem de köpek vakalarinin azaltilmasi için saglanan en iyi araçlar olarak kabul edilmektedir Deneysel kosullar altinda birçok asi test edilmis olsa da, sadece bazilari, dogal enfeksiyon tehdidine karsi saha testlerinde etkinlik göstermis ve sadece Leishmune® asisi halihazirda Kanada viseral laysmanyaza karsi profilaktik bir asi olarak lisanslanmistir.

Bianciardi v.d. (PARASITOLOGY RESEARCH, SPRINGER VERLAG, BERLIN, muzdarip köpeklerin tek basina enrofloksasin ile tedavi edilmesinin kendiliginden etkili olmadigini göstermektedir. Ancak, metronidazol ile kombinasyon halinde enrofloksasin kullanimi, enfekte köpeklerde, özellikle de kutanöz Iezyonlari olanlarda klinik iyilesme oldugunu belirlemistir ve köpek laysmanyazinin terapötik bir protokolü için önerilebilir.

Guadalupe Mirö ve es yazarlar (TRENDS IN PARASITOLOGY, ELSEVIER yilina kadar köpek viseral Iaysmanyaza karsi tedavi tekniklerinin durumunu inceleyip immunojenesitede FML-saponin Leishmune® asisinin (da Silva v.d., 2001, Borja Cabrera v.d., 2002) ve köpek viseral Iaysmanyazin immünoterapisinde (Borja Cabrera v.d., 2004; Santos v.d., 2007) potansiyelinin Önemli bir incelemesini köpeklerde, böceklerce sindirildiginde, böcegin orta midesine sindirilen parazitin yapismasini engelleyen anti-FML antikorlarinin üretimini indüke etme yeteneginden bahsetmektedir. Ardindan, böcek enfekte olmaz ve hastaligi köpeklere veya insanlara aktarmaz. asinin kullanildigi fare ve sigirlar Üzerinde yapilan deneyler göstermektedir. Knapp, hayvanlarin asilamasini ve asilama sonrasinda enfekte edilmelerini ögretir.

Knapp'in asisi, 0( ve [3 tubulin ile MAP15 ve MAP52 tanimli proteinlerden olusur. köpek kemoterapisinde enrofloksasin'in yararli kullanimini açiklar.

BULUSUN TANIMI Bu proses ve kompozisyonlar, hem hayvanlarda hem de insanlarda Iaysmanyazin tedavi edilmesi için kullanilan formülasyonlarin hazirlanmasinda kullanilabilir. Çizimler Sekil 1, laboratuvar ögretimi ve ticari Leishmune® ile zenginlestirilmis asilarin, CVL'ye karsi immünoterapi veya immünokemoterapide kullanildiginda lenf dügümlerindeki ve lDR'deki Laysmanya antiseni ile semptomatik vaka (semptom), obit, parazit (par) ve PCR kanitlarinin oranlari üzerine karsilastirmali bir analizidir.

Yatay eksen üzerindeki degisken isimlerinden sonraki 3 ve 8 rakamlari asilamadan sonraki aylari göstermektedir. Immünoterapi tedavi grubu, ticari asi verilen 15 köpegi ve laboratuarda yapilan asi verilen 16 köpekten olusurken, immünokemoterapi tedavisi, ticari asi ile tedavi edilen 21 köpege ve laboratuvar yapimi zenginlestirilmis Leishmune® asisi ile tedavi edilen 14 köpege uygulandi.

Laboratuar yapimi veya ticari formülasyonlar arasinda, IT ya da ICT tedavisinde degiskenin pozitif sonuçlari oraninda anlamli bir fark bulunmamistir. Oranlarin karsilastirmasi, Fisher kesin testi (Graphpad Yazilimi) kullanilarak yapildi.

Sekil 2, ek kemoterapi ile veya kemoterapi olmaksizin saponin ile zenginlestirilmis Leishmune® asisi ile tedavi edildikten sonra, CVL'li köpeklerde klinik, parazitolojik ve Immünolojik bir belirtidir. Dogal olarak edinilmis CVL'si olan otuz bir köpek, sadece (IT) üç doz saponin ile zenginlestirilmis Leishmune® (lT) aldi, 35'i asi ve ek kemoterapi (ICT) ile tedavi edildi ve 25 tanesi tedavi edilmeyen kontroller olarak kaldi. CVL karakteristik belirtileri, ilk asilama dozlarindan 0, 3 ve 8 ay sonra degerlendirildi. Obitlerin orani, lenf nodlarinda PCR ile amplifiye edilen Leishmania amastigotlari veya Leishmania DNA'sinin pozitif bulgulari ile lDR'nin laysmanya promastigot antijenine pozitif yanitlarinin orani da 3 ve 8. aylarda kaydedilmistir. Çubuklar, her bir tedavi grubunda pozitif sonuçlarin oranini temsil eder. Oranlarin karsilastirmasi, Fisher kesin testi (Graphpad Yazilimi) kullanilarak yapildi.

Sekil 3, salin veya FML-saponin asisi ile tedavi edilen ve Leishmania (L.) amazonensisin enfektif promastigotlari ile zorlanan, BALB/c farelerinin (n = 7/grup) enfekte olmus pençelerinin büyüklügünün gelistirilmesidir.

