TW201208689A - Anticancer derivatives, preparation thereof and therapeutic use thereof - Google Patents

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Laurence Gauzy-Lazo
Philippe Hubert
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Sanofi Sa
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Description

201208689 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於。tb咯并[1，4]苯并二氮呼（PBD)二聚體之偶 聯物、含有其之組合物及其醫療（尤其作為抗癌劑）之用 途。本發明亦係關於製備該等偶聯物之方法及其作為抗癌 劑之用途、亦及二聚體本身。 【先前技術】 «比咯并[1，4]苯并二氮呼二聚體係藉由共價結合至細胞 DNA起作用之抗癌劑。該等衍生物已闡述於專利申請案 WO 00/12508 及 WO 2005/085260亦及以下出版物中：Eur. J. Med. Chem. 2005，40，641-654 ; Tetrahedron Letters 1988, 29(40)，5105-5108。 多年前即已知偶聯物化學且其適於若干家族之細胞毒性 劑，例如類美登素（maytansinoid) (WO 04103272)、紫杉烷 (WO 06061258)、來普黴素（leptomycin) (WO 07144709)、 CC-1065及其類似物（WO 2007102069);關於偶聯物，亦參 見 Monneret C.等人，8111161^11(111€&11。6犷 2000，87(11)，829-38 ; Ricart A.D.等人，Nature Clinical Practice Oncology 2007，4，245-255 ; Singh R.及 Rickson Η.K.，Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols，2009，525，445-467。 吡咯并[1，4]苯并二氮呼二聚體之偶聯物已闡述於專利申 請案WO 07085930及WO 2009/016516中。所用二聚體具有 下式： 157426.doc 201208689
其中 T可代表經-G-D-(Z)p-sza4 -G-D_(Z)p-C(=0)ZbRb 取代 之芳基或雜芳基。G代表單鍵或雙鍵或另一選擇為_〇_、 -S-或-NR·。D代表單鍵或以下基團中之一者：-E_、-E_ NR- ' -E-NR-F- ' -E-O- x -E-O-F- > -E-NR-CO- ' -E-NR- CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、-E-S-、-E-S-F-、-E-NR-C-S-、-E-NR-CS-F-，其中 e及 f選自-(OCHzCHdi 烷基 (OCH2CH2)j-、-烧基（〇CH2CH2)i 烷基、（〇CH2CH2)i、 -(OCHzCHA 環烷基（〇CH2CH2)j-、-(〇CH2CH2)i 雜環基 (OCH2CH2)j-、-(〇CH2CH2)i 芳基（〇CH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i 雜芳基（OCH2CH2)j-、-烧基 _(〇CH2CH2)i 烧基（OCH2CH2)j_ 、-烧基-(〇CH2CH2)i·、-烧基(ocHaCHA 環烷基 (OCH2CH2)j-、烧基（〇CH2CH2)i 雜環基（OCH2CH2)j-、-烷 基-(OCHzCHOi 芳基-(〇CH2CH2)j-、-烷基（〇CH2CH2)i 雜芳 基（OCHzCHOj-、-環烷基-烷基-、-烷基-環烷基-、-雜環 基-烷基_、_烷基-雜環基_、_烷基-芳基_、_芳基-烷基_、 -烷基-雜芳基-、-雜芳基-烷基_。i及j代表介於〇至2〇〇〇範 圍内之整數。Z代表烷基且p係等於0或1之整數。在該等化 合物中，基團NR中之R不包含PEG鏈。 於2009年11月在EORTC會議（摘要B-126)上闡述之免疫 原係以下偶聯物： 157426.doc 201208689
其係由連接體及細胞毒性化合物之性質加以區分。在 2010年5月17日至21日在波士頓（Boston)舉行之第六屆 PEGS會議上重新闡述此化合物，亦及以下前體：
其中R=N-琥珀醯亞胺基或甲基。 WO 07085930及WO 2009/016516中尤其分別閣述以下二 聚體：
該二個申請案並未闡述或提出包含一條或兩條聚乙二酵 化鏈之本發明新穎連接體。
[技術問題J 本發明意欲解決之技術問題係提出比咯并[1，4]苯并二氮 呼二聚體之新穎偶聯物。 【發明内容】 [定義] 157426.doc 201208689 以下定義適用： •偶聯物：共價附接細胞毒性化合物之至少一個分子之 細胞結合劑； •細胞結合劑：對生物目標具有親和力之分子：其可為 (例如）配體·、蛋白質、抗體（更特定而言單株抗體）、蛋 白質或抗體片段、肽、寡核苷酸或寡糖。結合劑具有將 作為細胞毒性劑之生物活性化合物引導至生物目標之功 能； •生物目標：優先定位於癌細胞或與此腫瘤相關之基質 細胞之表面上的抗原（抗原之群組）；該等抗原可能為（例 如）生長因子受體、突變「腫瘤抑制劑」基因或致癌基 因產品、血管發生有關之分子、黏附分子； •連接體.將細胞毒性化合物共價附接至結合劑之一組 原子； •烷基：藉由自烷烴去除一個氫原子獲得之基於飽和脂 肪族烴之基團。該烷基可為直鏈或具支鏈。可提及之實 例包括f基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第 三丁基、戊基、2,2·二甲基丙基' 己基； 環烷基.包含3至8個接合在環結構中之碳原子之環狀 烧基。可提及之實例包括環丙基、環丁基、環戊基及環 己基； •芳基：不含任何雜原子之單環或二環芳香族基團。更 特定而言，其係苯基或萘基； 芳基13至夕一個接合在環中並與碳原子連接形 157426.doc 201208689 成環之雜原子（〇、S、N)的單環或二環芳香族基團。更 特定而言，其係吡啶基、吡咯基、噻吩基、咬喃基、鳴 咬基或三嗤基； •雜環燒基：包含至少一個接合在環中並與碳原子連接 形成環之雜原子（Ο、S、N)的環烧基。更特定而言，其 係六氫吡嗪基、N-甲基六氫。比嗪基、嗎啉基、六氫β比啶 基或》比洛啶基； •烷氧基：基團-〇-烷基，其中該烷基係如上文所定義； •烷醯氧基：基團-0-CO-烷基，其中該烷基係如上文所 定義； •伸院基.經驗式-CmHw之飽和二價基團，其係藉由自 烧烴去除兩個氫原子獲得。可提及之實例包括亞甲基 (CH2.)、伸乙基（_CH2CH2-)、伸丙基（_CH2CH2CH2·)、
Me、/Me 伸丁基（-CH2CH2CH2CH2-)、伸異丁基（十〕^ )及伸己基 (-CHzCI^CHaCHzCHzCH2-)。更特定而言，伸烷基可具 有式-(CH2)m-，m代表整數； •在值之範圍内，包括限值’例如，類型「介於1至6範 圍内之1」的範圍包括限值1及6。此外，該範圍亦指範 圍内之所有點；因此，「介於1至6範圍内之i」指值j、 2、3、4、5及 6 〇 所用缩寫
EtOAc :乙酸乙酯；ALK :伸烷基；（Cx_Cy)ALK :基團 (Cx-Cy)伸烷基；TLC :薄層層析；MSC :甲烷續醯氯； DBU · 1,8-一 氮雜一環[5.4.0]十一 _7_ 烯；DCC : Ν，Ν·-二環 157426.doc 201208689 己基碳化二亞胺；DCM :二氣甲烷；DEAD :偶氮二曱酸 二乙酯；DIC : N，N'-二異丙基碳化二亞胺；DIPEA : N，N-二異丙基乙基胺；DMA :二甲基乙醯胺；DMAP : 4-二曱 基胺基吡啶；DME :二甲氧基乙烷；DMF :二甲基甲醯 胺；DMSO :二曱亞砜；ewlL nm :波長WL下之莫耳消光係 數；EEDQ : 2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氫喹啉； EDC1 : N-(3-二甲基胺基丙基）-N·-乙基碳化二亞胺； EDTA :伸乙基二胺四乙酸；Fmoc :苐基曱氧基羰基； Hal :鹵素原子；HOBt : 1-羥基苯并三唑；HEPES : 4-(2-羥基乙基）-1-六氫吡嗪乙烷磺酸；WL :波長；Me :甲 基；NHS : N-羥基琥珀醯亞胺；NMP : N-甲基吡咯啶酮； RP :減壓；Rf :保留因子；SEC :空間排阻層析；RT :室 溫；TBDMS ··第三丁基二甲基甲矽烷基；TEA :三乙胺； TFA :三氟乙酸；TIPS :三異丙基曱矽烷基；THF :四氩 呋喃；tR :保留時間。 圖式顯示對於每一偶聯物而言，具有0至8個托馬黴素二 聚體之物質的分佈（D〇 :無二聚體；Dx : X個二聚體）。 本發明係關於式（I)化合物：
Q-(CH2CH20)k-CH2CH2-G i、/RCG, «ι R
其中： —代表單鍵或雙鍵，條件係 157426.doc •10- 201208689 若—代表單鍵，則： ❖ U及/或U'可相同或不同，其彼此獨立地代表H; ❖ W及/或W'可相同或不同，其彼此獨立地代表： OH、-OR、-OCOR、-COOR、-OCOOR、-OCONRR'、 使N10及C11包括在環中之環狀胺基曱酸酯、 -NRCONRR’、-OCSNHR、使 N10 及 C11 包括在環中 之環狀硫代胺基甲酸酯、-SH、-SR、-SOR、-SOOR、 -S03·、-NRSOOR’、-NRR·、使 N10 及 C11 包括在環 中之環狀胺、-NROR，、-NRCOR，、-N3、-CN、 Hal、三烷基鱗或三芳基鎮基團； 若=代表雙鍵，則： ❖ U及U·不存在； ❖ W及/或W'可相同或不同，其彼此獨立地代表η; • R!、R2、RV、R2’可相同或不同，其彼此獨立地代 表：Η、Hal或視情況經一或多個選自以下之取代基取 代之基團（CVCe)烷基：Ha卜 CN、NRR，、CF3、OR、 芳基或雜芳基、S(0)qR，其中q=〇、1或2 ; 或另一選擇為 心及R2及/或R】'及R2’分別一起形成雙鍵=CH2或=CH- CH3 ; • Y及Y’可相同或不同，其彼此獨立地代表11或_〇11; • Μ代表CH或Ν ; • ALK及ALK’表示基團（Ci-Ce)伸烷基； • R及R'彼此獨立地代表Η或視情況經一或多個選自以下 157426.doc -11- 201208689 之取代基取代之基團（C丨·θό)烷基或芳基：Η"、Cn、 nrr·、cf3、OR、芳基或雜芳基； • Li代表： 〇單鍵； 或 〇基團-(OCH2CH2)r，其經由氧原子附接至苯基或〇比 啶基環，i代表介於2至40、較佳2至10範圍内、較 佳等於3之整數； 或 。基團-D-(C丨-CdALK-，其經由D附接至苯基或吡啶 基環，其中D代表-〇_、-NH-或-Ν((ν(：4)烷基-; L2代表： ° 基團-(CVCdALK-; 或 0 基團-(CH2CH20)j-CH2CH2-，j 代表介於 1 至 40、較 佳1至10範圍内、較佳等於2或3之整數； 或 0 基團-(CHaCHzC^j-CHzCi^NR'MC^-CdALK-，其經 由單元-(CH2CH20)-附接至氮原子，j代表介於1至 4〇、較佳1至1〇範圍内、較佳等於2或3之整數，且 R"代表Η或基團（(VC4)烷基； • Q代表單鍵或基團c(=〇); • k代表介於〇至4〇、較佳1至4〇、更確切地1至1〇範圍内 之整數； 157426.doc •12· 201208689 • G代表基團-OR或-NRR·，R及R’係如前文所定義或使 得其與所附接之氮原子一起形成基團（C4-C1Q)雜環烷 基，該（C4-Clc))雜環烷基可在該環中包含選自N、0及 S之另一雜原子且其可視情況經至少一個選自基團 (Ci-CJ烷基、鹵素原子及羥基之取代基取代； • RCG1 代表基團-sza 或-C(=0)-ZbRb; • Za代表 Ac、Ra4SRa ; • Ra代表Η、或視情況經一或多個選自以下之取代基取 代之基團（C^-Ce)烷基、（C3-C8)環烷基、芳基、雜芳基 或（c4_ci。）雜環烷基：Hal、CN、NRR'、CF3、OR、 N〇2、芳基或雜芳基； • Zb代表單鍵、_〇·或_NH_iRb代表H或基團（CiC6)烷 基、（(VC8)環烷基、芳基、雜芳基或（C4_Ci())雜環烷 基或另一選擇為Zb代表單鍵且Rb代表Hal ; 條件係若Li代表單鍵，則RCG1代表-SZae 更特定而言，其係式（ΙΑ)或（IB)之化合物：
本發明亦係關於製備偶聯物之方
Q.(CH2CH20)k-CH2CH,-G ,RcG, 法，該方法由以下組 I57426.doc •13· 201208689 成：（1)使視情況經修飾劑修飾之結合劑的水溶液（視情況 經緩衝）與式（I)化合物之溶液接觸並反應，（ii)及隨後視情 況分離步驟⑴中形成之偶聯物與式⑴化合物及/或未反應 結合劑及/或可能形成之聚集物。式⑴化合物之化學基團 RCG1應對結合劑上存在之化學基團RCG2、尤其對抗體上 存在之胺基具有反應性，若適當，修飾劑已引入該等化學 基團RCG2以便藉由形成共價鍵將式⑴化合物附揍至結合 劑。 本發明亦係關於可經由上述方法獲得之偶聯物及偶聯物 溶液。 本發明亦係關於式（I)衍生物的用途，其用於製備下式之 二聚體在Μ之對位共價附接之結合劑：
該化合物、偶聯物及偶聯物溶液可用作抗癌劑。 本發明亦係關於式ρ2之化合物：
其中L〗、L2、Q、k、ALK、ALK，及G係如前文所定義； 及LG1代表離去基團且χι代表rcgi。 本發明亦係關於在本發明化合物與結合劑反應後，下式 157426.doc • 14 - 201208689 之二聚體在Μ之對位共價附接之結合劑：
【實施方式】 本發明係關於式（I)化合物：
Q-(CH2CH20)k-CH2CH2-G
其中： •=代表單鍵或雙鍵，條件係 若 代表單鍵，則： ❖ U及/或U'可相同或不同，其彼此獨立地代表Η ; ❖ W及/或W’可相同或不同，其彼此獨立地代表： OH、-OR、-OCOR、-COOR、-OCOOR、-OCONRR'、 使N10及C11包括在環中之環狀胺基甲酸酯、 -NRCONRR'、-OCSNHR、使 N10 及 C11 包括在環中 之環狀硫代胺基曱酸酯、-SH、-SR、-SOR、 -SOOR、-S03·、-NRSOOR'、-NRR'、使 N10 及 C11 包括在環中之環狀胺、-NROR'、-NRCOR·、-N3、 -CN、Hal、三烷基鱗或三芳基鱗基團； 157426.doc -15- 201208689 若=代表雙鍵，則： ❖ u及υ·不存在； ❖ W及/或W·可相同或不同，其彼此獨立地代表Η ; • h、R2、IV、r2•可相同或不同，其彼此獨立地代 表：Η、Hal或視情況經一或多個選自以下之取代基取 代之基團（ci_C6)烧基：Hal、CN、NRR'、CF3、OR、 芳基或雜芳基、StOhR，其中q=0、1或2 ; 或另一選擇為 心及尺2及/或尺!·及R2,分別一起形成雙鍵=CH2或=CH-CH3 ; • Y及Y’可相同或不同，其彼此獨立地代表H4_0r; • Μ代表CH或N ; • ALK及ALK’表示基團（c丨-C6)伸烷基； • R及R’彼此獨立地代表11或視情況經一或多個選自以下 之取代基取代之基團（Ci—C：6)烷基或芳基：Hal、CN、 NHRI、cf3、OR、芳基或雜芳基； • Μ代表： 〇單鍵； 或 〇基團-(OCH2CH2)r，其經由氧原子附接至苯基或吡 啶基環，i代表介於2至40、較佳2至1〇範圍内、較 佳等於3之整數； 或 。基團-D-(C,-C6)ALH經由D附接至苯基心唆 157426.doc -16 · 201208689 基環’其中D代表_〇·、_NH-或-Ν((ν(：4)烷基-; • L2代表： 〇 基團-(CrCdALK-; 或 。基團-(CH2CH2〇)rCH2CH2-，j 代表介於 1 至 40、較 佳1至10範圍内、較佳等於2或3之整數； 或 。基團-(CI^CHzCOj-CHzCHzNR^CrCdALK·，其經 由單元-(CH2CH2〇)-附接至氮原子，j代表介於1至 40、較佳1至1〇範圍内、較佳等於2或3之整數，且 R"代表Η或基團烷基； • Q代表單鍵或基團C(=0); • k代表介於〇至40、較佳1至40、更確切地1至1〇範圍内 之整數； • G代表基團-OR或_NRR'，R及R，係如前文所定義或使 得其與所附接之氮原子一起形成基團（C4_C1G)雜環烷 基’該（C4_C1())雜環烷基可在該環中包含選自N、〇及 S之另一雜原子且其可視情況經至少一個選自基團 ((VC4)烧基、鹵素原子及羥基之取代基取代； • RCG1 代表基團-SZa或-C(=0)-ZbRb; • Za代表 Ac、RdSRa ; • Ra代表Η、或視情況經一或多個選自以下之取代基取 代之基團（Ci-Ce)烷基、（Cs-C8)環烷基、芳基、雜芳基 或（C4-C10)雜環烧基：fjal、CN、NRR，、CF3、OR、 157426.doc -17- 201208689 N〇2、芳基或雜芳基； • Zb代表單鍵、_〇\^_NH•且心代表η或基團烷 基、(c3-c8)環烧基'芳基、雜芳基或（C4_Ci〇)雜環烧 基或另一選擇為zb代表單鍵且Rb代表Hal ; 條件係若1^代表單鍵’則RCG1代表-SZa。 因此’式（I)化合物可以如下形式存在：
本發明亦係關於式（Γ)之化合物：
