BRPI0902443A2 - processo e composição farmacêutica imunoquimioterápica para tratamento de leishmanìase canina e humana - Google Patents

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Abstract

PROCESSO E COMPOSIçãO FARMACéUTICA IMUNOQUIMIOTERáPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANìASE CANINA E HUMANA compreendendo uma vacina contendo o antigeno FML (Fucose Mannose-Iigand ou Ligante de Fucose e Manose) e o adjuvante saponina, usada em combinação com quimioterápicos, mostrando propriedade curativa, deixando os cães previamente infectados, na condição de cura estéril da leishmaniose visceral e tegumentar, caracterizada por ausência de parasitas e pela ausência total de DNA de Leishmania, visando impedir a transmissão do parasita causador da Leishmaniose canina visceral do cão para o inseto transmissor e desta forma, para outros cães e humanos. A invenção compreende, também, o uso da citada composição para produzir formulações destinadas a tratar a leishmaniose visceral canina e as leishmanioses viscerais e tegumentares murinas, humanas e caninas, bem como kit compreendendo imunoquimioterápicos para tratar as mesmas patologias.

Description

"PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA"
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a uma composiçãofarmacêutica para tratamento de leishmaníase canina visceral compreendendoImunoquimioterápicos. Tais Imunoquimioterápicos contemplam frações depromastigotas ou amastigotas de Leishmania denominadas "Fucosé MannoseLigand" (FML) e adjuvante saponina, em combinação com quimioterápicos. Osquimioterápicos comportam antibióticos antibacterianos, antiparasitários e/ouantifúngicos e/ou antivirais e/ou análogos de nucleotídeos ou nucleosídeos.
Tais composições podem ser empregadas na preparaçãode formulações usadas no tratamento da citada leishmaniose.
Contexto da Invenção
A Leishmaniose visceral humana ou calazar é nasAméricas e Mediterrâneo uma conhecida zoonose canina. Insetosflebotomíneos adquirem o agente etiológico alimentando-se em canídeossilvestres transmitindo-o, posteriormente, aos cães. A subseqüentetransmissão aos humanos pelos flebótomos causa Leishmaniose humanavisceral, uma doença grave que pode ser fatal se não tratada adequadamente.
Aproximadamente 500.000 de novos casos humanos decalazar são registrados anualmente no mundo. Uma vacina profilática protetoracontra doença humana não está ainda disponível. O melhor desempenho foilogrado com uma vacina experimental de primeira geração que induziu 12% deproteção, apenas entre as pessoas que converteram para positivo no testeintradérmico para o Iisado de Leishmania (IDR) após a vacinação completa. Atéo momento a quimioterapia contra calazar tem se revelado altamente tóxica enem sempre efetiva.As Leishmartia (L.) chagasi e Leishmania (L.) infantumsão os agentes etiológicos da Leishmaniose visceral humana (LV) em America,no Mediterrâneo, Oriente Médio e Ásia. Trata-se de uma doença severa efreqüentemente letal se não tratada logo após o aparecimento de sintomas.
Nesta regiões a doença é uma zoonose de canídeos. Os parasitas estãoexpostos na pele de cães e raposas, cães selvagens, e são transmitidos aoshumanos através da picada e ciclo desenvolvidos nos insetos flebotomíneos.
A Ieishmaniose visceral zoonótica (LVZ) é uma zoonosede canídeos re-emergente. cujo controle epidemiológico envolve: a eliminaçãode cães infectados soropositivos, o tratamento dos ambientes domésticos eperi-domésticos com inseticida e o tratamento sistemático dos casos humanos.Brasil é um dos 4 países que concentram 90% dos casos humanos totais(500.000 no Mundo todo). Como ferramenta de controle, o sacrifício dos cãessoropositivos é realizado amplamente em Brasil e China, porém não é aceitona Europa. Os programas de controle canino são muito trabalhosos, caros erequerem vigilância permanente e métodos de diagnóstico sorológico maissensíveis para aumentar a sua eficácia. Além disso, como muitos cãessoropositivos são assintomáticos, a adesão da população à campanha écomplicada, apesar de que a infecciosidade dos cães assintomáticos para osinsetos vetores já foi demonstrada.
O tratamento das residências com inseticidas e avacinação preventiva de humanos e cães contra a Ieishmaniose visceral foramconsideradas as melhores ferramentas previstas para controle e erradicação dadoença, diminuindo ambos, os casos humanos e caninos. Apesarde que váriasvacinas foram testadas em experimentos em canil, somente algumasmostraram eficácia em testes de campo, contra o desafio da infecção natural esomente a vacina Leishmune® esta atualmente licenciada no Brasil, sendo aprimeira no Mundo para profilaxia contra a Ieishmaniose visceral canina.