Sekil 4, FML-saponin ile asilanmis farelerin pençelerindeki parazit yükünün miktarini göstermektedir; sol, parazitlerin degerlendirildigi maksimum konsantrasyonun log 10 (konsantrasyon); saga, konsantrasyona esdeger seyreltme içinde lot promastigot sayisidir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLANMASI Leishmune® asisi, 0,5 mg saponin içinde formüle edilen Leishmania donovani'den FML (Fucose Mannose Ligand) antijeninden olusur. L. donovani promastigotlarindan FML antijeninin izolasyonu (CB Palatnik v.d., Infection and formülasyonu, P11100173-9 sayili Brezilya patentinde anlatilmistir.

Rio Grande do Norte'de yapilan denemelerde FML antijeni ve saponin ile olusturulmus asi, köpeklerin %92-95'ini koruyarak %76-80 oraninda verim Gerais'de asilanmis köpeklerin %99'unu korumustur, bu arada tedavi edilmeyen 4997). Iki yillik bir saha denemesinde, asilanmis köpeklerin %12 kadari semptom gösterirken, kontrol grubundaki enfekte köpeklerin %20,6'si semptomatikti. Son olarak, asilananlar arasindaki ölümlerin %1'inin nedeni viseral Iaysmanyaz iken, deneme sirasinda kontrol hayvanlarinin %39'u CVL'den öldü. Asilanmis ve kontroller arasindaki tüm farklar anlamliydi. Bu sonuçlar, Leishmune® ile asilanmis hayvanlarda %99 koruma oldugunu göstermektedir.

Leishmune® ile asilanmis köpekler, deri parazitlerini gösterdi, kan ve lenf dügümleri ile cildin immünohistokimyasi üzerinde pozitif PCR testlerinin bulunmadigini gösterip vektör böceklerin enfeksiyonunun azalmasina neden olmustur (Nogueira antikorlar, emilen kanda bulunan potansiyel parazitlerin, böcegin bagirsak zari ile etkilesime girmesini ve böylelikle döngüsünün normal gelisimini ve yeni insan veya köpeklerin gelecekteki enfeksiyonunu önleyerek hastaligin yayilmasini engeller bulunmustur. Bu nedenle, enfekte köpeklerden (anti-FML antikorlari IgG1 baskin olan) serumla beslenen kum sineklerinde, enfeksiyonda (%230,7) belirgin bir artis görülürken, Leishmune® (IgG2 antikorlari baskin anti-FML) ile asilanmis köpeklerden serumla beslenen böceklerde enfeksiyonda, %743 azalma görüldü.

Bu sonuçlar Leishmune®'nin bir Transmisyon-Engelleyici Asi (TBV) oldugunu ve asilamadan 12 ay sonra bile asilanmis köpeklerden alinan antikorlarin, hastaligin yayilmasini durdurmaya yardimci oldugunu göstermektedir.

Brezilya'daki mevcut asi kapsami hala düsük olmasina ragmen, asilamanin yapilmadigi bölgelerde vakalarda bir artis tespit edilirken asilamalarin gerçeklestigi yerlerde insan ve köpek vakalarinin sayisinda belirgin bir düsüs görülmüstür Leishmune® ile köpek asilamanin olasi katki maddesi etkisi, enfekte köpeklerin salginin azaltilmasinda bir araya getirilmesiyle birlestirildi. Belo Horizonte'de (BH), Barreiro, Venda Nova ve Noroeste bölgelernde köpek ve insan insidansinin yükselen egrileri fark edilirken, Centro Sul, Leste, Nordeste, Norte, Pampulha ve Oeste bölgelerinde Insan ve köpeklerin insidansi düsüs gösterdi ya da Leishmune® ile asilamadan sonra stabil kaldi.

Tablo 1'de gösterildigi gibi, insan insidansinin (-%36,5) yüzdesinde bir düsüs gösteren bölgeler arasinda, Centro Sul ve Pampulha en yüksek köpek asilama oranlarini göstermistir (sirasiyla %632? ve %272?) ve en düsük köpek vakalari köpeklerin insidansinda %12,86 artis görülen Oeste ve asilarin daha düsük oranlarinin oldugu (sirasiyla %11,72 ve %10,76) ve muhtemelen bu nedenle biraz daha yüksek köpek insidansi (%42,77 ve %35,73) yasanan Leste ve Noroeste takip etmistir. Tek istisna, insan ve köpek insidansinin düsmesinin Leishmune® ile asilama ile iliskili olmadigi Norte bölgesinde bulunmustur (Palatnik de Sousa CB daha az sayida köpek asisi yapilmis, buna göre köpek insidansinda (sirasiyla görülmüstürn. köpek (p :-0,008) ve insan (p = -0,048) insidanslarindaki düsüs, dogrudan asilanan köpeklerin sayisinin artisi ile ilgilidir, bu bulgu, Leishmune® ile asilamanin, köpek itlafina kari ek kontrol etkisini onaylar, parazit rezervini azaltir, köpekleri korur ve bu sayede, VL'nin insanlara bulasma riskini azaltip VL kontrolünde yeni, etkili bir araç haline gelir. Leishmune® ile asilamanin serolojik kontrol kampanyasina müdahale etmedigi de gösterilmistir (110,000 köpek).