其中： •——代表單鍵或雙鍵，條件係若=代表單鍵，則： v----代表單鍵； + U及/或ΙΓ可相同或不同，其彼此獨立地代表H; <· W及/或W'可相同或不同，其彼此獨立地代表： OH、-OR、-OCOR、-COOR、-OCOOR、-OCONRR·、 使N10及C11包括在環中之環狀胺基曱酸酯、 -NRCONRR'、-OCSNHR、使 N10 及C11 包括在環中 157426.doc -18- 201208689 之環狀硫代胺基甲酸酯、-SH、-SR、-SOR、 -SOOR、-SCV、-NRSOOR'、-NRR'、使 N10 及 Cll 包括在環中之環狀胺、-NROR·、-NRCOR'、-N3、 -CN、Hal、三烷基鱗或三芳基鱗基團； • Ri、R2、RV、RV可相同或不同，其彼此獨立地代 表：Η、Hal或視情況經一或多個選自以下之取代基取 代之基團（CVC6)烷基：Ha卜 CN、NRR'、CF3、OR、 芳基或雜芳基、S(0)qR，其中q=0、1或2 ; 或另一選擇為 1^及112及/或Ri'及R2'分別一起形成雙鍵=CH2或=CH- ch3 ; • Y及Y'可相同或不同，其彼此獨立地代表Η或-OR; • Μ代表CH或N ; • ALK及ALK’表示基團（CVC6)伸烷基； • R及R'彼此獨立地代表Η或視情況經一或多個選自以下 之取代基取代之基團（CrCd烷基或芳基：Hal、CN、 NRR’、CF3、OR、芳基或雜芳基； • 代表： 〇單鍵； 或 〇基團-(OCI^CHdi-，其經由氧原子附接至苯基或吡 啶基環，i代表介於2至40、較佳2至10範圍内之整 數； 或 157426.doc -19- 201208689 0基團-D-(Ci-C6)ALK- ’其經由D附接至苯基或咕啶 基環，其中D代表-〇-、-NH-或-Ν((ν(：4)烷基-; • L2代表： ° 基團-(CVCyALK-; 或 。基團-(CH2CH2〇)j-CH2CH2-，j 代表介於 1 至 40、較 佳1至10範圍内之整數； 或 0 基團-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"-(C丨-C6)ALK-，其經 由單元-(CH2CH20)-附接至氮原子，j代表介於1至 4〇、較佳1至10範圍内之整數，且R，，代表Η或基團 (C 1 -C4)炫基； • Q代表單鍵或基團c(=0); • k代表介於〇至40、較佳1至40、更轉切地1至1〇範圍内 之整數； • G代表基團-〇R或-NRR'，R及R’係如前文所定義或使 得其與所附接之氮原子一起形成基團（C4-C1G)雜環烷 基，該（C4_C1())雜環烷基可在該環中包含選自n、〇及 s之另一雜原子且其可視情況經至少一個選自基團 (C1-C4)院基、鹵素原子及經基之取代基取代； • RCG1 代表基團-SZa或-C(=0)-ZbRb; • Za代表 Ac、Ra4SRa ; • Ra代表Η、或視情況經一或多個選自以下之取代基取 代之基團（Ci-C6)烧基、（C3-C8)環烧基、芳基、雜芳基 •20· 157426.doc 201208689 或（C4-C10)雜環烷基：Hal、CN、NRR'、CF3、OR、 N〇2、芳基或雜芳基； • Zb代表單鍵、·〇·或-NH-且Rb代表H或基團（(VC6)烷 基、（C3-cs)環烷基、芳基、雜芳基或（C4_Ci〇)雜環烷 —選擇為Zb代表單鍵且Rb代表Hal ; 條件係若！^代表單鍵，則11(：(}1代表_SZa。
Q*(CH2CHaO)k-CH2CH2.G 術語L表示由+女 定義之連接體》 更特定而言’若^代表單鍵，則L2代表_((：η2(：η2〇)γ ch2ch2-或-(CH2CH2〇)rCH2CH2NR，，_(Ci_C6)ALK 及 / 或 k爹2。 更特定而言’當厘代表N時，-DJCrCdALK-更確切地 代表-0-(C丨-C6)ALK-。 更特定而言’附接至苯基或吡啶基核之兩個基團ALK及 ALK'二者均表示亞甲基。 更特定而言，D代表-Ο-、-NH-或-NMe- » 在上式（I)及（I')中，附接至苯基或η比咬基核之每一伸烧 基（因此’例如，兩個基團ALK及ALK，）可相同或不同；根 據另一實例，-D-CCi-CdALK-之基團ALK可與附接至苯基 或0比啶基核之基團ALK相同或不同。ALK可選自（例如）以 下中之一者：_CH2·、_CH2CH2-、CH2CMe2-、-CH2CH2CH2-。 更特定而言，γ及γ，代表基團（Ci-Cd烷氧基、尤其曱氧 基。 更特定而言，R及R'可彼此獨立地代表Η或基團（Ci-Ce) 157426.doc -21· 201208689 坑基。 根據一個特定實施例，υ=υ·及/或w=w，及/或Ri=Ri’及/ 或r2=r2’及/或γ=γ'及/或附接至苯基或吡啶基核之兩個基 團ALK及ALK1相同（對稱二聚體，其更容易製備）。 更特定而言，W與W•相同或不同且代表OH、OMe、 OEt、NHCONH2、SMe。 R"可代表H或基團（CVC4)烷基，尤其Me。 更特定而言，Μ代表氮原子（N)。 更特定而言’心及尺2及/或R〗，* r2，分別一起形成雙鍵 =(：Η24=(：Η·(：Ι·ί3，更具體而言=(：ίί-(：Ι13。 G可代表基圑-〇R，更特定而言基團_〇η或_〇(Cl_c6)烷 基’尤其-OMe。G亦可代表基團-NRR，，其中R及R·彼此獨 立地代表Η或基團（C^-Ce)烷基。更特定而言，g可由此代 表基團_ΝΗΖ、-ΝΗγ,-ί：6)烷基或-n(C「C6)烷基2，尤其 -N(CH3)2。G亦可代表基團-NRR，’其中R及R，與其所附接 之氮原子一起形成基團（C4_CiQ)雜環烷基，該（C4_Cig)雜環 烷基可在環中包含選自N、〇及8之另一雜原子且其可視情 況經至少一個選自基團（Ci_C4)烷基、齒素原子及羥基之取 代基取代。雜環烷基尤其可選自六氫。比嗪基、N-甲基六氫 °比°秦基、嗎琳基、六氫β比咬基及β比洛啶基。 k代表介於〇至40範圍内之整數。k可取值〇(無以附接至 氮原子之G作為末端之pEG鏈）。在本發明之化合物中，可 區別彼等包含以附接至氮原子之G作為末端之PEG鍵者且k 介於1至40、更確切地n〇、更確切地u 5之範圍内。亦 157426.doc •22- 201208689 可區別彼等包含至少一條PEG鏈者，即彼等k介於1至40、 較佳1至10、更確切地1至5之範圍内及/或Ι^=-(〇〇：Η2〇：Η2)ί- 及/或 L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2-或另一選擇為-(CH2CH20)j-CHzCHzNITJiVCdALK-者》 式（I)及（Γ)之化合物（包括彼等作為實例給出者）可以驗或 與醫藥上可接受之酸形成之加成鹽形式、亦及以該等鹼或 該等鹽之水合物或溶劑合物形式存在。 更特定而言’可區別彼等具有式（IA)或（IB)者：
此外，區別以下化合物： 其中 Lf-DJCVCOALK-且 L2=-(Ci-C6)ALK-之化合物 的第一子群； '其中Li^OCHAHA-且L2=-(C丨-C6)ALK-之化合物之 第二子群； 其中 Li=單鍵且 Ce)ALK-之化合物之第三子群； _ 其中 Lf-DjCrCdALK-且 L2=-(CH2CH20)j- CH2CH2NR"-(C广C6)ALK-之化合物之第四子群； 157426.doc •23- 201208689 •其中 Le-D^CrCJALK-且 L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2-之化合物之第五子群。 亦可區分化合物之以下群組：
Lp-D^C^-CdALK-，I^s^C^-CJALK-，Q=單鍵， k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; L i =-D-(C i-Cg) ALK- * L2=~(C I-Ce) ALK- * Q=CO ’ k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; L1=-(OCH2CH2)i- » L2=-(C,-C6)ALK- · Q=^m. · k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; -L,=-(OCH2CH2)i- » L2=-(C,-C6)ALK- « Q=CO > k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ;
Lp-D^CrCJALK-，I^s^CrCJALK-，Q=單鍵， k=l-10，G=NRR'，RCGl=-SZa ; L i =-D-(C i-Cg) ALK- * L2=-(C i-Οβ) ALK- » Q=CO ’ k=l-10，G=NRR·，RCGl=-SZa ; L】=單鍵，LfJCHzCHjOVCI^CI^NR’WC^-CdALK-，Q=單鍵，k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; L】=單鍵’1^2 = -((：112(：1120)』-(：112(：11：^11"-((：1-(：6)人1^_ ，Q=CO，k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; L,=單鍵， ，Q=單鍵，k=0-10，G=NRR·，RCGl=-SZa ; -L1== ，Q=CO，k=0-10，G=NRR'，RCGl=-SZa ; _ L1=-D-(C,-C6)ALK- « L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"- -24- 157426.doc 201208689 (Ci-CJALK-，Q=單鍵，k=0-10，G=NRR'，RCG1 = -SZa， L1=-D-(C1-C6)ALK-，L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"-(Cj-DALK-，Q=CO，k=0-10，G=NRR·，RCGl=-SZa ; _ L1=-D-(C1-C6)ALK-，L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"- (Cj-CJALK-，Q=單鍵，k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; L1=-D-(C1-C6)ALK-，L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"-(CrCdALK-，Q=CO，k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ;
Li =-D-(Ci-C$)ALK- ’ L<2=-(Ci-C6)ALK- ’ Q=早鍵， k=l-10，G=OR，RCGl=-C(=0)ZbRb ; L i =-D· (C i-C6) ALK- ’ L2=_(C i-C6) ALK- ’ Q=CO ’ k=l-10，G=OR，RCGl=-C(=0)ZbRb ;
Lf-D^Cj-CdALK-，L^^Cj-CdALK-，Q=單鍵， k=l-10，G=NRR·，RCGl=-C(=0)ZbRb ; L1=-D-(C1-C6)ALK-，L2=-(C1-C6)ALK-，Q=CO， k=l-10，G=NRR·，RCGl=-C(=0)ZbRb ; Ι^=·(0(：Η2(：Η2)ί·，L2=-(Ci-C6)ALK_，Q=單鍵，让=1_ 10，G=OR，RCGl=-C(=0)ZbRb ; • L1=-(OCH2CH2)i- 5 L2=-(C!-C6)ALK- » Q=CO > k=l-10，G=OR，RCGl=_C(=0)ZbRb ; L1=-(OCH2CH2)i- > L2=-(C!-C6)ALK- « Q=-^M » k=l-10，G=NRR'，RCGl=-C(=0)ZbRb ; • L1=-(OCH2CH2)i-，L2=-(C1-C6)ALK-，Q=CO，k=l-10，G=NRR，，RCGl=-C(=0)ZbRb ; 157426.doc -25- 201208689 li = ~D-(Ci-C6)ALK- > L2=-(CH2CH2〇)j-CH2CH2- « Q= 單鍵 ’ k=i_10，g=〇R ’ RCGl=-C(=0)ZbRb ; L^~D-(C,-C6)ALK- ’ L2=-(CH2CH20)rCH2CH2-， Q=C0，k=l-i〇，g=OR，RCGl=-C(=0)ZbRb ;
LlO-(C丨-C6)ALK-，L2=-(CH2CH20)rCH2CH2-，Q= 單鍵 ’ ku〇，g=Nrr,，RcGl=_C(=C〇ZbRb ;
Li^~D>(Cl-C6)ALK- » L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2-, Q—C〇，k=〇-l〇，g=NRR'，RCGl=-C(=0)ZbRb。 在上文所定義之化合物之群組中： 更特疋而言，丨代表介於2至10範圍内之整數，尤其等於 3之整數； 更特定而言’j代表介於1至1〇範圍内之整數，尤其等於 2或3之整數； 更特疋而s，k代表等於〇、或介於1至5範圍内之整數。 表I闡述特定連接體L亦及其對應之化合物之實例。此表 中之每一化合物均可WM=CH(笨）或另一選擇為m=n(吡啶） 之形式存在。M=N之化合物水溶性更大。纟此表中，實例 係以形式（IA)給出但亦可以形式（IB)存在。L、^、I〗、让 及G可選自彼等闡述於表i中者或該等實例。 157426.doc •26· 201208689 表i L, Q G 式(IA)之化合物 編號 -D-ALK- ALK OR 1 -D^ALK- ALK CO OR 2 *D-ALK- ALK OR so^*v^°'^〇·^ ?φ5^ 3 -D-ALK- ALK CO OR 4 -(OCHaCH^ ALK OR 、(/ 5 -(OCHzOWr ALK CO OR 6 -27- 157426.doc 201208689
Li 匕2 Q Q 式(IA)之化合物 編號 -[>ALK- ALK NRR， 7 -D-ALK- ALX CO NRR* 8 -D^VLK- ALK OR 9 -CMLK- ALK CO OR 〒〜 10 單鍵 -(CHaCHaOJj· CH^HaNR1- ALK- OR Jip 产; 11 單鍵 -(CHaCHaOir CHaCHaNR**- AIX- CO OR 12 -O-ALK- •(CHaCHaOJr ch2ch2mit· ALK- OR ,χρι. 13 4>ALK- -<CHaCH2〇)r CHaCHjNR»- ALK- CO OR J^；^；xp5^ 14 -28- 157426.doc 201208689 L, u Q G 式(IA)之化合物 編號 單鍵 -(CHjCHjOV CH2CH2NRw- ALK- NRR· 15 單鍵 -(CHaCHaOJr CHaCHaNR"- ALK. CO NRR, 16 -O-ALK- -(CHaCHaOJr CH2CH2NR,'- ALK- NRR- X t7 -OALK- -(CHiCHiOV CHzCHzNR’·- ALK- CO NRR* 1 方; 1β -D-ALK· ALK NRR· 〇o^o^s- ,χρι. 19 •D*ALK- ALK OR 20 办ALK- ALK OR '-Q-^Os^O^ 21 办AIK- ALK CO OR ,φι. 22 -29- 157426.doc 201208689 L, l2 Q Q 式(IA)之化合物 編號 -CMVLK- ALK CO OR 23 -IMLK- ALK OR 、〜O 、N^^N^s^AaRb 产;Xp5^ 24 4)-ALK. ALK CO OR 、N"^s^'SvX*NSi<<^^ZbRb 产? 25 -(OCH^CHaV ALK OR 26 KOChtCHajr ALK CO OR ?xs^〇v*x^O"i<"'s^N%v^'^^7bRb 27 -D-ALK^ ALK NRR_ 〇^Ss^Nx-/^s^ZbRb 2$ -DALK- ALK CO NRR， 1 Q-^^rk^^AaRi) ^φ：产;rp5^ 20 -O-ALK- ALK OR V〇^^°V^〇*^°'^〇-^ Λ ?-^N>^s^AaR|( j^； ,φι. 30 -30- 157426.doc 201208689 Μ l2 Q G 式(IA)之化合物 n。 -0-ALK· ALK CO OR 31 -D-ALK* -(ΟΗ,ΟΗζΟν CHjCHr OR 32 -D-ALK· -(CHaCHaOV CHaCHr CO OR ；xpi. 33 -E^ALK* -(CHaCHaOV CHaCHr NRR' 34 -DrALK. -(CH^CHzOV CHaCHr CO NRR， /ν>^*Ύ〇 n 35 -D-ALK- ALK CO NRR， 〇^s-^^s/s,^^NZbRb ；xp3^ 36 所述化合物包含對結合劑上存在之反應性化學基團 (RCG2)具有反應性之反應性化學基團（RCG1P RCG1與 RCG2之間之反應可藉由形成共價鍵將式（I)化合物附接至 結合劑。因此，式（I)化合物可與結合劑連接。 RCG1代表： (i)反應基團-SZa，其中Za代表Η或基團-SRa&Ra代表基 157426.doc -31- 201208689 圈（q-C6)烧基、（CVC7)環烧基、芳基、雜芳基或（c4_Ci〇) 雜環烷基； (ii)反應基團-C(=〇)-ZbRb，其中zb代表單鍵、_〇_或_ΝΗ· ，更特定而言-Ο- ’且Rb代表Η或基團（Ci-C^)烷基、（c3-c7) 環烷基、芳基、雜芳基或（C4_Cl())雜環烷基。 更特定而言，-SZa可代表-SH或-ss(c丨-C6)烷基，尤其 -SSMe、或-SS-雜芳基，尤其或_^ΧΓ(χ^χ2係 如下文所定義）。更特定而言，_SZa可代表_SH或_ss(Ci_ C6)烷基，尤其-SSMe。 更特定而言，-ZbRb可代表_〇H(酸官能團） 。5 -0-N Ϊ 基，尤其-OCH3、-〇CH2CH3、-〇CH2CH=CH2(酯官能團）邊 Q 〇
^SO,M
-0-N 另一選擇為-ZbRb可代表 f ' 厂Μ=Η*»*子 U或差 團^ ，其中IG代表至少一個電绣導基@ (electroinductive group)，例如·Ν〇α·Ημ，尤其_F。其〒 F e
基 反應基團-SH及
為（例如）以下基團中之一者：-οΗ〇>-νο2或 •C(—0)ZbRb之另一類型係 N0n。 示良好反應性》 更特定而言’ -ZbRb可代表_0H(酸官能團）、_〇(Ci-C6)烷 基：尤其-och3 . -och2ch3，·或另一選擇為_ZbRb可代表
更特定而言’ RCG1可選自彼等闡述於實例中之一者。 157426.doc •32· 201208689 作為RCG2之實例，可提及由存於抗體表面上之離胺酸 殘基之側鏈產生之離胺酸的ε-胺基、藉由鏈内二硫鍵還原 產生之半胱胺酸之较鏈區或硫醇之糖基團（Garnett M.C. 等人，Advanced Drug Delivery Reviews 2001，53，171-216)。最近，已考慮其他方法，例如藉由突變引入半胱胺 酸（Junutula J.R.等人，Nature Biotechnology 2008，26, 925-932; WO 09026274)或引入允許其他類型之化學基團的 非天然胺基酸（de Graaf A.J.等人，Bioconjugate Chem. 2009，出版曰期（網路）：2009年2月3曰（綜述）；DOI : 10.1021/bc800294a ; WO 2006/069246 及根據 Chin J.W.等 人，JACS 2002，124，9026-9027(ReCode® 技術））。該等用 於抗體之附接模式適用於所有已知隨其結構變化之靶向 劑。 亦可以化學方式修飾靶向劑以便引·入新穎反應性化學基 團RCG2。因此，彼等熟習此項技術者熟知使用修飾劑修 飾抗體之方式（尤其參見WO 2005/077090第14頁）。此修飾 可改良連接反應並可使用更寬範圍之基團RCG1。 用於引入二硫基團之修飾劑 該修飾劑可為式 飞之活化酯NHS其中R代表基 團（CkQ)烷基、芳基、雜芳基、（C3-C7)環烷基、（C4-C10) 雜環烷基；例如，可使用二硫代丙酸N-吡啶基酯（SPDP)或 吡啶基二硫代丁酸N-琥珀醯亞胺基酯（SPDB或4-(2·吡啶基 二硫代）丁酸之N-羥基琥珀醯亞胺基酯）以便引入RCG2之二 157426.doc -33- 201208689 硫代吡啶基反應基團（參見8〇1^(1〇11%.八.等人，則0(；116111.】. 1978，173，723-737 ; US 5208020)，其隨後可與吡哈并 [1，4]苯并二氮呼二聚體之連接體上存在之-SH型反應性化 學基團RCG1反應以形成新的-S-S-鍵（參見實例丨）用於具有 二硫鍵之偶聯物。N-羥基琥珀醯亞胺基團優先在存於抗體 上之胺基上反應以便形成醢胺鍵。修飾劑之另一實例係闡 述於WO 2004/016801中之式 例如 可使用4-(5-硝基-2-»1比咬基二硫代）戊酸N-琥珀醯亞胺基酯 (SNPP)、或闡述
