TR201910320T4 - Karaciğer organoidi, kullanımları ve elde edilmesine yönelik kültür yöntemi. - Google Patents

Abstract

Buluş, bir karaciğer organoidi, kullanımları ve elde edilmesine yönelik yöntemler ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME KARACIGER ORGANOIDI, KULLANIMLARI VE ELDE EDILMESINE YÖNELIK KÜLTÜR YÖNTEMI BULUSUN ALANI Bulus, bir karaciger organoidi, kullanimlari ve elde edilmesine yönelik yöntemler ile ilgilidir. BULUSUN ARKA PLANI Karaciger temel yapisal birimi, karaciger lobülüdür. Her bir lobül, merkezi bir efferent vene dogru yayilan sinüzoidal kilcal damarlarla kapli hepatosit plakalarindan olusur. Karaciger lobülleri, bir portal triad (portal ven, safra kanali ve hepatik arter) varligiyla sinirlandirilmis alti köse ile birlikte kabaca altigendir. Hepatositler, karacigerin ana parankimal hücre tipi olmasina ragmen, kolanjiyositler (safra epitel hücreleri), endotel hücreleri, sinüzoidal endotel hücreleri, Kupffer hücreleri, dogal öldürücü hücreler ve hepatik yildiz hücreler ile uyum içinde çalisirlar. Bu karmasik yapi, hepatik fonksiyon için çok önemlidir. Karaciger kök hücrelerinin varligi tartismali bir konudur. Bir taraftan, karacigerde doku muhafazasi ve bazi hasar türlerinin ardindan karaciger rejenerasyonu, kök hücreler tarafindan degil, olgun hücrelerin (hepatositler veya kolanjositler) bölünmesiyle tahrik edilir. Ancak hepatosit çogalmasinin inhibe edildigi karaciger hasari modellerinde ayrica, hasara yanit olarak organin kendini yenileyebilme özelligi görülmüstür. Bu, karacigerin fakültatif kök hücreler içeren bir organ olarak kabul edilebilecegini gösterir. Simdiye kadar, hepatositlerden veya Embriyonik Kök hücrelerin (ES) veya indüklenmis Pluripotent Kök Hücrelerin farklilasmasiyla türetilen karaciger kültürleri genislemez ve uzun süre kendi kendine yenilenmezdi. Yakin zamanda, ince bagirsakta, Paneth hücreleri arasina serpistirilmis küçük hücreler olan döngülü Kript tabanli silindirik hücrelerde (Crypt Base Columnar (CBC)) spesifik olarak eksprese olan Lgr5 geni tespit edilmistir (Barker ve dig., indüklenebilir Cre rekombinaz kasetinin Lgr5 lokusuna katildigi bir fare kullanilarak, soy takibi yoluyla Cre indüksiyonundan 14 ay sonra degerlendirildiginde bile Lgr5+ CBC hücrelerinin tüm epitel hücre tiplerini üreten multipotent kök hücreleri olusturdugu görülmüstür. Yakin zamanda ayrica, Lgr5'in yaninda Lgr6'nin da eriskin kök hücreler için essiz bir markör oldugu, ancak Lgr4 için bu durumun söz konusu olmadigi kesfedilmistir. Lgr5; beyin, böbrek, karaciger, retina, mide, bagirsak, pankreas, meme, kil folikülü, yumurtalik, adrenal medulla ve cilt kök hücrelerinde eksprese olurken, Lgr6; beyin, akciger, meme, kil folikülü ve cilt kök hücrelerinde eksprese olur. Burada, eriskin karaciger progenitörlerini kültürlemeye ve daha uzun ömürlü muhafazasini gösteren, hem hepatosit hem kolanjiyosit soylarini ayirt edebilen ve izole karaciger fragmanlarinin temel fizyolojisini koruyabilen bir karaciger organoidi elde etmeye yönelik bir yöntem gelistirdik. BULUSUN ÖZETI Bulus, bir karaciger organoidi elde etmeye yönelik bir yöntemdir ve söz konusu yöntem asagidakileri içerir: bir genisleme ortami varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde olan bir veya daha fazla karaciger epitel kök hücresinin veya bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger safra kanalinin kültürlenmesi ve söz konusu ortamin, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içermesi: epidermal büyüme faktörü (EGF), FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir fibroblast büyüme faktörü (FGF), Nikotinamid ve Rspondin l, Rspondin 2, Rspondin 3 veya Rspondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonisti. Bulus ayrica, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içeren bir hücre kültürü ortami saglar: EGF, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir FGF, Nikotinamid ve R-spondin l, R-spondin 2, Rrspondin 3 veya R- spondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonisti. Bulus ayrica, bir genisleme ortami varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde olan bir veya daha fazla karaciger epitel kök hücresinin veya bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger safra kanalinin kültürlenmesiyle elde edilebilir, Lgr5 eksprese eden hücreleri içeren bir karaciger organoidi saglar ve söz konusu ortam, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir` bazal ortami içerir: epidermal büyüme faktörü (EGF), FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir fibroblast büyüme faktörü (FGF), Nikotinamid. ve Rspondin 1, Rspondin 2, Rspondin 3 veya Rspondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonisti ve burada söz konusu karaciger organoidi, en az 3 ay boyunca kültürlenebilir. Bulus ayrica, bulusa ait bir karaciger organoidinin bir ilaç kesif taramasinda kullanimini saglar. Bulus ayrica, bulusa ait bir karaciger organoidinin bir toksisite analizinde kullanimini saglar. Bulus ayrica, bir karaciger bozuklugu, durumu veya hastaliginin tedavisinde veya rejeneratif tipta kullanilmaya yönelik bulusa ait bir karaciger organoidi saglar. TARIFNAMENIN KISA AÇIKLAMASI Bulus, bir karaciger organoidi elde etmeye yönelik bir yöntem ile ilgilidir ve söz konusu yöntem, hücrelerin bir birinci kültürlenmesini ve tercihen ardindan bir ikinci "farklilasma" kültür ortaminda (burada DM olarak da anilacaktir) kültürlenmesini içerir. Karaciger organoidi, bir tekli Lgr5+ kök hücresinin, en az bir Lgr5 kök hücresi içeren bir hücre popülasyonunun ve/veya bir karaciger fragmaninin kültürlenmesiyle elde edilebilir. Burada tekli Lgr5+ kök hücresini, en az bir Lgr5+ kök hücresi içeren bir hücre popülasyonu ve/Veya bir karaciger fragmani anlamina Bir uygulamada genisleme ortami EGF, bir Wnt agonisti, FGF ve Nikotinamid içerir. Tercihen Wnt agonisti, R-spondin l'dir ve bu nedenle genisleme ortami "ERFNic" olarak ifade edilir. Özellikle tercih. edilen bir genisleme ortami ayrica HGF'yi içerir ve Bir uygulamalarda farklilasma ortami, EGF, bir TGF-beta inhibitörü, FGF ve bir Çentik inhibitörü içerir. Bir uygulamada TGF-beta inhibitörü, A83-Ol'dir ve/veya Çentik inhibitörü, DAPT'dir. Bu farklilasma ortami burada "EAFD" olarak ifade edilir ve bulusa ait tercih edilen bir farklilastirma ortamidir. FGF, istege bagli olarak HGF ile degistirilebilir veya alternatif olarak hem FGF hem HGF, farklilasma ortaminda mevcut olabilir veya olmayabilir. Deksametazon da eklenebilir. Tercih edilen bir uygulamada hücreler ilk olarak, ayrica Wnt ve Noggin, örnegin EGF içeren bir "ENRW" ortami, R-spondin ve Wnt ve ayrica FGF, HGF ve Nikotinamid içeren bir genisleme ortaminda kültürlenebilir Bulus sahipleri, bu ortamin, ilk birkaç gün boyunca hücrelerin ilk genislemesinin uyarilmasi için en uygun ortam oldugunu bulmustur. Bu nedenle, bu birinci genisleme ortami, bazen burada EMI olarak ifade edilir. Bazi uygulamalarda Wnt ve Noggin, yaklasik 1 gün, 2 gün, 3 gün, 4 gün, 5 gün, 6 gün, 7 gün veya daha fazla, örnegin 2 hafta, 1 ay, 2, 3, 4, 5, süre sonra çikarilir. Hücreler daha sonra, Wnt veya Noggin içermeyen, yukarida tarif edildigi gibi bulusa ait bir genisleme ortaminda genisletilebilir. Bu ikinci genisleme ortami, bazen burada EMZ olarak ifade edilir. Bazi uygulamalarda hücreler, EMZ içinde, yaklasik 1 gün, 2 gün, 3 gün, 4 gün, 5 gün, 6 gün, 7 gün veya daha uzun süre, örnegin 3, 4, 5, 10, 20 veya daha fazla hafta süreyle kültürlenir. Kültür ortami daha sonra bir TGF-beta inhibitörü ve bir Çentik inhibitörü içeren, yukarida tarif edildigi gibi optimize edilmis farklilasma ortami ile degistirilebilir. Tipik olarak farklilasma ortami, bir Wnt agonisti, R-spondin 'veya `Nikotinamid. içermez. Bu, hücrelerin olgun hepatositlere ve kolanjiyositlere dogru farklilasmasini tesvik eder. Bu hücreler, insanlara veya hayvanlara nakil için uygundur. Bulus ayrica, bir karaciger` organoidi ile ilgilidir. Mevcut basvuruda, ilk defa karaciger organoidlerinin ex Vivo olarak büyümüs oldugu tarif edilir. BULUSUN AÇIKLAMASI Bir birinci görünümde bulus, bir karaciger organoidi elde etmeye yönelik bir yöntemdir ve söz konusu yöntem asagidakileri içerir: bir ortam varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde olan bir veya daha fazla karaciger epitel kök hücresinin veya bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger safra kanalinin kültürlenmesi ve söz konusu ortamin, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içermesi: Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen FGF, tercihen bir mitojenik büyüme faktörü olarak FGFlO, Nikotinamid ve R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3 veya R-spondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonisti ve istege bagli olarak Wnt-3a. Tercihen HGF de eklenir. Örnegin bir uygulamada bulus, bir karaciger organoidi elde etmeye yönelik bir yöntemdir ve söz konusu yöntem asagidakileri bir ortam varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde bir veya daha fazla karaciger epitel kök hücresinin veya bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger safra kanalinin kültürlenmesi ve söz konusu ortamin, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içermesi: bir BMP inhibitörü, R-spondin 1, R-spondin 2, R- spondin 3 veya R-spondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonisti, Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir FGF, tercihen mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF, gastrin, Nikotinamid, B27, N2 ve N-Asetilsistein. Sasirtici bir sekilde mevcut bulus sahipleri, bulusa ait bir yöntemin, farklilasmamis bir fenotip ve kendi kendine muhafaza özelliklerini koruyan kök hücrelerin varligi muhafaza edilirken, epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu kök hücreleri içeren karacigerden izole edilmis fragmanlarin kültürlenmesini sagladigini bulmustur. Daha da sasirtici olan ise bulusa ait bir yöntemin, bir tekli, izole edilmis epitel kök hücresinin, bir kök hücre nisi olmadan bir karaciger organoidin içine dogru fazla büyümesini saglamasidir. Kök hücreler, eriskin insanlarin ve farelerin birçok organinda bulunur. Her bir dokuda eriskin kök hücrelerin kesin özellikleri arasinda büyük farkliliklar olmasina ragmen, eriskin kök hücreler en azindan asagidaki özellikleri paylasir: farklilasmamis bir fenotipi korurlar; onlarin soylari, ilgili dokuda bulunan tüm soylara dogru farklilasabilir; yasami boyunca kendi kendine muhafaza özelliklerini korurlar ve hasardan sonra uygun dokuyu yenileyebilirler. Kök. hücreler, söz konusu kök hücre popülasyonunun muhafazasi için uygun hücre-hücre temaslarini ve sinyallerini saglayan özel bir lokasyonda, kök hücre nisinde bulunur. Epitel kök hücreler, epitelden olusan farkli hücre tiplerini olusturabilir. Cilt ya da bagirsak gibi bazi epitellerde hizli hücre döngüsü görülür ve bu da var olan kök hücrelerin sürekli çogalmasi gerektigini gösterir. Karaciger veya pankreas gibi diger epiteller normal kosullar altinda çok yavas bir döngüye sahiptir. Karaciger epitel kök hücrelerinin izolasyonu, birkaç farkli protokolle gerçeklestirilebilir. Bulus sahipleri herhangi bir teoriye bagli kalmak istememekle birlikte, burada, doku hasarinin ardindan karacigerde bulunan bir kök hücre popülasyonunun karaciger rejenerasyonundan sorumlu oldugu hipotezini ileri sürmektedir. Söz konusu hasara yanit veren rejenerasyondan sorumlu hücre popülasyonunun, aktive edildiginde Lgr5 markörünü eksprese ettigi düsünülür. Karaciger hasarini taklit etmek için Lgr5-LacZ knock-in farelerine hepatotoksik bilesik CCl4 enjekte ederek, bulus sahipleri, ilk defa karaciger hasarinin karacigerde aktif rejenerasyon alanlarinda Lgr5 ekspresyonunu indükledigini göstermistir (bkz. örnek 4). Bulus sahipleri ayrica, Wnt agonisti R-spondin enjeksiyonunun, karaciger kanallarinda Wnt sinyali ekspresyonunun yukari dogru regülasyonuna neden olur. Bulus sahipleri herhangi bir teoriye bagli kalmak istememekle birlikte, burada, rejeneratif kök hücrelerin/progenitörlerin, karaciger hasarindan sonra Wnt sinyali ile aktive edilebilecegi hipotezini ileri sürmektedir. Lgr5 pozitif hücreler daha sonra gerekmesi halinde burada tarif edildigi gibi karaciger/karaciger fragmanindan izole edilebilir. Bu nedenle mevcut açiklama, karaciger hasarinin indüklenmesini içeren veya Wnt sinyalinin uyarilmasi yoluyla, örnegin Respondin ile karacigerden Lgr5+ hücrelerinin elde edilmesine/izole edilmesine yönelik bir yöntemi tarif eder. Bazi uygulamalarda Lgr5+ hücreleri, in vitro karaciger organoidlerinin elde edilmesi için baslangiç noktasi oldugundan bu yararlidir (bulusa ait bir kültür ortaminin kullanimi, bir Wnt agonistinin, örnegin R-spondin'in eklenmesiyle bir Lgr5+ hücresinin olusmasini saglamasina ragmen bu sekildedir ve bu nedenle, mevcut bulusu uygulamak için bir Lgr5+ hücresinin elde edilmesi sart degildir). Bu yöntemle elde edilen Lgr5+ hücreleri de saglanir. Bazi uygulamalarda bu hücreler tercihen, yildiz hücre Harkörlerini, örnegin SMA'yi eksprese etmez. Bunun yerine, bu hücreler tercihen, bir veya daha fazla karaciger progenitör markörü veya kök hücre markörü, örnegin Sox9'u eksprese eder. Tercihen. bir veya daha fazla karaciger progenitör markörünün veya kök hücre markörünün, örnegin Sox9'un ekspresyonu, eriskin karacigere kiyasla söz konusu hücrelerde yukari dogru regüle edilir. Mevcut açiklama ayrica, Wnt sinyalinin uyarilmasini içeren, karacigerin rejenere edilmesine yönelik bir yöntemi tarif eder. Söz konusu yöntem, karaciger bozukluklarinin tedavisinde faydali olabilir. Karaciger hücrelerinde Lgr5 ekspresyonunun hasar veya Wnt sinyalinin uyarilmasi yoluyla indüksiyonu, izole edilmis bir karaciger in vivo, ex vivo veya bir karaciger fragmaninda veya bir karaciger hücresi popülasyonunda in vitro gerçeklestirilebilir. Lgr5 ekspresyonunun indüksiyonunun ex vivo veya in vitro gerçeklestirildigi uygulamalarda, Lgr5 pozitif hücreler, ihtiyaci olan bir hastaya uygun herhangi bir yolla, örnegin enjeksiyon veya implantasyon yoluyla uygulanabilir. Bazi uygulamalarda implante edilmis hücreler, biyouyumlu matris içinde bulunur. Bazi uygulamalarda hücreler, terapide kullanilmadan önce ex Vivo olarak genisletilir. Bulusun tercih edilen. bir yönteminde, söz konusu epitel kök hücreleri, bir karaciger fragmanindan veya bir karaciger safra yolundan, daha çok tercihen safra kanali dokusundan izole Safra kanali dokusunun izole edilmesine yönelik yöntemler, teknikte uzman kisilerce iyi bilinir. Örnegin safra kanali, burada yer alan örneklerde tarif edildigi gibi bir karacigerden izole edilebilir. Kisaca bir eriskin karaciger dokusu, bir soguk (4-lO°C) kültür ortaminda, tercihen Advanced-DMEM/Flz (Invitrogen) içinde yikanabilir ve daha sonra doku, yaklasik 5 mm'lik parçalar halinde kesilebilir ve ardindan soguk ayrisma tampon (DMEM ortaminda kollajenaz, dispaz, FBS) ile yikanabilir. Doku fragmanlari tercihen, yaklasik 37°C'de yaklasik 2 saat süreyle ayrisma tamponu ile inkübe edilir. Daha sonra doku fragmanlari, bir 10 ml pipet ile 10 ml'lik soguk (4-10°C) izolasyon tamponunda kuvvetlice süspanse edilebilir. Ölü hücreleri içeren birinci üst faz tercihen atilir ve tortu tercihen ayrisma tamponu (örn. 10-15 ml) ile süspanse edilir. Doku fragmanlarinin siddetli süspansiyonundan sonra üst faz, safra kanallarinda zenginlestirilir. Safra kanallarini içeren bir süspansiyon bu sekilde elde edilebilir ve safra kanallari, mikroskop altinda toplanir ve soguk ortamda (DMEM + % tutulur. Bu prosedür, en az 10-20 safra kanali/kuyucuk toplanana kadar tekrar edilebilir. Daha sonra izole edilmis safra kanallari çökeltilebilir. Izole edilen safra yollari tercihen yaklasik 20 safra kanali/kuyucuk oraninda 50ul matrigel içine Kisa bir sürede konflüansa ulasacak kadar büyüyen olgun hepatositlerin aksine, ölmeden önce mevcut açiklamaya göre izole edilmis karaciger epitel kök hücreleri, kendi kendini yeniler ve süresiz olarak büyür. Kendi kendini yenileyen hücre popülasyonunun, yüzeyinde LgrS'i eksprese edebildigi bulunmustur. Lgr5 negatif hücreler, kendi kendini yenilemez. orijinal çogalmasini ve farklilasma özelliklerini korurken bir hücrenin kendisini tekrar üretme kapasitesini temsil edecek sekilde anlasilmalidir. Bu hücreler ayrica, klonlar olusturacak sekilde bölünerek çogalir ve ayrica klonlara bölünür ve böylece dis müdahaleye gerek kalmadan, daha sinirli bir farklilasma potansiyeline sahip hücrelere evrimlesmeden hücre popülasyonunun boyutunu genisletir. Tercih edilen bir yöntem, bulusa göre karaciger kök hücrelerinin, yüzeyinde Lgr5 ve/Veya Lgr6 eksprese etmesine dayanir; bu proteinler, büyük G proteinine bagli reseptör (GPCR) süper ailesine aittir (bkz. örn. içerigi bütünüyle buraya dahil baglanmasi için Önemli lösin bakimindan zengin büyük bir ektodomen tasima konusunda benzersizdir. Bu nedenle tercih edilen bir yöntem, yukarida tarif edildigi gibi söz konusu epitel dokusundan bir hücre süspansiyonunun hazirlanmasini, söz konusu hücre süspansiyonunun bir Lgr5 ve/veya 6 baglayici bilesik (örnegin bir antikor) ile temas ettirilmesini, Lgr5 ve/Veya 6 baglayici bilesigin izole edilmesini ve söz konusu baglayici bilesikten kök hücrelerin izole edilmesini içerir. Epitel kök hücrelerini içeren bir tek hücre süspansiyonunun, izole edilmis safra kanalindan mekanik olarak olusturulmasi tercih edilir. Bu sekilde olusturulan küçük organoid fragmanlari, tercihen yaklasik l:6 oraninda bölünür. Gerekli olmasi halinde bu fragmanlar, kisa bir süre (sadece 2 veya 3 dakika) yaklasik l:2 oraninda bir seyreltmede tripsin içinde inkübe edilebilir. Bu asamada tripsin ile muamele edilmis epitel kök hücrelerin oldukça düsük sagkalim orani verdigi görülmüstür: hücrelerin, ayri ayri hücrelere ayrilmasi halinde yalnizca Lgr5 eksprese edenler sag kalmistir. Bu oran oldukça küçüktür (toplam hücre popülasyonunun yaklasik% lZ'si). Tercih edilen Lgr5 ve/veya 6 baglayici bilesikler antikorlari, örnegin Lgr5 ya da Lgr6'nin hücre disi domenini spesifik olarak taniyan ve buna baglanan monoklonal antikorlari, örnegin fare ve siçan monoklonal antikorlari dahil olmak üzere monoklonal antikorlari içerir (bkz. içerigi buraya bütünüyle dahil edilmis WOZOlO/Ol6766 sayili yayin). Böyle bir antikor kullanilarak Lgr5 ve/veya Lgr6 eksprese eden kök hücreler, teknikte yetkin kisi için açik oldugu gibi örnegin manyetik boncuklarin yardimiyla veya floresan ile aktiflestirilmis hücre ayirma yoluyla izole edilebilir. Açiklamanin bir yöntemin kullanilmasiyla, Lgr5 ve/Veya Lgr6'yi eksprese eden tek bir hücrenin izole edilmesi ve bulusa ait bir yöntemin buna uygulanmasi mümkündür. Bir karaciger organoidi, bir tek hücreden türetilebilir. Kök Hücre Nisi Izole edilmis kök hücreler tercihen, söz konusu kök hücrelerin dogal olarak içinde bulundugu bir hücresel nisi en azindan kismen taklit eden bir mikro ortamda kültürlenir. Söz konusu hücresel nis, söz konusu kök hücrelerin, kök hücre kaderini kontrol eden temel düzenleyici sinyalleri temsil eden matrisler, iskeleler ve kültür substratlari gibi biyolojik materyallerin varliginda kültürlenmesiyle taklit edilir. Söz konusu biyomalzemeler, dogal, yari sentetik ve sentetik biyomalzemeleri ve/Veya bunlarin karisimlarini içerir. Bir iskele, iki boyutlu veya üç boyutlu bir ag saglar. Söz konusu iskele için uygun sentetik malzemeler, gözenekli katilar, nanofiberlery ve hidrojeller, örnegin kendi kendine toplanan peptidler de dahil olmak üzere peptitler, polietilen glikol fosfat, polietilen glikol fumarat, poliakrilamit, polihidroksietil metakrilat, poliselüloz asetat ve/Veya bunlarin kopolimerlerinden olusan hidrojeller arasindan seçilen polimerleri içerir (bkz. örn. Saha ve dig., 2007. Curr 1796). Teknikte uzman kisilerce bilindigi gibi, iskelet esnekligi gibi mekanik özellikler, kök hücre çogalmasini, farklilasmasini ve göçünü etkiler. Tercih edilen bir iskele, örnegin doku rejenerasyonunu ve/veya yara iyilesmesini tesvik etmek üzere bir denege nakil edilmesinden sonra dogal olarak olusan bilesenlerle degistirilen, biyolojik olarak parçalanabilir (ko)polimerleri içerir. Ayrica, söz konusu iskelenin, bir denege nakil edilmesinden sonra anlamli ölçüde immünojenik bir tepki saglamamasi tercih. edilir. Söz konusu iskele, kök hücrelerinin çogalmasi ve/veya farklilasmasi ve/veya göçü için gerekli sinyaller saglayan dogal, yari sentetik veya sentetik ligantlarla desteklenir. Tercih edilen bir uygulamada, söz konusu ligantlar, tanimlanmis amino asit fragmanlari içerir. Söz konusu sentetik polimerlerin örnekleri arasinda Pluronic® F ve Ethisorb® (Johnson and Johnson) bulunur. Bir hücresel nis, kismen kök hücreler ve kök hücreleri çevreleyen hücreler ve hücreler tarafindan söz konusu nis içerisinde üretilen hücre disi matris (ECM) tarafindan belirlenir. Bulusun tercih edilen bir yönteminde, izole edilmis karaciger fragmanlari veya izole edilmis safra kanali veya epitel kök hücreler, bir ECM'ye baglanir. ECM, çesitli polisakkaritler, su, elastin ve glikoproteinlerden olusur; burada glikoproteinler, kolajen, entaktin (nidojen), fibronektin ve laminin içerir. ECM, bag dokusu hücreleri tarafindan salgilanir. Farkli tipte glikoprotein ve/Veya farkli glikoprotein kombinasyonlari dahil olmak üzere farkli bilesimler içeren farkli tipte ECM'ler bilinir. Söz konusu ECM, hücreler çikarilmadan önce ve izole edilmis karaciger fragmanlari veya izole edilmis safra kanali veya izole edilmis epitel kök hücreleri eklenmeden önce, bir kap içinde, fibroblast hücreleri gibi ECM üreten hücrelerin kültürlenmesiyle saglanabilir. Hücre disi matris üreten hücrelerin örnekleri, esas olarak kolajen ve proteoglikan üreten kondrositler, esas olarak tip IV kollajen, laminin, interstisyel prokolajen ve fibronektin üreten fibroblast hücreleri üreten kondrositler ve esas olarak kolajen (tip I, III ve V), kondroitin sülfat proteoglikan, hiyalüronik asit, fibronektin ve tenascin- C üreten kolonik Hdyofibroblastlardir. Alternatif olarak söz konusu ECM, ticari olarak saglanir. Ticari olarak temin edilebilen hücre disi matris örnekleri arasinda hücre disi matris proteinleri (Invitrogen) ve Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücrelerinden (örn. MatrigelTM (BD Biosciences)) elde edilen bazal membran preparasyonlari bulunur. ProNectin (Sigma 2378666) gibi bir sentetik hücre disi matris malzemesi kullanilabilir. Arzu edildigi takdirde, hücre disi matris malzemelerinin karisimlari kullanilabilir. Kök hücrelerin kültürlenmesi için bir ECM'nin kullanilmasi, kök hücrelerinin uzun süreli sagkalimini ve farklilasmamis kök hücrelerin varligini sürdürmesini arttirmistir. Bir ECM'nin yoklugunda, kök hücre kültürleri daha uzun süre kültürlenememis ve farklilasmamis kök hücrelerin varliginin devam ettigi gözlemlenmemistir. Buna ek olarak, bir ECM'nin varligi, bir ECM'nin yoklugunda kültürlenemeyen üç boyutlu doku organoidlerinin kültürlenmesini saglamistir. Hücre disi matris malzemesi, normalde bir hücre kültürü kabinin üzerine kaplanir, ancak (buna ek olarak veya alternatif olarak) çözelti halinde saglanabilir. Yaklasik 1 mg/ml'lik veya yaklasik 1 ug/cm2 ile yaklasik 250 ug/CHF arasinda veya yaklasik 1 ug/CHF ile 150 ug/cm2 arasinda bir fibronektin çözeltisi, bir hücre kültürü kabinin kaplanmasi için kullanilabilir. Bazi uygulamalarda, bir hücre kültür kabi, 8 ug/cnß ve 125 ug/CHF arasinda fibronektinle kaplanir. Bulusun bir yönteminde kullanilmak üzere tercih edilen bir ECM, iki farkli kolajen türü veya bir kolajen ve laminin gibi en az iki farkli glikoprotein içerir. ECM, sentetik bir hidrojel hücre disi matrisi veya dogal olarak olusan bir ECM olabilir. Tercih edilen baska bir ECM, laminin, entaktin ve kollajen IV içeren MatrigelTM (BD Biosciences) tarafindan saglanir. Bulusun bilesimleri, serum içerebilir veya burada baska bölümlerde tarif edildigi gibi serum ve/Veya serum replasmani içermez. Kültür ortami ve hücre preparasyonlari tercihen, FDA tarafindan biyoloji ürünlere yönelik olarak ve ürün tutarliligini saglamak için talep edilen standartlara uygun GMP prosesleridir. Kültür ortami Bulusun bir yönteminde kullanilan bir hücre kültürü ortami, burada saglanan sinirlamalara tabi olan herhangi bir uygun hücre kültürü ortamini içerir. Hücre kültürü ortami tipik olarak kültürlenmis hücrelerin muhafazasini desteklemek için gereken çok sayida bilesen içerir. Bilesenlerin uygun kombinasyonlari, asagidaki açiklamayi hesaba katarak, uzman kisi tarafindan kolayca formüle edilebilir. Bulusa uygun bir kültür ortami genel olarak, amino asitler, vitaminler, inorganik, tuzlar, karbon enerji kaynagi ve asagida ve literatürde daha detayli olarak tarif edilen sekilde bir tampon gibi standart hücre kültürü bilesenlerini içeren bir besleyici çözelti olacaktir. Bulusun bir kültür ortami, normalde iyonsuzlastirilmis, distile edilmis su içinde formüle edilecektir. Bulusa ait bir kültür ortami tipik olarak örnegin mor ötesi isik, isitma, isinlama veya filtrasyon ile kontaminasyonu önlemek için kullanimdan önce sterilize edilecektir. Bir kültür ortami, depolama veya nakil için (örn. -20°C veya -80°C'de) dondurulabilir. Ortam, kontaminasyonu önlemek için bir veya daha fazla antibiyotik içerebilir. Ortam, ml basina 0,1 endotoksin biriminden daha az bir endotoksin içerigine sahip olabilir veya ml basina 0,05 endotoksin biriminden daha az bir endotoksin içerigine sahip olabilir. Kültür ortaminin endotoksin içerigini belirlemeye yönelik yöntemler teknikte bilinir. Tercih edilen bir hücre kültürü ortami, hücreler, %5 ile %10 CO2 veya› en az %5 ve en fazla %10, tercihen %5 COZ içeren› bir atmosferde kültürlenirken 7,4'lük bir pH degerinde (tercihen 7,2 - 7,6 arasinda veya en az 7,2 ve en yüksek 7,6'lik bir pH degeriyle) bir karbonat bazli tamponla tamponlanmis, tanimlanmis sentetik bir ortamdir. Uzman kisi, bulusun hücre kültürü ortamlarinda bazal ortam olarak kullanilabilecek kültür ortami tiplerini, ortak genel bilgilerden anlayacaktir. Potansiyel olarak uygun hücre kültürü ortamlari ticari olarak temin edilebilir ve bu ortamlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Knockout- DMEM (KO-DMEM), Glasgow Minimal Essential Medium (G-MEM), Basal Medium Eagle (BME), DMEM/Ham's F12, Advanced DMEM/Ham's F12, lscove's Modified Dulbecco's Media ve Minimal Essential Media (MEM), Ham's F-lO, Ham's F-12, Medium 199 ve RPMI 1640 Media Tercih edilen bir hücre kültürü ortami, glutamin, insülin, Penisilin/streptomisin ve transferrin ile takviye edilen DMEM/F12 ve RPMI 1640 arasindan seçilir. Tercih edilen baska bir uygulamada, serum içermeyen ortam için optimize edilen ve hali hazirda insülin içeren Advanced DMEM/FlZ veya `Advanced. RPMI kullanilir. Bu durumda söz konusu Advanced DMEM/F12 veya Advanced RPMI ortami, tercihen glutamin ve Penisilin/streptomisin ile takviye edilir. Bazi uygulamalarda bazal ortam, Advanced DMEM F12, hepes, penisilin/streptomisin, Glutamin, NAsetil Sistein, B27, N2 ile Gastrin içerir. Bazi uygulamalarda kültür, N2 ile Gastrin ve penisilin/streptomisin içeren bir bazal ortam ile baslatilir, ancak bunlar daha sonra geri çekilir. Örnegin bazi uygulamalarda, N2 ile Gastrin ve penisilin/streptomisin, bulusa ait bir EM1 ortaminda mevcuttur, ancak bir EM2 veya DM'de mevcut degildir. Örnegin bazi uygulamalarda, N2 ile Gastrin ve penisilin/streptomisin, bulusa ait bir EMl ve EM2 ortaminda mevcuttur, ancak bir DM'de mevcut degildir. Özellikle tercih edilen uygulamalarda bazal ortam, penisilin/streptomisin, N2, B27, glutamin ve gastrin ile takviye edilmis Advanced DMEM/F12 veya bir DMEM varyantidir. Tercih edilen uygulamalarda bazal ortam, Gastrin içerir. Bazi uygulamalarda bazal ortam ayrica NAc ve/veya B27 içerir. Söz konusu hücre kültürü ortami, saflastirilmis, dogal, yari sentetik ve/veya sentetik bir büyüme faktörü ile takviye edilir ve fetal sigir serumu veya fetal buzagi serumu gibi tanimlanmamis bir bilesen içermez. Çesitli farkli serum replasman formülasyonlari ticari olarak temin edilebilir ve uzman kisilerce bilinir. Bir serum replasmani kullanildiginda, konvansiyonel teknikler uyarinca, ortamin hacmine göre yaklasik Genisleme Ortami (EM2): Mevcut bulusun bir görünümünde, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortamini içeren veya bir bazal ortamindan olusan bir hücre kültürü ortami saglanir: Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir` FGF, tercihen bir` mitojenik büyüme faktörü olarak FGFlO, Nikotinamid ve R-spondin l, R-spondin 2, R-spondin 3 ve R-spondin 4, tercihen R-spondin l arasindan seçilen bir Wnt agonisti. Bu ortam, EM2 olarak ifade edilir. Tercihen Wnt agonisti, R-spondin l'dir. EGF, R-spondin l, FGF ve Nikotinamid içeren bir ortam, burada ERFNic olarak ifade edilir. Bazi uygulamalarda EMZ ortami, noggin içermez ve daha tercihen bir BMP inhibitörü içermez. Bazi uygulamalarda EM2 ortami, Wnt, örnegin Wnt-3a içermez. Bazi uygulamalarda HGF, FGF'ye ek olarak mevcuttur. FGF'ye ek olarak HGF içeren tercih edilen bir ortam, ERFHNic'dir (EGF + R- spondin (tercihen R-spondinl) + FGF (tercihen FGF 10) + HGF + Nikotinamid). Bulus sahipleri, ERFHNic ortaminin hücrelerin uzun vadeli genislemesi için en uygun ortam oldugunu bulmustur. HGF yoklugunda hücreler, kültürde üç aydan uzun süre canli kalmamistir. Ayrica HGF yoklugunda lO pasajdan sonra hücreler, daha düsük bir çogalma orani ile kanitlandigi üzere, HGF varliginda kültürlenen hücrelere kiyasla bir büyüme dezavantaji göstermistir. Özellikle, 15 pasajdan sonra hücreler, HGF varliginda oldugu gibi HGF yoklugunda ayni hiz oraninda organoid yetistirmiyordu. Dolayisiyla HGF'nin, uzun süreli kültür sirasinda iyi bir çogalma oraninin muhafaza edilmesi için gerekli oldugu bulunmustur. Dolayisiyla mevcut bulus, bulusa ait bir ERFHNic ortaminin, en az 2 hafta, en az 1 ay, en az 2 ay, daha tercihen en az 3, en az 4, en az 5, en az 6, en az 7, en az 8, en az 9, en az 10 olmak üzere en az 15, en az 20, en az 24, en az 25, en az 30 veya daha fazla ay, örnegin 3 veya daha fazla yil süreyle hücrelerin kültürlenmesi için kullanilmasini saglar. Uygulamada, bulusun bazi uygulamalari, yaklasik 20-30 hücre pasajinda E2'nin kullanilmasini içerir. Örnegin hücreleri, genellikle haftada bir kez olmak üzere 20-30 kez bölünebilir. Tercihen, hücreler haftada yaklasik 4 kat veya haftada ikiden fazla popülasyon katlanmasi oraninda genisleyecektir. Bulus ayrica hücrelerin, en az 10 pasaj, örnegin en az 11, en az 12, arasinda pasaj boyunca kültürlenmesi için bulusa ait bir ERFHNic ortaminin kullanilmasini saglar. Bazi uygulamalarda, A83-01 gibi bir TGF-beta inhibitörü ek olarak EMZ ortaminda bulunur. Bu, insan hücreleri veya organoidler kültürlenirken özellikle yararlidir. arasinda, 470-530 nM arasinda. veya yaklasik. 