Leishmune® ile asilanan köpekler arasinda sadece %13 (5860 arasinda 76) pozitif Tablo 1. Viseral laysmanyaz köpek ve insan insidansinin dagilimi ve 2004-2006 döneminde Belo Horizonte'de Leishmune® ile asilanan köpeklerin sayisi. . . köpek ., .. .. . .. .. . o - A insan Bölgeler Yil Toplam köpek FM” insidansi .^ @pek Kg'mu'a'” Kumu'atlf /° '”sa” vakalari kopekler (%) insidansi L asilari asilanmis kopekler vakalari (%) . . köpek .. .. .. . .. .. . o - A insan Bölgeler Yil Toplam kopek Fozitif insidansi .A kopek Kgmmat'f Kumulatil' /° Insan vakalari kopekler (%) insidansi L asilari asilanmis kopekler vakalari (%) Tablo 1 Açiklamalari köpek insidansi (%): toplam köpekler arasinda seropozitif köpeklerin yüzdesi; A köpek insidansi: 2006 yilinda 2004 yilina göre köpek insidansinin yüzde cinsinden degisimi; kümülatif L® asilari = tarn asilama alan kümülatif Leishmune® asilanmis köpek sayisi (sonraki yilda 3 doz ve sonraki yillarda bir yillik güçlendirici) veteriner hekimlere dagitilmis; Asilanmis köpeklerin kümülatif yüzdesi: 2006 yilinda asilanmis köpek sayisinin 2004 yilina göre yüzde cinsinden degisimi; A Enfekte köpeklerin katledildigi ve asinin profilaktik oldugu ve hastaligin bulasmasini engelledigi göz önüne alindiginda, saponin adjuvan konsantrasyonundaki artis, asiyi köpeklerin katledilmesine alternatif sunan terapötik bir bilesime dönüstürmektedir. Gerçekten de, çift konsantrasyonlu bir saponin (1 mg /doz) ile formüle edilen Leishmune® asisinin, hem deneysel köpek viseral laysmanyazina karsi terapötik etkiye sahip oldugu bulunmustur. Saponin ile zenginlestirilmis Leishmune® asisi ile immünoterapi, koruyucu yanit ile korele olan IgG2 antikorlarinin seviyelerini CD8+ Ienfosit gamma interferon üreticilerinin seviyelerini arttirdi, %79 ila 95 pozitif IDR yaniti verdi ve 5 yila (simdiye kadar) kadar tedavi edilen, semptom göstermeyen deneyin 22. Ayinda parazitlerden arinmis olan köpeklerin hayatta kalmasiyla sonuçlandi. Ayni tarihte, CVL nedeniyle gerçeklesen ölümlerin %37'si (17/46 köpek) tedavi edilmeyen kontrol grubunda kaydedilmistir Leishmune® ile immL'inoterapi, kemoterapi tedavisinin Brezilya'da oldugu gibi tavsiye edilmedigi veya yasak oldugu yerlerde köpeklerin tedavisinde bir yarari temsil etmektedir. Burada kaygi, mevcut birkaç insan ilacinin kullaniminin dirençli parazitleri seçebilecegi yönündedir. Ayrica CVL'ye karsi köpek kemoterapisinden sonra tartismali etkinlik sonuçlari bulunmustur. Aslinda, geçici bir semptom remisyonu olusturmasina ragmen, nüks genellikle tedavinin tamamlanmasindan haftalar veya aylar sonra gerçeklesir. Insanlarda VL, genellikle Meglumin antimoniat (Glucantime®) allopurinol, Ampho-tericin B veya Glucantime ile allopurinol kombinasyonu ile tedavi edilir.

Bu bulus, sasirtici bir sekilde, saponin zenginlestirilmis Leishmune® asisi ile immünoterapi ile kombine kemoterapinin, sadece hayatta kalmalarindaki artisla degil, ayni zamanda parazit ve içlerindeki parazit DNA'sinin olmamasiyla köpek viseral laysmanyazli köpeklerde hastaligin eradikasyonunu sagladigini ortaya çikarmistir.

Ancak, bir örnek olarak, asagidaki kemoterapi ajanlari (bunlarla sinirli olmamak üzere), mevcut açiklamanin bilesimleri ile yöntemlerinde bir asi ile kombinasyon halinde etkili bir sekilde kullanilabilir: inosin analoglari, formisin ve nükleositlerin analoglari; antibakteriyel antibiyotikler: aminoglikozitler, amfizoller, ansamisinler, penisilin ve sefaleksin Iinkokamidleri, makrolidler, polipeptidler, tetrasiklinler, sikloserin, mupirosin, tüberenler, diaminopirimidinler, nitrofuranlar, kinolonlar, sülfonamitler, sülfonlar, enrofloksasin, paromomisin ve diger aminoglikozitler gibi beta-laktamlar, antiparaziter ilaçlar: allopurinol, pentavalent antimoniallar (N-Metil- meglumin, Na stibogluconate), amfoterisin B, Iipozomal amfoterisin B, aminosidin, pentamidin, alkilfosfokolinler, metronidazol, buparvaquone, sitamaquine veya 8 aminoquinolin ve temporinler, anti-fungal ilaçlar: ketokonazol, flukonazol, itrakonazol, terbin-afin ve digerleri arasinda miltefosin ve stimaquine gibi anti- kanser ilaçlari.

