TW200930407A - Conjugates of anti-RG-1 antibodies - Google Patents

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Jonathan A Terrett
Sanjeev Gangwar
Josephine M Cardarelli
Chetana Rao-Naik
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Description

200930407 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供與搭檔分子接合的抗RG-1抗體，以用於治 療諸如癌症等疾病，其中無論已被結合的RG-1是否在靶 細胞（target cell)内被内化，該搭檔分子均能發揮其作用。 【先前技術】 已開發出與細胞毒素化合物接合的抗體-搭檔分子，用 於治療包括癌症在内的疾病。通常，此技術僅限於抗原 標乾’當抗體/抗原複合物被内化（internalized)進入把細 胞中’然後在細胞内釋放和/或活化該搭構分子（partner molecule)。此類接合體（conjugate)通稱為抗體-藥物接合 體，或ADC。 可以使用「内化作用」系統（internalization-based system)進行治療的一疾病範例是攝護腺癌（或稱前列腺 癌’ prostate cancer)。攝護腺癌是男性的常見疾病，45 歲以上之男性約有三分之一受影響。有證據顯示是由遺 傳和環境兩種因素所造成，且絕大多數的病例有可能是 兩種因素結合之結果。 通常藉由身體檢查和攝護腺特異性抗原（PSA)的血清 濃度來診斷攝護腺癌。攝護腺根除術對於局部性疾病而 吕是一種治療選擇。晚期的轉移性疾病目前是採用雄性 素消融療法（androgen ablation therapy)或促性腺激素釋 200930407 放素（GnRH)治療以及制抗雄性素療法進行治療。然 而，晚期疾病幾乎總是變得具有激素抗性，因而不能户 癒這些病情持續發展中的疾病。此外，攝護腺根除術和 雄激素消融療法均伴有嚴重的副作用。儘管内化作用系 統有希望成為這些治療方法的替代方法，然而對用於早 期和晚期攝護腺癌的新型療法仍然存在相當大的需要。 多肽RG-l(p〇lypeptide RG_1}是細胞外基質蛋白之 Mmdui/F-spondin 家族中的同源體（us 5 871，969)。多肽 RG-1在攝護腺組織中高度表現（w〇 98/45442卜因此應 當是用於診斷和治療攝護腺癌和表現多肽RG-1之其他 癌症（例如膀胱癌）的有用靶標。Harkins等人（US 7,335,748)公開了人類抗-RG-1抗體及其在檢測和治療癌 症上的用途。我們出乎意料地發現RG—i抗體和搭檔分子 所形成的接合體能夠有效治療與表現異常有關的 病症’儘管當抗體結合至RG_ i時RG_ 1不進入細胞。 【發明内容】 本案揭示内容提供已分離的抗-RG-1抗體-搭檔分子接 〇 體（anti-RG-1 antibody-partner molecule conjugates)， 該接合體對RG-1具有高親和力且能專一性地結合至 RG_1。本文還提供使用該接合體治療諸如攝護腺癌和膀 胱癌等癌症的方法。 在一實施例中’抗體-搭檔分子接合體包含與搭檔分子 4 200930407 接σ (conjugated)的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體 或其抗原結合部分能與人類RG-1結合（binding),並且該 接合體顯示出以下性質中的至少一種（較佳兩種）性質： (a) 以1 X 1〇·8 IV[或更小的KD與人類RG-1結合；或 (b) 抑制體内rgj表現細胞cell)的 生長。 較佳者’該接合體的抗體部分是人類抗體，更佳為人 類單株抗體。亦較佳者，該抗體或其抗原結合部分交叉 競爭結合至人類RG_1上已被一參考抗體識別的表位 (epitope) ’參考抗體包括： (a) —包含序列編號：n之氨基酸序列的重鏈可變區 (VH) ’和一包含序列編號：Η之氨基酸序列的輕鏈可變 區（Vl);或 (b) —包含序列編號：14之氨基酸序列的Vh，和一包 含序列編號：1 6之氨基酸序列的vL。 在一較佳實施例中，參考抗體包括含有序列編號：13 之氨基酸序列的和含有序列編號：15之氨基酸序列 的VL。在另一較佳實施例中，參考抗體包括含有序列編 號：14之氨基酸序列的vh和含有序列編號：16之氨基 酸序列的Vl。 本發明之接合體的特別較佳抗體或其抗原結合部分包 括： (a) 包含序列編號：}的vH CDR1 ; (b) 包含序列編號：3的vH CDR2 ; 200930407 U 的 VL CDR3。 分=明之接合體的另一特別較佳抗體或其抗 (c) 包含序列編號 (d) 包含序列編號 (e) 包含序列編號 (f) 包含序列編號 體 5 的 Vh CDR3 ; 7 的 CDR1 ; 9的VL CDR2 ;以及 原結合部 (a) 包含序列編號：2的vH CDRi .
(b) 包含序列編號：4的Vh CDR2 ; ⑷包含序列編號：6的Vh CDR3 ; (d) 包含序列編號：8的Vl CDR1 ; (e) 包含序列編號：10的VlCDR2;以及 ⑴包含序列編號：12的Vl CDR3。 在另-態樣中，本發明之接合體的單株抗體或其 結合部分包括： 、 (a) — VH，其包含選自由序列編號：13和14組成之 群組中的一氨基酸序列；以及 (b) — VL，其包含選自由序列編號：15和16組成之 群組中的一氨基酸序列； 其中該抗體專一性（specifically)地結合至人類。 别述抗體或其抗原結合部分的一較佳組合包括： (a) 一包含序列編號：13之氨基酸序列的vH ;以及 (b) —包含序列編號·· 15之氨基酸序列的vL。 前述抗體或其抗原結合部分的另一較佳組合包括： (a) —包含序列編號：14之氨基酸序列的VH ;以及 6 200930407 (b) —包含序列編號：16之氨基酸序列的VL。 該抗體可以是全長的抗體，例如IgGi或IgG4同型抗 體（is〇tyPe)，或疋抗體斷片（fragments)，例如 Fab、Fab’ 或Fab’2斷片，或是單鏈抗體。 在另一態樣中’本發明涉及抑制表現RG-1之腫瘤細胞 生長的方法’該方法包括使所述細胞接觸本發明之抗體_ 搭槽分子接合體’以抑制所述RG-1腫瘤細胞的生長。 在另一態樣中’本發明涉及一種治療需要此類治療之 受試者體内癌症的方法，該方法包括給受試者施用有效 量的本發明之抗體·搭檔分子接合體，以治療該受試者體 内的癌症。較佳地，所述癌症是具有RG-1表現細胞的癌 症0 【實施方式】 本發明涉及抗體、抗體斷片和抗體模擬物，它們能專 〇 一性地結合至RG-1且對RG-1具有高親和性，並且被接 合到搭檔分子上，這些搭檔分子不需要接合體的内化作 用（internalization)即可發揮它們的效能。 非内化抗原（Non-internalized antigens，例如 RG-1)留 在腫瘤部位處，並且與抗體結合時不會快速地内化。據 報導，接合體的功效取決於細胞表面的抗體_抗原相互作 用引發内化作用（internalization)、運輸和隨後活性細胞 毒素有效載荷的釋放（Sutherland et al.，J. Bid. chem. 7 200930407 281’ 10540-10547 (2006))。然而，在本發明中，證明了 即使已被抗體識別的抗原沒有内化’或者可能不存在於 腫瘤細胞本身上，而是存在于周圍的細胞外基質、間質 細胞、腫瘤血管細胞或侵入性炎性細胞（如腫瘤相關的 巨嗤細胞）上，抗體藥物接合體在腫瘤部位的停留足以對 腫瘤產生細胞毒性效果。或者，當抗原脫離腫瘤細胞但 藉著與腫瘤細胞、細胞外基質、間質細胞、侵入性炎症 細胞或腫瘤血管細胞聯合（associati〇n)而留在腫瘤部位 時’仍能使該抗原停留。 非内化抗原（諸如RG-1)保持在腫瘤部位並且在當與抗 體結合時不被内化。可以藉著標靶抗原附著至腫瘤細 胞、周圍間質細胞或腫瘤血管細胞的外部原生質膜來介 導該抗原在腫瘤部位的停留《或者，當抗原脫離腫瘤細 胞但藉著其與細胞外基質或腫瘤細胞、間質細胞或腫瘤 金管細胞聯合而留在腫瘤部位時，仍能使該抗原停留 (retention) ° 在抗體-搭槽分子接合體的情況中，抗體-搭槽分子接 合體將藉著與抗原結合而留在疾病部位，使搭槽分子能 夠朝向腫瘤釋放（tumor-biased release)。當例如藉著連接 基團的斷裂（將說明於下）而釋放搭檔分子時，搭稽分子 隨後可自由地進入附近的細胞中，變成活化形式，並發 揮其作用。在pH敏感性連接子的例子中，例如腙類 (hydrazone)，腫瘤的較低細胞外pH值（pHe，該值通常 約為6,8或比正常組織的pH值大約低0.5單位）有益於連 200930407 接基團（linker group)的斷裂。或者，可利用在腫瘤的細 胞外基質中或腫瘤内之細胞表面上的蛋白酶來切斷連接 子（linker)，該蛋白酶例如CD 、組織蛋白酶 (cathepsins)基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteases) 和絲胺酸蛋白酶（serine proteases：)。 為了可以更容易理解本發明，首先對一些術語進行定 義。其他定義則在整個詳細說明中闡明。 術語「RG-1」包括人類rgj的變異體（variant)、同源 〇 異構型（isoform)和物種同系物（species homolog)。因此， 本文中的人類抗體在一些情況下可能與來自人以外之其 他物種的RG-1產生父又反應（cr〇ss_react)。在某些實施 例中，這些抗體、抗體斷片或抗體模擬物可以對一種或 多種人類RG-1具有完全專一性（Specific)，並且可能不 會顯示非人類交叉反應性的物種或其他類型。 術语「免疫反應（immune response)」係指諸如淋巴細 〇 胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、顆粒球（granul〇cyte)和由 以上細胞或肝臟所產生之可溶性大分子（包括抗體、細胞 激素和補體）的作用，該作用導致對侵入的病原體、被病 原體感染的細胞或組織、癌細胞或（在自體免疫炎症和 病理炎症情況下）正常人類細胞或組織造成選擇性損 害、破壞或從人體内清除。 「訊息傳遞路徑（signal transduction pathway)」係指各 種訊息傳導分子之間的生物化學關係，訊息傳導分子所 扮决的角色是將訊息從細胞的一部分傳遞至細胞的另一 200930407 胞表面受體（cell surface recept〇r)」包括能夠 接收訊息並且使該訊息傳遞通過細胞原生質膜（plasma membrane)的分子或分子複合物，例如RG-1受體。 術浯「抗體（antibody)」係指全部抗體和其任何抗原結 合斷片（抗原結合部分）或單鏈。「全長抗體（fuU “叫讣 antibody)」係指包括藉由雙硫鍵而互連之至少兩條重（η) 鏈和兩條輕(L)鏈的蛋白。每條重鏈包含一重鏈可變區 (縮寫為VH)和—重鏈恒定區。該重鏈恒定區包含三個功 能域（domain)，Ch1、Ch2和Ch3。每條輕鏈包含一輕 鏈可變區（縮寫為VL)和一輕鏈恒定區。該輕鏈恒定區包 含一功能域’ cl。VH和VL區還可再細分為具有高度可 變性的多個區，被稱為互補決定區（CDR)，其間散置有較 保守的多個區域，稱為框架結構區（FR)。每個vH和Vl 均由三個CDR和四個Fr所構成，且按照以下順序從氨 基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的這些可變區包含與抗原相互 作用的結合功能域（binding domain)。抗體的恒定區可介 導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統 的各種細胞（如作用細胞）和正統補體系統（cUssical complement system)的第一成分（Clq) ° 術語「抗體斷片（antibody fragment)」和抗體的「抗原 結合部分（antigen-binding portion)」（或簡稱為“抗體部 分”）係指抗體的一個或多個斷片，該些斷片保留與抗原 (如RG-1)專一性結合的能力，已經有文獻顯示能利用全 200930407 長抗體的多個斷片來執行抗原結合功能。此類結合斷片 .的實例包括（i)Fab斷片’即由Vl、Vh、Cl和Ch1功能 • 域構成的單價斷片；⑴）F(ab，)2斷片，即包含以一個雙 硫鍵橋在鉸鏈區（hinge region)相連之兩個Fab斷片的二 價斷片；（iii) Fab，斷片，其本質上是具有一部分鉸鏈區 的 Fab，參見 FUNDA-MENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed.， 3rded.l993); (iv)由vH和CH1功能域所構成的Fd斷片； (v)由抗肆單臂上的vL和VH功能域所橼成的卜斷片； ® (vi)由一 Vh功能域所構成的dAb斷片（wardetal.，（1989) — “re ·· 544-546) ; (vii)分離的互補決定區（CDR); 和（viii)奈米抗體（nan〇b〇dy)，包含單個可變功能域 和兩個恒定功能域的VH。儘管Fv斷片的兩個功能域， Vl和Vji’疋由個別的基因所編碼，但可以使用重組方法 藉由一合成的連接子來連接它們’該連接子能夠使這兩 個功能域成為單條蛋白鏈，鏈中的vL和vH區域配對以 Q 形成單價分子，稱為單鏈Fv (scFv)，例如參見Bird等 (1988) Science 242 · 423-426 ’ 和 Huston 等（1988) jFVoc 胸/· hi USA亞：5879-5883)。此類單鏈抗體也 應屬於抗體的「抗原結合部分」。 「已分離抗體（isolated antibody)」係指一種抗體，其 實質上不含具有不同抗原專一性的其他抗體（例如，與 RG-1專一性結合的已分離抗體，其實質上不含有會專一 性結合至除了 RG-1以外之其他抗原的抗體。然而，專一 性結合RG-1的已分離抗體對於其他抗原，例如來自其他 200930407 物種的RG_1分子，可能具有交叉反應性。此外，已分離 抗體可實質上不含其他細胞材料和/或化學物。 ， 術語「單株抗體（monoclonal antibody)」或「單株广體 組成（monoclonal antibody composition)」係指單一種八 子組成的抗體分子製劑。單株抗體組成顯示出對一特定 表位的單一結合專一性和親和性。 術語「人類抗體」包括該些其多個可變區中的框架結 構區和CDR區均來自人類種系免疫球蛋白岸列。此外， ® 如果該抗體包含一恒定區，則該恒定區也來自人類種系 免疫球蛋白序列。本發明的人類抗體包含由非人類種系 免疫球蛋白序列所編碼的氨基酸殘基，例如，由體外（比 vitro)隨機突變或定點突變所引入的突變，或是藉由體内 體細胞突變所引入的突變。然而，本文中使用的術語「人 類抗體」並非旨在包括以下抗體：將來自另一哺乳動物 物種（如小鼠）種系的CDR序列移植到人框架結構區序列 g 上的抗體。 術語「人類單株抗體」是指展現出單一結合專一性的 抗體’該抗體之多個可變區中的框架結構區和Cdr區均 來自人類種系免疫球蛋白序列。在一實施例中，該人類 單株抗體由融合瘤（hybridoma)產生，該融合瘤包括由基 因轉殖的非人動物（例如基因轉殖小鼠）得到的B細胞， 其基因組（genome ’或稱基因體）包含融合到永生細胞中 的人類重鏈轉瘦基因和輕鏈轉殖基因。 術語「重組人類抗體（rec〇rnbinant human antibody)」 12 200930407 包括所有利用重組方法所製備、表現、產生或分離而得 人類抗體，例如（a)從已轉殖有人免疫球蛋白基因的基因 轉殖或染色體轉殖動物（如小鼠）或從該動物製備而得的 融合瘤中所分離出的抗體（將進一步說明如下），（b)從經 轉型（transformed)以表達人類抗體的宿主細胞中所分離 出的抗體，例如從轉染瘤（transfect〇ma)所分離出的抗 體，（c)由聯合的人類的重組/組合抗體庫中所分離出的抗 體’和（d)利用任何其他手段所製備、表現、產生或分離 © 出的抗體，該些其他手段涉及將人免疫球蛋白基因序列 剪接到其他DNA序列上。在此類重組人類抗體具有的可 變區中，框架結構區和CDR區均來自人類種系免疫球蛋 白序列。然而，在某些實施例中，該重組人類抗體也可 進行體外突變（或者，當使用含人類Ig序列做動物基因 轉殖時進行體内的體細胞突變），因而該些重組抗體之 VH和VL區的氨基酸序列，儘管是來自人類種系Vh和 φ Vl序列和與該序列有關，但卻非天然存在於體内的人類 抗體種系表現庫（human antibody germline repertoire)中。 此處使用的「同型（is〇type)」一詞，係指由重鏈恒定 區基因所編碼的抗體種類’例如IgM或jgGi。 本文中，「識別一抗原的抗體」和「對一抗原具有專 一性的抗體」可與「專一性結合一抗原的抗體」一詞互 換使用。 「人源化抗體（humanized antibody)」係指將來自另一 哺乳動物物種（如小鼠）種系的CDR序列移植到人類框架 13 200930407 結構區序列上的抗體。可以在人類框架結構區序列中進 行額外的框架結構區修飾。
術語「嵌合抗體（chimeric antibody)」係指抗體中之可 變區序列來自一物種且恒定區序列來自另一物種#P 體’例如’一抗體中的可變區序列來自小鼠抗體而恒定 區序列來自人類抗體。 Ο ❹ 術語「抗體模擬物（antibody mimetic) j係指能狗模擬 抗體與抗原結合能力的分子，然而該些分子並不恨於天 然抗體結構。此類抗體模擬物的實例包括，但不限於， Affibodies、DARPins、Anticalins、Avimers 和 Versabodies ° 術語搭檔分子（partner molecule)」係指在抗體搭檔 分子接合體中與抗體接合的實體（entity)。搭冑分子的實 例包括藥物、細胞毒素、標記分子、蛋白質和治療劑， 標記分子包括但不限於肽（peptide ’或稱胜肽）和小分子 標記物（例如螢光染料標纪物彳， 种栋°己物）以及單原子標記物（例如 放射性同位素）。 本文中使用的「專_ ϋ _ 性^ «人類RG-1」抗體是指一 抗體，其以WO、或更小，較佳以“π、或更，] 更佳以3χ1〇-8 μ戎审,* ,, 次更小，更佳以1χ1〇·8Μ或更小，甚 更佳:乂 5:10、或更小的κ〇與人類㈣結合。 ? = :f上不結合」至蛋白質或細胞，係指抗類 結合至蛋白質或細胞上，也就是，抗餿 或更大，較佳以丨χ j 〇-5 M或更大，更佳以1 X 1 200930407 Μ或更大，更佳以1χ1〇-3 M 甘s *从 ,1λ.2 Μ取更大，甚至更佳以1 χ 1 〇 2 Μ或更大的KD結合至蛋白質或細胞上。 此處使用的術語「Kass。。」或「Ka,」，意指—特定抗體_ 抗原相互作用的結合速帛，而此處使用的術語「κ化」或 「Kd，」意指—特定抗體-抗原相互作用的解離速率。此 處使用的術語「KD，」意指解離常數，其是由心與 比（即Kd/Ka)得到，並被表示為莫耳濃度（M)。抗體的Kd 值可使甩本領域中已良好建立的方法來測定。測定抗體 的KD的較佳方法是使用表面電漿共振（surface plasm〇n resonance)，較佳使用一生物感測器系統，例如Biac〇re@ 系統。 用於IgG抗體的術語「高親和性（high affinity)」係指 抗體對靶抗原（target antigen)的KD值為ΐχΐ〇-7 μ或更 小，更佳為5xl0·8 Μ或更小，甚至更佳為ιχ1〇·8 Μ或更 小’甚至更佳為5 X 10_9Μ或更小，並且甚至更佳為！ χ丨〇·9 Μ或更小。然而’對於其他的同型抗體，「高親和性」結 合作用可以發生變化。例如，一種IgM同型抗體的「高 親和性」結合是指一種抗體具有KD為ΙΟ^Μ或更小，更 佳為1 Ο·7 Μ或更小，甚至更佳為1 〇·8Μ或更小。 此處使用的術語「受試者（subject)」包括任何人類或 非人動物。術語「非人動物（nonhuman animal)」包括所 有脊椎動物，如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長 類、綿羊、犬、貓、馬、牛、家禽、兩棲類、爬蟲類、 等等。 15 200930407 除非另作說明，術語「烷基（alkyl)」就其自身或作為 另一取代基的一部分，是指具有指定碳原子數（例如，一 個至十個碳原子，Cl_ClG)的直鏈、支鏈、環烴基團（cyclic hydrocarbon radical)或其組合，該基團可以是完全飽和、 單個不飽鍵和或多個不飽和鍵且可包括二價和多價的基 團。飽和烴基的實例包括，但不限於，甲基（methyl)、乙 基（ethyl)、正丙基（n_propyl)、異丙基（is〇pr〇pyl)、正丁 基（n-butyl)、叔丁基（t-butyl)、異丁基（is〇butyl)、仲丁基 (sec-butyl)、環己基（cyclohexyl)、（環己基）甲基 ((cyclohexyl)methLyl)、環丙基甲基（cyci〇propyimethy〇、 正戊基（n-pentyl)、正己基（n-hexyl)、正庚基（n_heptyl)、 正辛基（n-octyl)等等’及其類似物（homologs)和異構物 (isomers)。不飽和烷基是指具有一個或多個雙鍵或三鍵 的基困。不飽和烧基的實例包括，但不限於，乙烯基 (vinyl)、2-丙烯基（2-propenyl)、巴豆基（cr〇tyl)、2·異戊 Q 烯基（2-isopentenyl)、2-(丁 二烯基）（2-(butadienyl))、2,4- 戊二稀基（2,4-pentadienyl)、3-(1，4-戊二稀基） (3-(l，4-pentadienyl))、乙炔基（ethynyl)、1_ 丙炔基（1 -propynyl)、3-丙炔基（3-propynyl)、3· 丁炔基 (3-butynyl)，以及更高級的類似物和異構物。除非另作 說明，術§§·「烧基」還包括將在下方更詳細定義的燒基 衍生物’如「雜烷基」。只限於烴基的烷基被稱為「同燒 基（homoalkyl)」〇 術5吾「伸炫!基（alky lene)」就其自身或作為另一取代基 200930407 的一部分，是指來自烷類的二價基團，例如，但不限 於-CH/HzCHzCH2- ’並且還包括下方被稱為「雜伸烷基 (heteroalkylene)」的該些基團。通常，烷基（或伸烷基） 具有1至24個碳原子，在本發明中，較佳為該些具有 10個或更少碳原子的基團。 除非另作說明，術語「雜烷基（heter〇alkyl)」就其自身 或結合另一術語時’是指穩定的直鍵、支鏈、環烴基團 或其組合’其由一定數目的碳原子和選自於由〇、N、si ® 和8組成之群組中的至少一個雜原子所構成，其中，氮 原子複原子和硫原子可以選用性地（optionally)被氧 化’並且氮雜原子可以選用性地被鐘化（qUaternjzed)。一 或多個雜原子0、N、S和Si可位於雜烷基内部的任何 位置’或是位於烷基與分子其餘部分連接的位置處。其 實例，包括但不限於，-CH2-CH2-0-CH3 、 -CH2-CH2-NH-CH3 ' -CH2-CH2-N(CH3)-CH3 ' -CH2-S-CH2-CH3 ' ❿ -CH2-CH2，-S(=0)-CH3、-CH2-CH2-S(=0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3 、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3 及-CH=CH-N(CH3)-CH3-。可以 連續有多達兩個雜原子，例如_CH2-NH-OCH3 和-CH2-〇-Si(CH3)3。類似地，術語「雜伸烷基」就其自 身或作為另一取代基的一部分，是指由一雜烧基衍生出 來的一個二價基團’例如，但不限於 -CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對於 雜伸烷基而言’雜原子可佔據鏈末端的任一端或兩端（例 如’伸烧氧基（alkyleneoxy)、伸烧二氧基 17 200930407 (alkylenedioxy)、伸烷基氨基（alkyleneamino)和伸烧基二 氨基（alkylenediamino)等。術語「雜院基」和「雜伸燒基」 包括聚（乙二醇）（poly(ethylene glycol))及其衍生物，例如 參見 Shearwater Polymers Catalog，2001。此外，對於伸 燒基和雜伸烧基連接基團（linking groups)，書寫連接基 團分子式的方向並不表示連接基團的方向，例如分子式 「一co2r，-」同時表示「-co2r，-」和「-r，co2-」。 與 「烷基」、「伸烷基」、「雜烷基」等用語並用的術語 ® 「低級（lower)」是指具有1-6個碳原子的部分（m〇iety)。 術語「炫》氧基（alkoxy)」、「烧基氨基（alkylamino)」、「炫ι 基磺醯基（alkylsulfonyl)」和「炫硫基（alkylthio)」（或硫 代烷氧基（thioalkoxy))此處使用它們的常用含義，並且指 的是那些分別透過氧原子、氨基、S〇2基團或硫原子而 與分子其餘部分連接的烷基。術語「芳基續醯基 (arylsulfonyl)」指的是透過S〇2基團而與分子其餘部分 Q 連接的芳基’術語「巯基（sulfhydry卜或稱硫醇基或氫硫 基）」指的是SH基團。 術語「醢基取代基（acyl substituent)」是指與幾基碳 (carbonyl carbon)連接並滿足其原子價的基團，幾基碳與 本發明化合物的多環核直接或間接相連。「醯基取代基」 的取代基部分可選自於以上所列的基團中。 除非另作說明’術語「環燒基（cycloalkyl)」和「雜環 统基（heterocycloalkyl)」就其自身或結合其他術語時， 分別指的是被取代或未被取代的「烷基」的環形態樣 18 200930407 (cyclic versions)，以及被取代或未被取代的「雜烷基」 的環形態樣。另外，對於雜環烷基，雜原子可佔據雜環 與分子其餘部分連接處的位置。環燒基的實例包括，但 不限於，環戊基（CyCl〇pentyl)、環己基（cycl〇hexyl)、卜 環己烯基（Ι-cyclohexenyl) 、 3-環己烯基 (3-cyclohexenyl)、環庚基（cycloheptyl)等等。雜環烷基的 實例包括’但不限於，1_(1，2,5,6-四氫η比咬基） (l-(l,2,5,6-tetrahydropyridyl)) 、 1-哌啶基 (Ι-piperidinyl)、2-哌啶基（2-piperidinyl)、3-哌啶基 (3-piperidinyl)、4-昧嘛基（4-morpholinyl)、3-味淋基 (3-morpholiny.l)、四氫吱 η南 _2_基（tetrahydrofuran-2-yl)、 四氫吱 β南-3-基（tetrahydrofuran-3-yl)、四 I 嘆吩-2-基 (tetrahydrothien-2-yl)、四氫嗟吩-3-基（tetrahydrothien-3-yl)、 1 - 〇底奇基（1—piperazinyl)、2- 〇底命基（2-piperazinyl)等 等。環結構上的雜原子和碳原子可以選用性地被氧化。 ◎ 術語「鹵（halo)」或「鹵素（halogen)」就其自身或作為 另一取代基的一部分而言，是指氟、氣、溴或碘原子。 另外，術語諸如「鹵代烷基（haloalkyl)」包括單鹵代烷基 和多鹵代烷基。因此「鹵代（CrCU)烷基」包括，但不限 於’三 I 曱基（trifluoromethyl)、2,2,2-三氟乙基 (2,2,2-trifluoroethyl)、4-氣丁基（4-chlorobutyl)、3-漠丙 基（3-bromopropyl)等等。 除非另作說明，術語「芳基（aryl)」是指具有取代基 (substituted)或未具有取代基（unsubstituted)的多不飽和 19 200930407 芳烴取代基，它可為單環或為稠合在一起或共價連接在 一起的多環（較佳1至3個環）。術語「雜芳基（heteroaryl)」 是指含有一至四個選自N、0和S中之雜原子的芳基（或 環），其中，氮原子、碳原子和硫原子可以選用性地被氧 化，並且氮原子可以選用性地被錄化（quaternized)。雜芳 基可透過雜原子而連接至分子其餘部分。芳基和雜芳基 的非限制性實例包括，苯基（phenyl)、1-萘基 (Ι-naphthyl) 、2-萘基（2-naphthyl) 、4-聯苯基 (4-biphenyl)、1- β比洛基（1-pyrrolyl)、2- 比洛基 (2-pyrrolyl)、3- °比嘻基（3-pyrrolyl)、3- *比 *坐基 (3-pyrazolyl)、2- 11米》坐基（2-imidazolyl)、4-味唾基 (4-imidazolyl)、《比。井基（pyrazinyl)、2- °惡唾基 (2-oxazolyl)、4-°惡嗤基（4-oxazolyl)、2-苯基-4-喔吐基 (2-phenyl-4-oxazolyl)、5-噪<*坐基（5-oxazolyl)、3-異鳴唾 基（3-isoxazolyl)、4-異"惡嗅基（4-isoxazolyl)、5-異嗔吐基 ❹ （5-isoxazolyl)、2-嗟唑基（2-thiazolyl)、4-嘆唑基 (4-thiazolyl)、5-°塞唆基（5-thiazolyl) ' 2-吱味基（2-furyl)、 3- 0夫嚼基（3-furyl)、2-售吩基（2-thienyl)、3-售吩基 (3-thienyl)、2-°比咬基（2-pyridyl)、3-®比咬基（3-pyridyl)、 4- 吡啶基（4-pyridyl)、2-嘧啶基（2-pyrimidyl)、4-嘧啶基 (4_pyrimidyl)、5-苯並噻唑基卩吨印如让匕別卜丨）、嘌呤基 (purinyl)、2-本並味唾基（2_benzimidazolyl)、丨嗓基 (5-indolyl)、1-異喧琳基（i_is〇qUin〇iyi)、5-異噎琳基 (5-isoquinolyl)、2-喧考琳基（2_qUinoxaiinyi)、5-喧考淋 20 200930407 基（5-quinoxalinyl)、3-喹啉基（3_quin〇iyl)* 6_ 喹啉基 (6-quinolyl)。以上提到的每個芳基和雜芳基環體系的取 代基選自下述可接受的取代基群組中。「芳基」和「雜芳 基」也包括以下％體系· 一個或多個非芳香環體系與芳 基或雜芳基體系稠合或結合。 簡而言之’當術語「芳基」與其他術語（例如芳氧基、 芳基硫氧基、芳基烧基）並用時’包括如上所述之芳基和 雜芳基環。因此’術語「芳基燒基（arylalkyl)」包括芳基 與烷基連接的基團，例如苄基（benzyl)、苯乙基 (phenethyl)、°比啶基曱基（pyridylmethyl)等，所述烷基包 括該些碳原子（如伸甲基）已經被例如氧原子取代掉的烷 基，例如苯氧基甲基（phenoxymethyl)、比咬氧基甲基 (2-pyridyloxymethyl)和 3-(1-萘氧基）丙基 (3-(l-naphthyloxy)propyl)等。 以上每個術語（如「烷基」、「雜烷基」、「芳基」和「雜 芳基j )都包括所述基團之被取代和未被取代的形式。以 下提供每種基團類型的較佳取代基。 烷基和雜烷基類的取代基通常分別稱為「烷基取代基」 和「雜烷基取代基」，包括常被稱為伸烷基（alkylene)、 烯基（alkenyl)、雜伸烷基（heteroalkylene)、雜烯基 (heteroalkenyl)、炔基（alkynyl)、環烷基（CyCl〇alkyl)、雜 環院基（heterocycloalkyl)、環烯基（cycloalkenyl)和雜環 稀基（heterocycloalkenyl)的基團，它們可以是多種基團中 的一個或多個，這些基團選自但不限於：-OR’、=〇、 21 200930407 =NR’、=N-OR’、-NR’R”、_sr’、鹵素、_siR’R’’R’’’、 -0C(=0)R’ 、-C(=〇)R’ 、_c〇2r，、_c〇NR，R” 、 -0C(=0)NR’R”、-NR”C(=〇)r，、_nr，-C(=0)NR，，R’’，、 -NR”C02R， 、 -NR-C(NR，R，，R’，，)=NR，，，， 、 NR-C(NR，R”)=NR，，’ 、 _S(=〇)R， 、 _S(=〇)2R，、 -S(=0)2NR’R”、-NRS02R’、_CN 和-no2，取代基數目的 範圍從0到（2m’ + l) ’其中m’是該基團中碳原子的總數。 R’、R”、尺”’和R”’’較佳各自獨立地表示氫、被取代或 © 未被取代的雜烷基、被取代或未被取代的芳基（如被1-3 個鹵素取代的芳基）' 被取代或未被取代的烷基、烷氧基 或硫代烧氧J基、或方基院基。當本發明的化合物包含多 於一個的R基時’例如’每個R基均獨立地選擇，如同 R’、R”、R’’’和R’’’’基每一者般（當這些基團存在一以上 時）。當R’和R’’連接到同一個氮原子時，它們可以與氮 原子結合形成5、6或7員環。例如，_nR’R”包括，但不 ❹ 限於’ 1_ °比咯啶基（Ι-pyrrolidinyl)和4-。末啉基 (4-morpholinyl)。從以上對取代基的討論，本領域的技術 人員可以理解術語「燒基」包括含有與氫以外之基團連 接之碳原子的基團，例如鹵烷基（如_CF3和_CH2Cf3)和醯 基（如-C(=0)CH3、-C(=〇)CF3、-c( = o)ch2och3 等）。 類似於對烷基進行說明的取代基，芳基取代基和雜芳 基取代基通常分別被稱為「芳基取代基」和「雜芳基取 代基」，它們會變化且選自，例如鹵素、_〇R，、=〇、=NR，、 -N-OR、-NR’R”、-SR’、·齒素、_SiR’R，，R’’’、_〇c(=〇)r，、 22 200930407 -C(=0)R’、-C02R’、_c〇NR’R”、-〇C(=0)NR’R”、 -NR”C(=0)R’、-NR’-C(=〇)NR’’R’’’、-NR，，C02R，、 -NR-C(NR’R”)=NR，，，、 _s(=〇)R， 、 _S(=0)2R，、 -S(=0)2NR’R”、-NRS02R，、-CN 和-N〇2、-R，、-N3、 Ο