A vacina Leishmune ® é composta pelo antígeno FML(Ligante de Fucose Manose) de Leishmania donovani formulado em 0,5mg desaponina. A formulação contendo o antígeno FML e saponina protegeu 92-95%dos cães gerando de 76-80% de eficácia vacinai em experimentos realizadosno Rio Grande do Norte. A Leishmune® já demonstrou proteger 99% dos cãesvacinados em São Paulo e Minas Gerais, enquanto que 15,6% dos controlesnão tratados estavam soropositivos. Ao longo dos dois anos um máximo de1,2%, dos cães exibiu sintomas no grupo vacinado enquanto que 20,6% doscães expostos controles eram sintomáticos. Finalmente, enquanto que apenas1 % de óbitos confirmados por calazar foram detectados entre os vacinados atéo final do segundo ano, um total de 39% dos animais controles morreram deLVC durante o ensaio. Todas as diferenças entre vacinados e controles foramsignificantes. Os resultados indicaram a obtenção de 99% de proteção nosanimais vacinados, dois anos antes, com Leishmune®. Este valor obtido após ouso da formula industrial Leishmune® se correlaciona com o previamenteobtido com a preparação da vacina FML elaborada no nosso laboratório daUFRJ.
Os cães vacinados não expõem parasitas na pele,conforme demonstrado pela ausência de positividade nos testes de PCR desangue e Iinfonodos e imunohistoquímica de pele, portanto a infecção dosinsetos vetores fica reduzida. Assim mesmo, os anticorpos gerados nos cãesvacinados bloqueiam a transmissão da doença uma vez que impedem aosparasitas potencialmente presentes no sangue sugado de interagir com amembrana intestinal do inseto, impedindo o desenvolvimento normal do seuciclo e a futura infecção de novos seres humanos ou cães. Enquanto queinsetos alimentados com sangue contendo amastigotas de Leishmania e sorode cães pré-imunes mostraram alta percentagem de infecção e de razãonúmero de parasitas/inseto, fazendo índices de infecção mais altos, insetosalimentados com soro de cães vacinados com Leishmune® (anticorpos lgG2anti-FML predominantes) mostraram 74.3% de redução da infecção.
Por outro lado, os flebótomos alimentados com soros decães infectados (anticorpos anti-FML IgGI predominantes) mostraram umaumento pronunciado da infecção (230.7%). Estes resultados indicam que aLeishmune® é uma vacina bloqueadora da Transmissão (TBV)1 e que osanticorpos presente no soro de cães vacinados, mesmo 12 meses apósvacinação, auxiliam na interrupção da epidemia.
Apesar de que a cobertura vacinai atual no Brasil ainda ébaixa, já se observa nitidamente o declínio do numero de casos humanos ecaninos nas localidades vacinadas enquanto que um aumento dos mesmos sedetecta nas regiões não submetidas à vacinação.
Em efeito, o possível efeito aditivo da vacinação caninacom Leishmune®, sobre a remoção de cães, na interrupção da epidemia foiinvestigado. Em Belo Horizonte (BH), curvas crescentes de incidência canina ehumana foram observadas nos distritos de Barreiro, Venda Nova e Noroeste,enquanto que a incidência humana e canina de Centro Sul, Leste, Nordeste,Norte, Pampulha e Oeste, começaram a decrescer ou se mantiveram estáveisapós vacinação com Leishmune®. Conforme se observa na Tabelai, entre osdistritos mostrando um declínio na percentagem de incidência humana (-36.5%), Centro Sul e Pampulha mostraram as percentagens maiores devacinação canina (63.27% e 27.27%, respectivamente) e as menoresincidências caninas (-3.36%, 1.89%, respectivamente).
Eles foram seguidos por Oeste, que vacinou 25.30% dosanimais e experimentou um aumento de apenas 12.86 % da incidência caninae por Leste e Nordeste, com menores proporções de vacinados (11.72 e10.76%, respectivamente) e provavelmente por isso, incidências caninaslevemente maiores (42.77 e 35.73%). A única exceção foi a do distrito Norteonde a redução da incidência humana e canina não foi correlacionada com avacinação com Leishmune®.
Proporções muito menores de cães foram vacinados emVenda Nova (4.35%), Noroeste (10.27%) e Barreiro (0.09%) que, de acordocom isso, exibiram incidências caninas muito aumentadas (24.48, 21.85 e328.57%, respectivamente), e pronunciados aumentos de incidência humana(14, 4 e 17%, respectivamente). O declínio da incidência canina e humanaestão correlacionados com o aumento do número de cães vacinados,confirmando o efeito aditivo da vacinação com Leishmune® sobre o controlepor sacrifico dos cães, reduzindo o reservatório de parasitas, protegendo cães,reduzindo o risco de transmissão da LV para humanos, e desta forma semostrando como uma nova ferramenta efetiva de controle da LV. Também foidemonstrado que a vacinação com Leishmune® não interfere na campanha decontrole sorológico (110.000 cães). Apenas 1,3% de positividade (76 dos5,860) foi detectada entre os cães vacinados com Leishmune® que semostraram não infectados em testes parasitológicos.<table>table see original document page 7</column></row><table>
Legenda da Tabela 1: incidência canina (%): percentual de cães soropositivos entre o total de cãesanalisados; A incidência canina: variação do percentual da incidência canina de 2006 com relação à 2004;número acumulado de cães vacinados com Leishmune® = número de cães que receberam 3 doses noprimeiro ano e um reforço anual nos anos seguintes de acordo com dados dos números de dosesdistribuídas aos veterinários; Percentagem acumulada de cães vacinados: variação percentual donúmero de cães vacinados em 2006 relativo a 2004; A casos humanos: variação percentual do número decasos humanos em 2006 com relação à 2004. IC95%= intervalo de confiança 95%.
