TR201901647T4 - Saflaştırılmış ansamitosinlerin hazırlanmasına yönelik proses. - Google Patents

Abstract

Oldukça verimli ansamitosin üreten suşların büyük ölçekli fermantasyon prosesidir. Ham ansamitosinlerin izole edilmesine yönelik yöntemdir. Ansamitosinlerin saflaştırılmasına yönelik yöntemdir.

Description

TARIFNAME SAFLASTIRILMIS ANSAMITOSINLERIN HAZIRLANMASINA YÖNELIK BULUSUN SAHASI Bulus, saflastirilmis ansamitosinlerin hazirlanmasina yönelik bir proses ile ilgilidir. Ansamitosinler, C-3 ester yan zincirinde farklilik gösteren ansamitosinlerin bir karisimina refere eder. Ansamitosinler, C-3 alkol maytasinole dönüstürülebilir.

BULUSUN ALT YAPISI Ansamitosinler Actinosinnema pretiosum gibi mikroorganizmalarin fermantasyonunda türetilen yüksek derecede sitotoksik bilesiklerdir.

Ansamitosinler kimyasal olarak, terapötik kullanimi hücre baglama ajani maytanslnoid formunda birlesen tiyol içeren maytansinoidlere dönüstürülür Actinosynnema pretiosum gibi Actinosinnema spp suslarina sahip fermantasyon prosesi, C-3'te (Sekil 1) farkli ester sübstitüentlerini tasiyan birçok ansamitosin türünü üretir. Üretilen çesitli C-3 esterleri P-3 (izobütiril), P-3 ' (n-bütiril), P-2 (propionil), P-4 (lSO-valeril), P-4 ' (n-valeril) içerir. Tüm bu esterler, tiyol içeren maytanslnoidlerin sentezine yönelik prekursör olan C-3 alkol maytansinolünü (P-O) vermek üzere indirgenerek bölünebilir. Buna ek olarak, N-demetil, 20-0- demetil, ve 19-dekloro gibi diger alanlarda degistirilen istenmeyen ansamitosinler küçük miktarlarda üretilir. Indirgeyici deasilasyona göre bu ansamitosinler maytasinol üretmez.

Aktinosinnema spp fermantasyonundaki ansamitosin üretimine yönelik mg/L arasinda degisen titreler ile degisir. Ansamtosinler tipik olarak, organik katman ile konsantre edilme ve petrol eteri ile çökelmenin takip ettigi bir filtre destegi ve bir organik sivinin eklenmesini içeren birçok adimli proses ile geri kazanilir ve saflastirilir. Çökelme ayrica, yeniden kristallesme veya kromatografi yoluyla ileri derece saflastirmanin izledigi üzere silika kromatografisi ve kristallesme kullanilarak saflastirilmistir.

Dolayisiyla, proses kullanissizdir ve son derecede toksik materyali ile çalisilmasinin gerektigi birkaç adimi içerir. Bu, bu tür bir prosesin ölçeginin büyütülmesini oldukça zorlastirir. Buna ek olarak, insan operatörünün güvenligi, çesitli islem adimlari boyunca saglanmalidir. prosesteki belirli gelismeleri öne sürer. Fermantasyon sivisindaki ansamitosin titrelerin 65 ila 86 mg/L arasinda degiskenlik gösterdigi gözlemlenir. Belirtilen iyilestirmeler, 75°C'de sivinin isi ile etkisizlestirilmesini, toluen gibi bir aromatik hidrokarbon solventinin içerisine ekstrakte edilmesini, kristallesmenin izledigi bir açik silika kolonu üzerinden yapilan kromatografiyi içerir. özelliginden faydalanan kati faz ekstraksiyonu ile 20-Demetoksi-20-hidroksi- maytansinol izolasyonunu ögretir. Tercihen kullanilan adsorbent silika jelidir.

Ansamitosin üretiminin maliyetinin azaltilmasi amaciyla, daha önce açiklanana göre önemli ölçüde daha yüksek titreler (fermentörlerde 400 mg/L 'ye kadar) veren yeni Actinosinnema SPP suslari üretilir. Ansamitosinlerin üretimine yönelik olarak daha önceden açiklanan proseslerin birçok kusuru vardir ve dolayisiyla gelistirilen yeni yüksek üretimli suslara yönelik olarak adapte edilemez. Örnegin, 75 °C'de isi ile etkisizlestirme eylemi, ansamitosinin belirli bir oranda bozulmasi ve verimde %10 ila %20 oraninda kayip yasanmasi ile sonuçlanir. Aromatik hidrokarbonlara sahip yüksek ansamitosin içerigini içeren fermantasyon sivisinin ekstrakte edilmesi, ansamitosinerin bu tür solventler içerisinde yüksek derecede solunabilir olmamasi nedeniyle etkisiz ve eksiktir.

Ansamitosinlerin, açik kendinden sizdirmaz silika kolonlarindaki saflastirmasi iki kusura sahiptir:1) saflik ve geri kazanim bakimindan lot arasi degiskenlik ve 2) güvenlik endiselerine yol açan büyük ölçüde insan maruziyeti.