Bu bulusta hem Kompozisyon hem de kit içindeki tercihen saponin zenginlestirilmistir. Bulus, asagidaki örnek deneyden daha iyi anlasilacaktir: Bu deneyde Brezilya Sâo Paulo eyaletinden köpek viseral Iaysmanyazi olan toplam 104 köpek degerlendirildi. Bütün sehirlerde son salgin köpek ve insan VL ataklari görüldü. Bütün hayvanlar, FML-ELlSA denemesinde Leishmania (L.) donovani'nin FML antijenine seropozitif ve deney baslangicinda asemptomatikti. Bütün köpekler, iki Veteriner Klinigi tarafindan düzenli olarak izlendi.

Arastirmaya herhangi bir müdahaleden kaçinmak ve enfekte köpeklerin anti-FML serum antikorlarindaki artisin, semptomlarin sayisindaki artis ile pozitif Laysmanya DNA-PCR sonuçlarina, köpeklerin dagilimina bagli oldugunu bilmek için tedavi edilen grupta, FML-ELISA deneylerinde serum absorbans degerlerine göre bir tabakali randomizasyon izlenmistir. Bu deneyde, lT ve lCT ile tedavi edilen gruplar benzer cins kompozisyonu göstermislerdir (Tablo # 2) ve bu nedenle her bir grubun, CVL'ye daha fazla duyarlilik gösteren köpek irklarinin oranlarinda anlamli bir farklilik göstermemistir. Hayvanlarin arka tarafinda, 20 ila 30 günlük bir aralikla, subkutan yoldan üç doz asi enjekte edildi.

Tablo 2. BT ve BIT gruplarinin randomize edilmesinden sonra cins kompozisyonu.

Immünoterapi Köpeklerin sayisi immün Kemoterapi Köpeklerin sayisi Alman Kurdu* 1 Alman Kurdu 1 Doberman* 1 Doberman* 1 Avusturya Kurdu 2 Rottweiler * 4 Pit Bull 2 Poodle 4 Poodle 2 Labrador 2 Labrador 4 Pit Bull 1 Immünoterapi Köpeklerin sayisi immün Kemoterapi Köpeklerin sayisi Pinscher 1 Pinscher 2 Lhasa Apso 1 Daschund 4 Basset hound 1 Doqo 1 Toplam 31 35 * ile gösterilen cinsler, klinik, parazitolojik veya genetik kriterlere göre CVL'ye duyarli olarak görülmektedir.

Baslangiçta, saponin ile zenginlestirilmis Leishmune® asisi (1 mg) ile tedavi edilen köpekler, laboratuvarda gelistirilen ayni asi ile tedavi edilen köpeklerle karsilastirilmis, semptomatik köpeklerin veya köpeklerin lenf dügümlerindeki pozitif büyük bir fark olmadigi ortaya çikmis ve ticari Leishmune® formülasyonunun, laboratuvar formülasyonuyla ayni immünoterapötik özelliklere sahip oldugunu gösterilmistir (Sekil 1).

Yukaridaki sonuçlara bakildiginda, ticari Leishmune® asisi veya laboratuvar asisi ile asilanmis köpekler birlikte degerlendirildi. Ardindan, Leishmune® asisinin (n = 31) immünoterapi etkisi (lT), allopurinol (23 köpekte 15 ay boyunca 12 saatte bir -20mg/kg, tercihen 10 mg/kg) ya da CVL'ye karsi tedavide amfoterisin B ile kombinasyon halinde allopurinol (9 köpekte 16 doz, her 'üç günde bir 0,5 mg/kg) ve ikincil enfeksiyonlara karsi enrofloksasin (1 köpekte 10 gün boyunca günde bir kez 5mg/kg) ya da sefaleksin (1 köpekte 7 gün boyunca her 12 saatte bir 30 mg/kg) ile birlikte saponin ile zenginlestirilmis Leishmune® asi kullanilarak immünoterapötik etki (ICT) (n = 35) ile karsilastirildi.

Semptomatik köpeklerin oranlarinda, tedavi edilmeyen kontroller, IT ya da ICT ile tedavi edilen köpekler arasinda tedaviden önce (ay 0) (Resim 2) gruplarin homojenligini dogrulayan anlamli bir fark bulunmadi.