Um total de 65000 cães sadios foram vacinados no Brasilaté Outubro de 2008.
Considerando que os cães infectados são sacrificados eque a vacina é profilática e redutora da transmissão, surgiu a idéia de queaumentando a concentração do adjuvante saponina, a vacina pudesse setornar curativa para oferecer uma futura alternativa ao sacrifício dos cães. Foiobservado que a vacina Leishmune® formulada com a concentração dupla desaponina (1 mg/dose) tinha efeito terapêutico tanto contra a Ieishmaniosevisceral canina experimental quanto contra a naturalmente adquirida em áreaendêmica. A imunoterapia com Leishmune® enriquecida de saponinaaumentou os níveis de anticorpos lgG2 correlacionados com respostaprotetora, os níveis de linfócitos CD8+ produtores de Interferon gama, e geroude 79 a 95% de respostas IDR positivas resultando na sobrevivência dos cãestratados por até 5 anos (até o presente) que se mostravam assintomáticos elivres de parasitas no mês 22 do experimento. Ate a mesma data, 37% (17/46cães) de óbitos por LVC foram registrados no grupo controle não tratado.
A imunoterapia com Leishmune® pode então representarum benefício no tratamento dos cães enquanto que o tratamento apenasquimioterápico não é recomendado, e é proibido no Brasil, devido a que é feitocom as poucas drogas eficazes para tratamento humano podendo agir naseleção de parasitas resistentes, e tendo mostrado resultados de eficáciacontroversos. Em efeito, apesar de gerar uma remissão temporária dossintomas, o relapso usualmente acontece semanas ou meses após afinalização do tratamento. A LVC é tratada freqüentemente com antimoniato deMeglumina (Glucantime®), allopurinol, Anfotericin B ou a combinação deGlucantime e alopurinol.
A presente invenção representa uma novidade uma vezque revela que a quimioterapia combinada à Imunoterapia com a vacinaLeishmune enriquecida de saponina determina a cura estéril de cãesportadores de Leishmaniose canina visceral, não somente pelo seu aumentode sobrevivência se não também pela ausência de parasitas e DNA dosparasitas nos mesmos.
Ilustrativamente, mas não limitadamente, citam-se osseguintes quimioterápicos: análogos da inosina, formicina e análogos denucleosídios; antibióticos antibacterianos: aminoglicosídeos, anfenicóis,ansamicinas, beta-lactámicos como penicilinas e cefalexinas, lincosamídeos,macrolídeos, polipeptídeos, tetraciclinas, cicloserinas, mupirocinas, tuberinas,diaminopirimidinas, nitrofuranos, quinolonas, sulfonamidas, sulfonas,enrofloxacina, paromomicina e outros aminoglicosídeos, drogasantiparasitárias: allopurinol, antimoniais pentavalentes (N-Methyl-meglumina,stibogluconato de Na), Anfotericina B1 Anfotericina B lipossomal, aminosidina,pentamidina, alquilfosocolinas, metronidazole, buparvaquone, sitamaquina ou 8aminoquinolona e temporinas, drogas anti-fúngicas: ketoconazol, fluconazol,itraconazole, terbinafina, e drogas anti-câncer como: a miltefosina eestimaquina entre outras
Na presente invenção, reitera-se, tanto na Composição,quanto na Formulação, Uso ou Kit, a saponina pode, preferencialmente, serenriquecida. A invenção será melhor compreendida a partir do seguinte ensaiode caráter meramente exemplificativo, não limitativo.
Um total de 104 cães com Leishmaniose canina visceralnatural de duas cidades do interior do Estado de São Paulo, Brasil foramobservados neste ensaio. Todas estas cidades mostraram episódios recentesde epidêmicos de VL humana e animal. Todos os animais eram soropositivosao antígeno FML de Leishmania (L.) donovani no ensaio FML-ELISA eassintomáticos no início do ensaio. Todos os cães eram acompanhadosregularmente por duas Clínicas Veterinárias Especializadas.
Para evitar qualquer interferência no ensaio e sabendoque o incremento em anticorpos séricos anti-FML de cães infectados écorrelacionado ao aumento no número de sintomas e com os resultados PCRLeishmania-DNA positivos, a distribuição dos cães no grupo tratado seguiuuma randomização estratificada relatada aos seus valores de absorbânciasérica nos ensaios FML-ELISA. Neste experimento os grupos tratados IT e ICTapresentaram composição similar de raças, no tangente à proporção dasmesmas relacionadas à suscetibilidade clínica e parasitológica (Tabela 2), nãohavendo diferenças significativas nas proporções de cães de raças de maiorsuscetibilidade. Três doses da vacina foram injetadas através da rotasubcutânea no dorso dos animais, com 20-30 dias de intervalo.Tabela 2. Composição de raças após randomização dos grupos IT e ICT.
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As raças marcadas em cinza são as consideradas suscetíveis à LVC por critérios clínicos,parasitológicos ou genéticos.