於 WO 2009/134976 中之式 之聚乙二醇化類似物，或闡述於 WO 2009/134977 中之式 該等式中：
之磺酸類似物，在 • Χ3、Χ4、Χ5、Χ6代表Η或基團（CVC6)烷基， • X丨及Χ2代表-Η、-CONX8X9、_Ν02，Χ8&Χ9代表η或基團 (CVQ)烷基， -X7代表-SO，M+或Η或另一選擇為四級銨基團； -a表示介於〇至4範圍内之整數且b表示介於〇至2〇〇〇範圍 内、較佳介於1與200之間之整數；a及b分別可取介於〇與4 之間或0與2000之間之所有值》 較佳地，在式 化合物中，a: X3=Me 157426.doc -34. 201208689 且 X2=N02且 X丨=X4=X5=X6=X7=H。 用於引入馬來醢亞胺基之修飾劑 另一修飾劑可為式Α) 之活化酯NHS，其中R代表 基團-(CHA-、_(CH2)n_環己基-、-環己基_((^2)11_且η代表 介於1至10範圍内之整數；例如，可使用4_(Ν_馬來醯亞胺 基曱基）環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯（SMCC)(根據ΕΡ 0306943)或硫代_SMCC(4_(N_馬來醯亞胺基甲基）環己烷小 ^酸硫珀醯亞胺基酯可提及之其他實例包括
’例如3-馬來醯亞胺基丙酸N-琥珀醯亞胺基 … u 。。’例如6-(3-馬來醯亞胺基丙醯胺基） 己酸N-琥轴醯亞胺基酯；b卜Vr:x5，b為介於0與 2000之間、較佳介於1與200之間之整數（b可取介於〇與 2000之間所有值）’例如3_(2_{2_[3_馬來醯亞胺基丙醯基胺 基]-乙氧基}乙氧基2丙酸N-琥珀醯亞胺基酯或sm(PEG)2 ; k.，，"CJALK--0 丫 (C，-C«)AU<— 。，例如琥珀酸馬來醯亞胺基乙基N-琥
例如4-(4-馬來醯亞胺基 珀醯亞胺基酯；
例如3 -馬來画 苯基）丁酸N-琥珀醯亞胺基酯或 亞胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯 用於引入硫醇基團之修飾劑 闡述於WO 90/06774中之修飾劑的另一實例具有 157426.doc •35· 201208689
Ha|· ，其中 -Hal代表鹵素原子； 代表齒素原子或基團C〇〇Xm、石肖基、·未經取代或經 齒化之⑹心）烧基、未經取代或經以匕之（Ci_c〇炫氧基、 未經取代或經#化之（CVC㈣基、未經取代或經齒化之 (C2-CS)炔基、未經取代之（C3_Cs)環院基、未經取代或經— 至三個選自以下之取代基取代之芳基：胺基、齒素原子、 未經取代或經齒化之基團（C”C8)烧基或未經取代或經南化 之（C丨-c8)烷氧基； -基團X"、xia、X,3各自獨立地代表氫原子或另一選擇為 可代表X1Q; ^ 或X1G與xu—起形成（CrC5)伸烷基環，其未經取代或經i 至5個基團（c】-c4)烷基取代； 或X〗o或Xu與Xu —起形成（Ci-Cs)伸烷基環，其未經取代戈 經1至5個基團烷基取代； 且Xi4係-H或基團（C^-Cs)烷基； 或 XlOeXHsXjfXncH。 較佳地’ Hal代表氣或溴原子^ XwXu之可能性可參見 下表： 157426.doc -36- 201208689 X，〇 X11 Xu Xu Hal Me H H H Cl Ph H H H Cl t-Bu H H H Cl Me Me H H Cl (•CH2(CH2>3CH2-) H H Cl H (*CH2<CH2)3CH2·) H Cl Et H H H Br Et Me H H Cl -9h-ch2-9h H H H Cl Me H Me H Cl H H Me Me Cl Ph Me H H Cl 4-CIPh H H H Cl 3-呋喃基 H H H Cl i-Pr H H H Cl Me Me Me Me Cl CeHn H H H Cl Xio Xu X« X« Hal CH2Br H H H Cl CFj H H H Cl CH=CHa H H H Cl 2-NH2Ph H H H Cl
較佳亞胺基硫咮之實例係以下：。 用於引入齒代乙醯胺基之修飾劑 修飾劑之另一實例係4-(N-碘乙醯基）胺基苯曱酸琥珀醯 、 亞胺基酯（SIAB) 或類似化合物，包括N-換 乙酸琥珀醯亞胺基酯（SIA)# ° 、N-溴乙酸琥珀醯亞胺 基酯（SBA)、或3-(N-溴乙醯胺基）丙酸琥珀醯亞胺基酯 (SBAP)或闡述於WO 2009/134976中之類似聚乙二醇化化 合物W f1，b係如前文所述。圖1及2闡釋用 SPDP或另一選擇為上述較佳亞胺基硫咮修飾結合劑之胺 基0 因此，在RCG1代表-SH之情形下，可在結合劑上引入尤 -37· 157426.doc 201208689 其吡啶基二硫類型-S、 s^O或一s、s^QT之二硫RCG2基團 (-SSR)。類似地，在RCG1代表二硫情形下，可在結合劑 上引入硫醇（-SH) RCG2基團，例如利用亞胺基硫味，（即 RCGl=-SZa，其中Za#H，例如za= _s^))。亦可藉由與相 f 丫、X) rV：xr 、 應方香族一硫化物或反應將該等硫 醇（-SH) RCG2基團修飾為二硫（_SSR) RCG2基團，尤其吡 咬基二硫化物類型一s、s 或-s、s^〇T β在兩種情形下， 藉由RCG1與RCG2之間之反應形成之共價鍵係可裂解二硫 鍵。 在RCG1代表-SH之情形下’亦可在結合劑表面上引入馬 來醯亞胺基（《Γ )或鹵代乙醯胺基類型（例如，溴-或诚乙 醯胺基之RCG2基團。在此情形下，藉由虹⑴與 RCG2之間之反應形成之共價鍵係不可裂解之硫鍵。 因而， >在包含-SZa型反應性化學基團RCG1的式（I)衍生物存 在下，結合劑包含： 在RCG1代表-SH之情形下，二硫化學基團； •在RCG1代表-SZa且Za#H之情形下，硫醇化學基團； •在RCG1代表-SH之情形下，馬來醯亞胺基或鹵代乙 醯胺基化學基團； >在包含-C(=0)-ZbRb型反應性化學基團RCG1之式（I) 衍生物存在下，式（I)衍生物與結合劑之胺基官能團、尤其 157426.doc •38· 201208689 由抗體之離胺酸（Lys)殘基之側鏈產生之ε-胺基反應。 更特定來說， >在反應性化學基團RCG1屬於-SH型時，及在結合劑 具有胺基官能團、尤其由抗體離胺酸殘基之側鏈產生之ε- 胺基時’。後者借助修飾劑修飾，該修飾劑選自式 R、s/S-(c,*c6)alk又 之化合物，其中R代表基團（(：丨-(：6)烷基、芳 基、雜芳基、（C3-C7)環烷基、（c4-c1())雜環烷基；
之聚乙 x4、x5、X6代表Η或基團（CVC6)烷基，X,&X2代表-H、 _CONX8X9、-N02，X8&X9代表 η或基團（CVCe)烷基，X7 代表-SO/M+或Η或另一選擇為四級錢基團且a表示介於〇至 4範圍内之整數且b表示介於〇至2000範圍内之整數；或選 自4-(N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷_丨-甲酸琥珀醯亞胺基 酿；4-(N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷_丨-甲酸硫代琥珀醯亞
胺基酯 其中R代表基團 -(CH2)n-、_(CH2)n-環己基_、_環己基-(CH2)n-且η代表介於1 至10範圍内之整數； 157426.doc 39- 201208689
乙酸琥珀醯亞胺基酯；3-(N-溴乙醯胺基）丙酸琥珀醯亞胺
Q 基酯；
，b為介於〇與2000之間之整數。 >在反應性化學基團RCG1屬於-SZa型（Za#H)時及在結 合劑具有胺基官能團、尤其由抗體離胺酸殘基之侧鏈產生
之ε-胺基時，後者借助前文所述之式〜 之修飾劑 修飾。 >在反應性化學基團RCG1屬於-SH型時，及在結合劑 含有硫醇官能團時，尤其在藉由突變或藉由含有胺基官能 團之結合劑之化學修飾引入半胱胺酸後’結合劑經修飾以 使其硫醇官能图轉化為二硫官能。例如，讦蚀田浓ώ
代表-H、-CONX8X9 或-ν〇2，χ8 烷基。 -conx8x9 或-Ν〇2，χ8及 χ9代表 Η或基圑 之胺基的修飾。為簡 下表II闡釋根據前述方法之結合劑 明起見，使用下列縮寫： 157426.doc 201208689
修飾劑 在標記為MAb之抗體之 胺基、尤其離胺酸上 反應後的實例 偶聯物 FWS^S— (C1^e)ALX--^〇X3 0 R.s.S-(C^JALK—1nh MAb ^'S-tC.-CeJALK—ί.Νκ .W'UaU^’ _ tMAb d SPDP= θν8^-〇Η,ΟΗ,-1.〇Χ^ 0 MAb g L·. _JQ fKb SPDB= (X™i^ 0 - (X—A H MAb -fl Γ|1 Tom，、Aijh/i 人auc-to 吣 L. _Jfl AAb SMCC= IT^-srO^NH _ 〇 J MAb 3 A _T〇m，、AjhAAUC〆7⑽.， — [HMAb _d 碩基-SMCC: 飞 ° 157426.doc • 41 · 201208689 修飾劑 在標記為MAb之抗體之 胺基、尤其離胺酸上 反應後的實例 偶聯物 MAb g _ T〇m，、Ajk丄/^T_. d SNPP= ΧΡ^δ·，δ'γ^Ν^'ΝΗ ΜΑ - Jo i) L*^S_SY^^NHMA r〇m，、AH，Twn.，丄 b 〇 乂 Ϋ 乂。 、 MAb ΜΗ '丫 'ρϋ〜s、s人 、MAb NH、 f4Mb。〜s_s入 T〇m'vALK'M^ALH ,Tom\ ：^xr MAb-N so,Η Jo m f〇,H .NH^S-S [fj .Tom' _ 了⑽，、AL“人A」d ^11 ^^=NHj+ Hah L MAbNHY^SH •NH, Xii^a -Hah -」e fj _y^s1. :r.， _ T〇m，、AL^M人A _[d MAb N 这从。 Hah JB SIAB= 〇 W _ ° 丄 MAb h Ήγ(ΧΗ^3 0 —iXr t Jd SIA= 〇 MAbNH- - Jg MAb NH-. |Γ] /om，i T〇m，、AL^MfS^K· rf L. _J0 MAb Jg MAb NH 1,. xX^t Dm*, 」d g :經修飾結合劑上之官能團RCG2的數目；d :結合劑Mab 上之吡咯并[1，4]苯并二氮呼二聚體的數目 L*代表 -42· 157426.doc 201208689 本發明化合物由此可用於製備下式之二聚體在Μ之對位 共價附接之結合劑：
更特定而言，結合劑係抗體。更特定而言，二聚體具有 下式：
式（I)化合物可根據反應圖1來製備：
反應圖1 化合物Pi、P'l及Ρ2—起反應產生ρ3。LG及LG’表示離去 基團。術語「離去基團」表示原子或原子之群組，其中在 157426.doc • 43· 201208689 P2與Pi或ΡΊ之間之異裂反應中’連接ALK與LG或LG'之共 價鍵之孤對電子離去。更特定而言，離去基團選自函素原 子（尤其氯或溴）、甲續酸醋、甲苯績酸醋或硝基苯績酸 酯基團或-OPPh/。中間體化合物P2亦構成本發明之一部 分。 在包含基團RCG1之式（I)化合物之製備中，χ，可代表該 基團RCG1 ’在此情形下P3代表式（1)化合物β χι亦可為_SZa 型或另一選擇為-C(=0)ZbRb之該基團RCG1的前體，且在 此情形下’需要借助一或多種化學反應將χι轉化為 RCG1。根據一種變化形式，亦可對p2實施轉化χ，+ RCG1。 因此’對於化合物Ρ3(或根據變化形式Ρ2)(其中Za=H)之 製備而言，較佳使用相應連接體之前體引入基團X，=_gZa (其中Za=-S(c丨-C6)烷基），且隨後將二硫官能團_ss(c丨_c6) 烧基還原為硫醇官能團-SH。為此，可使用（例如）三（2_羧 基乙基）膦：就此而言，參見Burns J.A.等人，j. 〇rg,
Chem. 1991，56(8)，2648-2650 » 此轉化-SSCCVCJ院基 + -SH可尤其適於表I之化合物1至19。
在根據轉化X，+ RCG1自P3製備式⑴化合物以使rcgI代 表基團-SH之情形下，亦可形成化合物p3，以使χι亦可代 表基團-SZa，其中Za= 〇 其對應於硫醇官能團與亞胺官能團之加合物 157426.doc -44 - 201208689 類似地，對於包含基團RCGl=-C(=0)ZbRb之式（I)化合物 的產生而言，可借助一或多種化學反應將基團X’=-C(=0)ZbRb 轉化為基團RCGl=-C(=0)ZbRb。特定而言，在-C(=0)ZbRb= f之情形下，可在化合物P3(或根據變化形式P2)上引 入基團Xy-CpCOCKCVCd烷基或-C(=0)0-烯丙基，隨後 將其轉化為基團-C(==0)OH，其最後與碳酸N-N’-二琥珀醯 亞胺基酯或NHS反應。可藉由在胺「清除劑」（例如嗎啉） 存在下用鹼（例如LiOH)或鈀觸媒（例如四（三苯基膦）鈀）處 理來實施-COO烷基/烯丙基至-COOH之轉化。在鹼（例如 DIPEA)存在下實施與N，N’-二琥珀醯亞胺基之反應；在偶 合劑（例如DCC)存在下實施與NHS之反應。類似地，在 -C(=0)ZbRb= 之情形下，可引入基團-C(=0)ZbRb= -COOH，其隨後與N，N’-羰基二咪唑反應（JACS 1958，80, 4423; JACS 1960，82，4596)。此轉化X，=-C(=0)ZbRb + RCGl=-C(=0)ZbRb尤其可適於表I之實例20至36之化合 物。 化合物Pi及P、闡述於專利申請案WO 00/12508、WO 00/12507、WO 2005/040170、WO 2005/085260、WO 07085930或WO 2009/0165 16中或可經由全合成獲得（Mori Μ.等人，Tetrahedron，1986, 42, 3793-3806)。在卩！及/或 Ρ’ι 代表下式之托馬黴素（tomaymycin)之情形下：
托馬徽素 ，後者可借助菌株番紅鏈黴菌 157426.doc -45- 201208689 (Streptomyces croceus)藉由遵循FR 1516743之教示或另一 選擇為藉由全合成製得（參見J. Antibiotics 1983, XXXVI(3), 276-282 Z. Tozuka「Studies on tomaymycin. Total syntheses of the antitumor antibiotics E- and Z-tomaymycins」）。亦存在市售化合物Pi/P'i。 對於基團W/W之引入而言，亞胺官能團（==雙鍵）能 夠增加各種化合物HW/HW’（例如H20、醇ROH)。 Q=單鍵之情形
反應圖2 p2之製備
反應圖3 i.在鹼（例如K2C03)存在下在極性溶劑（例如DMF或THF) 中之P4之二級胺官能團-NH-與式LG''-(CH2CH2〇)k-(：Η2(：Η2-0(Ι^··=離去基團）之試劑之間之親核反應。 試劑 LG，，-(CH2CH20)k-CH2CH2-G係自式 H〇_(CH2CH20)k-CH2CH2-G之化合物藉由用離去基團LG"替代基團-OH借助 彼等熟習此項技術者已知之化學反應獲得。舉例而言，在 157426.doc • 46- 201208689 LG"代表甲磺酸酯基團之情形下，在鹼（例如三級胺（例如 TEA))存在下使用甲烷磺醯氯。在1^0"代表I之情形下，使 用（例如）蛾化鈉根據D. Marquis等人之J. Org. Chem. 1995, 24, 7984-96用I取代甲磺酸酯。 式 H0(CH2CH20)k-CH2CH20CH3 之 PEG-醇有市售（例如， 參見美國公司QuantaBioDesign有限公司之目錄）。其他 PEG-醇 H0(CH2CH20)k-CH2CH20R(R#Me)有市售或另一選 擇為可自H0(CH2CH20)k-CH2CH20H借助彼等熟習此項技 術者已知之化學反應獲得。類似地，其中G=NRR’且k>=l 之某些化合物有市售，例如：
ii. LG及LG，之引入。在甲磺酸酯基團之情形下’在驗 (例如三級胺（例如TEA))存在下使用MSC。 Q=-C(=0)之情形
反應圖4 P2之製備 157426.doc • 47· 201208689
反應圓5 i. P4 與式 T-C(=0)-(CH2CH20)k-CH2CH2-G之羧酸衍生物 之間之醯胺化反應。 羧酸衍生物可為酿基卤（T=-Hal)。根據一種變化形式， 在偶合劑存在下使用活化酯（例如T=-ONHS)或另一選擇為 羧酸（T=-OH)。式 H0C(=0)-(CH2CH20)k-CH2CH20R之 PEG-酸可自式HO-(CH2CH20)k•丨_CH2CH2OR之相應PEG-醇（對於 k=l至11，其有市售）藉由添加至丙烯酸鈉中根據J. Huskens, J.A. Peters, H. van Bekkum, Tetrahedron 1993, 15，3149-64製得。此與G係k>=l之基團NRR·時以式H-(OCH2CH2)ic-i-CH2CH2NRR’之相應化合物開始的情形相 同。類似地，化合物HOC(=〇HCH2CH2)-NRR' (k=0)有市 售。 ii. LG及LG·之引入。在甲磺酸酯基團之情形下，在鹼 (例如三級胺（例如TEA))存在下使用MSC。 P4之製備 X，=_C(=0)-ZbRb 之情形
反應圖6 157426.doc • 48· 201208689 i. 保護基團PG，，之引入。在4-硝基苯磺酸酯基團之情形 下’在驗（例如三級胺（例如TEA)或》比咬）存在下使用2-硝基 苯磺醯氯； ii. 基團PG及PG·之去保護。舉例而言，在氫氣酸或tfa 存在下在基團PG及PG'係TBDMS時》 根據一種變化形式，在ALK=ALKi=-CH2-之情形下，P5
可代表。 。。隨後用經（例如）硼氫化鈉將酯官能團 還原為-CH2OH之步驟替換去保護步驟；為此，可施加WO 2007/085930第62至63頁上給出之還原條件。如稍後所 述’此由使用二酯及隨後施加還原組成之變化形式可概括 為另一 Ps。此外，可對P4但視情況根據一種變化形式亦對 P5實施酯官能團之還原。 iii.在鹼（例如K2C03)存在下在極性溶劑（例如DMF或 THF)中之受保護胺官能團_NH(PG，，）與式LG-L2-C(=0)-ZbRb 之試劑之間之親核反應》 對於L2=(C丨-C6)ALK之情形而言，式Br-(C丨-C6)ALK-C(=0)-0Me之溴·烷基酯有市售。對於L2=-(CH2CH20)j-CHzCH2-之情形而言，可以式 H0-(CH2CH20)j-CH2CH2-C(=0)ZbRb之相應PEG-酵開始引入LG。該等化合物有市售 或另一選擇為可自式H0-(CH2CH20)j-H之相應PEG-二醇 (對於1至11而言’其有市售）藉由添加至丙烯酸鈉中根據j.