Dolayisiyla, yüksek verimli ansamitosinlerin üretilmesi ve yüksek oranda toksik ilaca karsi çalisan maruziyeti minimize edilirken ayni zamanda onun izolasyonu ve saflastirilmasina yönelik olarak verimli bir süreç saglanmasina ihtiyaç BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Saflastirilmis ansamitosinlerin hazirlanmasina yönelik bir proses asagidaki adimlari içerir: 1) sivi kültür ortaminda ansamitosin üreten bir mikroorganizmanin kültürlenmesi; 2) ansamitosinlerin ekstrakte etme islemlerinin kolaylastirilmasi amaciyla kültür ortaminin istege bagli olarak islem görmesi; 3) Ansamitosinlerin kültür ortaminda bir reçineye kati fazli olarak ekstrakte edilmesi; 4) organik bir solvent veya su ile kombine bir organik solvent kullanilarak reçineden ansamitosinlerin izokratik veya gradyan elüsyonu; ) Ekstrakte edilen ansamitosinlerin konsantre hale getirilmesi ve 6) Ansamitosinlerin ayrica b), c) ve d)'den herhangi biri araciligiyla istege bagli olarak saflastirilmasi: a) silika jel veya alümina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi, b) kristallesme, c) ardindan kristallesmenin geldigi silika jeli veya alümina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi ve d) silika jeli veya alumina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi tarafindan izlenen kristallesme; ve burada söz konusu ansamitosinler, sekil 1'deki yapiya ait bilesiklerin bir karisimini içerir, burada R, COCHs, COCH2, COCH2CH2CH3, COCHzCH(CH3)2 veya COCH2CH2CH2CH3'dIr.Proses istege bagli olarak asagidakileri içerebilir: (i) fermantasyon sivisinda mikroorganizmalarin kimyasal veya isi ile etkisizlestirilmesi; (ii) Saflastirma esnasinda gerçeklestirildiginde, herhangi bir ardisik kombinasyonda, organik solventte bulunan ansamitosinlerin bir kati solüsyonunun su, bir aköz tuz solüsyonu, bir aköz asit veya bir aköz baz ile yikandigi bir yikama adimi.

Yukarida açiklanan yöntemlerde, ansamitosin üreten mikroorganizmanin actinosinnema spp., daha fazla tercih edildigi üzere actinosinnema pretiosum olmasi tercih edilir. Ansamitosin üreten mikroorganizma ayrica, Actinosinnema pretiosum ATCC 31565 veya bunlardan türetilen suslar veya Actinosinnema pretiosum PF veya bunlardan türetilen suslar olabilir. Bu, Agustos Osaka Fermantasyon Enstitüsü, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, 5185 erisim numarasi altinda Ulusal Biyobilim ve Insan Teknolojisi Enstitüsü (eski Fermantasyon Arastirma Enstitüsü), Endüstriyel Bilim ve Teknoloji Ajansi, Uluslararasi Ticaret ve Sanayi Bakanligi, 1-3, higashi 1-chome, Tsukuba-shi, numarasi altinda Amerikan tipi Kültür Koleksiyonu, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, ABD'de muhafaza edilmistir. Ayrica, Actinosfnnema pretiosum PF4-4 Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu, 10801 tarihinde Budapeste Antlasmasi hükümleri altinda muhafaza edilmistir ve ATCC SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1 fermantasyon araciligiyla gerçeklestirilebilen çesitli ansamitosin C-3 esterlerine ait yapiyi gösterir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Yöntemler, büyük fermentörlerde bir sivi kültür ortaminda ansamitosinlere yönelik olarak son derecede üretken bir mikroorganizmanin kültürlenmesine yönelik olarak açiklanir. Gerekli olmasi halinde mikroorganizma, ekstraksiyon adimindan önce isil islem veya kloroform ile islem yapilmasi yoluyla etkisiz hale getirilebilir.

P-3, P-3', P-4, P-4', P-2 ve P-1 (Sekil 1) ansamitosinleri gibi çesitli C-3 esterlerinin bir karisimina içerebilen saflastirilmis ansamitosinler, istenen C-3 hidroksil bilesigini, maytasinolü (P-O) vermek üzere bir indirgeme ajani ile islenebilir. Saflastirilmis ansamitosinler tipik olarak, C-3 konumu disinda molekül alani üzerinde modifikasyonlara sahip olan yalnizca küçük miktarlarda istenmeyen ansamitosinleri içerir. Tercihen, ansamitosin üreten sus Actinosyiemma spp.'dir. Daha fazla tercih edildigi üzere mikroorganizma Actinosinnema pretlosumdur. Mikroorganizma ayrica Actinosinnema pretiosum PF ve bunlarin türevleri ve Actinosi'nnema pretiosum ATCC 31566 ve bunlarin türevleri olabilir. Mikroorganizma, burada açiklanan spesifik ortam veya teknikte açiklanan diger herhangi bir ortamin kullanilmasiyla teknikte uzman kisilerce bilinen fermantasyon kültür teknikleri ile yetistirilebilir. 4,350,265).

Mikroorganizma, sivi kültür ortaminda kültürlenebilir. Bakteriyel susun PF4-4'ün büyümesi kontrollü kosullar altinda gerçeklestirilir ve buna yönelik olarak çok çesitli ortam ve kosullar kullanilabilir. Örnegin, PF4-4, yayinlanan U.S'de ATCC fermente edici üretimini destekleyen genis kapsamli bir karbon kaynagini tolere edebilir. Örnek büyüme ortamlari Tablo 1 ve 2' de gösterilir. Tablo 1, Actinosynnema pret/osum PF4-4 gibi ansamitosin üreten mikroorganizmalarin üretimini destekleyen ortami gösterir ve Tablo 2,Actinosinnema pretiosum PF4- 4, ve ansamitosin üreten diger mikroorganizmalarin yayilma ve/veya büyümesine yönelik olarak uygun olan diger ortamlari gösterir.

Tablo 1.Üretim Ortami Bilesimi (girdiler % w/v).