-CH(Ph)2、氟（CVC4)烷氧基以及氟（(：丨-(：4)烷基，數目的 範圍從0至該芳環體系上開放價數的總數；R，、R”、R，，， 和R”’’較佳獨立地選自氫、（Cl，C8)烷基和雜烷基、未被 取代的芳基和雜芳基、（未被取代的芳基）_(Ci_C4)烷基、 和（未被取代的芳基）氧-(CrCd烷基。當本發明的化合物 包含多於一個的R’、R”、R，，，或R，’’’基團時，其中可以 獨立於其他基團來變化每一個基團。 選用性地’芳基或雜芳基環之相鄰原子上的兩個取代 基可被具有式-T-C( = 〇)-(CRR，）q-U-的取代基所替 換’其中T和u獨立地為—NR-、-〇-、-CRR，-或單鍵， q疋〇至3的整數。或者’選用性地，此類取代基的其 中兩個可被具有式_A-(CH2)r-B-的取代基所替換，其中A 和 B 獨立為 _CRR，-、-〇-、-NR-、-S-、-S(=0)-、-S(=0)2_、 _S(=〇)2NR’-或單鍵，並且r是1至4的整數。選用性地， 所形成之新環中的其中一個單鍵可被一雙鍵所替換。或 者’此類取代基的其中兩個可以被具有式 )s_x_(CR”R’”)d_的取代基所替換其中^和d獨 立地為0到3之間的整數，並且X是-〇-、-NR，-、-S-、 s( 〇)-、-S(=〇)2_或-S(=〇)2nr’ -。取代基 R、R，、R”和 R較佳獨立地選自氫以及被取代或未被取代的（Ci_c6) 23 200930407 烧基。 此處使用的術語「二磷酸酯（diphosphate)」包括，但 不限於，含有兩個磷酸根基團的磷酸酯。術語「三墻酸 酯（triphosphate)」包括’但不限於’含有三個磷酸根基 團的磷酸酯。 此處使用的術語「雜原子（heteroatom)」包括氧（〇)、 氮（N)、硫（S)和矽（Si)。 符號「R」是一通用縮寫，表示一取代基，該取代基選 自於被取代或未被取代的烧基、被取代或未被取代的雜 烷基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的 雜芳基和被取代或未被取代的雜環基團。 在以下各個子章節中詳細說明本發明的不同態樣。 抗 RG-1 括· _ . ❹ 本發明之接合體中的抗體’其特徵在於能專一性地結 類RG-1。較佳地，該抗體以高親和力結合至 RG-1，例如，具有 1χ1〇·7 m 磁 次更、的Kd值。抗RG-1 佳顯示出以下特性的-種或多種： (a) 以 1 X 1 〇 _ 7 十 °更小的Kd值與人類RG-1結入. (b) 結合至轉举古° 1 ㈣有狀-1的CH0細胞；和 制RG-1表現細胞在體内的生長。 在一較佳實施例中， - 的至少兩種性質。在更(a)、⑻和（c)性質中 ⑷，和(C)全部三… 例中’該抗體顯示性質 — 。較佳地，該抗體與人類RGd 24 200930407 結合的KD為5x1 Ο·8 Μ或更小、KD為2x10-8 M或更小、 “為 5χ1〇-9 Μ 或更小、KDS 4X10-9 M 或更 八* 〗 JVj) 3xl0_9 Μ或更小，或KD為2χ10·9 Μ或更小。 該抗體較佳結合至RG-1中的不存在於其他蛋白質内 的抗原表位《該抗體較佳結合至RG-1而不結合至其他蛋 白’或者以較低的親和力結合至其他蛋白，例如該低親 合力具有的尺0為ΐχΐ〇-δ μ或更大，更佳為1χ1〇-5μ* ❹ 更大，更佳為lxl〇-4M或更大，更佳為^丨^“或更大， 甚至更佳為1χ10-2Μ或更大。 評估該抗體對RG-1之結合能力的標準測定方法在本 領域中是已知的，例如包括ELISA、西方墨點法（Westem blots)、RJA和流式細胞儀分析法。也可利用標準測定， 例如利用Biacore®系統分析，來評估結合力。為了評估 與Raji或Daudi B細胞腫瘤細胞的結合，可從美國菌種 中心（American Type Culture Collection)獲得 Raji 細胞 ❹ （ATCC Deposit No. CCL-86)或 Daudi 細胞（ATCC Deposit
No. CCL-213)。 單株抗被19G9和34F1
用於本文所揭露之接合體中的較佳抗體是人類單株抗 體19G9和34E1 ’其揭示於專利文獻US 2004/0152139 和US 7,335,748 B2中，文獻内容以引用的方式併入本文 中以供參考。抗體19G9和34E1的氨基酸序列分別 顯示在序列編號：13 (第1A圖）和序列編號：14 (第2A 25 200930407 圖）中。抗體19G9和34E1的VL氨基酸序列分別顯示在 序列編號：15(第1B圖）和序列編號：16(第2B圖）中。 相應的編碼核苷酸序列也顯示在前述圖中：抗體19G9 之VH的序列編號：17 (第ία圖）、抗體19G9之VL的序 列編號：19 (第1B圖）、抗體34E1之VH的序列編號： 18 (第2A圖）以及抗體34E1之VL的序列編號：20 (第 2B 圖）。 在另一態樣中，這些抗體可包括19G9或34E1的重鏈 ❹ 和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3，或其組合。19G9和34丑1 的VH CDR1的氨基酸序列分別顯示在序列編號：1和2 中。19G9和34E1的VH CDR2的氨基酸序列分別顯示在 序列編號：3和4中。19G9和34E1的VH CDR3的氨基 酸序列分別顯示在序列編號：5和6中》19G9和34E1 的VLCDR1的氨基酸序列分別顯示在序列編號：7和8 中。19G9和34E1的VLCDR2的氨基酸序列分別顯示在 φ 序列編號：9和10中。19G9和34E1的VLCDR3的氨基 酸序列分別顯示在序列編號：11和12中。CDR區是用 Kabat 系統進行說明（Kabat，Ε· A.，ei α/·，（1991)· Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 ;以下稱之為「Kabat 43242」）。
因為抗原結合專一性主要是由CDR1、CDR2和CDR3 區提供，所以VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VL 26 200930407 CDIU、CDR2和CDR3序列可以「混合以及匹配（mixed and matched)也就是將來自不同抗體的CDR加以混合 與匹配（儘管每個抗體必須包括VhCDR卜CDR2* CDR3 以及VlCDR1、CDR2和CDR3)，從而產生其他的抗rg] 結合分子。較佳地，在進行混合和匹配時，來自特定Vh/Vl 配對中的VH序列可被結構類似的vH序列所代替。同 樣’來自特定VH/VL配對中的VL序列較佳地被結構類似 ❿ 的VL序列所代替。可使用上述結合測定法來測試此類 「混合和匹配」抗體的RG-1結合力。較佳地，當γΗ CDR 序列被混合和匹配時，來自特定νΗ序列的CDR卜CDR2 和/或CDR3序列可被結構類似的CDR序列所代替。同 樣’當VL CDR序列被混合和匹配時，來自特定vL序列 的CDR1、CDR2和/或CDR3序列可較佳地被結構類似的 CDR序列所代替。對於本領域中具有通常知識者將可清 楚了解到’可以利用與本文公開之單株抗體19G9和34E1 Q 之CDR序列結構類似的序列來替換掉一個或多個vH和/ 或VL CDR區序列，而創造出新的VH和VL序列。 因此’在另一態樣中，本發明之接合體中的抗體或其 抗原結合部分包括： (a) —包含序列編號：1或序列編號：2的重鏈可變區 CDR1 ； (b) —包含序列編號：3或序列編號：4的重鏈可變區 CDR2 ； (c) 一包含序列編號：5或序列編號：6的重鏈可變區 27 200930407 CDR3 ； (d) —包含序列編號：7或序列編號：8的輕鏈可變區 CDR1 ; (e) —包含序列編號：9或序列編號：10的輕鏈可變 區CDR2 ;以及 (f) 一包含序列編號：11或序列編號：12的輕鏈可變 區 CDR3。 人們已知’獨立於CDR1和/或CDR2功能域，CDR3 © 功能域可以單獨決定抗體對同源抗原（cognate antigen) 的結合專一性，並且基於共同的CDR3序列可預測生成 具有相同結合專一性的多種抗體。例如，參見Klimka ei al., British J. of Cancer 83m ： 252-260 (2000) ； Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296 ： 833-849 (2000) ； Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95.： 8910-8915 (1998)； Barbaset al, J. Am. Chem. Soc. 116, 2161-2162 (1994)； Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 ： 2529-2533 p — (1995) ； Ditzel et al., J. Immunol. 151 : 739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8_ ： Scientific Review 8 (2001) ； Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117: 452-7 (1995) ； Bourgeois et al., J. Virol 72 ： 807-10 (1998) ； Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90_ : 4374-8 (1993)； Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152: 521 8-5329 (1994) and Xu and Davis, Immunity 1_3.: 37-45 (2000)。還可參見 US 6,951,646 ； 6,914,128 ； 6,090,382 ； 6,818,216 ； 28 200930407 6,156,313 ; 6,827,925 ； 5,833,943 ； 5,762,905 和 5,760,185 ^這些文獻每一篇的全部内容均藉由引用方式 納入本文中以供參考。 因此’本發明提供了包含一個或多個來自人類或非人 動物抗體之重鏈和/或輕鏈CDR3的單株抗體，其中該單 株抗體能夠專一性地結合至人類RG-1。在一些態樣中’ 本文揭露之接合體可使用包含一個或多個來自非人類抗 體（如小鼠或大鼠抗體）之重鏈和/或輕鏈CDR3功能域的 ® 單株抗體’其中該單株抗體能夠專一性地結合至RG-1。 或者，它們可包含一個或多個來自非人類抗體的重鏈和/ 或輕鏈CDR3功能域，其（a)能夠與對應親源（parental)非 人類抗體做競爭結合；（b)保留其對應親源非人類抗體的 功能性特性；（c)與對應親源非人類抗體一樣結合到相同 的表位；和/或（d)具有與對應親源非人類抗體相似的結合 親合力。 ❿ 具有特定種系序列（Germline Sequence)的抗想 在一些實施例中’本發明之接合體的抗體部分包括來 自一特定種系（germline)免疫球蛋白重鏈基因的Vh和/或 來自一特定種系免疫球蛋白輕鍵基因的Vl。 如本文中所用者，如果一人類抗體的可變區是從使用 人類免疫球蛋白基因的系統中獲得時，則該人類抗體包 含「產自」或「衍生自」特定種系序列的重鏈或輕鏈可 變區。此類系統包括使用感興趣的抗原對攜帶人免疫球 29 200930407 蛋白基因的基因轉殖小鼠進行免疫反應，或使用感興趣 的抗原對在噬菌體上表現的人免疫球蛋白基因庫進行篩 檢。此類人類抗體可以下列方式進行鑒定：將其氨基酸 序歹!和人類種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比對，然 後選擇在序列上最接近（即，最高的一致性人類抗體序 列的人類種系免疫球蛋白序列。「產自」或「源自」特 定人類種系免疫球蛋白序列的一人類抗鱧可能含有與該 種系序列不同的氨基酸’這可能是由於例如自然產生的 體細胞突變或有意引入的定點突變所造成。然而，所選 擇的人類抗體的氨基酸序列與一人類種系免疫球蛋白基 因所編碼之氨基酸序列相比下通常具有至少90%的一致 性（identity)，而且當與其他物種的該種系之免疫球蛋白 氨基酸序列（例如，鼠科種系序列）進行比較時，其含有 用來識別人類抗體是屬於人類的氨基酸殘基。在一些情 況中，人類抗體與該種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基 ❹ 酸序列相比可能具有至少95%、至少96%、97%、98%或 99%的氨基酸序列相同性。通常，源自特定人類種系序 列的人類抗體顯現與人類種系免疫球蛋白基因所編碼之 氨基酸序列不相同的氨基酸數目不會超過1〇個。在一些 情況中，人類抗體可能顯現出與人類種系免疫球蛋白基 因所編碼之氨基酸序列不相同的氨基酸數目不超過5 個’甚至不超過4個、3個、2個或1個。 周源抗嫌（Homologous Anfibpdies) 30 200930407 在另一實施例中，本發明接合體之抗體部分中的抗體包 括重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區和輕鍵可變區 的氨基酸序列與本文所述較佳抗體的氨基酸序列同源 (homologous)，其中，該些抗體保留本發明所需之抗RG_ i 抗體的功能性質。 例如，本文揭露内容提供一種包含VH和VL的已分離 單株抗體或該單株抗體的抗原結合部分，其中： (a) 該VH包括一氨基酸序列，該氨基酸序列與選自由 序列編號：13-14組成之群組中的氨基酸序列具有至少 80%同源性； (b) 該VL包括一氨基酸序列，該氨基酸序列與選自由 序列編號：15-16組成之群組中的氨基酸序列具有至少 80%同源性；以及 (c) 該抗體專一性地結合至人類RG-1。 在其他實施例中，VH和/或VL的氨基酸序列可能與前 述序列具有 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同源性。與前述序列之VH和VL區具有高同源性（即， 80%或更大）之VH和VL區的抗體可藉由下列方式獲得： 使編碼有序列編號：17-18或19-20的核酸分子發生突變 (例如，定點突變或PCR介導突變），然後使用本文中所 述的功能測定方法來測試該已經過編碼改變之抗體所保 留的功能（也就是上述的功能）。 兩條氨基酸序列之間的同源性百分比（pereent homology)，等同於兩條序列之間的相同性百分比 31 200930407 (percent identity)，此百分比與兩序列所共有之相同位置 的數目有關（即，同源性％ =相同位置的數目/位置總數 X 100) ’並且需要考慮間距（gap )的數目，和每個間距 的長度’需要引入這些間距，以將兩條序列做最佳化的 對齊比對（alignment)。正如以下的非限制性實例中所 述’利用數學演算法可以完成兩條序列的序列比較和判 斷兩條序列的相同性百分比。 ❹ 可以運用 Ε· Meyers 和 W. Miller (Cowpwi.却户/. ， 生· 11 -1 7 (1988)的演算法來判斷兩條氨基酸序列的一致 性百分比’此演算法已經納入ALIGN程式中（版本 2.0) ’該演算法採用PAM12〇加權殘基表（weight table)、12間距長度扣分（gap length penalty)和4空位長 度扣分計算。此外，兩條氨基酸序列的一致性百分比還 可使用 Needleman 和 Wunsch 〇/. Μο/. 5ζ·ο/.处：444-453 (1970))演算法來判斷’此演算法已整合在gcg套裝軟體 Ο 的GAP程式中（可從http : //www.gcg.com獲得），此演算 法應用了 Blossum 62矩陣或PAM250矩陣’以及16、14、 12、1〇、8、6或4的間距加權和1、2、3、4、5或6 的長度加權。 另外或者，本發明的蛋白質序列能被進一步用作「查 詢序列（query seqUence>」以在公開的序列資料庫中進行 檢索，以便（例如）鑒定相關序列。此類檢索可採用 XBLAST 程式（版本 2.0) (Ahschul，ei a/.(1990) 从0/ 403_10)來進行。可使用xblast程式且採用 32 200930407 記分為50,字長為3的條件來進行BLAST蛋白質檢索， 以獲得與本發明抗體分子相似的氨基酸序列。為了獲得 用於比較的間距對齊（gapped alignments) ’可使用 Altschul et al.((1997) Nucleic Acids Res.25( 17): 3389-3402)中說明的Gapped BLAST程式。當運用BLAST 和 Gapped BLAST程式時，可使用相應程式（例如 XBLAST 和 NBLAST)的默認參數（default parameters)。 參見 http://www.ncbi.nlm.nih.go_v。 ❹ 具有保守倏你（Conservative Modification)的抗想 用於本發明接合體的抗體可包括一含有CDR1、CDR2 和CDR3序列的VH，以及一含有CDR1、CDR2和CDR3 序列的VL，其中，這些CDR序列中的一或多個包括基 於已知抗RG-1抗體的特定氨基酸系列，或其經過保守修 飾的序列，並且其中該抗體保持本案揭露之抗RG-1抗體 © 所需的功能性質。在本領域中熟悉該項技藝者可理解 到，可以在不移除抗原結合性的情況下完成某些保守序 列修飾。例如，參見 Brummell ei a/. (1993) 5/oc/zew 32.: 1180-8 ； de Wildt et a/.(1997) Prot. Eng. 10. ： 835-41 ； Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 : 26864-26870 ； Hall et al. (1992) J. Immunol. 149 ： 1605-12 ; Kelley 和 O’Connell (1993) 32 ： 6862-35 \ Adib-Conquy et ^/.(1998) Int. Immunol. 10 : 341-6 以及 Beers ei a/. (2000) C7z_«. 33 200930407 2835-43。因此，本發明接合體包含能與人類RGd專一 性結合的抗體或其抗原結合部分，其中： (a) 該VH CDR3序列包含序列編號：5-6的氨基酸序 列；和 (b) 該VL CDR3序列包含序列編號：11-12的氨基酸 序列； VH CDR；3和vL CDR3其中至少一者具有一種或多種 保守修飾。 額外或替代地，該抗體可能具有一或多個如上所述的 下列功能性質，例如對人類RG- 1的高親和性結合、能結 合至轉染有RG-1的CHO細胞，和/或與細胞毒素接合時 能抑制體内之表現RG-1腫瘤細胞的腫瘤生長。 在一較佳實施例中，該VH CDR2序列包含選自序列編 號：3-4的氨基酸序列；該vL CDR2序列包含選自序列 編號：9-10的氨基酸序列；該vH CDR1序列包含選自 序列編號：1-2的氨基酸序列；和/或所述VL CDR1序列 包含選自序列編號：7-8的氨基酸序列，其中前述的VH CDR2、VL CDR2、VH CDR1 和 VL CDR1 的其中一者或 多者可具有保守修飾。 因此’在另一態樣中，本發明接合體的抗體或其抗原 結合部分包括： (a) —重鏈可變區cdRI，其包含序列編號：1或序列 編號：2或其中任一序列之保守修飾序列； (b) —重鏈可變區CDR2，其包含序列編號：3或序列 34 200930407 編號：4或其中任一序列的保守修飾序列； (c) 一重鍵可變區CDR3，其包含序列編號：5或序列 編號：6或其中任一序列的保守修飾序列； (d) —輕鏈可變區CDR1，其包含序列編號：7或序列 編號：8或其中任一序列的保守修飾序列； (e) —輕鏈可變區CDR2，其包含序列編號：9或序列 編號：1 〇或其中任一序列的保守修飾序列；以及 (f) 一輕鏈可變區CDR3，其包含序列編號：11或序 ^ 列編號：12或其中任一序列的保守修飾序列。 術语 「保守序列修飾（conservative sequence modifications)」是指這類的氨基酸修飾不會顯著影響或 改變包含該氨基酸序列之抗體的結合特性，該修飾包括 氨基酸置換、增加和缺失。可利用例如定點突變和PCR 介導突變等標準技術將修飾引入本發明的抗體中。保守 氣基酸置換（Conservative amino acid substitutions)是指 φ 一氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基所替換。在 本領域中已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。 這些家族包括具有鹼性側鏈的氨基酸（如離胺酸、精胺 酸、組胺酸），具有酸性側鏈的氨基酸（如天冬胺酸、麵 胺酸）’具有未帶電之極性側鏈的氨基酸（如甘胺酸、天 冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱 胺酸、色胺酸），具有非極性側鏈的氨基酸（如丙胺酸、 纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫 胺酸），具有β_支側鏈的氨基酸（如蘇胺酸、纈胺酸、異 35 200930407 白胺酸），和具有芳香側鏈的氨基酸（如酪胺酸、苯丙胺 酸、色胺酸、組胺酸）。因此，本發明抗體之CDR區中 的一個或多個氨基酸殘基可以被來自相同側鏈家族的其 他氨基酸殘基所替代，並且使用本文中所述的功能分析 方法對改變後之抗體進行測試，以測定其保留的功能 (即，以上（a)-(c)中陳述的功能）。較佳地，保守修飾的數 目上不超過1個或2個。 〇 鸯合到與抗RG-1抗想相同之表位上的抗嫌 在另一實施例中，本發明接合體中的抗體可結合至能 被本發明任一抗RG-1單株抗體所辨識之rg-1上的表 位，也就是說’該抗體具有能與本文揭露的任一單株抗 體進行交又競爭地結合至人類RG-1的能力。在較佳實施 例中’用於交又競爭研究的參考抗體是抗體19G9或抗體 34E1 〇 Ο 在標準的RG-1結合分析試驗中，可根據與抗體19G9 或抗體34E1的交叉競爭能力來識別交叉競爭型抗體。例 如’可採用ELISA分析，其中，將重組人類Rg_〗蛋白 固定在孔盤上，將其中一抗體用螢光標記，評估未標記 抗體對該標記抗體的競爭能力。額外地或替代地， BIAc〇re分析也可以用於評估抗體的交又競爭能力。在 一較佳實施例中，能結合到可被19G9或34E1抗體所識 別之人類RG-1上相同表位的抗體是人類單株抗體。可以 使用本文所述的方法和本領域中公知的方法來製備與分 36 200930407 離這些人類單株抗體。 星產立.（engineered)釦敏格飾$ #被 本發明接合體中的抗體還可以從一抗體來製備，使用 具有一或多個已知VH和/或Vl序列的抗體作為起始材 料，以進行工程處理而製造出一經修飾的抗體，與起始 抗艘相比之下’該經修飾的抗體具有被改變的特性。可 ❹ 藉著修飾在一或兩個可變區中（例如在一或多個VDR區 和/或在一或多個框架結構區中）的一或多個氨基酸，來 對抗體進行改造。額外地或替代地，還可以藉著修飾一 或多個恒定區中的殘基，例如以改變作用物（effect〇r)的 功能，來對抗體進行改造。 在某些實施例中’ CDR移植可用於對抗體的可變區進 行改造。抗體和靶抗原主要透過位於六個重鏈和輕鏈互 補決定區（CDR)中的氨基酸殘基進行相互作用。為此原 〇 因’在各單獨抗體之間，CDR中的氨基酸序列比CDR以 外的序列更具多樣性。因為CDR序列負責絕大部分的抗 體-抗原相互作用’使得藉著構建包含被移植到骨架序列 (來自具有不同性質的不同抗體）上之來自特定天然抗體 之CDR序列的表現載體，而可能表現出能模擬特定天然 抗體性質的重組抗體。（參見，例如Riechmann，L.ei α/. (1998)胸wre 311: 323-327; Jones，P. ei α/. (1986)胸⑽ 3.21.： 522-525； Queen, C. et a/.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. t/U· 10029-10033 ; US 5,225,539 (授予 Winter)和 37 200930407 US 5,530，101 ; 5,585,089 ; 5,693,762 和 6，180,370 (授予 Queen 等人）。 可通過公共DNA資料庫或包括種系抗體基因序列的 已發表文獻來獲得該骨架序列。例如，人類重鏈和VL 基因的種系DNA序列可在「VBase」人類種系序列資料 庫中找到（可從網際網址www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 得到），以及從以下文獻中找到：Kabat ‘3242 ; Tomlinson， I. M., et al. (1992) uThe Repertoire of Human Germline ❹
Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of V-H Segments with Different Hypervariable Loops55 J. Mol. Biol. 227 ： 776-798 ；和 Cox，J. P. L.et al. (1994) “A
Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage^ Eur. J. Immunol. 2±_ ： 827-836 ;在此明確將各文獻的内容藉由引用方式納入本 文中以供參考。此外，人類重鏈和VL基因的種系DNA Q 序列可以從Genbank資料庫獲得。例如，下列在HCo7