500 nM'lik bir konsantrasyonda bulunur. EM2'de bir TGF-beta inhibitörünün bulundugu uygulamalarda, bir Çentik inhibitörü tercihen bulunmaz. Genisleme Ortami (EMI): Bir görünümde mevcut açiklama, bir EGF, bir BMP inhibitörü, R- spondin. ve Wnt'nin eklendigi, hayvan `veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içeren veya bir bazal ortamdan olusan bir hücre kültürü ortamini tarif eder. Tercihen BMP inhibitörü, Noggin'dir ve EMl ortami, "ENRW" (EGF, Noggin, R-spondin ve Wnt) olarak adlandirilir. Bu ortam, EMl olarak ifade edilir. Bulus sahipleri, Wnt ve Noggin içeren bir ortamin hücrelerin ilk genislemesinin uyarilmasi için ideal oldugunu kesfetmistir. Bu nedenle bazi uygulamalarda EMl ortami, sadece 1 pasaj veya 1 hafta boyunca kullanilir, ancak hücreler için zararli olmadigi için EMl ortaminin yaklasik bir yil kullanilabilecegi de düsünülür. Bu nedenle, bazi uygulamalarda, bir EMl ortami, hücrelerin kültürlenmesi için gün O`dan gün 10'a kadar, örnegin kullanilir; burada gün 0, hücrelerin baslangiçtaki dokusundan izole edildigi gün ve gün 1, bir sonraki gündür veya bir EMl ortami, 1 veya daha fazla hafta, örnegin 2, 3, 4 veya daha fazla ay kullanilir. Bazi uygulamalarda EMl ortami, yalnizca kültürün ilk günü veya ilk iki günü boyunca kullanilir. Bazi uygulamalarda EMl ortami, 1 veya daha fazla pasaj, örnegin 1, 2, 3, 4, 5, 6, pasaj boyunca kullanilir. Bazi uygulamalarda EMl ortami, bir dondurma asamasindan sonra veya optimum büyüme ile birlesmeyen bir ortam veya sicaklik degisimini içeren herhangi bir baska tasima asamasinda kullanilir. EMl ortami, FGF, HGF, Nikotinamid, gastrin, B27, N-asetilsistein ve N2'den olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla bilesik ile takviye edilir. Kültürlerin dondurulmus bir stoktan veya tek bir hücreden baslatilmasi durumunda, EMl ortami tercihen bir ROCK inhibitörü ile takviye edilir. Y27632, bulusta kullanilmak için tercih edilen ROCK inhibitörüdür. Bu nedenle bir uygulamada, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortami içeren veya bir bazal ortamdan olusan bir hücre kültürü ortami saglanir: Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ ve FGFR4'e baglanabilen bir FGF, tercihen mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF, gastrin, Nikotinamid, B27, N2 ve N-Asetilsistein ve tercihen; bir BMP inhibitörü, tercihen Noggin; ve R-spondin l, R-spondin 2, R-spondin 3 ve R-spondin 4, tercihen R-spondin 1 ve istege bagli olarak Wnt-3a'dan seçilen bir Wnt agonisti. Yukarida tanimlanan ortama B27 (Invitrogen), N-Asetilsistein (Sigma) ve N2 (Invitrogen), Gastrin (Sigma) ve Nikotinamid (Sigma) eklenir ve böylece hücrelerin çogalmasinin uyarildigi düsünülür. Bulus baglaminda Nikotinamid, burada "Nic" olarak ifade edilir. katalog no. 17502-048 ve PAA Laboratories GmbH, Pasching, Avusturya; www.paa.com; katalog no. F005-004; Bottenstein & Takviyesi, PAA Laboratories GmbH'den, SOOug/ml human transferrin, SOOug/ml sigir insülini, 0,63ug/ml progesteron, l6llug/ml putreskin ve 0,52ug/ml sodyum selenit içeren lOOx sivi konsantrat seklinde temin edilir. N2 Takviyesi, bir konsantrat halinde bir kültür ortamina eklenebilir veya bir kültür ortamina eklenmeden önce seyreltilebilir. Bir 1x nihai konsantrasyonda veya diger nihai konsantrasyonlarda kullanilabilir. N2 Takviyesinin kullanilmasi, bulusun bir kültür ortamina transferin, insülin, progesteron, putresin ve sodyum selenitin dahil edilmesi için uygun bir yoldur. mevcut durumda katalog no. 17504-044 ve PAA Laboratories GmbH, Pasching, Avusturya; www.paa.com; katalog no. FOl-OOZ; Brewer ve biyotin, kolesterol, linoleik asit, linolenik asit, progesteron, putresin, retinol, retinil asetat, sodyum selenit, triiyodotironin (T3), DL-alfa tokoferol (E vitamini), albümin, insülin ve transferrin içeren bir kültür ortami formüle etmek için kullanilabilir. B27 Takviyesi, baska bilesenlerin yani sira biyotin, kolesterol, linoleik asit, linolenik asit, progesteron, putresin, retinol, retinil asetat, sodyum selenit, triiyodotironin (T3), DL-alfa tokoferol (E vitamini), albümin, insülin ve transferrin içeren bir sivi 50x konsantrat olarak PAA Laboratories GmbH'den temin edilir. Bu bilesenlerden en azindan linolenik asit, retinol, retinil asetat ve triiyodotironin (T3), nükleer hormon reseptörü agonistleridir. B27 Takviyesi, bir konsantrat halinde bir kültür ortamina eklenebilir veya bir kültür ortamina eklenmeden önce seyreltilebilir. Bir 1x nihai konsantrasyonda veya diger nihai konsantrasyonlarda kullanilabilir. B27 Takviyesi kullanimi, biyotin, kolesterol, linoleik asit, linolenik asit, progesteron, putresin, retinol, retinil asetat, sodyum selenit, tri-iyodotironin (T3), DL-alfa tokoferol (E vitamini), albümin, insülin ve transferrini bulusa ait bir kültür ortamina eklemek için uygun bir yöntemdir. BMP inhibitörleri Tercihen bazal kültür ortamina eklenen bir bilesen, bir BMP inhibitörüdür. BMP'ler, iki farkli reseptör hücre serin/treonin kinazi tip I ve tip II reseptöründen olusan bir reseptör kompleksine bir dimerik ligant olarak baglanir. Tip II reseptörü, tip I reseptörünü fosforile ederek bu reseptör kinazin aktive olmasina neden olur. Tip I reseptörü daha sonra spesifik reseptör substratlarini (SMAD) fosforile ederek transkripsiyonel aktiviteye yol açan bir sinyal iletim yolagina neden olur. Bir BMP inhibitörü, bir kompleks olusturmak üzere bir BMP molekülüne baglanan bir ajandir ve burada, örnegin BMP molekülünün bir BMP reseptörüne baglanmasini önleyerek veya inhibe ederek BMP aktivitesi nötrlestirilir. Alternatif olarak söz konusu inhibitör, bir antagonist veya ters agonist olarak görev yapan bir ajandir. Bu tip inhibitör, bir BMP reseptörü ile baglanir ve bir BMP'nin söz konusu reseptöre baglanmasini Önler. Ikinci ajanin bir örnegi, bir BMP reseptörüne baglanan ve BMP'nin antikora bagli reseptöre baglanmasini engelleyen bir antikordur. Bir BMP inhibitörü, ayni hücre tipinde degerlendirildigi üzere söz konusu inhibitörün yoklugunda bir BMP aktivitesi seviyesine göre, bir hücrede BMP'ye bagli bir aktiviteyi en çok %90, daha çok tercihen en çok %80, daha çok tercihen en çok %70, daha çok tercih tercihen en çok %50, daha çok tercihen en çok %30, daha çok tercihen %10, daha çok tercihen %0 oraninda inhibe etmek için etkili bir iniktarda ortama eklenebilir. Teknikte uzman kisilerce bilindigi gibi, bir BMP aktivitesi, Zilberberg 've dig., 2007. BMC Cell Biol. 8:41 yayininda örnek olarak verildigi gibi BMP'nin transkripsiyonel aktivitesinin ölçülmesiyle belirlenebilir. Noggin (Peprotech), Kordin ve kordin domenleri içeren kordin benzeri proteinler (R&D systems), Follistatin ve bir follistatin domeni içeren follistatin ile iliskili proteinler (R&D systems), DAN ve bir DAN sistein dügümü domeni içeren DAN benzeri proteinler (R&D systems), sklerostin/SOST (R&D systems), dekorin (R&D systems) ve alfa-2 makroglobulin (R&D systems) dahil olmak üzere çesitli dogal BMP baglayici proteini siniflari bilinmektedir. Bulusun bir yönteminde kullanilmak üzere tercih edilen bir BMP inhibitörü, Cerberus ve Gremlin (R&D systems) de dahil olmak üzere Noggin, DAN ve DAN benzeri proteinler arasindan seçilir. Bu yayilabilir proteinler, bir BMP ligantini çesitli derecelerde afinite ile baglayabilir ve sinyal reseptörlerine erisimlerini inhibe eder. Bu BMP inhibitörlerinden herhangi birinin bazal kültür ortamina eklenmesi, kök hücre kaybini önler. Tercih edilen bir BMP inhibitörü, Noggin'dir. Bulusun bir kültür ortami baglaminda, Noggin burada ayrica "N" olarak da ifade edilir. Noggin, bazal kültür ortamina, tercihen en az 10 ng/ml, daha fazla tercihen en az 20 ng/ml, daha çok tercihen en az 50 ng/ml, daha da tercihen en az 100 ng/ml'lik bir konsantrasyonda eklenir. Daha da fazla tercih edilen konsantrasyon, yaklasik 100 ng/ml veya tam olarak 100 ng/ml'dir. Kök hücrelerin kültürlenmesi sirasinda, söz konusu BMP inhibitörü, gerektiginde örnegin her gün veya iki günde bir kültür ortamina eklenebilir. BMP inhibitörü tercihen her iki günde bir kültür ortamina eklenir. Kültür ortami, gerektiginde, örnegin her gün veya iki günde bir yenilenebilir, ancak dört günde bir yenilenmesi tercih Wnt Agonistleri Bazal kültür ortamina eklenen baska bir bilesen, bir Wnt agonistidir. Bulusun bir kültür ortami baglaminda, Wnt agonisti burada ayrica "W" olarak da ifade edilir. Wnt sinyal yolagi, bir Wnt proteini, Frizzled (kivrik) reseptör aile üyesinin bir hücre yüzeyi reseptörüne baglandiginda olusan bir dizi olayla tanimlanir. Bu, aksin, GSK-3 ve protein APC'yi içeren bir protein kompleksinin hücre içi ß-katenini bozmasini inhibe eden Dishevelled (düzensiz) ailesinden proteinlerin aktivasyonuna neden olur. Elde edilen zenginlestirilmis nükleer ß-katenin, TCP/LEE' ailesi transkripsiyon faktörleri ile transkripsiyonu Bir Wnt agonisti, bir hücrede TCF/LEF aracili transkripsiyonu aktive eden bir ajan olarak tanimlanir. Bu nedenle Wnt agonistleri, Wnt ailesindeki proteinlerin herhangi biri, hücre içi ß-katenin bozunmasinin bir inhibitörü ve TCF/LEF aktivatörleri de dahil olmak üzere bir Frizzled reseptör ailesinin üyesini baglayan ve aktive eden gerçek Wnt agonistleri arasindan seçilir. Söz konusu Wnt agonisti, ayni hücre tipinde degerlendirildigi üzere, söz konusu nwlekülün yoklugunda söz konusu Wnt aktivitesi düzeyine göre bir hücrede bir Wnt aktivitesini en az %10, daha çok tercihen en az %20, daha çok tercihen en az %30, daha çok tercihen en az %50, daha çok tercihen en az %70, en çok tercihen en az %90, en az %100 daha fazla uyarir. Teknikte tecrübeli bir kisi tarafindan bilindigi gibi, bir Wnt aktivitesi, Wnt'nin transkripsiyonel aktivitesinin, örnegin pTOPFLASH ve pFOPFLASH Tcf lusiferaz raportör yapilari ile ölçülmesi ile saptanabilir (Korinek ve Bir Wnt agonisti, Wnt-l/Int-l; Wnt-2/Irp (Int-1 ile iliskili Protein); Wnt-Zb/13; Wnt-3/Int-4; Wnt-3a (R&D systems); Wnt-4; Wnt-Sa; Wnt-Sb; Wnt-6 (Kirikoshi H ve dig. 2001. Biochem Biophys ve Wnt-16 dahil olmak üzere bir salgilanan glikoprotein içerebilir. Insan Wnt proteinlerine genel bir bakis "THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS", R&D Systems Catalog, 2004 yayininda yer almaktadir. Diger Wnt agonistleri arasinda Wnt sinyal yolunun aktivasyonu ve düzenlenmesinde rol oynayan ve 4 'üyeden olusan (R-spondin 1 (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA), R-spondin 2 ((R&D systems), R- spondin :3 ve Respondin-4) salgilanmis proteinlerin R-spondin ailesi ve Frizzled-4 reseptörüne yüksek afinite ile baglanmasi ve Wnt sinyal yolaginin aktivasyonunu indüklemesi bakimindan Wnt proteini gibi islev gören salgilanmis düzenleyici bir protein olan Norrin (ayrica Norrie Hastaligi Proteini veya NDP olarak da bilinir) (R&D systems) bulunur (Kestutis Planutis ve dig. (2007) BMC Cell Biol. 8: 12). R-spondin aktivitesini taklit eden bilesikler, bulusa ait Wnt agonistleri olarak kullanilabilir. Yakin zamanda R-spondin'in Lgr5 ile etkilesime girdigi bulunmustur. Bu nedenle Lgr5 agonistleri, Örnegin agonistik. anti-Lgr5 antikorlari, mevcut bulusta kullanilabilecek Wnt agonistlerinin örnekleridir. Bulusun bir kültür ortami baglaminda, R-spondin, burada ayrica Wnt sinyal yolaginin küçük moleküllü bir agonisti olan bir aminopirimidin türevi, kisa süre önce tanimlanmis ve açikça bir Wnt agonisti olarak dahil edilmistir (Liu ve dig. (2005) Angew Chem Int Ed Engl. 44, 1987-90). Bilinen GSK inhibitörleri, küçük interferans yapan RNA'lar (siRNA, Cell Signaling), lityum (Sigma), kenpaullone (Biomol Aldrich) ve FRAT ailesinin üyeleri ve GSK-3'ün aksin ile etkilesimini önleyen FRAT türevli peptitler içerir. Meijer ve yayininda genel bir bakis yer almaktadir. GSK-3 inhibisyonunun seviyesini belirlemeye yönelik yöntem ve analizler, uzman bir kisi tarafindan bilinmektedir` ve örnegin Liao ve dig. 2004, Endocrinology, 145(6):294l-9) yayininda tarif edilen yöntemleri ve analizleri içerir. Tercih edilen bir uygulamada, söz konusu Wnt agonisti, bir veya daha fazla bir R-spondin 1-4 (örnegin R-spondin 1 veya R-spondin 4) arasindan seçilir ve istege bagli olarak ayrica bir Wnt ailesi üyesi, Norrin ve/Veya bir GSK inhibitörü içerir. Bulus sahipleri, bazal kültür ortamina en az bir Wnt agonistinin eklenmesinin, karaciger epitel kök hücrelerinin veya izole edilmis safra kanallarinin veya izole edilmis karaciger fragmanlarinin çogalmasi için önemli oldugunu bulmustur. Tercih edilen baska bir uygulamada söz konusu Wnt agonisti, R- spondin l içerir veya bundan olusur. R-spondin 1, bazal kültür ortamina, en az 200 ng/ml, tercihen en az 300 ng/ml, daha da tercihen en az 500 ng/ml'lik bir konsantrasyonda eklenir. Daha da fazla tercih edilen R-spondin-l konsantrasyonu, yaklasik 500 ng/ml veya tam olarak 500 ng/ml'dir. Kök hücrelerin kültürlenmesi sirasinda, söz konusu Wnt ailesi üyesi, gerektiginde örnegin her gün veya iki günde bir kültür ortamina eklenebilir. Wnt inhibitörü üyesi tercihen her iki günde bir kültür ortamina eklenir. Kültür ortami, gerektiginde, örnegin her gün veya iki günde bir yenilenebilir, ancak dört günde bir yenilenmesi tercih edilir. Tercih edilen bir uygulamada bir Wnt agonisti, R-spondin, Wnt- 3a ve Wnt-6'dan olusan gruptan seçilir. Daha tercihen, R-spondin ve Wnt-Ba'nin her ikisi de Wnt agonisti olarak kullanilir. Bu kombinasyon, sasirtici bir sekilde organoid olusumu üzerinde sinerjik bir etkiye sahip oldugu için özellikle tercih edilir. Tercih edilen konsantrasyonlar, R-spondin için 1-500 ng/ml, örnegin 100 ng/ml veya 1000 ng/ml'dir. Bir Wnt agonisti, tercihen örnegin Wnt3a gibi bir Wnt ligantidir ve bir kültür ortamina taze olarak eklenebilir. Alternatif olarak bir Wnt liganti, bir hücre hattinin söz konusu Wnt ligantini eksprese eden uygun bir ekspresyon yapisi ile transfekte edilmesi veya enfekte edilmesiyle bir hücre hattinda eksprese olur. Söz konusu hücre hatti kültürlenir ve salgilanan Wnt ligantini içeren kültür ortami, uygun zaman araliklarinda hasat edilir. Örnegin hücreler, konfluansa ulasir ulasmaz ve hücrelerin büyümesi durur durmaz Wnt3a üretecektir. Söz konusu ekspresyon vektörü ile transfekte edilmemis veya enfekte edilmemis hücrelerden elde edilen kültür ortami, bir kontrol olarak kullanilir. Kosullu ortam hasat edilir ve örnegin lusiferaz ekspresyonunun, Wnt3a gibi bir Wnt agonistinin varliginin test edilmesi için TFC'ye yanit veren elemanlar tarafindan kontrol edildigi bir analizde test edilir (Korinek ve doku rejenerasyonu için kullanildiginda seyreltilir. Uzman kisi tarafindan bilindigi üzere fazla Wnt ligantinin eklenmesi, bazen kültür için çok az Wnt ligantinin eklenmesi kadar zararlidir. Bu nedenle, kosullu ortamin gerçek seyreltmesi, Testte belirlenen Wnt ligant miktarina bagli olacaktir. Mitojenik Büyüme Faktörleri Yine de bazal kültür ortamina eklenen baska bir bilesen, epidermal büyüme faktörü (EGF; (tercihen Peprotech'ten), FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir fibroblast büyüme faktörü (FGF) ve istege bagli olarak hepatosit büyüme faktörü (HGF) (tercihen Peprotech'ten) dahil mitojenik büyüme faktörlerinin bir kombinasyonudur. FGFRZ (FGF reseptörü) veya FGFR4'e baglanabilen bir FGF, tercihen FGF4, FGF7 veya FGFlO (tercihen Peprotech'ten), en çok tercihen FGF lO'dur. Tercihen EGF, bir FGF ve HGF'nin 3'ü de kullanilir. Bulusun bir kültür ortami baglaminda, EGF, ayrica "E" olarak ifade edilir, FGF ayrica "F" olarak ifade edilir ve HGF, ayrica "H" olarak ifade edilir. EGF, kültürlenmis çesitli ektodermal ve mezodermal hücreler için güçlü bir Initojenik faktördür` ve belirli hücrelerin in vivo sekilde ve in vitro sekilde ve hücre kültüründe bazi fibroblastlarin farklilasmasi üzerinde derin bir etkiye sahiptir. EGF prekürsörü, hücreleri uyaran 53 amino asit peptit hormonu üretmek üzere proteolitik olarak bölünen bir membrana bagli molekül halinde bulunur. EGF, EGF reseptöründe bulunan plazma membranina baglanarak hedef hücrelerde etkilerini uygular. EGF reseptörü, bir transmembran protein tirozin kinazdir. EGF'nin reseptöre baglanmasi, kinaz aktivasyonuna ve ardindan reseptör otofosforilasyonuna neden olur. Otofosforilasyon, reseptörün substratlari ile etkilesimi için gereklidir. EGF tarafindan aktive edilen sinyal iletim yolaklari, protein kinaz C'nin aktivasyonuna ve hücre içi Ca2+ konsantrasyonunda artisa neden olan fosfatidilinositol yolagini ve MAP kinaz aktivasyonuna neden olan ras yolagini içerir. Bu yolaklar, hücresel çogalmanin, farklilasmanin ve sagkalimin düzenlenmesine rol oynar (Herbst, 2004, Int Journal of radiation oncology, 59, 2, 821-826). EGP, tercihen bazal kültür ortamina, 5 ila 500 ng/ml arasinda veya en az 5 ve en fazla 500 ng/ml'lik; bir konsantrasyonda eklenir. Tercih edilen bir konsantrasyon, en az 10, 20, 25, 30, 200, 150 veya 100 ng/ml'dir. Daha çok tercih edilen bir konsantrasyon, en az 50 ve en fazla 100 ng/ml'dir. Daha da fazla tercih edilen konsantrasyon, yaklasik 50 ng/ml veya 50 ng/ml'dir. FGFlO, fibroblast büyüme faktörü (FGF) ailesine ait bir proteindir. FGF ailesinin. üyeleri, genis mitojenik. ve hücre sagkalim aktivitelerine sahiptir ve embriyonik gelisim, hücre büyümesi, marfogenez, doku onarimi, tümör büyümesi ve istilasi gibi çesitli biyolojik proseslerde yer alir. FGF'ler, hücre yüzeyi tirozin kinaz reseptörleri (FGFR) ile etkilesime girerek hücreleri uyarir. Dört yakindan iliskili reseptör (FGFRl- FGFR4) tanimlanmistir. FGFRl-FGFR3 genlerinin çoklu izoformlari kodladigi gösterilmistir ve bu izoformlar, ligand spesifikligini belirlemede kritik öneme sahip olabilir. Çogu FGF, birden fazla 57). Bununla birlikte FGFlO ve FGF7, yalnizca FGFRZ'nin spesifik bir izoformu olan, yalnizca epitel hücreler ile eksprese olan FGFRZb olarak gösterilen FGFFRb ile etkilesime girmeleri nedeniyle FGF'ler arasinda benzersizdir (lgarashi, J Biol Chem. tercih edilen bir FGF'dir. Hepatosit büyüme faktörü/scatter faktör (HGF/SF), proto- onkojenik c-Met reseptörüne baglandiktan sonra bir tirozin kinaz sinyal kaskadinin aktive edilmesiyle hücre büyümesini, hücre hareketliligini ve morfogenezi düzenleyen morfojenik bir faktördür. Ayni konsantrasyonlar, FGFlO ve HGF için kullanilabilir. FGFlO ve 500ng/ml'den yüksek degildir. HGF için tercih edilen konsantrasyonlar, 1, 10, 20, 50 ng/ml'dir ve 50ng/ml'den yüksek degildir. Kök hücrelerin kültürlenmesi sirasinda, söz konusu mitojenik büyüme faktörlerinin (EGF, FGFlO ve HGF) kombinasyonu, tercihen gerektiginde, örnegin her gün veya iki günde bir kültür ortamina eklenir. Her iki günde bir eklenmesi tercih edilir. Kültür ortami, gerektiginde, örnegin her gün veya iki günde bir yenilenebilir, ancak dört günde bir yenilenmesi tercih edilir. Bazi uygulamalarda, A83-Ol gibi bir TGF-beta. inhibitörü ek olarak EMl ortaminda bulunur. Bu, insan hücreleri veya organoidler kültürlenirken özellikle yararlidir. Bazi 470-530 nM arasinda veya yaklasik 500 nM'lik bir konsantrasyonda bulunur. EMl'de bir TGF-beta inhibitörünün bulundugu uygulamalarda, bir Çentik inhibitörü tercihen bulunmaz. Bulusun Tercih Edilen Genisleme Ortami Tercih edilen kültür ortami ve bunlarin kullanim yöntemleri, Örnekler bölümünde tarif edilmistir. Örnegin bir hücre kültürü ortami, içine asagidakilerin eklendigi bir bazal ortam içerebilir veya bundan olusabilir: FGFlO ile takviye edilmis EGF ve R-spondin l, HGF ve Nikotinamid; örnegin FGFlO (lOOng/ml) ile takviye edilmis EGF (50 ng/ml) ve R-spondin l (lpg/ml), HGF (25-50ng/ml) ve Nikotinamid (l-lOmM). Bulus sahipleri, bu ortamin, hücrelerin uzun vadeli genislemesi için tercih. edilebilir oldugunu. bulmustur. Dolayisiyla, bu hücre kültürü ortami, bulusa ait bir EMZ olarak kullanilmak üzere tercih edilir. Bazal ortam tercihen B27, N2 ve 200 ng/ml N- Asetilsistein ile takviye edilir. Bazi uygulamalarda, bazal ortam. Advanced-DMEM/FlZ'tir. Bununla birlikte, herhangi bir baska uygun bazal ortam da kullanilabilir. Tercih edilen baska bir* hücre kültürü ortami ve bu ortamin kullanim yöntemi, örneklerde tarif edilmistir ve tercihen B27, N2, 200ng/ml N-Asetilsistein ile takviye edilmis Advanced- DMEM/FlZ, 50ng/ml EGF, l ug/ml R-spondinl, 10 nM gastrin, lOO ng/ml FGFlO, lOmM Nikotinamid ve 50ng/ml HGF ve %50 Wnt kosullu ortam. ve tercihen 10-100ng/ml Noggin içerir veya bunlardan olusur. Wnt kosullu ortam, Advanced DMEM, P/S, B27, N2 ve ayrica FCS içerir. Wnt3A ekspresyon plazmidiyle transfekte edilen 293T hücreleri Wnt üretir. Bütün ortam birkaç gün sonra (salgilanmis Wnt ile) alinir ve Wnt kaynagi olarak kullanilir. Bulus, bu nedenle, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içeren veya bu bazal ortamdan olusan bir hücre kültürü ortami saglar: Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ'ye veya FGFR4'e baglanan bir FGF, tercihen mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF, gastrin, Nikotinamid, B27, N2 ve N-Asetilsistein ve tercihen bir BMP inhibitörü, daha tercihen Noggin ve R-spondin l, R-spondin 2, R-spondin 3 ve R-spondin 4, daha çok tercihen R-spondin 1 ve istege bagli olarak Wnt-3a'dan seçilen bir Wnt agonisti. Bulus, bu nedenle, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bazal ortami içeren veya bu bazal ortamdan olusan bir birinci tercih edilen kültür ortamini Epidermal Büyüme Faktörü, mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF, gastrin, Nikotinamid, B27, N2 ve N-Asetilsistein, bir BMP inhibitörü, daha tercihen Noggin ve R-spondin l, R-spondin 2, R-spondin 3 ve R-spondin 4, daha çok tercihen R-spondin 1 ve Wnt-3a'dan seçilen bir Wnt agonisti. Bu ortam, hücrelerin baslangiçtaki genislemesini uyarmak için bulusun bir EMl hücre kültürü ortami olarak kullanilabilir. Bazi uygulamalarda, bir EMl hücre kültürü ortami olarak kullanilan ortam, bulusun bir EM2 kültür ortaminin tüm bilesenlerini içerir ve ek olarak Wnt- 3 a ve Noggin içerir. Bazal ortamin, N-Asetilsistein, B27 ve N2 ile takviye edildigi uygulamalarda, kültür ortamina tercihen asagidakiler eklenir: EGP, R-spondinl, gastrin, FGFlO, Nikotinamid ve HGF ve Wnt kosullu ortam. Tercihen bazal ortam, yukarida tarif edilen miktarlara uygun olarak N-Asetilsistein, EGF, R-spondinl, gastrin, FGFlO, Nikotinamid ve HGF ile Wnt kosullu ortam ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda bazal ortam, 150 ng/ml ila 250 ng/ml N-Asetilsistein ile takviye edilebilir; tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 200 ng/ml N-Asetilsistein ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda bazal ortam, 40ng/m1 ila 60ng/ml EGF ile takviye edilebilir; tercihen bazal ortam, yaklasik.veya tam olarak 50ng/ml EGF ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda. bazal ortam, 0,5 ug/ml ila 1,5 ug/ml R- spondinl ile takviye edilebilir; tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 1 ug/ml R-spondinl ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda bazal ortam, 5nM ila 15nM gastrin ile takviye edilebilir; tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 10 nM gastrin ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda bazal ile takviye edilebilir; tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 100 ng/ml FGFlO ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda bazal ortam, 5mM ila 15mM Nikotinamid ile takviye edilebilir; tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 10 nM Nikotinamid ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda bazal ortam, 25ng/ml ila 100 ng/ml HGF, örnegin 35ng/ml ila 65ng/ml HGF ile takviye edilebilir; tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 50ng/ml HGF ile takviye edilir. Örnegin, bazi uygulamalarda bazal ortam, %35 ila %65 Wnt kosullu ortam ile takviye edilebilir; tercihen, bazal ortam, yaklasik veya tam olarak %50 Wnt kosullu ortam ile takviye edilir. Bazi uygulamalarda gastrin ve N2'den biri veya her ikisi, hücre kültürü ortaminda mevcut degildir. Tercihen bazal ortam, Advanced-DMEM/FlZ'dir. Bu birinci kültür ortami (örnegin EMl, EM2 veya EMl ve EMZ'nin her ikisi), bulusun kültür yönteminin ilk iki haftasinda kullanilir. Bununla birlikte, 1, 2, 3, 5, 7 veya 10 gün gibi daha kisa bir süre veya 3, 4, 5, 10, 20 veya daha fazla hafta, daha fazla gibi daha uzun bir zaman boyunca kullanilabilir. Farklilasma Ortami (DM): Bazi uygulamalarda bulusun yöntemi, içine asagidakilerin eklendigi bir bazal ortam içeren veya bu bazal ortamdan olusa bir ikinci hücre kültürü ortamini içerir: EGP, bir TGF-beta inhibitörü ve bir Çentik inhibitörü. Bulus sahipleri, bu ortamin hücrelerin farklilastirilmasi için yararli oldugunu bulmustur. Hücrelerin farklilastirilmasi için kullanilan ortam, burada DM olarak ifade edilir. Tercihen ikinci hücre kültürü ortami ayrica FGF ve/veya HGF'yi Bir uygulamada ikinci kültür ortami, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortami içerir veya bu bazal ortamindan olusur: Epidermal Büyüme Faktörü, mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF; bir Çentik inhibitörü; ve bir TGF-beta inhibitörü. Bir uygulamada TGF-beta inhibitörü, ABB-Ol'dir ve/Veya Çentik inhibitörü, DAPT'dir. Baska bir uygulamada DM hücre kültürü ortami, ek olarak Deksametason içerir. Tercih edilen bir ikinci hücre kültürü ortami ve bu ortamin kullanim yöntemi, örneklerde tarif edilmistir ve içine asagidakilerin eklendigi bir bazal ortami içerir veya bu bazal ortamindan olusur: SOng/ml EGF, lOO ng/ml FGFlO, 50 nM A830l ve uM DAPT. Advanced-DMEM/FlZ, bazal ortam olarak kullanilabilir ve baska herhangi bir uygun bazal ortam da kullanilabilir. Bazi uygulamalarda ikinci hücre kültürü ortami, R-spondin veya Wnt içermez. Bazi uygulamalarda ikinci hücre kültürü ortami, bir Wnt agonisti içermez. Bazi uygulamalarda ikinci hücre kültürü ortami, Nikotinamid içermez. Bazi uygulamalarda ikinci hücre kültürü ortami, bir BMP inhibitörü içermez. Bulus sahipleri, R-spondinl ve Nikotinamid'in her ikisinin de olgun hepatosit markörü CYPBAll'in ekspresyonunu inhibe ettigini, ancak hepatoblast markör albüminin ekspresyonunu tesvik ettigini kesfetmistir. Bu nedenle, hücrelerin daha olgun karaciger kaderine farklilasmasini arttirmak için bulus sahipleri, hücre kültüründen R-spondin ve Nikotinamid'i çikarmistir. Bulus sahipleri ayrica, spesifik safra transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunun, R-spondinl içeren genisleme kültürlerinde yüksek seviyede yukari regüle edildigini kesfetmistir; bu, kültür gen ekspresyonunun. bir safra hücre kaderine dogru daha dengesiz oldugunu göstermistir. Çentik ve TGF-beta sinyalleme yolaklari, in vivo safra hücre kaderinde rol oynamistir. Aslinda, Rbpj'nin silinmesi (aktif Çentik sinyalini elde etmek için gerekli) anormal tubülojeneze neden olur (Zong Y. Development 2009) ve karaciger eksplantlarina TGF-beta'nin eklenmesi, in vitro safra farklilasmasini kolaylastirir (Clotman F. Genes and Development 2005). Bulus sahipleri, karaciger kültürlerinde hem Çentik hem de TGF-beta sinyal yolaklari yüksek seviyede yukari dogru regüle edildiginden (Sekil 9), safra kanali hücre kaderinin inhibisyonunun, hücrelerin daha hepatositik bir fenotipe dogru farklilasmasini tetikleyebilecegini düsünmüstür. Tercihen R-spondin 'veya Wnt içermeyen bir farklilasma ortamina bir TGF-beta inhibitörü (A eklenmesinin, olgun hepatosit markörlerinin ekspresyonunu arttirdigi ve hepatosit benzeri hücrelerin sayisini artirdigi (bkz. örn. Örnek 2) görülmüstür. Çentik, çoklu proteolitik yarilmalar yoluyla aktive edilebilecek bir transmembran yüzey reseptörüdür ve söz konusu yarilmalardan biri, gamma-sekretaz olarak adlandirilan proteaz aktivitesine sahip bir protein kompleksi tarafindan gerçeklestirilen bir yarilmadir. Gamma-sekretaz, membran içindeki bölünme aktivitesini gerçeklestiren bir proteazdir. Gamma-sekretaz, çok bilesenli bir enzimdir ve presenilinler (presinilin 1 veya 2), nikastrin, PEN-2 ve APH-I olmak üzere en az dört farkli proteinden olusur. Presenilin, gamma-sekretazin katalitik merkezidir. Ligant baglanmasinda Çentik reseptörü, bir metalloproteaz olan bir ADAM proteazin etkisiyle ektodomen dökülmesine izin veren konformasyonel bir degisim geçirir. Bunun hemen ardindan gamma-sekretaz kompleksinin etkisiyle Çentik hüre içi domeninin (NICD) salinmasi gerçeklesir. NICD, CSL ile etkilesime girdigi çekirdege dogru yer degistirir (C-promotör baglanma faktörü/rekombinant sinyal sekansi baglanma proteini JK/Tüysüz Süpresörü/Lagl). NICD'nin baglanmasi, CSL'yi transkripsiyonel bir baskilayicidan bir aktivatöre dönüstürüp, Çentik hedef genlerinin ekspresyonuna neden olur. Mevcut bulusun baglaminda kullanilabilecek tercih edilen Çentik inhibitörlerinin örnekleri sunlardir: gamma-sekretaz inhibitörleri, örnegin DAPT veya dibenzazepin (DBZ) veya benzodiazepin (BZ) veya LY-411575, ligant aracili Çentik aktivasyonunu yok edebilen (örnegin baskin negatif bir Çentik liganti araciligiyla veya baskin negatif bir Çentik araciligiyla veya bir Çentik liganti ve Çentik arasindaki etkilesimi en azindan kismen engelleyebilen bir antikor araciligiyla) bir inhibitör veya ADAM proteazlarinin bir inhibitörü. TGF-beta sinyali, hücre büyümesi, hücre kaderi ve apoptoz dahil birçok hücresel fonksiyonda yer alir. Sinyal tipik olarak bir TGF-beta süper ailesi ligantinin bir tip II reseptörüne baglanmasi ile baslar ve bir tip I reseptörünü fosforile eder. Tip 1 reseptörü daha sonra,çekirdekte transkripsiyon faktörleri olarak görev yapan ve hedef gen ekspresyonunu regüle eden SMAD'leri fosforile eder. Alternatif olarak TGF-beta sinyali, örnegin p38 MAP kinaz araciligiyla MAP kinaz sinyalleme yolaklarini aktive edebilir. TGF-beta süper ailesi ligantlari, kemik morfojenik proteinleri (BMP'ler), büyüme ve farklilasma faktörleri (GDF'ler), anti-müllerien hormonu (AMH), aktivin, Bir TGF-beta inhibitörü, TGF-beta sinyal yolaklarinin aktivitesini indirgeyen bir ajandir. TGF-beta sinyalleme yolaklarinin bozulmasina yönelik teknikte bilinen ve mevcut bulusla baglantili olarak kullanilabilen birçok yol vardir. Örnegin TGF-beta sinyallemesi asagidakiler yoluyla bozulabilir: bir küçük interferans yapan RNA stratejisi ile TGF-beta ekspresyonunun inhibisyonu; furin (bir TGF-beta aktive edici proteaz) inhibisyonu; fizyolojik inhibitörler ile yolak inhibisyonu, örnegin Noggin, DAN veya DAN benzeri proteinler ile BMP inhibisyonu; bir monoklonal antikor ile TGF-beta nötrlestirilmesi; küçük moleküllü inhibitörler ile TGF-beta reseptör kinaz 1 (aktivin reseptörü benzeri kinaz, ALKS), ALK4, ALK6, ALK7 veya diger TGF-beta ile iliskili reseptör kinazlarin inhibisyonu; Smad 2 ve Smad 3 sinyallemesinin, fizyolojik inhibitörü Smad 7'nin asiri ekspresyonu yoluyla veya Smad'in aktivasyonunu engelleyen bir Smad ankraji olarak tioredoksinin kullanilmasiyla inhibisyonu (Fuchs, O. Inhibition of TGF- Signaling for the Treatment of Tumor Metastasis and Fibrotic Diseases. Current Signal Transdüction Therapy, Cilt 6, Sayi 1, Bir maddenin bir TGF-beta inhibitörü olup olmadigini belirlemek için çesitli yöntemler' bilinir` ve bulusla baglantili olarak kullanilabilir. Örnegin hücrelerin, bir lusiferaz raportör geni sürerek insan PAI-l promotörü veya Smad baglanma bölgelerini içeren bir raportör yapi ile stabil olarak transfekte edildigi bir hücresel analiz kullanilabilir. Kontrol gruplarina göre lusiferaz aktivitesinin inhibisyonu bilesik aktivitesinin bir ölçümü olarak kullanilabilir (De Gouville ve dig., Br J Mevcut bulusa göre bir TGF-beta inhibitörü, bir protein, peptit, küçük moleküller, küçük interferans yapan RNA, antisens oligonükleotit, aptamer veya antikor olabilir. Inhibitör, dogal olarak olusan veya sentetik bir inhibitör olabilir. Mevcut bulus baglaminda kullanilabilecek tercih edilen küçük moleküllü TGF- beta inhibitörleri, Tablo 1'de siralanan küçük moleküllü inhibitörleri içerir: Tablo 1: Reseptör kinazlari hedefleyen küçük moleküllü TGF-beta inhibitörleri Molekü (TGF- ß 12 3-(6-Meti1-2- R1) piridinil)-N-feni1- ALK4 45 pirazoýl_ . karbotiyoamit benzodioksol-il)-5- imidazol-Z- ALK7 i1]benzamit benzo[1,3]dioksol- -il-2-tert-butil- ALK4 129 metilpiridin hidroklorür hidrat Dimetileti1)-5-(6- meti1-2-piridinil)- H-imidazol-4-i1] kinoksalin florofenil)-4-[(4- piridil)amino]pteri TGF-ß ls- pirazol-4-i1]- RII 400 kinolin Metilpiridin-Z-i1)- 1H-pirazol-4-i1)- 1,5- naftiridin Bulusun bir yöntemi, tablo 1'de siralanan inhibitörlerden herhangi birini veya daha fazlasini içerebilir. Bulusun bir yöntemi, bir inhibitörün listede yer alan baska bir inhibitör ile kombinasyonunun kullanimini içerebilir. Örnegin bulusun bir içerebilir; veya bulusun bir yöntemi, SD-208 ve A83-01 kullanimini içerebilir; veya bulusun bir yöntemi, SD-208 ve A83- 01 kullanimini içerebilir. Uzman kisiler, çok sayida baska küçük moleküllü inhibitörün, baska kinazlari hedeflemek üzere tasarlandigini, ancak yüksek konsantrasyonlarda TGF-beta reseptör kinazlarini da inhibe edebilecegini takdir edecektir. Örnegin SB-203580, yüksek konsantrasyonlarda (örnegin 10 uM veya daha fazla) ALKS'i inhibe ettigi düsünülen bir p38 MAP kinaz inhibitörüdür. TGF-beta sinyal yolagini inhibe eden herhangi bir inhibitör de mevcut bulusun baglaminda kullanilabilir. A83-Ol, kültür ortamina, 10 nM ila 10 uM arasinda veya 20 nM ila uM arasinda veya 50 nM ila 1 uM arasinda bir konsantrasyonda eklenebilir. Örnegin A83-Ol, yaklasik 500 nM'de kültür ortamina eklenebilir. Bir EM içinde kullanildiginda, A83-Ol, kültür tercihen yaklasik 500 nM konsantrasyonda eklenebilir. Bir DM içinde kullanildiginda, A83-01, kültür ortamina, 25-75 nM arasinda, örnegin 40-60 nM arasinda veya yaklasik 50 nM konsantrasyonda eklenebilir. nM ila 40 uM arasinda veya 500 nM ila 10 uM arasinda bir konsantrasyonda eklenebilir. Örnegin SB-431542, kültür ortamina, yaklasik 1 uM'de eklenebilir. ila 20 uM arasinda veya 200 nM ila 1 uM arasinda bir konsantrasyonda eklenebilir. Örnegin SB-505124, kültür ortamina, yaklasik 500 nM'de ilave edilebilir. ila 5 uM arasinda veya 50 nM ila 1 uM arasinda bir konsantrasyonda eklenebilir. Örnegin SB-525334, kültür ortamina, yaklasik 100 nM'de ilave edilebilir. ile 20 uM arasinda veya 200 nM ile 1 uM arasinda bir konsantrasyonda eklenebilir. Örnegin LY 364947, kültür ortamina, yaklasik 500 nM'de eklenebilir. SD-208, kültür ortamina, 40 nM ila 40 uM arasinda veya 80 nM ila uM arasinda veya 200 nM ila 1 uM arasinda bir konsantrasyonda eklenebilir. Örnegin SD-208, yaklasik 500 nM'de kültür ortamina eklenebilir. ila 10 uM arasinda veya 100 nM ila 1 uM arasinda bir konsantrasyonda eklenebilir. Örnegin A83-Ol, yaklasik 200 nM'de kültür ortamina eklenebilir. Baska bir görünümde bulus, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içeren veya bu bazal ortamdan olusan alternatif ikinci bir kültür ortamini Epidermal Büyüme Faktörü, mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF; gastrin, Nikotinamid, B27, N2 ve N-Asetilsistein. Bu alternatif ikinci kültür ortami, bir farklilasma ortami (DM) olarak yararlidir. Bu alternatif ikinci kültür ortami, tercihen kültürün ilk iki haftasindan sonra kullanilir. Bu asamada, bir BMP inhibitörü ve bir Wnt ligantinin artik gerekli olmadigi görülür. Bu nedenle bazi uygulamalarda, alternatif ikinci kültür ortami, bir BMP inhibitörü veya bir Wnt liganti içermez. Bazi uygulamalarda, alternatif ikinci kültür ortami, bir BMP inhibitörü veya bir Wnt liganti agonisti içermez. Birinci kültür ortamiyla (EM, yani EMl ve EM2 veya EMl veya EM2), bazal ortam bazi uygulamalarda, asagida tarif edilen miktara uygun olarak N-Asetilsistein, EGF, gastrin, FGFlO, Nikotinamid ve HGF ile takviye edilebilir. Örnegin tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 200ng/ml N-Asetilsistein ile takviye edilebilir. Tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam. olarak 50ng/ml EGF ile takviye edilebilir. Tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 10nM gastrin ile takviye edilebilir. Tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 100 ng/ml FGFlO ile takviye edilebilir. Tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 10mM Nikotinamid ile takviye edilebilir. Tercihen bazal ortam, yaklasik veya tam olarak 50ng/ml HGF ile takviye edilebilir. Bulusa göre kullanilan bir birinci ve bir ikinci hücre kültürü ortami, bir hücre disi matris üzerinde epitel kök hücrelerin veya karaciger epitel kök hücrelerin veya izole edilmis safra kanali veya izole edilmis karaciger fragmanlarinin sagkalimini ve/veya çogalmasini ve/veya farklilasmasini saglar. Sagkalimi ve/veya çogalmayi saglayan bir ortam, tercihen en az 180, 200 günlük kültür sirasinda hücrelerin sagkalimini ve/veya çogalmasini indükleyen veya tesvik eden bir ortamdir. Çogalma, BrdU boyamasi, Edu boyamasi, Ki67 boyamasi gibi teknikte bilinen teknikler kullanilarak degerlendirilebilir ve büyüme egrilerinin kullaniminin analizi gerçeklestirilebilir. Örnegin 10 safra kanalindan, 6 gün sonra kuyucuk basina 10 organoidli 6 kuyucuga (60 yeni organoid) seyreltmenin mümkün oldugu gösterdik. 6 günlük her bir pasajda yaklasik 360 organoid olusturabildik. 32 hafta boyunca haftada 1 pasaj gerçeklestirerek yalnizca 7 ayda hücrelerin ve organoidlerin nakli için uygun olmasi önemli bir sorun teskil ettigi için endüstri için önemlidir. Bir fare nakli için örnegin minimum 105 hücre gerekir. Bir greftin basarili olmasi için, insan nakli için muhtemelen 106 veya 10 x 106 gerekli olabilir. Baska bir ifadeyle, bulusa göre kullanilan ortam, karaciger organoidleri olusturmak için uygun kosullar altinda en az 3, en 80, en az 90 veya en az 100 pasaj boyunca bir kök hücre popülasyonunu genisletebilir. Yukarida tanimlanan sekilde ikinci ortam tercihen en az bes günlük kültür boyunca hücrelerin spesifik farklilasmasini indükler veya tesvik eder. Farklilasma, burada tanimlanan sekilde karaciger soyu ile iliskili spesifik bir markör varliginin tespit edilmesiyle ölçülebilir. Farklilasma, burada tanimlanan sekilde karaciger soyu ile iliskili spesifik. bir markör varliginin tespit edilmesiyle ölçülebilir. Markorün bagli olarak, söz konusu markörün ekspresyonu, bir birinci ortamda veya burada tanimlanan sekilde bir birinci ortamda ve ardindan günlük kültürden sonra RTPCR. veya immüno-histokimya yoluyla degerlendirilebilir. Bir farklilasma ortami, tercihen en az bes günlük kültür boyunca hücrelerin spesifik farklilasmasini indükler veya tesvik eder. Farklilasma, burada tanimlanan sekilde karaciger soyu ile iliskili spesifik bir markör varliginin tespit edilmesiyle Ölçülebilir. Bulusun baglaminda, hücre kültürü ortami terimi, ortam, kültür ortami veya hücre ortami veya bazal ortam veya bazal hücre ortami veya bazal hücre kültürü ortami veya genisleme ortami veya farklilasma ortami ile es anlamlidir. Bulusun yine baska bir görünümüne göre, bulusun bir kültür ortamini içeren hermatik olarak kapatilmis bir kap saglanmistir. Bazi uygulamalarda kültür ortami, bir genisleme ortamidir. Bazi uygulamalarda kültür ortami, bir farklilasma ortamidir. Kontaminasyonun önlenmesi amaciyla, burada açiklanan kültür ortaminin tasinmasi veya depolanmasi için hermetik olarak kapatilmis kaplar tercih edilebilir. Kap, bir flask, bir plaka, bir sise, kavanoz, bir Viyal veya bir torba gibi uygun herhangi bir kap olabilir. Kök Hücrelerin Elde Edilmesine ve/veya Kültürlenmesine Yönelik Yöntemler Bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik yöntem, epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, bulusa göre bir veya daha fazla hücre kültürü ortamininin varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde kültürlenmesini içerir. Bazi uygulamalarda, bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik yöntenn epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, EMl ortami ve daha sonra EMZ ortami ve daha sonra DM ortami varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde kültürlenmesini içerir. Bazi uygulamalarda, bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik yöntenu epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, EMl ortami kullanilmaksizin EM2 ortami ve daha sonra DM ortami varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde kültürlenmesini içerir. Bazi uygulamalarda, bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik yöntem, epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, EMZ ortami kullanilmaksizin EMl ortami ve daha sonra DM ortami varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde kültürlenmesini içerir. Bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik yöntem, asagidakileri i) epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, bir ortam varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde kültürlenmesi ve söz konusu ortamin, içine asagidakilerin eklendigi hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içermesi: Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir FGF, tercihen mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF, Nikotinamid ve tercihen bir Wnt agonisti, tercihen R-spondin l-4'ten herhangi biri; ve ardindan ii) kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücrelerini içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, burada tanimlandigi gibi bir ikinci hücre ortaminin (bir DM ortami) varliginda hücre disi bir matris ile kültürlenmesi. Bazi uygulamalarda adim i)'den önce, söz konusu yöntem, epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, içine EGF, bir BMP inhibitörü, R-spondin ve Wnt'nin eklendigi hayvan ve insan hücreleri için bir bazal ortam içeren veya bu bazal ortamdan olusan bir ortam varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde kültürlenmesini içerir. Tercihen BMP inhibitörü, Noggin'dir ve EMl ortami, "ENRW" (EGF, Noggin, R-spondin ve Wnt) olarak adlandirilir. Bir uygulamada, bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik, asagidakileri içeren bir yöntem saglanmistir: epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, burada tarif edildigi gibi bir EMZ kültür ortaminda, örnegin bir Wnt agonisti, örnegin R-spondin, Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir FGF, tercihen FGFlO ve nikotinamid içeren bir ortamda, hücre disi bir matris ile temas haline kültürlenmesi. Tercihen söz konusu ortam ayrica HGF içerir. Baska bir uygulamada, bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/Veya kültürlenmesine yönelik, asagidakileri içeren bir yöntem saglanmistir: epitel kök hücrelerin ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis doku fragmanlarinin, bir BMP inhibitörü, bir Wnt agonisti, Epidermal Büyüme Faktörü, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir FGF, tercihen mitojenik büyüme faktörleri olarak FGFlO ve HGF, gastrin, Nikotinamid, B27, N2 ve N- Asetilsistein içeren bir ortamda hücre disi bir matris ile temas halinde kültürlenmesi. Tercih edilen baska bir yöntemde, yukarida tanimlanan sekilde bir EMl ortaminda en az iki haftalik bir kültürden sonra, kültür, bir BMP inhibitörü ve bir Wnt inhibitörü içermeyen bir ortamda sürdürülür. Bazi uygulamalarda bu kültür, bulusun bir EM2'sinde sürdürülür. Alternatif uygulamalarda kültür, ek olarak bir TGF- beta inhibitörü, örnegin A83-01 ve bir Çentik inhibitörü, örnegin DAPT içeren bulusun bir ikinci ortaminda (DM) sürdürülür. Bazi uygulamalarda bu kültür, bulusun bir EM2 ortaminda ve daha sonra bir DM ortaminda sürdürulür. Bu nedenle, bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik tercih edilen bir yöntemde, epitel kök hücreleri ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis karaciger doku fragmanlari, birinci adimda birinci ortamda (EM) ve daha sonra ayri ikinci bir adimda ikinci ortamda (DM) kültürlenir. Birinci kültür adimi, en az iki hafta sürebilir ve daha uzun, örnegin 3 hafta veya daha uzun, 4 hafta veya daha uzun veya 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ay veya daha fazla sürebilir. Ikinci adim tercihen, 6 hafta veya daha az, daha çok tercihen 1 ay veya daha az, örnegin 3 hafta veya daha az, 2 hafta veya daha az, 1 hafta veya daha az sürer. Birçok hücrenin, DM içinde 2 hafta sonra ölmeye basladigi görülmüstür ve bu nedenle, tercihen ikinci adim, 2 hafta veya daha az veya en fazla 1 ay sürer. Bu nedenle ikinci adim, yalnizca daha az tercih edilen veya 1, 2, 3, 4, 5, 6 ay veya daha uzun sürebilir. Her bir adim, tercihen burada tarif edildigi gibi hücre disi bir matris kullanilarak ve burada ayrintili bir sekilde tarif edilen kültür ortami kullanilarak gerçeklestirilebilir. Baska bir uygulamada alternatif olarak, söz konusu yöntem, ikinci ortama geçmeden birinci ortamda gerçeklestirilir. Bu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ay veya daha uzun sürebilir. Bazi uygulamalarda bulusun birinci ortaminda kültürleme adimi, EMl ortaminda kültürlemeyi ve daha sonra EM2 ortaminda kültürlemeyi içerir. Bu nedenle yukarida tarif edilen süreler, hücrelerin veya fragmanlarin, EM1 ve ardindan EM2 ortaminda kültürlendikleri toplam süreyi ifade edebilir. Bazi uygulamalarda EM1 kültür ortaminda kültürleme adimi, 10 günden az, örnegin 9 günden az, 8 günden az, 7 günden az, 6 günden az, az sürebilir. Bazi uygulamalarda EMl kültür ortaminda kültürleme adimi, 1 ile 10 gün arasinda, örnegin 1-7 gün, 2-6 gün, 3-5 gün, örnegin 4 veya 5 gün sürebilir. Bazi uygulamalarda, EM2 ortaminda hafta veya 1, 2, 3, 4, 5, 6 ay veya daha uzun sürebilir. Her bir ortamda mevcut her bir bilesigin tercih edilen konsantrasyonlari, mevcut tarifnamede veya örnekler bölümünde tarif edilmistir. Bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger organoidinin elde edilmesine ve/veya kültürlenmesine yönelik burada tarif edilen yöntem ayrica Lgr5 eksprese eden bir hücre popülasyonunun elde edilmesi ve/veya kültürlenmesi için kullanilabilir ve söz konusu yöntemler, bulusun kapsami dahilindedir. Bulusun bir yöntemi ile elde edilen, Lgr5 eksprese eden bir hücre popülasyonu da açiklanmistir. Mevcut tarifnameyi okuyan uzman kisilerce anlasilacagi üzere, bulusun tercih edilen kültür yöntemleri, besleyici hücreler gerekmedigi için avantajlidir. Besleyici hücre katmanlarina, kök hücrelerin kültürünü desteklemek ve bunlarin farklilasmasini inhibe etmek için sik sik gerek duyulur. Bir besleyici hücre katmani, genellikle ilgi konusu hücreler ile birlikte kültürlenen ve bu hücrelerin büyümesi için uygun bir yüzey saglayan tek bir hücre katmanidir. Besleyici hücre katmani, ilgi konusu hücrelerin büyüyebilecegi bir ortam saglar. Besleyici hücreler genellikle, çogalmayi önlemek için (örnegin isinlama veya mitomisin C ile muamele yoluyla) mitotik olarak inaktive edilmistir. Besleyici hücrelerin kullanimi, hücrelerin pasajini zorlastirdigi için arzu edilmez (hücrelerin her pasajda besleyici hücrelerden ayrilmasi gerekir ve her bir pasajda yeni besleyici hücreler gerekir). Besleyici hücrelerin kullanimi ayrica, arzu edilen hücrelerin besleyici hücreler ile kontamine olmasina neden olur. Bu durum, herhangi bir tibbi uygulama için net bir sekilde problem yaratir ve hatta bir arastirma baglaminda, hücreler üzerinde yapilan deneylerin sonuçlarinin analiz edilmesini zorlastirir. Burada baska bir kisimda belirtildigi gibi, bulusun kültür ortami, besleyici hücre temasi olmaksizin kültür` hücrelerine kullanilabilmesinden dolayi özellikle avantajlidir; baska bir ifadeyle bulusun yöntemleri, büyümesi desteklenmekte olan hücreleri destelemek için bir katman besleyici hücre gerektirmez. Dolayisiyla bulusun bilesimleri, besleyici hücre içermeyen bilesimler olabilir. Bir bilesimin, bilesim içindeki karaciger hücrelerinin, bir besleyici hücre katmaninin yoklugunda en az bir pasaj boyunca kültürlenmis olmasi durumunda, konvansiyonel olarak besleyici hücre içermedigi kabul edilir. Bulusun bir besleyici hücre içermeyen bilesimi, normal olarak yaklasik toplam hücre sayisina göre % seklinde ifade edilmistir) içerecektir veya tercihen hiç besleyici hücre içermeyecektir. Tercih edilen bir uygulamada, örnegin bir karaciger organoidinin rejeneratif tip için kullanilacak olmasi durumunda, söz konusu yöntem, epitel hücrelerden veya bir izole edilmis karaciger fragmanindan baslatilabilir. Hücreler veya karaciger fragmani, otolog veya allojeneik olabilir. "Otolog" hücreler, örnegin doku rejenerasyonuna izin vermek amaciyla hücresel terapi için yeniden dahil edildigi organizma ile ayni organizmaya ait hücrelerdir. Bir otolog hücrenin, prensip olarak immün reddi sorunlarinin üstesinden gelmek için hastayla eslesmesi gerekmez ve/veya nakil sonrasinda immün baskilama girisimlerine olan ihtiyaci azaltir. "Allogeneik" hücreler, örnegin ayni tür olmasina ragmen doku rejenerasyonuna izin vermek için, hücrelerin hücresel terapi için verildigi bireyden farkli bir bireyden elde edilen hücrelerdir. Rejeksiyon problemlerini önlemek için bir dereceye kadar hasta uyumu gerekebilir. Doku reddini en aza indirmeye yönelik teknikler, teknikte uzman kisilerce iyi bilinir. Bulusun tercih edilen bir yöntemi, söz konusu epitel kök hücreleri içeren bir izole edilmis karaciger fragmaninin kültürlenmesine yönelik bir yöntemi kapsar. Tercih edilen baska bir yöntem, bir karaciger organoidin epitel kök hücrelerden ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis karaciger fragmanlarindan elde edilmesine yönelik bir yöntemi kapsar. Tercih edilen baska bir yöntem, bir karaciger organoidin epitel kök hücrelerden ve/veya söz konusu epitel kök hücreleri içeren izole edilmis karaciger fragmanlarindan elde edilmesine ve kültürlenmesine yönelik bir yöntemi kapsar. Daha önce tanimlandigi gibi tercih edilen bir yöntemde, BMP inhibitörü, Noggin, DAN ve Cerberus ve Gremlin dahil DAN benzeri proteinler arasindan seçilir, tercihen Noggin içerir veya Noggin'dir ve/veya söz konusu Wnt agonisti, bir veya daha fazla Wnt, tercihen Wnt-3a, R-spondin 1-4, Norrin ve bir GSK inhibitörü arasindan seçilir~ ve daha tercihen› Wnt-3a 've/veya R-spondin içerir veya Wnt-3a ve/veya R-spondin'dir. Bir baska tercih edilen uygulamada, bir karaciger organoidi, bir tek hücreden, tercihen Lgr5 eksprese eden bir hücreden elde edilir ve burada tek hücre, ilgi konusu bir nükleik asit molekülünü içeren bir nükleik asit yapisini içerir. Hücre ayrica, Hnfld ve Hnf4 gibi karaciger spesifik markörleri de eksprese edebilir. Lgr5'i eksprese eden belirli hücre tiplerinin izolasyonu, daha önce de tarif edilmistir (örn. bkz. WOZOO9/022907 ve WOZOlO/Ol6766). Ancak, burada açiklanan tipti Lgr5 eksprese eden karaciger spesifik kök hücreler, daha önce de tarif edilmistir. Dolayisiyla bulus, en azindan Lgr5 ile Hnfld, Hnf4a, Sox9, KRT7 ve KRT19 arasindan bir veya daha fazla markörlerin Önemli bir düzeyde dogal ekspresyonu ile karakterize edilen bir eriskin kök hücre popülasyonunu içeren bir organoid saglar. Bu hücre popülasyonu, Cd44 ve Sox9 gibi ince bagirsakta ve midede yaygin progenitör popülasyon markörlerini de eksprese eder (Barker & Huch ve dig. Cell stem cell 2010). Bunlar, bulusa göre kök hücrelerde yüksek düzeyde eksprese edilir, ancak eriskin karacigerinde eksprese edilmez ve burada tarif edilen karaciger kültürlerinin kendi kendini yenileme kapasitesini pekistirir. Mevcut bulusun bu görünümüne göre hücreler, örnegin MMP7, Sp5 ve Tnfrsl9 dahil olmak üzere Wnt hedef genlerini yukari dogru regüle edebilir. Bu, bu kültürlerin kendi kendini yenileme kapasitesini muhafaza etmek. için etkin ve saglani bir kanonik Wnt sinyal faaliyetine gerekli oldugunun güçlü kanitini saglar. rekombinant olarak manipüle edilmedigi anlamina gelir; baska bir ifadeyle hücreler, yapay olarak bu markörleri eksprese etmek veya bu Harkörlerin ekspresyonunu, heterojen (dogal olmayan) veya daha güçlü promotörler veya çalisir bir sekilde endojen genlere ya da genlerin egzojen olarak verilmis biçimlerine baglantilanmis diger düzenleyici sekanslarin dahil edilmesi gibi, egzojen genetik materyalin dahil edilmesiyle modüle etmek için suni olarak indüklenmemistir. Dogal ekspresyon, bunlarin mevcut oldugu ekson kodlama sekanslari arasinda var olan intronlar da dahil olmak üzere hücrelerdeki genomik DNA'dandir. Dogal ekspresyon, cDNA'dan