Dextrin (Lodex-5) 6 6 5 5 5 FM 27- FM Maltoz (Difco) 4 4 Proflo (Traders) Soya unu (ADM) 1.5 2.0 Pharmamedia CSP (Roquette) 0,5 0,5 P.Kuru Maya (Difco) 0,25 CaCO3 (Hayashi) (NH4)2SO4 (Wako) KH2PO4 (Wako) 0.05 K2HPO4 (Wako) NaHC03 (Wako) Zeolit 0.1 Fe804- 0,0002 Nikotin Asidi 0,0002 Izobüîanol1 (Tedoa) pH 6,8 2.0 2.5 0,5 0.15 0,5 0,5 0,5 0,3 6,8 7.2 112- FM 4-4 FM 4-6 FM 4-7 Sterilizasyon 20 dakika boyunca 121 °C'de yapilmistir.1 Son olarak eklenmistir.

TABLO 2 Ilgili Ortam ggim ve kap kültürü. CM4-1 Aga_r Maya ekstrakti (Difco) 0,3 Malt ekstrakti (Difco) 0,3 Soytone (Difco) 0,5 Gliserol (Difco) 1.0 Bacto agar (Difco) 2.0 Sterilizasyon öncesinde pH degerini 6,5'e ayarlama; 121 °C, 20 Sterilizasyon: dakika Tohum Ortami.VM4-1' Çözünür nisasta (BDH) 2.0 Glikoz (Shuling) 1.0 Soya yemegi (ADM) 1.0 Misir Maserasyon Sivisi (Solulys) 0,5 Soytone (Difco) 0,5 NaCI (Wako) 0,3 pH 6.8; Sterilizasyon: 121 °C, 20 Ansamitosinlerin PF4-4 susundan fermente edici biçimde üretilmesine yönelik olarak tercih edilen yöntemler ayrica, asagida bulunan ÖRNEKLER 1 ve 2'de açiklanir.

Fermantasyon: diger tüm kültür kosullari ile yürütülebilir. iyi kültür büyümesi ve ansamitosinlerin büyük tank fermentörler içerisindeki yüksek üretimine yönelik olarak aerobik batik kültür tercih edilir. Ansamitosin üretimi, fermantasyon sirasinda besinler ile beslenerek daha fazla oranda gelistirilebilir. Örnegin, organizma FM4-6 ortaminda yetistirildiginde, fermantasyon süresince ilave glikoz beslemesi veya yaklasik ilk 24 ila 72 saat boyunca, tercihen yaklasik ilk 48 saat boyunca glikoz beslemesi, akabinde glikoz ve bir pamuk tohumu unu (örnegin Trader's Protein, Memphis, TN çikisli Proflo veya Pharmamedia) veya soya unu gibi bir protein besin maddesi ve fermantasyonun sonuna kadar izobütanol, izobütraldehit, n- bütanol, n-bütiraldehit, n-propanol, n-propionaldehit, izopropanol, izopropionaldehit, pentanol, valeraldehit, izopentanol, izovaleraldehit gibi C-3 ester yan zincirinin olusumunu kolaylastirmak üzere bir alkol veya bir aldehit ile beslenmesi, ansamitosin üretiminin iki katina çikmasi ile sonuçlanabilir. Kültür kosullari, kullanilan ortam ve üretim ölçegine bagli olurken, fermantasyonun normal olarak 5 ila 9 arasinda bir pH degerinde, tercihen 6.5 ila 8.0 baslangiç pH'ina sahip olarak yürütülmesi tercih edilir. Daha fazla tercih edildigi üzere pH araligi 7 ila 8. daha fazla tercih edildigi üzere ise 7 ila 7.4'tür.En çok tercih arasinda degisir. Daha fazla tercih edildigi üzere sicaklik 28 °C ' dir.

Fermantasyon maksimum ansamitosin birikimi elde edildigi sürece devam eder.

Kültivasyon süresi, kültür yöntemi, ortam bilesimi ve sicaklik dahil olmak üzere birçok faktöre baglidir ve buna göre degisebilir. Tipik olarak, fermantasyon süresi 96 ila 336 saat arasinda degiskenlik gösterir.

Ansamitosinlerin analizi: C-14'te (Sekil 1) bir metil veya hidrometil grubunun varligi ile ayristirilabilen iki sinif ansamitosinlerin üretimi açiklanir. Her iki sinifa yönelik olarak, birçok farkli ansamitosin, ilgili asil yan zincirinin C-3 oksijen atomuna baglanmasina ve C- 14'ün bir metil veya hidroksimetil (veya sonraki çalismalar, N- demetil) grubunu tasiyip tasimadigi hususunda farklilik gösterecek sekilde üretilir. Burada degistirilmis bilesiklere yönelik olarak kullanilan terminoloji, Sekil 1'e verilen referans ile yukarida tanimlanir.

Ansamitosin P-3, belirli büyüme kosullari altinda olmak üzere PF4-4 ve parental sus ATCC 31565'in ana ürünüdür. Bakterinin, valin veya izobütirik asit (bakiniz U.S.Patent No. 4.228.239), varliginda veya izobütil alkol veya Izobütiraldehit (bakiniz U.S.Patent No. 4.356.265), varliginda büyümesi halinde, diger ansamitosin bilesikleri, yalnizca küçük miktarlarda mevcuttur.

PF4-4 susu, hepsi izobütil alkol içeren farkli fermantasyon ortaminda (Tablo 1'de belirtilen FO) büyüdügünde, ansamitosin P-3, üretilen baskin ansamitosindir. Ansamitosin miktarinin analiz edilmesine yönelik bir yöntemde, fermantasyon sivilarinin numuneleri, etanol ve asetonitril ile seyreltilir, daha sonra kuvvetli bir sekilde sallanir ve nihai olarak santrifüjlenir. Süpernatant daha sonra ansamitosin P-3 içerigine yönelik olarak analiz edilir.