Asilamadan sonraki üçüncü ayda (Sekil 2), benzer etkililik ve çogu degiskende iki tedavi arasinda önemli farkliliklar bulunmamistir. Tedavi edilmeyen kontroller ile karsilastirildiginda, hem lT hem de ICT tedavileri, pozitif IDR yanit oranini arttirmis oldugu kanitli vakalarin oranini (%54'ten %12-15'e kadar) ve CVL'ye bagli ölüm orani (%48'den %19-12'ye kadar) azaltmis, bu da köpeklerin çogunun asemptomatik hale gelmesiyle sonuçlanan klinik ve parazitolojik hastaligin kontrolünün ortaya çikarmistir. Ancak, 3 ay öncesine kadar, IT veya ICT tedavileri, lenf dügümlerindeki Iaysmanya DNA'sinin kanitlarini ve hatta tedavi edilmeyen pozitifliginde önemli bir artis saglamayi basaramadi. ICT grubundaki köpeklerde (%85) önemli Laysmanya latent infeksiyon durumlari görüldü (Sekil 2). Sonuç, asilamadan hemen sonra her iki tedavinin - IT ve ICT- Laysmanya enfeksiyonuna karsi koruyucu hücresel immün tepkisini artirip korudugunu, hastaligin yayilmasini önleyerek, ölüm oranini azalttigini ve köpekleri asemptomatik hale getirdigini göstermektedir. Ancak, Laysmanya ile Iatent enfeksiyon, moleküler tani araçlari tarafindan tespit edilen kalinti Leishmania DNAsi olmasi ile ortaya çikar. Bu nedenle, hücresel immün tepkisinin geri kazanimi, u degiskende kemoterapi tedavisinin önemli bir ek katkisi gözlenmediginden Leishmune® ile yapilan lT tedavisine baglidir.

Leishmune® asisinin IT ve lCT ile zenginlestirilen potansiyel terapötik etkileri, üçüncü aydan itibaren belirgin hale geldiginden ve tedavi edilmeyen kontrollerde semptomlar ile ölümler anlamli olarak arttigindan, etik nedenlerden ötürü, bu denemede veteriner hekimler, kontrol köpeklerini CVL'ye karsi kemoterapi ile tedavi etmeye karar verdiler ve bu köpekler tedavi sonrasinda çalismadan çikarildi.

Sekil 2, ayni zamanda, asilamanin tamamlanmasindan sonra ay 8'de elde edilen sonuçlari sunmaktadir. Hem IT hem de ICT gruplarindaki köpekler, 3. ayda tedavi edilmeyen kontrollerin sadece %8 olan ve 8. ayda hayvanlarin %100'ünde tespit edilen IDR'nin pozitif sonuç oranlarinda daha fazla artis gösterdi. Bu sonuçlar, 3. ayda kaydedilen Skorlar üzerindeki anlamli artisin %33 ila 24'ünü temsil etmektedir, bu da tüm enfekte köpeklerin, asilamadan sonra Laysmanyaya karsi aktif hücresel immün yanitini geri kazandigini göstermektedir. Semptomatik vakalarda, ölümlerde veya parazit kanitlarinda belirgin bir degisiklik görülmemistir, bu da her iki tedavinin de 3. aya kadar asemptomatik bir duruma neden oldugunu göstermektedir. 8'inci aydaki iki tedavi arasinda fark edilen tek önemli fark, sadece lCT grubunda gözlemlenen pozitif PCR sonuçlari (%85 ila %20; p = 0.0001) gösteren köpeklerin oranlarinda keskin bir düsüs iken, lT grubu degismeden kalmistir (%58 ila 67, p = 0,7288), bu da saponin ile zenginlestirilmis Leishmune ile asilamaya eklenen kemoterapi tedavisinin Iatent enfeksiyonu ortadan kaldirip dolayisiyla köpekleri iyilestirdigini düsündürmektedir. lCT grubundaki (%20) ve lT grubundaki (%67) 8. aydaki (p = 0,0253) (Sekil # 2) PCR pozitifligi arasinda anlamli fark, iyilesme oranindaki artisin %70'inin, lCT tedavisi ile elde edildigini göstermektedir.

Denemelerin baslangicindan 4.5 yil sonra elde edilen bilgiler, BT veya ICT grubunun sagkalim oranlarinda anlamli bir farklilik göstermemistir; IT grubundaki köpeklerin sadece %13'ü ( 8 ila 4,5. yillar arasinda CVL nedeniyle ölmüstür (Sekil # 2). Denemenin 4,5 yili içerisinde CVL kaynakli kümülatif ölüm orani, IT grubu Için %32 (10/31) ve lCT grubu için %20 (7/35) olmustur (p = 0.2780). Bu anlamli olmayan fark, iki tedavi arasindaki benzer bir iyilesme oranini göstermektedir. Ancak, sasirtici bir sekilde, 3. aydaki tedavi edilmeyen kontrol grubuyla karsilastirildiginda (12/25 köpek, %48), sadece lCT azalma yasanirken, ayni durum lT tedavisi ardindan gözlemlenmedi (%32, p = 0,278) (Sekil 2). Lenf nodlarinin PCR sonuçlari ile birlikte ele alindiginda, sonuçlar CVL'nin kontrolü ve tedavisi için lCT tedavisinin avantajli oldugunu göstermektedir.

Köpek sahipleri ve veteriner hekimler için, kemoterapinin basarisi, klinik isaretlerin remisyonu anlamina gelir, ancak endemik bölgelerde bu, vektörlerin hala mevcut oldugu ve bu köpeklerin hala bulasici olma ihtimalinin ve hastaligin insanlara bulasma olasiligi oldugundan kabul edilemez. Parazitologlar için, bir tedavi parazitlerden kurtulma anlamina gelirken, halk sagligi kuruluslari, epidemiyologlar ve entomologlar Için, kanla besleyen kum sinekleri için enfektivite eksikligi ve dirençli suslarin bulasmasi-blokaji yeterlidir. Ancak, klinik ve parazitolojik tedavi, hayvani "iyilestirilmis" olarak degerlendirmek için yetersizdir, çünkü steril bir tedavi, hayvanda parazit veya Laysmanya DNA'si olduguna dair bir kanit olmadigi ve bunun artik hastaligi aktaramayacagi anlamina gelir.