Foram inicialmente comparados cães tratados com avacina Leishmune® enriquecida de saponina (1mg) com cães tratados com avacina elaborada no laboratório da UFRJ e demonstrado que não haviadiferenças significativas entre ambas no que diz respeito à percentagem decães sintomáticos, ou com reações de IDR positivas, PCR positivos ouparasitas nos Iinfonodos e mortes por LVC indicando que a formulaçãoindustrial mantém as propriedades imunoterápicas descritas para a formulaçãolaboratorial.
Estes resultados demonstram que o processo deindustrialização não alterou as propriedades imunogênicas previamentedescritas para a vacina feita no laboratório.<figure>figure see original document page 11</figure>
Figura 1: Análise comparativa do impacto da vacina Leishmune® enriquecida com saponina(1,5mg de antígeno FML e 1mg de saponina/dose) e da mesma formulação feita no laboratório,quanto às proporções de casos sintomáticos (sint), óbitos, parasita (par) nos linfonodos,evidências de DNA por PCR em linfonodos e IDR para antígeno de Leishmania, sendo asvacinas utilizadas em imunoterapia ou imunoquimioterapia contra CVL. O grupo de tratamentode imunoterapia foi composto por 15 cães que receberam a vacina comercial e 16 cães quereceberam a vacina feita no laboratório, ao passo que o tratamento de imunoquimioterapia foidado a 21 cães tratados com a vacina comercial e 14 cães tratados com a vacina feita nolaboratório com Leishmune® enriquecida. Não houve diferenças significantes entre aformulação feita no laboratório e a comercial quanto à proporção dos resultados positivos dequalquer variável nem no tratamento IT1 nem no tratamento ICT. A comparação das proporçõesfoi feita utilizando o Teste Exato de Fisher (Graphpad Software).
A partir destes resultados os cães vacinados com a vacina comercial ou feitano laboratório forma avaliados em conjunto. Posteriormente, o efeitoImunoterápico (IT) da vacina Leishmune (n=31) foi comparado ao efeitoImunoquimioterápico (ICT) (n=35), utilizando a vacina Leishmune ®enriquecida de saponina juntamente com alopurinol (10 mg/kg cada 12 horaspor 15 meses em 23 cães) ou alopurinol em combinação com anfotericina B1cada três dias, 16 doses em 9 cães) no tratamento contra LVC1 e enrofloxacina(5 mg/kg uma vez ao dia durante 10 dias em 1 cão) ou cefalexina (30 mg/kgcada 12 horas por 7 dias em 1 cão) contra infecções secundárias.Nenhuma diferença significativa na proporção de cães sintomáticos foiencontrada entre controles não-tratados, cães tratados IT ou ICT antes dotratamento (mês 0) (Figura 2) confirmando a homogeneidade dos grupos.
<figure>figure see original document page 12</figure>
•Significativamente diferente dos controles não tratados# significativamente diferente dos resultados do mês 3 no seu próprio grupo+ significativamente diferente do tratamento IT
Legenda da Figura 2: Sinais clínicos, parasitológicos e imunológicos em cães com LVC1 após otratamento com vacina Leishmune® enriquecida com saponina com ou sem quimioterapiaadicional. Trinta e um cães com LVC naturalmente adquirida receberam três doses deLeishmune® enriquecida com saponina somente (IT)1 35 foram tratados com vacina equimioterapia adicional (ICT), ao passo que 25 permaneceram como controles não tratados. Aproporção de óbitos, achados de amastigotas ou DNA de Leishmania por PCR nos Iinfonodos ea proporção de respostas de IDR positivas para antígeno de Leishmania foram tambémregistrados nos meses 3 e 8. As barras representam a proporção de resultados positivos emcada grupo de tratamentos. AS proporções acumuladas de mortes por LVC, mortes por outrascausas e de sobrevivência 4,5 anos após o inicio do experimento estão também representadas.A comparação das proporções foi feita utilizando o Teste Exato de Fisher (Graphpad Software).
No terceiro mês após a vacinação (Figura 2), eficáciasimilar e diferenças não significativas foram encontradas entre os doistratamentos na maioria das variáveis. Quando comparados com os controlesnão tratados, ambos os tratamentos, IT e ICT, aumentaram a proporção derespostas de IDR positivas (de 8 a 67-76%), e reduziram a proporção de casossintomáticos (de 100 ã 33-18%), a proporção de casos com evidência deparasitas (de 54 a 12-15%), e a proporção de mortes devidas ao LVC (de 48 a19-12%) revelando o controle da doença clínica e parasitológica que tornouassintomáticos a maioria dos cães. Até o mês 3, entretanto, nem o tratamentoIT, nem o ICT foram capazes de eliminar a evidência de DNA de Leishmaniaem Iinfonodos e até um aumento significativo da mesma sobre a dos controles(38%, p=0.0075) e sobre a do grupo IT (58%, p=0.0487) foi visto no grupo ICT(85%) revelando a sua importante condição de infecção latente (Figura 2). Oresultado indica que ambos os tratamentos IT e ICT, logo depois da vacinação,aumentaram e sustentaram a importante resposta imune celular protetivacontra infecção Leishmania1 impedindo o avanço da doença, reduzindo aproporção de mortes e tornando os cães assintomáticos, mas portadores deuma infecção inaparente por Leishmania, revelada somente pela presença deresidual de DNA de Leishmania detectado pelas ferramentas diagnosticasmoleculares. A recuperação da resposta imune celular é devida ao tratamentoIT com Leishmune uma vez que nenhuma contribuição significativa adicional daquimioterapia se observa para essa variável.