Ansamitosinler tercihen ters fazli yüksek performansli sivi kromatografisi (HPLC) ile parçalanir ve analiz edilir, ancak örnegin MALDl-TOF veya ince tabaka kromatografisi gibi herhangi bir uygun teknik kullanilabilir.

Ansamitosinlerin ekstraksivonu: Ansamitosinler genellikle ikincil metabolitlerin geri kazanilmasina yönelik olarak kullanilan yöntemler araciligiyla fermantasyon sivisindan ekstrakte edilebilir.

Ansamitosinlerin aromatik olmayan solventler içerisinde kolayca çözünür olmasi nedeniyle, alkil asetatlar gibi aromatik olmayan, suyla karismayan çözücüler ile karistirilarak kolay bir sekilde ekstrakte edilebilir, burada alkil zinciri, lineer veya dallidir ve 1-5 karbon atomuna, dialkilketonlara ve halojenli solventlere sahiptir.

Uygun alkil asetatlara ait örnekler, n-bütil asetat, etil asetat ve metil asetati içerir.

Uygun bir dialkilketona ait bir örnek metil izobütil ketondur. Uygun bir halojenli solvente ait bir örnek diklorometandir. N-bütil asetat ile ekstraksiyon tercih edilir.

Tercihen, fermantasyon sivisinin aromatik olmayan suyla karismayan solvente olan orani hacimce 1: 1'dir.

Bulusa göre ansamitosinler, Rohm and Haas Company'den tedarik edilebilen Amberlite XAD-4, XAD-16, Mitsubishi Chemical lndustries Ltd.'den elde edilen reçineler üzerindeki fermantasyon sivisindan adsorbe edilir. Bu örnekler kapsami kisitlayici degildir, teknikte uzman kisilerce bilinen diger reçineler ayni zamanda yukarida belirtilen amaca yönelik olarak kullanilabilir. Reçine ayrica miknatis veya yüksek yogunluklu bir materyal gibi ikincil bir yapi üzerine kaplama olarak kullanilabilir, böylelikle polimer, manyetik olarak veya genis yatak kromatografisi gibi adsorban yogunluguna dayanan yöntemler ile geri kazanilabilir. Ansamitosinler reçine üzerine adsorbe edildiginde, izokratik veya gradyan elüsyon araciligiyla bir veya daha fazla organik solventler kullanilarak birbirinden ayrilir. Bir düzenlemede reçine, ansamitosinlerin ekstrakte edilmesine yönelik olarak dogrudan siviya eklenebilir.

Ansamitosinler, birçok araç ile reçineden geri kazanilabilir. Bir düzenlemede, reçine filtrasyon ile geri kazanilabilir. Bir ikinci düzenlemede, reçine santrifüjleme ile geri kazanilabilir ve pelet daha sonra, bir veya daha fazla organik solvent veya su ile kombine edilen bir veya daha fazla organik solvent ile birbirinden ayristirilabilir. Bir üçüncü düzenlemede, aköz faz ve kati birikinti, reçine üzerinden genis yatak kromatografisi kullanilarak giderilebilir. Reçine daha sonra genis yatak kolonunda sikistirilabilir ve bir veya daha fazla organik solvent veya izokratik veya gradyan elüsyon yoluyla su ile kombine edilen bir veya daha fazla organik solvent ile birbirinden ayristirilabilir. Bir dördüncü düzenlemede, reçine, kismi olarak geçirgen olan bir membran araciligiyla fermantasyon sivisindan ayristirilirken ansamitosinleri ekstrakte edebilir. Örnegin reçine ile doldurulmus bir diyaliz membrani, fermantasyon sivisi ile karistirilabilir, su ve düsük molekül agirligina sahip bilesenler membran üzerinden geçebilir, ansamitosinlerin reçineye tutunmasina olanak saglar.

Diyaliz çantasi daha sonra sividan giderilebilir ve geri kazanilan reçine bunun ardindan yukarida açiklandigi üzere ayristirilabilir.

Ekstraksiyon öncesinde, mikroplar, istenmesi halinde, yaklasik 30 dakika ila 2 saat boyunca yaklasik 50° ila 55 °C'de hafif isitmaya maruz birakilarak veya %1 eklenerek etkisiz hale getirilebilir.

Ayrica, ekstraksiyon sirasinda veya bundan önce, proses, ansamitosinlerin solvent ekstraksiyonunu kolaylastirmak üzere kültür ortaminin islenmesini içerebilir. Islem, bunlar ile sinirli olmamak üzere, isitma, pH ayarlamasi veya poli ferrik sülfat eklenmesi gibi enzimatik islem veya kimyasal islem, de- emülsifiye ajanlar, aseton veya metanol gibi alkoller gibi isli silika orkosolventlerini içerebilir.

Organik faz ekstraksiyonu durumunda, ekstraksiyon, 2.0 ile 13.0 arasinda bir pH'ta, ancak tercihen yaklasik 6.0 ila 7.0 arasinda bir pH'ta ve daha fazla tercih edildigi üzere yaklasik 6.5 ila 7.0 arasinda bir pH'ta ve tercihen n-bütil asetat ile gerçeklestirilir. Ekstraksiyonun verimliligini artirmak amaciyla, sivi, ekstraksiyon sirasinda tercihen 30° ile 45°C arasinda 5°C ile 80°C arasinda bir sicaklikta korunabilir.

Ekstraksiyon süresi, sivi bilesimi, sivi ve ekstraksiyon solventinin sicakligi, sivi ve solventin karistirilma yöntemi ve ekstraksiyona yönelik olarak kullanilan solvent dahil olmak üzere çesitli faktörlere dayanir. Ekstraksiyon süresi, ekstraksiyon yöntemine bagli olarak 1 saat ile 120 saat arasinda degisir. Örnegin, hizli bir ekstraksiyon ve filtrasyon islemi seçildiginde, ekstraksiyon süresi 1-12 saat arasinda degisebilir.