Huskens, J.A. Peters, H. van Bekkum, Tetrahedron 1993, 15, 3149-64獲得。 157426.doc -49- 201208689 iv.基團PG"之去保護。舉例而言，在硫代苯酚及鹼（例如 碳酸铯）存在下在PG"係4-硝基苯磺酸酯基團時。 X’=-SZa之情形 L2=(Ci-C6)ALK 之情形
反應圖7 i.在基團PG及PG'係TBDMS時在（例如）氫氣酸或TFA存在 下較佳在酸性介質中之保護基圑PG及PG'的去保護。 根據一種變化形式，在ALK=ALK' = -CH2-之情形下，P5
可代表。 。。隨後用經（例如）硼氫化鈉將酯官能團 還原為官能團-CH2OH之還原替代醇官能團之去保護步 驟，之後進行胺官能團之去保護步驟；為此，可施加WO 2007/085930之第62至63頁上給出之還原條件。 ii. 用式HC(=0)-ALK-SZa之醛的還原胺化。 iii. 用還原劑（例如三乙醯氧基硼氩化鈉）根據A.F. Abdel-Magid等人，J. Org. Chem. 1996, 61, 3849-62較佳在乙酸中 原位還原中間體胺。 L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"-ALK-之情形 157426.doc -50- 201208689
iPO、AL
(CHaCHl〇UCH1CH,NR，MCt-Ce)AL»'
反應圖8 i. 保護基團PG"之引入。在4-硝基苯磺酸酯基團之情形 下，在鹼（例如三級胺（例如TEA)或吡啶）存在下使用2-硝基 苯確醯氯； ii. 基團PG及PG'之去保護。舉例而言，在氫氯酸或TFA 存在下在基團PG及PG'係TBDMS時。 根據一種變化形式，在ALK=ALK'=-CH2-之情形下，P5
可代表。 。。隨後用經（例如）硼氫化鈉將酯官能團 還原為官能團-CH2OH之步驟替換去保護步驟；可施加為 此，WO 2007/085930第62至63頁上給出之還原條件。 iii. 在鹼（例如K2C03)存在下在極性溶劑（例如DMF或 THF)中之受保護胺官能團-NH(PG")與式LG-(CH2CH20)jCH2CH2N3之試劑之間之親核反應。該等化合 物可根據 WO 07/085930 以式 H0-(CH2CH20)j + 1-H 之相應 PEG-二醇（對於j=0至10而言，其有市售）開始獲得。 iv. 在三苯基膦及水存在下經由（例如）Staudinger反應之 157426.doc -51- 201208689 疊氮基的還原。 V.式HC(=0)-ALK-SZa之醛的還原胺化； vi. 用還原劑（例如三乙醯氧基硼氫化鈉）根據A.F. Abdel-Magid等人，J. Org· Chem. 1996, 61, 3849-62較佳在乙酸中 原位還原中間體胺。 vii. 二級胺官能團之院基化。 viii. 基團PG"之去保護。舉例而言，在硫代苯酚及鹼（例 如碳酸鉋）存在下在PG"係4-硝基苯磺酸酯基團時。 P5之製備
Lp-D^C丨-C6)ALK-、D=0 或 NH 之情形 GP0
0GP· ALK
i.Br-(CrCe)ALK-NHboc GPO
ALK 人〆〇GP. M ALK*
D-fC^^ALK-NHBoc ii.去保護 GPO
反應圖9 i. 在鹼（例如K2C03)存在下在極性溶劑（例如DMF或THF) 中之官能團-DH與式Br(C丨-C6)ALK-NHboc之boc-保護之溴-胺之間的親核反應（例如，參見WO 07085930之第63頁上之 條件）。 ii. 在（例如）氫氣酸或TFA存在下較佳在酸性介質中之胺 之選擇性去保護。對於不可實施選擇性去保護之情形而 言，例如在基團PG及PG'係TBDMS時，需要醇之選擇性重 新保護的步驟。 根據一種變化形式，在ALK=ALK'=-CH2-之情形下，可 157426.doc -52- 201208689
DH ΕωγΌγ0Ει 用式 』 。之二酯親核取代溴-胺以便獲得式
IjMCAiALK-NH, Εωγ^Μ^γ〇Ε* ° 。 之化合物Ρ5，其以如所獲得形式用於製備Ρ4。 • Lr-NUCVCO 烷基 HCVDALK-之情形
反應圖9’ i.在鹼（例如K2C03)存在下在極性溶劑（例如DMF或THF) 中之官能團-NH-與式R*-Hal之烷基_ (RLCCi-Cd烷基）之 間之親核反應。 根據一種變化形式，在ALK=ALK'=-CH2-之情形下，可 ΝΗΗΟ,-Ο^Κ-ΝΗΒοε
OEt 用式 b 。 之二酯親核取代烷基函以便獲得式 ^Ν-ίΟ,-Ο,ΪΑίΚ-ΝΗ,
OEt R* ΰ 。 之化合物Ρ5，其以如所獲得形式用於製備Ρ4 Lf^OCH^CHA之情形
i_在鹼（例如K2C03)存在下在極性溶劑（例如DMF或THF) 157426.doc -53- 201208689 中之-OH官能團中之一者（另兩者經表示保護基團之PG保 護）與具有離核基團（LG)(例如Hal或甲磺酸酯）之式LG- 之疊氮基-PEG試劑之間的親核 反應（例如，參見WO 07085930第63頁上之條件）。 ii.在水存在下在極性溶劑（例如THF)中之經（例如）三苯基 膦之疊氮基的還原。 根據一種變化形式，在ALK=ALK^=-CH2-之情形下，可
之羥基-二酯親核取代疊氮基-PEG試劑以
便獲得式。 。之化合物P5，其以如所獲得形式用於 製備P4。 L1 =單鍵之情形
反應圖11 i.醇基團之保護
應受保護二醇之實例闡述於WO 2009/016516第48頁上之反 應圖1中（反應圖1之化合物2及3)。受保護二醇之兩個實例 係CAS第181225-40-1號及第181225-41-2號之彼等。鹵基-二醇可藉由還原相應二酸或二酯化合物（例如CAS第 157426.doc •54- 201208689 193010-40-1號之二酸或二酯化合物）獲得。在吡咬（M=N) 之情形下’亦參見：Liebigs Annalen der Chemie 1991，10, 987-988或 Tetrahedron 2005，61(7)，1755-1763(反應圖 1之 化合物3)。 可藉由下述實例之操作條件來啟示熟習此項技術者，該 等操作條件係針對特定連接體及L2給出且可使其適應其 他連接體1^及1^。 製備偶聯物之方法 經由由以下組成之方法獲得偶聯物： ⑴使視情況經修飾劑修飾之結合劑的水溶液（視情況經緩 衝）與式（I)化合物之溶液接觸並反應； (Π)及隨後視情況分離步驟⑴中形成之偶聯物與式⑴化合 物及/或未反應結合劑及/或可能形成之任何聚集物。 式（I)化合物之化學基團RCG1可對結合劑上存在之化學 基團RCG2 '尤其對抗體上存在之胺基具有反應性，若適 當’修飾劑已引入該等化學基團RCG2以便經由形成共價 鍵將式（I)化合物附接至結合劑》 根據一種變化形式’在步驟（ii)中，分離步驟⑴中形成 之偶聯物與未反應之結合劑及溶液中可存在之任何聚集 物。根據另一變化形式’在步驟（ii)中，僅分離步驟⑴之 偶聯物與未反應式（I)化合物及可能已形成之聚集物，且任 何未反應結合劑留在溶液中。 可用至少一種緩衝液（例如磷酸鉀或N-2-羥基乙基六氣 °比嗪-Ν··2·乙烷磺酸）(HEPES緩衝液）緩衝結合劑之水溶 157426.doc •55- 201208689 液。緩衝液取決於結合劑之性質。將式⑴化合物溶解於極 性有機溶劑（例如DMSO或DMA)中。 通常在介於20°C與40°C之間之溫度下進行反應。反應時 間可介於1小時至24小時之範圍内。可藉由SEc用折射及/ 或紫外線檢測器監測結合劑與式⑴化合物之間之反應以便 破定其過程。若接枝程度不足，則可反應更長時間及/或 可添加式（I)化合物。對於關於可用於連接之特定條件的其 他細節’可參照實例部分中給出之一般方法。 熟習此項技術者具有各種層析技術可供用於步驟（Π)之 分離：可藉由（例如）空間排阻層析（SEC)、藉由吸附層析 (例如’離子交換，IEC)、藉由疏水相互作用層析（HIC)、 藉由親和層析、藉由混合支撐物（例如陶瓷羥基磷灰石）上 層析或藉由HPLC純化偶聯物。亦可使用藉由透析或透析 過濾之純化。 術語「聚集物」意指可在兩種或更多種結合劑之間形成 之締合該等結合劑可能藉由連接經修飾。聚集物能夠在 大量因素影響下形成，該等因素例如結合劑在溶液中之高 漢度、溶液之pH、高剪切力、接枝二聚體之數量及其疏水 性質、溫度（參見 J. Membrane Sci. 2008, 318, 311-316 之前 言中所引用之參考文獻），偶然地並不精確解釋其中之一 些之影響。在蛋白質或抗體情形下，可參照AAPS Journal， 「Protein Aggregation and Bioprocessing j 2006，8(3)， E572-E5 79。可借助已知技術（例如SEC)確定聚集物之含量 (就此而言，參見 Analytical Biochemistry 1993，212(2)， 157426.doc ·56· 201208689 469-480) ° 在步驟⑴或（ii)後，偶聯物之溶液可經受超濾及/或透析 過濾之步驟（iii)。在該等步驟後由此獲得存於水溶液中之 偶聯物。 抗體 . 抗體（就此而s ’參見Janeway等人 「Immunobiology」，第 5版，2001，Garland Publishing, New York)可選自彼等尤其 闡述於專利申請案WO 04043344、WO 08010101、WO 08047242、WO 05009369(抗CA6)中者。抗體尤其可為單 株、多株或多特異性抗體。其亦可為抗體片段。其亦可為 鼠類、人類、人類化或嵌合抗體。 偶聯物 偶聯物通常包含約1至10個附接至結合劑之吡咯并[1，4] 苯并二氮呼二聚體（此係接枝程度或「藥物與抗體比率」 (或「DAR」））。此數目隨結合劑及二聚體之性質、亦及用 於連接之操作條件變化而變化（例如，二聚體相對於結合 劑之等效量之數目、反應時間、溶劑及任何共溶劑之性 質）。使結合劑與二聚體接觸產生包含以下之混合物：因 , 不同DAR個別地彼此區分之若干偶聯物；可能之未反應結 合劑（在不完全反應情形下）；可能之聚集物。因此，藉由 (例如）UV光譜針對最終溶液測定之DAR對應於平均DAR。 在結合劑係抗體之情形下，UV光譜可為用於測定DAR 之方法。此方法受Antony S. Dimitrov(編輯），LLC， 2009、「Therapeutic Antibodies and Protocols」，第 525 卷， 157426.doc ·57· 201208689 445，Springer Science中所提出者啟示。其由在兩個波長 (標記為WL1及WL2)下在分離步驟（ii)後量測偶聯物溶液之 吸光率組成。使用連接之前之裸抗體及°比咯并[1，4]苯并二 氮呼二聚體的以下莫耳消光係數。 在SEC譜之相應峰上（其使得可計算「DAR(SEC)」）或藉 由使用標準UV分光光度計（其使得可計算「DAR(UV)」）量 測WL1及WL2下偶聯物之溶液的吸光率（AWL1)及（AW1^2)。 可以以下形式表示吸光率：
AwLl=(CDXeD WLi) + (CaX6a WLl)
AwL2 = (c〇Xe〇 WL2) + (CAXeA WL2) 在該等方程中： • CD&CA分別表示與°比咯并[1，4]苯并二氮呼二聚體有關 之偶聯物之部分及與抗體有關之偶聯物之部分之溶液 中的濃度； • eD WL丨及eD WL2分別表示在波長WL1及WL2下連接之前 之吡咯并[1,4]苯并二氮呼二聚體的莫耳消光係數； • wli及eA WL2分別表示兩個波長WL1及WL2下之裸抗 體之莫耳消光係數。 術語「裸抗體」意指不附接吡咯并[1，4]苯并二氮呼二聚 體之抗體，即連接步驟之前之抗體。 解析該兩個方程得出： CD_[(eA WLlXA\VL2)-(eA WL2><A\vLl)]/[(eD WL2XeA WLl)-(eA WL2 XeD WLl)] cA=[AwLi-(c〇xeD wLi)]/eA WL1 157426.doc -58- 201208689 則平均DAR對應於cD/cA。在。比咯并[1，4]苯并二氮呼二聚 體之情形下，所考慮之兩個波長係：WL· 1=280 nm及 WL2=320 nm。平均DAR較佳介於1與10之間，且較佳介於 1.5與7之間。 偶聯物可用作抗癌劑。由於結合劑之存在，使得偶聯物 對腫瘤細胞而非健康細胞極具選擇性。此使得可將具有抗 癌活性之式（I)化合物引導至接近該等腫瘤細胞或直接在其 中之環境中（就此而言，參見以下公開案，其闡述單株抗 體偶聯物在癌症腫瘤中之用途：「Antibody-drug conjugates for cancer therapy」 Carter P.J.等人，Cancer J_ 2008，14, 154-169 ; r Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs」 Chari R·，Acc. Chem. Res. 2008，41， 98-107)。可治療實體癌或液體癌。 可以通常介於1 mg/ml與10 mg/ml之間之濃度以緩衝水 溶液形式調配偶聯物。因此可以灌注形式注射此溶液，或 可重新稀釋以形成灌注溶液。 [實例] 方法A:高壓液相層析-質譜（LMSC) 在Waters UPLC-SQD機器上以正及/或負電噴霧離子化模 式（ES+/-)獲得該等譜。層析條件：管柱：ACQUITY BEH C18-1.7 μιη-2.1χ50 mm ;溶劑：A : Η2Ο(0·1%曱酸）B : CH3CN(0.1% 甲酸）；管柱溫度：50°C ;流速：1 ml/min ; 梯度（2 min):在 0.8 min内自 5%至 50% B ; 1.2 min : 100% B ; 1.85 min : 100% B ; 1.95 : 5% B。 157426.doc -59- 201208689 方法B:高壓液相層析-質譜（LMSC) 在Waters ZQ機器上以正及/或負電噴霧模式（ES+/-)利用 U.V. DAD 200<WL<400 nm檢測器獲得該等譜。層析條 件：管柱：Phenomenex Kinetex C18 100A 3x50 mm，顆粒 直徑2.6 μιη ;溶劑：A : H2O(0.1% 甲酸）B : CH3CN ;管柱 溫度：50°C ;流速：1 ml/min ;梯度（6 min) : 6% B 達 0·80 min ;在 3.9 min内自 6%至 100% Β ; 4·80 min : 100% Β ; 5 min : 6% B ; 6 min : 6% B。 方法C:高壓液相層析-質譜（LMSC) 在Waters ZQ機器上以正及/或負電喷霧模式（ES+/-)利用 U.V. DAD 200<WL<400 nm檢測器獲得該等譜。層析條 件：管柱：Phenomenex Kinetex C18 3x100 mm管柱，顆粒 直徑2.6 μιη ;溶劑：A : H2O(0.1% 曱酸）B : CH3CN ;管柱 溫度：5 0°C ;流速：0.8 ml/min ;梯度（8.2 min) : 4% B達 0.15 min;在 6.85 min 内自 6% 至 100% B; 7.1 min: 100% B ; 7.4 min : 4% B ; 8.2 min : 4% B。 方法D:偶聯物之去糖基化及質譜（HRMS)
去糖基化係使用糖苷酶之酶消化技術。其係以500 μΐ偶 聯物+100 μΐ Tris HC1 50 mM緩衝液+ 10 μΐ聚糖酶-F酶 (100單位凍乾酶/100 μΐ水）開始實施。將混合物於37°C下旋 轉並維持過夜。隨後準備去糖基化試樣以由HRMS分析。 端視情形而定，亦可不在去糖基化之前實施試樣之HRMS 分析。在兩種情形下，在Waters Χένο Q-Tof機器上以正電 喷霧模式（ES+)獲得質譜。層析條件：Acquity UPLC 157426.doc -60- 201208689
Waters BEH 300 C4 2.1x150 mm管柱，顆粒直徑 1·7 μιη ; 溶劑：A : Η2Ο+0·1%甲酸：β : CH3CN+0.10/〇甲酸；管柱溫 度 70°C :流速 0.5 ml/min ;梯度（1〇 min) : 20% B 達2 min 50 sec ;在 2 min 5 sec内自 20%至 80% B ; 8 min 50 sec : 80〇/〇 Β ; 8 min 5 5 sec : 20〇/〇 Β ; 10 min : 20% B。 方法Ε:高壓液相層析-質譜（LMSC) 在Waters UPLC-SQD聯用儀（line)上以正及/或負電喷霧 離子化模式（ES+/-)利用U.V. DAD 210<WL<400 nm檢測器 獲得該等譜。層析條件：管柱：ACQUITY UPLC BEH C18- 1.7 μιη-2.1χ30 mm ;溶劑：A : H2O(0.1% 曱酸）Β : CH3CN(0.1°/〇甲酸）；管柱溫度：45°C ;流速：0.6 ml/min ;梯度（2 min):在 1 min 内自 5〇/〇 至 50% B ;在 0.3 min内自 50%至 100% B ; 1.45 min : 100% B ;在 0.3 min内 自 100%至 5% B ; 2 min : 100% B。 方法F:高壓液相層析質譜（LMSC) 在Waters ZQ聯用儀上以正及/或負電喷霧模式（ES+/-)利 用U_V. DAD 200<WL<400 nm檢測器獲得該等譜。層析條 件：管柱：XSelect CSH Waters C18 3x75 mm，顆粒直徑 3.5 μιη ;溶劑：A : H2O(0.1% 曱酸）B : CH3CN (0.1%曱 酸）；管柱溫度：50°C ;流速：0.8 ml/min ;梯度（6 min): 6% B達 0.80 min ;在 3.9 min内自 6%至 100% B ; 4.80 min : 100% B ; 5 min : 6% B ; 6 min : 6% B。 方法G:高壓液相層析-質譜（LMSC) 在Waters UPLC-SQD機器上以正及/或負電噴霧離子化模 157426.doc • 61 - 201208689
式（ES+/-)獲得該等譜。層析條件：管柱：ACQUITY BEH C18- 1·7 μπι-2.1χ50 mm ;溶劑：A : Η2Ο(0·10/〇甲酸）B : CH3CN(0.1%甲酸）；管柱溫度：50〇c ;流速：〇 8 ml/min ;梯度（2.5 min):在 1.8 min 内自 50/〇至 100% Β ; 2.40 min : 100〇/〇 B ; 2.45 min : 100% B ;在〇.〇5 min内自 100% 至 5% B » 使用抗體hu2Hll(在WO 2008010101第15頁上亦稱作 hu53 2H11 ;其係包含具有胺基酸序列SEq m No. 24之Vh 的抗體）或藉由hu53 2H11之誘變獲得之抗體 hu2HllR35R74(在 WO 2011039721 第 20 頁上提及；其係包 含具有胺基酸序列SEQ ID No. 18之Vh及具有序列SEQ No. 16之VI的抗體）。 第1章：新穎托馬擻素衍生物 實例1 : 1·1· 4-{2-【{2-【2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基】·乙基卜(2-甲 基-(2-甲基-2-酼基-丙基）-胺基】-乙氧基卜2,6-雙-【(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫吼咯并[2，lc】【l,4】苯并 二氮呼-5-酮-8-基氧基甲基】-吹啶
向溶解於 900 pL MeOH 及 400 pL DMF 中之 20 mg 4-{2- [{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}·(2_曱基_2_曱基 二硫统基-丙基）-胺基]-乙氧基}-2,6-雙-[(S)-2 -乙-(E)·亞基- 157426.doc -62- 201208689 7-二甲氧基-1，2,3，11&-四氫。比咯并[2，1(；][1，4]苯并二氮呼-5- 酮-8-基氧基甲基]-η比咬中添加17.5 mg三（2-缓基乙基）膦鹽 酸鹽及15.8 mg NaHC〇3存於370 pL水中之溶液。將所得混 合物於室溫下攪拌1小時且隨後在減壓下濃縮並藉由二氧 化矽上急驟層析（Interchrom Puriflash二氧化矽15/35U 2G) 使用存於9:1 DCM/乙腈混合物中之〇〇/。至i〇% Me〇H之梯度 純化。合併含有預期產物之各部分並在減壓下濃縮。由此 獲得7 mg 4-{2-[曱基-(2-甲基·2-巯基-丙基）_胺基]_乙氧 基}-2,6·雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基 _7_ 二甲氧基四 氫比咯并[2，lc][1.4]笨并二氮呼_5_酮-8-基氧基甲基]_ °比咬.LC/MS (A): tr=l.〇6 min ; [M+H] + : m/z 941 ; [M+H20+H] + : m/z 959 ° 1·2· 4-{2-[{2-[2-(2-甲氧基_乙氧基）·乙氧基】乙基卜(2甲 基-2-甲基二硫烷基-丙基）_胺基卜乙氧基卜2 6雙_【(s)_2已_ (E)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3，113-四氫哺咯并[2，1(^】[1.4】苯 并二氮呼-5-酮-8-基$基甲基卜啦咬