degildir. Dogal ekspresyon, gerektiginde, genin okuma çerçevesi içinden sekanslanmasi, hariçten gelen herhangi bir heterojen sekansinin bulunmadiginin kontrol edilmesi gibi çesitli yöntemlerden herhangi biri yoluyla ispatlanabilir. "Eriskin", post-embriyonik anlamina gelir. Mevcut bulusun kök hücreleri ile ilgili olarak, "eriskin kök hücre" terimi, kök hücrenin bir hayvanin bir dokusundan veya organindan, embriyonik asamadan sonra büyüme asamasinda izole edildigi anlamina gelir. Bu kök hücre popülasyonu, birçogu hücresel farklilasma ile baglantili olan belirli markörlerin herhangi bir önemli düzeyde dogal ekspresyonunun eksikligi ile karakterize edilebilir. Spesifik olarak, izole edilmis eriskin kök hücre popülasyonunun hücreleri, dogal olarak Cdllb, CDl3, CDl4, AFP, Pdxl, herhangi bir CYP üyesi (örn. CYP3All, CYP llAl) arasindan bir veya daha fazlasini önemli bir düzeyde eksprese etmez. Burada tanimlandigi gibi, bu markörlerin negatif markörler oldugu söylenmektedir. varligini belirtmek için kullanilir. Eksprese edilmis olarak kabul edilebilmesi için, bir markörün saptanabilir bir seviyede bulunmasi gerekir. "Saptanabilir seviye", markörün, PCR, blotlama veya FACS analizi gibi standart laboratuvar metodolojilerinden birinin kullanilarak tespit edilebilecegi anlamina gelir. Bir genin, 30 PCR döngüsünden sonra ekspresyonun makul bir sekilde saptanabilmesi durumunda, bulusun bir hücre popülasyonu tarafindan eksprese edildigi düsünülür ve hücre basina en az yaklasik 100 kopya olan bir ekspresyon seviyesine karsilik gelir. "Eksprese etme" ve "ekspresyon" terimlerinin birbirlerine karsilik gelen anlamlari vardir. Bu esigin altindaki bir ekspresyon seviyesinde, bir markörün eksprese olmadigi kabul edilir. Bir markörün bulusun bir hücresindeki ekspresyon seviyesi ile ayni markörün baska bir hücredeki, örnegin bir embriyonik kök hücredeki ekspresyon seviyesinin karsilastirilmasi, tercihen ayni türden izole edilmis iki hücre türünün karsilastirilmasiyla gerçeklestirilebilir. Tercihen bu tür, bir memelidir ve daha tercihen bu tür, insandir. Bu sekilde bir karsilastirma, ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) deneyinin kullanilmasiyla gerçeklestirilebilir. Teknikte bilinen bir dizi fiziksel yöntemden herhangi biri, bulusun bu görünümünün hücrelerini seçmek ve bunlari diger hücre tiplerinden ayirt etmek için kullanilabilir. Bu gibi fiziksel yöntemler, bulusun hücreleri tarafindan spesifik olarak eksprese edilen markörlere dayanan FACS ve çesitli immüno-afinite yöntemlerini içerebilir. Yukarida tarif edilen sekilde, Lgr5, Hnfld ve Hnf4, hücrelerde yüksek seviyelerde eksprese edilen hücre markörlerinden üçüdür. Bu nedenle, yalnizca örnek olarak hücreler, bu markörlerin varligina dayanan birkaç fiziksel ayirma yöntemi ile izole edilebilir. Bir uygulamada hücreler, örnegin bu markörlerin birine karsi bir antikor kullanilarak FACS yoluyla izole edilebilir. Teknikte yetkin bir kisi tarafindan görülecegi üzere bu, floresan etiketli bir antikor vasitasiyla veya birincil antikor için baglanma özgünlügü olan bir floresan etiketli sekonder antikor vasitasiyla elde edilebilir. Uygun floresan etiketi örnekleri arasinda, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, FITC, Alexa Fluor® 488, GFP, CFSE, CFDA-SE, DyLight 488, PE, PerCP, PE-Alexa Fluor® PE-Cy7 bulunur. Bu liste sadece örnek amaçli verilmis olup, sinirlayici olmasi amaçlanmamistir. Teknikte uzman bir kisi, bir anti-Lgr5 antikoru kullanarak yapilan FACS analizinin saflastirilmis bir hücre popülasyonu saglayacagini görecektir. Bununla birlikte bazi uygulamalarda, tanimlanabilir diger markörlerden biri veya daha fazlasinin, tercihen Hnfld ve Hnf4'ün kullanildigi, ancak digerlerinin de kullanilabildigi daha ileri bir FACS analizi turu gerçeklestirerek hücre popülasyonunun daha da saflastirilmasi tercih edilebilir. Baska bir uygulamada hücreler, teknikte iyi bilinen bir ayirma yöntemi olan immüno-afinite saflastirmasi ile izole edilebilir. Sadece örnekleme amaçli olarak hücreler, c-kit'e yönelik immüno- afinite saflastirmasi ile izole edilebilir. Teknikte yetkin bir kisi tarafindan görülecegi üzere, bu yöntem, antikorlarin bir saflastirma kolonu üzerinde immobilizasyonuna dayanir. Hücre örnegi kolona yüklenir, böylece uygun hücrelerin antikorlarla baglanmasi ve dolayisiyla kolona baglanmasi saglanir. Bir yikama asamasinin ardindan hücreler, immobilize edilmis anti-c-kit antikoruna tercihen baglanan ve hücrelerin kolondan salinmasini saglayan bir rakip kullanarak kolondan ayristirilir. Teknikte uzman bir kisi, immobilize edilmis bir antikor kullanarak yapilan immüno-afinite saflastirma analizinin saflastirilmis bir hücre popülasyonu saglayacagini görecektir. Bununla birlikte, bazi uygulamalarda, diger tanimlanabilir markörlerin bir veya daha fazlasinin, örnegin Hnf4'ün kullanildigi ileri bir immüno-afinite saflastirma turu gerçeklestirerek hücre popülasyonunu daha da saflastirmak ve diger ilgili hücre içi markörlerin ekspresyonunu saptamak için izole edilmis klonlarin bir kismini kullanmak tercih edilebilir. Teknikte yetkin bir kisi, ardisik saflastirma adimlarinin ayni fiziksel ayirma yöntemini içermesi gerekmedigini açikça görecektir. Bu nedenle, örnegin, hücrelerin bir anti-Lgr5 antikoru kullanilarak bir FACS adimi, ardindan bir SSEA-l afinite kolonunun kullanildigi bir immüno-afinite saflastirma adimiyla saflastirilabilecegi açik olacaktir. Bazi uygulamalarda hücreler, izolasyondan sonra en az yaklasik 15, en az yaklasik gün, en az yaklasik 25 gün veya en az yaklasik 30 gün boyunca kültürlenebilir. Bazi görünümlerde hücreler, hücre popülasyonunda hücre fenotipinin homojenligini arttirmak için kültürde daha uzun süre genisletilir. Bu yöntemin diger özellikleri, tarifnamenin tanimlara ayrilmis kisminda tanimlanmistir. Teknikte bilindigi gibi büyük hücre kümeleri yerine, tek hücre süspansiyonlari veya küçük hücre kümeleri (2-50 hücre/küme) ekilir. Bunlar bölünürken, bu hücreler, bir destegin üzerine hücre çogalmasini tesvik eden bir yogunlukta ekilir. Tipik olarak tek hücreler kullanildiginda, en az 1-500 hücre/kuyucuk kaplama yogunlugu kullanilir ve kuyucugun yüzeyi 0,32 cm2 olur. Kümeler ekildiginde, kaplama yogunlugu tercihen 250-2500 hücre/cmz'dir. Yeniden kaplama için, yaklasik 2500 hücre/cm? ve yaklasik 5-000 hücre/cm2 arasinda bir yogunluk kullanilabilir. Yeniden kaplama esnasinda, teknikte bilinen sekilde, normal olarak büyük hücre kümeleri yerine, tek hücre süspansiyonlar veya küçük hücre kümeleri ekilir. Bulusun Organoidleri Yukarida açiklanan hücreler, "organoid" olarak adlandirilan cisimler halinde büyür. Dolayisiyla, bulusun bir yöntemiyle elde edilebilen bir organoid, bulusun baska bir görünümüdür. Bildigimiz kadariyla, bu kadar uzun bir süre sonra (baska bir ifadeyle, en az 7 aylik kültür; bkz. burada yer alan örnekler) islevsel ve canli olan bir karaciger organoidi ilk defa elde edilmistir. Islevsellik tercihen, burada tanimlanan sekilde bir karaciger markörünün varligi ve/veya burada tanimlanan sekilde söz konusu organoidin yapisi ile karakterize edilir. Elde edilen organoidlerin nihai miktari, kültür süresi ile iliskili oldugundan, uzman bir kisi bulusun öncü bir bulus oldugunu ve potansiyel olarak örnegin rejeneratif tipta olmak üzere yeni olanaklarin kapisini açacagini anlar. Örnegin mevcut bulusa göre bir organoid, en az 1xlO3 hücre, en az lxlO 4 hücre, en az lxlO5 hücre, en az lxlO6 hücre, en az lxlO7 hücre ya da daha fazla bir hücre popülasyonu içerebilir. Bazi uygulamalarda her bir organoid, yaklasik lxlO3 hücre ve 5xlO3 hücre arasinda hücre içerir; genel olacak 10-20 organoid, 24 kuyucuklu bir plakanin bir kuyucugunda birlikte büyütülebilir. Mevcut bulusa göre hücreler ve organoidler, insan disinda bir hayvan veya insan olabilir. Bulus sahipleri ilk defa, bulusun kültür ortamlarinin ve yöntemlerin kullanilmasiyla hem hayvan hem insan karaciger organoidlerini in vitro büyütmenin ve muhafaza etmenin mümkün oldugunu göstermistir. Mevcut bulusa göre üretilen organoidlerin açiklayici örnekleri, ekteki sekillerde verilmistir. Bulusa göre organoidlerin, bir kistik yapiya ve dis kisminda en azindan bir tomurcugu ve merkezi bir lümeni olan bir hücre katmanina sahip olabilecegi görülebilir. Matrigel'in disindaki organoidler, belki de gerekli büyüme faktörlerine daha iyi erisimleri oldugu için, matrigel'in merkezindeki organoidlerden daha büyük olma egilimindedir. Yapisal olarak ,bulusa göre organoidler genelde sekil bakimindan uzundur. Bunlar, bir veya daha fazla tomurcuklanma yapisina, bir safra kanalindan farkli olmayan bir yapiya sahip tek hücreli bir epitel katmanina sahip olabilir. Konfokal mikroskop altinda yapilar, keratin için pozitif boyanabilir. Bunlar, polarize çekirdekli ve küçük sitoplazmali hücreler içerebilir. Organoidler, çoklu katmanlardan olusan bir kesite sahip olabilir; bu hücrelerin çekirdekleri genellikle hücrelere göre daha merkezidir, yani polarize olmazlar. Çok katmanli kesitteki hücreler, hücreler arasinda bir bosluk veya lümen içerecek sekilde kendilerini organize edebilir. Bir karaciger organoidi tercihen, bir hepatosit ve bir kolanjiyosit hücresi içerir, daha tercihen asagidaki markörlerden en az bir tanesi saptanabilir: en az bir hepatosit markörü, örnegin transtiretrin, B-l integrini ve Glutamin sentetazi ve/veya CYP3A11, FAH, tbx3, TAT ve Gck'den en az biri ve/veya Keratin 7 ve 19 gibi en az bir kolanjiosit yapicisi. Uzman kisiler, bu markörlerin her birinin nasil saptanabilecegini (RT-PCR ve/veya immünofloresans) bilir. Tercihen, bu markörlerin her birinin ekspresyonu, deney bölümünde gerçeklestirildigi gibi degerlendirilir. Bu markörlerin her biri, bulusun bir yöntemi kullanilarak genellikle en az iki hafta, üç hafta veya bir aylik kültürden sonra eksprese edilir. Organoidlerin her iki kültür kosulundaki mikrodizi analizinde, karaciger organoidlerinin eriskin karaciger dokusuna benzedigi görülmüstür. Bazi uygulamalarda bir karaciger organoidindeki hücrelerin yaklasik %35'i bir hepatosit yüzey markörü, örnegin %25-45, %30- Tercihen, bulusa göre üretilen hücreler ve organoidler ayrica, albümin, B-l integrini, CK-8, CK-18, trans-sitrat (TTR), glikoz 6P, Met, Glutamin sentazi (Glul), transferrin, Fahdl, Fahd2a, K7, Kl9 ve sitokrom P 2DlO (CYPZDlO), , hepatik markorleri için pozitif ekprese etme veya boyama gibi hepatosit fonksiyonlara sahiptir. Ayrica, embriyonik karaciger geni AFP, bazi uygulamalarda eriskin karacigerinde oldugu gibi her iki kültür kosulunda da saptanmaz. Bazi uygulamalarda alfa fetal proteinin ekspresyonu, arka plan gen ekspresyonunun hemen üstündedir. Ayrica, HNFla, HNFlb ve HNF4a gibi iyi bilinen karaciger transkripsiyon faktörleri, her iki kosulda da yüksek düzeyde eksprese edilir. Karaciger ve pankreas birbirleriyle iliskili organlar oldugu için, karaciger kültürlerimizin de pankreasa özgü genlerle eksprese edilip edilmedigini arastirdik. Pankreas, fonksiyonel olarak endokrin ve ekzokrin pankreasa bölünmüstür. Endokrin pankreas esas olarak insülin, glukagon ve somatostatin eksprese etmesi ile karakterize edilir. Bu hormonlarin ekspresyonu, bir dizi endokrin pankreas spesifik transkripsiyon faktörü tarafindan siki bir sekilde düzenlenir ve bu faktörlerden en önemlileri, Pdxl ve NeuroD'dir. Ekzokrin pankreas, digerlerinin yaninda amilaz, pankreatik lipaz ve kimotripsin sindirim enzimlerini üretmekten sorumlu asiner ve duktal bölmelerden olusur. Bu genlerin ekspresyonu ayrica, Ptfl gibi spesifik ekzokrin pankreatik genleri tarafindan düzenlenir. Burada tarif edilen karaciger kültürlerinde Ptfla, pankreatik amilaz (Amy2a4), pankreatik lipaz (Pnlip), insülin (insl ve insZ), glukagon (Gcg), kimotripsin (celal), Pdxl ve NeuroD bulunmamaktaydi. Bazi uygulamalarda asagidaki genlerin biri veya daha fazlasi veya tamami, eriskin karaciger hepatositlerinde karsilik gelen gene benzer düzeyde karaciger organoidlerinde eksprese edilir: qul, Bmp2, Apo3, Apol7a, Sord, C3, Ppara, Pparg, tbx3, lgfl, lll7rb, lllb, Tgfbi, Apoal, Apoa4, Apob, Cyp26bl, Cyp27al, Cyp4alO ve Cypfl4. Örn. bkz. Sekil 16A. Bazi uygulamalarda asagidaki genlerin bir veya daha fazlasi veya tamami, eriskin karaciger hepatositlerinde karsilik gelen gene kiyasla karaciger organoidlerinde benzer kapanma seviyesinde eksprese edilir: CclZ, Osmr, Icaml ve CxclZ. Bazi uygulamalarda asagidaki genlerin biri veya her ikisi, bir karaciger organoidinde veya yenidogan karacigerinde diferansiyel olarak eksprese edilir: mKi67 ve cdkn3. Bazi uygulamalarda asagidaki genlerin biri, ikisi veya tamami, asagidaki genlerin biri, ikisi veya tamami, bir karaciger organoidinde veya yenidogan karacigerinde benzer bir düzeyde eksprese edilir: cyp2j6, olfm4 ve Lefty 1. Örn. bkz. Sekil 16B. Bazi uygulamalarda, bulusun bir karaciger organoidi, bulusun genisleme ortaminda (örn. EMl veya EMZ) kültürlendigi zaman bir duktal fenotipe sahiptir. Bazi uygulamalarda, bulusun bir karaciger organoidi, bulusun bir farklilasma ortaminda kültürlendiginde eriskin karaciger markörlerini eksprese eder. Bir uygulamada bulusa ait bir karaciger organoidi, Sekil 16C'de gösterildigi gibi bir gen ekspresyon profiline sahiptir. Özellikle tercih edilen bir uygulamada, bulusun bir fare karacigeri hücre popülasyonu veya organoidi, Sekil 18'de gösterildigi gibi gen ekspresyon profiline sahiptir. Örnegin, tercih edilen bir uygulamada, bulusun bir fare karacigeri hücre popülasyonu ya da organoidi: a) asagidaki kök hücre markörlerinden en az birini (örnegin Cdca7 ve Elf3; ve/Veya b) asagidaki kök hücre markörünü eksprese etmez: lgr6; c) bulusun genisleme ortaminda büyütüldügünde asagidaki hepatosit veya kolanjiyosit markörlerinin en az birini (örn. 1, tercihen tamamini eksprese eder: Hnfla, Hnflb, Hnf4a, Hhex, Onecutl, Onecut2, Proxl, Cdhl, Foxa2, Gata6, Foxml, Cebpa, Cebpb, Cebpd, Cebpg, Glul, Krt7, Krtl9 ve Met; ve/Veya d) bulusun genisleme ortaminda büyütüldügünde asagidaki Ptfla, Celal, Cela2a, Cela3b, Neurodl, NeurodZ, Neurogl, Neurog2, Neurog3, Amy2a4, Igflr, Igf2 ve Cd34; ve/veya e) bulusun asagidaki yeniden programlama genlerinden en az birini (örnegin 1, 2 veya 3) eksprese eder: Klf4, Myc ve Pou5f1 f) asagidaki yeniden programlama genini eksprese etmez: burada, genlerin ekspresyonu tercihen mRNA seviyesinde ölçülerek, örnegin bir mikrodizi kullanilarak saptanir. Daha tercihen, bulusun bir fare karacigeri hücre popülasyonu veya organoidi, yukaridaki a) ila f) maddeleri arasindaki Bazi uygulamalarda, yukarida bulusun bir fare karaciger hücre popülasyonu veya organoidi için tarif edilen gen ekspresyon profili, bulusun genisleme ortaminda kültürlenen bir fare hücre popülasyonu veya organoidi içindir. Bazi uygulamalarda mevcut bulusun, Sekil l9'da gösterilen gen ekspresyon imzasina sahip bir insan karacigeri hücre popülasyonu veya organoidi saglanmistir. Örnegin, bulusun EMl'inde kültürlenen bir insan karacigeri hücre popülasyonu veya organoidi, tercihen EMl hücre kültürü ortaminda eksprese edildigi sekilde Sekil l9'da belirtilen genleri eksprese eder. Örnegin, bulusun EM2'inde kültürlenen bir insan karacigeri hücre popülasyonu veya organoidi, tercihen EMZ hücre kültürü ortaminda eksprese edildigi sekilde Sekil l9'da belirtilen genleri eksprese eder. Örnegin DM'de kültürlenen bir insan karacigeri hücre popülasyonu veya organoidi, tercihen› DM hücre kültürü ortaminda eksprese edildigi sekilde Sekil l9'da belirtilen genleri eksprese eder. Örnegin, tercih edilen bir uygulamada, bulusun bir insan karacigeri hücre popülasyonu ya da organoidi: a) asagidaki kök hücre imza genlerinden en az birini (Örnegin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), tercihen tamamini eksprese eder: LGR4, TACSTDl/Epcam, CD44, SOX9, SP5, CD24, PROMl, CDCA7 ve ELF3; ve/veya b) asagidaki yeniden programlama genlerinden en az birini (örnegin 1, 2, 3, 4), tercihen tamamini eksprese eder: KLF4, MYC, POU5F1 ve SOX2; ve/veya c) asagidaki hepatosit/kolanjiyosit spesifik genlerin en HNFlB, HNF4A, HHEX, ONECUTl, ONECUTZ, PROXl, CDHl, FOXAZ, GATA6, FOXMl, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, GLUL, KRT7, KRT19 ve MET; d) asagidaki hepatosit/kolanjiosit spesifik genlerin en az birini (örn. 1, 2, 3, 4, 5, 6), tercihen tamamini eksprese etmez: NEUROGZ, IGFlR. ve CD34, AFP, GCG ve PTFlA; örnegin NEUROGZ, IGFlR ve CD34'ü eksprese etmez; ve/Veya e) asagidaki hepatosit spesifik genlerin en. az birini 18), tercihen tamamini eksprese eder: TTR, ALB, FAH, TAT, CYP3A7, APOAl, HMGCSl, PPARG, CYPZBö, CYP2C18, CYP2C9, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F8, CYP4V2 ve SCARBl; burada, genlerin ekspresyonu tercihen mRNA seviyesinde ölçülerek, örnegin bir mikrodizi kullanilarak saptanir. Daha tercihen, bulusun bir insan karacigeri hücre popülasyonu veya organoidi, yukaridaki a) ila f) maddeleri arasindaki Bazi uygulamalarda bulusun bir insan karacigeri hücre popülasyonunda veya organoidindeki genler, Sekil l9'da gösterildigi gibi bir referans RNA'nin ekspresyonuna göre yukari dogru veya asagi dogru regüle edilir. Tercihen referans RNA, Evrensel Insan Referansi RNA'dir (Stratagene, Catalog #740000). Bazi uygulamalarda bir gen, Sekil l9'da referans RNA'ya göre yukari dogru veya asagi dogru regüle edildigi halde referans RNA'ya göre yukari dogru veya asagi dogru regüle edilir, ancak yukari veya asagi regülasyonun kapsaminin ayni olmasi gerekmez. Baska uygulamalarda asagi regülasyon veya yukari regülasyonunun , %+/-5, +/-3 veya Sekil l9'da gösterilen ile neredeyse aynidir. Baska uygulamalarda genlerin ekspresyonunun bulusun bir insan organoidindeki mutlak seviyesi, %+/-35, %+/-30, %+/-25, gösterilenle neredeyse aynidir. Bulusun insan karacigeri hücre popülasyonu veya organoidleri ayrica tercihen Egr5 ve/veya Tnfrsfl9'u, tercihen her ikisini de eksprese eder. Bazi uygulamalarda insan karacigeri hücre popülasyonu veya organoidleri, bulusun genisleme ortaminda kültürlendiginde Lgr5 ve/veya Tnftsf9'u, tercihen her ikisini de eksprese eder. Tercihen, Lgr5 ve/veya Tnfrsfr19'un ekspresyonu, RT PCR ile saptanabilir. Bazi uygulamalarda Lgr5 ve/veya Tnfrsfl9, genisleme ortaminda kültürlendiginde ekspresyon organoidlerinin veya hücrelerinin seviyelerine kiyasla farklilasma ortaminda kültürlendiginde organoidler veya hücrelerde çok daha düsük ekspresyon düzeylerinde bulunur (örn. en az 15 kat daha düsük). Mevcut bulusa göre hücreler ve organoidler, örnegin 106 hücre basina saatte yaklasik 1 ug ile 106 hücre basina saatte 10 ug arasinda, tercihen 106 hücre basina saatte 2 ug ile 6 ug arasinda albümin salgilama özelligine sahip olabilir. Ayrica bu hücreler ve organoidler, üre salgilayabilirler. Örnegin, 35 mm'lik bir hücre tabaginda, üre sentezinin aktivitesi, 48 saat içinde lug ve SOug arasinda, tercihen Sug ila 30ug arasinda olabilir. Bulusa göre hücreler ve organoidler, örnegin boyandiklarinda görünür glikojen depolari gösterebilir. Bulusa göre hücrelerin ve organoidlerin aktif olarak glikojen sentezleyebilme kapasitesi, kültür ortamini düsük glikoz diferansiyasyon ortamindan iki gün boyunca %10 FBS ve 0,2 pM deksametazon ile takviye edilmis yüksek glikoz DMEM'e degistirilerek test edilebilir. Bulusa göre hücreler ve organoidler, indüklenebilir sitokrom P sahip olabilir. Bu tür aktivite, örnegin bir etoksiresorufin-O-deetilaz (EROD) analizi (Cancer hücreler veya organoidler, kontrol hücrelerine kiyasla 3- metilkolandren ve EROD aktivitesi seviyeleri gibi bir P450 substratina maruz birakilabilir. Morfolojik olarak hücreler, hepatosit benzeri gibi görünür. Tercih edilen bir karaciger organoidi, bir kistik yapi ve dis kisminda Sekil 2'de gösterildigi gibi tomurcuklari ve merkezi bir lümeni olan bir hücre tabakasi içerir veya bunlardan olusur. Bu karaciger organoidi, asagidaki özelliklerden birine veya daha fazlasina (örn. 2, 3 veya 4'ünün tamami) sahip olabilir: (a) olan; (b) 2-30 katman hücreye denk bir kalinliga, tercihen 2-15 katman hücreye denk bir kalinliga sahip olan; (0) hücrelerin, karsilikli olarak üç boyutta temas halinde olmasi, (d) saglikli karaciger dokusunda bulunan bir islevi gösteren, (e) 2 tanimlanmis domenli uzun bir sekle sahip olan, yani yüksek düzeyde polarize hücrelerin saptandigi ve keratin markörlerinin eksprese edildigi (bu domen safra kanali domenine benzer) ve diger domen organoidinin ana gövdesini olusturan ve polarize edilmemis hücrelerle çok katmanli bir epitelyumdan olusan tek katmanli bir epitel domene sahip, burada, albümin ekspresyonu saptanabilir. Bu tür bir karaciger organoidinin tercihen bir karaciger fragmani olmadigi ve/veya bir kan damari içermedigi ve/veya bir karaciger lobülü veya bir safra kanali içermedigi uzman bir kisi tarafindan anlasilabilir. Bulus baglaminda, bir karaciger fragmani, eriskin bir karacigerin, tercihen bir insan eriskin karacigerinin bir parçasidir. Bu nedenle, burada tanimlandigi gibi bir karaciger organoidi, tercihen bir karaciger fragmani degildir. Bir karaciger organoidi, tercihen eriskin bir karacigere ait bir hücrenin, tercihen eriskin bir karacigerin bir epitel kök hücresi, daha tercihen Lgr5 eksprese eden eriskin bir karacigerden alinan bir epitel kök hücre kullanilarak elde Bazi uygulamalarda bir karaciger organoidi, Lgr5'i eksprese eden hücreleri içerir. Örnegin bazi uygulamalarda, karaciger organoidindeki hücrelerin en az %2'si, daha tercihen en az %S'i, en az %lO'u, en az %20'si, en az %30'u, en az %40'i, en az en az %95'i Lgr5'i eksprese eder. Benzer sekilde mevcut bulus, Lgr5'i eksprese eden bir hücre veya bir hücre popülasyonu saglar ve burada söz konusu hücreler, bulusun bir karaciger organoidinden elde edilir. Bu hücrelerin soylari da bulus tarafindan kapsanmaktadir. Bir uygulamada› bir karaciger organoidi, bulusun bir yöntemi kullanilarak hala kültürlenen ve bu nedenle bir hücre disi matrisle temas halinde olan bir karaciger organoididir. Tercihen bir karaciger organoidi, mezenkimal olmayan bir hücre disi matriste gömülüdür. Mevcut bulusun baglaminda, "temas halinde" ifadesi, fiziksel veya mekanik veya kimyasal temas anlamina gelir; bu ifade, söz konusu karaciger organoidinin söz konusu hücre disi matristen ayrilmasi için bir kuvvetin kullanilmasi gerektigi anlamina gelir. Tercih edilen bir uygulamada, bir karaciger organoidi, en az 2, ay veya daha uzun süre kültürlenebilir. Bir baska tercih edilen uygulamada, bir karaciger organoidi, tercihen Lgr5 eksprese eden bir tek hücreden elde edilir ve daha çok tercihen burada tek hücre, ilgi konusu bir nükleik asit molekülünü içeren bir nükleik asit yapisini içerir. Mevcut bulus ayrica, epitel kök hücrelerin veya bu kök hücreleri içeren izole edilmis organoid yapilarinin hücre disi bir matris üzerinde kültürlenmesi için bulusa göre bir kültür ortaminin kullanimini saglar ve burada söz konusu kök hücreler tercihen insan embriyonik kök hücreleri içermez. Insan eriskin kök hücreleri tercih edilir. Ayrica karacigerden elde edilen tek ayrilmis epitel kök hücreler, 3 boyutlu organoidleri bulusa göre bir kültür ortaminda baslatabilir. Bulus ayrica, kök hücreleri içeren karaciger fragmanlarinin kültürlenmesi için bulusa göre bir kültür ortaminin kullanimini saglar. Söz konusu kök hücrelerin, karaciger kök hücreleri veya epitel kök hücreleri olmasi tercih edilir. Bulusa göre bir kültür ortami, uzun vadeli kültür kosullarinin olusturulmasini saglar ve bu kosullar altinda tüm farklilasmis hücre tiplerinin bulundugu bir karaciger organoidi olusturulur. Mevcut bulusa göre bir kültür yönteminin kullanilmasi, en az yedi ay, en az sekiz ay, en az dokuz ay, en az on aylik kültür sürelerine olanak saglamistir. Mevcut bulus ayrica, tercihen en az %50 canli hücre, daha fazla tercihen en az %60 canli hücre, daha fazla tercihen en az %70 canli hücre, daha fazla tercihen en az %80 canli hücre, daha tercihen en az %90 canli hücre içeren bir karaciger organoidi saglar. Hücrelerin canliligi, FACS'de Hoechst boyama veya Propidyum Iyodür boyamasi kullanilarak degerlendirilebilir. Canli hücreler tercihen, yukarida tarif edilen sekilde hepatik fonksiyonlara veya hepatositlerin özelliklerine sahiptir. Bulusun Hücrelerinin ve Organoidlerinin Kullanimlari Baska bir görünümde bulus, yukarida tarif edildigi gibi bulusa göre bir karaciger hücresi veya organoidinin bir ilaç kesif taramasinda, toksisite tahlilinde veya rejeneratif tipta kullanilmasini saglar. Bulus ayrica, bulusun karaciger organoidlerinin soyunun toksisite analizlerinde kullanimini saglar. Bu toksisite analizleri, bir karaciger organoidi veya bir karaciger organoidinin parçasindan türetilmis bir hücrenin kullanildigi in vitro analizler olabilir. Bu soy ve karaciger organoidlerinin kültürlenmesi kolaydir ve örnegin mevcut durumda toksisite analizlerinde kullanilan Caco-Z (ATCC HTB-37), I- gibi epitel hücre hatlarindan ziyade primer epitel hücrelere daha çok benzer. Karaciger organoidleriyle elde edilen toksisite sonuçlarinin hastalarda elde edilen sonuçlara daha fazla benzemesi beklenmektedir. Bir hücre bazli toksisite testi, organ spesifik sitotoksisitenin belirlenmesi için kullanilir. Söz konusu testte test edilen bilesikler, kanser kemopreventif ajanlari, çevresel kimyasallari, gida takviyelerini ve potansiyel toksik maddeleri içerir. Hücreler, belli bir süre birden fazla konsantrasyonda test ajanina maruz birakilir. Analizdeki test ajanlari için konsantrasyon araliklari, bes günlük bir maruz kalma süresinin ve en yüksek çözülebilir konsantrasyondan log seyreltmelerinin kullanildigi bir ön analizde belirlenir. Maruz kalma süresinin sonunda kültürler, büyüme inhibisyonu bakimindan degerlendirilir. Veriler, son noktayi yüzde 50 oraninda inhibe eden konsantrasyonu (TC50) belirlemek için analiz edilir. Örnegin karaciger hepatositlerindeki sitokrom P450 enzimlerinin indüksiyonu, ilaçlarin etkinligini ve toksisitesini belirleyen önemli bir faktördür. Özellikle P450'lerin indüksiyonu, sorunlu ilaç-ilaç etkilesimlerinin önemli bir mekanizmasidir ve ilaç etkinligini sinirlayan ve ilaç toksisitesini düzenleyen önemli bir faktördür. Sitokrom P450 indüksiyon analizlerinin gelistirilmesi, intakt normal insan hepatositleri gerektirdiklerinden zor olmustur. Bu hücrelerin yüksek verimli analizlerin seri üretimini sürdürmek için yeterli sayida üretime Örnegin bulusun bu görünümüne göre bir aday bilesik, burada tarif edildigi gibi hücre veya organoid ile temas halinde olabilir ve hücrelere veya hücrelerin aktivitesinde meydana gelen herhangi bir degisim izlenebilir. Mevcut bulusun hücrelerinin veya organoidlerinin terapötik amaçli olmayan diger kullanimlarinin örnekleri arasinda, karaciger embiyolojisi, karaciger hücre soylari ve farklilasma yollarinin arastirilmasi; rekombinant gen ekspresyonu dahil gen ekspresyon çalismalari; karaciger hasari Ve onariminda rol oynayan mekanizmalar; karacigerin inflamatuar ve bulasici hastaliklarinin arastirilmasi; patojenik mekanizmalara iliskin çalismalar ve karaciger hücresi dönüsümünün mekanizmalari ve karaciger kanserinin etiyolojisine iliskin çalismalar bulunur. Yüksek verimli amaçlar için söz konusu karaciger organoidleri, örnegin 96 kuyucuklu plakalar veya 384 kuyucuklu plakalar gibi çok kuyucuklu plakalarda kültürlenir. Molekül kütüphaneleri, söz konusu organoidleri etkileyen bir molekülü tanimlamak için kullanilir. Tercih edilen kütüphaneler arasinda antikor fragmani kütüphaneleri, peptit faji gösterim kütüphaneleri, peptit kütüphaneleri (örn. LOPAPW, Sigma Aldrich), lipit kütüphaneleri (BioMol), sentetik bilesik kütüphaneleri (örn. LOP