HuMAb 小鼠體内發現的重鏈種系序列可從以下的 Genbank 登錄號獲得：1-69 (NG_0010109、NT_024637 和 BC070333)，3-33 (NG_0010109 和 NT_024637)和 3-7 (NG_0010109和NT_024637)。作為另一實例，下列在 HCol2 HuMAb小鼠體内發現的重鏈種系序列可以從以 下所附的Genbank登錄號獲得：1-69 (NG_00101〇9、 NT_024637 和 BC070333)、5-51 (NG_0010109 和 NT_024637)、4-34 (NG_0010109 和 NT_024637)、3-30.3 38 200930407 (CAJ556644)和（AJ406678)。 使用被稱為Gapped BLAST的序列相似性檢索方法 (Altschul et al.( 1997) Nucleic Acids Research 25 : 3389-3402)將抗體蛋白序列和編制的蛋白質序列資料庫 進行比較。BLAST 是啟發式演算法.（heuristic algorithm)，其中抗體序列與資料庫序列之間的統計重要 性的比對可能包括已對齊字元的高得分斷片對（HSP)。無 法藉由擴展或修正來提高得分的斷片對（Segment pair)被 Ο 稱為命中記錄（a hit )。簡言之，VB ASE來源的核苷序 对[http ·· "vbase. mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php)可板 轉譯，並且FR1至FR3框架結構區之間的區域（包括FR1 至FR3框架結構區）被保留。資料庫序列的平均長度為 98個殘基。能精確匹配至蛋白質全長上的重複序列被剔 除。用於蛋白質的BLAST檢索，採用默認值（default)的 程式blastp、不包括已被關閉的低複雜性過濾的標準參 _ 數和BLOSUM62的置換矩陣，該檢索濾出實現序列相配 的前5個命中記錄。該些核苷酸序列可在全部六個框架 (frame)中被翻譯，在資料庫序列的匹配斷片中不具有終 止密碼子的框架被視為潛在的命中記錄。並採用BLAST 程式tblastx來確認之，tblastx翻譯了在全部六個框架中 的抗體序列，並且將這些翻譯結果與在全部六個框架中 動態翻譯出來的VBASE核苷序列進行比較。 一致性是指抗體序列和蛋白質資料庫之間在序列全長 上的確實氨基酸匹配。陽性（一致性+取代匹配）並不相 39 200930407 同’但氨基酸取代是由BLOSUM62取代矩陣所引導。如 果抗體序列對資料庫序列中的兩條序列具有相同的一致 性（identity) ’則具有最大陽性的命中記錄將被判定為匹 配序列命中記錄。 本發明的抗體中使用的較佳框架序列是那些在結構 上與已知的RG-1抗韹所使用的框架序列相似的框架序 列。VH CDR1·、CDR2 和 CDR3 序列，以及 vL CDR1、 CDR2和CDR3序列可被移植到具有與該些框架序列來 © 源之種系免疫球蛋白基因中發現到具有相同序列的框 架結構區，或者CDR序列可被移植到與種系序列相比 包括一或多個突變的框架結構區。例如，已經發現在一 些情況中，在框架結構區使殘基突變，從而保留或增強 抗體的抗原結合能力是有益的（例如，參見Queen等人 的 US 5,530，101，5,585,089 ; 5,693,762 和 6，180,370)。 另一類型的可變區修飾是使Vh和/或％ CDR1、CDR2 φ 和/或CDR3區中的氨基酸殘基突變，從而改善一種或更 多種結合性質。可以進行定點突變法或PCR介導突變 法，以引入突變並影響抗體的結合性，或影響其他關注 的功忐性質，並可以採用體外或體内分析法進行評估。 較佳引入保守修飾（conservative modifications)。這些突 變可能是氨基酸的置換、增加或刪減，然而較佳是置換。 此外，通常在一個CDR區中不超過卜2、3、4或5個 殘基被改變。 因此，在另一實施例中，本發明之接合體中的抗體或 40 200930407 其抗原結合部分包括：（a)包含選自序列編號：1至2之 氨基酸序列的一 Vh CDR1區；（b)包含選自序列編號： 3至4之氨基酸序列的一 VH CDR2區；（c)包含選自序 列編號：5至6之氨基酸序列的一 VH CDR3區；（d)包 含選自序列編號：7至8之氨基酸序列的一 VL CDR1區； (e)包含選自序列編號：9至10之氨基酸序列的一 VL CDR2區；和（f)包含選自序列編號：11至12之氨基 酸序列的一 Vl CDR3區；其中，與參考的序列編號相比， 〇 前述 νΗ 之 CDIU、CDR2 和 CDR3 以及 VL 之 CDRJ、CDR2 和CDR3中的至少一者具有1個、2個、3個、4個或5 個（較佳1個或2個）氨基酸的置換、增加或缺失。 改造後的抗體包括已經對VH和/或VL中的框架殘基進 行修飾的那些抗體，通常用來降低免疫原性。例如，一 種方法是使一或多個框架殘基進行「回復突變 (backmutate)」而成為相應的種系序列。更具體而言，已 φ 經歷體細胞突變的抗體可能包含與得到該抗體之種系序 列不同的框架殘基。可以藉著將抗體框架結構序列與該 抗體來源的種系序列進行比較而鑑識出這類殘基。 另一類型的骨架修飾涉及使框架結構區内，或甚至一 或多個CDR區内的一或多個殘基突變，從而移除τ細胞 表位，也可降低免疫原性。該方法也被稱為「去免疫化 (deimmunization)」，並說明在 Carr等人的 US 2003/0153043 中。 還可以對抗體進行改造以使Fc區中包含修飾，通常用 200930407 於改變諸如血清半衰期、補I结合（c〇mpiement fixation)、Fc受體結合和/或抗原依賴的細胞毒性等性 質。此外，本發明的抗體可以進行化學修飾（例如，一或 多個化學物部分可以與抗體連接），或進行修飾以改變其 醣化作用（giycosyiation)，從而再次改變該抗體的一或多 個功能性質》下面將對這些實施例個別進行更詳細的說 明。Fc區中的殘基的編號是£讣以的Eu索引的編號。 在一實施例中，ChI的鉸鏈區被修飾，從而改變了（例 如，增加或減少）鉸鏈區中的半胱胺酸殘基的數目◦在 Bodmer等人的US 5,677,425中進—步說明該方法。將 CH1之鉸鏈區中的半胱胺酸殘基數目加以改變，例如， 有助於組裝輕鏈和重鏈，或是增加或減小抗體的穩定性。 在另一實施例中，抗體的Fc鉸鏈區發生突變，以減小 其生物半衰期。更具體而言，將一或多個氨基酸變異引 入Fc鉸鏈域斷片之CH2_CH3功能域的介面區域，以致 〇 相較於天然Fc鉸鏈域與SpA結合，該抗體削弱與葡萄 球菌蛋白 A( Staphyl〇cocal protein A，SpA)的結合。Ward 等人的US 6,165，745更詳細地說明該方法。 在另一實施例中，對該抗體進行修飾，以增長其生物 半衰期。各種方法皆可能可行。例如，可以引入一或多 個下列突變：如Ward的US 6277375中說明的T252L、 T254S、T256F °或者’為了增加生物半衰期，該抗體可 以在cHi或cL區域中發生變化，而從IgG之Fc區域的 CH2功能域的兩個環（1〇〇ps)獲得救援受體 42 200930407 receptor)結合表位，如Presta等人的us 5,869,046和 6，121，022 所述。 在又一實施例中，精者使用不同的氨基酸殘基取代至 ’個氨.基®^殘基以改變Fc區，從而改變抗體的作用因 子功能。例如，選自氨基酸殘基234、235、236、237、 297、318、320和322中的一或多個氨基酸可以被不同 的氨基酸殘基取代’從而改變抗體對作用因子配體的親 ❹ 和力性’但仍保留其親滅抗趙（parent antibody)的抗原結 合能力。抗體對其親和力已產生變化的該些作用因子配 體可以例如是Fc受體或補體的C1成分。均為授予給 Winter等人的US 5,624,821和5,648 26〇更詳細地說明 該方法。 在另一實例中’選自氨基酸殘基329、331和322中的 一或多個氨基酸殘基可以被不同的氨基酸殘基取代，以 改變該抗體的Clq結合性，和/或降低或去除其補體依賴 ® 性細胞毒性（CDC)。Idusogie等人的US 6，194,55 1更詳細 地說明該方法。 在另一實例中，改變氨基酸位置231和239中的一或 多個氨基酸殘基，進而改變抗體固定補體的能力。 Bodmer等人的w0 94/29351中更詳細地說明該方法。 在又一實例中，藉著修飾下列位置處的一或多俩氨基 酸來修飾Fc區，從而提高抗體對FcY受體的親和力： 238、239、248、249、252、254、255、256、258、 265、 267、 268、 269、 270、 272、 276、 278、 43 200930407 280 ' 283、 285、 286 ' 289、 290 ' 292 ' 293 ' 294、 295、 296 ' 298、 301、 303、 305、 307 ' 309、 312、 315 ' 320 ' 322 ' 324、 326、 327 ' 329 > 330、 331 ' 333 ' 334、 335 ' 33 7 > 338、 340 ' 360 ' 373 ' 376 ' 378 ' 382 ' 388 ' 389、 398、 414、 416 ' 419 ' 430、 434 ' 435、 437、 438或439。Presta的WO 00/42072進一步說明該方法。 此外，人類 IgGl 上用於 FcylU、FcyRII、FcyRIII 和 FcRn Ο 的結合位置已被定位（mapped)出來，並且已揭示各種具 有增強結合性的變體（參見311丨61£18，11丄.61&1.(2001)>[· Biol. Chem. 276 : 6591-6604)。位置 256、290、298、333、 334和339處的特定突變，顯示出能夠增進與FcyRin的 結合。另外，下列組合的突變體，顯示出能夠增進對 FcyRIII 的結合：T256A/S298A、S298A/E333A、 S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。 〇 在又一實施例中，如 King等人的國際申請案 PCT/US2008/073 569所說明（其全部内容通過引用結合於 本文中），藉著引入一個半胱胺酸殘基來修飾本發明抗體 的C端。該修飾包括，但不限於，對位在全長重鏈序列 之C端處或附近處的現有氨基酸殘基進行取代，以及將 一含半胱胺酸的延長序列（extension)引至全長重鏈序列 的C端。在較佳實施例中，含半胱胺酸的延長序列包括 序列丙胺酸-丙胺酸-半胱胺酸（從N端至C端）。 該C端半胱胺酸修飾可提供用於接合搭檔分子的官能 44 200930407
以優化該接合，從 按照該方式接合，可增強對連接特定位置的 ’藉者在c端或其附近引入該連接位置，可 ^，從而減少或消除抗體-抗原結合的干擾， 並實現分析簡化和品質控制。 在又一實施例中，可以對抗體進行改造以使其去醣化 (即’缺乏醣化作用），從而增強該抗體對抗原的結合。 ❹ 可藉著改變抗體序列中的一或多個醣化位置來實現此類 修飾。例如，可以進行一或多個氨基酸取代，從而消除 一或多佃可變區框架醣化作用位置，防止發生該位置的 醣化作用。Co等人的US 5,714,350和6,350,861更詳細 地說明該方法。Hanai等人的US 7,214,775、Presta的 US 6,737,056 、Presta 的 US 2007/0020260、Dickey 等 人的 WO 2007/084926 、Zhu 等人的 WO 2006/089294 和 Ravetch等人的WO 2007/055916說明用於改變醣化作用 〇 的其他方法，各所述文獻的全部内容通過引用結合在此。 可以製得具有改變的醣化類型的抗體，如具有減少的 岩藻糖殘基量的低岩藻糖化抗體，或具有增大的平分 (bisecting)GlcNac結構的抗體。此類改變的醣化位置 (patterns)已被證明可提高ADCC。可利用具有已改變之 醣化系統的宿主細胞來表現抗體而實現此類修飾。在本 領域中已經說明具有改變的醣化系統的細胞，並且該細 胞可以用作宿主細胞來表現重組抗體，進而製備出具有 改變畴化作用的抗體。例如，細胞株Ms704、Ms705和 45 200930407
Ms709缺乏岩藻糖轉移酶基因FUT8 (α(1,6)岩藻糖轉移 酶），以致在這些細胞株中被表現的抗體在其碳水化合物 上缺乏岩藻糖。可使用兩個置換載體（replacement vectors) 針對CHO/DG44細胞中的FUT8基因進行破壞來產生這 類細胞株（參見 Yamane等人的 US 200401 10704和 Yamane-Ohnuki et al.(2004) Biotechnol Bioeng 87 : 614-22))。作為另一實例，Hanai等人的EP 1，176，195說 明一具有功能被破壞之FUT8基因的細胞株，而FUT8 〇 基因編碼了岩藻糖轉移酶，藉著減少或消除與al，6鍵有 關的酶，使得在該細胞株中表現的抗體而顯示出低岩藻 糖化作用。Hanai等還說明這類的細胞株：其將岩藻糖添 加至與抗體 Fc 區域結合之 N-乙醯基葡糖胺 (N-acetylglucosamine)的酶活性較低，或者不具有該酶活 性，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0 (ATCC CRL 1662)。 Presta 的 WO 03/035835 說明變體 CHO 細胞株，Lecl3 φ 細胞，其將岩藻糖連接至與Asn(297)相連之碳水化合物 上的能力很低，導致了在該宿主細胞中表現的抗體具有 低岩藻糖化程度（也參見Shields et al.，（2002) J. Biol. Chem. 277 : 26733-26740)。Umana 等人的 WO 99/54342 說明被改造成表現醣蛋白修飾醣基的細胞株，以使在這 些細胞株中表達的抗體顯示出增大的平分乙醯氨基葡糖 結構，導致抗體的ADCC活性增大（也參見Umana et al.(1999) Nat. Biotech. 17 : 176-180)。或者，可以使用 岩藻糖苷酶切掉抗體的岩藻糖殘基，如用α-L-岩藻糖苷 46 200930407 酶（alpha-L-fucosidase)從抗體中除去岩藻糖殘基 (Tarentino et al.(1975) Biochem. 14 : 5516-23)。 另外或替代地，可以製得具有改變的唾液酸醣化 (sialylation)程度的抗體，例如 Dickey 等人的 WO 2007/084926 和 Ravetch 等人的 WO 2007/055916 所說 明，其全部内容均通過引用結合在此。例如，可以採用 唾液酸酶（例如唾液酸酶）進行酵 素反應。該反應的條件通常如US 5,831，077中所說明， ❿ 其全部内容通過引用而結合在此。合適之酶的其他非限 制性實例是神經胺酸酶（neuraminidase)和 N-糠苦酶 F(N-Glycosidase F)，分別如 Schloemer et al· (J. Virology， 15(4)，882-893 (1975))和 Leibiger et al. (Biochem J.，338, 529-538 (1999))所述。去唾液酸醣化抗體可以使用親合 性層析法進一步純化。或者，可以採用各種方法，例如 採用唾液酸醣轉移酶（sialytransferase)以提高唾液酸膽 Q 化的程度。該反應的條件總體上如 Basset et al.， (Scandinavian Journal of Immunology, 51(3)，307-311 (2000))所說明。 對於此處使用之抗體的另一考慮修飾是聚乙二醇化 (pegylation)。可對一抗體進行聚乙二醇化來增大抗體的 生物（如血清）半衰期。為使抗體聚乙二醇化，在可使一 或多個PEG基團與抗體或抗體斷片連接的條件下，抗體 或其斷片通常與聚乙二醇（PEG)(例如PEG的反應性酯或 醛衍生物）反應。較佳是，利用具有反應性的PEG分子（或 47 200930407 者類似的反應性水溶性聚合物）進行醯化反應或烷基化 反應來執行聚乙二醇化。此處使用的術語「聚乙二醇 (polyethylene glycol)」包括已經用於衍生其他蛋白質的 任何形式PEG，例如單（Cl-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二 醇或聚乙二醇-馬來酿亞胺（polyethylene glycol-maleimide)。在某些 實施例中，有待進行聚乙二醇化的抗體是無醣化的抗 體。將蛋白質聚乙二醇化的方法在本領域中是公知的。 例如，參見Nishimura等人的EP 0154316和Ishikawa等 〇 人的 EP 0401384。 抗逋的物理性晳 可用各種物理性質來鑑定（characterized)用於本發明 的抗體。 抗體可能在Vl或VH中包含一或多個醣化位置，而造 成抗體的免疫原性增強或pK改變（Marshall et al. (1972) ❺ Annu Rev Biochem 41 : 673-702 ; Gala 和 Morrison (2004) J Immunol 172 ： 5489-94 ； Wallick et al. (1988) J Exp Med 168 ： 1099-109 ； Spiro (2002) Glycobiology 12 ： 43R-56R ； Parekh et al. (1985) Nature 316 ： 452-7 \ Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37 : 697-706)。醣化作用已知發生在 含有N-X-S/T序列的基序中。可變區的醣化作用可使用 Glycoblot分析法測試，其係將抗體切割以製得Fab，然 後使用測定高碰酸鹽氧化作用（periodate oxidation)和錫 夫氏驗（Schiff base)形成的分析法來測試醣化。或者，可 48 200930407 還可以使用Dionex光色層分析法（Dionex-LC)測試可變 區酶化作用’其是將Fab的多醣由切成單醣，然後分析 各糖的含量。在一些情況中，較佳是具有不含可變區醣 化的抗RG-1抗體。這可以藉著選擇在可變區中不包含醣 化序列（glycosylation motif)的抗體或使用標準技術使醣 化序列中的殘基突變來實現。 在一較佳實施例中，本發明揭示的抗體不含有天冬醯 © 胺異構位置。天冬醯胺酸（asparagine)的脫醯胺作用可能 發生在N-G或D-G序列上，並產生異天冬醯胺酸殘基 (isoaspartic acid residue)，這將節結（kink)引入多肽鏈中 並降低其穩定性（異天冬醯胺酸效應）。異天冬醯胺酸的 存在可使用反相HPLC測試（等量分析法）測定。 各種抗體將具有獨特的等電點（pI)，通常落入6至9.5 的pH範圍》IgGl抗體的pI通常落入7至9 5的pH範 圍’ IgG4抗體的pi通常落入6至8的pH範圍。據推測， Ο 具有正常範圍外之pi的抗體在體内條件下可能會有某些 程度展開（unfolding)和不穩定性因此，較佳是具有包 含落入正常範圍内之pI值的抗間皮素 體。選擇具有正常範圍内的pI的抗體或使帶電的表面殘 基突變可以實現該目的。 各抗體將具有特性解鏈溫度（characteristic咖⑴叫 temperature) ’較高的解鏈溫度表示較大的體内總體穩定 性（Krishnamurthy R 和 Manning MC (2〇〇2)〜打 pharm
Bl〇teChn〇1 3 : 361_71)。通常，較佳使TM1 (初期展開溫 49 200930407 度）高於60°C，較佳高於65°C，甚至更較佳高於70°C。 抗體解鏈溫度的測定可以使用差示掃描量熱法（Chen et al. (2003) Pharm Res 20 ： 1952-60 ； Ghirlando et al. (1999)
Immunol Lett 68: 47-52)或圓二色譜法（Murray et al.(2002) J. Chromatogr Sci 40 ： 343-9) ° 在一較佳實施例中，選擇不會迅速降解的抗體。抗 RG-1抗體的斷片化可以採用毛細管電泳（CE)和 MALDI-MS測定’如本領域中所公知者（Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67 ： 3626-32) 〇 在另一較佳實施例中’選擇具有最小凝集效應的抗 體’凝集效應可能引發不想要的免疫反應和/或改變或是 不利的藥物代謝動力學性質。通常，抗體可接受的凝集 率為25%或更小，較佳20%或更小，甚至更較佳15%或 更小，甚至更較佳10%或更小’甚至更較佳5%或更小。 凝集可以通過若干種技術測定，這些技術包括大小排阻 層析管柱（SEC)、高效竦相層析法旧凡以和光散射。 拉體改造方法
合）的抗RG-1抗體。例如， 項功能性質（例如與人類RG-1結 4如，已知RG-1抗體或其突變體 50 200930407 的一或多個CDR區可以與已知的框架結構區和/或其他 的CDR透過重組組合’來生成額外且經過重組改造的本 發明抗RG-1抗體，如上所述。其他類型的修飾包括在前 述内容中說明的那些修飾。改造方法的起始材料是此文 中所提供的一或多個^^和/或VK序列，或其一或多個 CDR區。要產生改造抗體，不必實際製備（即，表現成蛋 白質）具有一或多個已知RG-i抗體VH和/或¥&序列或其 ❾ 或夕個CDR區的抗體。而是使用序列中所含的資訊做 為起始材料’來創造出源自原始序列的「第二代」序列， 然後製備「第二代」序列並且將其表現成蛋白質。 可沿著編碼著抗RG-1抗體的全部或部分序列來隨機 或選擇性地引入突變，可如文中所述般，針對結合活性 和/或功能性質來篩選所得到的修飾後抗抗體。現 有技術已經說明了突變方法。例如，short等人的w〇 02/092780揭示使用飽和突變法（saturati〇n © mutagenesis)、合成黏接組裝法（別如以Hgati〇n assembly)或二者的組合來創造並篩選抗體突變的方法。 或者，Lazar等人在WO 03/074679中揭示使用計算篩選 法（computational screening method)以及將抗體之物理化 學性質最佳化的方法。 抗體斷片和抗體棍揆物 本發明的接合體並不限於作為結合成分的傳統 抗體，也可以使用抗體斷片和抗體模擬物來實踐本發 51 200930407 明。如今已經開發出多種抗體斷片和抗體模擬物技術， 且這些技術在現有技術中廣泛為人熟知。 單域抗體（domain antibody，dAb)是抗體的最小功能結 合單元，分子量約13 kDa，相當於抗體的重鏈（VH)或輕 鏈（VL)的可變區。關於單域抗體及其製造方法的更多的 細節可在 US 6291158、6582915、6593081、6172197 和 6696245 ； US 2004/0110941 ； EP 1433846 、 0368684 和 0616640 ; WO 2005/03 5572、2004/101790 ' 2004/081026 ' ❹ 2004/058821 ' 2004/003019 和 2003/002609 中找到，其 全部内容均通過引用方式納入本文中以供參考。 奈米抗體（Nanobodies)是一種包含天然重鏈抗體之 獨特結構及功能性質的抗體衍生蛋白質。這些重鏈抗體 包括單一可變區（VHH)和兩個恒定區（CH2和CH3)。重要 的是，經選殖和分離的VHH區是一種保有原始重鏈抗體 之全部抗原結合能力的穩定多肽。奈米抗體與人類抗體 φ 的VH區具有高度同源性，且可進一步人源化而不會損失 任何活性。重要的是，奈米抗體具有低免疫原潛力 (immunogenic potential) 〇 奈米抗體結合了傳統抗體的優點與小分子藥物的重要 特徵。如同傳統抗體，奈米抗體顯示出很高的標靶專一 性和親和性，並且較低的固有毒性。此外，奈米抗體極 為穩定，可以通過注射之外的方法施用（例如，參見WO 2004/0418 67)，並且易於製造。奈米抗體的其他優點包 括：由於尺寸小而能夠識別罕見或隱藏的表位、由於其 52 200930407 獨特的三維結構而能以高親和性和$ 砰氐和選擇性結合至蛋白 靶物的空腔或活性部位、靈活的藥物形式、可調整半衰 期、自由與快速適應藥物發現^ < ❹
奈米抗體被單基因編碼，並在幾乎全部的原核宿主和 真核宿主中都能夠有效製造’宿主例如為大腸桿菌⑼. coli)(例如，參見US 6,765,087)、黴菌（例如麯黴 (Aspergillus)或木黴（Trichodema))和酵母（例如酵母菌 屬（Saccharomyces)、克魯維酵母（Kluyver〇myces)、漢遜 酵母（Hansenula)或畢赤酵母（Pichia))(例如’參見us 6’838,254)。文獻全部内容藉由引用方式併入本文中以供 參考。 基於B細胞的自動大量篩選，奈米選殖方法 (Nanoclone method ’ 例如參見 w〇 06/079372，其全文引 用於本文中）能產生抗針對期望標靶的奈米抗體，並且能 夠應·用在本發明中。
UniBodies是另一種基於移除IgG4抗體之鉸鏈區的抗 體斷片技術。刪除鉸鏈區可得到實質上為傳統IgG4抗體 一半大小的分子，並且該分子具有單價結合區，而非二 價結合區。此外，因為UniBodies較小，因此它們可以 在較大的實體腫瘤上顯示出更好的分佈，具有潛在的有 利功效。關於 UniBodies的更多細節可參考 WO 2007/059782，其全部内容藉由引用方式納入本文中以供 參考。
Affibody分子是高親和力蛋白，其是依據葡萄球菌蛋 53 200930407 白A的三螺旋igG結合功能域所衍生出的58氨基酸殘 基蛋白功能域。該功能域已被用來構建組合喧菌體庫 (combinatorial phagemid library)的框架，使用嗟菌體表 現技術可從該組合噬菌體庫中篩選出針對目標乾分子的
Affibody 變體（Nord et al·，Nat Biotechnol 1997 ; 15 : 772-7 ； Ronmark et al., Eur J Biochem 2002 ； 269 ： 2647-55)。Affibody分子的簡單堅固結構和低分子量（6 ❹ kDa)使得它們適於各種廣泛的用途’例如受體相互作用 的檢測試劑和抑制劑。.關於Affibody的更多的細節可在 US 5,831，012中找到，其全部内容通過引用納入此處。 標記的Affibody在用於檢測同型物之豐富量的影像應用 中也是有用的。 DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein, DARPin)體 現了 DRP (Designed Repeat Protein)抗體模擬技術，該技 術展現出非抗體多肽的結合能力。重複蛋白，例如錯蛋 &白（ankyrin)和富含白胺酸的重複蛋白’是普遍存在的結 合性分子’與抗體不同的是，其出現在細胞内和細胞外。 獨特的模組結構以重複結構單元（重複子）為其特徵，這 些單元堆曼在一起而形成展示出可變的和模組式標靶結 合表面的延長重複域。基於該模組性，可以生成具有高 度多樣性結合專一性的多肽組合庫。該策略包括對展示 了變表面殘基的自交親和重複序列（self_c〇mpatibie repeat)的共有設計和將它們隨意組裝至重複域中。關於 DARPin和其他DRp技術的更多資訊可以在us 54 200930407 2004/0132028和WO 02/20565中找到，其全部内容均通 過引用結合在此。 ❹
G
Anticalins是另一種抗體模擬技術。在此技術中，結合 專一性來自於脂質運載蛋白（lipocalin )，脂質運載蛋白 是在人體組織和體液中天然產生且表現量豐富的一低分 子量蛋白家族。脂質運載蛋白已經演化成可在體内執行 與生理運輸和儲存化學敏感或不溶性化合物有關的各種 功能。脂質運載蛋白具有牢固的内部結構，其包括在蛋 白質的一端具有四個環（l〇〇p )的高度保守β桶 (β-barrel) ^這些環形成結合口袋的入口，並且分子在這 一部分的構形差異，解釋了各個脂質運載蛋白間之結合 專一性的變化。 儘管由保寸β-片狀結構所支持的高度可變性環 (hypervariable loop)的整體結構能夠讓人聯想起免疫球 蛋白，然而脂質運載蛋白與抗體在大小上有顯著差異， 其由160至180個氨基酸的單一多肽鏈構成，在稍大於 單一個免疫球蛋白功能域。 可以選殖脂質運載蛋白，對它們的環進行改造，… 造出Anticalin。、结構多樣性的AnticaHn資料庫已心 成’杨^表現庫（Antiealindisplay)允許對結合⑴ 進仃選擇和㈣，隨後在原核或真核系統中表現和生, 可溶性蛋白質以進行進一步的分 乎針於…才祈研究表明開發出! 何人_蛋白都具有專一性的Anticalin… 莫耳或更高範圍内的結合親和性。關於Anticali 55 200930407 的其他資訊可以在US 7,250,297和WO 99/16873中找 到，其全部内容均通過引用結合在此。
Avimer是另一類型可用於本發明的抗體模擬技術。 Avimer是從人類胞外受體功能域的大家族所演化而來， 其是利用外顯子拼凑技術（exon shuffling)以及嗤菌體表現技 術來產生具有多重結合和抑制性質的多功能域蛋白。已 經顯示出，連接多個獨立結合功能域可創造出親和力， 且與傳統的單表位結合蛋白相比，其具有提高的親和性 和專一性。其他潛在的優點包括可在大腸桿菌中簡單且 有效地製造出多重標靶專一性分子，並且具有較高的熱 穩定性和蛋白酶抵抗力。已經得到對各種標靶目標具有 低於奈莫耳（sub-nanomolar)之親和性的 Avimer。關於 Avimer 的其他資訊可在下列文獻中找到（US 2006/0286603 ' 2006/0234299 、 2006/0223114 、 2006/0177831 、 2006/0008844 、 2005/0221384 、 2005/0164301 、 2005/0089932 、 2005/0053973 、 2005/0048512、2004/0175756)，該些文獻全部内容均通 過引用結合在本文中。