Zenginlestirilmis Leishmune® ile enfekte edilmis köpeklerin tedavisi, hücresel immün tepkisini arttirabilir, lenf dügümlerindeki parazitlerin varligi ve ölümler dahil olmak üzere semptomlari azaltir. Yani, IT'nin zenginlestirilmis Leishmune® ile tedavisi, hastaligi kontrol edebilir, remisyonu indükleyebilir ve hayvanlarin hizli klinik ve parazitolojik tedavisini saglayabilir. ICT tedavisinde, kemoterapinin daha fazla kullanimi, asilamanin baslangicindan 8 ay sonra, yüksek hassasiyetli moleküler tani yöntemlerinde gösterildigi gibi, lenf dügümlerinden Laysmanya DNA'sinin temizlenmesi dahil hayvanlarin iyilesmesini saglayabilir, bu da köpeklerin bulasici olmamasini saglar. Gerçekten de, bu hayvanlarin endemik bölgelerde insanlara hastalik bulasma riski olmaz. Denemenin baslangicindan 4,5 yil sonra ICT ile tedavi edilen grupta daha düsük kümülatif bir ölüm indeksinin bulunmasi, bu tedavinin üstünlügünü göstermektedir. 31 ila 35 köpek içeren gruplarda arastirilan bu bulusun sonuçlari, sadece 5-17 köpek kullanan diger literatür çalismalari ile karsilastirildiginda daha anlamlidir.

Sadece pentavalan antimon, allopurinol, amfoterisin B, lipozomal amfoterisin B, aminosidin, pentamidin veya metronidazol, ketokonazol ve flukonazol gibi antimikrobiyal ve antifungal ilaç bilesimlerinin kemoterapi ile kullanimi, bazi klinik gelismelere neden olur, ancak parazitolojik tedavi nadiren bulunur ve DNA kalintisi genellikle devam eder.

Aslinda, antimoniat ile tedaviden sonra, tedavi edilen 15 köpegin %79'undan parazitler elde edilmis ve 5/6 köpek PCR pozitif bulunmustur. Allopurinol ile tedavi edilen köpeklerin 9/10'unda bile klinik iyilesme görüldü, ancak bunlardan 8 tanesinde parazit kültürüne parazit veya lenf dügümünden çikarilmis PCR pozitifti.

Ayrica, meglumin ve allopurinol ile tedavi edilen 6 köpekten 5'i, parazitolojik yönü pozitif, 2'si flebotomi için bulasiciydi. Lipozomal amfoterisin B ile tedavi edilen on üç köpek, parazitolojik açidan pozitif kalip 12'sinde nüks tespit edilse de hizli klinik iyilesme gösterdi. Aminosidin ile tedavi edilen 12 köpegin on bir tanesi klinik olarak iyilesti, ancak 4/4 lenf dügümlerinin kültür örneklerinde parazitler gösterdi. Daha yüksek dozlarda aminosidin ile 3/12 köpekte 4 yil boyunca semptom ve parazit görülmedi ve diger 9'unda hastalik nüksetti. Pentamidin ile tedavi edilen köpekler de klinik olarak iyilesir, ancak hastaligin nüksettigi görülür.

Saponin ile zenginlestirilmis Leishmune® asisi ile immünoterapi, daha önce tek basina kemoterapi için rapor edilenlerden daha iyi sonuçlar vermistir ve Leishmune® ile immünokemoterapi, tek basina immünoterapi ile tedaviden daha Zenginlestirilmis Leishmune® ile immünoterapi, ayrilan zamani ve içsel toksisiteyi azaltmasi kosuluyla, bilinen allopurinol ile kemoterapiden daha iyidir. Allopurinol ile tedavi edilen köpekler sadece 2 aydan 6 aya kadar iyilesip, parazitolojik tedavi veya ay tedavi PCR için negatif sonuçlar olmaksizin % köpekte hastalik nüksederken parazitolojk iyilesme ve hücresel immün tepkisinin geri kazanimi ile 8. ayda %76 negatif PCR gösterir.

Glucantime® asisi için incelenmistir. Tedavi edilen hayvanlar, klinik iyilesme gösterdi, ancak 3/5 ayda nüks ve pozitif lenf dügümleri gözlemlendi. Böylece, zenginlestirilmis Leishmune® ile immünoterapi, L. infantum asisi ile immünokemoterapiye göre daha iyidir.

Son zamanlarda iki es zamanli doz kullanilarak Leishmune® (0.5mg saponin içeren) ile immünoterapinin, enfekte köpekleri asemptomatik ve immünhistokimya için 2 yil negatif tuttugu fark edilmistir.