Como o potencial terapêutico da vacina Leishmuneenriquecida, através de IT e de ICT já era evidente no mês 3, e asintomatologia e morte estavam significativamente aumentados nos controlesnão tratados, por razões éticas, os veterinários neste ensaio decidiram tratar oscães controle com quimioterapia contra CVL e eles foram excluídos doexperimento após o mês 3.
A Figura 2 também representa os resultados obtidos nomês 8 após a vacinação completa. Cães do dois grupos IT e ICT exibiramaumentos adicionais nas proporções dos resultados positivos de IDR,presentes em apenas 8% dos controles não tratados no mês 3, e detectadosem 100% dos animais no mês 8. Esses resultados representam 33 a 24% deaumento significante respectivo, sobre os valores registrados no mês 3,expressando que todos os cães infectados recuperaram a respectiva respostaimune celular ativa contra Leishmania depois da vacinação. Nenhumasignificativa mudança significativa em casos sintomáticos, mortes ou evidênciaparasitária foi observada, revelando que os dois tratamentos sustentam acondição assintomática adquirida no mês 3. A única diferença significativaobservada entre os dois tratamentos no mês 8 foi uma pronunciada diminuiçãona proporção de cães apresentando resultados PCR positivos (de 85 a 20%;p=0.0001), observado apenas no grupo ICT, enquanto o grupo IT permaneceuinalterado (de 58 a 67%; p=0.7288), sugerindo que a o tratamento dequimioterapia adicional à vacinação com Leishmune enriquecida com saponina,aboliu a condição de infecção latente e curando os cães. A diferença altamentesignificativa entre as positividades no PCR do grupo ICT (20%) e do grupo IT(67%) no mês 8 (p=0.0253) (Figura 2) indicam que 70% do aumento na taxa decura foi conseguida pelo tratamento ICT.
Informações obtidas 4,5 anos após o início dos ensaiosrevelaram não haver diferenças significativas na taxa de sobrevivência dosgrupos IT ou ICT. Apenas mais 13% dos cães do grupo IT (3/23) e mais 7% dogrupo ICT (2/30) morreram de LVC entre o mês 8 e 4.5 anos (Figura 2). Aproporção acumulada de mortes por CVL nestes 4.5 anos do experimento foi32% para o grupo IT (10/31) e 20% do grupo ICT (7/35) (p=0.2780). Estadiferença não significativa sugere um poder curativo semelhante dos doistratamentos. Porém quando comparados com o grupo de controle não tratadono mês 3 (12/25 cães, 48%), uma diminuição na taxa de óbitos por LVC ésomente observada após o tratamento por ICT (7/35 cães, 20%; 0.0273), masnão após o tratamento IT (32%, p=0.278) (Figura 2). Considerados juntamentecom a negativação dos resultados PCR dos linfonodos, os resultados apontampara vantagem do tratamento ICT no controle e cura estéril de LCV.
Para donos de cães e veterinários, o sucesso dotratamento quimioterápico significa a remissão dos sinais clínicos, porém emáreas endêmicas isto é inaceitável porque os vetores estão presentes e apossibilidade de que estes cães ainda sejam infecciosos e de que a doençaseja transmitida para humanos, não pode ser excluída. Para parasitologistas, acura significa a eliminação dos parasitas, enquanto que para os órgãos desaúde pública, epidemiologistas e entomologistas, a ausência de infectividadepara insetos flebótomos e o bloqueio da transmissão de cepas resistentes, ésuficiente. Recentemente, a cura clínica e parasitológica é, portantoconsiderada insuficiente e se procura a cura estéril, sem evidências deparasitas ou de DNA de Leishmania, para considerar o cão curado e nãotransmissor.
Neste trabalho demonstramos que o tratamento dos cãesinfectados com Leishmune® enriquecida é capaz de aumentar a respostaimune celular, reduzir os casos sintomáticos, a presença de parasitas noslinfonodos e as mortes. Ou seja, o tratamento de IT com Leishmune®enriquecida é capaz de controlar a doença, induzir remissão e promover a curaclínica e parasitológica dos animais rapidamente. Estes resultados já tinhamsido demonstrados em trabalhos anteriores. No tratamento por ICT1 o usoadicional de quimioterápicos permite atingir, 8 meses após o início davacinação, a cura estéril dos animais, eliminando a presença de DNA deLeishmania dos linfonodos, conforme revelado por métodos de diagnósticomolecular de grande sensibilidade, deixando os cães não infecciosos. Emefeito, estes animais não apresentam risco de transmissão da doença parahumanos nas áreas endêmicas. O achado de um índice cumulativo de óbitosmenor no grupo tratado por ICT, 4,5 anos após o início do experimento,confirma a superioridade deste tratamento.
Os resultados desta invenção investigada em grupos de31 a 35 cães ganham importância se comparados com o resto da literatura queutiliza de 5 a 17 cães apenas.