Versabodies是另一種可用於本發明的抗體模擬技術。 Versabodies是一種約3至5 kDa且具有超過15%之半胱 胺酸的小分子蛋白，其形成高雙硫鍵密度的結構來替代 典型蛋白質所具有的疏水性核心。這種替代方式，使其 蛋白質分子更小且更加親水（即，不易發生凝集和非專一 性結合），對於熱和蛋白酶具有更大的抵抗力，具有較低 56 200930407 密度的τ細胞表位，這是因為多數呈現給MHC的殘基是 疏水性的。眾所周知這些性質會影響免疫原性，而且預 期它們會大幅度降低免疫原性。 對於Versabodies的結構，這些抗體模擬物提供了包括 多價、多重專一性、多樣的半衰期機制、對組織的標靶 模式以及缺乏抗體Fc區域等多種形式。此外，可從E. 大腸桿菌中製得尚產率的versabodies，且由於其親水性 和小尺寸，Versabodies高度可溶，能夠配製出高濃度。 Versabodies極具熱穩定性，並具有長的保存期。關於
Versabodies的更多資訊可在us 2007/0191272中找到， 其全部内容通過引用結合在本文中。 以上關於抗體斷片和模擬技術的說明並非全面性。各 種其他的技術，包括基於選擇性多肽的技術，如Qui等 人概述的互補決定區融合（Nature Bi〇techn〇1〇gy，25(8) 921-929 (2007)) ’以及基於核酸的技術，如RNA適體技 術（RNA aptamer，參閱 US 5789157、5864〇26、5712375、 5763566、6013443、6376474、6613526、6114120、0261774 和63 87620) ’都可用於本發明中，這些文獻均藉由引用 方式結合在本文中。 座瑪有本發明抗想的姑後分早 本發明的另一態樣涉及編碼有本發明抗體的核酸分 子。核酸可能存在於全部細胞、細胞溶胞物中，或以部 分純化或實質純化的形式存在。利用標準技術從其他細 57 200930407 胞成分或其他雜質（如其他的細胞核酸或蛋白質）中純化 出核酸時，稱為「分離」或「實質純化」的核酸，所述 標準技術包括鹼性/SDS處理、CsC1區帶化（CsC1 banding)、管柱色層分析、瓊脂糖凝膠電泳以及其他本領 域公知的技術。參見 F. Ausubel，et al，ed (1987) Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and
Wiley lnterscience，New Y〇rk。本發明的核酸例如可以為 〇 DNA或RNA，並且可能包含或不包含基因插入子序列 (intronic sequences)。在一較佳實施例中，所述核酸是 cDNA分子。 可使用標準分子生物技術獲得該核酸。對於使用融合 瘤表現的抗體（例如，如下述從攜帶有人類免疫球蛋白基 因的基因轉殖小鼠所製備出的融合瘤），可利用標準pcR 擴增或cDNA選殖技術來獲得編碼有融合瘤製造抗體之 輕鏈和重鏈的cDNA。對於從免疫球蛋白基因庫獲得的 〇 抗體（例如’採用噬菌體表現技術），可從基因庫中回收 獲得編碼有該抗體的核酸。 較佳的核酸是該些編碼有19G9或34E1單株抗體之Vh 和Vl序列的核酸。編碼有19G9和34E1之vH序列的 DNA序列分別顯示在序列編號：17至18中。編碼有19G9 和34E1之VL序列的DNA序列分別顯示在序列編號： 19至20中。 一旦得到編碼有VH和VL的DNA斷片，即可利用標準 重組DNA技術來操作這些DNA斷片，例如，將可變£ 58 200930407 基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab斷片基因、或scFv基 因。在這些處理當中’編碼有VL或VH的DNA斷片可操 作地連接至編碼有其他蛋白質的另一條Dna斷片，例如 一抗體恒定區或一撓性連接子。本文中使用的術語「可 操作地連接（0Peratively linked)」係指連接兩條DNA斷 片’以使它們所編碼的氨基酸序列仍正確讀取（讀框， in-frame) 〇 可藉著將編碼有VH的DNA可操作地連接至另一條編 碼有重鍵桓定區Ch1、Ch2和Ch3的DNA分子，而將 分離出編碼有VH區域的DNA轉化為全長的重鏈基因。 人類重鏈恒定區基因序列在本領域中是已知的（例如參 見Kabat ‘3242)，可利用PCR擴增來獲得包括這些序列 的DNA斷片。重鏈恒定區可以是IgGl、IgG2、igG3、 IgG4、IgA、IgE、lgM或IgD恒定區，然而最佳是IgG1 或IgG4的恒定區。對於Fab斷片重鏈基因，可將編碼有 VH的DNA可操作地連接到只編碼有重鏈Ch1恒定區的 DNA 上。 可將編碼有VL的DNA可操作地連接至另一條編碼有 輕鏈恒定區CL的DNA分子，而將分離出編碼有區域 的DNA轉化為全長的輕鏈基因（以及Fab輕鍵基因）。人 類輕鏈恒定區基因序列在本領域中是已知的 J 如參見
Kabat‘3242)，可利用PCr擴增來獲得包括這也序列的 DNA斷片。在較佳實施例中，輕鏈恒定區可為 w κ或λ恒 定區》 59 200930407 為了產生一 scFv基因，編碼有vH和VL的DNA斷片 可操作地連接至另一條編碼有撓性連接子的斷片，如編 碼有氨基酸序列（Gly4_Ser)3，以使和VH序列表現成 一連續的單鏈蛋白質，其和VL區域透過該撓性連接 子連接（例如，參見 Bird et al. (1988) Science 242: 423-426 ； Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 ： 5879-5883 ； McCafferty et al., (1990) Nature 348 ： 552-554)。 ❹ 單株抗逋的製備 可利用各種技術來製造用於本發明的單株抗體 (mAb) ’這些技術包括傳統單株抗體方法，如參見K〇hlel· 和 Milstein (1975) Nature 256 : 495 的體細胞雜合技術。 儘&較佳疋體細胞雜合技術（somatic ceH hybridization) ’然而原則上也可以採用其他技術，例如 © B淋巴細胞的病毒性或致癌性轉型法。 用於製備融合瘤的較佳動物系統是鼠科系統。在小鼠 系統中的融合瘤製備技術是一種非常成熟的技術。用於 分離出已免疫之脾細胞以進行細胞融合的免疫程序和技 術在本領域中是已知的。融合物件（諸如鼠類骨髓瘤細胞） 和融合方法也係已知的。 可依據上述製備非人類單株抗體的程序來製備嵌合或 人源化抗體。編碼有重鍵和輕鏈免疫球蛋白的DNA可從 感興趣的非人類融合瘤中獲得’並使用標準分子生物技 200930407 術改造成包含非鼠（如’人）免疫球蛋白序列。例如，為 了創造出攸合抗體，可使用本領域中已知的方法將鼠科 的可變區連接至人類恒定區（例如參見Chilly等人的 US 4,816,5 67)。為了創造出人源化抗體，可以使用本領 域已知的方法將鼠科CDR區插入人類的框架結構區中 (例如參見 US 5,225,539 (Winter)、和 US 5,530，101 ; 5,585,089 ; 5,693,762 和 6，180,370 (Queen 等人。 ❾ 本發明的抗體較佳是人類單株抗體。可使用攜帶有部 分人類免疫系統而非小鼠系統的基因轉殖或染色體轉殖 小鼠來產生這類針對RG-1的人類單株抗體。這些基因轉 殖和染色體轉殖小鼠包括此處被分別稱為HuMAb Mouse®和KM Mouse®類型或品系的小鼠，並被統稱為 「人類 Ig 小鼠（human Ig mice)」。
HuMAb Mouse®品系（Medarex®，lnc.)包含人類免疫球 蛋白基因的微基因座（miniloci)，該微基因座編碼有未重 © 排之人類重鏈（p和γ)和κ輕鏈的免疫球蛋白序列，並且 具有可使小鼠的内源性μ鏈和κ鏈基因座失活的特定突 變（例如’參見 Lonberg et al.(1994) Nature 368(6474): 856-859)。因此’小鼠表現出較少的小鼠IgM或K，並 在免疫反應時’引入的人類重鏈和輕鏈轉殖基因經歷類 型轉換（class switch)和體細胞突變（s〇matic mutati〇n)， 以產生高親和性的人類igGK單株抗體（Lonberg et al (1994), supra ； reviewed in Lonberg (1994) Handbook of
Experimental Pharmac〇i〇gy 113 : 49_1〇1 ; Lonberg 和 200930407
Huszar (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 : 65-93，以及 Harding fa Lonberg (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764 : 536-546)。HuMAb Mouse®品系的小鼠的製備和使用，以 及該小鼠所攜帶的基因體修飾在下列文獻中有進一步的 說明（Taylor et al.(1992) Nucleic Acids Research 20 : 6287-6295. ; Chen et al.(1993) International Immunology 5 : 647-656 ; Tuaillon et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724; Choi et al.(1993) Nature Genetics.4.:. 117-123 ; Chen et al.( 1993) EMBO J. 12 : 82**3 0 ; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152 ： 2912-2920 ； Taylor et al. (1994) International Immunology 6 : 579-591 ;以及 Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14 ： 845-851)。這些文獻的全部内容以引用的方式併入本文 中以供參考，更多請見：S 5,545,806 ; 5,569,825 ; 5,625,126； 5,633,425； 5,789,650； 5,877,397； 5,661,016 ； 〇 5,814,318 ; 5,874,299 ;和 5,770,429 ;所有的以上專利都
授予 Lonberg 和 Kay ;授予 Surani 等人的 US 5,545,807 ; 都授予 Lonberg 和 Kay 的 WO 92/03918，WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 and WO 99/45962 ;以及授予 Korman 等人的 WO 01/14424 〇 在另一實施例中，可以使用在轉殖基因和轉殖染色體 (如人類重鏈轉殖基因和人類輕鏈轉殖染色體）上攜帶人 免疫球蛋白序列的小鼠來產生人類抗體。這類小鼠在此 處被稱為「KM Mouse®」型’並在Ishida等人的 WO 62 200930407 02/43478中有詳細說明〇 此外’本領域中已可取得能表現人類免疫球蛋白基因 的替代性基因轉殖動物系統，並可用於產生本發明的抗 RG-1抗體。例如’可以使用稱為Xenomouse (Abgenix， Inc.)替代性基因轉殖系統；此類小鼠在例如us 5 939598、6075181、6114598、6150584 和 6162963 (授予
Kucherlapati等人）文獻中有說明。 ❹ 另外’在本領域中可取得能表現人免疫球蛋白基因的 替代性染色體轉殖動物系統’並可用於產生本發明的抗 RG-1抗體。例如，可以使用同時攜帶有人類重鏈轉殖染 色體和人類輕鏈轉殖染色體的小鼠，其被稱為「TC小
鼠」；在 Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 · 722-727中說明有該小鼠。此外，在本領域中已經揭 示攜帶有人類重鏈和輕鏈轉殖染色體的牛（Kuroiwa et al.
(2002) Nature Biotechnology 20 : 889-894 和 WO ❹ 2002/〇92812)，並且可用於產生本發明的抗rg-1抗體。 還可使用噬菌體表現法來製備本發明的人類單株抗 體’以篩選出人類免疫球蛋白的基因庫。例如參見us 5’223,409 ; 5,403,484 ;和 5,571，698 (授予 Ladner 等人）；
US 5,427,908 和 5,580,717 (授予 Dower 等人）；US 5,969，108 和 6，172，197 (授予 McCafferty 等人）；和 US 5,885,793 ； 6,521,404 ； 6,544,731 ； 6,555,313 ； 6,582,915 和 6,593,081 (授予 Griffiths 等人）。 還可使用SCID小鼠來製備本發明的人類單株抗體， 63 200930407 該小鼠中已經重建構出人類免疫細胞，而可在進行免疫 時，產生人類抗體反應。例如在 Wilson等人的US 5,476,996和5,698,767中說明該小鼠》 人類Ig小鼠的免疫作用 當人類Ig小鼠用於產生人類抗體時，可使用純化或濃 化後的RG-1抗原和/或重組RG-1製備物、或表現RG-1 _ 的細胞、或R.G-1融合蛋白.來免疫該些小氣，如Lo’nberg © et al. (1994) Nature 368(6474) ： 856-859 ； Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14 : 845-851 ;和 WO 98/24884和W0 01/14424中所述。較佳地，這些小鼠在 鼠齡6至16周時進行第一次注射◊例如，可使用rg- 1 抗原的純化或重組製備物（5到50微克）對人類Ig小鼠進 行腹腔内免疫。 多種抗原研究叙驗積累顯示，當使用加在完全弗氏佐 ❿ 劑（Freund’s adjuvant)中的抗原進行初次腹腔内免疫 (IP)，隨後每隔一周使用加在不完全弗氏佐劑中的抗原進 行IP免疫（直至一共6周）時，基因轉殖小鼠產生免疫反 應。然而發現弗氏佐劑以外的佐劑也有效。另外，不存 在佐劑時的全細胞被發現具有高度免疫性。使用眼窩後 方采金所獲得的血漿樣品來監控免疫全程過程中的免疫 反應。可利用ELISA來篩檢血漿，具有足夠效價（titer) 之抗RG-1人類免疫球蛋白的小鼠可用來進行細胞融 合。在殺死和摘除脾臟的前三天，用抗原進行靜脈注射 64 200930407 來促進小鼠的免疫作用。預期每次免疫需要2到3次注 射。對於每種抗原，通常使用6到24隻小鼠進行免疫。 小鼠通常使用HCo7和HCol2品系。另外，可使用HC〇7 和HCo 12基因轉殖鼠一同繁殖，以繁殖出單隻小鼠内具 有兩種不同人類重鏈轉殖基因（HCo7/HCol2)的單一小鼠 體内。替代或額外地’可以使用KM Mouse®品系的小鼠。 _ 製造_能產生人類單株抗嫌的融合痼細胞 ❹ 為了製造能產生人類單株抗體的融合瘤，從已經過免 疫的小鼠體内分離出脾細胞和/或淋巴結細胞，然後融合 至適宜的永生細胞株’例如小鼠骨髓瘤細胞株。篩選所 得到的融合瘤，以用於製造具有抗原專一性的抗體。例 如’使用50% PEG將來自免疫小鼠脾臟淋巴細胞的單細 胞懸浮液融合至六分之一數目的P3X63-Ag8.653非分泌 性小鼠骨鎚瘤細胞（ATCC，CRL 15 80)。或者，也可利用 ❹ CytoPulse大容量細胞融合電穿孔儀（CytoPulse Sciences，
Inc·’ Glen Burnie Maryland)執行電場式電融合法來融合 該些來自免疫小鼠脾臟淋巴細胞的單細胞懸浮液。細胞 以約為2x1 〇5的數目舖於平底微滴定孔盤中，隨後在含 20%胎選瘦血清（fetal Clone Serum)、1 8%的「653」調整 培養基、5% origen(IGEN)、4 mM 的 L-麩酿胺酸、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate)、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol)、50 單位/ml 青黴素、50 mg/ml 鏈黴素，50mg/ml 慶大黴素（gentamycin)和 65 200930407 lxHAT(Sigma ’ HAT在融合μ小時後添加）的篩選培養 基中培月2周。約兩周後’在用替換掉hat的培養 基中培育細胞。然後針對人類單株IgM和IgG抗體’例 如ELISA來篩檢各個孔中的細胞。一旦發生大量的融合 瘤生長，則可從培養基觀察到（通常在1〇到14天之後）。 分泌抗體的融合瘤可進行重新鋪盤，再次篩選，如果對 人類IgG仍呈現陽性，利用限數稀釋法來次選殖該些單 0 株抗體至少兩次。然後在體外培養該些穩定的次選殖 株，以在組織培養基中產生少量抗體以供鑒定。 為了純化人類單株抗體’所選融合瘤可在2升的旋轉 瓶内生長，以用於單株抗體純化。上清液可先過濾和濃 縮’然後用蛋白A-瓊脂進行親和性層析法（pharmacia， Piscataway，Ν·J.)。可以利用凝膠電泳和高效液相色層分 析來檢驗所沖提出的IgG ’以保證純度。緩衝液可改換 成 PBS ’ 可使用 1.43 的消光係數（extinction coefficient) 〇 以0D280測定其濃度。將該單株抗體分裝後儲存於 80〇C。 生產可製造單株抗體的韓染痼細胞 還可使用例如重組DNA技術與基因轉染法的組合（例 如 Morrison，S. (1985) Science 229 : 1202)，在宿主轉染 瘤細胞（transfectomas)内製造用於本發明中的抗體。 為表現該抗體或其抗體斷片，可利用標準技術（例如， PCR擴增或使用能表現所欲抗體之融合瘤的cDNA選殖 66 200930407 技術）’來獲得編碼有部分或全長輕鏈和重鏈的dna，並 且該DNA可插入表現載體中，以使基因可運作地連接至 轉錄和轉譯控制序列。術語「可運作地連接（〇perativeiy linked)」疋札抗體基因黏接（ligated)到載體中以使載體 中的轉錄和轉譯控制序列能夠發揮其預期功能，即調節 抗體基因的轉錄和轉譯。所選擇的表現載體和表現控制 序列與所使用的表現宿主相容。抗體輕鏈基因和抗體重 ❹ 鏈基因可插入不同的載體中，或更常見的是，兩種基因 插入同一個表現載體中。利用標準技術（如，抗體基因斷 片和載體上的互補限制位置處黏接，或若無限制位置時 則採用平端黏接（blunt end)，而將抗體基因插入表現載體 中。此處說明之抗體的VL和VH可用來創造任何抗體類 型的全長抗體基因，其係藉著將VL* VfI插入已經編碼 有所需類型之重鏈恒定區和輕鏈恒定區的表現載體中， 以使VH斷片可操作地連接至載體中的CH斷片，且使vL 〇 斷片可操作地連接至載體中的CL斷片。額外地或替代 地，該重組表現載體可編碼能促使抗體鍵從宿主細胞中 分泌出去的信號肽。抗體鏈基因可被選殖入載體，以使 該信號肽以能夠正確讀取的方式（in-frame)連接至抗體 鏈基因的氨基端。該信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或 異源信號肽（即，來自非免疫球蛋白的信號肽）。 除了抗體鏈基因之外，本發明的重組表現载體還攜帶 有調控序列，調控序列控制抗體鏈基因在宿主細胞内的 表現。術語「調控序列（reSulatory sequence)j包括控制 67 200930407 抗體鏈基因之轉錄和轉譯作用的啟動子、増強子和其 表達控制元件（如聚腺苷酸化信號）。例如，在 (Gene Expression Technology. Methods in Εη2γπι〇1ο^ 185’ Academic Press’ San Diego’ CA (1990))中說明有這 些調控序列。本領域技術人員可以理解的是，表現載體 的設計，以及包括調控序列的選擇，取決於諸如進行轉 型的宿主細胞選擇、期望的蛋白質表限量等因素。用於 ❸ 哺乳動物宿主細胞表現的較佳調控序列包括在哺乳動物 細胞内引導表現高蛋白質表現量的病毒元件，例如來自 巨細胞病毒（CMV)、猿猴病毒40 (SV4〇)、腺病毒（如腺 病毒主要晚期啟動子，AdMLP)和多瘤病毒（poly〇ma)的 啟動子和/或增強子。或者’可以使用非病毒調控序列， 例如泛素啟動子（ubiquitin promoter)或β-球蛋白啟動子 (β-globin promoter) ««更進一步，調控元件是由來自不同 來源的序列所構成，例如SRa啟動子體系，其包含來自 © SV40早期啟動子序列和人類τ細胞第一型白也病病毒的 長末端重複序列（Takebe，Y.等（1988) Mol. Cell. Biol. 8 : 466-472) ° 除了該抗體鏈的基因和調控序列之外，本發明的重組 表現載體還可攜帶其他序列，如宿主細胞中载體的調節 複製物（如複製起點）和篩選標記基因。篩選標記基因有 助於篩選出在細胞中已導入載體的宿主細胞（例如，參見 US 43 99216、4634665 和 5179017，均屬於 Axel 等人）。 例如，篩選標記基因通常使細胞中已導入有該載體的宿 68 200930407 主細胞對藥物具有抗性，藥物例如G418、潮黴素 (hygromycin)或曱氨蝶呤（meth〇trexate)。較佳的篩選標 記基因包括一氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase， DHFR)基因（用於在dhfr-宿主細胞中以甲氨蝶呤進行篩 選/增殖）和neo基因（用於G41 8篩擇）。 為了表現輕鏈和重鏈，將編碼有重鏈和輕鏈的表現載 體轉染入宿主細胞。術語「轉染（transfecti〇n)」涵蓋常 〇 用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的各種技 術’如電穿孔（electroporation)、礎酸約沉殿法 (calcium-phosphate precipitation) 、DEAE 葡聚糖 (DEAE-dextran)轉染等。儘管理論上，在原核或真核宿 主細胞中表現本發明之抗體皆可行，但在真核細胞中表 現抗體為佳’並且以在哺乳動物宿主細胞中表現抗體為 最佳，因為真核細胞，尤其是哺乳動物細胞，比原核細 胞更可能組裝且分泌出適當折疊又具有免疫活性的抗 © 體。據報導，在原核細胞中表現抗體基因無法有效產生 尚產量的活性抗體（Boss和Wood (1985) Immunology Today 6 ： 12-13)。 用於表現本發明之重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞 包括：中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary ’ CHO cell)(包括 dhfr- CHO 細胞，說明在 Urlaub 和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4216-4220 中，與 DHFR可選性標記配合使用，如Kaufman和Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159 : 601-621 中所述）、NSO 骨趙瘤細胞、 69 200930407 COS細胞和SP2細胞。為了用於NSO骨髓瘤細胞，較佳 的表現系統是 WO 87/04462 (授予 Wilson)、WO 89/01036 (授予 Bebbington)和 EP 338,841 (授予 Beb-bing-ton)中公 開的GS基因表現系統。當將編碼有抗體基因的重組表 現載體導入哺乳動物宿主細胞中時，培養該宿主細胞足 夠的時間，以能夠在宿主細胞中表現出抗體，或者更佳 是使抗體分泌至宿主細胞所生長的培養基中，以製造抗 體。可以使用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體。 ❹ 與抗原結合之抗體的鑑定 利用標準ELISA分析法來測試抗體對rg- 1的結合。 簡而s之’以溶於PBS中且濃度為〇.2$ pg/ml的純化 RG-1來塗覆微量滴定孔盤’然後用含有5〇/〇牛血清白蛋 白的PBS來遮蔽該孔盤。將抗體的稀釋液（如來自rG_i 免疫小鼠之血漿的稀釋液）添加至各孔中並在37。C下反 〇 應1至2小時。用PBS/Tween洗滌該孔盤，然後用連接 有鹼性磷酸酶的二次試劑（例如，針對人類抗體的山羊_ 抗-人類IgG Fc專一性多株抗體試劑）在3pc反應1小 時。洗滌後，用pNPP受質（1 mg/ml)對孔盤進行顯色， 並以OD405-650進行分析。較佳地，顯現出最高效價的 小鼠將用於細胞融合。 上述的ELISA分析可用來篩檢出呈現RG1免疫原陽 性反應的融合瘤。再次選殖該些對RG-1具有高親和性結 合力的融合瘤並且進一步鑑定。選擇出該些保留了親代 70 200930407 細胞之反應性的每個融合瘤選殖株（利用ELISA來偵 測），用於製造5至10小瓶的細胞庫’並將其儲存於 -140°C準備用於抗體純化。 為純化抗RG-1抗體，所選出融合瘤可在2升的旋轉瓶 内生長’以用於進行單株抗體純化。過濾和濃縮該上清 液’然後使用蛋白 A-壤脂（Pharmacia，Piscataway, N.J.) 進行親和性層析分離。可以利用凝膠電泳和高效液相色 層分析來檢查洗提出來的IgG，以確保純度。缓衝液可 改換.成 PBS，使用 1.43 的消光係數（extinction coefficient) 以及OD280法來測定IgG的濃度。將該單株抗體分裝後 儲存於-80°C。 為了測定所選擇的抗RG-1單株抗體是否與獨特表位 結合’可以使用市售試劑（Pierce，R〇ckford，IL)使抗體生 物素化（biotinylated)。可以採用未標記的單株抗艎和生 物素化的單株抗體，使用塗覆有RG-丨的ELISA孔盤上 進行競爭作用的研究。可使用鏈黴卵白素_鹼性磷酸酶探 針來偵測該生物素化mAb的結合。 為測定純化抗體的類型（isotype) ’可使用對特定類型 抗體具有專一性的試劑進行類型ELISA分析。例如，為 了測定人類單株抗體的類型，可以使用lpg/ml的抗人類 免疫球蛋白在4°C下塗覆微量滴定孔盤的孔一個晚上。 用1。/。的BSA遮蔽後，使該孔盤與1 pg/ml或更少的待測 試單株抗體或已純化的同型對照物在室溫下反應1至2 小時。然後使孔盤的孔與人類IgGl或人類igM專一性 71 200930407 驗性磷酸酶接合探針進行反應。如上所述將孔盤顯色並 進行分析。 使用西方墨點法進一步測試抗RG-1人類“(^對RGl 抗原的反應性。簡而言之’製備RG-1，並對其進行十_ 烧基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。然後將分離的抗原轉 移至硝酸纖維素膜上’用10%的胎牛血清遮蔽，並用待 測試的單株抗體進行檢測。可使用抗人類IgG驗性碟酸 酶來偵測人類IgG的結合作用’並且使用BCIP/NBT受 質片.（Sigma Chem. Co.，St. Louis，Μο·)來顯色。 還可以透過監測抗體與RG-1表現細胞的結合（例如 利用流式細胞儀）來測定本發明抗體的結合專一性。通 常’細胞株’如CHO細胞株，可以轉染有編碼著跨膜逛 RG-1的表現載體。轉染的蛋白可能包含標籤（較佳在N 端），例如myc標籤’並且使用可與標籤結合的抗體進行 读測。可藉著使抗體與經過轉染的細胞進行反應，並且 檢測結合至細胞的抗體，而測定本發明抗體與RGj之間 的結合。抗體與轉染蛋白上的標籤的結合可作為陽性對 照》 可使用與測定RG-1結合的相同方法，藉著測定抗體是 否與其他蛋白質（如PROTEIN Y或RG-1)結合，而進一步 研究本發明抗體對於RG-1的專一性。 雙重專一钟分子 接合體的抗體部分可以是雙重專一性分子。抗RG-1 72 200930407 其斷片可以被另一功能分子衍化或與另-功能分 的配體、列如另一個肽或蛋白質(如另一抗體或用於受體 ^配體）m可結合到至少兩個μ結合位置或標乾 二的雙重專—性…抗體實際上被多個其他功二分 π化或與其連接，以產生能結合至兩個以
位置和/或乾分子的多重專一性分子；該多重專—性二 也包括在此處使用的術語「雙重專一性分子」内。 創造出雙重專—性好，抗體可㈣紐料」（例如2 為合、基因融合、非共價結合或其他方式)至一個或多個 結合分子，例如另一抗體、抗體斷片、肽或結合模擬物， 以產生雙重專一性分子。 雙重專一性分子包括至少一個用於RGq的第一結合 專一性和一用於第二靶表位的第二結合專一性該第二 靶位表例如Fc受體，如人類FcyRI(CD64)或人類Fca受 體（CD89) 〇該雙重專一性分子能夠結合至表現f^r或 FcaR的作用細胞（如單核細胞、巨噬細胞或多形核白細 胞（PMN))以及表現RG-1的細胞。這些雙重專一性分子 將RG-1表現細胞導向作用細胞，並引發pc受體介導的 作用細胞活性，如RG-1表現細胞的吞噬作用、抗體依賴 型細胞介導的細胞毒性（ADCC)、釋放細胞激素或過氧陰 離子的產生。 雙重專一性为子實際上可以是多重專一性的，也就是 說，除了抗Fc的結合專一性和抗rg- 1的結合專一性之 外，它還可以包含第三種結合專一性。在一實施例中， 73 200930407 第三種結合專-性是一抗增強因子（ef)部分，例如，一 種能與涉及細胞毒素活性的表面蛋白結合而提高對㈣ 胞之免疫反應的分子。「抗增強因子部分 (antl-enhancement factor portion)」可以是一種能結合至 指定分子（如抗原或受體）而增強對“受體或靶細胞抗原 ❹
之〇決定區效果的抗體、功能性抗體斷片或配體。「抗 增強因子部分」可以結合至Fe受體樣細胞抗原，或 者，作為替代地，其所結合的實體（entity)與第一和第二 結合專一性所結合的實體不相同。例如，抗增強因子部 分可結合至細胞毒性T細胞（如’經CD2、CD3、CD8、 CD28、CD4、CD40、ICAM-1或導致對乾細胞的免疫反 應增強的其他免疫細胞）。 在一實施例中’本發明的雙重專一性分子包括具有結 合專一性的至少一種抗體或其一抗體斷片（包括如Fab、 Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb 或一條單鏈 Fv)。抗體還可 以是輕鏈或重鏈的二聚體，或是其任何小斷片，如Fv或 一單鏈構成體，如Ladner等人的US 4,946,778中所述 者，其内容藉由引用方式併入本文中以供參考。 在一實施例中，由單株抗體來提供Fey受體的結合專 一性，其結合作用不會被人類免疫球蛋白G (IgG)所阻 擂。此處使用的術語「IgG受體（IgG receptor) j是指位 於第一號染色體上的八個丫-鏈基因中的任一個。這些基因 編碼全部12個跨膜受體或可溶受體同種異構物 (isoform)，它們被分成三個Fey受體群組：FcyRI (CD64)、 200930407