CVL'de kemoterapinin eksiklikleri ve hastaligin epidemiyolojik kontrolü üzerindeki olumsuz etkileri dikkate alindiginda, zaten enfekte olmus köpeklerin immünoterapisinde koruyucu asinin kullanilmasi son derece cesaret vericidir ve enfekte köpeklerin katledilmesine dayanan kontrole göre toplumda daha fazla kabul görecektir. Bu bulus, kemoterapi ile birlikte saponin ile zenginlestirilmis Leishmune® asisinin Immünoterapötik tedavi köpek viseral Iaysmanyazinda kullanilip epidemik bölgelerde hastaligin etkili bir sekilde kontrolüyle sonuçlandiginda terapötik degerini göstermektedir.

Brezilya'da köpek viseral laysmanyazin önlenip tedavi edilmesinde ve buna bagli olarak Leishmania chagasi'nin yol açtigi insan viseral laysmanyazin azalmasinda gösterilen FML-saponin asisi veya Leishmune® ile tedavi ya da immünokemoterapinin yararli etkisi, dünya çapinda viseral laysmanyazin önlenmesi, tedavisi ve iyilestirilmesi için de kullanilabilir. Gerçekten de, Hindistan'da ve Afrika'nin bazi bölgelerinde insan hastaliginin altinda yatan ajani olan Leishmania (L.) donovani'den (Sudan) izole edilen FML antijeni, Ispanya'da (Avrupa) L. infantum ile ve Amerika'da (Brezilya) Leishmania chagasi ile enfekte olmus insan ve köpek serumlari tarafindan kabul edilmektedir.

Dünya çapinda, viseral Iaysmanyaz insidansi daha yaygin ancak daha az ölümcül olan ve ilerlemesini yavaslatan tegumer laysmanyazindan daha fazladir. FML- saponin asisi ya da Leishmune®, bu nedenle hem viseral hem de tegumenter laysmanyazin önlenmesi, kontrolü, immünoterapisi ya da immünokemoterapisinde bir araç olarak kullanilabilir. Dünya çapindaki yillik 2.000.000 yeni Iaysmanyaz vakasinin 1.500.000'i degisken ekspresyona sahip üç klinik sendromun bir formu olan tegumeral laysmanyazdir: kutanöz laysmanyaz (CL), mukokütanöz alt gruba ayrilir: Leishmania (L.) ve Viannia (V.); endemik bölgelerde morbidite ve mortaliteye neden olan yaklasik 30 tür vardir. Donovani kompleksi (L. (L.) donovani, L. infantum-L. (L.) chagasi)'den Leishmania, kala-azar veya viseral laysmanyaz etken ajanlari iken, Leishmania mexioana (L. (L.). mexicana, L. (L.) pifanoi, L. (L). amazonensis, L. enrietti, L. (L.) venezuelensis) ve Leishmania braziliensis kompleksleri (L. (V.) brazilensis, L. (V.) guyanensis L. (V), panamensis, L. (V), peruviana, L. (V.) Lainson, L. (V.) Shaw, L. (V.) Naiffl) kutanöz mukokutanöze neden olup ve Laysmanyazi Yeni Dünya'da diffüze ederken, L. (L.) tropica, L. (L.) majör, L (L.) aethiopica, Eski Dünya'da tegumeral Iaysmanyaz ajanlaridir.

Kutanöz laysmanyaz vakalarinin %90'indan fazlasi Afganistan, Iran, Suudi Arabistan, Suriye, Brezilya ve Peru'da görülür.

Deneyler, FML-saponin asisinin, L. (L.) mexicana ile zorlanan farelerde %65 koruma sagladigini göstermektedir. Ayrica, IL-12, saponin Quil-A, Riedel de Ha'en veya QS-21 ile birlikte 3 doz FML ile asilanmis BaIb/c farelerinin, antikorlarin ve L.

(L.) amazonensis lizatina karsi lDR'nin önemli ölçüde arttirilmis tepkilerini indükledigi gösterilmistir. Tepkiler, L. (L.) amazonensis'ten izole edilen FML analog fraksiyonu ile asilanmis farelerde üretilenlerden bile daha büyüktü ve L. (L.) donovani'nin her iki laysmanyaza karsi immün profilaktik potansiyelini dogruladi.

FML, bir Nükleosit hidrolaz (NH36) enzimi olarak klonlandiktan sonra tanimlanan GP36 glikoproteininin ana antijenik fraksiyonunu içerir. Bu enzim parazit için hayati öneme sahiptir, çünkü sentezinin kendi DNA'si için parazit tarafindan kullanilan bazlari serbest birakan ithal nükleosidleri ayirir. NH36 Nükleosit hidrolaz geni olan mexicana tarafindan murin viseral Iaysmanyaza karsi profilaktik ve immünoterapötik olmustur, bu da FML'den gelen bu ana antijenin tegumeral klonlama ile, L. (L.) amazonensis'in Nucleoside hidrolazinin, çapraz korumanin olasi moleküler temelini açiklayan L. (L.) donovani'de tanimlanan yüksek homolojiye sahip oldugunu belirledik. BaIb/c farelerinde indüklenen immün tepkisini ve korumayi, hamsterlerdeki amastigotlardan L. (L.) amazonensis'in 106 promastigotu ile enfeksiyona karsi 3 subkutan FML (150mg) + saponin (100mg) ile asilama yoluyla inceledik.