A cura clínica e parasitológica após tratamento comLeishmune® enriquecida já tinha sido mostrada anteriormente, e foi tambémsugerida após a utilização simultânea de duas doses de Leishmune® profilática(0.5mg de saponina). Diferente de nossos resultados, apenas o controle clínicoe parasitológico parcial foi atingido após o uso de tratamento com a vacinaLeishl IOf-MPL (monofosoforil-lipídio A)-SE (esqualeno) em combinação comGlucantime® ou com Glucantime®, indicando a menor eficácia desta vacina eadjuvantes, fato que já tinha sido apontado pelo fracasso prévio desta vacinaem testes de campo.
Por outro lado o tratamento exclusivamentequimioterápico com antimônio pentavalente, alopurinol, anfotericina B,anfotericina B lipossomalizada, aminosidina, pentamidina e várias drogasantimicrobianas e antifúngicas tais como metronidazol, cetoconazol efluconazol induzem algum tipo de melhora clínica, mas a cura parasitológica édifícil de ocorrer e evidências de DNA usualmente persistem.
Em efeito, após terapia com antimoniato parasitas foramrecuperados parasitas a partir de 79% dos 15 cães tratados e 5/6 cães eramPCR positivos. Assim mesmo 9/10 cães tratados com alopurinol mostravamrecuperação clínica mais 8 deles eram positivos na cultura de parasitas ouPCR de aspirados de linfonodo. Também 5 de 6 cães tratados com megluminae alopurinol permaneceram parasitologicamente positivos e 2 deles foraminfecciosos para flebótomos. Treze cães tratados com anfotericinaB Iipossomalmostraram uma rápida melhora clínica, mas se mantiveramparasitologicamente positivos, tendo sido detectada recidiva em 12 dosmesmos. Onze de 12 cães tratados com aminosidina melhoraram clinicamentemais 4/4 mostraram parasitas em cultura de amostras de linfonodos. Comdoses maiores de aminosidina 3/12 cães mostraram ausência de sintomas ede parasitas por 4 anos com recidiva acontecendo nos 9 restantes. Cãestratados com pentamidina também melhoram clinicamente, mas recidivam.
Na nossa investigação observamos que a imunoterapiacom Leishmune® enriquecida de saponina obteve melhores resultados do queos previamente reportados para o tratamento quimioterápico apenas, e que aimunoquimioterapia com Leishmune® foi melhor que o tratamento comimunoterapia exclusiva.
A imunoquimioterapia com Leishmune® enriquecida émelhor que a quimioterapia usual com alopurinol, uma vez que reduz o seutempo de uso e a toxicidade intrínseca. Enquanto cães tratados com alopurinolapenas se recuperam em 2 a 6 meses, sem cura parasitológica ou negativaçãode PCR mesmo com 20 meses de tratamento e recidiva em % cães, otratamento por ICT com Leishmune® e 15 meses de alopurinol revelou 89% decura clínica, 100% de cura parasitológica e de recuperação da resposta imunecelular e 76% de negativação do PCR, já no mês 8.
O efeito de ICT foi estudado para uma vacina de Iisado deLeishmania (L.) infantum e Glucantime® em 5 cães acompanhados apenas por6 meses. Os animais tratados apresentaram melhor clínica, porém com recidivaem 3/5 e aspirados de linfonodo positivos. Portanto, a imunoterapia comLeishmune® enriquecida foi superior a imunoquimioterapia com a vacina de L.(L.) infantum.
Recentemente foi observado que a imunoterapia comLeishmune®, usando duas doses simultâneas da vacina profilática licenciada,que contém 0.5mg de saponina, em lugar de uma dose da vacina enriquecida,que contém 1mg de saponina, deixou cães infectados assintomáticos enegativos na imunohistoquímica por 2 anos.
Considerando as deficiências da quimioterapia na CVL eseu impacto negativo no controle epidemiológico da doença, o possível uso deuma vacina protetora na imunoterapia dos cães já infectados é altamenteencorajadora e teria mais ampla aceitação na comunidade, do que o controlebaseado no sacrifício dos cães infectados. A expressiva proteção e decréscimoda incidência humana e caninas lograda previamente pela vacina FML noensaio de campo e recentemente pela vacina Leishmune ®, elevaram aperspectiva do seu uso nas tentativas em imunoterapêutica canina. Estainvenção demonstrou o valor terapêutico da vacina Leishmune® saponina emcombinação com quimioterápicos, quando utilizada no tratamentoImunoquimioterápico da Leishmaniose visceral canina, revelando seuextraordinário e surpreendente potencial como inédita ferramenta para controleda doença em áreas endêmicas.
O efeito benéfico da terapia ou imunoquimioterapia com avacina FML-saponina ou Leishmune®, demonstrado na prevenção etratamento da Ieishmaniose visceral canina, se mostra pela diminuiçãoconseqüente da Ieishmaniose visceral humana, causada no Brasil porLeishmania chagasi, podendo se estender à prevenção, tratamento e cura dasIeishmanioses viscerais causadas na Europa e África (Mediterrâneo) porLeishmania infantum, uma vez que o antígeno FML é reconhecido pelos soroshumanos e de cães infectados com L.(L.) infantum na Espanha, e dasIeishmanioses viscerais da Ásia e África, uma vez que o antígeno FML é obtidoa partir de células de Leishmania (L.) donovani (Sudan), que é o agente causaida doença humana na índia e em algumas regiões da África.