FcyRII(CD3 2)和 FcyRIII (CDl 6)。在一較佳實施例中，FCy 受體為人類高親和性FcyRI。人類FcyRI是大小為72 kDa 的分子，其顯示出對單體IgG的高親和性（1〇8至1〇9 μ·1)。 抗Fey .單株抗體的製造和鐘定（characterization)在 Fanger 等人的 WO 88/00052 和 US 4954617 中有說明， 其内容藉由引用方式全部納入本文中以供參考。這些抗 體在一位置處結合至FcyRI、FcyRII或FcyRIII的一表位， 該位置與受體的Fey結合位置不同，它們的結合基本上 〇 不會被IgG的生理濃度所阻擋。可用於本發明中的專一 性抗 FcyRI 抗體是 mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62 和mAb 197。能產生mAb 32的融合瘤可從美國菌種中心 (ATCC Accession No. HB9469)得到。在其他的實施例 中，抗Fey受體的抗體是一人源化形式的單株抗體22 (H22)°H22抗體的製造和鑑定在Graziano等人（1995) J. Immunol 155 (10) : 4996-5002 和 Tempest 等人的 WO j 94/103 32中有說明。會產生H22抗體的細胞保存於美國 菌種中心，名稱為HA022CL1，登錄號為CRL 11177。 在其他較佳實施例中，可利用能與人類IgA受體（例如 Fc-α受體（FcotRI (CD89))結合的抗體來提供對Fc受體的 結合專一性，較佳地，該抗體的結合作用不會被人類免 疫球蛋白A (IgA)所阻擋。術語「IgA受體（IgA receptor)」 包括位於第19號染色體上一 a基因（FcotRI)的基因產物。 已知該基因編碼了數個替換性剪接（alternatively spliced) 的跨膜同種異構物（55-110 kDa) » FcotRI (CD89)常在性地 75 200930407 (constitutively)表現在單核細胞/巨嗔細胞、嗜酸性顆粒 球和嗜中性顆粒球上，但不表現在非作用細胞群上。 FcotRI對IgAl和IgA2均具有中等親和性（》5xl07 M_1)， 與諸如G-CSF或GM-CSF等細胞激素接觸時，該親和性 提高（Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440)。四個 FcaRI 專一性單株抗體 (標示為A3、A59、A62和A77)結合IgA配體結合功能 域以外的 Fc aRI，其已經說明在（Monteiro，R.C. et Ο al.( 1992) J. Immunol· 148 : 1764)中。
FcaRI和FcyRI是用於本發明之雙重專一性分子中的較 佳觸發受體（trigger receptor)，因為它們是（1)主要表現在 免疫作用細胞上，如單核細胞、PMNs、巨嗟細胞和樹突 細胞；（2)高表現量（如，每個細胞表現5000至100000 個該受體）；（3)細胞毒素活性（如，ADCC、吞噬作用）的 介導物，以及（4)調節該些與FcaRI和FcyRI受體結合之 Q 抗原（包括自體抗原）的增高抗原遞呈作用（antigen presentation) ° 儘管較佳是人類單株抗體，但可用在本發明之雙重專 一性分子中的其他抗體還有鼠類單株抗體、嵌合單株抗 體和人源化單株抗體。 可使用本領域中的公知方法，藉由接合具有結合專一 性（如，抗FcR和抗RG-1結合專一性）的組分來製備雙重 專一性分子。例如，雙重專一性分子的兩種結合專一性 可各自分開產生，然後彼此接合。當結合專一性是蛋白 76 200930407 質或肽時’可用各種耦聯劑或交聯劑進行共價接合。交 聯劑的實例包括蛋白A(protein A)、碳二醯亞胺 (carbodiimide)、N-琥珀醯重胺基乙酿基-硫代醋酸酯 (N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate，SATA)、5,5'-二硫 雙（2-頌基苯甲酸）（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)， DTNB)、鄰伸本基二馬來醯亞胺（0_口]1611丫16116(^111&16-imide，oPDM)、N-琥珀醯重胺基_3_(2_吡啶基二硫）丙酸 酯（N-succinimidyl-3-(2-pyridyl<iithio)propionate，SPDP) ❹ 和硫代琥珀醯重胺基4-(N-馬來酸酿亞胺甲基）瓖己烷-1-叛酸 S旨（硫代- SMCC)(例如，參見 Karpovsky et al.(1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu et al.(1985) Proc. Natl· Acad. Sci. USA 82 . 8648)。其他方法包括在 pauius (1985)
Behring Ins. Mitt· No. 78, 118-132 ; Brennan et al.(1985)
Science 229 ： 8**3, and Glennie et al.(1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)中說明的方法。較佳的接合試劑是SATA ❹ 和硫代-SMCC，均由 Pierce Chemical Co. (Rockford，IL) 獲得。 當結合專一性是抗體時，抗體可以經由兩個重鏈之C 端鉸鏈區的疏基鍵結進行接合。在一特佳實施例中，在 接合之前，鉸鏈區被修飾成包含奇數個（較佳一個）酼基 殘基。 或者’兩者的結合專一性可編碼在同一載體（vector)中 並在同一宿主細胞中表現和組裝。當雙重專一性分子是 mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab’)2 或配體 xFab 的融合蛋 77 200930407 白時，該方法尤其有用。本發明的雙重專一性分子可以 是包含一單鏈抗體和一結合決定區（binding determinant) 的一單鏈分子，或是一包含兩個結合決定區的單鏈雙重 專一性分子。雙重專一性分子可能包含至少兩個單鏈分 子。製備雙重專一性分子的方法在US 5260203、 5455030 、 4881175 、 5132405 、 5091513 、 5476786 、 5013 653、5258498和5482858中均有舉例說明，其全部 文獻藉由引用方式併入本文中以供參考。 0 可以藉由諸如酵素免疫吸附測定（ELISA)、放射性免疫 測定（RIA)、FACS分析、生物性測定（如抑制生長）或西 方墨點法來確認該雙重專一性分子與其特定標靶的結 合。這些方法通常使用對感興趣之複合物具有專一性的 標記試劑（如抗體），來偵測特別感興趣的蛋白質-抗體複 合物是否存在，例如，可使用能識別且專一性結合至該 抗體-FcR複合物的酵素連接（enzyme-linked)抗體或抗體 〇 斷片來偵測FcR-抗體複合物。或者，可使用各種其他免 疫測定法中的任一種方法來偵測該複合物。例如，該抗 體可被放射性標記，並用於放射性免疫測定（RIA)中（參 見，例如 Weintraub，B.，Principles of Radioimmuno-assays， Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，這些文 獻藉由引用方式併入本文中以供參考）。可使用γ計數器 或閃爍計數器（scintillation counter)等工具或藉由放射 自顯影法（autoradiography)來偵測放射性同位素。 78 200930407 接合§t 本發明的接合體中，該搭檔分子是藉由一化學連接子 (有時簡稱為「連接子」）而接合至一抗體。該搭檔分子 可以是一治療劑或一標記物。該治療劑可是例如一細胞 毒素（cytotoxin)、一非細胞毒性藥物（如免疫抑制劑， immunosuppressant)、一放射性試劑、另一抗體或酶 (enzyme ’或稱酵素）。搭檔分子較佳是一細胞毒素。該 φ 標記物可以是能產生可偵測信號的任何標記，如放射性 標兒、螢光標記或是一種能催化受質進行可偵測性修飾 的酶°抗體具有一靶向功能（targeting functi〇n):該抗體 藉著與發現具有其抗原的靶組織或靶細胞結合，而將接 合體帶往該靶組織或細胞。在該靶組織或細胞所在之 處，該連接子被切斷，釋放出搭檔分子，以執行其所期 望的±物學功能。 、 © 搭檔分子與一抗體連接的比值（ratio)可以隨著諸如接 合反應時所用的搭檔分子用量以及實驗條件等因素而變 化。搭檔分子與抗體的比率較佳介於1至3之間，更佳 為1至1.5。本領域的技術人員將可以理解到，抗體 的各單獨分子與整數個搭檔分子接何時，而接合體的製2 備可以分析出搭檔分子與抗體的非整數比，而反映 統計平均值。 、出一 連接子 79 200930407 在一些實施例中，該連接子是一肽基連接子，此處以 (Lip-F^L1)!!!來表示。其他連接子包括肼（hydrazine)和二 硫化物（disulfide)連接子，此處分別以（Ι^ρ-Η-α1、和 (I^p-iKL1、來表示。F、H和J分別為肽基、肼和二硫 化物部分，它們可以被切斷，以使搭檔分子使其從抗體 上釋放出來，且L1和L4是連接子。Ρ'Η、·！、！/*!/， 連同下標Ρ和m —起在下文有更充分的定義。這些和其 他連接子的製備和使用說明於WO 2005/112919中，其露 的内容以引用方式並入本文中以供參考。 US 2006/0004081 、 2006/0024317 、 2006/0247295 、 6,989,452、7,087,600 和 7,129,261、WO 2007/051081、 2007/038658、2007/059404 和 2007/089100 說明肽基和 其他連接子在抗體-搭檔分子接合體中的使用，所有文獻 藉由引用方式併入本文中以供參考。 US 6,214,345'2003/0096743 ^ 2003/0130189； de Groot 等人，J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot 等人 J. Org. Chem. 43，3093 (2000) ; de Groot 等人，J. Med. Chem. 66， 8815,（2001) ; WO 02/083180 ; Carl 等人，J. Med· Chem. Lett· 24，479, (1981) ; Dubowchik 等人，Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998)說明其他連接子，所有文獻披 露的内容藉由引用方式併入本文中以供參考。 除了用來連接抗體和搭檔分子之外，連接子還增加了 搭檔分子的穩定性，減小搭檔分子在體内的毒性，或者 對其藥物動力學、生物利用度和/或藥效學產生有利的影 200930407 響。通常期望的是，-旦接合體被輪送至其作用部位， 連接子立即被切斷以釋放出搭標分h也期望，連接子 是無痕跡性，使得一旦連接子被切割，不會留下連接子 存在的痕跡。 在另一實施例中，連接子的特徵在於具有在靶細胞内 或在附近位置（例如在搭檔分子的治療作用位置或標記 活性位置處）被切斷的能力。肖切斷作用I質上是酶催化 ❹ 性（enzymatic)。這—特點有助於減小搭檔分子的全身性 活化作用（systemic activation)、減少毒性和全身性的副 作用。可進行酶催化性斷裂的較佳可切斷性基團包括肽 鍵、酯鍵、二硫鍵，如前述的F、H和】部分。在其他的 實施例中，連接子對ρΗ敏感，可藉由改變卩^1來切斷連 接子。 一重要態樣是控制連接子斷裂速度的能力。一般期望 連接子快速斷裂/然而，在一些實施例中，可能希望較 © 慢斷裂的連接子。例如，在緩釋製劑或同時具有快速釋 放成分和慢速釋放成分的製劑中，提供斷裂較慢的連接 子是有用的。前述的WO 2005/112919公開了肼連接子， 匕被没計成以一速度範圍（從極快到極慢）來斷裂。 在接合體處在循環系統中並且在到達靶組織或細胞 前，連接子還可用於穩定搭檔分子，防止其降解。這是 重要的有利之處，因為它延長了搭檔分子的循環半衰 期。連接子還可用於減弱搭檔分子的活性，以使接合體 在循環時相對為良性，而當搭檔分子在期望的作用位置 81 200930407 需的效果，例如具有細胞毒性。 連接子的這一特點可改善該試 處被活化之後，其具有所 對於治療劑接合體而言， 劑的治療指數。
除了可切斷性的肽、肼或二硫化物基圏（分別為fh 或J)之外’根據情況’可選用牲地將一或多個連接子 基團L1導人搭檀分子和F、^ ;之間。這些連接子基 團還可被稱為間隔基團（印咖以卿）並包含至少 兩個官能基。依據下標m的值(即，存在的以團的數 目）和特定基團L1的位置，根據情況，基團。的化學官 能基可結合至該搭檔分子以及F、H或j的一化學官能 基，或者與另一連接子L1的化學官能基結合（如果有一 個以上的L1基團存在時）。用於間隔基團[j的適宜化學 官能基的例子包括羥基（hydroxy)、酼基（mercapt0)、羰基 (carbonyl)、緩基（carboxy)、氨基（aniin〇)、酮（ketone) ' 路（aldehyde)和巯基。 連接子L1可以是被取代或未被取代的烷基、被取代或 未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜芳基，或被取 代或未被取代的雜燒基。在一實施例_，烧基或芳基可 包含1至20個碳原子。它們還可以包含聚乙二醇部分 (polyethylene glycol moiety) 〇 示例性的基團 L1包括例如 6-氨基己醇 (6-aminohexanol)、6-疏基己醇（6-mercaptohexanol)、10-經基癸酸（l〇-hydroxydecanoic acid)、甘胺酸（glycine)和 其他氨基酸、1,6-己二醇（l，6-hex.anediol)、β-丙胺酸 82 200930407 (β-alanine)、2-氨基乙醇（2-aminoethanol)、半胱胺（2-氨 基乙硫醇）（cysteamine (2-aminoethanethiol))、5-氨基戊 酸（5-aminopentanoic acid)、6-氨基己酸（6-aminohexanoic acid)、3-馬來醯亞胺基苯曱酸（3-maleimidobenzoic acid)、苯駄（2 -苯並（C)咬味綱，phthalide，）、ct-取代的苯 酞（α-substituted phthalides)、羰基、縮路胺酯（aminal esters)、核酸（nucleic acids)和狀（peptides)等。 基團L1的一功能是根據情況在F、Η或J與搭檔分子 ® 之間提供空間上的分離，以免後者干擾（例如藉由立體阻 障效應或電效應）在F、Η或J的斷裂化學性。基團L1還 可用於將額外的分子量和化學官能團基引入接合體中。 通常’額外的分子量和官能基影響接合體的血清半衰期 和其他性質。因此，藉由仔細挑選間隔基團，可以製得 血清半衰期在一範圍内的接合體。可選用的是，一或多 個連接子L1可以是一種自消性基團（self-immolative Q group)，如後所述。 下標m是選自0、1、2、3、4、5和6的整數。多個 L1基團存在時，它們可是相同或不同的。 L4是一連接子部分，其可根據情況在F、Η或J與抗 體之間提供空間分離的連接子，以免I?、Η或J干擾到抗 體與抗原的結合，或防止抗體干擾F、H或J的斷裂化學 性。較佳是，L4利用包含所述部分或改變接合體之水解 速率的連接子來增大接合體的溶解性或減小其凝集性》 如在L1情況中，選用性地，L4是一自消性基團。在一實 83 200930407 施例中’ L是被取代的烧基、未被取代的烧基、被取代 的芳基、未被取代的芳基、被取代的雜烷基或未被取代 的雜烧基’任何所述基團都可以是直鏈狀、支鏈狀或環 狀。取代基例如可以是低級（c]_c6)烷基、烷氧基、烷硫 基、烧基氨基或者二烷基氨基。在一些實施例中，[4包 括非環狀部分。在另一實施例中，L4包括帶正電或負電 的氨基酸聚合物，如聚離胺酸或聚精胺酸。L4可包括聚 ❹ 合物，例如聚乙二醇部分。另外，舉例而言，L4可同時 包括聚合物部分和小分子部分。 在一較佳實施例中，L4包括聚乙二醇（peg)部分。L4 的PEG部分可為1到50個單元長。較佳地，peg含有1 到12個重複單元’更較佳為3到12個重複單元，更較 佳為2到6個重複單元，或甚至更較佳為3到5個重複 單元，最佳為4個重複單元。L4可僅含有peg部分，或 也可包括其他的未取代或未被取代的烷基或雜烷基。將 Ό PEG作為L4部分的一部分進行組合，可以提高複合物的 水溶性》另外，PEG部分可能在藥物和抗體接合時降低 凝集程度（aggregation)。 下標P為0或1;也就是說，L4的存在是選用性的。 當L4存在時，其至少具有兩個官能基根據情況，一官 能團連接至F、H或J中的一化學官能團，另一官能團連 接至抗體。基團L4之適宜化學官能團的實例包括羥基、 疏基、幾基、缓基、氨基、_、搭和疏基。由於抗體的 接合通常利用酼基（例如來自未氧化的半胱胺酸殘基，用 84 200930407 亞氨基硫烷（iminothiolane)使含有酼基的擴鏈物 (extension)加成至離胺酸殘基，或者二硫橋鍵的還原）、 氨基（例如來自離胺酸殘基）、醛基（例如來自糖苷側鏈的 氧化）或羥基（例如來自絲胺酸殘基），用於連接抗體的較 佳化學官能團是對前述基團具有反應性的官能團，其範 例為馬來醯亞胺（maleimide)、巯基、藤基、肼基、氨基 脲（semicarbazide)和羧基。以抗體上的疏基與L4上的馬 來酿亞胺組合為彳圭。 在一些實施例中，L4包括： Ο Ρ26·ρ25'
20 R 是選自氫（H)、被取代或未被取代的烷基、被取代 或未被取代的雜烷基和醯基中的基團。R25、R25,、R26 和R26’各自獨立地選自氫（H)、被取代或未被取代的烷 基、被取代或未被取代的雜烷基、被取代或未被取代的 芳基、被取代或未被取代的雜芳基和被取代或未被取代 的雜環烷基；S和t獨立為1至6的整數。較佳地，R2〇、 R25、R25’、R26和R26’是疏水性的❶在一些實施例中， r2G是氫（H)或烧基（較佳是未被取代的低級烧基）。在一些 實施例中，R25、R25,、R26和R26’獨立為氫（H)或烷基（較 佳是未被取代的C1-C4院基）。在一些實施例中，R2 5、 R25’、R26和R26’均為氫（H)。在一些實施例中，t是卜 且s是1或2。 85 200930407 肽連接子 如上所述，本發明的肽基連接子可由通式（L4)p—F— (L)m表示，其中F表示含有肽基的部分。在一實施例中， F部分包括一選用性的額外自消性連接子L2和一羰基， 對應於式（a)接合體：
X4-(L4)p-(AA1)c-(L2-c)〇_(Li)m_D 〇 在該實施例中，Ll、L4、P和m如上所述。X[是抗 體’ D是搭播分子。下標。為Q或！，l2如果存在，匕2 即表示自消性連接子。AAl代表-個或多個天然氨基酸 和/或非天然α-氨基酸；C為i到2〇的整數。在一些實施 例中’c為2至5的整數，或〇是2或3。 式（a)中，AA1的氨基端直接與L4相連，如果沒有[A， 則直接與X4相連。在一些實施例中，如L4存在，l4不 含直接與端相連的羰醯基團。 > 在另-實施例中，F部分包括—氨基和—選用性的間 隔基團且1/不存在（即m為零），對應於式（b)的接 合體： χ4-(L4)p-(M1)c-B-(L3)〇—D。 在該實施例中，X4、D、L4、AA1、4PM^。 下標。為0或卜L3如果存在，則l3是含有一級胺或二 級胺或緩基官能的間隔基團，並且L3的胺基與〇的側鏈 m基官能基形成酿胺鍵，或者L3的幾基與〇的側鍵胺基 86 200930407 官能基形成醯胺鍵。 自消性連接子（Setf-Immolative 自消連接子是一種雙官能性化合物部分，它能將兩個 分開的化學部分共價連接成一個通常穩定的三節式分子 (tripartate molecule )，藉由酶來切斷該三節分子而釋放 出其中一個該間隔開的化學部分；在酶切割之後，分子 的其餘部分中發生自發斷裂而釋放出另一個間隔開的化 學部分。根據本發明，自消性間隔子（self_imm〇lative spacer)的其中一端共價連接至該肽部分，而在其另一端 共價連接至藥物部分的化學反應性位置，藥物部分的衍 化反應（derivatizati〇n)會抑制藥理活性，以將肽部分與藥 物部分間隔開來且共價連接成一個三節式分子，該分子 在標靶酶（target enzyme)*存在的情況下是穩定的且無 藥理活性，但藉著該標靶酶在間隔子部分（邛扣” 〇 moiety)與肽部分共價連接的鍵處進行酶催化性切割， 可使肽部分從三節式分子中釋放出來。此酶催化性切割 又能夠啟動間隔子部分的自消性質，且引發間隔子部分 與藥物部分間之共價連接鍵的自發性斷裂，而釋放出藥 理活性形式的藥物。例如，參見Carl et al，J Med Chem， 24 (3), 479-480 (1981) ； Carl et al., WO 81/01145 (1981)； T〇ki et al., J. 〇rg. Chem. 67, 1866-1872 (2002) ； Boyd et al· WO 2005/112919 ;以及 Boyd et al· WO 2007/03 865 8， 八内谷藉由引用方式併入本文中以供參考。 87 200930407 一特別佳的自消性間隔子可以由式（c)表示：
氨基苄基（aminobenzyl)的芳環上可取代有一或多個 「K」基團》「κ」基團是芳環上的取代基，其取代氫， 而與構成環結構之四個未被取代碳的其中―者相連。「κ」 基團可以是單原子，如齒素，也可以是多原子基團如 烧基.、雜烧基、氨基、X肖基（nitro)、經基、燒氧基、鹵 烷基和氰基。每個K獨立選自於由被取代的烷基、未被 取代的烷基、被取代的雜烷基、未被取代的雜烷基、被 取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的雜芳基、未被 取代的雜^•基、被取代的雜環燒基、未被取代的雜環烧 基、鹵素，no2、nr21r22、NR21COR22、〇C〇NR21R22、 OCOR21和OR21所組成的群組中，其中R21和r22獨立地 選自於由氫（Η)、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取 代的雜燒基、未被取代的雜烧基、被取代的芳基、未被 .. 取代的芳基、被取代的雜芳基、未被取代的雜芳基、被 取代的雜環烷基和未被取代之雜環烷基所組成的群組 中。示例性的Κ取代基包括，但不限於，氟（F)、c卜Br、 I ' N〇2 ' OH ' OCH3 ' NHCOCH3 ' N(CH3)2 ' NHCOCF3 和甲基。對於「Kj」’ i是〇、i、2、3或4中的整數。在 一較佳實施例中，i是〇。 上述結構的醚氧原子連接至羰基（未示出）。NR24官能 88 200930407 團與芳環相連的線表示該胺官能基團可能連接至該成環 狀且未被-CH2_〇-所取代之5個碳令的任一個。較佳地， X的NR24官能基團在-CHh-O-的對位處與芳環共價連 接。R24是選自於由氫（H)、被取代的烷基、未被取代的 炫基、被取代的雜烷基和未被取代之雜烷基所組成的群 組中的一基團。在一具體實施例中，R24為氫（H)。 在一實施例中’本發明提供上式（a)的肽連接子，其中 F包含以下結構：
其中，R24、AA1、K、i和e的定義如前所述。 在另一實施例中’上式（a)的肽連接子包含具有以下結 構的-F-(L1 )m-: (AA1)C-
其中R24、AA1、K、i和e的定義如前所述。 在一些實施例中，自消性間隔子Ll或L2包括：
(R1\ 9獨立地選自氫（Η)、被取代或未 其中各R17、R18和Ri9 被取代的烷基、被取代或未被取代的雜烷基以及被取代 89 200930407 或未被取代的芳基，其中W為〇到4的整數。一些實施 例中，R17和R1*獨立地為氫（Η)或烷基（較佳為未被取代 的q-CU烷基）。較佳地，R”和尺18為q的烧基， 如甲基或乙基。一些R17實施何中，w為〇。實驗證明， 該特定之自消性間隔子的成環速度相對較快。 在一些實施例中，L1或L2包括：
(R19)w 其中，R17、R18、R19、R24和κ的定義如前所述。 間隔基團（spacer Groups) 間隔基團L3的特徵在於包括一級胺（primary amine)或 二級胺（secondary amine)或羧基官能團，並且l3的胺基 與D的侧鍵缓基官能基形成醯胺鍵或是L3的羧基與〇 ❹ 的側鏈胺基官能基形成醯胺鍵。L3可選自於由被取代或 未被取代的烷基、被取代或未被取代的雜烷基、被取代 或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜芳基或被取 代或被取代的雜環院基所組成的群組中。在一較佳實施 例中，L3包括芳香族基團。更佳地，L3包括苯甲酸基團、 苯胺基團或》引哚基團。可作為_L3_NH_間隔子之結構的非 限制性實例包括下列結構： 90 200930407
其中Ζ選自〇、s和NR23中的一成員，並且其中R23 是選自氫（Η)、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被 φ 取代的雜烧基和醯基中的基團 包含L3的本發明連接子在切割時，l3部分仍然與藥物 D連接。因此’選擇L3部分，以使其與D的連接不會顯 著改變D的活性。在另一實施例中’藥物部分d本身可 作為L3間隔子。例如，在一實施例中，藥物d是多卡黴
素（duocarmycnn)的诉生物，其令藥物部分即為L3間隔 子。該實施例的非限制性實例包括結構内之 具有選自其中一種以下結構的該些實例：
91 200930407
其中，Z是ο、s和NR23，其中R23是氫、被取代 或未被取代的烧基、被取代或未被取代的雜烷基或酿 基；各結構上的NH2基團與（AAi)e反應形成_(aV)c_nh_。 肽庠列（AA1、 基團AA表示單個氣基酸，或多個藉由醯胺鍵（amide bond)連接在一起的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸和 /或非天然α氨基酸。它們可為L或D構型。在一實施例 中，使用至少三個不同的氨基酸。在另一實施例中，僅 僅使用兩個氨基酸。 術語「氨基酸（amino acid)」是指天然氨基酸和合成氨 基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物，它們作用方 式與天然氨基酸類似。天然氨基酸是被遺傳密碼子編碼 的氨基酸’以及隨後被修飾的那些氨基酸，如經基脯胺 酸 （hydroxyproline) 、 γ-羧基谷胺酸酯 (鹽）（γ-carboxyglutamate)、瓜胺酸（citruUine)和鄰磷酸絲 胺酸（O-phosphoserine)。氨基酸類似物是指具有與天然 92 200930407 氨基酸相同之基本化學結構的化合物，即，α碳與氫、 羧基、氨基和R基團連接，如高絲胺酸（h〇m〇serine)、正 白胺酸（n〇HeUcine)、甲硫胺酸亞砜（methionine SUlf〇Xlde)、甲硫胺酸甲基錡（methionine methyl suifonium)。這些類似物具有經過修飾的r基團（如正白 〇 ❹ 胺酸）或經過修錦的肽骨架，但保留與天然氨基酸相同的 基本化子、，.α構。尤其可以使用的氨基酸為瓜胺酸，它是 精胺酸的前驅物，與肝臟中尿素的合成有關。氨基酸模 擬物疋札其結構與氨基酸通常的化學結構不同但是作用 方式與天然氨基酸類似的化學化合物。術語「非天然氨 基酸（unnatural amino acid)」表示上述二十個天然氨基酸 的D」立體化學形式。進一步而言，術語「非天然氨基 酸」包括天然氨基酸的同系物和天然氨基酸的合成修飾 形式σ成修飾形式包括，但不限於具有縮短或延長 不超過2個碳原子之伸烷基鏈的氨基酸，包括任選取代 有方基的氧基酸和包括_化基團（較佳為_化烧基和芳 基）的氨基酸。當連接至本發明的連接子或接合體時，氨 基酸為「氣基駿侧赫 Tf^ JL· ^ ^ J鍵J Φ式，氰基酸之羧酸基團的位置 被酮(c(0))基團取代。目此，例如丙胺酸側鏈為 -C(0)-CH(NH2)-CH3 等等。 狀序歹J (AA )c在功能上是單個氨基酸時）或多個 藉由1醯胺鍵連接在—起之氨基酸的醯胺化殘基。狀序列 (AA〗)C較佳選擇可利用酶在生物系統中所感興趣的位置 處進行酶催化切斷者。例如，對於已結合至細胞但是未 93 200930407 被内化的接合體，選擇可刺 、俘j才】用胞外基質中之蛋白酶來切
斷的狀，蛋白酶例如士财μ、此_»_A j如由附近瀕於死亡之細胞釋放的蛋白 酶或與腫瘤有關的I自給，##^, j J贫白酶使侍肽在細胞外被切斷。對 於設計成可被細胞内化的接合體，序列（AAl)c較佳選擇 可被胞飲小體（end〇some)蛋白酶或溶酶體蛋白酶切斷 者。肽中的氨基酸數目可為i至2〇個；然而較佳包含j 至8個氨基酸，含丨至6個氨基酸或1、2、3或4個氨
基酸的（AA )e。可被特定多個酶或酶族切斷的肽序列在 本領域中是公知的β 較佳是’（AA^c包含一段氨基酸序列（「切斷識別序列 (cleavage recognition sequence)」），該序列是被蛋白酶 切斷的位置。許多蛋白酶切斷序列在本領域中是公知 的。例如’參見 Matayoshi et al· Science 247:954 (1990); Dunn et al.Meth. Enzymol. 241 ： 254 (1994) ； Seidah et al. Meth. Enzymol. 244175 (1994); Thornberry, Meth.
Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al.Meth.
Enzymol.244 : 595 (1994) ; Smith et al.Meth. Enzymol. 244 · 412 (1994) ； Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248 · 614 (1995), Hardy et al., in Amyloid Protein Precursor in Development, Aging, and Alzheimer's , ed. Masters et al. pp.190-198(1994)。 肽通常包含3至12(或更多）個氨基酸。特定氨基酸的 選擇至少部分取決於將用於切斷肽鏈的酶’以及取決於 肽鏈在體内的穩定性。合適的可切斷性肽之實例是 94 200930407 β-Ala—Leu-Ala-Leu (序列編號：27)。它可與一穩定基團 結合形成琥ίέ S蓝-β-Ala-Leu-Ala-Leu (序列編號：.30)。其 他合適的可切斷性肽的實例提供在下面引用的文獻中。 或者’可以使用包含單個氨基酸殘基的連接子，如W〇 2008/103 693中所公開者，其公開内容藉由引用方式併入 本文中以供參考。 在一較佳實施例中，選擇肽序列（AAi)e係因為它能夠 被溶S#體蛋白酶切斷’所述蛋白酶的實例包括組織蛋白 扭（cathePsin) B、C、D、Η、L 和 S。較佳地，肽序列（AA1)。 在體外能夠被組織蛋白酶Β切斷。雖然組織蛋白酶β是 溶S#體蛋白酶（lysosomal proteaste)，但在腫瘤組織周圍 的胞外基質中發現了一定濃度的組織蛋白酶B。 在另一實施例中’選擇肽序列（AAi)c是因為它可被一 腫瘤相關蛋白酶切斷（例如在腫瘤細胞附近胞外發現的 蛋白酶）’其實例包括募聚肽酶（thimet 〇ng〇peptidase， ❹ top)和cdio。或者，將序列（AAl)c設計成可被尿激酶 (urokinase)或類胰蛋白酶（tryptase)的選擇性切割。 作為一說明例，CD1〇，也被稱為腦啡肽酶 (neprilysin)、中性肽内切酶（neutral end〇peptidase，NEp) 以及疋常見的急性淋巴母細胞白血病抗原（calla)，其 是一種第二型細胞-表面鋅依賴型金屬蛋白酶。適宜使用 CD10的可切割受質包括Leu Ala Leu和jie-Ah Leu。 另說月例疋依據基質金屬蛋白酶（MMP)。其可能是 與腫瘤有關且最具特性的蛋白水解肖，MMp #活化作用 95 200930407 與腫瘤微環境具有明顯的相關性。尤其是，已經對可溶 性基質酶 MMP2 ( gelatinase A)和 MMP9 ( gelatinase B) 進行了深入研究，並且顯示出在包括腫瘤生長在内的組 織重建過程中，MMP2和MMP9會被選擇性活化。已設 計出可被MMP2和MMP9切斷的肽序列，並且用來進行 下列物質的接合體測試：葡聚糖（dextran)和氨甲嗓吟 (methotrexate)(Chau et al., Bioconjugate Chem. 15 :
931-941 (2004))，聚乙二醇（PEG，polyethylene glyc〇i) 和多柔比星（Bae et al·, Drugs Exp. Clin. Res. 29: 15-!3 (2004));以及白蛋白（albumin)和多柔比星（Kratz et al.，
Bioorg. Med. Chem. Lett. 11 : 2001-2006 (2001))。可使 用 MMP的合適序列實例包括但不限於：
Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly (序列編號：21)、 Gly-Pro-Leu-Gly-Val (序列編號：22)、 Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln (序列編號:23)、 Pro-Leu-Gly-Leu (序 列編號：24)、
Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Leu-Ser-Gln (序列編號：25)和
Gly-Pro_Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-Gln (序列編號：26)(例 如，參見上文引用的文獻以及 Kline et Mol
Pharmaceut. 1 : 9-22 (2004)和 Liu et al.，Cancer Res 60 ： 6061-6067 (2000)) ° 又一實例是第二型跨膜絲胺酸蛋白酶（type h transmembrane serine proteases) ° 這一族群的酶包括作不 限於例如 hepsin、睾蛋白（testisin)和 TMpRSS4。 96 200930407
Gln-Ala-Arg是一受質序列，其可作為蛋白裂解酶 (matriptase)/MT-SP 1 (在乳腺癌和卵巢癌中過度表現）的 受質，Leu-Ser-Arg可作為hepsin(在攝護腺和其他一些 腫瘤類型中過度表現）的受質。（例如，參見Lee et al.，J. Biol. Chem. 275: 36720-36725 以及 Kurachi andYamamoto, Handbook of Proeolytic Enzymes Vol.2, 2nd edition(Barrett AJ, Rawlings ND &Woessner JF, eds) pp. 1699-1702(2004))。 ^ 適合用於本發明之接合體中的適宜、但非限制性的肽 序列實例包括 Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、 Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、 Ile-Cit、Trp、 Cit、Phe-Ala、Phe-N9-tosyl-Arg、Phe-N9-nitro-Arg、 P he -Phe-Ly s 、 D-Phe-Phe-Ly s 、 Gly-Phe-Ly s 、
Leu-Ala-Leu 、 Ile-Ala-Leu ' Val-Ala-Val 、
Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu (序列編號：27)、 ©Gly-Phe-Leu-Gly (序列編號：28) 、 Val-Ala,
Leu-Leu-Gly-Leu (序列編號·· 29)、Leu-Asn-Ala 和 Lys-Leu-Val。較佳的肽序列是 Val-Cit 和 Val-Lys。 在另一實施例中，最接近藥物部分之位置處的氨基酸 選自於由 Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gin、Glu、Gly、 lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 和Val所組成的群組中。在又一實施例中’最接近藥物 部为之位置處的氣基酸選自於由Ala、Asn、Asp、Cys、
Gin、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、 97 200930407
Trp、Tyr和Val組成的群組中。 無需過度試驗的情況下，本領域的技術人員可迅速評 估肽序列的排列，以判斷其在本發明中的效用。例如， 參見 Zimmerman ，M.，et ai., (1977) Analytical
Biochemistry 78： 47-51 ； Lee, D., et al., (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9 : 1667-72 ;和 Rano, T.A·，et al·，（1997) Chemistry and Biology 4 : 149-55。 本發明的接合體可選用性地（〇pti〇nally)包含兩個或兩 ^ 個以上的連接子。這些連接子可能相同.或不同。例如， 肽基連接子可用於連接藥物和配體，第二肽基連接子可 連接診斷剤和複合物。額外連接子的其他用途包括用來 連接分析試劑、生物分子、靶向試劑和抗體_搭檔分子複 合物的可偵測性標記。 肼連接子（ΒΠ ◎ 在另一實施例中，本發明的接合體包括肼自消性連接 子（hydrazine self-immolative linker) ’ 其中所述接合體具 有以下結構：
X4-(LVH-(L1)m-D 其中，D、L·〗、l/、p、m和X4如上所H、土 上所述者，並在此處 進一步說明，Η是包含以下結構的連接子：
98 200930407 其中η,是1至ίο的整數；η2是ο、1或2 ;各個R24 是獨立選自於由Η、被取代的烷基、未被取代的烷基、 被取代的雜烷基和未被取代的雜烷基所組成之群組中的 基團；Ϊ是一鍵（即’骨架上的礙原子與臨近氮之間的鍵） 或以下結構： R24 R24
〇 其中，是〇或 是 1、2 或 3。 在一實施例中，笨環上的取代是對位（para)取代。在較 佳實施例中，…是2、3或4’或„丨是3。在較佳實施例 令，n2疋1。在較佳實施例中’ j是鍵(即’骨架上的碳 原子與臨近氮之間的鍵）。一態樣中，肼連接子Η在切斷 時可形成6元環的自消性（seif imm〇iative)連接子，例如 當〜是〇和〜是2時。另―態樣中’肼連接子η可在 :斷時形成…元環的自消性連接子。在其他態樣 、’切斷時’ Η形成一個5元環的自消性連接子 成7元環的自消性連接子，或Η形成 / 性i亵A 2 i U )疋％的自消 運接子和一個6元環的自消性連接 切斷時所开彡&夕# + , 斷裂逮率受到 呵-所形成之％大小的影響。因此， 祛衣 攸艨所需的斷裂 、〃’可選擇切斷時所形成的適宜大小的環。 另一種肼結構H具有下式： 99 200930407
I 其中q是0、1、2、3、4、5或6;各R24是獨立選自 由氫（Η)、被取代的炫基、未被取代的烧基、被取代的雜 烷基和未被取代的雜烷基所組成之群組中的基團，該肼 結構也可形成五元、六元或七元環，可以加入其他成分 以形成多個環。 WO 2〇05/1 12919公開了各種肼連接子的製備、斷裂化 學性和環化動力學，所公開的内容藉由引用方式納入本 文中以供參考。 二硫化物連接子fj、 在又一實施例中，連接子包括酶切割性（enzymatically cleavable)的二硫化物基團。在一實施例中，本發明提供 一種具有式（d)結構的細胞毒性抗體-搭構分子化合物：
X4 D 其中，0、1^、[4、卩、111和乂4如上所述者，並在此處 進一步說明，J是包括具有以下結構之基團的二硫化物連 接子：
其中’各個R24獨立地選自於由氫（H)、被取代烷基、 未被取代的烷基、被取代的雜烷基和未被取代的雜烷基 roo 200930407 所組成之群組中的一基團；各艮是獨立地選自於由被取 代的烷基、未被取代的烷基、被取代的雜烷基、未被取 代的雜烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代 的雜芳基、未被取代的雜芳基、被取代的雜環烷基、未 被取代的雜環烧基、_素·、n〇2、nr21r22、nr21cor22、 〇CONR21R22、OCOR2 和OR21所組成之群組中的基團
其中，R21和R22獨立地選自於由氫（H)、被取代的烧基、 未被取代的烷基、被取代的雜烷基、未被取代的雜烷基、 被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的雜芳基、.未 被取代的雜芳基、被取代的雜環烷基和未被取代的雜環 烧基所組成之群組中；1是〇、1、2、3或4的整數；d 是0、1、2、3、4、5或6的整數。 二硫化物連接子的芳環上可取代有一個或多個「K」基 團。「K」基團取代氫，而連接至構成環結構之四個未被 取代碳的其中一個。「K」基團可以是單原子，如齒素， 也可以是多原子基團，如烧基、雜烧基、氨基、石肖基、 經基、院氧基、i烧基和氰基。示例性的κ取代基包括， 但不限於，氟（F)、C1、Br、卜 N〇2、〇H、〇叫、nhc〇ch3、 n(ch3)2、NHCOCF3和甲基。對於「Ki」，i 是 〇、卜2、 3或4中的整數。在一具體實施例中，i是〇。 在一較佳實施例中，連接子包含下式的酶切割性二硫 化物連接子： 101 200930407 9 R\4r24
如上所述者
其中，L·4、X4、P和R ’ d 是 0、1、2、 3、4、5或6。在一特定的實施例中 Y ’ d是1或2。 更具體的二琉化物連接子如下式.所厂、
較佳地，d是1或2 ’各κ是氫（η) 〇 另一種二硫化物連接子如下士·^- 較佳地，d是1或2，各K是氫（η)。 在各種實施例中，二硫化物位在胺的鄰位。在另一具 體的實施例中’ a是0。在較佳實施例中，r24獨立地選 © 自氫（Η)和CH3中。 WO 2005/1 1 2919公開了如上述的二硫化物連接子的製 備和使用’其公開内容藉由引用方式併入本文中以供參 考。
對於細胞毒素、連接子和與抗體接合之治療劑類型的 更多討論’還可參見US 7087600 ; US 6989452 ; US 7129261 ; US 2006/0004081 ; US 2006/0247295 ; WO 02/096910 ; WO 2007/051081 ; WO 2005/1 12919 ; WO 102 200930407 2007/059404 ； WO 2008/083312 ； WO 2008/103693 ； Saito et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 * 1 99-2 1 5 ; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52 : 328-337 ; Payne. (2003) Cancer Cell 3 ： 207-212 ； Allen (2002) Nat. Rev. Cancer 2 · 750-763 ； Pastan andKreitman (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3 : 1089-1091 ; Senter andSpringer (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53 : 247-264，以上各文獻 藉由引用方式併入本文中以供參考。 φ 作為搭檔分子的細胞奏素 在一態樣中，本發明的特徵在於抗體接合至一搭檔分 子’例如細胞毒素、藥物（如免疫抑制劑）或放射性毒素。 該接合體也被稱為「免_疫毒素（im mu no toxin s)」。細胞毒 素或細胞毒性劑包括對細胞有害（如殺死）的任何試劑。 此處，「細胞毒素（cytotoxin)」包括前驅藥形式並在體内 ⑩ 轉化為實際有毒物種的化合物。 本發明的搭檔分子實例包括紫杉醇（tax〇l)、松胞菌素 B(cytochalasin B)、短桿菌肽 £>(gramicidin D)、溴化乙鍵 (ethidium bromide)、吐根鹼（emetine)、絲裂黴素 (mitomycin)、依託泊苷（et〇p〇side)、替尼泊苷 (tenoposide)、長春新驗（vincristine)、長春驗 (vinblastine)、秋水仙素（c〇ichicin)、多柔比星 (doxorubicin)、柔紅黴素（daun〇rubicin)、二羥基炭疽菌 素一酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽酉昆 103 200930407 (mitoxantrone)、光輝黴素（mithramycin)、放射菌素 D(actinomycin D)、1-去氫睾酮（Ι-dehydrotestosterone)、 膽皮質素（glucocorticoids)、普魯卡因（procaine)、丁卡因 (tetracaine)、利多卡因（lidocaine)、普萘洛爾（propranolol) 和嘌呤黴素（puromycin)及其類似物或同系物。搭檔分子 的實例還包括例如抗代謝物（如，曱氨蝶吟 (methotrexate)、6-疏基嗓呤（6-mercaptopurine)、6-硫鳥 嘌呤（6-thioguanine)、阿糖胞苷（cytarabine)、5-氟尿嘧咬 氨氮烯σ米胺（5-fluorouracil decarbazine))、烧基化試劑 (如’氮芥（mechlorethamine)、沙奥特帕（thioepa)、苯丁 酸氮芬（chlorambucil)、美法侖（melphalan)、卡莫司汀
(carmustine，BSNU)和洛莫司汀（lomustine，CCNU)、環 磷醯胺（cyclophosphamide)、白消安（busulfan)'托布萊星 (音譯 tubulysin)、二溴甘露醇（dibromomannitol)、鏈腺徽 素（streptozotocin)、絲裂黴素 C(mitomycin C)、順鉑 (cisplatin)、蒽環類抗生素（anthracyclines，例如柔紅比 星（以前為柔紅黴素）和多柔比星），抗生素（例如，更生黴 素（以刖為放線鹵素）、博來黴素（bieomyCin)、光輝黴素 和安麯黴素（anthramycin，AMC))，以及抗有絲分裂劑（如 長春新鹼和長春鹼）。其他可與本發明抗體接合的搭檔分 子較佳範例包括刺孢黴素（calicheamicins)、美登素 (maytansines)和阿裡斯達汀（讓丨仙如）及其衍生物。 搭檔分子的較佳實例是CC-1065的類似物和衍生物。 其結，構相關的多卡黴素（du〇carmycins)。雖然具 104 200930407 有強效而廣泛的抗腫瘤活性，但因CC-1 065會造成試驗 動物的遲發性死亡，故不能用於人類，進而促進研究具 有更好治療指數的類似物或衍生物。
CC-1 065的許多類似物和衍生物和多卡黴素在本領域 中是公知的。已對許多化合物的結構、合成和性質的研 究進行 了回顧。例如，參見 Boger et al.，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 : 1438 (1996);和 Boger et al.，Chem. Rev. 97: 787 (1997)。關於CC-1065之類似物或衍生物的其他 公開文獻包括：US 5101038、US 5641780、US 5187186、 US 5070092、US 5703080、US 5070092、US 5641780、 US 5101038 、 US 5084468 、 US 5739350 、 US 4978757 、 US 5332837 和 US 4912227、WO 96/10405 以及 EP 0537575 A1 〇 在特別佳的態樣中，搭檔分子是具有下式（e)結構的 CC-1065/多卡黴素類似物：
其中，環系統A是選自於被取代或未被取代的芳基、 被取代或未被取代的雜芳基和被取代或未被取代的雜環 烧基中。示例性的環系統A包括苯基和吡ij各基。 符號E和符號G獨立地選自氫(H )、被取代或未被取代 105 200930407 的烧基、被取代或未被取代的雜烷基、雜原子、單鍵中； 或者選擇性地，E和G可連接形成一環系統，該環系統 選自被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜 芳基以及被取代或未被取代的雜環烷基中。 符號X表示選自〇、S和NR23中。R23是選自氳（H)、 被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的雜烷 基、和醯基中。 符號R3表示選自（=〇)、SR11、NHR11和OR11中的一基 ^ 團’其中，R11是氫（H)、被取代或未被取代的烷基：被 取代或未被取代的雜烷基、單磷酸根、二磷酸根、三鱗 酸根、磺酸根、醯基、C(〇)R12 R13、^(0)0^2、 c(0)nr12r13、P(0)(0R12)2、c(0)CHRl2Rl3、SR12 或
SiR12R13R14。符號R12、R"和r14獨立地表示氫、被 取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的雜烷基以 及被取代或未被取代的芳基，其中Ri2* Rn及與之相連 〇 的氮原子或碳原子可選用性地連接而形成一被取代或未 被取代的雜環烷基環系統，該環系統為4至6元環並且 可依需求包含2個或兩個以上的雜原子。 R、R 、R和R5’獨立地選自氫（H)、被取代或未被取 代的烷基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取 代的雜芳基、被取代或未被取代的雜環烷基、南素、 N02、NR15R,6、NC(〇)R15、0C(0)NR丨 5R〗6、〇c(〇)〇Rl5、 C(〇)Rl5、SRl5、〇Rl5、CRl5=NRl6 和 〇(CHAN(CH3)2 中 的一基團，其中，n為1至20的整數，或者R4、R4,、 106 200930407 R和R5,的任何相鄰對（pair)與其所連接的碳原子共同形 成4至6員之被取代或未被取代的環絲或雜環烧基環 系統I15和m立地表示氫（H)、被取代或未被取代 的烧基、被取代或未被取代的雜院基、被取代或未被取 代的芳基、被取代或未被取代的雜芳基、被取代或未被 取代的雜環烷基以及被取代或未被取代的肽基，其中， 選用性地’ R15和Ru及其所連接的氮原子共同形成一被 取代或未被取代的雜㈣基環线，該㈣統為4至6 元環系統’’並且可選用性地包含兩個或更多個雜原子。 一示例性的結構是苯胺（aniline)。 R、R、R’、r5和R5’其中一者將細胞毒素連揍至本 發明的連接子或酶切割性受質（substrate)，如此處所述， 例如連接至L1或L3 (如果存在），或連接至F、H或j。 R疋存在或不存在的單鍵。當R6存在時，R6和R7連 接形成環丙基環。R7是CHs-X1或_CH2-。當R7是-CH2_ Q 時’它是環丙烷環的一成分。符號X1表示一離去基 (leaving group)，如鹵素（例如C1、Br或氟（F))。以不會 違反化學價鍵原理的方式來解釋R6和R7的組合。 X可以是任何離去基。有用的離去基包括，但不限於， 鹵素疊氮化物（azides)、石夤酸西旨（suifonic esters，例如 烧基續醯基、芳基磺醯基）、氧鏽離子（〇x〇nium i〇ns)、 過氣酸烷基酯（alkyl perchlorates)、氨基烷基磺酸酯 (ammonioalkanesulfonate esters)以及烷基氟代續酸酯 (alkylfluorosulfonates)和氟化化合物（例如三氟甲磺酸鹽 107 200930407 (triflates)、全氟甲磺酸越。 — (tresylates))# &以）、二氟乙烷磺酸鹽 (咖eS))4。可作為離去基的特定鹵素 和 B**。 \
G 六元環中的曲線表示該環可能具有一或 度，它可能是芳環。因此，環結構（如以下所示… 相關結f始於式（f)的範圍内： 、 乂 I 厂χ1 y 和κ Ύ 〇 JVW 如也 “ . （f)。 在-實施例中，Rn包括χ5部位，其不會自我環化’並 將藥物連接至L1或L3(如果存在），或連接至F、Η或卜 X5部位較佳為可以使用酶來切斷，並在切斷時，提供活 性藥物。作為一實例，Rn可具有以下結構（其右側接合至 藥物的其餘部分）：
ν' ο ο 在一些實施例中，R4、R4,、R5和R5’中的至少一個將所 述藥物連接至L1(如果存在），或連接至f、h、J或X2, 並且 R3 選自 SR11、NHR11 和 OR11。R11 選自 _s〇(〇H)2、 -P〇(OH)2、-AAn、-Si(CH3)2C(CH3)3、-C(0)0PhNH(AA)m、
108 200930407
或任何其他糖或多種糖的組合、、'丫Ο〇^ γ
Ν-
Ν 和 ❿ 及其藥學上可接受的 頌具中η是1至1 〇範圍中的 意整數，m是丨至4銘m + 關r的妇 疋1至4粑圍中的任意整 圍中的任意整數，AA县右^ 6 #E 疋任何天然或非天然氨基酸。盆中 式⑷的化合物是經由R4、R4’H r、接合，_ 包括一可斷裂的阻斷基團（Gleavable blQeking g咖p)，該 基團可阻斷該化合物的細胞毒性活性，但是#其處在預 期作用位點處的條件T時，#由—機制來切斷該阻斷基 團，並且該機制與用來切斷連接細胞毒素和抗體之連接 子的機制不相同。藉由這種方法，如果在血漿中存在接 合體的偶然性斷裂’該阻斷基團則可削弱所釋放之細胞 毒素的細胞毒性。例如，如果接合體具有腙連接子或二 硫化物連接子，則阻斷基團可以是酶切斷性 (enzymatically cleavable)的醯胺。或者，如果連接子是 蛋白酶可切割的肽基，則阻斷基團可以是被羧酸g旨酶 (carboxyesterase)切割的酯或氨基甲酸酯。 109 200930407 例如，在一較佳實施例中，D是具有結構（j)的細胞毒 素： R2
上式（e)中所說明者。z為選自〇、s和nr23中的一成員， 其中R23是選自氫（H)、被取代或未被取代的烷基、被取 代或未被取代的雜烷基和醯基中的其中一者。 R1是氫（H)、被取代或未被取代的低級烷基、c(〇)R8 或C02R8，其中R8是選自NR9Rl〇和〇R9中的一基團， 其中R9和R1G是獨立地選自氫（H)、被取代或未被取代的 院基以及被取代或未被取代的雜烧基中。 R疋氫（H)、被取代或未被取代的低級烷基或 C(〇)R8 ’其中R8是選自NR9R10和〇r9中的基園，其中 R9和R1G是獨立地選自於氫（H)、被取代或未被取代的烷 基 '被取代或未被取代之雜烷基中的基團。 R是氫（H)、被取代或未被取代的低級烷基、未被取代 的雜烷基、氰基（cyano)或烧氧基；R2,是氫（H)、被取代 或未被取代的低級烷基或未被取代的雜烷基^ R3、R4、R4’、R5或R5’其中一者將細胞毒素連接至Li 或L3(如果存在），或連接至F、η或j。 110 200930407 另一實施例具有下式：