向3〇 mg 4-{2-[{2-[2-(2_曱氧基乙氧基）乙氧基]乙基}_ (2-曱基-2-曱基二硫烧基-丙基）_胺基]_乙氧基卜2 6雙（經 基曱基）-吡啶及65.5 μι二異丙基乙基胺存於2〇〇 DCM 中之冷卻至ic之溶液中添加194 MSC。純摔2〇分 鐘後，混合物水解並將有機相用水洗滌且隨後經1^以〇4乾 157426.doc -63- 201208689 燥並在減壓下濃縮。向26 mg牦馬黴素存於425 DMF中 之溶液中添加溶解於彻0卿中之所得殘餘物（36叫) 以及39.6 mg 1(：03及15.8 mg K卜將混合物於3〇t下攪拌 12小時且隨後水解直至發生沉殿。藉由在燒結式漏斗上過 濾去除不溶性物質，用DCM洗滌且隨後將合併之有機相在 減壓下濃縮'並藉由二氧化矽上急驟層析（Anal〇gix Super Flash Si〇2 SF25_8g)使用存於 DCM 中之 〇%至1〇% Me〇Hi 梯度純化。合併含有期望產物之各部分並在減壓下濃縮， 吸收於丨/i二噁烷/水混合物中並在減壓下再次濃縮。由此 獲得23 mg 4-{2-[{2-[2-(2-甲氧基_乙氧基）_乙氧基]乙基}_ (2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基）·胺基]_乙氧基卜26雙_[(s)_ 2-乙-(丑)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3，113_四氫吡咯并[2，1〇][14] 苯并二氮呼-5_酮-8·基氧基甲基]_吡啶。NMR (500 MHz,氯仿-d):寬信號：1.20至 1.78 (m，12 H); 2·40 (s，3 H)，2.70至 3.10 (m，10 H); 3.34 (m，4 H); 3.49至 3.70 (m，8 H)，3.71 (s，3 H)，3.91 (m，2 +H); 4.00 (s，6 H); 4.27 (m，4 H); 5.27 (m, 4 H); 5.60 (m, 2 H); 6.86 (s, 2 H); 7.00 (m, 2H); 7.56 (s，2 H), 7.65 (d, J=4.4 Hz, 2 H)。LC/MS (A): Τγ=0·81 min; [M+H] + : m/z 987。 1.3. 4-{2-【{2-【2-(2-甲氧基_乙氧基）_乙氧基】乙基卜(2甲 基-2-甲基二碰烧基-丙基）-胺基]-乙氧基卜2，6-雙-(經基甲 基啶 157426.doc • 64 - 201208689
向100 mg 4-[2-(2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基胺基）_乙氧 基]-2,6-雙-(羥基曱基）-吡啶存於2 mL DMF中之溶液中添 加99 mg 1-碘-2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙烷（B. Ben Aroya Bar Nir, J.F. Kadla Carbohydrate Polymers, 2009，76，60-67)及 54 mg K2C03。在 60°C 下 12小時後，對 混合物補充40 mg 1-碘-2-[2-(2-甲氧基·乙氧基）-乙氧基]-乙 烷及又一 55 mg K2C03。將所得混合物於8〇。(：下再攪#24 小時。在減壓下濃縮後，將由此獲得之粗產物溶解於最少 量 MeOH 中並施加於 MegaBE-SCX，lGM6ML(Varian)上。 在用MeOH洗滌該相後，用存於MeOH中之2 N氨溶液洗脫 目標產物。在減壓下濃縮MeOH相且隨後根據相同方案重 新施加於Mega BE-SCX，2GM 12ML (Varian)上。在減壓下 濃縮曱醇/NH3相且藉由二氧化矽上急驟層析（Merck SuperVarioFlash 10g管柱 ’ Si60 15-40 μιη)使用存於 DCM 中 之0%至10% MeOH之梯度純化。合併含有預期產物之各部 分並在減壓下濃縮。由此獲得30 mg 4-{2-[{2-[2-(2-甲氧 基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}-(2-曱基-2-甲基二硫烷基-丙基）-胺基]-乙氧基}-2,6-雙-(羥基甲基）_吡啶。4 NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.27 (s, 6 H); 2.40 (s, 3 H); 2.75 (s, 2 H); 2.80 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 3.00 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 3.23 (s, 3 印；3.40(111，2 11);3.47至3.55(111，8 11);4.12〇，1=5.9 1^，2 H); 4.45 (d, J=5.9 Hz, 4 H); 5.30 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 6.85 157426.doc •65· 201208689 (s，2 Η)。LC/MS (A): tr=0.44 min; [M+H] + : m/z 479; [M-H+HC02H]-: m/z 523。 1·4· 4-【2-(2 -甲基-2-甲基二硫烧基-丙基胺基）-乙氧基】-2,6_ 雙-(羥基甲基）-«*啶
HO
向390 mg 4·[2-胺基-乙氧基]-2,6-雙-(經基甲基）-〇比 啶）（4-(2-第三丁氧基羰基胺基-乙氧基）_2,6-雙-(羥基甲基）-°比啶之boc基團去保護後製得，闡述於w〇 07085930第101 頁上）存於2 mL THF中之懸浮液中添加270 μΐ 2-(甲基二硫 代）-異丁酿及730 pL異丙醇鈦。20 min後，再添加270 μΐ 2-(甲基二硫代）-異丁路及730 μι異丙醇欽並將混合物於室 溫下授拌2小時。隨後對混合物補充6 mL乙醇，於室溫下 攪拌20 min且隨後補充124 mg氰基硼氫化鈉。在45分鐘 後，再添加124 mg氰基硼氫化鈉且在攪拌1小時後，在減 壓下濃縮混合物並用EtOAc及水稀釋》過濾所得沉澱，並 /谷解於1 M HC1水溶液中。用5 Μ氫氧化鈉水溶液使所得水 相達到鹼性pH’用DCM萃取3χ並在減壓下濃縮合併之有 機相。獲得322 mg 4-[2-(2-曱基-2-甲基二硫烷基_丙基胺 基）-乙氧基]-2,6-雙-(羥基曱基）_〇比啶。iH NMR (4〇〇 MHz， DMSO-d6): 1.26 (s，6 H); 1.81 (寬 m，1 h); 2.39 (s，3 H); 2.67 (寬 s，2 H); 2.94 (寬 t，J=5.7 Hz，2 H); 4.11 (t，J=5.7
Hz, 2 H); 4.45 (d, J=5.5 Hz, 4 H); 5.32 (t, J=5.5 Hz, 2 H); 6-85 (s, 2 H) ° LC/MS (A): tr=0.24 min; [M+H] + : m/z 157426.doc -66_ 201208689 347 ° 實例2 2.1. 4-(【2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基·7·二甲氧基. l，2,3，lla-四氫-吡咯并【2，lcni.4】苯并二氮呼_5酮_8基氧 基甲基卜啶-4-基氧基）-乙基】·{2-[2_(2-甲氧基_乙氧基）_ 乙氧基】-乙基卜胺基）-丁酸
向 28 mg 4·([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙·(Ε)_ 亞基·7_ 二甲氧基_ 1，2,3，11&-四氫-吨咯并[2，1(；][14]苯并二氮呼_5_酮_8_基氧 基甲基]-。比啶-4-朞氧基）·乙基]_{2_[2·(2_甲氧基乙氧基）_ 乙氧基]•乙基}-胺基）_丁酸乙酯存於527 THF&61 y水中 之溶液中添加32 μΐ 1 Μ氫氧化鋰水溶液。將混合物於室溫 下攪拌1小時30分鐘並向其中再添加5 μ1 j Μ氫氧化鋰水溶 液。於至溫下攪拌1小時3〇分鐘後，藉由添加8〇〇 Μ破酸鉀 緩衝液（ρΗ=3)將混合物酸化至接近3之ρΗ&隨後用DCM萃 取5x。合併有機相’經MgS〇4乾燥，在減壓下濃縮並藉由 一氧化矽上急驟層析（Anal〇gix Super F丨ash Si〇2 SF1〇_4g) 使用存於DCM中之3%至2〇% Me〇H之梯度純化。合併含有 預期產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得10·2 mg 4-([2-(2’6-雙-[(s)-2-乙·⑻·亞基_7_二曱氧基··四氫_0比 咯并[2，lc][1.4]苯并二氮呼_5_酮_8•基氧基甲基]β比啶_4_基 氧基）-乙基]-{2-[2-(2_曱氧基_乙氧基）_乙氧基]乙基}_胺 157426.doc -67- 201208689 基）-丁酸。LC/MS (B): tr=3.08 min; [M+H] + : m/z 939。 2·2· 4-([2-(2,6-雙-【(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基- l，2,3，lla·四氫吡咯并丨24CHJ.4】苯并二氮呼_5酮_8_基氧基 甲基】-咕啶-4·基氡基）-乙基】·{2·【2_(2_甲氧基_乙氧基）_乙 氧基】-2*基}-胺基）-丁酸乙輯
向 50.4 mg (S)-2-乙-(E)-亞基-8-羥基-7-甲氧基-i，2,3，lla-四氫比洛并[2.1-c][1.4]苯并二氮呼-5-酮存於4 ml DMF中 之溶液中添加77 mg K2C03、30.7 mg碘化鉀及67 mg 4-([2-(2,6-雙-曱烷磺醯基氧基甲基比啶-4-基氧基）_乙基]·{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}-胺基）-丁酸乙醋。將混 合物於30°C下加熱18小時且隨後冷卻至室溫，經由0.45 μιη膜過濾，在減壓下濃縮並藉由二氧化矽上急驟層析 (Analogix Super Flash Si02 SF15-12g)使用存於 DCM 中之 0%至10% MeOH之梯度純化。合併含有預期產物之各部分 並在減壓下濃縮。獲得51 mg 4-([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3,11丑-四氮-吡咯并[2,1<;][1.4]苯并二 氮呼-5-酮-8-基氧基曱基]比啶-4-基氧基）-乙基]-{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）-乙氧基]乙基}-胺基）-丁酸乙酯。LC/MS (B): tr=3.20 min; [M+H] + : m/z 967。 2·3· ([2-(2,6-雙-甲烷磺醯基氧基甲基-吼啶-4-基氧基）-乙 基】-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基卜胺基）-丁酸 157426.doc • 68· 201208689 乙酯
向51 mg 4-([2-(2,6-雙-羥基曱基-°比咬-4-基氧基）-乙基]· {2-[2-(2 -甲氧基-乙氧基）_乙氧基]-乙基}-胺基）-丁酸乙醋存 於5 ml DCM中之預冷卻至-25°C之溶液中添加110 μΐ二異 丙基乙基胺及34 μΐ MSC。將混合物於-15°C下攪拌1小時 且隨後用5 ml水洗務。用5 ml DCM萃取水相。合併有機 相’經MgS04乾燥並在減壓下濃縮。獲得69 mg 4-([2-(2,6-雙·曱烷磺醯基氧基曱基·"比啶-4-基氧基）-乙基]-{2-[2-(2-甲 氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}-胺基）-丁酸乙酯。LC/MS (B): tr=2.87 min; [M+H] + : m/z 615。 令4. 4-([2-(2,6-雙-羥基甲基-吡啶-4-基氧基）-乙基】-{2-【2-(2-甲氧基氧基）-乙氧基]-乙基}•胺基）-丁酸乙酯
向180 mg 4-[2-(2,6-雙-羥基曱基-吡啶-4-基氧基）-乙基胺 基]-丁酸乙酯存於18 ml乙腈中之溶液中添加207 mg 1-碘-2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）_乙氧基]-乙烷及192 μΐ二異丙基乙 基胺。將混合物於80°C下加熱3天且隨後在減壓下濃縮並 藉由二氧化石夕上急驟層析（Merck SuperVarioFlash 15 g管 柱，Si60 15-40 μm)使用DCM/MeOH/水混合物（40/5/0.5)純 化。合併含有預期產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得51 157426.doc •69· 201208689 mg 4-([2-(2,6-雙-經基甲基-«比咬-4-基氧基）-乙基]-《2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}-胺基）-丁酸乙醋。 LC/MS (B): tr=0_70 min; [M+H]+: m/z 459。 2.5. 442·(2,6-雙-羥基甲基-咕啶-4-基氧基）-乙基胺基】-丁 酸乙酯
在氬下向390 mg 4-[[2-(2,6-雙-羥基曱基-吡啶-4-基氧 基）-乙基]-(2-硝基-苯磺醯基）-胺基]-丁酸乙酯存於10 mi乙 腈中之溶液中添加766 mg碳酸铯及160 μΐ硫代苯酚。將混 合物於室溫下攪拌17小時且隨後經由孔隙率為4之礦渣過 濾。用EtOAc洗滌該餅並在減壓下濃縮濾液並在Mega ΒΕ-SCX，2GM 12ML柱（Varian)上使用經MeOH之洗務及用存於 MeOH中之2 N氨溶液分離期望產物來純化。合併含有預期 產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得183 mg 4-[2-(2,6-雙_ 經基曱基··吡啶_4_基氧基）-乙基胺基]-丁酸乙酯。LC/MS (B): tr=〇.68 min; [M+H] + : m/z 313。 2·6· 4·[[2-(2,6-雙-羥基甲基啶-4-基氧基）-乙基]-(2-確 基·-笨磺醯基）_胺基]-丁睃乙酯
在氬下向767 mg N-[2-(2,6-雙-羥基曱基-吡啶·4-基氧 157426.doc -70· 201208689 基）-乙基]-2-硝基-氨苯磺醯胺存於15 ml DMF中之溶液中 添加344 μΐ 3-溴-丁酸乙酯及丨.38 g K2C03。將混合物於 40°C下攪拌約20小時且隨後經由孔隙率為4之礦渣過渡。 用EtOAc洗滌該餅並在減壓下濃縮濾液。藉由二氧化矽上 急驟層析（Merck SuperVarioPrep 90 g管柱，Si60 15-40 μιη) 使用存於DCM中之〇%至ι〇% Me〇H之梯度純化粗產物。合 併含有預期產物之各部分並在減壓下濃縮《獲得395 mg 4_ [[2-(2,6-雙-羥基曱基-咕啶_4_基氧基）_乙基]_(2_硝基-苯磺 醯基）-胺基]-丁酸乙酯。LC/MS (B): tr=2_72 min; [M+H] + : m/z 498; [M+HC02H-H]·: m/z 542。 2·7· N-[2-(2,6-雙-羥基甲基-哺咬_4_基氧基）_乙基】·2硝 基-氨苯磺醢胺
向1.3 g 4-[2-(2-硝基-苯續酿基胺基）_乙氧基]比啶_2,6_ 二曱酸二乙酯存於200 mL乙醇中之溶液中連續添加315 mg 侧氫化納及941 mg CaCh。將混合物於室溫下搜拌1小時3〇 分鐘且隨後向其中添加50 ml水。在減壓下去除乙醇並向 所得殘餘物中添加50 ml水；用EtOAc萃取水相3χ。合併有 機相，用飽和NaCl溶液洗滌，經MgS04乾燥並在減壓下濃 縮。獲得1_06 g Ν-[2-(2,6·雙-羥基甲基·吡啶_4_基氧基）-乙 基卜2-硝基-氨苯續醯胺。LC/MS (A): tr=0.57 min; [Μ+Η] + : 157426.doc -71 - 201208689 m/z 384。 2·8· 4-[2-(2-頌基-苯罐酿基胺基）-乙氧基卜啦咬_2,6·二甲 酸二乙酯 α, 〇* 令=〇
向957 mg 4-(2-胺基-乙氧基）-»比咬-2,6-二甲酸二乙醋單 鹽酸鹽存於30 ml DCM及734 Μ·1π比咬中之預冷卻至約5°C之 溶液中添加798 mg 2-硝基苯磺醯氣。將混合物升溫至室溫 並授拌2小時。隨後向其中再添加244 μΐ 〇比咬及665 mg 2-硝基苯磺醯氯並繼續攪拌15小時。用25 ml水洗滌混合物 並用25 ml DCM萃取水相2χ。合併有機相，經MgS〇4乾 媒’在減壓下濃縮並藉由一*氧化梦上急驟層析（Merck
EasyVarioPrep 150 g管柱，Si60 15-40 μηι)使用存於DCM 中之0%至1 0% EtOAc之梯度純化。合併含有預期產物之各 部分並在減壓下漠縮。獲得960 mg 4-[2-(2-硝基-苯項酿基 胺基）-乙氧基]-吡啶-2,6-二甲酸二乙酯。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.35 (t, J=7.2 Hz, 6H); 3.41 (t, J=5.2 Hz, 2 H); 4.22 (t, J=5.2 Hz, 2 H); 4.39 (q, J=7.2 Hz, 4 H); 7.50 (s, 2 H); 7.80 (m, 2 H); 7.92 (m, 1 H); 8.04 (m, 2 H); 8.40 (m，1 H)。LC/MS (C): tr=3.50 min; [M+H] + : m/z 468 » 2.9. 4-(2-胺基-乙氧基）-吡啶-2,6-二甲酸二乙酯單鹽酸鹽
〇 157426.doc -72- 201208689 向2·64 g 4-(2-第三丁氧基羰基胺基-乙氧基）·吡啶·2,6_二 曱酸二乙酯（闡述於WO 07085930第101頁上）存於27 mi二 。惡烧中之溶液中添加20.7 ml存於二°惡烧中之4 N氫氣酸。 將混合物在室溫下攪拌約20小時且隨後在減壓下濃縮。將 蒸發殘餘物吸收於約70 ml二噁烷中，且隨後在減壓下再 次濃縮。重複此操作3χ。將混合物吸收於50 ml第三丁基 曱基醚中並經由孔隙率為4之礦渣過濾所得懸浮液。將該 餅用第三丁基甲基醚洗滌，並在減壓及室溫下在乾燥器中 乾燥。獲得2 g 4-(2-胺基·乙氧基）-吡啶-2,6-二曱酸二乙酯 單鹽酸鹽。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6): 1.35 (t，J=7.2 Hz, 6H); 3.26 (m, 2H); 4.39 (q, J=7.2 Hz, 4 H); 4.45 (m, 2 H); 7.77 (s，2 H); 8.16 (寬m，3 H)。LC/MS (C): tr=2.39 min; [M+H] + : m/z 283。 實例3 3·1· 3-([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫-吡咯并[2，1C][1.4】苯并二氮呼-5-酮-8-基氧 基甲基】-啦啶-4-基氧基）-乙基】-{2-ρ·(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基】-乙基}-胺基）-丙酸
向 30 mg 3-([2·(2,6-雙-[(S)-2-乙-(e)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3，11&-四氫_吡咯并[2，1(：][1.4]笨并二氮呼_5-酮_8-基氧 基甲基]比啶-4-基氧基）-乙基]_{2·[2_(2-甲氧基_乙氧基）- 157426.doc •73- 201208689 乙氧基]-乙基}-胺基）-丙酸曱S旨存於576 μΐ THF及6 7 μ 1水中 之溶液中添加35 μΐ 1 Μ氫氧化鋰水溶液。將混合物於室溫 下攪拌1小時30分鐘且隨後吸收於4 ml DCM中並藉由添加 1 ml磷酸鉀緩衝液（pH=3)酸化至接近3之pH。用DCM萃取 混合物4x併合併有機相，經MgS04乾燥，在減壓下濃縮並 藉由二氧化矽上急驟層析（Analogix Super Flash Si02 SF10-4g)使用存於DCM中之10%至20% MeOH之梯度純 化。合併含有預期產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得13 mg 3-([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫-«比咯并[2,lc][1.4]苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基甲基]-»比 咬基氧基）-乙基]-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙 基}-胺基）-丙酸。LC/MS (B): tr=3.07 min; [M+H] + : m/z 925 〇 3·2· 3-([2-(2,6·雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫·吡咯并【2，lc】【14】苯并二氮呼_5-酮_8_基氧 基甲基]-吼啶-4-基氧基）-己基]-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基】-乙基}-胺基）_丙酸甲酯