Considerando que no mundo, grande parte das áreas deincidência de Ieishmaniose visceral se superpõe às de Ieishmaniosetegumentar, doença mais freqüente e menos letal, porém mutilante, a vacinaFML-saponina ou Leishmune® pode ser usada como ferramenta bivalente naprevenção, controle, imunoterapia ou imunoquimioterapia de ambas asleishmanioses: viscerais e tegumentares. De cada 2.000.000 de novos casosanuais de Ieishmaniose no Mundo, 1.500.000 correspondem à Ieishmaniosetegumentar, que se apresenta sob a forma de 3 síndromes clínicas deexpressão variável, conhecidas como: Ieishmaniose cutânea (LC)1Ieishmaniose mucocutânea (LMC) e Ieishmaniose difusa (LD). As espécies deparasitas do gênero Leishmania estão separadas em dois subgêneros:Leishmania (L.) e Viannia (V.), existindo aproximadamente 30 espécies quecausam morbidade e mortalidade em áreas endêmicas. Enquanto que asIeishmanias do complexo donovani (L.(L.) donovani, L.(L.) infantum-L.(L)chagasi) são agentes causais do calazar ou Ieishmaniose viceral, asIeishmanias do complexo mexicana (Z_. (L.). mexicana, L. (L.). pifanoi, L. (L).amazonensis, L. enrietti, L.(L.) venezuelensis) e do complexo braziliensis(L.(V.) brazilensis, L (VJ guyanensis, L. (V). panamensis, L. (V). peruviana,L.(VJ Iainsoni, L (VJ shawi, L(VJ naiffi) causam as Ieishmanioses cutânea,mucocutânea e difusa no Novo Mundo enquanto que as L. (L.) tropica, L. (L.)major, L (L.) aethiopica são agentes de Ieishmaniose tegumentar no VelhoMundo.
Mais de 90% dos casos de Ieishmaniose cutânea ocorremno Afeganistão, Irã, Arábia Saudita, Síria, Brasil e Peru. Estima-se que350.000.000 de seres humanos estão sob risco de contraírem algum tipo deleishmaniose. No Brasil, aproximadamente 90% dos casos humanos deleishmaniose visceral se concentravam no Nordeste até 1993. Em 2002,64,02% dos casos correspondem ao Nordeste sendo que a epidemia seestendeu pelo Norte (14,12%), Centro-Oeste 8,22% e Sudeste (13,63%) dopaís. Um importante surto da doença se registra atualmente em São Paulo eMato-Grosso do Sul. A leishmaniose tegumentar por outro lado, apresentou28569 casos no ano de 2004, sendo estes distribuídos por todo o país commaior concentração nos estados do Norte, Nordeste e Centro Oeste.
No intuito de iniciar uma possível vacina bivalente, contraas Ieishmanioses visceral e cutânea, demonstramos anteriormente que avacina FML-saponina induziu 65% de proteção, em animais desafiados comL.(L.) mexicana. Assim mesmo, demonstramos que camundongos Balb/cvacinados com 3 doses de FML combinadas com IL-12, saponina Quil-A,Riedel de Haen ou QS-21 induziram respostas significativamente aumentadasde anticorpos e de IDR contra Iisado de L. (L.) amazonensis. As respostasforam até maiores que as geradas em animais vacinados com a fração análogaao FML isolada de L.(L.) amazonensis confirmando o potencial imunoprofiláticodo FML de L.(L.) donovani contra ambas as leishmanioses. O FML contémcomo maior fração antigénica a glicoproteína GP36, identificada apósclonagem como a enzima Nucleosidio Hidrolase (NH36). Esta enzima é vitalpara o parasita, pois cliva nucleosídeos importados liberando bases para aconfecção do DNA do parasita. A vacina de DNA contendo o gene da NH36, aVR1012NH36 foi imunoprofilática e imunoterapéutica contra a Ieishmaniosevisceral murina por L. chagasi e cutânea murina por L. mexicana, sugerindoque este antígeno principal do FML induz proteção cruzada contraIeishmaniose tegumentar. Recentemente, identificamos por clonagem aNucleosidio hidrolase de L.(L.) amazonensis com altíssima homologia com aidentificada em LfLJ donovani o que explica a possível base molecular daproteção cruzada. Foi também analisada a resposta imune e proteção induzidaem camundongos Balb/c, pela vacinação com 3 doses subcutâneas de FML(150pg) + saponin (100pg) contra a infecção por 106 promastigotas de L.amazonensis obtidos de amastigotas de hamsters.
Na semana 26, após a infecção, diferenças significativasforam encontradas entre os grupos, no aumento de tamanho das patas(p=0.004). A vacina FML+ saponina induziu 49% de redução na evolução dostamanhos das lesões (Figura 1). Em efeito, o aumento no tamanho das patasfoi detectado em 5 de 7 animais tratados com salina e apenas 1 tratado comFML-saponina (Figura 1). A análise da carga parasitária por diluição Iimitantedo tecido das lesões dos sobreviventes indicou que houve uma proteçãosignificante nos animais vacinados com FML+ saponina (Figura 2). Em efeito,foram detectados 81,8% de redução nos títulos de parasitas e 77,8% deredução nas contagens de parasitas dos animais vacinados com FML-saponina.