以上式（e)中所說明者。z是選自〇、s和nr23中的一成 員，其中R23是選自氫（H)、被取代或未被取代的烷基、 被取代或未被取代的雜烷基和醯基中的一基團。 R34是C(=0)R33或Cl_C6烷基，其中r33選自氫（H)、 被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的芳基、 被取代或未被取代的雜芳基、被取代或未被取代的雜環 烷基、函素、N02、NR15R16、NC(0)R15、〇C(〇)NR15R16、 〇C(0)〇R〗5、C⑼Rl5、sR15、〇Rl5、cR15 = NR16 和 〇(CH2)nN(CH3)2，其中n是i至20之間的整數。Rls和 R獨立地表示氫（H)、被取代或未被取代的烷基、被取 代或未被取代的雜烧基、被取代或未被取代的芳基、被 取代或未被取代的雜芳基、被取代或未被取代的雜環烷 基和被取代或未被取代的肽基，其中，選用性地，尺j5 和R6及與其所連接的氮原子共同形成一被取代或未被 取代的雜環院基環系統，該環系統為4至6元環，並且， 選用性地（opti〇nally)包含兩個或更多雜原子。 較佳者’ A是被取代或未被取代的笨基，或是被取代 或未被取代的吡咯基。此外，本文中針對Rll所說明的 111 200930407 任何取代基選擇也適用於R33。 較槽分子具有式⑴表示的結構 ίι ί \ m ° 0 〇
式(I)中’ PD表示前驅藥基團(有時也稱為保護基團” 化合物（I)在原位水解（較佳為酵素催化性水解）從而釋放 出式（II)的化合物。本領域的技術人員可認知到，化合物 式（II)屬於 CBI 化合物（Boger et ai，J 〇rg c/2ew 2〇〇1， 66，6654-6661，和 Boger et al.，US 2005/0014700 A1 (2005))。CBI化合物於原位（或者當施用于患者時，為體 内）轉化成為它們的環丙基衍生物，如化合物（ΠΙ)，而與 DNA的小溝槽結合’然後在腺嘌呤基團上院基化dna，
合適前驅藥基團PD的非限制性實例包括酯類、氨基 曱酸酉旨（鹽）、鱗酸鹽和醣普，如下圖所示： 112 200930407
較佳的前驅藥基團PD是：氨基曱酸酯 (鹽）（carbamate，以上述的前五個結構為例），其可被緩基 酯酶（carboxyesterases)水解；磷酸酯（鹽）（上述第六個結
構）’其可被驗性構酸酶水解；以及β _葡糖酸酸衍生物， 其可被β-葡糖搭酸酶（β-glucuronidase)水解。特別佳的搭 檔分子是式（IV)表示的氨基曱酸醋（鹽）前驅藥基團： CI、 _____
ϋ為搭檔分子的標誌物
當搭檔分子是一種標諸物（marker)時，它可以是任何具 有或產生可偵測物理或化學性質以表明其存在於特定組 織或細胞中的部分（moiety)。標誌物（有時也稱為報導基 團）已經在免疫測定、生物醫學研究和醫療診斷領域得到 充分發展。可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化 學、電學、光學或化學手段來偵測標總物。其實例包括 磁珠（如DYNABEADSTM)、螢光染料（如螢光素異硫氮 酸酉旨（fluorescein isothiocyanate)、德州紅（Texas red)、睫 113 200930407 基桃紅精（或稱玫瑰紅’ rhodamine)等等）、放射性標記（如 n 、"C或32?)、酶（或稱酵素，例如辣^過氧 化酶（horse radish peroxidase)、鹼性磷酸酶（aikaHne phosphatase)以及常用於ELISA的其他酶），以及比色標 記，例如膠態金或有色玻璃或塑膠珠（如聚苯乙烯、聚丙 烯、膠乳等）。 該標誌物較佳選自於由放射性同位素、螢光劑螢光 劑前驅物、發色團、酶及其組合所組成之群組中的一員。 ^ 適宜的酶實例為辣根過氣化酶、鹼性磷酸酶、β_半乳糖 苷酶（β-galactosidase)和葡萄糖氧化酶 oxidase)。螢光劑包括螢光素（flu〇rescein)及其衍生物、 鹽基桃紅精及其衍生物、丹磺醯（dansyl)、傘形酮 (umbemfer〇ne)等。化學發光化合物包括螢蟲素（iuciferin) 和 2,3-二氫酞嗓二酮（2,3_dihydr〇phthalazinedi〇n㈣，例 如發光胺（luminol)。對於可用的各種標記或信號產生系 g 統的回顧，參見US 4391904。 可以藉由間接手段來連接標誌物：配體分子（如生物素） 與抗體共價連接。然後該配體與另一分子（如鏈黴卵白 素，streptavidin)結合，該分子本身可即為可偵測系統， 或該分子可肖-信號系統（如可備測酶、勞光化合物或化 學發光化合物）共價連接。 接合體的督你丨 適合與本發明抗體接合的搭檔分子_連接子組合，其具 Π4 200930407
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24之間的整數。R，無論出現在何處，其為
每一個前述化合物均具有馬來醯亞胺基團（maleimide group)，且容易經由其上的疏基（sulfhydry 1 group)接合至 抗體。 藥物組合物 120 200930407 另l樣中，本發明提供—種藥物組合物，其包括本 發明之接合體與藥學可桩為 ' ，、眾予』接文载劑，以及選用性的其他活 性或非活性成分。 本發明的藥物組合物還可在組合療法中與其他試劑並 用例如，組合療法可包括本發明之抗RG-1接合體盥至 少了種其他抗發炎劑或免疫抑制劑的組合。以下將進一 步詳、.田說明可用於組合療法的治療劑實例。
匕處使用@藥學可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier)」包括任何和全部的生理相容性溶 劑、分散介質、塗料（coatings)、抗細菌劑和抗真菌劑、 等滲劑和吸收延緩劑等。較佳地，該載劑適用於靜脈、 肌肉内皮下、月腸外、脊趙和表皮給藥，例如注射或 輸液（infusion)。依據給藥途徑，可使用一材料來包覆該 活性化合物，以保護該化合物免於受到可能導致化合物 失活的酸和其他自然條件的影響。 本發明的藥物組合物可能包含一種或多種藥學可接受 的孤 藥學可接受的鹽（pharmaceutically acceptable salt)」是指一種鹽類，其能夠保有母化合物 compound)期望的生物活性且不會產生任何不希望有的 毒理作用（例如參見 Berge，S.M.，ei α/·，（1977) 乂 ^ : 1-19) °此種鹽類的實例包括酸加成鹽（acid addition salts)或驗加成鹽（base addition salts)。酸加成鹽 包括來自無毒性無機酸的鹽，例如鹽酸、硝酸、磷酸、 硫酸、氫溴酸、氫碘酸和亞磷酸等等，以及來自無毒性 121 200930407 有機酸的冑，例如月旨肪族單叛酸和二m酸、纟有苯基取 代基的烷醇酸（alkanoic acid)、羥基烷醇酸、芳香酸、脂 肪族和方香族磺酸等等。鹼性加成鹽包括來自鹼土金屬 (如納、鉀、鎮和|弓等）的鹽，以及來自無毒有機胺的鹽， 例如 Ν，Ν·-二苄基乙二胺（N，N,_dibenzyiethyiene_ diamine)、N-甲基葡萄糖胺（N_methyigiucamine)、氯普魯 卡因（chi〇r〇procaine)、膽鹼（ch〇Hne)、二乙醇胺 (diethanolamine)、氨茶鹼（ethylenediamine)和普魯卡因 (procaine)等。 ’ 本發明的藥物組合物還包括藥學可接受的抗氧化劑。 藥學可接受抗氧化劑的實例包括：（丨）水溶性抗氧化劑， 例如抗壞血酸（ascorbic acid)、半胱胺酸鹽酸鹽（cysteine hydrochloride)、硫酸氫鈉（s〇diuni bisulfate)、偏亞硫酸 氫鈉（sodium metabisulfite)和亞硫酸鈉（sodium sulfite) 等，（2)油洛性抗氧化劑，抗壞血酸掠橺酸g旨（asc〇rbyl palmitate)、丁基經基茴香醚（butylated hydroxyanisole， BHA)和 丁基經基曱苯（butylated hydroxytoluene，ΒΗΤ)、 卵磷脂（lecithin)、沒食子酸丙酯（pr0pyl gallate)和α-生育 酚（alpha-tocopherol)等；和（3)金屬螯合劑，例如檸檬酸 (citric acid)、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid ’ EDTA)、山梨醇'+(sorbitol)、酒石酸（tartaric acid) 和鱗酸（phosphoric acid)等。 合適的載劑實例包括水、乙醇、多元醇（如甘油、丙二 醇和聚乙二醇等)及其混合物、植物油（如橄欖油），以及 122 200930407 可注射的有機酯，例如油酸乙酯（ethyl 〇leate)。藉由使用 包覆材料（如即磷脂）、維持在分散液中所需顆粒的大小 以及使用表面活性劑，可保持適當的流動性。 所述組合物還可包含佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化 劑和分散劑。可同時藉著滅菌和添加抗細菌劑與抗真菌 劑，例如對羥苯甲酸（paraben)、三氯丁醇（chlorobutanol) 和苯酚山梨酸（phenol sorbic acid)等，來防止微生物的存 在。該組合物中也可包含等滲劑（如糖和氯化鈉等）可能 也係理想的。此外，可包含延遲吸收的試劑，例如單硬 脂酸鋁和明膠，以實現可注射藥物劑型的延長吸收。 藥學可接受的載劑包含無菌水溶液或分散液以及用於 即時配製無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。此類用於 藥學活性⑯f #之彳質和試劑的使用彳法在本領域中是 公知的。除了與活性化合物不相容的任何傳統介質或： 劑外，可考慮Μ發明《藥學虹合物中使用該些介質或 試劑。還可以加入辅助性活性化合物。 在製造和存儲條件下，該治療組合物通常必須是無菌 且穩定的。該組合物可以配製成溶液、微乳化劑、脂質 體（iiposome)，或者其他適於高藥物濃度的有序結構7載 劑可以是溶劑或如分散介質（包含 U叶 夕7L醇， 例如甘油、丙二醇和液狀聚乙二醇等），及其適宜的混人 物。藉著包覆(如即磷脂)、維持分散液中所需顆粒：： 小和使用表面活性劑，可保持適當的流動性。在許多情 況中，較佳地，組合物中包含等滲試劑，例如糖、：： 123 200930407 醇（如甘露醇、山犁醢、 人、 木醇）或虱化鈉。可藉由在組合物中包 3延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鹽和明膠），來延長可注 射性組合物的吸收。 可將所需量的活性化合物加入一適宜溶劑中且有必 要時可加入有以上列舉成分的其中一種或其組合，然後 進仃無菌微過濾來製備出無菌注射液。通常，藉由將活 性化合物加至無菌媒介物（包含基礎分散介質和所需的 φ ❹ 上述列舉之其他成分）中，以製備分散液。在用於製備 無菌注射液的無菌粉末時’較佳的製備方法是真空乾燥 和冷康乾燥（;東乾）一預先製備含有活性成份和任何所需 額外成分的無g過渡溶液，以製得活性成分與任何所需 額外成分的粉末。 用來與載劑組合製成單一劑型的活性成分用量會隨著 欲接受治療的受試者和特定給藥方式而變化，該活性成 分的用量通常是能產生治療效果的量。通常，纟咖％的 範圍内，與藥學可接受載劑組合的活性成分用量為從約 0.01%到約99%，較佳從約〇 1%到約7〇%，最佳從約 到約30%。 調節劑量方案以提供最適當的期望反應（如治療反 應）例如可以一次施用一大劑量（single bolus)，可以 隨時間分成多成多次用藥，或者根據治療情況的緊急程 度按比例減少或增加劑量。為了給藥方便及劑量—致， 以配製腸胃外用組合物尤為有利。此處使用的劑量單元 形式（dosage unit f0rm)是指物理上的不連續單位，適合 124 200930407 作為單位劑里以用於治療受試者；每個單位包含經計算 產生預』療效的預定量之活性化合物以及所需的藥學 載劑。本發明的劑量單元形式的說明由以下因素決定並 直接取=於以下因素：（a)活性組合物的特有特料欲達 成的特定療政，和（b)針對個體的治療敏感度來調配該活 性物質時在該領域固有的局限性。 φ ❹ 施用接合體時’根據受試者的體重，㈣4從約〇.0001 丨100 mg/kg ’更常為〇 〇1到5mg/kg。例如，劑量可以 為〇.3 mg/kg體重’丨mg/kg體重，3 mg/kg體重，$ 體重或1〇 mg/kg體重，或者」至1〇 mg/kg的範圍内。 :例性治療方案可為每週給藥—次，每兩週給藥一次， 每三週給藥一次，每四周給藥一次，每月給藥一次，每 三個月給藥-次或每3到6個月給藥一次。本發明接人 體的較佳劑量方案包括利用以下其中一種給藥方案以靜 脈給藥且劑量為丨mg/kg體重或3 mg/kg體重的方式來 施用接合體，給藥方案為：⑴每4周用藥6次，之後每 3個月給藥’·⑼每三周給藥；㈣W 3叫心體重 -次後’接著以i mg/kg體重的劑量每三周給藥—次:、 在-些方法調整劑量，使接合體的n農度為約i 至lOOOgg/m卜在一些方法t為約25至盹/mi。 或者’可以緩釋劑型來施用抗體，在這種情況中，需 要以較低頻率給藥。劑量和頻率隨著抗體在患者體内的 半衰期而改變。通常’人類抗體的半衰期最長，其次是 人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥的劑量和頻 125 200930407 率可能依據該治療是預防性還是治療性而有所不同。在 預防性應用申，在一 p旦主 隹奴長時間内以相對較低的頻率給予 相對較少的劑量。—歧串者 —思首將終生持續接受治療。進行 β療f生應用時’有時需要以相對較短的間隔來給予相對 較高的劑量，直到病情緩減或終止，並且較佳地直到患
者表現出部分改盖赤—八^^ A 又》次7C全纾解疾病症狀。之後，患者可 以接受預防性的給藥方案。 用於預防和/或治療與細胞增殖異常有關的疾病時，施 V 用化合物的循環濃度（CirCUlating _eentrati〇n)較佳為 約0.001 μΜ到20 μΜ，其中更佳約〇 〇1 μΜ到5 μΜ。 此處說明該化合物的患者口服劑量通常為從約1毫 克（mg)/天到約i0,000 mg/天，更典型為從約1〇㈣天到 約1,000 mg/天’最典型為從約5〇 mg/天到約5〇〇 mg/天。 按照患者體重來計算，常用劑量為從約〇 〇丨到約丄5〇 mg/kg/天，更典型從約〇」到約15爪以“/天，最典型從 〇 約1到約10 mg/kg/天，例如5 mg/kg/天或3 mg/kg/天。 在一些貫施例令，延遲或抑制腫瘤生長的患者劑量可 以是1微莫耳/公斤/天（μιηοΐ/kg/day)或更小。例如，患 者劑量可以為 0.9、0.6、0.5、0,45、0.3、0.2、0.15 或 0·1 pmol/kg/天或更少（指藥物的莫耳數）。較佳地，當施 用每日劑量持續至少五天時，該抗體_藥物接合體延緩了 腫瘤的生長。在至少一些實施例中，該腫瘤是在SCID 小鼠中的人類腫瘤。作為一例子，SCID小鼠可以是 CB1 7·SCID 小鼠（可由 Taconic，Germantown，NY 獲得）。 126 200930407 可以改變實際的劑量水準，以獲 合物和給藥方式 t特疋患者、組 量，且對串去預期療效的有效活性成分用 物代謝動力學因辛，：劑*用置將取決於各種藥 類…… 所採用之特定組合物或其醋 “員或醮胺類的活性、給藥途徑、給藥時 =物療程、與所採用之特定組合物並用的其他藥物： φ ❹ 體健唐1 /或材料、患者的年齡、性別、體重、狀態、總 健康狀態和病史等因素。 本發明之接合體#「治療有效‘量㈦⑽peuti吨 e d0sage)」k佳能減輕疾病症狀的嚴重程度、延 2無疾病症狀期的頻率和持續時間，和/或防止由 ^成的損害或殘疾。例如，用於治療购+腫瘤時，盘 未接受治療的受試者相比，「治療有效劑量」較 制
細胞生長或腫瘤生長至少约2〇%，更佳至少約4〇%，甚 至更佳至少約6G%，更佳至少約嶋。可在預測對於人 類腫瘤功效的動物模型系統中評估接合體抑制腫瘤生長 的能力二或者’可由有經驗的從業者利用已知方法進J 》、丨疋以汗估一組合物抑制腫瘤生長的能力。治療 有效里的冶療性化合物可減小受試者體内的腫瘤大小， =者緩解f試者的症狀。本領域的—般技術人員可根據 又式者的身材、症狀嚴重程度和所選的具體組 藥途徑等因素來決定該量。 可採：本領域中已知的一種或多種方法，透過—種或 多種給藥途徑’來施用本發明的接合體。如本領域技術 127 200930407 人員將理解到，可依據所期望的結果來改變給藥途徑和/ 或方式。本發明之抗體的較佳給藥途徑包括靜脈、肌肉 内皮内、腹腔、皮下、脊髓或其他胃腸外途徑（例如藉 由注射或輸液）。此處使用「胃腸外給藥（parenteral administration)」一詞是指除了腸内和局部用藥以外的其 他、，'。藥方式，通常藉由注射，包括但不限於靜脈内、肌 肉内、動脈内、脊髓腔内（intrathecal)、囊内、眼框内、 心内、皮内、腹膜内、經氣管、皮下、表皮下、關節内、 囊下、蛛網膜下腔、脊柱内、硬腦膜外和胸骨内注射及 輸液。或者，本發明的組合物可經由非胃腸外途徑 (n〇n-parenteralroute)來給藥，如局部、表皮或粘膜途徑 給藥，例如鼻内、口服、陰道、直腸、舌下或局部途徑 給藥。 活性化合物可與載劑一起製備’載劑可保護活性化合 物免於提前釋放，例如控釋製劑、植入劑、經皮貼劑和 0 微囊化遞送系統。可以使用具有生物降解性、生物相容 1"生的I合物例如乙稀-醋酸乙稀醋（ethyiene vinyl acetate)、聚酐（polyanhydrides)、聚羥基乙酸（p〇iygiyc〇iic acid)、膠原、聚原酸酯（p0丨y〇rth〇esters)和聚乳酸。（參見， 例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York， 1978)。 可利用本領域中已知的醫用裝置來施用治療性組合 物。例如’在一較佳實施例中，可利用無針皮下注射裝 128 200930407 置來施用本發明的治療組合物，例如5399〗63 ; 5383851 ， 5312335 ; 5064413 ; 4941880 ; 4790824 ;或 4596556中所公開的裝置。其他適宜裝置的實例包括 US 4487603 ； US 4486194 ； US 4447233 ； US 4447224 ； US 4439196 ;和US 4475196中所公開的裝置。這些專利 藉由引用方式併入本文中以供參考。 在一些實施例中，配製本發明的接合體，以確保其在 體内適宜分佈。例如’血腦障壁（BBB)阻擔了許多高親水 性化合物。為確保本發明的治療性化合物可通過Bbb(如 果需要的話）’該些化合物可以被配製成例如脂質體 (liposomes)。配製脂質體的方法參見例如US 4522811; 5374548 ;和539933 1。脂質體可包含一或多個部分 (moieties) ’該部分被選擇性地輸送到特定的細胞或組織 中以增強標靶藥物的遞送（參見，例如V v Ranade (1989)/. Clin. Pharmacol. 29 ： 68 5)。示例性標把分子部 分包括葉酸鹽（酯）或生物素（biotin)，例如參見授予Low 專人的 US 5416016;甘露糖苦（Umezawa ei α/., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 ： 1038);抗體（卩.0· Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357 ： 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 29_ : 180);表面活 性蛋白 A 受體（Briscoe α/. (1995) dm. /· 1233 : 134) ； pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 : 9090);以及 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346. ： 123; J.J. Killion; I. J. Fidler (1994) 129 200930407
Immunomethods 4 ·· 213 〇 用途和方法 0 本發明的抗體-搭檔分子接合體組合物和方法具有多 種體外和體内診斷治療用途，其中涉及診斷和治療 介導的病症。例如，可將這些分子加至培養的細胞（體外 或離體），或用於人類受試者（如體内），以治療、預防和 診斷各種病症。較佳的受試者包括患有由RG_ i活性介導 之疾病的人類患者。所述方法特別適合用於治療· RGd 表現異常相關疾病的人類患者。其中，值得注意的是攝 護腺癌和膀胱癌。本案發明人已經發現rg-丨與其他許多 種腫瘤有關，特別是肺癌、胃癌、乳癌、腎癌、胰腺癌、 結腸癌、黑色素瘤和胰島瘤。雖然在胰腺癌和胰島瘤的 腫瘤細胞上也表現RG-1，但大多數的情況下，RG-1存 在於腫瘤間質（tumor stroma)中。因此，本發明的接合體 適於治療這類癌症。 考慮到本發明的抗體對於RG_丨的專一性結合，本發明 的抗體可用於專一性地檢測RG-1的表現，此外，還可用 來進行免疫親合性純化，以純化RG-1。 此外’考慮到不同腫瘤鈿胞的RG-1表現，本發明的抗 體-搭樣分子接合體組合物和方法可用於治療患有致癌 性疾病的受試者，例如’該疾病的特徵是出現會表現 RG-1的腫瘤細胞，包括例如攝護腺癌和膀胱癌。 在一實施例中’本發明的組合物可用於檢測RG-1的含 130 200930407 量’該含量可能與一些疾病症狀有關聯。或者，所述組 合物可用於抑制或阻斷RG-1的功能，而rg-1的功能又 與預防或改善某些疾病症狀有關，進而暗示RG-1是咳疾 病的介導物（mediator)。可以在允許抗體與rg·〗之間形 成複合物的條件下，使樣品和對照品接觸抗RG-1抗體來 實現之。例如，可使用搭檔分子作為標誌物或報導基團， 來檢測並且比較在樣品和對照品中抗體和RG-1之間所 形成的任何複合物。 在另一實施例可先測試本發明組合物與體外治療 或診斷用途有關的結合活性。例如，可使用本領域已知 的流式細胞分析法來測試本發明的組合物。 在一具體實施例中’所述組合物可用於體内治療、預 防或診斷各種與RG-1有關的疾病。與RG_丨有關的疾病 實例包括攝護腺癌和膀胱癌。 如前所述’本發明的組合物可包含下列試劑：抗腫瘤 _ 劑，如夕柔比星（d〇xorubicin)、阿黴素（adriamyCjn)、順 鉑（cisplatin)、硫酸博萊黴素（ble〇mycin sulfate)、卡氮芥 (carmustine)、苯丁酸氮芥（chi〇rambucU)和環磷醯胺羥基 脲（cyclophosphamide hydroxyUrea)’ 這些藥物本身僅在 對患者具有毒性或弱毒性的用量時才有效。以靜脈給藥 方式施用順鉑，以1〇〇 mg/kg的劑量每四周用藥—次； 以靜脈給藥方式施用阿黴素，以6〇_75 mg/ml的劑量每 21天用藥一次。本發明的人類抗RG_ i抗體或其抗原結 合斷片與化學治療劑聯合用藥，提供經由不同機制對人 131 200930407 腫瘤細胞產生細胞毒性作用的兩種抗癌劑。該聯合給藥 可解決因腫瘤細胞產生耐藥性或其抗原性變化造成對腫 瘤細胞對抗體沒反應的問題。 當抗體具有補體結合位（c〇mplement binding sites)，例 如來自IgG卜IgG2或IgG3或igM可結合補體的部分時， 也可以在存在補體時使用。在一實施例中，藉由加入補 體或含有補體的血清，可增補使用本發明結合劑以及適 宜作用細胞來治療内含靶細胞之細胞群的離體治療效 果^藉著結合補體蛋白，可增進被本發明結合劑包覆之 靶細胞的胞噬作用。在另一實施例中，利用補體可使被 本發明組合物（如人類抗體、多重專一性和雙重專一性分 子）包覆的細胞也可能被溶胞（lyse(J)。在又一實施例 中’本發明的組合物不活化（active)補體。 本發明的組合物也能與補體一起施用。在某些實施例 中’本發明揭露内容提供包含人類抗體、多重專一性 G (multispecific)或雙重專一性（bispecific)分子以及金清或 補體的組合物。當補體位於與人類抗體、多重專一性或 雙重專一性分子非常接近的位置時，這些組合物是有利 的。或者，補體或血清也能與本發明的人類抗體、多重 專一性或雙重專一性分子分開施用。 本發明範圍内還包括一種試劑盒，該試劑盒包括本發 明抗體組合物和使用說明書。該試劑盒還可包括一或多 種其他試劑（如免疫抑制劑、細胞毒性劑或放射性毒素試 劑）’或一或多種本發明的其他人類抗體（例如，一且 132 200930407 ::補活性的人類抗體’其在咖抗原中的結合表位與 第人類抗體在RG-i抗原中的結合表位不㈣卜 因此，使用本發明抗體組合物進行治療的患者可在本 發明組合物施用之前、同時或之後’額外使用另—治療 劑例如細胞毒素試劑或放射性毒素試劑，它可增強或 擴大該組合物的治療效果。