向 84 mg (s)-2-乙-(E)-亞基-8-羥基-7-甲氧基-l，2,3,lla-四氫-吡咯并[2.1-c][i.4]苯并二氮呼·5-酮存於5 ml DMF中 之溶液中添加 128 mg K2C03、51 mg KI及 110 mg 3-([2-(2’6·雙-甲烷磺醯基氧基曱基比啶-4-基氧基）-乙基]-{2-[2- 157426.doc •74· 201208689 (2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}-胺基）-丙酸甲酯》將混 合物於30°C下加熱18小時且隨後冷卻至室溫’經由0.45 μπι膜過濾，在減壓下濃縮並藉由二氧化矽上急驟層析 (Analogix Super Flash Si02 SF15-24g)使用存於 DCM 中之 0%至10% MeOH之梯度純化。合併含有預期產物之各部分 並在減壓下濃縮。獲得33 mg 3-([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)_ 亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫-吡咯并[2，lc][1.4]苯并二 氮呼-5-酮-8-基氧基甲基]比啶-4-基氧基）-乙基]-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}-胺基）-丙酸甲酯。LC/MS (B): tr=3.21 min; [M+H] + ·· m/z 939。 3·3· 3-(【2-(2,6-雙-甲烷磺醯基氧基甲基-nb啶-4-基氧基）_ 乙基]-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基】-乙基}-胺基）-丙酸 甲酯
向80 mg 3-([2-(2,6-雙-羥基甲基-吡啶-4-基氧基）-乙基]-{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）·乙氧基]-乙基}_胺基）_丙酸甲酯存 於8 ml DCM中之預冷卻至-25°C之溶液中添加183 μΐ二異 丙基乙基胺及57 μΐ甲烷磺醯氯。將混合物於_15°C下攪拌1 小時且隨後用5 ml水洗滌《用5 ml DCM萃取水相。合併有 機相’經MgS04乾燥並在減壓下濃縮《獲得i10 mg 3-([2-(2,6-雙-甲烷磺醯基氧基甲基比啶_4_基氧基乙基] (2-曱氧基-乙氧基）_乙氧基]-乙基胺基）_丙酸甲酯。 157426.doc -75- 201208689 LC/MS (B): tr=2.67 min; [M+H] + : m/z 587。 3·4· 3-(丨2-(2,6-雙-羥基甲基_吼啶_4·基氧基）_已基卜{2_[2· (2-甲氧基·乙氧基）-乙氧基卜乙基胺基）·丙酸甲酯
向284 mg 3-[2-(2,6-雙-經基甲基·》比啶基氧基）-乙基胺 基]-丙酸曱酯存於28 ml乙腈中之溶液中添加356 mg 1-碘-2-[2-(2-甲氧基-乙氧基乙氧基]_乙烷及33〇 μ1二異丙基乙 基胺。將混合物於80°C下加熱3天且隨後在減壓下濃縮並 藉由二氧化矽上急驟層析（Anal〇gix Super Flash Si02 SF2 5-40g)使用存於DCM中之5%至10% MeOH之梯度純 化。合併含有預期產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得 165 mg 3-([2-(2,6-雙-羥基甲基比啶_4_基氧基）-乙基]_{2_ [2-(2-曱氧基-乙氧基）_乙氧基乙基卜胺基丙酸甲酯。 LC/MS (B): tr=0.44 min; [M+H] + : m/z 431。 3·5· 3-[2-(2,6-雙-羥基甲基_吼啶_4_基氧基）-乙基胺基】-丙 酸甲酯
在氬下向155 mg 3-[[2-(2,6-雙-羥基曱基比啶-4-基氧 基）-乙基]-(2-硝基-苯磺醯基）_胺基]_丙酸曱酯存於6 mi乙 腈中之溶液中添加325 mg碳酸铯及67 μΐ硫代苯酚。將混合 物於室溫下攪拌4小時且隨後經由孔隙率為4之礦渣過濾。 157426.doc -76- 201208689 用EtOAc洗滌濾餅並在減壓下濃縮濾液並在Mega be_scx， 2GM 12ML柱（Varian)上使用經Me〇H之洗滌及用存於 MeOH中之2 N氨溶液分離期望產物來純化。合併含有預期 產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得82 mg 3_[2(26雙_ 羥基曱基-吡啶-4-基氧基）-乙基胺基卜丙酸曱酯。lc/ms (B): tr=0.33 min; [M+H] + : m/z 285。 3·6· 3-[P-(2,6-雙·羥基甲基啶_4_基氧基广乙基】_(2硝 基-苯磺醯基）-胺基】-丙酸甲酯
向670 mg 3-[2-(2,6-雙-經基曱基比啶_4·基氧基）_乙基胺 基]-丙酸第三丁基酯存於20 ml DCM中之溶液中添加2 ml TFA。將混合物於室溫下攪拌6小時且隨後在減壓下濃 縮，吸收於DCM中並再次在減壓濃縮。於5°C下向溶解於 10 ml MeOH中之所得殘餘物中添加7 ml存於己烷中之2 μ (三曱基甲矽烷基）重氮甲烷溶液。將混合物於5〇c下攪拌i 小時30分鐘且隨後添加200 μΐ乙酸。將混合物吸收於3〇 ml 水及30 ml EtOAc中。用30 ml EtOAc萃取水相2χ»合併有 機相’用飽和NaCl溶液洗務，在減壓下濃縮並藉由二氧化 石夕上急驟層析（Analogix Super Flash Si02 SF15-24g)使用存 於DCM中之0%至l〇% MeOH之梯度純化。合併含有預期產 物之各部分並在減壓下濃縮。獲得155 mg 3-[2-(2,6-雙-羥 基曱基比啶·4-基氧基）·乙基胺基]-丙酸甲酯。LC/MS (C): 157426.doc •77- 201208689 tr=2.56 min; [M+H] + : m/z 470。 3·7· 3-【丨2-(2,6-雙-羥基甲基-咕啶-4-基氧基）-乙基】_(2-硝 基-苯磺醯基）-胺基】-丙酸第三丁基酯
向0.8 g 4-{2-[(2-第三丁氧基羰基-乙基）-(2·硝基-苯磺醯 基）-胺基]-乙氧基}-吡啶-2,6-二甲酸二乙酯存於80 mL乙醇 中之溶液中連續添加152 mg硼氫化鈉及447 mg CaCl2。於 室溫下攪拌混合物並隨後在反應結束時添加2〇 ml水》在 減壓下去除乙醇，向所得殘餘物中添加1〇〇 ml水並用 EtOAc萃取水相3x〇合併有機相，用飽和NaCl溶液洗滌， 經MgS04乾燥並在減壓下濃縮。獲得670 mg 3_[[2_(26_雙_ 羥基曱基比啶-4-基氧基）-乙基]_(2-硝基-苯磺醯基）_胺基]_ .丙酸第二 丁基醋。LC/MS (C): tr=3 min; [M+H] + : m/z 512 ° 3.8. 4-{2-【(2-第三丁氧基羰基_乙基）_(2_硝基_苯磺醢基卜 胺基】-乙氧基咬-2,6-二甲酸二乙醋
向10_6 g 3-[(2-曱烷磺醯基氧基乙基）_(2硝基苯磺醯 基）-胺基]-丙酸第三丁基酯存於22〇 ml DMF中之溶液中添 加16.2 g K2C03及5_6 g 4-羥基-吡啶_2,6_二曱酸二乙酯。 157426.doc -78- 201208689 將混合物於6〇t下加熱20小時且隨後在減壓下濃縮並吸收 於 200 ml 水及 200 ml Et〇Act。用 Et〇A(^取水相 2χ。合 併有機相，用飽和NaCl溶液洗滌，經MgS〇4乾燥，在減壓 下濃縮並藉由一氧化石夕上急驟層析（Merck EasyVarioPrep 600 g管柱’ Si60 15-40 μιη)使用存於DCM中之0%至20%
EtOAc之梯度純化。合併含有預期產物之各部分並在減壓 下濃縮。獲得6.56 g 4-{2-[(2-第三丁氧基羰基-乙基）_(2•硝 基-笨續醯基）-胺基]_乙氧基比咬·2,6_二甲酸二乙酯。 LC/MS (C): tr=4.14 min; [M+H] + : m/z 596。 3·9· 3-[(2-曱烷磺醯基氧基-乙基）_(2_硝基-苯磺醢基）_胺 基】-丙酸第三丁基酯
向9_2 g 3-[(2-經基-乙基）-(2-·*肖基-苯績酿基）-胺基]-丙酸 第三丁基酯存於92 ml DCM中之溶液中添加8.1 ml二異丙 基乙基胺。將混合物冷卻至-5°C並逐滴添加2.34 ml MSC 存於10 ml DCM中之溶液。在升溫至室溫後，將混合物攪 拌約2小時且隨後補充有1〇〇 ml水。將水相用DCM萃取兩 次併合併有機相，經MgS04乾燥，在減壓下濃縮並藉由二 氧化石夕上急驟層析（Analogix Super Flash Si〇2 SF40-240g) 使用存於DCM中之0%至5°/〇乙酸乙酯之梯度純化。合併含 有預期產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得10.62 g 3-[(2-曱烷磺醯基氧基-乙基）-(2-硝基-苯磺醯基）-胺基]-丙酸第三 丁基酉旨。LC/MS (C): tr=3.77 min; [M+Na] + : m/z 475。 157426.doc ·79· 201208689 3·10. 3-[(2-羥基-乙基）-(2-硝基-苯磺醯基）-胺基卜丙酸第三 丁基醋
在風下向8.7 g N-(2 -經基-乙基）-2 -硝基-氨苯績酿胺 (Skerlj, R.T.； Nan, S.; Zhou, Y.; Bridger, G.J. Tetrahedron Lett. 2002 (43) 7569-75 71)存於 87 ml DMF 中之溶液中添加 8·8 ml 3-溴丙酸第三丁基酯及14.6 g K2C03。將混合物於 40°C下攪拌15小時且隨後再添加5 ml 3-溴丙酸第三丁基 醋。將混•合物於40°C下加熱過夜且隨後經由孔隙率為4之 礦渣過濾。用乙酸乙酯洗滌該餅且隨後在減壓下濃縮濾、液 並藉由二氧化石夕上急驟層析（Merck EasyVarioPrep 400 g 管柱，Si60 15-40 μιη)使用存於DCM中之0%至10% EtOAc 之梯度純化。合併含有預期產物之各部分並在減壓下濃 縮。獲得9.54 g 3-[(2-羥基-乙基）-(2-硝基-苯磺醯基）··胺 基]-丙酸第三丁基酯。LC/MS (C): tr=3.39 min; [M+Na] + : m/z 397。 實例4 4·1· 4-【2-((2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基）-{2-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基氧基】-乙基卜胺基）·己氧基卜2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3，113-四氫吡咯并丨2，1<:】[1.4】 苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基甲基卜吹啶 如實例1製備’以4-[2·((2-曱基-2-甲基二硫烷基-丙基）-{2 [2-(2 -嗎嚇基-乙氧基）_乙氧基]_乙基胺基）_乙氧基]_ 157426.doc • 80 · 201208689 2,6-雙-(羥基曱基）·吡啶開始：
H NMR (500 MHz，DMSO-d6): 1.22 (s，6 HV 1 a Hz, 6 H); 2.28至 2.44 (m，6 H); 2.36 (m，3 HV，1 . ’“·71 (s，2 HV 1 59 (d, j=7 〇 2.77(1了=6.7 1^，2 11);2.88至3.08(111,61^.〇 叫’ 3·42至 3.55 (m, 12 H); 3.86 (s, 6 H); 3.88 (m, 2 H)； 4 l〇 ( (t, J=5.7 Hz, 2 H); 5.17 (d, J=13.2 Hz, 2 H)； 5.23 KS, 4 H)； 4.15 (d， J=13.2
Hz，2 H); 5.55 (m，2 H); 6.93 (s，2 H); 7.06 “ v 5 1 H)； 7 30 (s，2 H); 7.76 (d，J=4.4 Hz, 2 H)。LC/MS fA、. + lA)* tr==〇.68 min.
[河+11]111/2 1042;[]^+211]2+:111/2 521.5(基蜂）。 ’ 4·2· 4-[2-((2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基卜{2_u_(2嗎啉* 基-乙氧基）-乙氧基】-乙基}-胺基）-乙氧基卜2,6-雙_(經基甲 基）-"比啶 如實例1製備，以4-{2-[2-(2-碘-乙氧基）-乙氧基]-乙基 嗎啉及4-[2-(2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基胺基）-乙氧基]-2,6-雙·（羥基曱基）-吼啶開始：
!H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.26 (s, 6 H); 2.36 (m, 4 H); 2.39 (s, 3 H); 2.43 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 2.74 (s, 2 H); 2.79 (t，J=5.9 Hz，2 H); 3.00 (t，J=5.9 Hz，2 H); 3.46至 3.55 157426.doc -81 - 201208689 (m, 12 H); 4.12 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 4.45 (d, J=5.9 Hz, 4 H); 5.30 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 6.84 (s, 2 H) 〇 LC/MS (E): tr=0.33 min; [M+H] + : m/z 534。 4·3· 4-{2-【2_(2-碘-乙氧基）·乙氧基】_乙基}_嗎啉 Ο 於0C下向1·12 g 2-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-乙氧基]-乙 醇及940 μΐ二異丙基乙基胺存於6 ml DCM中之冷卻至相同 溫度之溶液中添加44〇 μ1甲烷磺醯氣存於3 mLDCM中之溶 液。將混合物於〇〇c下攪拌1小時且隨後用8 ml水洗滌。經 MgS〇4乾燥有機相並在減壓下濃縮。 將所得殘餘物溶解於3〇 mi丙酮中且隨後補充有142 g碘 化鈉。在回流下攪拌5小時後，藉由在燒結式漏斗上過濾 去除不溶性物質。在減壓下濃縮濾液且隨後吸收於二氣甲 烷中。藉由過濾再次去除不溶性物質，並在減壓下濃縮濾 液並藉由一氧化碎上急驟層析（Analogix Super Flash Si02 SF25_4〇g)使用存於DCM中之0%至5〇/〇 MeOH之梯度純化。 «併含有預期產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得丨〇9邑 4_{2-[2-(2·碘·乙氧基）-乙氧基]-乙基}-嗎啉。4 NMR (400 MHz, DMSO-d6)： 2.39 (m, 4 H); 2.45 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 3 32 (t, J=6.4 Hz, 2 H); 3.475.3.60 (m, 10 H); 3.67 (t, 4 Hz, 2 H) » LC/MS (A): tr=0.29 min; [M+H]+: m/z 330 〇 實例5 5·1· 4_([2_(2’6_ 雙-【(S)_2-已-(E)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3, 157426.doc -82 - 201208689
Ua_四氮咬略并[2,lc】[1.4】苯并二氮呼-5_酮-8-基氧基甲 基】比咬·4·基氧基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙 氧基卜乙氧基}-丙醯基）-胺基】 -丁酸Ν-羥基琥珀醯亞胺基酯
向溶解於 3.8 mL THF 中之 65 mg 4-([2-(2,6_ 雙 _[(S)-2-乙-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫-吡咯并[2，lc][1.4]苯 并二氮呼-5·酮_8-基氧基曱基]_。比啶-4-基氧基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基_乙氧基乙氧基]_乙氧基}_丙醯基）·胺基 丁酸中添加67 01〇卩丑八及33 11^碳酸1^，：^，-二琥珀醯亞胺基 醋°於室溫下1小時後，添加8 mL DCM並將所得有機相用 水洗滌兩次，經MgS04乾燥，在減壓下濃縮並藉由二氧化 矽上急驟層析（Analogix Super Flash Si02 SF10-8g)使用存 於DCM中之0%至7.5%曱醇之梯度純化。由此獲得35 mg 4-([2·(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫 °比略并[2, lc] [1.4]苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基甲基]比咬-4-基氧基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧 基}-丙酿基）-胺基]-丁酸N-經基玻珀酿亞胺基酯。 LC/MS (F): tr=3.54 min; [M+H] + : m/z 1108; [Μ+Η20+Η] + ： m/z 1126; [M+2H2〇+H]+: m/z 1144。 5.2· 4_([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-1,2,3，113-四氫-吡咯并【2，1<；】[1.4]苯并二氮呼-5-酮-8-基氧 基甲基】-咐•啶-4-基氧基）-乙基】-(3-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧 157426.doc -83 · 201208689 基）-乙氧基】-乙氧基}-丙醯基）-胺基】-丁酸 如實例2製備，以4_([2_(2,6-雙-[(S)-2-乙·(Ε)_亞基_7-二 甲氧基-l，2,3，lia-四氫〇比洛并[2，lc][1.4]笨并二氮呼-5_酮_ 8·基氧基甲基]-°比啶-4-基氧基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基· 乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙醯基）-胺基]-丁酸甲酯開始：
LC/MS (E): tr=l.〇5 min; [M+H] + : m/z 1011； [M+H2〇+H] + : m/z 1029; [M+2H20+H] + : m/z 1047。 5·3· 4·(【2-(2,6-雙-[(S)-2- 6 -(E)-亞基·7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫吡咯并丨2，lc】【1.4】苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基 甲基卜他啶-4-基氧基）-乙基】-(3-{2-【2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基卜丙醯基）-胺基】-丁酸甲酯 如實例2製備’以4-[[2-(2,6-雙-羥基曱基-吡啶-4-基氧 基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙 醯基）-胺基]-丁酸乙酯開始：
LC/MS (E): tr=1.14 min; [M+H] + : m/z 1025; [Μ+Η20+Η] + : m/z 1043; [M+2H20+H] + : m/z 1061。 5·4· 4-【[2-(2,6-雙-羥基甲基_啦啶_4_基氧基）_己基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基卜乙氧基}-丙醯基）-胺基】-丁 157426.doc •84· 201208689 酸甲酯