Filtrasyon süresince filtre destekleri kullanilabilir. Bu tür destekler, bunlar ile sinirli olmamak üzere Celpure P1000. Celatom FW-80, Hyflo Super Gel ve Celite'i içerebilir. Istege bagli olarak filtre destekleri. filtrasyon süresinde siviya dogrudan eklenebilir. Istege bagli olarak, filtreler ayni zamanda filtre destegi ile önceden kaplanmis olabilir. Bu proseste kullanilabilecek filtrasyon yöntemleri, bunlar ile sinirli olmamak üzere teget akis filtrasyonu, filtre destegi kaplamali kazima tambur filtrasyonu veya yigin filtrasyonunu içerir.

Ekstraksiyonun pH 1 - pH 5 veya pH 8 - pH 13 gibi asiri uçlarda veya 60 ° C - 90 ° C gibi yüksek sicakliklarda yapildigi durumlarda, ekstraksiyon ansamitosinlerin asiri ayrismasini engelleyen bir oranda tamamlanmalidir.

Gerekli olmasi halinde, ekstraksiyon ayrica, devamli santrifüjleme ile son derece hizli bir sekilde yapilabilir. Bu tür bir durumda, fermantasyon sivisinin pH'i veya sicakligi, sivi santrifüje girerken sert kosullara uzun süre maruz kalinmasinin engellenmesi amaciyla ayarlanacaktir. Fermantasyon isleminde kullanilmis olabilen ve ansamitosinlerin ekstrakte edilmesine yönelik olarak kullanilan santrifüj ekipmanina ait örnekler bunlar ile sinirli olmamak üzere santrifüj süzme kaplarini ve yigilmis disk santrifüjlerini içerir. Tutulan organik solvent ekstrakti daha sonra ansamitosinleri içeren bir tortuyu vermek amaciyla düsük basinç altinda konsantre edilebilir. Alternatif olarak su ile karisabilen bir solvent, fermantasyon sivisi ile karistirilabilir ve tek fazli, kati içermeyen bir solventi veren katilari çikarmak amaciyla santrifüjlenebilir. Solüsyon daha sonra, örnegin, akabinde organik fazin konsantrasyonunun gelistigi organik ve aköz fazin ayristirilmasina yol açmak üzere su ile karisabilen bir solventin eklenmesiyle islenebilir.

Ansamitosinlerin solüsyon içerisinde aköz olarak yikanmasi.

Su ile karisabilen organik bir solventin bir solüsyonu içindeki ansamitosinler, su, aköz asit, aköz baz, kismen veya tamamen tuza doymus suyla veya açiklanan aköz yikamalarin herhangi birinin bir kombinasyonu ile yikanabilir. Aköz asitlerin örnekleri arasindai bunlarla sinirli olmamak üzere, 1 ila 6.9 arasinda bir pH'ta aköz solüsyonlu hidroklorik asit, sülfürik asit, asetik asit, formik asit ve fosforik asit solventleri bulunur. Aköz asit ayrica bir asidik aköz tamponlu sistemi içerir.

Asidik tamponlu sistemlerin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, her biri kendi asidik tamponlama araliklarinda kullanilmak üzere pH ayarlamasi yapilmis sodyum fosfat. potasyum fosfat, amonyum asetat ve amonyum format bulunur. Aköz bazlarin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, 7.1 ila 13 arasinda bir pH'ta aköz solüsyonlu sodyum bikarbonat, potasyum bikarbonat, sodyum karbonat, sodyum hidroksit, amonyum hidroksit ve sodyum fosfat solventleri bulunur. Aköz baz ayni zamanda, bir bazik aköz tamponlama sistemini içerir. Bazik tamponlu sistemlerin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, her biri kendi bazik tamponlama araliklarinda kullanilmak üzere pH'i ayarlanan sodyum fosfat, potasyum fosfat, sodyum borat ve amonyum karbonat bulunur.

Asidik veya bazik yikamalar, ansamitosinlerin pH'ina göre degisecegi üzere gözle görülür bir sekilde bozulmadan tamamlanmak zorundadir. Gerekli olmasi halinde, bu, son derece hizli ekstraksiyon santrifüj teknikleri ile yapilabilir.

Kismen veya tamamen tuza doymus su örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, çesitli doygunluk seviyelerinde aköz sodyum klorür, çesitli doygunluk seviyelerinde aköz sodyum sülfat ve çesitli doygunluk seviyelerinde aköz potasyum klorür içerir. Ayni zamanda tamamen veya kismen doymus bir sulu tuz solüsyonunun bir karisiminin bir aköz baz veya bir aköz asitle birlestirildigi sulu yikamalar gerçeklestirilebilir.

Ekstraksiyon öncesinde filtrasyon: Alternatif olarak, ekstraksiyon öncesinde, fermantasyon sivisi içeren ansamitosinlerde bulunan katilar, filtrasyon veya santrifüjleme ile ayrilabilir. Kati hücre kütlesindeki antamitosinler, etanol , aköz etanol gibi bir solvent veya etil asetat, bütil asetat, diklorometan veya aseton gibi diger organik solventler ile yikanarak geri kazanilabilir ve teknikte uzman olan kisilerce iyi bilinir.