，在另外一些實施例中，可使用能調節（例如，增進或抑 制）FcY或Fcy受體表現或活性的試劑對該受試者進行 額外治療，例如使用細胞激素（cyt〇kine)來治療該受試 者/α療時，可與多重專一性分子聯合施用的較佳細胞 激素包括：顆粒球集落刺激因子（G_CSF)、顆粒球-巨噬 細胞集落刺激因子（GM_CSF)、干擾素_γ (ΙρΝ_γ)和腫瘤壞 死因子（TNF)。 本發明的組合物還能指出表現FqR或RG_i的細胞， 例如用來標記該細胞。對於此種用途，可將該結合劑連 接至被偵測的分子。因此’本發明提供一種方法， 其能離體或體外定位出表現Fc受體（如Fcyr或) 的細胞°可彳貞測的標記例如放射性同位素、螢光化合物、 S#(enzyme)或酶辅助因子（enzyme co-factor) ° 在又一實施例中，使用本發明的免疫接合體，可藉著 將化合物（如治療劑、標記物、細胞毒素、放射性毒素、 免疫抑制劑等）與抗體連接，而使該化合物能以該些表現 RG-1的細胞為目標。例如，抗RGM抗體可與us 6,281,354 和 6,548,530 、 US 2003/005033 1 、 133 200930407
2003/0064984、003/0073852 和 2004/0087497 或 WO 03/0228 06中所揭示的任何細胞毒素化合物接合。因此， 本發明還提供一種方法，其可離體或體外定位表現rG_i 的細胞（例如使用可偵測性標記，如放射性同位素、螢光 化合物、柄或轉輔助因子）。或者，使用該免疫接合體.， 可藉著使細胞毒素或放射性毒素以RG-1為攻擊目標，而 殺死該些具有RG- 1細胞表面受體的細胞。
在又一實施例中，本發明的免疫接合體包含腙類連接 子（hydrazone linkers)，在細胞内的細胞質pH值條件下， 腙類連接子容易斷裂。此類連接子可用於非内化性接合 體’因為腫瘤的胞外環境是缺氧性和酸性環境。已使用 許多基團進行腫瘤的細胞外pH (pHe)測定。並且認為可 藉著腫瘤微環境中氧和葡萄糖的有限利用造成乳酸和二 氧化碳（C02)累積，來控制pHe值（Helmlinger β/.， (2002). C7z'«· Cawcer 及，1284-1291)。pHe 的估計值 始終約為6.8 ;或是比相應組織要低〇.5 pH單位 (Yamagata & Tannock (1996) Br. J. Cancer 73_, 1328-1334. Yamagata et al., (1998). Br. J. Cancer ^7, 1726-1731 ·
Helmlinger et al, (1997) MeA L i77_182)。可操 控該pH值’以在短時間内使PH值低至6.5(Helmlinger以 al., (1997) Nature Med. 3_, 177-182; Kozin et al., (2001)
Cancer Res. 61, 4740-4743)。雖然這只是pH的微小差 異’但抗體仍然將藥物保留在腫瘤環境中持續較長的時 間，使藥物從腙連接子釋放出來。p〇2和pHe之間有著 134 200930407 密切關聯性，腫瘤中心的壞死性血管化不良區域中的 pHe值最低，抗體極少滲入那些區域，但卻可以長時間 滯留（Yamagata , (1998)心 / 立 1726-1731)。 ~~~ φ 藉由以下實施例進一步說明本發明，但這些實施例不 應當被理解為對本發明的進一步限制。在本申請案中的 所有附圖和引用的所有參考文獻、專利和已公開之專利 申吻案的内谷皆以引用方式併入本文中以供參考。 f施例1:接合體的贺備釦配想 將抗RG-1抗體19G9和數個對照抗體（c〇mparative antibodies)接合至式（瓜）的分子：
以下說明用於抗體1 9G9和分子（m)的製程，作為代表。 濃度約〜5 mg/mL的抗體19G9在100 mM磷酸鈉、50 mM NaCn、2 mM DTPA(pH 8.0)的條件下，使用10倍莫 耳過量的2 -亞氨基硫烧（2-iminothiolane)進行硫醇化。硫 醇化反應在室溫且連續攪拌下進行1小時。2-亞氨基硫 135 200930407 烷與離胺酸ε-氨基（lySine s_amin〇 gr〇ups)反應，並將這 些基團轉化成用來進行接合反應的硫醇。 硫醇化後’藉著使用具有PES膜的1 〇 kDa NMWO平 板切向流過遽益（10 kDa NMWO flat sheet Tangential Flow Filtration (TFF) cassette )進行透析過濾，將抗體緩 衝交換成接合緩衝液（conjugation buffer，50 mM HEPES、5 mM 甘胺酸、2 mM DTPA，pH 5.5)。將已硫 醇化抗體的濃度調整為2.5 mg/mL，並且測定硫醇濃度。
0 依據抗體的硫醉’以3倍莫耳過量（3-f〇ldmolarexcess) 的比例來加入保存在DMSO中且濃度為5 mM的分子（m) 儲液’於室溫下混合90分鐘。用0.2 μηι的過濾器來過 濾該已接合的抗體。接合後，以比抗體硫醇含量過量1〇 倍莫耳的比例來加入保存於DMSO中且濃度為1〇〇 mM 的N-乙基馬來酿亞胺（N-ethylmaleimide)，以耗盡（quench) 任何未反應的硫醇基團。該耗盡反應在室溫下進行1小 時，同時連續攪拌。 先以0.2 μηι過濾器來過濾接合體，然後進行陽離子交 換層析純化法。用5倍管柱體積（5CV)的含50 mM HEPES、5 mM甘胺酸與1M NaCl(pH 5.5)溶液來再生 SP-Sepharose 高效陽離子交換管柱（High Performance Cation Exchange column，CEX)。再生後，用 3 倍管柱體 積（3CV)的平衡緩衝液（50 mM HEPES、5 mM甘胺酸，pH 5.5)平衡該管柱。將接合體載入管柱中，並用平衡緩衝液 洗務管柱一次。用含50 mM HEPES、5 mM甘胺酸、230 136 200930407 mM NaCl且PH 5_5的溶液沖提出接合體。分成多個餘分 來收集該沖提液（eluate)。然後用含50 mM HEPES、5 mjvi 甘胺酸、1M NaCl ( pH 5.5 )的溶液來再生該管柱，以除 去蛋白凝集物和任何未反應的分子（m)。 依據凝集程度（aggregation level)和取代率 (Substitution Ratio，SR)，也就是依據每分子抗體的搭檔 分子莫耳數，來匯集（pooling)該些沖提液餾分。採集標 ^ 準>95%單體，以1-1.5的SR範圍由SEC_HPLC測定。 ^ 已純化的CEX沖提液混合物表具有pES膜的1〇 NMWCO平板TFF盒中緩衝交換成透析過濾缓衝原液 (30 mg/mL蔗糖、1〇 mg/mL甘胺酸，ρΗ 6·〇)。將蛋白質 濃度稀釋成5 mg/ml並加入Dextran 40至已經透析過遽 後的接合體溶液中，直到最終濃度為1〇mg/ml而完成製 劑原液。以0_2 μηι的PES過濾器將製劑原液過濾到無 菌PETG瓶中並且保存在2至80C。 0 具有式（m)分子和抗體的接合體可由式（A)表示，其中
Ab表示抗體，在上述實例中，抗體是19G9)。正如^至 1.5的S R輕（圍所示，'—此括練卜；击祕士夕 >人 / 1 ^ 二机體上連接有多於一個的式（m) 分子，1 - 1.5的範圍是統計平均值。 137 200930407
本領域技術人員可以理解結構（m)實際上包括搭檔分 子（IV)本體以及將搭檔分子連接至抗體的連接子部分， 並在接合體斷裂後’搭檔分子（IV)本體被釋放出。如上 所述，氨基甲酸酯（鹽）前驅藥基團水解，隨後釋放出活 性分子本體。
宜施例2:在LNCaP和786-0細胞上的廉瘤啟叙性活性 為了測定抗RG-1和ED-B細胞毒素接合體的腫瘤啟動 性活性（tumor activated activity)，根據 ATCC 的說明書， 用RPMI培養基（含10%熱失活的胎牛血清，pcs )來 培養附著性細胞LNCaP (PSMA+/CD70-攝護腺癌）和 786-0 (CD70+/PSMA+腎細胞癌）（由ATCC獲得）。用胰 蛋白酶（trypsin)溶液使細胞脫離培養皿。洗滌所收集的細 胞’並分別在 RPMI(含 10% FCS )中以 0.25xl06 或 〇· ιχι〇6 細胞/毫升（cells/ml)的濃度重新懸浮LNCaP和786-0細 138 200930407 胞。將1 00微升（μΐ)的細胞懸浮液加至96孔盤中，培養 該些孔盤3小時使細胞附著。培養後，從3〇〇 的細胞 毒素開始，將該專一性抗體-細胞毒素接合體以1 : 3的 比例進行連續稀釋，並加至各個盤孔中。然後培養該些 孔盤48小時，並且在加入10 μι的1〇〇 μ(：Μ/ιηι 3Η_胸腺 哺唆之後’再培養24小時。使用96孔盤收穫器（96 well Harvester，Packard Instruments)來收集孔盤内的細胞， 並用Packard Top Count計數器來計量之。使用pHsm軟 體’以藥物的體積莫耳濃度對3H-胸腺喷π定的摻入量做 圖，繪出四個參數對數曲線，以判定EC5q值。在第3 A 和3B圖中’繪出分別在LNCaP和786-0細胞中各個抗 體細胞毒素接合體的對數曲線及其EC5〇值。考慮到 LNCaP 細胞是 PSMA+、RG-1+和 ED-B +和 CD70-及 786-0 細胞是PSMA—、RG-1 -和ED-B —和CD70 +之間的本質差 異’這些曲線圖表明抗體-細胞毒素接合體以抗原專一性 $ 方式’有效抑制3 H-胸腺嘧啶的摻入，因此表示細胞生 長的減緩。 宜施例3 : 小鼠體内的LNCaP/振講腺間皙共 培巷踵瘤的狳1
為確定本發明的抗RG-丨和 ED_B細胞毒素接合體的效 能’如下述方式進行LNCaP異種移植：120隻CB17.SCID 小鼠各自在側腹區皮下注射重新懸浮於〇 2毫升之 PBS/Matrigel (1: 1) (BD Bioscience)中的 2 百萬個 LNCaP 139 200930407 細胞和1百萬個攝護腺間質細胞（cat# CC-2508, Cambrex
Bio Science Walkersville，Inc, Walkersville, MD)。該 LNCaP/間質模型’在細胞表面表現出高量的pMSA，並 且在間質中表現出高量的RG-1。CD70作為異種移植物 呈現陰性的同型對照組（is〇type c〇ntr〇1)。移植後，稱重 小鼠，並使用電子測徑器以三維方式測量腫瘤，每週測 量夂。腫瘤體積的計算方式為：高度X寬度X長度/2。 腫瘤平均為50mm3的小鼠在前—天（Day _υ隨機分成16 個冶療組別，每組7隻小鼠，纟第。天按照表i所示的 劑$方案使用媒介物（vehicle)、抗體或抗體_細胞毒素接 合ΙΪ對小鼠進杆腹脉、;φ 4达_ L i。
抗體或接合體 劑量（細胞毒素pm〇l/kg，
_ 抗-PSMA IP SD 赛介物IP SD (對照組)
抗-RG-1 IP SD —------
抗-EDB Ip SD
抗-CD70-毒素 ip SD 0.03 ' 0.1 ' 0.3
第4A至 40圖繪示1 6組不同組別且每組七隻小鼠之 140 200930407 腫瘤體積的中位數增加情形。如左上圖所示，抗KG·】 裸抗體以及抗ED-B裸抗體對腫瘤生長沒有抑制作用。 抗-PSMA裸抗體對腫瘤生長具有一些抑制作用。當細胞 毒素與抗-PSMA抗體接合時，該抗腫瘤效果增強。然而， 出乎意料的是’當將先前對於非内化性抗原無效的抗體 接合至細胞毒素時，觀察到其抗腫瘤活性，與針對内化 性抗原之接合抗體的抗腫瘤活性類似。這些結果表明， 可利用針對非内化性抗原的抗體來介導細胞毒素的抗腫 < 瘤活性。 第5A至5D圖繪示研究的！6組不同組別且每組七隻 小鼠的中位數體重變化。LNCaP腫瘤導致小鼠體内產生 惡病質，該惡病質造成接受媒介物或裸抗體治療的小鼠 體重減輕’推測係腫瘤生長所致。相反地，接受抗體-藥 物接合體治療的小鼠在給藥後的體重最低，表明所有進 行測試的劑量（0·03-0.3)都是能耐受的劑量。在接合體組 別中’小鼠體重增加這一事實表示腫瘤的生長受到控制 且惡病質得到改善。 實施_例._4 :抑制SCID小鼠體内之LNCaP腫癍的祐旲 為確定本發明的抗RG-1和.ED-B細胞毒素接合體的功 效，如下所述般進行LNCaP異種移植：將 120隻 CB1 7.SCID小鼠各自在侧腹區皮下注射重新懸浮於〇.2 毫升之 PBS/Matrigel (1 ·’ 1) (BD Bioscience)中的 2.5 百-萬個LNCaP細胞。移植後，稱重小鼠，並使用電子測徑 141 200930407 y三維方:式測量腫瘤’每週測量一次。腫瘤體積的計 式為· W度X寬度X長度/2。該LNCap模型在細胞表 二表1現出高量# PMSA ’並且在間質中表現出低量的 …CD70作為異種移植物呈陰性的同種對照組。腫 瘤平均為80 mm3的小鼠在前—天㈣」）隨機分成u θ …一 ^又γ机，攸弗υ天按照表2所示的劑 里方案使用媒介物、抗體、抗體_毒素接合體對小鼠進行 腹治療。研究在第55天終止。 ------—， 1 川卜不 J J 八吟jL 〇 —----__参2 : SCID小鼠的給藥 抗體或接合體 劑量（細胞毒素μιηοΐ/kg， 抗體mg/kg ) 媒介物IP SD (對照組） 抗-CD70 IP SD 30 抗-PSMA IP SD 30 抗-RG-1 IP SD 30 抗-CD70-毒素 IP SD 0.03, 0.1, 0.3 抗-PSMA-毒素 IP SD 0.03, 0.1, 0.3 抗-RG-1-毒素 IP SD 0.03, 0.1, 0.3 Φ 第6A至6D圖繪示對進行研究的1 3組不同組別且每 組八隻小鼠的腫瘤體積平均增加量。與LNCaP/間質模型 類似，抗RG -1裸抗體對腫瘤生長不具有抑制作用。抗 -PSMA裸抗體具有一些程度的抗腫瘤生長效果。當抗 -PSMA抗體與細胞毒素接合時，其抗腫瘤效果明顯增 142 200930407 強。類似’但卻未能預期的是，當非内化性 (non-internalizing)的抗RG_丨抗體與細胞毒素接合時，觀 察到抗腫瘤活性。這些結果進一步證明，能利用針對非 内化性抗原的抗體來介導細胞毒素的抗腫瘤活性。
第7A至7D圖繪示1 6組不同組別且每組八隻小鼠的 中位數體重變化。如上所述，LNCaP腫瘤導致小良產生 惡病質。而該惡病質造成接受媒介物或裸抗體治療的小 鼠體重減輕’推測係腫瘤生長所致。相反地，接受抗體_ 藥物接合體治療的小鼠在剛給藥後的體重最低，表示所 有進行測試的劑量（0.03 — 0.3 )都是完全可耐受的劑量。 在接合體組別中的小鼠體重增加這一事實，表示腫瘤的 生長受到控制且惡病質得到改善。 本發明的前述詳細内容包括主要或專門依據本發明特 疋邛分或態樣進行解說的各段落。可以理解到，為了清 楚和方便起見，且具體特徵可能不僅限於揭示該特徵的 段落，且文中揭示的内容還包括所有在不同段落中出現 之資訊的適當組合。類似的，Μ本文中的各附圖和說 :内容是參照本發明的數個特^實施例，但可以理解的 疋’當-具體特徵揭露於特定附圖或實施例中時，該特 徵也可以適當程度地用於另—附圖或實施例t，與另-特徵結合，或是用於本發明整體。 此外’儘管本發明已根據—些較佳實施例進行具體說 ，然而本發明並不限於這些較佳實施例。相反地，本 只明的範圍由後附申請專利範圍所限定。 143 200930407 序列表整理 序列編號： 序列 序列編號： 序列 1 VH CDR1 a.a. 19G9 17 VH n.t. 19G9 2 VH CDR1 a.a. 34E1 18 VH n.t. 34E1 3 VH CDR2 a.a. 19G9 19 VLn.t. 19G9 4 VH CDR2 a.a. 34E1 20 VL n.t. 34E1 5 VH CDR3 a.a. 19G9 21 肽連接子 6 VH CDR3 a.a. 34E1 22 肽連接子 7 « VL CDR1 a.a. 19G9 23 肽連接子 8 VL CDR1 a.a. 34E1 24 肽連接子 9 VL CDR2 a.a. 19G9 25 肽連接子 10 VL CDR2 a.a. 34E1 26 肽連接子 11 VL CDR3 a.a. 19G9 27 肽連接子 12 VL CDR3 a.a. 34E1 28 肽連接子 13 VH a.a. 19G9 29 肽連接子 14 VH a.a. 34E1 30 肽連接子 15 VL a.a. 19G9 16 Vl a.a. 34E1
【圖式簡單說明】 第1A圖顯示19G9人類單株抗體之VH的核苷酸序列 (序列編號：1 7)和氨基酸序列（序列編號：1 3)。該圖標示 出CDR1 (序列編號：1)、CDR2 (序列編號：3)和CDR3 (序 144 200930407 列編號：5)區域。 第1B圖顯示19G9人類單株抗體之Vl的核苷酸序列 (序列編號：19)和氨基酸序列（序列編號：15)。該圖標示 出CDR1 (序列編號：7)、CDR2 (序列編號：9)和CDR3 (序 列編號：11)區域。
第2A圖顯示34E1人類單株抗體之vH的核苷酸序列 (序列編號：1 8)和氨基酸序列（序列編號：1 4)。該圖標示 出CDR1 (序列編號：2)、CDR2 (序列編號：4)和CDR3 (序 列編號：6)區域。 · 第2B圖顯示34E1人類單株抗體的VL的核苷酸序列 (序列編號：20)和氨基酸序列（序列編號：16)。該圖標示 出CDR1 (序列編號：8)、CDR2 (序列編號：10)和CDR3 (序列編號：12)區域。 第3A和3B圖分別顯示某些抗體-搭檔分子接合體對 LNCaP和786-0細胞的體外腫瘤啟動活性EC5〇值。 第4A-4D和5A-5D圖顯示體内LNCaP/攝護腺間質細 胞異種移植小鼠模型的結果，示出中位數腫瘤體積（第 4A-4D圖）和中位數體重的變化資料（第5A-5D圖）。 第6A-6D和7A-7D圖顯示體内LNCaP異種移植小鼠 模型的結果，示出中位數腫瘤體積（第6A-6D圖）和中位 數體重的變化資料（第7A-7D圖）。 【主要元件符號說明】 145 200930407

Claims (1)

  1. 200930407 七、申讀專利範圍： =〜種抗體-搭檔分子接合體，包含一人類單株抗體或 類早株抗體的一抗原結合部分，該人類單株抗體或 ::原結合部分與一搭檔分子接合，其中該抗體或其抗 “ σ 口部分會與人類RG-1結合，並且該接合體展現以 特性中的至少一種： (a) 以1χ10·8Μ或更小的Kd與人類RG]蛋白址人. 〇 ^ … (b) 抑制體内表現RG-1之細▲的生長。 2.如申請專利範圍第丨項所述之接合體，其中該抗體或 其抗原結合部分包括·· (a) (b) (c) 彎 (d) (e) (Ο 包含序列編號.1的重鍵可變區C d r 1 . 一包含序列編號.3的重鍵可變區cdr_2 ; 一包含序列編號：5的重鏈可變區CDR3 ; 一包含序列編號：7的輕鏈可變區cDR1 ; 一包含序列編號：9的輕鏈可變區CDR2 ;和 一包含序列編號：11的輕鏈可變區CDR3。 3·如申請專利範圍第1項所述之接合體，其中該抗體或 其抗原結合部分包括： (a) —包含序列編號：2的重鏈可變區cdri ; (b) —包含序列編號：4的重鏈可變區cdr2 ; (c) 一包含序列編號.6的重鏈可變區cdR3 ; 147 200930407 (d) —包含序列編號：8的輕鏈可變區CDR1 ; (e) —包含序列編號：1 〇的輕鏈可變區CDR2 ;以及 (f) 一包含序列編號：12的輕鏈可變區CDR3。 4.如申請專利範圍第1項所述之接合體，其中該抗體或 其抗原結合部分包括：
    (a) —重鏈可變區，其包含一氨基酸序列，該氨基酸 序列選自序列編號：13至14或其中任一序列之保守修 飾序列所組成的群組中；以及 (b) —輕鏈可變區，其包含一氨基酸序列，該氨基酸 序列選自序列編號：1 5至16或其中任一序列之保守修 飾序列所組成的群組中。 5.如申請專利範圍第1項所述之接合體，其中該抗體或 其抗原結合部分包括： (a) —重鏈可變區CDR1，其包含序列編號：1或序列 編號：2或其中任一序列的保守修飾序列； (b) 一重鏈可變區CDR2 ’其包含序列編號：3或序列 編號：4或其中任一序列的保守修飾序列； (c) 一重鏈可變區CDR3，其包含序列編號：5或序列 編號：6或其中任一序列的保守修飾序列； (d) —輕鏈可變區CDR1，其包含序列編號：7或序列 編號：8或其中任一序列的保守修飾序列； (e) —輕鏈可變區CDR2，其包含序列編號：9或序列 148 200930407 編號.1 〇或其中任一序列的保守修飾序列；以及 (f) 輕鏈可變區CDR3，其包含序列編號：11或序 列編號：1 2或其中任一序列的保守修飾序列。 6_如申請專利範圍第丨項所述之接合體，其中該抗體或 其抗原、.、。合部分結合至已被一參考抗體所識別之人類 RG-1上的一表位，該參考抗體包括： (a) ~包含序列編號：13之氨基酸序列的重鏈可變 P 區，和一包含序列編號：丨5氨基酸序列的輕鏈可變區； 或 (b) 包含序列編號：14之氨基酸序列的重鏈可變 區和包含序列編號：1 6之氨基酸序列的輕鏈可變區。 7. 如申吻專利範圍第丨項所述之接合體，其中該搭檔分 子疋一細胞毒素。 8. ⑹申請專利範圍第1項所述之接合體，其中該搭檔分 子具有式（I)所表示的一結構：
    p 其中PD表示一前驅藥基團。 9.如申明專利範圍第8項所述之接合體，其中該前驅藥 149 200930407 基團PD是一氨基甲酸酯（鹽）、磷酸酯（鹽）或β-葡萄糖搭 酸衍生物。 10·如申請專利範圍第8項所述之接合體，其中該抗體或 其抗原結合部分包括： (a) —重鏈可變區CDR1，其包含序列編號：1或序列 編號：2或其中任一序列的保守修飾序列； (b) —重鏈可變區CDR2，其包含序列編號：3或序列 ◎ 編號：4或其中任一序列的保守修飾序列；’ (c) 一重鏈可變區CDR3，其包含序列編號：5或序列 編號：6或其中任一序列的保守修飾序列； (d) —輕鏈可變區CDR1，其包含序列編號：7或序列 編號：8或其中任一序列的保守修飾序列； (e) —輕鏈可變區CDR2，其包含序列編號：9或序列 編號：1 〇或其中任一序列的保守修飾序列；以及 _ (f) 一輕鏈可變區CDR3，其包含序列編號：1 i或序 列編號：1 2或其中任一序列的保守修飾序列。 11.如申請專利範圍第1項所述之接合體，其中該搭檔分 子具有式（IV)所表示的一結構：
    150 200930407 12.如申叫專利I色圍帛丄項所述之接合體，具有式⑷所 表示的一結構： ~
    其中Ab表示該抗體或其抗原結合部分。 (A) 〇Λ〇
    13. 一種組合物，包含申請專利範圍第丨項所述之接合體 和一藥學上可接受的载劑。 14. 一種抑制表現RGq之腫瘤細胞生長的方法，包括使 該表現RG-1的腫瘤細胞接觸如申請專利範圍第1項所述 的〆接合體，使得該表達RG-1之腫瘤細胞的生長得到抑 制0 15 ·如申晴專利範圍第14項所述之方法，其中該抗體戋 其抗原結合部分包括： (a) —重鏈可變區CDR1，其包含序列編號：1或序列 編號：2或其中任一序列的保守修飾序列； (b) —重鏈可變區CDR2，其包含序列編號：3或序列 151 200930407 編號· 4或其中任一序列的保守修飾序列； (c) —重鏈可變區CDR3，其包含序列編號：5或序列 編號：6或其中任一序列的保守修飾序列； (d) —輕鏈可變區CDR1，其包含序列編號：7或序列 編號· 8或其中任一序列的保守修飾序列，· (e) —輕鏈可變區CDR2，其包含序列編號：9或序列 編號1 0或其中任一序列的保守修飾序列；以及 (〇 —輕鏈可變區CDR3，其包含序列編號：11或序 列編號.1 2或其中任—序列的無守修飾序列。 1 6.如申睛專利範圍第14項所述之方法，其中該搭檔分 子具有式⑴所表示的一結構：
    ^ 其中PD表示一前驅藥基團。 17·如中請專利範圍第14項所述之方法，其t該搭檔分 子具有式（IV)所表示的一結構：
    152 200930407 其中該接合體 18·如申請專利範圍第14項所述之方法 具有式（Α)所表示的一結構：
    其中Ab表示該抗體或其抗原結合部分。 〇 &如申請專利範圍第14項所述之方法，其令該表達 RG-.1的腫瘤細胞是攝護腺癌細胞或膀胱癌細胞。 2 0 ·種治療一受試者體内癌症的方法，包括給予需要此 類/α療的文試者一有效量之如申請專利範圍第丨項所述 的—接合體’以治療該受試者體内的癌症。 21 ·如申請專利範圍第20項所述之方法，其中該癌症是 攝護腺癌或膀胱癌。 22·如申請專利範圍第20項所述之方法，其中該癌症是 肺癌、胃癌、乳癌、腎癌、胰腺癌、結腸癌、黑色素瘤 或騰島素瘤。 153 200930407 23.如申請專利範圍第21項所述之方法其中讀 子是一細胞毒素。 Q檔分 24.如申請專利範圍第以項所述之方法其中該搭檔分 子具有式（I)所表示的一結構： 田刀
    Ο N ^ 其中PD表示一前驅藥基團。 25.如申凊專利範園第24項所述之方法，其中該抗體或 其抗原結合部分包括： (a) —重鏈可變區cDR1，其包含序列編號：丄或序列 編號.2或其中任—序列的保守修飾序列； (b) —重鏈可變區CDR2，其包含序列編號：3或序列 ^ 編號· 4或其中任一序列的保守修飾序列； (c) 一重鏈可變區CDR3,其包含序列編號：5或序列 編號.6或其中任一序列的保守修飾序列； (d) —輕鏈可變區CDR1，其包含序列編號：7或序列 編號：8或其中任—序列的保守修飾序列； (e) —輕鏈可變區CDR2，其包含序列編號：9或序列 編號：10或其中任一序列的保守修飾序列；以及 (f) 一輕鏈可變區CDR3，其包含序列編號：！丨或序 列編號：1 2或其中任一序列的保守修飾序列。 154 200930407 26.如申請專利範圍第2 1項所述之方法，其中該搭檔分 子具有式（IV)所表示的一結構：
    27.如申請專利範圍第2 1項所述之方法，其中該接合體
    i 具有式（A)所表示的一結構： ,Ab ㈧
    Η
    其中Ab表示該抗體或其抗原結合部分。 155
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