AC", Sigma Aldrich) veya dogal bilesik kütüphaneleri (Specs, TimTec) bulunur. Ayrica, adenom hücrelerin soyunda bir ya da daha fazla genin ekspresyonunu indükleyen veya bastiran genetik kütüphaneler kullanilabilir. Bu genetik kütüphaneler arasinda CDNA kütüphaneleri, antisens kütüphaneleri ve siRNA veya diger kodlayici olmayan RNA kütüphaneleri bulunur. Hücreler tercihen belli bir süre birden fazla konsantrasyonda test ajanina maruz birakilir. Maruz kalma süresinin sonunda kültürler degerlendirilir. "Etkileyen" terimi, bunlarla sinirli olmamak üzere çogalmanin azalmasi veya kaybi, bir morfolojik degisiklik ve hücre ölümü de dahil olmak üzere bir hücredeki herhangi bir degisikligi kapsamak için kullanilir. Söz konusu karaciger organoidleri ayrica söz konusu karaciger organoidlerini hedeflemeyip epitel karsinom hücreleri spesifik olarak hedefleyen ilaçlari tanimlamak için kullanilabilir. Bulusa göre karaciger organoidleri ayrica, potansiyel yeni ilaçlarin veya bilinen veya yeni gida takviyelerinin toksisite analizlerinde Caco-2 hücreleri gibi, hücre hatlarinin kullaniminin yerini alabilir. Ayrica bu karaciger organoidleri, bir patojenin kültürlenmesi için kullanilabilir. Karaciger organoidlerini içeren kültürler, rejeneratif tipta, örnegin karaciger epitelinin radyasyon sonrasi ve/veya ameliyat sonrasi hasarinda, kronik veya akut karaciger yetmezlik veya hastaligindan muzdarip hastalarda epitel hasarinda yararlidir. Karaciger hastaliklari arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, Hepatosellüler Karsinom, Alagille Sendromu, Alfa-l-Antitripsin Eksikligi, Otoimmün Hepatit, Biliyer Atrezi, Kronik Hepatit, Karaciger Kanseri, Siroz Karaciger Sirozu, Kistler, Yagli Karaciger, Galaktozemi Gilbert Sendromu, Primer Safra Sirozu, Hepatit A, Hepatit B, Hepatit C, Primer Sklerozan Kolanjit, Reye Sendromu, Sarkoidoz, Tirozinemi, Tip I Glikojen Depo Hastaligi, Winson Hastaligi, Neonatal Hepatit, Alkolik Olmayan SteatoHepatit, Porfiria ve Hemakromatoz bulunur. Karaciger yetmezligine neden olan genetik kosullar, bulusun ortamina ve/Veya yöntemlerine göre kültürlenmis hücrelerin kullanildigi kismi veya tam hücre replasmani biçimindeki hücre bazli terapiden faydalanabilir. Karaciger yetmezligine neden olan genetik kosullarin sinirlandirici olmayan bir listesinde sunlar bulunur: Progresif ailesel intrahepatik kolestaz, Glikojen depo hastaligi tip III, Tirosinemi, Deoksiguanozin kinaz eksikligi, Piruvat karboksilaz eksikligi, Konjenital diseritropoetik anemi, Polikistik Karaciger Hastaligi, Polikistik Karaciger Hastaligi, Alfa-l antripsin eksikligi, üre döngüsü bozukluklari, Organik asidemi, lizozomal depo hastaliklari ve Yag Asidi Oksidasyon Bozukluklari. Hücre bazli terapiden faydalanabilecek diger kosullar arasinda Wilson Hastaligi ve Kalitsal amiloidoz (FAP) bulunur. Tam terapötik etkiye ulasmak için bütün bir karaciger nakli gerektirecek karaciger yetmezliginin hepatosit ile ilgili olmayan diger nedenlerde de bulusun ortamina ve/veya yöntemlerine göre kültürlenmis hücrelerin kullanildigi hücre bazli terapi kullanilarak geçici isleV' restorasyonundan faydalanabilir. Bu tür kosullarin sinirlayici olmayan bir listesinde asagidakiler bulunur: Primer Safra Sirozu, Primer Sklerozan Kolanjit, Aglagille sendromu, Homozigoz Ailesel hiperkolesterolemi, Sirozlu Hepatit B, Sirozlu Hepatit C, Sirozlu Hepatit C, Primer hiperoksalüri, Otoimmün Hepatit ve Alkolik karaciger hastaligi. Bulusun karaciger organoidleri, düzgün çalismayan hepatositleri içeren kalitsal bir hastaligin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanilabilir. Bu hastaliklar, erken baslangiçli veya geç baslangiçli olabilir. Erken baslangiçli hastaliklar arasinda metabolit ile ilgili organ yetmezligi (örn. alfa-l-antitripsin eksikligi), glikojen depo hastaliklari (örn. GSD II, Pompe hastaligi), tirosinemi, hafif› DGUOK, CDA. tip I, Üre döngüsü bozukluklari (örn. OTC eksiklikligi), organik asidemi ve yag asidi oksidasyon bozukluklari bulunur. Geç baslangiçli hastaliklar arasinda primer hiperoksalüri, ailesel hiperkolesterolemi, Wilson hastaligi, Kalitsal Amiloidoz ve Polikistik karaciger hastaligi bulunur. Bulusun karaciger organoidlerinden kaynaklanan saglikli hepatositlerle kismi veya tam replasman, karaciger fonksiynunu geri kazandirmak veya karaciger yetmezligini ertelemek için kullanilabilir. Bulusun karaciger organoidleri, kalitsal metabolik hastalik nedeniyle veya hepatosit enfeksiyonunun bir sonucu olarak ortaya çikan kronik karaciger yetmezliginin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanilabilir. Bir kalitsal metabolik hastaligin tedavisi, bulusun genetigi degistirilmis otolog karaciger organoidlerinin uygulanmasini içerebilir. Hepatosit enfeksiyonlarinin tedavisi, bulusun allojenik karaciger organoidlerinin uygulanmasini içerebilir. Bazi uygulamalarda karaciger organoidleri, 2-3 aylik bir süre boyunca uygulanir. Bulusun karaciger organoidleri, örnegin parasetamol, ilaç veya alkol kullanimindan kaynaklanabilen karaciger zehirlenmesinin bir sonucu olarak akut karaciger yetmezligini tedavi etmek için kullanilabilir. Bazi uygulamalarda karaciger fonksiyonunun geri kazandirilmasina yönelik terapi, bulusun organoidlerinden elde edilen dondurulmus ve kullanima hazir allojenik hepatositlerden hepatosit süspansiyonunun enjekte edilmesini içerecektir. Uygun organoidlerin dondurulabilmesi, organoidlerin derhal uygulamaya hazir olabilecegi ve bu nedenle bir kan naklinin beklenmesine Yetersiz karaciger fonksiyonunun replasmani veya düzeltilmesi durumunda, mevcut bulusa göre olusturulan bir veya daha fazla karaciger organoidinden bir hücre-matris yapisinin olusturulmasi mümkün olabilir. Yeteri fonksiyon için hepatik hücre kitlesinin sadece yaklasik %lO'unun gerekli oldugu düsünülür. Bu, sinirli donör uygunlugu ve juvenil organlarin daha küçük boyutta olmasi nedeniyle çocuklara bütün organ naklinden ziyade görece organoid birimi bilesimlerinin implantasyonunu özellikle tercih edilebilir hale getirir. Örnegin 8 aylik bir çocugun yaklasik 250 g agirliginda normal bir karacigeri vardir. Bu çocuk bu nedenle yaklasik 25 gramlik bir dokuya ihtiyaç duyar. Bir eriskin karacigeri, yaklasik 1500 g agirligindadir; bu nedenle gerekli olan implant, eriskin karacigerinin yaklasik %l,5'i kadar olacaktir. Bulusa göre organoidler implante edildiginde, istege bagli olarak bir polimer iskelesine baglandiginda, yeni konakta çogalma meydana gelir ve ortaya çikan hepatik hücre kütlesi, eksik konak fonksiyonunun yerini alir. Bulus sahipleri ilk kez, eriskin karaciger kök hücrelerinden veya insan disindaki hayvanlara veya insanlara nakil gerçeklestirmek için uygun olan kök hücreleri içeren karaciger doku fragmanlarindan olgun hepatositleri üretmenin mümkün oldugunu göstermistir. Bulus sahipleri, bulusa göre birinci kültür ortamini kullanarak, bir karaciger kök hücre popülasyonunu muhafaza etmenin ve genisletmenin mümkün oldugunu göstermistir. Bulus sahipleri, bulusa göre ikinci kültür ortamini kullanarak, hepatoblastlarin, nakil amaçlarina uygun olgun hepatositlere in vivofarklilasabilecegini göstermistir. Bu nedenle bulus sahipleri, karaciger rejenerasyonu, yetersiz karaciger fonksiyonunun replasmani veya düzeltilmesine yönelik yeni bir hepatosit kaynagi saglar. Bulus sahipleri ayrica, mevcut bulusun yöntemleri ile büyütülmüs organoidlerin immün yetersiz farelere basari bir sekilde gerçeklestirilen naklini ve nakli yapilmis organoid türevli hücrelerin in vivo kolanjiyositleri ve hepatositleri ürettigini (bkz. örnek 7) göstermistir. Bu nedenle bir uygulamada mevcut bulus, insan veya hayvanlara nakil gerçeklestirmeye yönelik bulusun organoidlerini veya organoid türevli hücrelerini saglar. Insan karaciger organoidlerinin nakil amaçlarina yönelik kullanimi, çesitli nedenlerden dolayi fetal veya eriskin hepatositlerin kullanimina göre daha avantajlidir. Ilk olarak bulusun kültür yöntemleri, sinirsiz hücre genislemesi ve buna bagli olarak sinirsiz bir tedarik saglar. Bulus sahipleri özellikle, dogru kültür kosullari altinda (örn. bulusun genisleme kültür ortami kullanilarak) Lgr5+ hücrelerinin lOOO'den fazla in vitro bölünme gerçeklestirebilecegini göstermistir. Bu nedenle Lgr5+ hücreleri, karaciger organoidlerinden ekstrakte edilebilir ve sürekli kendi kendine yenilenebilen bir nakil edilebilir hepatosit ve kolanjosit üreten hücre kaynagi saglamak üzere yeniden pasajlanabilir. Buna karsilik fetal ve eriskin hepatositlerin, yalnizca tek bir nakil turu saglayan donör karacigerlerinden elde edilir. Ayrica donör hücreler, yalnizca birkaç gün hayatta kalabilir, ancak hepatosit özelliklerini kaybedebilir. Bu, nakillerin donör hazir olur olmaz yapilmasi gerektigi anlamina gelir. Organoid türevli hücreler, birden fazla bölünme ve uzun süre boyunca fenotiplerini korur ve bu, bunlarin herhangi bir asamada nakli için hazir ve uygun olduklari anlamina gelir. Bu ayni zamanda karaciger nakli için bekleme listesindeki hastalar için hastalarin Ömrünü uzatmak amaciyla organoid türevli hücrelerin geçici bir karaciger tedavisi olarak kullanilmasini saglayabilir. Bulusun karaciger organoidlerinin baska bir avantaji ise fonksiyon kaybi olmaksizin dondurulabilmesi ve daha sonra çözündürülebilmesidir. Bu, hücre bankaciligi, kolay saklama ve hizli kullanilabilirlik saglar. Bu, örnegin akut karaciger toksisitesinin tedavisi için kullanilabilecek bir Organoidler ayrica, canli donörlerden küçük biyopsiler halinde alinan hücrelerden veya doku fragmanlarindan büyütülebilir ve böylece tedaviye yönelik etik itirazlar en aza indirilmis olur. Donör, tedavi edilecek hastadan bile olabilir ve böylece yabanci hücrelerin ve organlarin nakli ile iliskili her türlü negatif yan etki azaltilabilir ve immünosüpresif ilaçlara olan ihtiyaç azaltilabilir. Bu nedenle, mevcut bulusun kapsamina, bir insan veya hayvan hastanin hücresel terapi vasitasiyla tedavisi yönteminde kullanilmaya yönelik organoidler de girer. Buradaki "hayvan" terimi, tüm memeli hayvanlari, tercihen insan hastalari belirtir. Ayni zamanda, embriyonik ve fetal evreler dahil olmak üzere tüm gelisim evrelerindeki hayvanlari içerir. Örnegin hasta, bir yetiskin olabilir veya terapi, pediatrik kullanima yönelik olabilir (örn. yenidogan, çocuk veya ergen). Söz konusu hücresel terapi, bulusa göre üretilen hücrelerin veya organoidlerin bir hastaya herhangi bir uygun yolla uygulanmasini kapsar. Özellikle, bu tür tedavi yöntemleri, hasar görmüs dokularin rejenerasyonunu içerir. Burada kullanildigi sekliyle nakil yoluyla uygulama gibi, örnegin mevcut bulusa göre hücrelerden veya organoidlerden türetilen tasarlanmis karaciger dokusunun ameliyat yoluyla nakli, greftlenmesi veya nakli gibi iyi bilinen uygulama biçimlerini ifade eder. Hücreler söz konusu oldugunda bir bireye yapilan sistemik uygulama, örnegin üst mezenterik artere, çölyak artere, subklavyen damara torasik kanal yoluyla infüzyon, üst vena kava yoluyla kalbe infüzyon veya subdiafragmatik lenfatikler yoluyla daha sonra hücrelerin göçü ile peritoneal kaviteye veya infüzyon yoluyla karaciger bölgelerine hepatik arter kan akisina veya portal vene dogrudan infüzyon yoluyla mümkün olabilir. hücre uygulanabilir. Tercihen yaklasik l-5x104 ile l-5xl07 arasinda hücre, 100 kg'lik bir kisi için intravenöz olarak uygulanabilir. Daha çok tercihen yaklasik lxlO4 ile 10x106 arasinda hücre, lOO kg'lik bir kisi için intravenöz olarak infüze edilebilir. Bazi uygulamalarda, hücrelerin veya organoidlerin tekli bir uygulamasi saglanir. Baska uygulamalarda çoklu uygulama kullanilir. Örnegin ardisik 3-7 günlük bir baslangiç tedavi rejimi boyunca çoklu uygulamalar saglanabilir ve daha sonra baska zamanlarda tekrarlanabilir. Bazi uygulamalarda, bulusun bir karaciger organoidinden kaynaklanan saglikli hepatositlere sahip bir hastanin karacigerinin %lO-20'sini yeniden yerlestirilmesi/degistirilmesi arzu edilir. Burada tanimlandigi gibi Lgr5 eksprese eden bir tek hücreden bir karaciger organoidini yeniden olusturmak da mümkündür. Bu tek hücre, örnegin bir genetik eksikligi veya mutasyonu düzeltmek için burada tanimlandigi gibi bir nükleik asit yapisinin dahil edilmesiyle modifiye edilebilir. Ayrica, örnegin siRNA kullanilarak, ekspresyonun spesifik olarak kesilmesi de mümkün olacaktir. Eksprese edilecek potansiyel polipeptitler, örnegin AAT (alfa antitripsin) dahil olmak üzere metabolik karaciger hastaliklarinda eksik polipeptitlerden herhangi biri olabilir. Karaciger fizyolojisini açiklamak için Wnt, EGF, FGF, BMP veya çentik yolaginda yer alan genleri eksprese edebilir veya inaktive edebiliriz. Ayrica, ilaç toksisitesinin taranmasi için karaciger ilaç metabolizmasindan sorumlu genlerin ekspresyonu veya inaktivasyonu (örnegin CYP ailesindeki genler), yüksek Bir uygulamada genisletilmis epitel kök hücreler, örnegin bir hepatosit ve bir kolanjiyosit hücresi dahil olmak üzere ilgili doku kaderlerine yeniden programlanabilir. Simdiye kadar eriskin kök hücrelerinden karaciger hücrelerini rejenere etmek mümkün olmamistir. Mevcut bulusun kültürleme yöntemleri, yakindan iliskili epitel kök hücresini bir hepatosit ve bir kolanjiyosit hücresi dahil olmak üzere bir karaciger hücresine trans- farklilastiran faktörler` bakimindan analiz edilmesini mümkün kilacaktir. Yetkin bir kisi için, gen terapisinin ek olarak zarar görmüs veya hastalikli dokunun onarilmasina yönelik bir yöntemde kullanilabilecegi açiktir. Örnegin, kök hücrelere DNA ve/veya RNA gibi genetik bilgi aktarmak için bir adenoviral veya retroviral gen aktarim araci kullanimindan istifade edilebilir. Yetkin bir kisi, gen terapisinde hedeflenen. belirli genleri degistirebilir veya onarabilir. Örnegin, normal bir gen, fonksiyonel olmayan bir genin yerini almasi için genom içinde spesifik olmayan bir lokasyona yerlestirilebilir. Baska bir örnekte, homolog rekombinasyon yoluyla normal bir gen sekansi için anormal bir gen sekansi degistirilebilir. Alternatif olarak seçici ters mutasyon, bir geni normal islevine döndürebilir. Bir baska örnek, belirli bir genin regülasyonunu (bir genin açilip kapatilma derecesini) degistirmektir. Tercihen kök hücreler, bir gen terapisi yaklasimi ile ex vivo muameleye tabi tutulur ve daha sonra memeliye, tercihen de tedaviye ihtiyaç duyan bir insana aktarilir. Örnegin organoid türevli hücreler, hastalara nakledilmeden önce kültürde genetik olarak modifiye edilebilir. Bulus sahipleri, kalintisal Lgr5 saptansa da Lgr5'in saglikli karacigerde saptanamadigini bulmustur. Dolayisiyla mevcut açiklama ayrica, Lgr5'in eksprese edilip edilmediginin saptanmasini içeren karaciger hasarinin teshisine yönelik bir yöntemi tarif eder ve burada LgrS proteini ekspresyonu, karaciger hasarini belirtir. Mevcut açiklama ayrica, karacigerde Lgr5'in ekspresyonunun izlenmesiyle karaciger hasarinin veya rejenerasyonunun izlenmesine yönelik bir yöntemi tarif eder. Lgr5 ekspresyonu, uygun herhangi bir yöntemle ,örnegin akis sitometrisi, immünohistokimya veya PCR yöntemlerinin kullanimi yoluyla saptanabilir. Mevcut bulusma ayrica, yukarida tarif edilen bulusun görünümlerinden herhangi birine göre hücreleri ve/Veya organoidleri içeren bir bilesim, veya. hücre kültürü kabi ve yukarida tarif edilen bulusun görünümlerinden herhangi birine göre bir kültür ortami saglar. Örnegin böyle bir bilesim veya hücre kültürü. kabi, yukarida tarif edildigi gibi bir kültür ortaminda bulusun bir yöntemine göre kültürlenen herhangi bir sayida hücre veya organoid içerebilir. Örnegin tercih edilen bir kültür ortami, B27, N2 ile takviye edilmis Advanced-DMEM/FlZ, 200ng/ml N-Asetilsistein, 50ng/ml EGF, l ug/ml R-spondinl, 10 nM gastrin, 100 ng/ml FGFlO, 10mM Nikotinamid ve 50ng/ml HGF ve %50 Wnt kosullu ortami içerir veya bunlardan olusur. Tanimlar Bir nükleik asit yapisi, ilgi konusu bir nükleik asit molekülünü içerir ve söz konusu nükleik asit molekülünün, dahil edildigi hücrelerde ekspresyonunu saglar. Özellikle tercih edilen bir nükleik asit yapisi, bir polipeptiti kodlayan bir nükleik asit molekülünün, soz konusu nükleik asit molekülünün ekspresyonunu yönlendirebilen bir promotöre çalisabilir sekilde bagli oldugu bir ekspresyon vektörüdür. "Ekspresyon vektörü" ifadesi genellikle, bu sekanslarla uyumlu bir hücrede bulunan bir gen/nükleik asit molekülünün ekspresyonunu etkileyebilen bir nükleik asit leekülünü ifade eder. Bu ekspresyon vektörleri tipik olarak en azindan uygun promotör sekanslarini ve istege bagli olarak transkripsiyon sonlandirma sinyallerini içerir. Bir polipeptiti kodlayan bir nükleik asit veya DNA veya nükleotit sekansi, bulusun bir yönteminde tanimlandigi gibi bir in vitro hücre kültürüne dahil edilebilen ve eksprese edilebilen bir DNA/nükleik asit yapisina, dahil edilir. Belirli bir hücreye dahil edilmek üzere hazirlanan bir DNA yapisi, tipik olarak söz konusu hücre tarafindan taninan bir replikasyon sistemini, arzu edilen bir polipeptiti kodlayan amaçli bir DNA segmenti ve polipeptit kodlayici segmente çalisabilir sekilde bagli trankripsiyonel ve translasyonel baslatma ve sonlandirma düzenleyici sekanslari içerir. Bir DNA segmenti, baska bir DNA segmenti ile fonksiyonel bir iliski içine konuldugunda arttirici, sekansin transkripsiyonunu uyariyorsa bir kodlayici sekansa çalisabilir sekilde baglanmistir. Bir sinyal sekansi için DNA, bir polipeptitin salgilanmasina katilan bir preprotein olarak eksprese edilirse bir polipeptiti kodlayan DNA'ya çalisabilir sekilde baglanmistir. Genel olarak çalisabilir sekilde baglanmis bir DNA sekansi, bitisiktir ve bir sinyal sekansi söz konusu oldugunda hem bitisik hem de okuma asamasindadir. Ancak arttiricilarin kontrol ettikleri bir kodlayici sekans ile bitisik olmasi gerekmez. Baglama, uygun kisitlama alanlarinda veya bunun yerine yerlestirilmis adaptörlerde veya baglayicilarda ligasyon yoluyla gerçeklestirilir. Uygun bir promotör sekansinin seçilmesi genel olarak bir DNA segmentinin ekspresyonu için seçilmis konak hücreye baglidir. Uygun promotör sekanslarinin örnekleri arasinda teknikte iyi bilinen ökaryotik promotörleri bulunur (bkz. örn. yukarida yer alan Sambrook ve Russell, 2001). Bir transkripsiyonel düzenleyici sekans tipik olarak hücre tarafindan taninan bir heterolog arttirici veya promotör içerir. Uygun promotörler, CMV promotörünü içerir. Bir ekspresyon vektörü, replikasyon sistemi içerir ve polipeptit kodlayici segment için ekleme alani ile birlikte transkripsiyonel ve translasyonel düzenleyici sekanslar kullanilabilir. Hücre hatlari ve ekspresyon vektörlerinin uygulanabilir kombinasyonlarinin örnekleri, Sambrook ve Russell (2001, yukarida yer verilmistir) ve Metzger ve dig. (1988) Nature ggg: 31-36 yayinlarinda tarif edilmistir. Bulus, burada tanimlandigi gibi Lgr5 eksprese eden bir hücrede eksprese edilecek ilgi konusu bir spesifik polipeptit veya nükleik asit molekülü ile sinirli degildir. Yöntemin amacina bagli olarak, bir karaciger hücresinde bir polipeptiti eksprese etmek ve/veya bir karaciger hücresinde bir polipeptitin ekspresyonunu inaktive etmek için tasarlanabilir. Eksprese edilecek potansiyel polipeptitler, örnegin AAT (alfa antitripsin) dahil olmak üzere metabolik karaciger hastaliklarinda eksik polipeptitlerden herhangi biri olabilir. Karaciger fizyolojisini açiklamak için Wnt, EGF, FGF, BMP veya çentik yolaginda yer alan genleri eksprese edebilir veya inaktive edebiliriz. Ayrica, ilaç toksisitesinin taranmasi için karaciger ilaç metabolizmasindan sorumlu genlerin ekspresyonu veya inaktivasyonu (örn. CYP ailesindeki genler), yüksek düzeyde ilgi konusu olacaktir. Bulusun bazi görünümleri, bir nükleik asit yapisinin veya yukarida tanimlandigi gibi bir nükleotit sekansi içeren ekspresyon vektörünün kullanimi ile ilgilidir* ve burada söz konusu vektör, gen terapisi için uygun bir vektördür. Gen terapisi için uygun vektörler, Anderson 1998, Nature gâg: 25- Opin. Biotechnol.lg: 448-53; Vigna ve Naldini, 2000, J. Gene Ther. 7: 910-3 yayinlarinda ve burada belirtilen referanslarda tarif edilmistir. Bunlarin örnekleri arasinda, entegratif veya entegratif olmayan vektörleri, örnegin retrovirüslere, adenovirüslere (AdV), adeno-iliskili virüslere (AAV), lentivirüslere, çiçek virüslerine, alfa virüslere ve herpes virüslere dayanan vektörü içerir. Özellikle uygun bir gen terapisi vektörü, bir Adenoviral (Ad) ve Adeno ile iliskili virüs (AAV) vektörünü içerir. Bu vektörler, karaciger hücreleri dahil olmak üzere çok sayida bölünen veya bölünmeyen hücre tipini enfekte eder. Ayrica, adenoviral vektörler, yüksek düzeyde transgen ekspresyonu yapabilir. Bununla birlikte, hücre girisinden sonra adenoviral ve AAV vektörlerinin epizomal yapisindan dolayi, bu viral vektörler, yukarida belirtildigi gibi sadece transgenin geçici ifadesini gerektiren terapötik uygulamalar için çok uygundur (Russell, 2(1):43). Tercih edilen adenoviral vektörler, Russell (2000, yukarida yer verilmistir) tarafindan incelendigi üzere konak yanitini indirgemek üzere modifiye edilmistir. AAV gen transferinin güvenligi ve etkinligi, insanlarda kapsamli bir sekilde çalisilmistir ve karaciger, kas, MSS ve retinada cesaret verici sonuçlar elde edilmistir (Manno ve dig. Nat medicine 2006, Stroes ve dig. ATVB 2008, Kaplitt, Feigin, Fancet 2009; Maguire, hem insanlarda hem deneysel modellerde gen transferi çalismalari için en iyi karakterize edilen serotiptir. AAVZ, iskelet kaslarina, nöronlara, vasküler düz kas hücrelerine ve hepatositlere karsi dogal tropizm sunar. AAVZ, bu nedenle karaciger dokularini hedef almak için iyi bir vektör seçimidir. Adeno iliskili virüse dayanan entegratif olmayan vektörlerin diger örnekleri arasinda AAVl, AAV3, AAV4, AAVS, AAV6, AAV7, AAVS, AAV9, AAVlO, AAVll ve psödotipli AAV bulunur. AAVS ve AAV9 gibi insan disi serotiplerin kullanilmasi, deneklerde bu immünolojik tepkilerin üstesinden gelmek için faydali olabilir ve klinik denemeler yeni baslatilmistir (ClinicalTrials.gov için, bir adenovirüs serotip 5 veya bir AAV serotip 2, 7 veya 8'in etkili vektörler oldugu ve bu nedenle tercih edilen bir Ad veya AAV serotipi oldugu görülmüstür (Gao, Ablecular Therapy Mevcut bulusta uygulamaya yönelik tercih edilen bir retroviral vektör, lentiviral bazli bir ekspresyon yapisidir. Lentiviral vektör, bölünmeyen hücreleri enjekte etme özelligine sahiptir ekspresyon yapilarinin yapimi ve kullanimina yönelik yöntemler, Genel olarak gen terapisi vektörleri, bulusun eksprese edilecek bir polipeptitini kodlayan bir nükleotit sekansini içermesi bakimindan yukarida tarif edilen ekspresyon vektörleri gibi olacaktir ve burada bir nükleotit sekansi, yukarida açiklandigi gibi uygun düzenleyici sekanslara Çalisabilir sekilde baglanmistir. Bu düzenleyici sekans, en azindan bir promotör sekans içerecektir. Gen terapisi vektörlerinden bir polipeptiti kodlayan bir nükleotit sekansinin ekspresyonu için uygun promotörler arasinda, örnegin sitomegalovirüs (CMV) ara ürün erken promotörü, viral uzun terminal tekrarli promotörler (LTR'ler), örnegin murin moloney lösemi Virüsü (MMLV) rous sarkom virüsü veya HTLV-l'den elde edilenler, simian virüsü 40 (SV 40), erken promotör ve herpes simpleks virüsü timidin kinaz promotörü bulunur. Uygun promotörler asagida tarif edilmistir. Küçük organik veya inorganik bilesiklerin uygulanmasiyla indüklenebilen birkaç indüklenebilir promotör sistemi tarif edilmistir. Bu indüklenebilir promotörler arasinda, agir metaller ile kontrol edilenler, örnegin metallotiyonin promotürü ve White, , tetrasiklin (Gossen ve Bujard 1992 Proc. domeni ve bir östrojen reseptörünün bir ligant baglayici domeni olarak bir tetR polipeptitinden olusan multi-kimerik transaktivatöre dayanan bir tTAER sistemi (Yee ve dig., 2002, US 6,432,705) bulunur. RNA interferansi tarafindan spesifik genlerin knock down edilmesine yönelik küçük RNA'lari kodlayan nükleotit sekanslari için uygun promotörler, yukarida belirtilen polimeraz II promotörlerine ek olarak polimeraz III promotörlerini içerir. RNA polimeraz III (pol III), 55, U6, adenovirüs VAl, Vault, telomeraz RNA ve tRNA'lar dahil olmak üzere çok çesitli küçük nükleer ve sistoplazmik kodlayici olmayan RNA'larin sentezinden sorumludur. Bu RNA'lari kodlayan çok sayida genin promotör yapisi belirlenmistir KK& RNA EKU. III promotörlerinin In; tip yapiya ayrildigi görülmüstür (bu konuya iliskin inceleme için bkz. Geiduschek ve Tocchini-Valentini, 1988 Annu. ReV. Biochem. için özellikle uygun promotörler, tip 3 RNA pol II promotörüdür ve burada transkripsiyon, yalnizca 5' ucunu kusatan bölgede, baska bir ifadeyle transkripsiyon baslangiç alaninin akis yukarisinda bulunan cis-etkili elemanlar tarafindan tahrik edilir. Akis yukarisindaki sekans elemanlari arasinda geleneksel proksimal sekans elemani ve bir distal sekans elemanini (DSE; Tip :3 pol III promotörünün kontrolü altindaki gen örnekleri arasinda U6 küçük nükleer RNA (U6 snRNA), 7SK, Y, MRP, Hl ve telomeraz RNA genleri bulunur (bkz. örn. Myslinski ve dig., 2001, Bir gen terapisi vektörü, istege bagli olarak bir ikinci veya ikinci veya baska bir polipeptit için kodlayici bir veya daha fazla nükleotit sekansi içerebilir. Ikinci veya baska bir polipeptit, ekspresyon yapisini içeren hücrelerin tanimlanmasini, seçilmesini ve/veya taranmasini saglayan bir (seçici) markör polipeptiti olabilir. Bu amaca yönelik uygun markör proteinler arasinda örnegin floresan GFP proteini ve seçilebilir markör genleri HSV timidin kinaz (HAT ortami üzerinde seçim için), bakteriyel higromisin B fosfotransferaz (higromisin B üzerinde seçim için), Tn5 aminoglikosit fosfotransferaz (G418 üzerinde seçim için) ve dihidrofolat redüktaz (DHFR) (metotreksat üzerinde seçim için), CD20, düsük afiniteli sinir büyüme faktörü geni bulunur. Bu markör genlerin elde edilmesine yönelik kaynaklar ve kullanim yöntemleri, Sambrook. ve Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. baski), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York yayinlarinda verilmistir. Alternatif olarak ikinci veya baska bir nükleotit sekansi, gerekli görüldügü takdirde transgenik hücrelerden bir denegin iyilestirilmesini saglayan bozulmaya dayanikli mekanizma saglayan bir polipeptiti kodlayabilir. Genellikle bir intihar geni olarak adlandirilan bir nükleotit sekansi, bir ön ilaci polipetitin eksprese edildigi transgenik hücreleri öldürebilen bir toksik maddeye dönüstürebilen bir polipeptiti kodlar. Bu intihar genlerinin uygun örnekleri arasinda, örnegin E.coli sitozin deaminaz geni veya Herpes Simpleks Virüsü, Sitomegalovirüs ve Varicalla-Zoster* Virüsünden timidin kinaz genlerinin biri bulunur ve bu durumda gansiklovir, denekteki IL- lO transgenik hücreleri öldürmek için ön ilaç olarak kullanilabilir (bkz. örn. Clair ve dig., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. gl: 844-849). Bir spesifik polipeptitin ekspresyonunun knock down edilmesi için bir gen teraisi vektörü veya baska bir ekspresyon yapisi, tercihen bir RNAi ajanini, baska bir ifadeyle RNA interferansi gerçeklestirebilen veya RNA interferansi gerçeklestirebilen bir RNA molekülünün parçasi olan bir RNA molekülünü kodlayan, arzu edilen nükleotit sekansinin ekspresyonu için kullanilir. Bu RNA molekülleri, siRNA olarak ifade edilir (örnegin bir kisa saç tokasi RNA dahil olmak üzere kisa interferans yapan RNA). Alternatif olarak bir siRNA inolekülü, dogrudan örnegin Lgr5 eksprese eden bir hücre veya bir karaciger hücresi (hepatosite veya kolanjiyosit) veya bir karaciger organoidi içinde veya çevresinde uygulanan farmasötik bir bilesim içinde olabilir. Arzu edilen bir