Ansamitosinlerin saflastirilmasi: Ham ürün, akabinde gerekli olmasi halinde yeniden kristallestirmenin gerçeklestigi silika jeli veya alümina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi gibi saflastirma prosedürlerine tabi tutulabilir. Tercihen kromatografi, Biotage kromatografi sistemi kullanilarak bir Biotage silika jel kartusu gibi önceden paketlenmis bir kolon üzerinde gerçeklestirilir. Arzu edilen ansamitosinler, bir etil asetat ve heksan karisimi ile baslayan ve artan miktarlarda metanol eklenerek ve bir solvent gradyani kullanilarak kolondan ayristirilabilir. Istenen ansamitosinleri içeren fraksiyonlar toplanabilir ve konsantre edilebilir. istenmesi halinde, ansamitosinler, ürünü çözmek amaciyla etil asetat gibi bir solvent kullanilarak ve daha sonra saf ürünü kristalize etmek amaciyla heptan veya heksan gibi polar olmayan bir solvent ilave edilerek kristallestirme yoluyla daha fazla oranda saflastirilabilir. Burada kullanilan kristallesme ifadesi ayrica solüsyondan olusan katinin, amorf veya tanimlanmis bir yapiya sahip olabilmesi amaciyla çökelme terimini kapsar.

Hücre Baglavici AianlMavtansinold Kompleksleri: Bulusun prosesi, tümörle etkilesime sahip pro ilaçlar olarak faydali olan hücre baglayici ajan/maytasinold komplekslerini yapmak amaciyla kullanilabilir.

Bulusun prosesi ile hazirlanan ansamitosinler, U.S içerisinde açiklandigi üzere kullanilabilen maytansinole indirgeyici bölünmeyi geçirebilir. Patent Numaralari.

N-metil-alaninin üretilmesi amaciyla mevcuttur. Bu türevler daha sonra disülfit içeren baglayicilar gibi çesitli baglayicilar vasitasiyla hücre baglayici ajanlara, ÖRNEKLER Bulus artik kisitlayici olmayan örneklere verilen referans ile gösterilecektir.

Referans ÖRNEGI 1 Ansamitosinlerin üretimi: Primer Tohum: %2 çözünebilir nisasta, %1 glikoz, %1 soya kÜSpesi, %05 misir maserasyon sivisi, (Roquette) %0.5 Soytone, %03 sodyum klorid ve %0.5 kalsiyum karbonati içeren tohum kültür ortami VM4-1 (400mI/sise), 2 L kapasiteye sahip on bir Erlenmeyer sise içerisine dökülmüstür. Sterilizasyondan sonra, siselerden her biri PF kültürü ile asilanmistir. Siseler, 48 saat boyunca 230 rpm'de bir orbital karistiricida 28 °C'de inkübe edilmistir.

Ikinci Tohum: Birincil tohum siselerinin içerigi daha sonra toplanmistir. A 300 L fermentörü, 100 L VM4-1 tohum ortami ile doldurulmustur.

Sterilizasyondan sonra, fermentör, 4 L toplanmis primer tohum kültürü ile asilanmistir. Fermentör, 80 rpm'de karistirilarak 28°C'de muhafaza edilmistir. Çözünmüs oksijen seviyesi, havalandirma ve istenmesi halinde artan karistirma ile % 30 oranindan fazla doygunluk ile muhafaza edilmistir.24 saat boyunca inkübasyonun sonrasinda, ikinci tohum kültürü, üretim tanklarina tasinmak üzere hazir durumda olmustur. Üretim: Iki 300 L üretim fermentörünün her birine, 250 L üretim ortami FM4-6 (bakiniz Tablo 1) doldurulmustur. Sterilizasyon sonrasinda, fermentörlerin her biri, 15 L ikinci tohum kültürü ile asilanmistir.

Fermentörler, 107 ± 5 rpm'de karistirma ve 0.4 vvm'de havalandirma ile 28 °C'de muhafaza edilmistir.2. günün sonrasinda, çözünen oksijen içerigi, karistirma hizini maksimum 170 ± 5 rpm'ye ve havalandirma hizini maksimum 1 vvm`ye yükselterek %30'un üzerinde bir oranda muhafaza edilmistir. Ansamitosin titresi, akabinde HPLC analizi ile yapilan miktar tayininin gerçeklesecegi sekilde günlük olarak bir fermantasyon sivisina ait numunenin geri çekilmesi ve etanole seyreltilmesi ile ölçülmüstür. Fermantasyona 10 gün boyunca devam edilmistir, bu noktada, ansamitosin birikimi sabit olarak kalmistir.10. günde iki fermentördeki ansamitosin titresi sirasiyla 251 mg/L ve 244 mg/L olmustur. Fermantasyon sivisinin pH degeri, fosforik asidin eklenmesiyle 6.5'e ayarlanmistir. Fermentörler, 55 °C'ye isitilmistir ve mikroorganizmalarin etkisiz hale getirilmesine yönelik olarak 1 saat boyunca bu sicaklikta muhafaza edilmistir. Fermentörler daha sonra bir organik solvent ile ekstraksiyon isleminin gerçeklestirilmesine yönelik olarak ortam sicakligina düsürülerek sogutulmustur.

Referans ÖRNEK 2:Bir besleme kesikli proses kullanilarak Ansamitosinlerin üretilmesi. doldurulmustur. Sterilizasyonun arindan fermentör, yukarida belirtildigi üzere hazirlanan 54 L ikinci tohum kültürü ile asilanmistir. Fermentör, 107 ± 5 rpm'de karistirma ve 0,4 WM'de havalandirma ile 28°C'de muhafaza edilmistir.0 ila 48 saat boyunca %285 oraninda glikozun bir aköz solüsyonu, 0.39 mL/L/h bir oranda beslenmistir.48 saat ila 288 saat boyunca, beslemeden, %215 glikoz, %7.1 Proflo ve %7.1 izobütanolü içeren, 0.51 mL//L/h oraninda beslenmis olan bir doygun çözeltiye geçilmistir.2. günün sonrasinda, çözünen oksijen içerigi, karistirma hizini maksimum 170 ± 5 rpm'ye ve havalandirma hizini maksimum 1 vvm'ye yükselterek %20'un üzerinde bir oranda muhafaza edilmistir. Ansamitosin titresi, akabinde HPLC analizi ile yapilan miktar tayininin gerçeklesecegi sekilde günlük olarak bir fermantasyon sivisina ait numunenin geri çekilmesi ve etanole seyreltilmesi ile ölçülmüstür. Fermantasyona 13 gün boyunca devam edilmistir, bu noktada. ansamitosin birikimi sabit olarak kalmistir.13. günde fermentördeki ansamitosin titresi 304 mg/L olmustur.