Enfeksiyondan sonra 26. haftada, gruplar arasinda, pençelerin artmis boyutunda anlamli farkliliklar bulundu (p = 0,004). FML + saponin asisi Iezyonlarin büyüklügünün gelisiminde %49'Iuk bir artisa neden olmustur (Sekil 3). Aslinda, pençelerin büyüklügündeki artis, salin ile tedavi edilen 7 hayvandan 5'inde ve FML- saponin ile tedavi edilenlerin sadece 1'inde tespit edildi (Sekil 3). Sag kalanlarin yaralanma dokularinin seyreltisini sinirlandirarak parazit yükünün analizi, FML + saponin ile asilanmis hayvanlarda önemli bir koruma oldugunu gösterdi (Sekil 4).

Aslinda, parazitlerin titerlerinde %81,8, FML-saponin ile asilanmis hayvanlarin % 77.8 oraninda parazit sayimi tespit edilmistir.

Sonuçlar, FML-saponin asisinin, bu asinin L. (L.) amazonensis ve L. (L.) mexicana tarafindan tegumeryal laysmanyaza karsi önemli çapraz korumaya neden oldugunu göstererek hem viseral hem de tegumeryal Iaysmanyazin kontrol araci olarak potansiyelini dogrulamaktadir. FML kompleksinin NH36 genini içeren, köpek viseral ve murin tegumenter ve viseral Iaysmanyaza karsi olan imm'ünoterapötik ve profilaktik etkisinin önceki tespiti, FML kompleksinin her iki hastaliga karsi korumada uygunlugunu teyit eder ve insan viseral ve tegumeral Iaysmanyaz immünokemoterapisinde potansiyel iyilesme etkisini gösterir TANIMLAMADA BELIRTILEN REFERANSLAR Basvuran tarafindan belirtilen bu referanslar listesi yalnizca okuyucu için bir kolaylik saglamasi içindir. Avrupa patent dokümaninin bir parçasini teskil etmez.

Referanslarin derlenmesinde büyük bir özen gösterilmis olmakla birlikte hatalar veya eksiklikler olabilir ve EPO bu anlamda hiçbir sorumluluk üstlenmemektedir.

Tarifnamede Atifta Bulunulan Patent Belgeleri Tarifnamede Atifta Bulunulan Patent Disi Dökümanlar BIANCIARDI et al. PARASITOLOGY RESEARCH. SPRINGER VERLAG, 01 GUADALUPE MlRO ; CO-AUTHORS. TRENDS IN PARASITOLOGY. ELSEVIER n labora

Claims (6)

ISTEMLER

1. Köpek laysmayazinin tedavisinde kullanim için bir bagisiklik kemoterapötik/farmasötik bilesim olup, burada a) bilesim, antijenini içerir; b) bilesim, 1 mg saponin adjuvani içerir ve c) bilesim, bir veya daha fazla kemoterapötik madde ile birlikte kullanilir, burada bir veya daha fazla kemoterapötik ajan, amfoterisin B ile kombinasyon halinde allopurinol veya allopurinol içerir.

2. Istem 1'in kullanimi için bilesim olup, burada bahsedilen bilesim köpek viseral

3. Istem 1'In kullanimi için bilesim olup, burada bilesim, Laysmanya promastigotlari veya amastigotlari ve bunun nükleosid hidrolaz (NH36) alt fraksiyonunun fraksiyonlarini içerir.

4. Istem 1'in kullanimi için bilesim olup, burada bahsedilen bir veya daha fazla kemoterapötik ajan, allopurinol içerir.

5. Asagidakileri içeren bir kit: 8) antijeni b) 1 mg saponin adjuvani içeren bir bilesimin hazirlanmasi için saponin adjuvani, burada adi geçen bilesim köpek ve insan Iaysmanyazinin tedavisinde kullanim içindir ve C) amfoterisin B ile kombinasyon halinde allopurinol veya allopurinol içeren kemoterapötik ajanlar olup, burada bahsedilen bilesim, bahsedilen bir veya daha fazla kemoterapötik madde ile birlikte kullanilir.

6. Bahsedilen bilesimin köpeklere uygulanmasini içeren köpek ve insan viseral a) bilesim, antijenini içerir; b) bilesim, 0,5 veya 1 mg saponin adjuvani içerir ve C) bilesim, bir veya daha fazla kemoterapötik madde ile birlikte kullanilir, burada bir veya daha fazla kemoterapötik ajan, amfoterisin B ile kombinasyon halinde allopurinol veya allopurinol içerir. Istem 6'nin kullanimi için bilesim olup, burada sözü edilen immünizasyon, köpek viseral Iaysmanyazinin immünizasyonudur. Istem 6'nin kullanimi için bilesim olup, burada bahsedilen kemoterapötik ajan, allopurinol içerir. Istem 8'in kullanimi için bilesim olup, burada allopurinol dozu, 15 ay boyunca 12 saatte bir 10-20 mg/kg, tercihen 10 mg/kg'dir. Istem 6'nin kullanimi için bilesim olup, burada amfoterisin B dozu, her üç günde bir 16 doz olan 0,5 mg/kg'dir.