nükleotit sekansi, hedef gen mRNA'nin bir bölgesine karsi yönlendirilen antisens RNA için kodlayici bir antisens kod RNA ve/veya hedef gen mRNA'nin ayni bölgesine karsi yönlendirilen sens RNA için kodlayici bir sens kod DNA içerir. Bulusun bir DNA yapisinda bir antisens ve sens kod DNA'lar, sirasiyla bir antisens ve sens RNA'yi eksprese eden yukarida tanimlandigi gibi bir veya daha fazla. promotöre çalisabilir sekilde baglanmistir. "siRNA", tercihen memeli hücrelerde toksik olmayan kisa uzunluklu çift iplikli bir RNA olan küçük interferans yapan bir RNA anlamina gelir (Elbashir ve dig., 2001, sinirlandirilmasi zorunlu degildir. siRNA'nin uzunlugunda, toksisite göstermedigi sürece herhangi bir sinirlama bulunmaz. , 30, 35 veya 49 nükleotit uzunlugunda olabilir. Alternatif olarak eksprese edilecek siRNA'nin nihai bir transkripsiyon ürününün çift iplikli RNA kismi, örnegin en az 15, 18 veya 21 nükleotit ve en fazla 25, 30, 35 veya 49 nükleotit uzunlugunda olabilir. sekansa sahip bir RNA ipligidir ve hedef gen mRNA'ya baglanarak RNAi'yi indükledigi düsünülür. "Sens RNA", antisens RNA'ya tamamlayici bir sekansa sahiptir ve siRNA olusturmak üzere tamamlayici antisens RNA'sina tavlanmistir. Mevcut baglamda siRNA nedeniyle ekspresyonu susturulacak ve istege göre seçilebilecek bir geni ifade eder. Bu hedef gen olarak, örnegin sekanslari bilinen, ancak fonksiyonlari açik bir sekilde anlatilmasi gereken genler ve ekspresyonlari hastaliklara neden oldugu düsünülen genler özellikle tercih edilir. Bir hedef gen, siRNA'nin ipliklerinden (antisens RNA ipligi) birini baglayabilen bir uzunluk olan en az 15 nükleotit. veya daha fazlasina sahip genin kismi bir` mRNA sekansi belirlenmedigi sürece genom sekansi, tamamen açiklanmamis bir gen olabilir. Dolayisiyla bazi sekanslarin (örnegin en az 15 nükleotit) açiklandigi genler, eksprese edilmis sekans etiketleri (EST'ler) ve MRNA parçalari, tam uzunluklu sekanslari belirlenmemis olsa da "hedef gen" olarak seçilebilir. Iki RNA ipliginin eslestirildigi siRNA'larin çift iplikli RNA parçalari, tamamen eslesmisler ile sinirli degildir ve uyumsuzluk (karsilik gelen nükleotitler tamamlayici degildir), çikinti (bulge) (bir iplik üzerinde karsilik gelen tamamlayici nükleotitte eksik) ve benzerleri nedeniyle eslesmemis parçalari içerebilir. Eslesmemis parçalar, siRNA olusumuna müdahale etmeyecek derecede tutulabilir. Burada kullanilan "çikinti" terimi tercihen 1 ila 2 eslesmeyen nükleotitleri içerir ve iki RNA ipliginin eslestirildigi siRNA'larin çift iplikli RNA bölgesi, tercihen 1 ila 7, daha çok tercihen 1 ila 5 çikinti içerir. Buna ek olarak burada kullanilan "uyumsuzluk" terimi, iki RNA ipliginin eslestirildigi siRNA'larin tercihen çift iplikli RNA bölgesinde bulunur ve tercihen 1 ile 7, daha çok tercihen 1 ile 5 arasindadir. Tercih edilen bir uyumsuzlukta nükleotitlerin biri, guanindir ve digeri urasildir. Böyle bir uyumsuzluk, sens RNA'yi kodlayan DNA'da C'den T'ye, G'den A'ya bir mutasyon veya bunlarin karisimlarindan kaynaklanir, ancak bunlarla sinirli degildir. Ayrica iki RNA ipliginin eslestirildigi siRNA'larin bir çift iplikli RNA bölgesi, tercihen 1 ila 7, daha çok tercihen 1 ila 5'e kadar çikinti ve uyumsuzluk içerebilir Bu eslesmemis parçalar (uyumsuzluklar veya çikintilar vb.), antisens ve sens kod DNA'lar arasinda asagida tarif edilen rekombinasyonu baskilayabilir~ ve asagida tarif edildigi gibi siRNA ekspresyon sistemini stabil hale getirebilir. Ayrica, iki RNA ipliginin eslestirildigi siRNA'larin çift iplikli RNA bölgesinde eslesmemis parça içermeyen sap-iplik DNA'nin sekanslanmasi zor olsa da, sekanslama yukarida açiklandigi gibi uyumsuzluklar veya çikintilar eklenerek saglanir. Ayrica eslesen çift iplikli RNA bölgesinde uyumsuzluk ve çikinti içeren siRNA'lar, E. coli veya hayvan hücrelerde stabil olma avantajina sahiptir. siRNA'nin terminal yapisi, siRNA'nin RNAi etkisinden dolayi hedef gen ekspresyonunu susturmayi sagladigi sürece kör veya yapiskan (sarkinti) olabilir. Yapiskan (sarkinti) uç yapisi, yalnizca 3' sarkintisi ile sinirlidir ve 5' sarkinti yapisi, RNAi etkisini indükleyebildigi sürece dahil edilebilir. Buna ek olarak, sarkan nükleotit sayisi, önceden belirlendigi gibi 2 veya 3 ile ilgilidir; ancak sarkinti, RNAi etkisini indükleyebildigi sürece herhangi bir sayida olabilir. Örnegin sarkinti, 1 ila 8, tercihen 2 ila 4 nükleotitten olusur. Burada, yapiskan uçlu yapiya sahip siRNA'nin toplam uzunlugu, eslesmis çift iplikli parçanin uzunlugunun ve her iki uçta sarkan tek iplikleri içeren bir eslesmenin uzunlugunun toplami olarak ifade edilir. Örnegin, her iki uçta 4 nükleotit sarkintisina sahip 19 bp çift iplikli RNA parçasi söz konusu oldugunda toplam uzunluk, 23 bp olarak ifade edilir. Ayrica bu sarkan sekans, bir hedef gene yönelik düsük spesifiklige sahip oldugundan, hedef gen sekansina tamamlayici (antisens) veya özdes (sens) olmak zorunda degildir. Ayrica, siRNA'nin hedef gen üzerinde gen susturucu etkisini koruyabildigi sürece, siRNA, bir ucundaki sarkan parçada düsük moleküler agirlikli bir RNA (tRNA, rRNA veya viral RNA gibi bir dogal RNA nwlekülü veya yapay bir RNA molekülü olabilir) içerebilir. Buna ek olarak "siRNA"nin terminal yapisi, yukarida tarif edildigi sekilde her iki uçtan kesilmis olmasi gerekir ve çift iplikli RNA'nin bir tarafinin uçlarinin bir baglayici RNA (bir Çift iplikli RNA bölgesinin uzunlugu (kök ilmik parçasi), veya 49 nükleotit uzunlugunda olabilir. Alternatif olarak eksprese edilecek siRNA'nin nihai bir transkripsiyon ürününün çift iplikli RNA bölgesinin uzunlugu, örnegin en az 15, 18 veya uzunlugundadir. Ayrica, kök parçasinin eslesmesini engellemeyecek bir uzunluguna sahip oldugu sürece baglayicinin uzunlugu bakimindan herhangi bir sinirlama yoktur. Örnegin, kök parçasinin stabil eslestirilmesi ve parçayi kodlayici DNA'lar arasindaki rekombinasyonunun baskilanmasi için baglayici parça, yonca yapragi tRNA yapisina sahip olabilir. Baglayici, kök parçanin eslesmesini engelleyen bir uzunluga sahip olmasina ragmen, örnegin intronlari içerecek sekilde baglayici parçanin olusturulmasi mümkündür ve böylece intronlar, prekürsör RNA'nin olgun RNA'ya islenmesi sirasinda eksize edilir ve kök parçanin eslestirilmesi saglanir. Bir kök ilmik siRNA söz konusu oldugunda, hiç bir ilmik yapisina sahip RNA'nin iki ucundan biri (bas veya kuyruk), düsük moleküler agirlikli bir RNA'ya sahip olabilir. Yukarida tarif edildigi gibi bu düsük moleküler agirlikli RNA, tRNA, rRNA, snRNA veya Viral RNA gibi bir dogal RNA molekülü veya yapay bir RNA molekülü olabilir. Sirasiyla antisens ve sens kod DNA'lardan antisens ve sens RNA'larin eksprese edilmesi için bir DNA yapisi, yukarida tanimlandigi gibi bir promotör içerir. Yapi içindeki promotör sayisi› ve lokasyonu, antisens ve sens kod, DNA'lari eksprese edebildigi sürece prensipte istege bagli olarak seçilebilir. Bir DNA yapisinin basit bir örnegi olarak, bir promotörün antisens ve sens kod DNA'larin akis yukarisinda yer aldigi bir tandem ekspresyon sistemi olusturulabilir. Bu tandem ekspresyon sistemi, her iki uçta yukarida bahsedilen kesilmis yapiya sahip siRNA'lari üretebilir. Kök ilmik siRNA ekspresyon sisteminde (kök ekspresyon sistemi), antisens ve sens kod DNA'lar, ters yönde düzenlenir ve bu DNA'lar, bir birim olusturmak üzere bir baglayici DNA araciligiyla baglanir. Bir promotör, bir kök ilmik siRNA ekspresyon sistemi olusturmak üzere bu birimin bir tarafina baglanir. Burada, baglayici DNA'nin uzunlugu ve sekansi üzerinde herhangi bir sinirlama yoktur; sekansi, sonlandirma sekansi olmadigi sürece ve bunun uzunlugu ve sekansi yukarida tarif edildigi gibi olgun RNA üretimi sirasinda kök parçasi eslestirmesini engellemedigi sürece herhangi bir uzunluga ve sekansa sahip olabilir. Bir örnek olarak, yukarida bahsedilen tRNA için kodlayici DNA ve benzeri, bir baglayici DNA olarak kullanilabilir. Tandem ve kök ilmikli ekspresyon sistemlerinin her ikisinde de ' ucu, promotörden transkripsiyonu destekleyebilen bir sekansa sahip olabilir. Daha spesifik olarak, tandem siRNA söz konusu oldugunda, siRNA 'üretiminin etkinligi, antisens ve sens kod DNA'larin 5' uçlarindaki promotörlerden transkripsiyonu destekleyebilen bir sekansin eklenmesiyle gelistirilebilir. Kök ilmik siRNA söz konusu oldugunda, böyle bir sekans, yukarida tarif edilen birimin 5' ucuna eklenebilir. Böyle bir sekanstan gerçeklesen bir transkript, siRNA yoluyla hedef gen susturmasinin engellenmedigi sürece siRNA'ya baglanma durumunda kullanilabilir. Bu durum, gen susturmasini engellemesi halinde, bir kirpma araci (örnegin teknikte bilindigi üzere ribozim) kullanilarak transkriptin kirpilmasi tercih edilir. Bir antisens ve sens RNA'nin, ayni vektörde veya farkli vektörlerde eksprese edilebilecegi uzman kisilerce bilinir. Sens ve antisens RNA'larin akis asagisina fazla sekanslarin eklenmesini önlemek için, ilgili ipliklerin (antisens ve sens RNA'lar için kodlayici iplikler) 3' uçlarina bir transkripsiyon sonlandiricisinin yerlestirilmesi tercih edilir. Sonlandirici, dört veya daha fazla ardisik adenin (A) nükleotitten olusan bir sekans olabilir. Bu belgede ve istemlerde, "içermek" fiili ve bu fiilin ek almis halleri, kelimenin ardindan gelen ögelerin dahil edildigi, ancak özellikle belirtilmeyen ögelerin disarida birakilmadigi, sinirlayici olmayan bir anlamda kullanilir. Buna ek olarak olarak ifade edilenlerden baska bileseni/bilesenleri içerebilecegi anlamina gelen "esas olarak ...'dan olusmak" ifadesi ile degistirilebilir ve söz konusu bilesen/bilesenler, bulusun benzersiz özelligini degistirmez. Buna ek olarak, burada tarif edilen bir yöntem, burada spesifik olarak ifade edilenlerden baska adim/adimlari içerebilir ve söz konusu adim/adimlar, bulusun benzersiz özelligini degistirmez. Buna ek olarak, "bir" belgisiz tanimligi ile bir elemana yapilan atif, baglamda yalnizca bir elemanin olmasi gerektigi açikça belirtilmedigi sürece, birden fazla elemanin bulunma ihtimalini disarida birakmaz. "Bir" belgisiz tanimligi, bu nedenle genellikle "en az bir" anlamina gelir. Bir sayisal deger ile birlikte kullanildiginda "yaklasik" ifadesi (yaklasik 10), tercihen söz konusu degerin, %10 daha fazla veya %1 daha az bir deger olabilecegi anlamina gelir. Asagidaki örnekler, yalnizca açiklama amaciyla sunulmustur ve mevcut bulusun kapsamini herhangi bir sekilde sinirlandirmasi amaçlanmamistir. SEKILLERIN AÇIKLAMASI Sekil 1 Karaciger organoidleri büyüme faktörü gerekliligi. (A) FGFlO, HGF ve Nikotinamid ile takviye edilmis EGF (E), R-spondin 1 (R), Noggin (N), Wnt3A kosullu ortam (W) veya bunlarin kombinasyonu ile muhafaza edilen karaciger organoidlerinin DIC görüntüleri. (B) Organoid sayisi, haftada bir sayilmistir ve gerektiginde pasajlanmistir. Sonuçlar, 3 bagimsiz deneyin ortalama ± standart hata (SEM) seklinde gösterilmistir. (C) RTPCR tarafindan LgrS, Keratin 7 (K7) ve Albümin (alb) genlerinin gen ekspresyonu analizi. (D) Organoidlere dönüsen izole edilmis safra kanallari. Ekimden sonra karsilik gelen günlerden diferansiyel interferans karsit görüntüleri. 10 kat büyütme (gün 0, l, 3 ve 5). 4 kat büyütmede Gün 15. Kültürler, mekanik ayrisma yoluyla 4-7 günde bir pasajlanmistir. Kültürler, en az 8 ay boyunca büyütülmüstür. Sekil 2 Karaciger organoidlerinin morfolojisi. (A) Üst paneller: Farkli domenleri gösteren bir fare karacigerinin parafin kesiti (PT = portal triad, CV = merkezi ven). Alt paneller: Farkli domenler b (tek katmanli epitelyum) ve h'yi (katmanli epitel) gösteren bir karaciger organoidinin parafin kesiti (B) Sag panel: Karaciger organoidlerinde Ekaderin boyamasi. Iki farkli domen tanimlanabilir. Domen b, karacigerdeki safra kanali yapilarini andiran tek katmanli bir epitelden olusur. Bu safra kanali domeni, pansitokeratin (PCK) için pozitif boyanmayi gösteren yüksek düzeyde polarize hücrelerden olusur (alt panel). Sol paneller, karaciger organoidlerinin içinde ikinci bir domenin varligini gösterir. Bu h domeni, polarize olmayan hücrelerle katmanli bir epitel ile olusturulur. Hücreler,, merkezi bir lümen çevresinde düzenlenir ve hepatosit markörü Alb'yi eksprese eder. 10 kat büyütme. Sekil 3 Karaciger kültürlerinde Wnt sinyalleri. Lac Z ekspresyonu, Lgr5-LacZ veya Axin2 LacZ farelerinden türetilmis kültürlerde saptanmistir. Bir Bl6 farelerinden türetilen karaciger kültürlerinde pozitif boyama saptanmamistir. 4 kat büyütme, 20 kat büyütülmüs ekli resim. Sekil 4 Karaciger farklilastirici markörlerin ekspresyonu. (A) kolanjiyosit markörü keratin 7 (K7) ve hepatosit markörü keratin 8 (K8) ve albümin (Alb) ekspresyonunun immünohistokimyasal ve immünofloresan analizleri. (B) asagida yer alan hepatosit markörlerinin gen ekspresyonunun analizi: Albümin (Alb), transtiretrin (Ttr), Glutamin sentazi (Glul), glikoz 6 fosfat (G6P) ve Sitokrom p; ve kolanjiyosit markörleri keratin 7 (K7) ve Keratin 19 (K19). Sekil 5 Karaciger tek hücre kültürleri. (A) ayrilan hücrelerin alanini gösteren akis sitometrisi grafigi. (B) belirtilen zaman noktalarinda organoidlere büyüyen tek hücre. 40 kat (gün 1-3), kat (gün 16), 4 kat (gün 21) büyütme. (C & D) bir LgrSGFP tek sirali hücrelerin koloni olusumu etkinliginin temsili görüntüsü. 100 hücre, üç kopya halinde ekilmistir ve koloniler, 10 gün sonra sayilmistir. Sekil 6 Karaciger kültürlerinin mikrodizi analizi. ER veya Noggin (ENR) veya noggin ve Wnt (ENRW) ile takviye edilmis ER ortaminda 1 ay boyunca muhafaza edilmis eriskin karaciger dokusunun 've karaciger organoid kültürlerinin gen ekspresyon profilinin analizi. Kahverengi adipoz dokusu (BAT), beyaz adipoz dokusu (WAT), kas ve yenidogan karacigerinin genetik profili ve farkli örneklerin genetik profili karsilastirilmistir. (A) kültürlerin eriskin karacigere benzer* bir profil sundugunu, ancak kas ve BAT ve WAT olarak karacigerle iliskili olmayan dokular için farkli bir profil sundugunu gösteren isi haritasi analizi, (B) Farkli kosullarda hepatosit markörleri ve kolanjiyosit markörlerinin listesi. Sekil 7: Fare karaciger organoidi kültürü, uzun süreli kültürden sonra stabil karyotiplendirme gösterir. A - FGFlO, HGF ve Nikotinamid (soldaki sekil, ER) ile takviye edilmis EGF (E) ve R-spondin l (R)'de muhafaza edilen veya Noggin (N) ve Wnt3A kosullu ortam (W) (sagdaki sekil, ENRW) ile takviye edilen ayni kombinasyonda 24 ay süreyle muhafaza edilen karaciger organoidlerinin DIC görüntüleri. B - Kültürde 8 ay sonra fare karaciger organoidlerinin karyotip analizi. Tipik bir hepatosit özelligi olan normal kromozom sayilari (n:40, sol paneldeki sekil) ve poliploidi bulunmustur (n=80, sag paneldeki sekil) Sekil 8: Takviye faktörleri FGFlO, HGF ve Nikotinamid; büyüme ve A - Karaciger gelisiminin :3 asamasinda hepatoblasttan olgun hepatosite diferansiyel olarak eksprese edilen genleri gösteren diyagram. B - Kullanilan protokolü gösteren sema. Kültürler, deneyden 2 gün önce genisleme ortami EMZ'ye (ERFHNic: FGFlO, HGF ve Nikotinamid ile takviye edilmis EGF (E) ve Rrspondin 1 (R): ERFElNic, Sekil 8B'de `ER' olarak gösterilmistir) ekilmistir. Iki gün sonra, kültür ortami tek basina EGF (E) ya da FGFlO (F) veya HGF (H) veya Nikotinamid (Nic) veya bunlarin metinde belirtilen konsantrasyonlarda bir kombinasyonu arasindan seçilen ilave takviye ile veya olmaksizin R-spondin l (ER) takviyeli EGF'yle degistirilmistir. Bes gün sonra kültürler bölünmüs ve her kosul için l:4 oraninda yeniden kaplanmistir. Bu kosullar altinda kültürler bölünmüs ve her 7 günde bir toplam 10 hafta süreyle yeniden kaplanmistir. C - Test edilen kültür kosullarinin her birinde ilk bölünmeden sonraki ilk gün. Sonuçlar, FGFlO veya HGF veya Nikotinamid veya bunlarin bir kombinasyonu ile birlestirilen EGF ve R-spondin l'in, en az 1 pasaj gerçeklestirilmesi için sart oldugunu gösterir. D - Uzun süreli kültürden sonra, FNic veya ER, FHNic ile takviye edilmis ER veya her ikisi, yüksek pasaj sayilarina neden olur. Pasaj lO'dan sonra büyüme orani, 3 takviye faktörü içeren kültür kosulu için daha iyidir; ERFHNic (sekil 15 A, B). E - Bazi faktörlerin (baslangiç noktasi ERFHNic idi) çekilmesinden 5 gün sonra farkli hepatosit markörlerinin (CYP ve kök hücre markörü IGRS'in ekspresyonunu gösteren RT-PCR analizi. Yalnizca EF kosulunun, test edilen tüm hepatosit markörlerinin ekspresyonunü gösterdigine dikkat ediniz. HPRT, gen ekspresyonu için normallestirme amaciyla bir referans gen olarak kullanilmistir. Sekil 9: Üç farkli karaciger kültürü kosulundan hücrelerde ve yetiskin karaciger dokusunda farkli hepatosit ve kolanjiyosit spesifik transkripsiyon faktörlerinin miktarini gösteren tablo. Çentik ve TGF-beta sinyal yolaklarinin temel bilesenlerinin ekspresyonu da gösterilmistir. E=EFHNic, ER=ERFHNic, ENRW:ENRWFHNi c . Sekil 10: Farklilasma protokolü A - Kullanilan protokolü gösteren sema. Kültürler, deneyden 2 gün önce genisleme ortamina (ERFHNic: FGFlO, HGF ve Nikotinamid ile takviye edilmis EGF (E) ve R-spondin 1 (R); ERFElNic, Sekil lOA'da `ER' olarak gösterilmistir) ekilmistir. Iki gün sonra kültür ortami, A veya HGF (H) veya Nikotinamid (Nic) veya R-spondin 1 (R) veya Wnt3A veya Noggin (N) veya bunlarin gösterilen konsantrasyonlarda bir kombinasyonu ile takviye edilen EGF (E) ile degistirilmistir. RNA, birkaç zaman noktasinda izole edilmistir. Fare karaciger dokusu, pozitif kontrol (+) olarak alinirken su, negatif kontrol (-) olarak alinmistir. B - Farklilasma kosullarindan 7 gün sonra hepatosit markörleri CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT ve Gck'nin ekspresyonunu gösteren RT-PCR analizi. Yalnizca EADF kosulunun test edilen tüm hepatosit markörlerinin bir ekspresyonunu gösterdigine dikkat ediniz. HPRT, gen ekspresyonu için normallestirme amaciyla bir referans gen olarak kullanilmistir. C- Farklilasma kosullarindan sonra zaman içindeki ekspresyon analizi. Farklilasmadan sonra 2, 5 ve 8. günlerde, hepatosit markörleri CYP3All, Alb, FAH ve kolanjiyosit. markörü Kl9'un ekspresyonu RTPCR ile analiz edilmistir. Karaciger markörleri CYP3All ve FAH ekspresyonunun, farklilasmadan sonra 5.günde baslayip 8. günden zirve noktasina geldigine dikkat ediniz. HPRT, gen ekspresyonu için normallestirme amaciyla bir referans gen olarak kullanilmistir. A; A830l, D; DAPT, F; FGFlO, H; HGF, De; Deksametazon D - Farkli konsantrasyonlardaki farklilasma bilesikleri A ve D'den 7 gün sonra hepatosit markörleri CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT, G6P ve Gck'nin ekspresyonunu gösteren titrasyon deneyleri. HPRT, gen ekspresyonu için normallestirme amaciyla bir referans gen olarak kullanilmistir. E - Karaciger markörleri K19, Albümin ve hepatosit yüzey markörü için immünofloresan boyama. Hoeschst, çekirdeklerin boyanmasi için kullanilmistir. E` - AlbcreertZLacZ farelerinin karacigerinden türetilen organoidler üzerinde Xgal boyamasi. Tamoksifenle indüklenen AlbcreertZLacZ türevli kültürlerde EADF farklilasmasi sonrasinda albümin pozitif hücreler (oklar) tespit edilmistir. Sekil 11: ERFHNic kültür kosullarinda insan türevli karaciger kültürleri Sekil 12: Fizyolojik kosullar altinda veya hasardan sonra rejenerasyon sirasinda Wnt sinyal uyarimina karaciger yaniti A: Axin2 LacZ farelerine yapilan Lgr5 liganti R-spondinl enjeksiyonu, karaciger hücrelerinin Wnt uyarimina duyarli oldugunu gösterir (X-gal pozitif hücreleri gösteren oklar). Lgr5 ekspresyonu görülmemistir, bu nedenle bulus sahipleri, yaniti baslatmak için Lgr4'ün kullanildigi hipotezini kurmustur. B: Axin2 LAcZ farelerine yapilan CCL4 enjeksiyonu, rejenerasyon yaniti sirasinda Wnt sinyalinin aktiflestirildigini gösterir. Sekil 13: Karaciger hasari rejenerasyonu modelinin ardindan Lgr5'in yukari dogru regülasyonu. Eriskin Lgr5-LacZ KI farelerine, 0,8 ml/kg hepatotoksik bilesik CCL4 ile enjekte edilmistir. Görüntülerde, enjeksiyon yapilmamis (hasar görmemis) karacigerlerde Wnt yolaginin, kanallari kaplayan hücrelerde aktif oldugu görülür. CCl4 hücreleri tarafindan gerçeklesen hasardan sonra kanali kaplamayan hücreler de, aktif bir Wnt yolagina sahiptir. A - CCL4 hasarli karacigerde LgrS'in yukari dogru regülasyonunu gösteren zamana bagli deney (X-gal pozitif hücreleri gösteren oklar). Kontrol CCL4 enjekte edilen WT farelerde ve plasebo enjekte edilen Lgr5LacZ Ki farelerde herhangi bir boyama görülmemistir (sag panel). B - Karaciger markörleri ile birlikte Lgr5 boyamasi. Sekil 14: K19 için izole edilmis kanal boyamasi Lgr5LacZ kanal izolasyonu. K19 boyamasi, izole edilmis ve ekilmis yapilarin gerçekten intrahepatik kanallar oldugunu dogrular. Sekil 15: Büyüme faktörü gerekliligi 3 takviye faktörü (FGFlO, HGF ve Nikotinamid), karaciger kültürlerinin kendi kendine uzun süreli muhafazasi için gereklidir. Uzun süreli kültürden sonra FNiC (S) veya ERFHNic ($$) içeren kombinasyonlarin her ikide yüksek pasaj sayilarina neden olur. Pasaj 10'dan sonra büyüme orani, 3 takviye faktörü içeren kültür kosulu için daha iyidir; ERFHNic (bkz. sekil 16B). Sekil 16: Farklilasma kosullari altinda fare karaciger organoidlerinin gen ekspresyonu profili, eriskin ve yeni dogan karaciger profiline benzer A - Farklilasma kosulu EADF ve eriskin veya yenidogan karacigeri arasinda benzer sekilde eksprese edilen (a) veya benzer sekilde kapatilmis (b) genleri gösteren gen kümeleri. B - Karaciger organoidleri ile eriskin veya yenidogan karacigeri arasinda diferansiyel olarak eksprese edilen genleri (a) ve EADF ile yenidogan karacigeri arasinda benzer sekilde eksprese edilen genleri (b) gösteren gen kümeleri. C - Seçilen duktal markörlerin ekspresyon seviyelerinin, genisleme ortamindaki eriskin karacigeri, eriskin pankreasi, pankreas organoidleri ve karaciger organoidlerinde Ngn3 ekspresyonu ve endokrin markörleri için gerekli transkripsiyon faktörlerininin karsilastirildigi mikrodizi analizinden elde edilen ham sinyal verileri. Sekil 17: Hücrelerin karaciger hastaligi fare modeline nakli Organoidler, su fare modeline nakil edilmistir: eriskin FGR fareleri (FAH-/-RAG-/- IL2R-/-). Hepatositler, kontrol olarak farelere nakil edilmistir. A - FAH "knock out" farelerine nakil edilmis karaciger organoidlerinden türetilen Kl9 pozitif hücreler (sol üst panel) ve Fah pozitif hücreler (orta panel). Hepatosit nakli yapilmis kontrol (üst sag panel). Alt akis sitometrisi grafikleri, hepatosit pozitif hücrelerin yüzdesinin, pozitif FAH ile asilanmis hepatositlerle sonuçlanan grupta daha yüksek oldugunu gösterir. C ve D - Nakledilen hücrelerin Akis Sitometri analizleri. (C) Lgr5-GFP farelerinden elde edilen klon 1 ve (D) LgrS-lacZ farelerinden elde edilen klon 2. Hepatosit yüzey markörü, büyük hücreleri ve yüksek oranda granül hücreleri, baska bir ifadeyle olgun hepatosit fenotipini temsil eden hücreleri içeren bir pozitif alt popülasyon gösterir. E - Nakil programi. Sekil 18: Fare karacigeri imza genleri a) fare karaciger kök hücrelerinde eksprese edilen markörleri; b) fare karaciger kök hücrelerinde eksprese edilmeyen markörleri; c) genisleme ortamindaki fare karaciger organoidleri için fare karaciger kök hücre imzasinda eksprese edilen hepatosit ve kolanjiosit markörlerini; d) genisleme ortamindaki fare karacigeri organoidleri için fare karaciger kök hücre imzasinda eksprese edilmemis hepatosit ve kolanjiyosit markörlerii; e) fare karaciger organoilerinde eksprese edilen genlerin yeniden programlanmasini; f) fare karaciger organoidlerinde eksprese edilmeyen genlerin yeniden programlanmasini gösteren tablo. Sonuçlar, bir referans RNA olarak Evrensel Fare Referansi RNA (Strategene, Catalog #740100) kullanilarak bir karaciger mikrodizisi kullanilarak elde edilmistir. Saptanan mutlak rakamlar lOO'den az ise, genin saptanmamis olarak kabul edilir. Sekil 19: Insan karacigeri imza genleri Insan organoidlerinin karaciger mikrodizilerinin sonuçlarini gösteren tablo. Sonuçlar, soldan saga olmak üzere a) genisleme ortami EMl, b) genisleme ortami EMZ, c) farklilasma ortami, d) eriskin karacigerine yönelik olarak gösterilmistir. Soldaki dört sütundaki sayilar (logZ), örnek ile tüm diziler için kullanilan bir referans (ticari) RNA örnegi arasindaki bir karsilastirmanin sonucudur. Referans örneginde bulunan RNA'ya kiyasla, her örnekteki mRNA'nin göreli ekspresyonu gösterilmistir. . Kullanilan referans RNA, Evren Insan Referansi RNA'dir (Stratagene, Catalog # 740000). Dolayisiyla, bu sütunlardaki negatif sayilar, gerçek ekspresyon seviyeleri ile alakali degildir; sadece Referans örneginde söz konusu RNA'nin daha az oldugu anlamina gelir. Sagdaki 4 sütun mutlak rakamlardir. lOO'ün altinda olmalari halinde, saptanmamis olarak kabul edilir. ÖRNEKLER Örnek 1 - Karaciger organoid büyümesi ve genislemesi için bir genisleme ortami Izolasyondan sonra safra kanallari (bkz. Sekil 1), Matrigel içinde süspanse edilmistir ve farkli büyüme faktörü kosullarinda kültürlenmistir. FGFlO (lOOng/ml), HGF (25-50ng/ml) ve Nikotinamid (l- lOmM) ile takviye edilmis EGF (50ng/ml) ve R- spondin 1 (lug/ml) kombinasyonu (ERFHNic), kültürlerin uzun süre muhafaza edilmesi için gerekli olmustur ve bu, Wnt sinyalininin ve EGF sinyalinin, in vitro eriskin karaciger progenitör çogalmasini muhafaza etmek için kesinlikle gerekli oldugunu gösterir. Noggin (lOOng/ml) ve Wnt kosullu ortam (%50)'in eklenmesiyle, kültürlerin uzun süre muhafaza edildigi görülmüstür (bkz. Sekil 1A ve lB). Uzun süre muhafazayi destekleyen bu kosullar altinda, Lgr5 ekspresyonu ve ayni zamanda hepatosit markörleri (Albümin) ve kolanjiyosit markörü (K7), RT-PCR yoluyla saptanabilmistir (bkz. Sekil lC). Bu kosullar altinda karaciger organoidleri, 1:8 oraninda seyreltmede mekanik veya enzimatik ayrisma ile haftada bir pasajlanmistir ve aylarca büyütülmüstür (Sekil 1D). Wnt hedef genleri AxinZ ve Lgr5'in kültürlerdeki ekspresyonu üzerinde analiz gerçeklestirdik. Hem Axin2LacZ hem de Lgr5-LacZ karacigerlerinin kültürleri, karaciger organoidlerinde ekildikten 1 ay sonra AxinZ ve Lgr5 pozitif hücrelerin varligini ortaya çikarmistir ve böylece Wnt sinyalinin aktif oldugu ve kültür büyümesi için gerekli oldugu dogrulanmistir (Sekil 3). Karaciger kültürleri ayrica, hepatosit markörlerini (örn. albümin, transtiretrin, Glutamin sentaz) ve kolanjiyosit markörlerini (Keratin 7 ve 19) eksprese eder (bkz. Sekil 4). Bir LgrSLacZ veya LgrSGFP faresinden tek Lgr5 hücreleri siralandiginda, tek koloniler organoidlere dönüsmüstür. Bu kültürler ayrica, kolanjiyosit ve hepatosit soylarinin markörlerini eksprese eder ve 4 aydan fazla bir süre boyunca muhafaza edilmis ve l:6-l:8 oranlarinda düzenli olarak bölünmüstür (bkz. Sekil 5A ve B). Ilginç bir sekilde yalnizca Lgr5 pozitif hücrelerden türetilen kültürler organoidlere dönüsmüstür (Sekil SC ve D). Bu veriler, Lgr5 hücrelerinin, bu kültürlerin progenitör hücreleri oldugunu ve 2 farkli karaciger soyunun çogaltabildigini gösterir. Karaciger organoidlerinin Lgr5+ hücrelerinden türedigini belirledikten sonra, eriskin karaciger imzasina kiyasla bunlarin tekli gen imzasini belirlemeyi amaçladik. RNA, FGFlO, Nikotinamid ve Hepatosit Büyüme Faktörü ile takviye edilmis ER veya ENRW ortaminda büyütülmüs karaciger organoidlerinden ve eriskin karacigerinden izole edilmistir. Eriskin karacigerinin ve 2 karaciger kültür kosulunun genetik imzasi, daha sonra bir Evrensel RNA referansinin ekspresyonuna göre karsilastirmali gen ekspresyonu profilinden türetilmistir. Tüm örneklere hibridizasyon için ayni referans RNA'nin kullanilmasi, 3 farkli örnegin (eriskin karacigeri, ER ve ENRW) arasinda karsilastirma yapma imkani saglamistir. Isi haritasi analizinde, her iki kültür kosulunun ekspresyon profilinin eriskin karaciger dokusu ekspresyon profiline yüksek oranda benzerken, kas veya adipoz doku profili ile karsilastirildiginda ayni profili paylasmadiklari ortaya çikmistir (bkz. Sekil 6). Eriskin karacigeri ve karaciger kültürleri arasindaki benzer gen ekspresyon profilinde HNFla, HNFlb, HNF4, Alb, Glül, Met, G6P, Fahdl, Fahd2a, CYP4B1, K7 ve Kl9 gibi karaciger spesifik genler saptanmistir. Isi haritasi analizinda, her iki kültür kosulunun birbirine ve eriskin karaciger örnegine benzer ekspresyon paterni sundugu ortaya çikmistir. Ancak verileri ayrintili olarak analiz ederken Wnt içermeyen ve noggin içermeyen kosulun, her iki büyüme faktörünü de içeren kosuldan daha farklilasmis bir patern gösterdigini görebiliriz. Bu durum, Sekil lC'de gösterilen verilerle uyumludur; hepatosit farklilasmasi (albümin ekspresyonu yoluyla), Wnt varliginda neredeyse yoktur. Bu sonuç, Wnt'nin, farklilasmaya zarar verecek sekilde kültürün kendi kendini yenilemesini destekledigini gösterecektir. Ayrica, eriskin karacigerinde oldugu gibi her iki kültür kosulunda da, AFP gibi spesifik olmayan eriskin karaciger genleri ve Pdxl veya NeuroD gibi karaciger disi transkripsiyon faktörleri saptanabilir. Eriskin karacigerinde olmasa da her iki kültür kosulunda da kök hücre markörü Lgr5'in, karaciger` kültür imzasinda en yüksek düzeyde zenginlestirilmis genlerden biri olmasi dikkat çeker. Ayrica, Cd44 ve Sox9 gibi ince bagirsak ve nddede yer alan progenitör popülasyonlarinin hücre markörleri (Barker & Huch ve dig. Cell stem cell 2010), eriskin karacigerinde olmasa da her iki kültür kosulunda yüksek oranda eksprese edilir ve bu, karaciger kültürlerinin kendi kendini yenileme kapasitesini ve normal eriskin karacigerinin pasif durumunu tekrar gösterir. Ek olarak, Lgr5 disinda MMP7, Sp5 ve Tnfrsl9 dahil olmak üzere birden fazla Wnt hedef geni eriskin karacigerine kiyasla karaciger kültürlerinde yüksek oranda yukari dogru regüle edilmistir ve bu, kültürlerin kendi kendini yenileme kapasitesinin muhafaza edilmesi için aktif ve saglam bir kanonik Wnt sinyalinin gerekliligine dair güçlü bir kanit sunar. Örnek 2 - Gelistirilmis bir farklilasma ortami ER veya ENRW kosullari altinda karaciger kültürleri, kendi kendini yeniler ve 1 yila kadar haftalik bazla muhafaza edilebilir ve genisletilebilir (sekil 7A). 