Fermantasyon sivisinin pH degeri, fosforik asidin eklenmesiyle 6.5'e ayarlanmistir. mikroorganizmalarin etkisiz hale getirilmesine yönelik olarak 1 saat boyunca bu sicaklikta muhafaza edilmistir. Fermentörler daha sonra organik bir solvent ile ekstraksiyona yönelik olarak 30 ile 40°C arasinda sogutulmustur. Örnek 3 (karsilastirmali): Ansamitosinlerin ekstraksiyonu ve Kromatografik Saflastirmasi. Örnek 2'de yer alan fermantasyon sivisi, esit hacimli bir n-bütil asetat ile karistirilmistir. Karisim 30 ile 40°C ila 45°C'de muhafaza edilmistir ve iki fazin karistirilmasinin yalnizca solvent arayüzünde ortaya çikmasi amaciyla yavasça karistirilmistir. Ekstraksiyon 5 gün boyunca veya ansamitosinlerin % 80'inin ekstrakte edildiginin belirtildigi organik katmanin HPLC analizi gerçeklestirilene kadar devam etmistir. Organik katman daha sonra ayristirilmistir ve düsen film evaporatörü kullanilarak 20 ile 50 L arasindaki bir nihai hacme buharlastirilmistir. Konsantre ekstrakt, 2.2 kg silika jelini içeren bir siseye aktarilmistir. Ham ansamitosinler, indirgenmis basinç altinda çalisan bir döner buharlastirici kullanilarak solventin kuruyana kadar buharlastirilmasiyla silika jel üzerine kaplanmistir. Kaplanmis silika daha sonra Blotage, Inc., Charlotesville, VA'dan tedarik edilen bir numune enjeksiyon modülüne (SlM) aktarilmistir. SlM, sikloheksan ve heksan karisimi ile yikanmistir (211 v/v), ve daha sonra bir silika kartusu ile donatilan bir Biotage 150M sistemine baglanmistir. Istenen ürün etil asetatheksanzmetanol (29.4:68.6:2.0, v/v/v) karisimi kullanilarak kolondan ayristirilmistir. Ansamitosin içeren fraksiyonlar toplanmistir ve solvent, indirgenmis basinç altinda buharlastirilmistir. Ürün ayrica, 24 saat boyunca yüksek vakum altinda kurutulmustur.

Referans Örnek 4:Ansamitosionlerin yeniden kristallesmesi.

Yukarida belirtilen adimdaki kuru ürün, sicak etil asetat (23 ml/g kalinti) içerisinde çözülmüstür. Karisim, ansamitosinler tam olarak çözülene kadar 60- 75 °C arasinda muhafaza edilmistir. Heptan (80 mL/g kalinti), yiginin sicakligi 60-75°C'de muhafaza edilirken yavas bir sekilde eklenmistir. Tüm heptanin eklenmesinin ardindan yiginin oda sicakligina sogutulmasina olanak saglanmistir. Kristaller filtrasyon araciligiyla geri kazanilmistir ve akabinde 221 gram saf ansamitosinin saglanmasi amaciyla yüksek vakum altinda kurutulmustu r. Örnek 5 (karsilastirmali):Filtrasyonlu fermantasyon sivisinin ekstraksiyonu. Örnek 2'de açiklandigi üzere hazirlanan fermantasyon sivisi (200 ml), 200 ml n- bütil asetat (200 ml) ile 5 dakika boyunca kuvvetli bir sekilde karistirilmis, bir emülsiyon ile sonuçlanmistir. Cellatom FW-80 filtre destegi (209) eklenmistir ve karisim, Cellatom FW-8O filtre destegiyle önceden kaplanmis olan bir buchner hunisi boyunca vakum ile filtrelenmistir. Filtre çamuru, 40 mL n-bütil asetat ile yikanmistir. Hâlihazirda kati kirleticilerden arindirilan, bir temiz organik ve aköz katmani içeren filtrat, bir ayirma hunisine aktarilmistir. Aköz faz bosaltilmistir.

Ansamitosinleri içeren organik faz tutulmustur. Örnek 6 (karsilastirmali):Fermantasyon sivisinin suyla karismayan bir solvent kullanilarak ekstraksiyonu. Örnek 2'de açiklandigi üzere hazirlanan fermantasyon sivisinin bir kismi, n-bütil asetatin bir kismi ile 2 dakika boyunca kuvvetli bir sekilde karistirilmistir. Elde edilen emülsiyon 1 dakika boyunca santrifüjlenmistir ve kati kirletici maddeleri içermeyen ansamitosinleri içeren organik katman geri çekilmistir. Örnek 7 (karsilastirmali):Fermantasyon sivisinin su ile karismayan bir solvent kullanilarak ekstraksiyonu. Örnek 2'de açiklandigi üzere hazirlanan fermantasyon sivisinin bir kismi asetonun bir parçasi ile kuvvetli bir sekilde karistirilmistir. Karisim, katilarin peletlenmesi amaciyla 1 dakika boyunca santrifüjlenmistir. Süpernatant geri çekilmistir ve heksanlarin bir yari parçasi ile karistirilmistir. Aköz katman, ansamitosinleri içeren temiz bir organik fazi birakarak ayristirilmistir. ÖRNEK &Ansamitosinlerin XAD-16 hidrofobik boncuklar kullanilarak kati faz ekstraksiyonu. Örnek 2'de açiklandigi üzere hazirlanan bir litre fermantasyon sivisi, alti saat boyunca 10 gram XAD-16 boncuk ile karistirilmistir. Karisim daha sonra santrifüjlenmistir ve süpernatant kaldirilmistir. Pelet, küçük bir kolona aktarilmistir ve akabinde 90:10 deiyonize suzasetonitrili izleyerek deiyonize su ile ayristirilmistir. Ansamitosinleri içeren fraksiyonlar kombine edilmistir ve solvent, 112 mg konsantre ekstraktin saglanmasi amaciyla buharlastirilmistir.