向460 mg 4-[[2·(2,6-雙-羥基甲基-吡啶·4-基氧基）_乙 基]-(3-{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基卜丙酿基）_ 胺基]-丁酸第三丁基酯存於7 ml DCM中之溶液中添加114 ml TFA。將混合物在室溫下攪拌15小時且隨後在減壓下濃 縮。於5 °C下向溶解於3 · 8 ml MeOH中之所得殘餘物中添加 3.1 ml存於己烷中之2 Μ (三曱基甲矽烷基）重氮曱烷溶 液。將混合物於51：下攪拌1小時且隨後添加1〇〇 μι乙酸。 在減壓下濃縮後’藉由二氧化矽上急驟層析（Analogix Super Flash Si02 SF25-40g)使用存於 DCM 中之 2%至 1〇〇/。 MeOH之梯度純化所得殘餘物。合併含有預期產物之各部 分並在減壓下濃縮。獲得265 mg 4-[[2-(2,6-雙-羥基甲基_ °比啶-4-基氧基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）-乙氧 基]-乙氧基}-丙醯基）-胺基]-丁酸甲酯。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):具有以下構象之50°/。-50%混合物：1.67至1.86 (m, 2 H); 2.27 (t, J=7.3 Hz, 1 H); 2.36 (t, J=7.3 Hz, 1 H); 2.57 (t, J=6.7 Hz, 1 H); 2.66 (t, J=6.7 Hz, 1 H); 3.23 (s, 3 11);3.31至3.75(111，2111);4.14(1，1=5.6 112，111);4.19(1， J=5.6 Hz, 1 H); 4.45 (m, 4 H); 5.30 (m, 2 H); 6.84 (s, 1 H); 6.86 (s，1 H)。LC/MS (G): tr=0.62 min; [M+H] + : m/z 517; [M-H+HC02H]-: m/z 561。 5.5. 4-[[2-(2,6-雙-羥基甲基比啶-4·基氧基）·乙基】-(3-{2- 157426.doc • 85 · 201208689 [2-(2·甲氧基-乙氧基）·乙氧基卜乙氧基卜丙醢基）胺基】丁 酸第三丁基酯
向560 mg 3-[2-(2,6-雙-羥基曱基-吡啶_4_基氧基乙基胺 基]-丁酸第二丁基醋存於4 mi DMF中之溶液中添加65 8 mg 3-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基乙氧基]_乙氧基丨丙酸N_羥基 琥站醯亞胺基酯（參見M.A. Miller，N.B. Malkar, D. Severynse-Stevens, K.G. Yarbrough, M.J. Bednarcik, R.E. Dugdell, M.E. Puskas, R. Krishnan, K.D. James
Bioconjugate Chem.，2006，17，267-274)存於 4 mL DMF 中 之溶液。將混合物於室溫下攪拌1 5小時且隨後在減壓下濃 縮並藉由二氧化石夕上急驟層析（Analogix Super Flash Si02 SF40-80g)使用存於DCM中0%至10%之10%氨溶液（存於 MeOH中）之梯度純化。奋併含有預期產物之各部分並在減 壓下濃縮。獲得460 mg 4-[[2-(2,6-雙-羥基甲基-吡啶-4-基 氧基）-己基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙醯基）-胺基]-丁酸第三丁基酯。1H NMR (400 MHz， DMSO-d6):具有以下構象之50%-50%混合物：1.39 (s，4.5 H); 1.40 (s，4.5 H); 1·63至 1.81 (m，2 H); 2.16 (t，J=7.3 Hz, 1 H); 2·25 (t，J=7.3 Hz，1 H); 2.57 (t，J=6.7 Hz，1 H); 2.66 (1，1=6.7出，111);3.23(3,3 1^);3.31至3.74(111，18 1^); 4.14 (t，J=5.7 Hz，1 H); 4.19 (t，J=5.7 Hz, 1 H); 4.45 (m，4 H); 5.30 (m，2 H); 6.84 (s，1 H); 6.86 (s，1 H)。LC/MS (G): 157426.doc -86 · 201208689 tr=0.8〇 min; [M+H] + : m/z 559； [M-H+HC02H]·： m/z 603 ·> 5·6. 3-[2-(2,6-雙-羥基甲基啶_4-基氧基）·乙基胺基卜丁 酸第三丁基酯 如實例2製備，以3-溴-丁酸第三丁基酯及义[2_(2,6_雙_ 羥基曱基-»比啶-4-基氧基）-乙基]_2_硝基-氨苯磺醯胺開 始：
!H NMR (400 MHz, DMSO-d6)： 1.39 (s, 9 H); 1.62 (t, J=7.2
Hz，2 H); 1.84 (寬m，1 H); 2.22 (t，J=7.2 Hz，2 H); 2.55 (t， J=7.2 Hz, 2 H); 2.86 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 4.07 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 4.45 (d, J=5.7 Hz, 4 H); 5.29 (t, J=5.7 Hz, 2 H); 6.85 (s，2 H)。LC/MS (A): tr=0.40 min; [m+H] + : m/z 341;基 峰：m/z 156。 實例6 6.1. 4-([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基 _ l，2,3，lla-四氫吼咯并[2，lc】【1.4]苯并二氮呼-5-萌-8-基氧基 曱基]-0比啶-4-基氧基）-己基卜(3·{2-[2-(2-甲氧基-己氧基）-乙氧基】-2*氧基}•丙酿基）-胺基】•丁酸乙醋 如實例5製備’以4-[[2-(2,6-雙-羥基甲基比咬-4-基氧 基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）·乙氧基]-乙氧基}_丙 酿基）-胺基]-丁酸乙酯開始： 157426.doc •87· 201208689
4 NMR (500 MHz, DMSO-d6):具有以下構象之50%·50〇/〇 混合物：1·11 至 1.18 (m, 3 H); 1.54至 1·82 (田，8 H); 2·24 (d，J=7.3 Hz，1 H); 2.32 (d，J=7.3 Hz，1 H); 2·53至 2·68 (m， 4 11);2.87至3.07(111，4 1€);3.20(3，1.5 1^);3.21(3，1.511); 3.31 至 4.27 (m，32 H); 5.16 (d，J=13.2 Hz, 2 H); 5.22 (d， J=13.2 Hz，2 H); 5.55 (q，J=7.0 Hz，2 H); 6.94 (s，2 H); 7.08 (s，2 H); 7.37 (s，2 H); 7.76 (d，J=4.4 Hz，2 H)。 LC/MS (A): tr=0.86 min; [M+H] + : m/z 1039;基峰：m/z 376。 6.2. 4-[[2-(2,6-雙-羥基甲基-nb啶-4-基氧基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基-己氧基）-乙氧基】-乙氧基卜丙醯基）-胺基】-丁 酸乙酯 如實例5製備，以3-[2-(2,6-雙·羥基甲基-吡啶_4·基氧 基）-乙基胺基]-丁酸乙酯開始：
NMR (400 MHz，DMSO-d6)具有以下構象之5〇% 5〇% 混合物：1.16 (t，J=7.1 Hz，1.5 H); 1.17 (t，J=71 Ηζ χ 5 H); 1.67至 1.97 (m，2 H); 2.25 (t，J=7.3 Hz，】H); 2 34 (t, J=7.3 Hz，1 H); 2.57 (t，J=6.8 Hz, 1 H); 2.66 (t，j=6 8 Hz i H);3·23(S，3H);3.32至3.74(m，18H);4·04(q，J=71Hz， 157426.doc • 88 · 201208689 1 H); 4.05 (q，j=7 1 Hz, 1 H); 4.14 (t，J=5.7 Hz，1 H); 4.19 (t, J=5.7 Hz, 1 H); 4.45 (m, 4 H); 5.30 (m, 2 H); 6.84 (s, 1 H); 6.86 (s, 1 h)。LC/MS (A): tr=0.47 min; [M+H] + : m/z 531;基峰：m/z 376; [M-H+HC02H]_: m/z 575。 實例7 7·1· 4-([2-(2,6-雙-【⑻_2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基- l，2,3，lla-四氫吡咯并【2^】” 4】苯并二氮呼_5_酮_8_基氧基 甲基]-咕咬-4·基氧基乙基卜(3_{2_[2_(2-嗎啉-4-基-乙氧 基）-乙氧基]_乙氧基卜丙醢基）·胺基】-丁酸甲酯 如實例5製備’以4_[[2-(2,6-雙-羥基甲基-吡啶-4-基氧 基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧 基}-丙醯基）-胺基]-丁酸曱酯開始：
LC/MS (E): tr=0.88 min; [M+H] + : m/z 1080; [Μ+Η20+Η] + : m/z 1098; [M+2H20+H] + : m/z 1116。 7·2· 4-[[2-(2,6-雙-羥基甲基-咬啶_4_基氧基）_乙基】_(3_{2_ [2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-乙氧基】-乙氧基卜丙酿基）·胺基卜 丁甲酸酯 如實例5製備，以4-[[2-(2,6-雙-經基甲基-β比咬_4_基氧 基）-乙基]-(3-{2-[2-(2嗎啉-4-基-乙氧基）_乙氧基]•乙氧 基}-丙醯基）-胺基]-丁酸第三丁基酯開始： 157426.doc •89· 201208689
4 NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.83 (m，2 H); 2.33 (m，2 H); 2.42 (m，4 H); 2.48 (t，J=5.8 Hz，2 H); 2.61 (m，2 h); 3.40(m，2H);3.4S^3.55(m，10H);3.56(m，4H);3.62(s， 3 H); 3.69 (寬t，J=6.6 Hz，4 H); 4.21 (t，J=5.6 Hz，2 H); 4.49 (d, J=5.3 Hz, 4 H); 4.90 (t, J=5.3 Hz, 2 H); 6.87 (s, 2 H)。LC/MS (G): tr=0.50 min; [M+H] + : m/z 572;基峰：m/z 198; [M-H+HC02H]·: m/z 616。 7.3. 4-[[2-(2,6-雙-經基甲基咬-4-基氧基）-乙基卜(3 【2-(2-嗎啉-4-基氧基）-乙氧基]-乙氧基}_丙釀基）_胺 基】-丁酸第三丁基酯 如實例5製備，以3·{2-[2·(2-嗎淋-4_基-乙氧基）-乙氧 基]-乙氧基}-丙酸經基玻拍醯亞胺基醋開始：
Xju 4 NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.42 (s，9 H); 1.78 (m，2 H); 2.22 (m，2 H); 2.42 (m，4 H); 2.48 (t，J=5.8 Hz，2 H); 2.61(111，2即3.39(111，2 11);3.48至3.55(111,1〇11);356 (m，4 H); 3.69 (寬 t，J=6·6 Hz，4 H); 4.21 (t, J=5.6 Hz, 2 H); 4.49 (d, J=5.3 Hz, 4 H); 4.90 (t, J=5.3 Hz, 2 H); 6.87 (s, 2 H)。LC/MS (G): tr=0.65 min; [M+H] + : m/z 614;基峰：m/z 240 〇 7·4· 3-{2-[2-(2-嗎淋-4-基-乙氧基）-乙氧基]乙氧基}-丙酸 157426.doc -90· 201208689 N-羥基琥珀醯亞胺基酯 <α °'^Yc Ο1 一 向溶解於50 mL THF中之830 mg 3-{2-[2_(2_嗎啉_4•基_ 乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙酸中添加1.1 g碳酸Ν，ν，-二琥 珀醯亞胺基酯及1.5 mL DIPEA。在室溫下24小時後，添加 200 mL DCM並在減壓下將所得有機相濃縮至其體積之— 半且隨後用水洗滌兩次，經Mg S〇4乾燥並在減壓下濃缩。 由此獲得1.05 g 3-{2-[2-(2-嗎淋-4-基-乙氧基）乙氧基]_乙 氧基}-丙酸N-經基玻ίό酿亞胺基S旨。丨!·} NMR (400 MHz:， DMSO-dg)： 2.39 (m, 4 H); 2.45 (t, J=5.9 Hz, 2 H); 2.81 (s, 4 11);2.92(1;，】=6.0 112，2 11);3.45至3.57(111,14 11);3.72(1;， J=6.0 Hz, 2 H) 〇 LC/MS (G): tr (ELSD)-〇.49 min; [M+H] + : m/z 389。 7·5· 3-{2-【2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-乙氧基卜乙氧基卜丙酸 〇 〇〇 ，v^Yc 向1 g 3-{2-[2-(2-嗎淋-4-基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙 酸第三丁基酯存於50 ml DCM中之溶液中添加4 ml TFA。 將混合物於室溫下攪拌10小時且隨後在減壓下濃縮並在 Mega BE-SCX，25GM 150ML 柱（Varian)上使用經 MeOH 之 洗滌及經存於MeOH中之2 N氨溶液之期望產物之分離來純 化。合併含有預期產物之各部分並在減壓下濃縮。獲得 830 mg 3-{2-[2-(2-嗎啉-4-基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙 酸。LC/MS (E): tr (ELSD)=0.16 min; [M+H]+: m/z 292 » -91· 157426.doc 201208689 7·6· 3·{2-[2-(2 -嗎琳·4-基-乙氧基）-乙氧基】-乙氣基}-丙酸 第三丁基酯 〇0
^Y°V 向989 mg 2-[2-(2-嗎琳-4-基-乙氧基）-乙氧基]-乙醇存於 2.8 mL無水THF中之溶液中添加1.04 mg鈉。在40°C下加熱 2小時15分鐘後，添加793 μί丙烯酸第三丁基酯。在40°C 下再加熱2小時後，將反應混合物於室溫下靜置20小時且 隨後在減壓下濃縮並藉由二氧化矽上急驟層析（Merck SuperVarioPrep 70 g管柱，Si60 1 5-40 μιη)使用存於 DCM 中 之0%至6% MeOH之梯度純化。合併含有預期產物之各部 分並在減壓下濃縮。獲得1 g 3-{2-[2-(2-嗎琳-4-基-乙氧 基）-乙氧基]-乙氧基}-丙酸第三丁基酯。LC/MS (E): tr (ELSD)=0.59 min; [M+H] + : m/z 348。 用式（IA)化合物抑制細胞系MDA-MB-231、MDA-A1及 HCT116增殖之評價，其中RCGl=-SZa (Za=SMe)或 RCGl=-C(=0)ZbRb (ZbRb=OMe) 使MDA-MB-231、MDA-A1或HCT116細胞在其指數生長 期中胰蛋白酶化並重新懸浮於其相應培養基（對於MDA細 胞而言，DMEM/F12 Gibco 第 21331 號、10% FCS Gibco 第 10500-056號、2 nM麩胺醯胺Gibco第25030號；對於 HCT116 細胞而言，DMEM Gibco 第 11960 號、10°/〇 FCS Gibco 第 10500-056 號、2 mM麩胺醯胺 Gibco 第 25030 號） 中。將細胞懸浮液接種於含有血清之完全培養基中之 157426.doc -92- 201208689
Cytostar 96 孔培養板（GE Healthcare Europe，第 RPNQ0163 號）中至 5000 個細胞 / 孔（MDA-MB-231、MDA-A1、 HCT116)之密度。在培育4小時後，向孔中添加連續稀釋之 托馬黴素二聚體，每一濃度一式三份。在細胞毒性劑存在 下及在37°C及5% C02氣氛下將細胞培養3天。在第四天， 向每一孔中添加10 μΐ 14C-胸苦溶液（0.1 μ(Μ/孔，Perkin Elmer第NEC56825000號）。在開始實驗96小時後利用 Microbeta放射性計數器（Perkin Elmer)量測14C-胸皆之納 入。藉由測定利用經細胞毒性劑處理之細胞獲得之計數與 利用對照孔之細胞（僅用培養基處理）獲得之計數之間的比 率以存活百分比形式表示該等數據。
表II 對增殖之抑制(在96 h時14C-胸苷脈衝） IC50 [pM] 式(IA)化合物之結構 HCT116 MDA-MB231 MDA-A1 、。〜 靡;Λ;取 61 128 16270 18 41 3465 、〇〜〇0〇) ^N^·^u^0、 235 384 17849 48 81 26474 157426.doc -93- 201208689
發現測試化合物（RCGl=-SZa，其中Za=SMe，或RCG1 = -C(=0)ZbRb，其中ZbRb=〇Me)具有強大抗癌活性；此表明 以另一基團ZbRb表徵之類似化合物易於具有至少相同活 性。 第2章·新顆托馬徽素偶聯物 實例8 :利用4-{2-【{2-丨2-(2-甲氧基·乙氧基）_乙氧基]-乙 基}-(2-甲基-(2-甲基_2·疏基-丙基）_胺基】_乙氧基卜2,6_雙_ [(s)-2-乙-(e)-亞基+二甲氧基四氫吡咯并 [2，1<;】丨1.4】苯并二氮呼_5_酮_8_基氧基甲基]_吡啶之經8?〇8 修飾之偶聯物hu2Hll的製備 在磁力攪拌下向存於2.37 ml具有濃度為〇·〇5 Μ之磷酸 鉀、0.05 M NaCl及2 mM伸乙基二胺四乙酸（EDTA)之水性 緩衝液（pH=6.5)中的 24 mg hu2Hl 1(亦由 WO 2008010101 第 15頁上之hu5 3 2H11闡述之抗體；此係包含具有胺基酸序 列SED ID No. 24之Vh的抗體）中添加溶解於62 pL DMA中 之320 pg SPDB(闡述於WO 2010/076474第7頁上）。在室溫 下4小時後，藉由在Sephadex G25(PD-10 GE管柱）上凝膠 過濾純化經修飾抗體，該管柱在具有濃度為0.05 Μ之N-(2-羥基乙基）-六氫吡嗪-Ν·-2-乙烷磺酸（HEPES)、0.05 M NaCl 及2 mM伸乙基二胺四乙酸（EDTA)之水性緩衝液（pH=8)中 預平衡。用二硫代蘇糖醇（DTT)處理經修飾抗體之等分試 157426.doc -94· 201208689 樣以裂解二硫代吼啶基團。藉由分光光度法使用吡啶硫醇 之消光係數…343 nm=8080 M^cm·1)、二硫代。比咬基團之消 光係數（e28。nm=5100 M'm·丨）及hu2Hll之消光係數（e280 nm=206941 Μ、πΓ〗）分析所釋放之經修飾抗體以及吡啶硫 醇：在7.08 mg/mL之濃度下測得平均3.2個二硫代吡啶基 團/抗體分子。 在磁力授拌下向存於3.2 ml具有0.05 Μ濃度之N-(2-經基 乙基）-六氫0比嗪-N，-2-乙烷磺酸（HepeS)、0.05 M NaCl及2 mM伸乙基二胺四乙酸（EDTA)之水性緩衝液（pH=8)中之12 mg上述經修飾抗體中添加713 μί DMA及溶解於87 μί二曱 基乙醯胺（DMA)中之1.22 mg 4-{2-[{2-[2-(2-曱氧基-乙氧 基）-乙氧基]-乙基}-(2-甲基-(2-甲基-2-酼基-丙基）-胺基]•乙 氧基}-2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四 氮°比咯并[2，1(：][1.4]苯并二氮呼-5_酮-8-基氧基甲基]_〇比 啶。在30°C下12小時後’將混合物在MillexR-SV 0.45 μΜ (PVDF Durapore Millipore)上過濾並於在含有20% Ν-甲基 吡咯啶酮（ΝΜΡ)之鹽水磷酸鹽緩衝液中預平衡之