1 yildan sonra karyotipik analizde kromozomal sapmalara iliskin bir kanit görülmez. Analiz edilen hücrelerin %66'sindan fazlasi normal kromozom› sayilarinir gösterirken, %13'ü7 hepatositlerin karakteristik bir özelligi olan poliploidi göstermistir (Sekil FGFlO (lOO ng/ml), HGF (25-50 ng/ml) ve Nikotinamid (l-lOmM) ile takviye edilmis EGF (50ng/ml) ve R-spondin l'in (lug/ml) kombinasyonu, kültürlerin uzun süre muhafaza edilmesi için tercih edilmistir. Bu kosullar altinda, safra kanali ve bazi hepatoblast veya olgunlasmamis hepatosit. markörlerini (Glul, Albümin) eksprese eden uzun ömürlü hücre kültürleri elde etmis bulunuyoruz. Ancak, bu hepatosit markörleri için pozitif olan hücre sayisi çok düsük olmustur. Bu kültür kosullari altinda olgun hepatosit markörleri (örn. p450 Sitokromlar) saptanmamistir. Bu sonuçlar, burada açiklanan kültür kosullarinin, düsük sayilarda olsa da hepatosit benzeri hücreler üretebilen, ancak tamamen olgun hepatositler üretmeyen karaciger progenitörlerinin genislemesini kolaylastirdigini gösterir (Sekil 8A). Kültürlerin hepatositik özelliklerini gelistirmek ve olgun hepatositleri in vitro olarak elde etmek için önce EGF'ye ve R- spondinl'e eklenen üç takviye faktörünün (FGFlO, HGF ve Nikotinamid) hepatosit ekspresyonu ve ayni zamanda kültürün kendi kendini yenilemesi üzerinde pozitif veya negatif bir etkiye sahip olup olmadigini belirledik. Karaciger organoid kültürleri ürettik ve bunlari EGF veya EGF ve Rspondinl arti FGFlO veya HGF veya Nikotinamid veya bunlarin kombinasyonu ile kültürledik ve kültürleri toplam 10 haftalik bir süre boyunca haftada bir kez böldük. Her bir zaman noktasinda birkaç olgun hepatosit markörünün (FAH, CYPBAll) ve hepatoblast markörünün (albümin) ekspresyonunu analiz ettik (Sekil 8B). Sekil 1'de yer alan verilerle uyumlu olarak (bkz. Örnek 1), FGFlO ile birlestirilen R-spondinl ve Nikotinamid'in karaciger kültürlerinin büyümesi ve kendi kendini yenilemesi için gerekli oldugunu gözlemledik (Sekil 8C ve D). R-spondinl ve Nikotinamid, olgun markör CYP3A11'in ekspresyonunu inhibe eder ve yine de hepatoblast markörü albüminin ekspresyonunu tesvik eder. FGFlO veya HGF'nin sadece EGF içeren (R-spondinl içermeyen ve nikotinamid içermeyen) ortama eklenmesi, çok düsük seviyelerde de olsa olgun markör CYP3All'in ekspresyonunu kolaylastirmistir (sekil 8E). Hepatosit farklilasmasini kolaylastirabilecek. ek bilesikleri tanimlamak için, temel kosullar EGF + HGF ve/veya FGFlO'a dayanan iki farkli yaklasim kullandik. Ilk yaklasim, EGF + FGFlO veya HGF kosuluna ilaveten bir dizi bilesigin test edilmesini içerir. Analiz edilen bilesiklerin tam listesi tablo 2'te gösterilmektedir. Bilesikler Sinyal KonsantrasyonSonuç Alb C YP3AI I Exendin4 Glukagon benzeri Sigma O,l-luM peptit 2 analogu E7144 Retinoik asit RAR-RXR reseptör Sigma 25nM ligandi Retinoik asit Exendin 4 Sonic Invitrogen 500-lOOng/ml Hedgehog CZSII BMP4 BMP sinyallemesi Peprotech 20ng/ml 120-05 DAPT Gamma-sekretaz Sigma 10 nM inhibitörü D5942 A830l Alk5/4 /7 Tocris 50 nM inhibitörü Bioscience FGF4 FGFR1,2 ligandi Peprotech 50ng/ml FGFl FGFR1,2,3,4 Peprotech lOOng/ml ligandi 450-33A Deksametazon Sigma lO pM-lmM D4902 25MG (OSM) systems 495-MO-025 FGF4+OSM+Dexa Valproik asit.histon deasetilazStemgent 250 pM inhibitörü ve 04-0007 ERK, PKC Wnt/ß- katenin yolaklari regülatörü Sodyum histon deasetilazStemgent 250 pM Butirat inhibitörü 04-0005 BIX01294 G9a HMTase Stemgent l uM inhibitörü 04-0002 RG 108 DNA Stemgent 1 pM metiltransferaz 04-0001 inhibitörü Hidrokortizon glukokortikoid Sigma 5nM H6909 (OSM) systems 495-MO-025 ARA Sigma A 500 nM kinaz inhibitörü 5919 Arterenol andrenoreseptör Sigma A 500nM-50nM- bitrartre: agonisti 0937 5nM PD 035901 MEKl inhibitörü Axon 500nM Medchem CHIR99021 GSK3 inhibitörü Axon 3uM Medchem L-Askorbik Sigma 1mM VEGF Peprotech Matrigel %50 Matrigel %20 VEGF+DEXA Ikinci yaklasim, in vivo safra ve hepatosit farklilasmasi için gerekli olan transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu ile ilgili yayinlanmis gelisimsel çalismalardan edinilen bilgileri dikkate almistir. FGFlO, HGF ve Nikotinamid ile takviye edilmis E veya ER veya ENRW kosullari altinda organoidlerdeki transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunun karsilastirmali bir analizi sekil 8'de gösterilmistir. Tbx3 ve proxl'in yani sira Hepatosit spesifikasyonu için gereken tüm transkripsiyon faktörleri mevcuttu. Bununla birlikte, spesifik safra transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunun, R-spondinl (R) içeren kültürlerde yüksek düzeyde yukari dogru regüle edildigini fark ettik; bu, kültür geni ekspresyonunun, daha çok bir safra hücre kaderine dogru daha dengesiz oldugunu göstermistir. Çentik ve TGF-beta sinyalleme yolaklari, in Vivo safra hücre kaderinde rol oynamistir. Aslinda, Rbpj'nin silinmesi (aktif Çentik sinyalini elde etmek için gerekli) anormal tubülojeneze neden olur (Zong Y. Development 2009) ve karaciger eksplantlarina TGF-beta'nin eklenmesi, in vitro safra farklilasmasini kolaylastirir (Clotman F. Genes and Development 2005). Karaciger kültürlerinde hem Çentik hem de TGF-beta sinyal yolaklari yüksek seviyede yukari dogru regüle edildiginden (Sekil 9), safra kanali hücre kaderinin inhibisyonunun, hücrelerin daha hepatositik bir fenotipe dogru farklilasmasini tetikleyebilecegini düsündük. A830l, TGF-beta reseptörü AEKS, 4 ve 7'nin bir inhibitörü olarak ve DAPT, Çentik yolagini aktive etmek için gerekli olan aktif` proteaz olan gamma-sekretazin inhibitörü olarak seçilmistir. Ilk önce hücreleri genisleme kosullarinda (ER ortami) 2 gün boyunca kültürledik ve 2. günde (sekil lOA), farkli bilesiklerin kombinasyonunu ekleyerek farklilasma kosullarina basladik. Ortam, iki günde bir degistirilmis ve farklilasmis markörlerin ekspresyonu, 8-9 gün sonra analiz edilmistir. ER ve ENRW kosullari, negatif kontrol olarak kullanilmistir. EGF + FGFlO'un DAPT ve A8301 ile kombinasyonu, analiz edilen hepatosit markörlerinin (CYPBAll, TAT, Albümin) ekspresyonunda sasirtici sekilde büyük bir artisa neden olmustur (sekil lOB). Etki, 5'inci günde dahi saptanabilir düzeyde olmustur ve 8- 9'uncu günlerde zirveye ulasmistir (sekil lOC). Maksimum konsantrasyon verimliligi, sirasiyla lOuM (DAPT) ve SOnM'de (A830l) (sekil lOD) elde edilmistir. Deksametazon (bilinen bir hepatosit farklilasma molekülü) ilavesi, gen ekspresyonunda herhangi bir iyilesmeye neden olmamistir. EGF, FGFlO, A830l ve DAPT kombinasyonu, yalnizca ekspresyonu arttirmakla kalmayip ayni zamanda hepatosit markörleri albümin ve 2F8'e karsi immünofloresan ile ve AlereLacZ'den türetilmis organoidler üzerinde Xgal boyamasi ile degerlendirildigi üzere hepatosit benzeri hücrelerin sayisini arttirir (Sekil lOE ve F). Bu nedenle, yukarida bahsedilen farklilasma protokolünün karaciger kök hücre kültürlerinden in vitro hepatosit benzeri hücrelerin üretimini kolaylastirdigi sonucuna varabiliriz. Örnek 3 - Insan karaciger organoidleri Bu genisleme ortamlari kullanilarak (ERFHNic ve ENRWFHNic), genisleme ortamina ekleyerek insan safrasi türevli kültürleri (sekil ll) genisletebildik. MALZEMELER VE YÖNTEMLER (Örnek 1-3 için) Karaciger kültürü-safra kanali izolasyonu Izole edilmis eriskin karaciger dokusu, soguk Advanced-DMEM/FlZ (Invitrogen) içinde yikanmistir ve daha sonra doku, yaklasik 5 mm'lik parçalar halinde kesilmistir ve ardindan soguk ayrisma tampon (DMEM ortaminda kollajenaz, dispaz, FBS) ile yikanabilir. Doku fragmanlari, 37°C'de 2 saat süreyle ayrisma tamponu ile inkübe edilmistir Daha sonra doku fragmanlari, bir 10 ml pipet ile 10 nü'lik soguk izolasyon tamponunda kuvvetlice süspanse edilmistir. Ölü hücreleri içeren birinci üst faz atilmistir ve tortu, lO-lSml ayrisma tamponu ile süspanse edilmistir. Doku fragmanlarinin siddetli süspansiyonundan sonra üst faz, safra kanallarinda zenginlestirilir. Bu prosedür, yeterli safra kanali elde edilinceye kadar tekrar edilir. Izole edilmis safra kanallari peletlenir ve 50ul of Matrigel (BD Bioscience) ile karistirilir, 24 kuyucuklu doku kültür plakalari üzerinde ekilir ve Matrigel tam polimerize olana kadar 37°C'de -10 dakika boyunca inkübe edilir. Polimerizasyondan sonra 500 ul doku kültürü ortami asiri yüklenir. Ortam.bilesimi: B27, N2, ZOOng/ml N- Asetilsistein, SOng/ml EGF, l ug/ml R-spondinl, gastrin: 10 nM, FGFlO lOO ng/ml, Nikotinamid lOmM ve HGF: 50ng/ml ve %50 Wnt kosullu ortam ile desteklenmis Advanced-DMEM/FlZ. Bütün ortam, 2 günde bir degistirilmistir. 1 hafta sonra Wnt kosullu ortam çekilir ve olusturulan organoidler, bir 1000 ul pipet kullanilarak› Matrigel'den çikarilir* ve mekanik, olarak parçalara ayristirilir ve taze Matrigel'e aktarilir. Pasaj, haftada bir veya iki kez l:4 bölünme oraninda gerçeklestirmistir. Bu kosullar altinda kültürler, en az 6 ay boyunca muhafaza edilmistir. Reaktifler Insan Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF), Peprotech, EGF invitrogen, R-Spondin Nuvelo, Noggin peprotech, FGFlO Peprotech, gastrin Sigma Aldrich, nikotinamid Sigma'dan alinmistir. Mikrodizi Lgr5 türevli karaciger kültürlerinin ekspresyon analizi için RNA, insan karacigerinden veya Wntcm ile Noggin (ER) içeren veya Wntcm.ile Noggin (ENRW) içermeyen ortamda kültürlenmis karaciger kültürlerinden bir Qiagen RNAase kiti kullanilarak izole edilmistir. 150ng toplam RNA, düsük RNA Girisli Lineer Amp kiti (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ile etiketlenmistir. Evrensel Fare Referansi RNA (Agilent), diferansiyel olarak etiketlenmistir ve eriskin karaciger dokusuna veya ER veya ENRW ile muamele edilmis kültürlere hibritlenmistir. Bir 4x44K Agilent Bütün Fare Genomu çift renkli Mikrodiziler (G4122F) kullanilmistir. Etiketleme, hibridizasyon ve yikama islemleri Agilent kurallarina göre yapilmistir. Örnek 4 - Lgr5 ekspresyonu, karaciger hasarini takiben yukari dogru düzenlenir Karacigerde Wnt sinyali, merkezi ven alanlarinda aktiftir. Yakin zamanda, Wnt sinyalinin karaciger metabolizmasinda kilit bir rol oynadigini gözlemledik (Boj ve digerleri ile dogrudan iletisim kurulmustur). Karaciger kanali hücrelerinde Wnt sinyali, karaciger hasarini takiben aktive edilir (Hu ve dig. 2007, Gastroenterology, l33(5): 1579-91). Benzer sekilde, Wnt sinyali için sadik, genel bir raportörü temsil eden AXiHZ-LacZ aleli kullanarak, ayrica Wnt agonisti Rspol'ün enjekte edilmesinden sonra (bkz. sekil 12A) veya hepatotoksik bilesik karbon tetraklorür (CC14) tarafindan karaciger hasarini takiben bütün karaciger parankimasinda Wnt sinyalinin yukari dogru regüle oldugunu gözlemledik (bkz. sekil 12B). Wnt hedef geni Lgr5, aktif olarak kendi kendini yenileyebilen çesitli dokularda kök hücreleri isaretler, ancak daha önce hasarin ardindan eksprese edildigi bildirilmemistir. Daha önce açikladigimiz Lgr5- LacZ knockin farelerinde (Barker ve dig, ekspresyonunu qPCR yoluyla saptanmasina ragmen, Lgr5'in saglikli karacigerde esas olarak. saptanamadigi görülmüstür. Lgr5-LacZ knockin farelerine yapilan CCl4 enjeksiyonunun ardindan (bkz. LacZ fareleri için yukarida bahsedilen Barker ve dig, 2007 ve CC14 yönteminin açiklamasi için Furuyama K ve dig., Nat Genetics, raportörün net bir sekilde eksprese edildigini (bkz. sekil 13A), ekspresyonunun hasardan sonra gün 6,5'te zirveye ulastigini ve gün 9'a kadar sürdügünü ve karaciger, gün 13'te tamamen rejenerasyon gerçeklestirdiginde net bir sekilde dagildigini (sekil 13 A, üst sag panel) gözlemledik. Benzer hasar protokolüne tabi tutulan yabani tip yavrularda raportör ekspresyonu saptanmamistir (bkz. sekil 13A, alt sag panel). Lgr5 ekspresyonunun aktif rejenarasyon alanlarinda görülmesi, Lgr5'in hasarin ardindan rejeneratif kök hücrelerin/progenitörlerin Wnt'si tarafindan de novo aktivasyonun habercisi olabilecegini göstermistir. Aslinda, novo görünen Lgr5 hücrelerinin olgun karaciger hücrelerinin veya yildiz hücrelerinin markörlerini (Kl9 veya FAH) eksprese etmedigini, ancak bunun yerine yakin zamanda açiklanan karaciger progenitör markörü Sox9 için pozitif` oldugunu bulduk (Sekil l3B). Bu, in vitro organoidlerin elde edilmesi için baslangiç noktasi olan Lgr5+ hücrelerinin, karaciger hasarinin indüklenmesiyle veya R-spondin ile Wnt sinyalininin uyarilmasiyla karaciger fragmanlarindan elde edilebilecegi anlamina gelir. Karaciger hücrelerinde Lgr5 ekspresyonunun hasar veya R-spondin yoluyla indüksiyonu, hücreler elde edilmeden önce in vivo olarak, izole edilmis bir karacigerde ex vivo olarak ve bir karaciger fragmaninda veya bir karaciger hücresi popülasyonunda in vitro olarak gerçeklestirilebilir. Örnek 5 - Karaciger organoid kültürlerinin uzun süreli genislemesi Örnek l'de, FGFlO (lOOng/ml), HGF (25-50ng/ml) ve Nikotinamid (l-lOmM) ile takviye edilmis EGF (50 ng/ml) ve R-spondin 1'in (lug/ml) kombinasyonu, kültürlerin uzun süre muhafaza edilmesi için tercih edildigini gördük. Su anda, EGF ve Respondinl'e eklenen üç takviye faktörünün hepsinin (FGFlO, HGF ve Nikotinamid) kültürlerin 3 aydan daha uzun süre genislemesi için gerekli olduguna dair kanitlarimiz bulunmaktadir. Bunu degerlendirmek amaciyla, Sekil l4'te gösterildigi gibi karaciger parankimasindan safra kanallarini izole ettik (Kl9 boyamasi, izole edilmis yapilarin kimligini dogrulamak için kullanilmistir) ve bunlarin asagidakiler ile kültürlenmesiyle karaciger organoidi kültürleri olusturduk: i) EGF veya ii) EGF ve R-spondinl arti FGFlO veya HGF veya Nikotinamid veya iii) EGF ve R-spondinl arti FGFlO ve HGF ve Nikotinamid (ERFHNic). Kültürleri, toplam 14 hafta boyunca haftada bir kez böldük. Sonuçlar, örnek 1 ve 2'de bildirildigi gibi FGFlO ile birlestirilen EGF, R-spondinl ve Nikotinamid'in, karaciger kültürlerinin büyümesi ve kendi kendini yenilemesi için gerekli oldugunu dogrulamistir. 10 pasajdan sonra HGF içermeyen kültürlerde, HGF ile takviye edilmis kültürlere kiyasla. bir büyüme dezavantaji görülmüstür. Hala canli olsa da çogalma orani, bütün kombinasyon (FGFlO, HGF ve Nikotinamid) ile takviye edilmis kültürlere ait 1:6-128 oranlarina kiyasla 1:2-lz4 oranlarina düsmüstür. 15 pasajdan sonra, HGF ile takviye edilmemis ERFNic'li kültürler canli kalmamistir. Dolayisiyla bu sonuçlar, HGF'nin, uzun süreli muhafazadan sonra iyi bir çogalma oranini muhafaza etmek için gerekli oldugunu göstermistir (sekil Örnek 6 - Farklilasma kosullari altinda karaciger organoidlerinde eksprese edilen markörler Örnek 2'de tarif edilen farklilasma protokolü kullanarak, karaciger organoidlerinde bir hepatosit yüzey markörü (albümin) ve bir hepatosit yüzey markörü saptayabildik. Bu hepatosit benzeri hücrelerin sayisini ölçmek için bir hepatosit yüzey markörü kullanarak kültürler üzerinde akis sitometri analizi gerçeklestirdik. Genisleme kültürü kosulunda neredeyse hiç hepatosit yüzey markörü pozitif hücre saptanmazken, farklilasmadan sonra hücrelerin neredeyse %35'i, bu hepatosit yüzey markörü için pozitif oldugunu gözlemledik (bkz. Sekil 178 Daha sonra bu farklilasma kosullari altinda fare karaciger organoidlerinin gen ekspresyon profilini analiz ettik (sekil 16 ve sekil 1'de örnegin Alb, FAH, TAT ve Cyp3 genlerinin güçlü bir sekilde yukari dogru regüle edildigini görüyoruz). Farklilasma sonrasi fare karaciger organoidlerinin gen ekspresyonunun, olgun fare hepatositlerinin ve/veya fare karacigerinin gen ekspresyonuna benzedigini gördük. Örnek 7 - Karaciger organoidlerinin farelere nakli Hücreler, ERFHNic ekspresyon kosullari ve EAFD farklilasma kosullari kullanilarak büyütülmüs organoidlerden alinmis ve Tirozinemi tip I insan hastaligi için bir fare modeli olan tirozin katabolik enzimi fumarilasetoasetat hidrolazi (FAH) bakimindan yetersiz immün yetersiz fare susuna nakil edilmistir programi, Sekil 17D'de gösterilmistir. Ön sonuçlar, dagilmis FAH pozitif hücrelerin, FAH eksikligi bulanan farelerin karaciger parenkimasinda bulundugunu gösterir ve bu, organoid kültürlerinden türetilmis karaciger hücrelerinin, alici karacigerlere asilandigini gösterir (bkz. sekil 17A, sag taraf). Ayrica, alici farelerin karacigerlerinde de önemli ölçüde artan K19 pozitif hücre sayilari saptanmistir. Bu, organoid türevli nakledilen hücrelerin, asagidaki iki soyun her ikisini de in Vivo üretebildigini gösterir: hepatositler (FAH markörü ile gösterildigi üzere) ve kolanjiyositler (K19 markörü ile gösterildigi üzere) (bkz. Sekil 17A, sol üst panel). Bu, iki ayri kültürden iki ayri kolondan gelen nakledilmis hücrelerin akis sitometri analizi ile desteklenmistir (sirasiyla sekil 17B ve 17C). Lgr5+ hücreleri, GFP içeren bir Virüs ile transdüse edilmistir ve akis sitometri analizi farklilasmadan sonra gerçeklestirilmistir. Hepatosit yüzey markörü için pozitif hücreler, daha büyük hücrelere isaret eden daha büyük bir dagilim gösterir ve bu, granüllügü ve olgunlugu, baska bir ifadeyle olgun hepatosit hücreleri temsil eder. Hepatosit yüzey markörü için negatif olan hücreler, daha az dagilmaya neden olmustur ve bu, daha küçük hücreleri, baska bir ifadeyle daha az olgun progenitörleri isaret eder. Dolayisiyla tüm tipleri, bir farklilasma kültüründe mevcuttur (olgun ve olgunlasmamis hücreler). Farklilasmis hücrelerin geri kalani, yani FACS analizi için kullanilmayan hücreler, nakil deneyleri için kullanilmistir. Bulusun bir yöntemine göre kültürlenen fare karacigerinden elde edilen organoidler, hangi genlerin eksprese edildigini ve hangi genlerin eksprese edilmedigini belirlemek için mikrodizi analizi kullanilarak analiz edilmistir. Bulusun EMl, EM2 ve DM ortami kullanilarak kültürlenen insan karacigerinden elde edilen organoidler, hangi genlerin eksprese edildigini ve hangi genlerin eksprese edilmedigini belirlemek için oligonükleotit mikrodizi analizi kullanilarak analiz edilmistir. Genisleme ortaminda eksprese edilen genler, farklilasma ortamina eksprese edilen genler ve eriskin karacigerinde eksprese edilen genler arasinda belirgin bir sekilde farkli bir gen ekspresyon profili göze çarpmistir. Hepatosit. gen ekspresyonu için olan trend, farede görülenle neredeyse aynidir, ancak organoidlerin farklilasmasi, fare karaciger organoidlerindeki farklilasmadan daha az olmustur. Bu, insan hücresinin kullanilmasindan kaynaklaniyor olabilir. Bir oligonükleotit mikrodizinin kullanildigi bir analizde siklikla oldugu gibi LgrS ve Tnfrsfl9 saptanmamistir. Ancak, genisleme ortaminda kültürlenen organoidlerde bulunduklari görülmüstür. MALZEMELER VE YÖNTEMLER (Örnek 4 ila 7 için) Hayvan tedavisi Iki ila sekiz aylik LgrSLacZ veya Axin2-LacZ veya WT yavrulari BL6/Balbc Fl farelerine, misir yaginda (n =) çözülmüs intraperitoneal 0,8 ml/kg CCL4 enjeksiyonu veya yalnizca misir yagi (n: ) verilmistir. Fareler, 2, 5, 9 veya 13 gün sonra sakrifiye edilmistir ve karaciger izole edilmis ve RNA ve B- galaktosidaz boyamasi için ayrica islemden geçirilmistir. Karaciger dokulari izole edilmis ve hemen dönen bir platformda 4°C'de 20 kat hacimli buz soguklugunda sabitleyici (PBSO içinde boyunca inkübe edilmistir. Sabitleyici çikarilmis ve dokular, dönen bir platformda oda sicakliginda 20 dakika boyunca yikama tamponunda (PBSO; 2 mM MgClz; % iki kez yikanmistir. ß-galaktosidaz substrati (PBSO içinde 5 mM NaDeoksikolat; l mg/ml X-gal) daha sonra eklenmistir ve dokular, 37°C'de 2 saat ve oda sicakliginda gece boyunca karanlikta inkübe edilmistir. Substrat çikarilmis ve dokular, dönen bir platformda oda sicakliginda 20 dakika boyunca PBSO içinde iki kez yikanmistir. Dokular daha sonra dönen bir platformda karanlikta 4°C'de PBSO içinde 20 kat hacimli %4 Paraformaldehit (PFA) içinde gece boyunca sabitlenmistir. PFA çikarilmis ve dokular, dönen bir platformda oda sicakliginda 20 dakika boyunca PBSO içinde iki kez yikanmistir. Boyanan dokular, standart yöntemler kullanilarak doku kasetlerine ve parafin bloklarina aktarilmistir. Doku kesitleri (4 uM) hazirlanmis ve nötr kirmizi ile karsi boyanmistir. R-spondinl tedavisi 6-8 haftalik AxinZ-lacZ farelerine, lOO ug saflastirilmis insan R-spondinl IP yoldan enjekte edilmistir ve bu fareler, karacigerde LacZ ekspresyonu analizi için 48 saat sonra sakrifiye edilmistir. RNA, gastrik hücre kültürlerinden veya taze izole edilmis dokudan RNeasy Mini RNA Ekstraksiyon Kiti (Qiagen) kullanilarak ekstrakte edilmistir ve Moloney Murin Lösemi Virüsü ters transkriptazi (Promega) kullanilarak ters transkribe edilmistir. cDNA, daha önce tarif edildigi gibi bir termal döngüleyicide (GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems, Londra, Birlesik Krallik) amplifiye edilmistir (Huch ve dig., 2009). Kullanilan primerler, asagida Tablo 3'te gösterilmektedir. Gen adi Gen Sekans PCR sembolü ürünü Sitokrom P450, aile CYP3All fw 'TGGTCAAACGCCTCTCCTTGCTG 100 alt aile a, rV ACTGGGCCAAAATCCCGCCG polipeptit ll Glikoz-6-fosfat G6P fw GAATTACCAAGACTCCAGG 581 rv TGAGACAATACTTCCGGAGG Keratin l9 Krtl9 fw GTCCTACAGATTGACAATGC 549 rV CACGCTCTGGATCTGTGACA Albümin fw GCGCAGATGACAGGGCGGAA 358 rv GTGCCGTAGCATGCGGGAGG t-box 3 Tbx3 fw AGCGATCACGCAACGTGGCA 441 rv GGCTTCGCTGGGACACAGATCT Prospero ile Proxl fw TTCAACAGATGCATTACC 270 iliskili homeobox protein l rV TCTTTGCCCGCGATGATG Fumarylacetoacetate Fah ÜN ACGACTGGAGCGCACGAGAC 183 hidrolaz rv AGGGCTGGCTGTGGCAGAGA Tirozin Tat fw TTTGGCAGTGGCTGAAAGGCA 258 rv GGGCCCAGGATCCGCTGACT Triptofan 2,3- TdoZ ÜN ACTCCCCGTGAAGGCAGCGA 583 rV TCTTTCCAGCCATGCCTCCACT Lösin bakimindan Lgr5 ÜN GGAAATGCTTTGACACATTC 413 içeren G proteini rv GGAAGTCATCAAGGTTATTATA kenetlenmis Transtiretin TTR ÜN ATGGTCAAAGTCCTGGATGC 220 rV AATTCATGGAACGGGGAAAT Glikokinaz Gck fw AAGATCATTGGCGGAAAG 193 rV GAGTGCTCAGGATGTTAAG hipoksantin Hprt fw AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA 186 fosforibosiltransfe rv TTGCGCTCATTAGGCTTT Immünohistokimya Burada kullanilan immünoboyama prosedürü daha önce Huch ve dig. 2009 yayininda tarif edilmistir. Kisaca bes mikrometrelik kesitler parafinize edilmis, rehidre olmus ve doku kesitleri, PBS-T (PBS; TweenZO %0,l) kullanilarak geçirgenlestirilmistir. Gerektiginde kesitler, antijen alimi için 10 mM sitrat tamponu (pH 6,0) ile muamele edilmis, evrensel bloklama tamponu (BioGenex) kullanilarak. bloke edilmis ve primer antikor ile inkübe edilmistir. Daha sonra kesitler, PBS ile iki kez yikanmistir ve peroksidaz ile konjüge edilmis sekonder antikorlarla inkübe edilmistir. DAB+ (DAKO), bir kromojen substrati olarak kullanilmistir. Kesitler, Mayer hematoksilini ile karsi boyanmistir ve bir Leica DMR inikroskobu üzerinde görsellestirilmistir. Kullanilan primer antikorlari sunlardir: tavsan anti-Sox9 (1:600; oda sicakliginda 1 saat, Millipore), fare anti-SMA (1:1000, 4°C'de gece boyunca, Sigma), tavsan anti- FAH (1:5000; 37°C'de gece boyunca, M. Grompe tarafindan hediye edilmistir), tavsan anti-Kl9 (1:500; 4°C'de gece boyunca, M. Grompe tarafindan hediye edilmistir). Peroksidaz ile konjüge edilmis sekonder antikorlar, Fare veya Tavsan Brightvision (Immunologic) idi. Immünofloresan Bütün boyama için, organoidler veya izole edilmis safra kanallari, aseton (organoidler) veya %4 PFA (safra kanallari) ile 30 dakika boyunca sabitlenmis, PBS ile bir kere yikanmis, PBS %O,3 Triton-X100 ile 5 dakika boyunca geçirgenlestirilmis, Evrensel bloklama çözeltisi (Power block HK085-5KE BioGenex) kullanilarak bloke edilmistir ve PBS%1FBS içinde seyreltilen primer antikorlarla inkübe edilmistir. PBS içinde birkaç yikamadan sonra örnekler, sekonder antikor ile inkübe edilmistir. Çekirdekler, Hoescht33342 ile boyanmistir. Görüntüler, konfokal mikroskopi (Leica, SP5) kullanilarak elde edilmistir. Volocity Software (Improvision) kullanilarak üç boyutlu rekonstrüksiyon yapilmistir. Kullanilan primer antikorlar sunlardir: tavsan anti-Kl9 (1:500; M. Grompe tarafindan hediye edilmistir), siçan anti-hepatosit yüzey markörü (1:50, M. Grompe tarafindan hediye edilmistir), keçi anti-albümin (1:50, santa Cruz). Kullanilan sekonder antikorlarin hepsi, esek içinde büyütülmüstür ve farkli Alexa fluoroforlarina (esek anti-keçi 568, esek anti siçan-488, esek anti tavsan- 647, Molecular problari) konjüge edilmistir. Akis sitometrisi Ayrismis hücreler, 1:20 oraninda bir seyreltmede MIC1-1C3 hibridom üst fazinin veya 1:50 oraninda bir seyreltmede OCZ-2F8 hibridom üst fazi ilave edilmeden önce lml DMEM %2 FBS içerisinde mililitre basina 1 xlO4 hücre oraninda tekrar süspansiyon haline getirilmistir ve 4°C'de 30 dakika boyunca inkübe edilmistir. Soguk. Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile yikandiktan sonra hücreler, fare serum proteinlerine karsi adsorbe edilmis 1:200 oraninda bir seyreltmede APC ile konjüge edilmis keçi anti- siçan sekonder antikoru içeren DMEM 1- %2 PES içinde yeniden süspanse edilmistir. Propidyum iyodür boyamasi, ölü hücreleri disarida birakmak üzere etiketlemek için kullanilmistir. Hücreler analiz edilmis ve bir Cytopeia. inFluxV-GS (Becton- Dickenson) ile siralanmistir. Nakil analizi Siralanan hücre popülasyonlarinin dalaga enjeksiyonu ve hepatosit seçiminin indüklenmesi için NTBC'nin geri çekilmesi, daha önce tarif edilen sekilde gerçeklestirilmistir (Overturf ve dig. 1996). Ilacin geri çekilmesi, 3 haftalik periyotlarda gerçeklestirilmistir ve ardindan alici hayvanlar normal agirliga gelene kadar tekrar uygulama gerçeklestirilmistir. TR TR TR TR TR TR