HPLC analizi, 50 mg ansamitosini içeren ekstrakti ifade etmistir.

Bulus ayrintili olarak ve bunlarin spesifik düzenlemelerine verilen referans ile açiklanirken, teknikte uzman kisilerce, burada çesitli degisikliklerin ve modifikasyonlarin yapilabilecegi anlasilacaktir.

Claims (1)

ISTEM LER

1. Saflastirilmis ansamitosinlerin hazirlanmasina yönelik bir proses olup, özelligi asagidaki adimlari içermesidir: i. bir sivi kültür ortaminda ansamitosin üreten bir mikroorganizmanin kültürlenmesi; ii. ansamitosinlerin kültür ortaminda bir reçineye kati fazli olarak ekstrakte edilmesi; iii. organik bir solvent veya su ile kombine bir organik solvent kullanilarak reçineden ansamitosinlerin izokratik veya gradyan elüsyonu; iv. ekstrakte edilen ansamitosinlerin konsantre hale getirilmesi ve vi. ansamitosinlerin asagidaki a), b), c) ve d)'den herhangi biri araciligiyla istege bagli olarak saflastirilmasi: a. silika jel veya alümina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi, b. kristallesme, C. ardindan kristallesmenin geldigi silika jeli veya alümina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi ve d. silika jeli veya alumina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi tarafindan izlenen kristallesme; ve burada söz konusu ansamitosinler, asagidaki yapiya ait bilesiklerin bir karisimini içerir: burada R, COCHs, COCH2CH3, COCH(CH3)2, COCH2CH2CH3, COCH2CH(CH3)2 veya COCH2CH2CH2CH3'dIr. . istem 1'e göre proses olup, özelligi ekstrakte etme isleminin, 6 ila 7 pH degerinde ve/veya 30 °C ila 45 °C'deki bir sicaklikta gerçeklestirilmesidir. . istem 1 veya istem 2'ye göre proses olup, özelligi ansamitosin üreten mikroorganizmalarin Actinosinnema spp veya Actinosinnema pretiosum olmasidir. .istem 3'e göre proses olup, özelligi ansamitosin üreten mikroorganizmalarin Actinosinnema pretiosum ATCC 31565 veya bundan türetilen bir sus veya Actinosinnema pretiosum PF4-4 (ATCC FTA-3921) veya bundan türetilen bir sus olmasidir. . Istemler 1-3'ten birine göre proses olup, özelligi söz konusu kültürleme isleminin, 6.5 ila 8 veya 7 ila 7.4 veya 7.2 araliginda bir pH degerinde olmasidir ve/veya burada sicaklik 15 °C ila 35 °C veya 25 °C ila 30°C veya 28 °C araligindadir. . Istem 5'e göre proses olupi özelligi sicakligin 28°C ve pH degerinin 7.2 olmasidir. . Istemler 1-6'dan herhangi birine göre proses olup, özelligi en az bir besin maddesinin söz konusu kültürleme esnasinda saglanmasidir. . Istem 7'ye göre proses olup, özelligi en az bir besin maddesinin bir karbon kaynagi olmasidir. . istem 8'e göre proses olup, özelligi karbon kaynaginin glikoz olmasidir. 10.Istem 8 veya 9'a göre proses olup, özelligi en az bir besin maddesinin, bir protein besin maddesinin izledigi bir karbon kaynagi olmasidir. 11.Istem 10'a göre proses olup, özelligi protein besin maddesinin pamuk tohum unu veya soya unu olmasidir. 12.Istemler 7-11'den herhangi birine göre proses olup, özelligi bunun ayrica, ansamitosinin bir C-3 ester yan zincirinin olusumunu kolaylastiran bir alkol veya bir aldehitin kültürlenmesi sirasinda saglanmasidir. 5 13.Istem 12'ye göre proses olup, özelligi aldehit veya alkolün, izobütanol, izobütraldehit, n-bütanol, n-bütiraldehit, n-propanol, n-propionaldehit, izopropanol, izopropionaldehit, pentanol, valeraldehit, izopentanol ve izovaleraldehit içeren gruptan seçilmesidir. 10 14.Istemler 1-13'ten herhangi birine göre proses olup, özelligi ayrica asagidaki adimlardan bir veya daha fazlasini içermesidir: i. kültür ortamindaki mikroorganizmalarin kimyasal veya isi ile etkisiz hale getirme islemi ile etkisiz hale getirilmesi; ve ii. organik solventteki ansamitosinlerin bir ham solüsyonunun, 15 herhangi bir sirali kombinasyonda olmak üzere su, bir aköz tuz solüsyonu, bir aköz asidi veya bir aköz baz ile yikandigi, saflastirma esnasinda gerçeklestirildiginde çökelmenin öncesinde veya sonrasinda gerçeklestigi yikama islemi.