Os nossos resultados sugerem que a vacina FML-saponina induz proteção significante cruzada contra Ieishmaniose tegumentarpor L. (L.) amazonensis e por L. (L.) mexicana confirmando o potencial destavacina como ferramenta de controle de ambas as leishmanioses: visceral etegumentar. A detecção prévia de efeito profilático e imunoterápico da vacinade DNA, contendo o antígeno NH36 do FML contra as Ieishmanioses visceraise tegumentares murinas e a Ieishmaniose visceral canina, confirma arelevância do complexo FML na proteção contra ambas as doenças e sugere oseu potencial efeito curativo na imunoquimioterapia das Ieishmaniosesviscerais e tegumentares humanas.
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Figura 3 Evolução do tamanho das patas infectadas de camundongos Balb/c (n=7/ grupo)tratados com salina ou vacina FML-saponina e desafiados com promastigotas infectivos deLeishmania (L.) amazonensis.<figure>figure see original document page 21</figure>
Figura 4. Quantificação da carga parasitária nas patas de camundongos vacinados com FML-saponina; à esquerda, Log10 da diluição máxima na qual são observados parasitas (título), àdireita, IogIO do número de promastigotas na diluição equivalente ao título.

Claims (11)

1.- "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", caracterizado pelo fato de compreender uma vacinacontendo o antígeno FML ("Fucose Mannose-Iigand ou Ligante de Fucose eManose) e o adjuvante saponina, usada em combinação com quimioterápicos,para o tratamento das Leishmanioses humanas e animais, em especial dasIeishmanioses viscerais caninas.
2.- "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", caracterizado pelo fato de compreender uma vacinacontendo entre 0,5 e 1000 mg/ml do antígeno FML ("Fucose Mannose -Iigandou Ligante de Fucose e Manose) e de 0,5 a 1000 mg/ml do adjuvanteSaponinai utilizados em combinação com quimioterápicos para tratamento dasLeishmanioses humanas e animais, em especial das Ieishmanioses visceraiscaninas.
3.- "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 2, caracterizado porincluir na vacina, frações de promastigotas ou amastigotas de Leishmania,denominadas FML ("Fucose Mannose -Iigand ou Ligante de Fucose e Manose)e a sua subfração nucleosídeo-hidrolase (NH36), e saponina, em combinaçãocom quimioterápicos.
4.- "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatoque os quimioterápicos contemplam antibióticos, drogas anti-câncer e/ouantifúngicos e/ou antivirais.
5.- "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fatode que os quimioterápicos contemplam: análogos da inosina, formicina eanálogos de nucleosídios; antibióticos antibacterianos: aminoglicosídeos,anfenicóis, ansamicinas, beta-lactámicos como penicilinas e cefalexinas,lincosamídeos, macrolídeos, polipeptídeos, tetraciclinas, cicloserinas,mupirocinas, tuberinas, diaminopirimidinas, nitrofuranos, quinolonas,sulfonamidas, sulfonas, enrofloxacina, paromomicina e outrosaminoglicosídeos, drogas antiparasitárias: alopurinol, antimoniais pentavalentes(N-Methyl-meglumina, stibogluconato de Na), Anfotericina B, Anfotericina Blipossomal, aminosidina, pentamidina, alquilfosocolinas, metronidazol,buparvaquone, sitamaquina ou 8 aminoquinolona e temporinas, drogas anti-fúngicas: ketoconazol, fluconazol, itraconazol, terbinafina e drogas anti-câncertais como a miltefosina, estimaquina, entre outras.
6. - "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fatode utilizar a vacina com saponina e qualquer dosagem de quimioterápicos,administrados por via mucosa (oral, nasal, retal e vaginal), ocular, intradérmica,intraperitoneal, subcutânea e/ou intramuscular.
7. - "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", caracterizado pelo incluir um KIT para tratamento deLeishmaniose visceral canina.
8. - "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fatode o referido kit compreender a vacina Leishmune® de formulação profiláticacontendo 0.5 mg de saponina e a vacina Leishmune® de formulaçãoimunotérapica (contendo de 1-100 mg/ml de saponina) e quimioterápicos, parao tratamento da Ieishmaniose visceral canina, administrados por qualquer via.
9. - "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode a referida vacina ser aplicada em cães, reduzindo a presença dos parasitasexpostos nos cães, reduzindo assim o número de parasitas nos insetosflebotomíneos que se alimentam nos cães e, finalmente, reduzindo a infecçãode outros cães e humanos por estes insetos.
10. "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fatoda imunoquimioterapia com a referida vacina apresentar propriedade curativa,deixando cães previamente infectados na condição de cura estéril daleishmaniose visceral e tegumentar, caracterizada por ausência de parasitas epela ausência total de DNA de Leishmania.
11. "PROCESSO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICAIMUNOQUIMIOTERÁPICA PARA TRATAMENTO DE LEISHMANÍASECANINA E HUMANA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fatodo tratamento com a referida vacina ser de uso potencial na imunoterapia eimunoquimioterapia animal e humana contra a leishmaniose visceral etegumentar.
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