Claims (15)

ISTEMLER

1. Bir karaciger organoidinin elde edilmesine yönelik bir yöntem olup, özelligi; söz konusu yöntemin asagidakileri içermesidir: bir genisleme ortami varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde olan bir veya daha fazla karaciger epitel kök hücresinin veya bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger safra kanalinin kültürlenmesi ve söz konusu ortamin, hayvan veya insan hücrelerine yönelik içine asagidakilerin eklendigi bir bazal ortam içermesi: epidermal büyüme faktörü (EGF), FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir fibroblast büyüme faktörü (FGF), Nikotinamid ve Rspondin l, Rspondin 2, Rspondin 3 veya Rspondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonisti.

2. Istem 1'e göre bir yöntem olup, özelligi; genisleme ortaminin ayrica HGF içermesidir.

3.Istem 1 veya istem Z'ye göre yöntem olup, özelligi; bir TGF-beta inhibitörünün ayrica ortam içinde bulunmasi ve istege bagli olarak TGF-beta inhibitörünün, A83-Ol, SB- olusan gruptan seçilen bir küçük moleküllü inhibitördür.

4.Istem 1 ila istem 4'ten herhangi birine göre yöntem olup, özelligi; söz konusu yöntemin, söz konusu bir veya daha fazla epitel kök hücresinin, içine EGF, bir BMP inhibitörü, R- spondin ve Wnt'nin eklendigi, hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içeren veya bir bazal ortamdan olusan bir hücre kültürü ortaminda; ve ardindan içine EGF, bir FGF ve HGF, Nikotinamid ve bir R- spondin'in eklendigi, hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içeren veya bir bazal ortamdan olusan bir genisleme ortaminda; ve ardindan içine EGF, FGF ve/veya HFG, bir TGF-beta inhibitörü ve bir Çentik inhibitörünün eklendigi, hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içeren veya bir bazal ortamdan olusan bir farklilasma ortaminda kültürlenmesini içermesidir.

5.Istem 4'e göre yöntem olup, özelligi; farklilasma ortaminin ayrica deksametazon içermesidir.

6.Bir hücre kültürü ortami olup, özelligi; içine EGF, FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir FGF, Nikotinamid ve R-spondin l, R-spondin 2, R-spondin 3 veya R-spondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonistinin eklendigi, hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortami içermesidir.

7. Istem 6'ya göre hücre kültürü ortami olup, özelligi; HGF'nin ortama eklenmesidir.

8. Isteni 6 veya 7'ye göre kültür ortami olup, özelligi; gastrin, B27, N2 ve N-Asetilsistein'den olusan gruptan bir, iki, üç, dört veya daha fazlasinin bazal ortama eklenmesidir.

9.Bir karaciger organoidi olup, özelligi; bir genisleme ortami varliginda hücre disi bir matris ile temas halinde olan bir veya daha fazla karaciger epitel kök hücresinin veya bir karaciger fragmaninin veya bir karaciger safra kanalinin kültürlenmesiyle elde edilebilir, Lgr5 eksprese eden hücreleri içermesi ve söz konusu ortamin, içine epidermal büyüme faktörü (EGP), FGFRZ veya FGFR4'e baglanabilen bir fibroblast büyüme faktörü (FGF), Nikotinamid ve Rspondin l, Rspondin 2, Rspondin 3 veya Rspondin 4 arasindan seçilen bir Wnt agonistinin eklendigi, hayvan veya insan hücrelerine yönelik bir bazal ortam içermesi ve söz konusu karaciger organoidinin, en az 3 ay boyunca kültürlenebilmesidir.

10. Istem 9'a göre karaciger organoidi olup, özelligi; bir kistik yapi ve dis kisminda en az bir tomurcugu ve merkezi bir lümeni olan bir hücre katmani içermesidir.

11. Istem 9 veya istem lO'a göre karaciger organoidi olup, özelligi; asagidaki özelliklerden birine veya daha fazlasina (örn. 2, 3, 4 veya 5) sahip olmasidir: (a) >5 x lO5hücre/cm% tercihen >1O x 105 hücre/cm3'lük bir hücre yogunluguna sahip olmasi; (b) 2-30 katman hücreye denk bir kalinliga, tercihen 2-15 katman hücreye denk bir kalinliga sahip olmasi; (c) hücrelerin karsilikli olarak üç boyutta temas halinde olmasi, (d) saglikli karaciger dokusunda bulunan bir islevi göstermesi, (e) tanimlanmis iki domenli uzun bir sekle sahip olmasi.

12. Isteni 9 ila ll'den herhangi birine göre karaciger organoidi olup, özelligi; (a) organoidin, polarize hücrelerin saptandigi ve keratin inarkörlerinin eksprese edildigi tek katmanlir bir epitel domen ve organoidin ana gövdesini olusturan, polarize olmayan hücreler içeren çok katmanli bir epitel tarafindan olusturulan, istege bagli olarak albümin eksprese eden ikinci bir domen içermesi ve/veya (b) organoidin, Lgr5 eksprese eden ve en az lxlO3 hücre ile SXlO4 hücre arasinda bir hücre popülasyonu içeren bir eriskin karacigerinden alinan bir epitel kök hücreden elde edilmesidir.

13. Istem› 9 ila 12'den birinde tanimlandigi gibi bir karaciger organoidi olup, Özelligi; bir ilaç kesif taramasinda kullanilmasidir.

14.Istem 9 ila 12'den herhangi birinde tanimlandigi gibi bir karaciger organoidi olup, özelligi; bir toksisite analizinde kullanilmasidir.

15. Istem 9 ila 12'den herhangi birine göre bir karaciger organoidi olup, özelligi; bir karaciger bozuklugu, durumu veya hastaliginin tedavisinde veya rejeneratif tipta kullanilmaya yönelik olmasidir.