SuperdexTM 200製備級管柱（Hil〇adTM 26/60 GE管柱）上純 化。合併目標部分並在Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k Millipore)上濃縮且隨後在 Sephadex G-25(PD10，GE管柱） 上過漉’該管柱在具有含10%嚴糖及5 % NMP之一定濃度 之10 mM組胺酸的水性緩衝液（ΡΗ=6.5)中預平衡。 藉由分光光度法使用4-{2-[{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）_乙 氧基]-乙基}-(2-曱基-2-甲基二硫烧基-丙基）_胺基]_乙氧 157426.doc -95- 201208689 基}-2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二曱氧基-l，2,3，lla-四氫 吡咯并[2，lc][1.4]苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基甲基]-吡啶之 消光係數 ^32〇 nm=7843 M cm * 及 e28〇 nm=4436 M*丨cm-1 及 hu2Hl 1之消光係數e28〇 nm=206941 M^cm·1分析所得偶聯物 (3.5 mL):在1.74 mg/mL下測得平均2.9個托馬黴素（4-{2- [{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基卜(2-甲基_(2_甲基· 2_巯基-丙基）-胺基]-乙氧基}-2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3,11&-四氫吡咯并[2，1〇][1.4]苯并二氮呼_5_ 酮-8-基氧基甲基]吡啶）二聚體/抗體分子。 實例9 :利用4-{2-【{2·[2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基】_乙 基}-(2-甲基-(2-甲基-2-酼基-丙基）-胺基】-乙氧基卜2,6_雙_ [(S)_2_乙-(E)-亞基-*7-二甲氧基_i，2,3，lia-四氫啦洛并 [2，lc]【l·4】苯并二氣呼-5-闕_8-基氧基甲基】_ιf比咬之經sNPP 修飾之偶聯物hu2HllR35R74的製備 在磁力攪拌下向存於8.2 ml具有0.05 Μ濃度之磷酸卸、 〇·〇5 M NaCl及2 mM伸乙基二胺四乙酸（EDTA)之水性緩衝 液（pH=6.5)中的 1〇〇 mg hu2HllR35R74(參見 WO 2011039721第20頁）中添加溶解於186 pL DMA中之1.3 mg SNPP(闡述於WO 2004/016801第36頁上）》在室溫下4小時 後’將經修飾抗體之溶液分成四份並藉由在四個Sephadex G25管柱（PD-10 GE管柱）上凝膠過濾純化，該等管柱在具 有〇·〇5 Μ濃度之N-(2-經基乙基）-六氫π比嗪_ν·_2 -乙烧續酸 (HEPES)、0.05 M NaCl及 2 mM伸乙基二胺四乙酸（EDTA) 之水性緩衝液（pH=8)中預平衡。在混合並均質化由此獲得 157426.doc • 96· 201208689 之四份濾液後，藉由分光光度法使用硝基°比啶硫醇之消光 係數（C280 nm = 3344 M km 1 及 e325 nm=l〇964 M km·1)、及 hu2HllR35R74之消光係數（e280 nm=219528 M^cm·1)分析經 修飾抗體：在6.27 mg/mL之濃度下測得平均4.47個二硫代· 硝基°比啶基團/抗體分子。 在磁力攪拌下向存於23.24 ml具有0.05 Μ濃度之N-(2-羥 基乙基）-六氫吡嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES)、0.05 M NaCl及 2 mM伸乙基二胺四乙酸（EDTA)之水性緩衝液（pH=8)中之 87 mg上述經修飾抗體中添加4.38 mL DMA及溶解於1.43 11^二甲基乙醯胺（〇]^八）中之17.73 11^4-{2-[{2-[2-(2-甲氧 基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}_(2-甲基-(2-曱基-2-疏基-丙基）_ 胺基]-乙氧基卜2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3，11&-四氫°比咯并[2，1(：][1_4]苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基 曱基]-吡啶。在30°C下17小時後，將混合物在SteriflipR 0.45 μΜ (PVDF Durapore Millipore)上過遽並於在含有 20% N-曱基吡咯啶酮（NMP)之鹽水磷酸鹽緩衝液中預平衡之 SuperdexTM 200 製備級管柱（HiloadTM 26/60 GE 管柱）上 3 次 注射純化。合併目標部分並在Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k Millipore)上濃縮且隨後在 Sephadex G_25(HiPrep 26/10 脫鹽，GE管柱）上過濾，該管柱在具有含10%蔗糖及5% NMP之一定濃度之10 mM組胺酸的水性緩衝液（PH=6.5)中 預平衡。 藉由分光光度法使用hu2HllR35R74之消光係數e280 nm=219528 IV^cnr1 分析所得偶聯物（28 mL):在 1·99 157426.doc •97- 201208689 mg/mL之濃度下測得平均3.13個托馬黴素（4-{2-[{2-[2-(2· 甲氧基_乙氧基）-乙氧基]-乙基}-(2 -甲基-(2-甲基-2-疏基-丙 基）-胺基]-乙氧基}-2,6-雙-[(S)-2-乙_(E)-亞基-7-二甲氧基-1，2,3，113-四氫。比咯并[2，1(；][1.4]苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基 甲基]比啶）二聚體/抗體分子。 實例10 :利用4-{2-[{2-【2-(2-甲氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙 基}-(2-甲基-(2-甲基-2-酼基-丙基）-胺基】-乙氧基}-2,6-雙· [(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3，lla-四氫吡咯并 [2，1<:】[1.4】苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基甲基]-吡啶之經8?08 修飾之偶聯物hu2HllR35R74的製備 如實例8製備，以11112111111351174開始：測得平均2.92個 托馬黴素（4-{2-[{2-[2-(2-曱氧基-乙氧基）-乙氧基]-乙基}-(2-甲基-(2-曱基-2-毓基-丙基）-胺基]-乙氧基}-2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基-l，2,3,lla-四氫"比咯并[2，lc][1.4] 苯并二氮呼-5-酮-8-基氧基甲基]-°比啶）二聚體/抗體分子。 實例11 :利用4-([2-(2,6-雙-【(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧 基-1，2,3，113-四氫吡咯并【2，1<:】[1.4】苯并二氮呼-5-酮-8-基 氧基甲基]-it啶-4-基氧基）-乙基]-(3-{2·[2·(2-甲氧基-乙氧 基）-乙氧基】-乙氧基卜丙醯基）-胺基]-丁酸Ν-羥基琥珀醯亞 胺基酯之偶聯物hu2HllR35R74的製備 向存於150 μί具有0·043 Μ濃度之磷酸鉀之水性緩衝液 (ρΗ=6.6)中的 1.59 mg hu2HllR35R74 中連續添加 6 pL 1 Μ HEPES水溶液，之後添加267 μί具有0.05 Μ濃度之Ν-(2-羥 基乙基）-六氫吡嗪-Ν，-2-乙烷磺酸（HEPES)、0.05 M NaCl及 157426.doc •98· 201208689 2 mM伸乙基二胺四乙酸（EDTA)之水性緩衝液（ρΗ=8)、ι〇〇 pL DMA及隨後添加溶解於5 μ1 DMA中之83 pg 4-([2-(2,6-雙-[(S)-2-乙-(E)-亞基-7-二甲氧基_i，2,3，lla-四氫吡咯并 [2，lc][1.4]本并二氮呼基氧基甲基]-η比咬_4_基氧 . 基）-乙基卜(3-{2·[2_(2·甲氧基_乙氧基）-乙氧基]-乙氧基-丙 醯基）-胺基]-丁酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯。在川它下斗小時 後，在Sephadex G-25(NAP_5 GE管柱）上過濾混合物，該 等管柱在具有濃度為10 mM之組胺酸且含1 〇%蔗糖及5 〇/0 NMP之水性緩衝液（pH=6.5)中預平衡。 藉由分光光度法使用4·[[2-(2,6-雙-經基曱基比咬-4-基 氧基）-乙基]-(3-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基）_乙氧基]•乙氧基卜 丙醯基）-胺基]-丁酸乙酯之消光係數（e322 nm=7971 M^cm·1 及e28〇 nm=5219 M'm·1)分析所得偶聯物（丨mL):在1.14 mg/mL之濃度下測得平均4.18個托馬黴素二聚體/抗體分 子。 用細胞毒性偶聯物hu2Hll(或分別hu2HllR35R74)抑制細 胞系MDA-MB-231增殖之評價
使MDA-MB-231細胞在其指數生長期中胰蛋白酶化並重 - 新懸浮於其培養基（DMEM/F12 Gibco第21331號、10% FCS
Gibco 第 10500-056 號、2 nM 麵胺酿胺 Gibco 第 25030 號） 中。將細胞懸浮液接種於含有血清之全培養基中之
Cytostar 96 孔板（GE Healthcare Europe，第 RPNQ0163 號） 中至5000個細胞/孔之密度。在培育4小時後，以自1〇·7 Μ 至ΙΟ·12 Μ減小之濃度向孔中添加連續稀釋之抗體-細胞毒 157426.doc -99- 201208689 性劑免疫偶聯物（對每一濃度一式三份）。在抗體-細胞毒性 劑免疫偶聯物存在下及在37°C及含有5% C02氣氛下將細胞 培養3天。在第四天，向每一孔中添加10 μΐ 14C-胸苷溶液 (0.1 μ(：ί/孔，Perkin Elmer第 NEC56825000號）。在開始實 驗96小時後利用Micro beta放射性計數器（Perkin Elmer)量 測14C-胸苷之納入。藉由測定利用經免疫偶聯物處理之細 胞獲得之計數與利用對照孔細胞（僅用培養基處理）獲得之 計數之間的.比率以存活百分比形式表示該等數據。在用星 號（*)指示之某些實驗中，在實驗開始時向孔中添加裸抗體 hu2Hll(或分別hu2HllR35R74)至1 μΜ之濃度並如先前所 述量測增殖之抑制。
表III 對增殖之抑制(在96 h時14C-胸苷脈衝） IC50 [pM] 转構 平均IC50 平均 IC50(+裸 Ab*) IC50 比 58 760 13 〜！!kXs,S^JL 广 2H11R 議 0 丨 丨 0 32 502 16 〜<ikXs,Sy〇L，U2H”R35R74 72 3550 49 【圖式簡單說明】 157426.doc •100· 201208689 圖1 : SPDP對結合劑之修飾； 如2 :亞胺基硫咮對結合劑之修飾； 圖3:實例8之偶聯物在去糖基化後的去卷積高解析度質 譜； • 圖4 :實例9之非去糖基化偶聯物的去卷積高解析度質譜 (HRMS)； 圖5 :實例10之非去糖基化偶聯物的去卷積高解析度質 譜（HRMS); 圖6 :實例11之非去糖基化偶聯物的去卷積高解析度質 譜（HRMS)。 157426.doc -101 -

Claims (1)

  1. 201208689 七、申請專利範圍： 1. 一種式（I)化合物： Q-(CH2CH2〇)k-cH2CH2'G
    其中： ——代表單鍵或雙鍵，條件係 若=代表單鍵，則： U及/或LT可相同或不同，其彼此獨立地代表Η ; W及/或W’可相同或不同，其彼此獨立地代表： OH、-OR、-OCOR、-COOR、-OCOOR、-OCONRR，、使 N10及C11包括在環中之環狀胺基甲酸酯、-NRCONRR·、 -OCSNHR、使N10及C11包括在環中之環狀硫代胺基曱 酸酯、-SH、-SR、-SOR、-SOOR、-S03·、-NRSOOR·、 -NRR'、使N10及C11包括在環中之環狀胺、-NROR，、 -NRCOR*、-N3、-CN、Ha卜三烷基鎸或三芳基鎸基團； 若=代表雙鍵，則： U及U·不存在； W及/或W'可相同或不同，其彼此獨立地代表Η ; R!、R2、R!’、R/可相同或不同，其彼此獨立地代 表：Η、Hal或視情況經一或多個選自以下之取代基取代 157426.doc 201208689 之基團（CrCe)烧基：Hal、CN、NRR,、CF3、OR、芳基 或雜芳基、S(0)qR ’其中q=0、1或2 ; 或另一選擇為 心及尺2及/或Ri'及RV分別一起形成雙鍵=CH2或=CH-CH3 ； 丫及T可相同或不同，其彼此獨立地代表Η或-OR ; Μ代表CH或N ; ALK及ALK·表示基團（CVC6)伸烷基； R及R'彼此獨立地代表Η或視情況經一或多個選自以下 之取代基取代之基團（Ci-Cg)烧基或芳基：Hal、CN、 NRR’、CF3、OR、芳基或雜芳基； L!代表： 單鍵； 或 基團-(OCH2CH2)r ’其經由氧原子附接至苯基或吡 啶基環’ i代表介於2至40範圍内之整數； 或 基團-iHCVCdALK- ’其經由D附接至該苯基或吡 啶基環’其中D代表〇、-NH-或-N(Ci-C4)烷基-; L2代表： 基團-(CVCdALK-; 或 基團-(CHaCKCOj-C^CH2-，j代表介於1至40範圍内 之整數； 157426.doc -2- 201208689 或 基團，其經 由單元-(CI^C^O)·附接至氮原子，〗代表介於丨至⑽範圍 内之整數，且R，，代表Η或基團（(VC4)烷基； Q代表單鍵或基團C(=〇); k代表介於〇至40範圍之整數； G代表基團-OR或.NRRm，係如前文較義或使得其 與所附接之氮原子一起形成基團（C4_CiG)雜環烷基，該 (C4-C1())雜環烷基可在該環中包含選自N、〇及8之另一雜 原子且其可視情況經至少一個選自基團（Ci_c^烷基、鹵 素原子及經基之取代基取代； RCG1 代表基團 _SZa或-C(=0)_ZbRb; za代表 Ac、Ra或 SRa ; Ra代表Η、或視情況經一或多個選自以下之取代基取代 之基團（C丨-C6)烷基、（Cs-Cs)環烷基、芳基、雜芳基或 (C4_Ci〇)雜環烧基：Hal、CN、NRR/、CF3、OR、N〇2、 芳基或雜芳基； Zb代表單鍵、_〇_或-NH-且Rb代表Η或基團院基、 (C3-cs)環烧基、芳基、雜芳基或（C4_Ci〇)雜環烷基或另 一選擇為Zb代表單鍵且Rb代表Hal ; 條件係若1^代表單鍵，則RCG1代表-SZa。 2.如請求項1之化合物’其中 及/或R2=R2’及/或γ=γ·及/或該兩個附接至該苯基或吡啶 基核之基團ALK及ALK，相同。 157426.doc 201208689 3·如請求項1之化合物，其具有式（IA)或（IB): Q-(CH2CH2〇)k.CH2CH2-G
    如請求項3之化合物，其具有式（IA):
    5. 如請求項1至4中任一項之化合物，其中γ及γ，代表基團 (CrCO烷氧基。 6. 如請求項1至4中任一項之化合物，其中μ代表N。 7. 如請求項1至4中任一項之化合物，其中若^代表單鍵， 則 L2 代表-(CH2CH2〇)rCH2CH2-或 _(CH2CH20)j- CHzCHzNRycvCdALK-。 8·如請求項1至4中任一項之化合物，其中G代表基團 157426.doc -4- 201208689 -OH、-0(Ci-C6)烷基、-NH2、-NHA-Ce)烷基或 _N(Ci、 CO烷基2或G代表基團-NRR，，其中R及R，與其所附接之 氮原子一起形成基團（C4-C1Q)雜環烷基，該（C4_C1G)雜環 烷基可在該環中包含選自Ν、Ο及S之另一雜原子且其可 視情況經至少一個選自基團（Q-C4)烷基、鹵素原子及經 基之取代基取代。 9.如請求項1至4中任一項之化合物，其中： Lf-DJCpCdALK-且 LfJCVCdALK-;或 LeyOCHzCHdi-且 LfJCVCdALK-;或 L!=單鍵且 Ι^π-βΗπΗζΟγΟΗΑΗζΝΙΙΉί^-^ΑΙ^Κ-:或 Lf-DJCVCdALK-，且 L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"_ (CVCOALK-;或 Lf-DyCVCdALK-且L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2-。 10·如請求項1至4中任一項之化合物，其中： Li=-D-(Ci-C6)ALK-，L^^-CCi-CejALK-，Q=單鍵， k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; Li=-D-(Ci-C6)ALK-，L2=-(Ci-C6)ALK_，Q=CO，k=l-l〇， G=OR，RCGl=-SZa ; Li=-(〇CH2CH2)i_，L2=-(Ci_C6)ALK_，Q=單鍵，k=l-l〇， G=OR > RCGl=-SZa ； L^-COCHiCHi)；- > L2=-(C1-C6)ALK- » Q=CO » k=l-l〇 » G=OR，RCG卜-SZa ; Li=_D-(Ci-C6)ALK-，L2=-(Ci_C6)ALK-，Q=單鍵， 157426.doc 201208689 k=l-10，G=NRR，，RCGl=-SZa ; Li=-D-(C1-C6)ALK- > L2=-(C1-C6)ALK- > Q=CO > k=l-10 « G=NRR'，RCGl=-SZa ; L!=單鍵， ，Q=單鍵，k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; Li= ，Q=CO，k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; Li=單鍵，Le-CCHfHsCOj-CHzCHzNR'YCi-CdALK-’ Q=單鍵，k=0-10，G=NRR，，RCGl=-SZa ; Le單鍵，L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"-(Cl-C6)ALK-，Q=CO，k=0-10，G=NRR，，RCGl=-SZa ; Li=-D-(C!-C6)ALK- ， L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NRM- (CrCOALK-，Q=單鍵，k=0-10，G=NRR，，RCGl=-SZa ; L1=-D-(C1-C6)ALK- ， L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2NR"- (C,-C6)ALK- » Q=CO > k=0-10 > G=NRR' > RCGl=-SZa ； Li=-D>(c1-C6)ALK- ， L2=-(CH2CH20)rCH2CH2NR"- (CkDALK-，Q=單鍵，k=l-10，G=OR，RCGl=-SZa ; Li=-D-(C1-C6)ALK- ， L2=-(CH2CH20)rCH2CH2NR"- (Ci-C6)ALK- » Q=CO > k=l-10 * G=OR * RCGl=-SZa ； Le-D^CrCJALK-，I^s^CrCJALK-，Q=單鍵， k=l-10，G=〇R，RCGl=-C(=0)ZbRb ; L1=-D-(C,-C6)ALK- > L2=-(CrC6)ALK- » Q=CO > k=l-10 > G=OR > RCGl=-C(=0)ZbRb ； Li=-D-(C,-C6)ALK- * L2=-(C1-C6)ALK- » Q= # ^ . 157426.doc 201208689 k=l-10，G=NRR'，RCGl=-C(=0)ZbRb ; Lj—-D-(Ci~C6)ALK- 1 L2=-(Ci-C6)ALK- * Q=CO * k=l-10 * G=NRR·，RCGl=-C(=0)ZbRb ; L^-COCHsCHz^- » L2=-(Ci-C6)ALK- > Q=-f-M > k=l-10 > G=OR，RCGl=-C(=0)ZbRb ; L1=-(〇CH2CH2)r » ^-(C^^ALK- > Q=CO · k=l-10 » G=OR，RCGl=_C(=0)ZbRb ; Li=-(OCH2CH2)i_，L2=-(Ci-C6)ALK~ ’ Q=單鍵，k=l-10， G=NRR·，RCGl=-C(=0)ZbRb ; Lf-COCHzCHA·，L2=-(CrC6)ALK-，Q=CO，k=l-10 ’ G=NRR·，RCGl=-C(=0)ZbRb ; Li=-D-(Ci-C6)ALK- ’ L2=_(CH2CH2〇)j-CH2CH2-，Q: 單鍵，k=l-10，G=OR，RCGl=-C(=0)ZbRb ; L!=-D-(Ci-C6)ALK- ， L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2-， Q=CO，k=l-10，G=OR，RCGl=-C(=0)ZbRb ; Li=-D-(Ci-Cg)ALK- 5 L2=-(CH2CH2〇)j-CH2CH2- * Q= 單鍵，k=0-10，G=NRR·，RCGl=-C(=0)ZbRb ; L1=-D-(C1-C6)ALK- ，L2=-(CH2CH20)j-CH2CH2-， Q=CO，k=0-10，G=NRR·，RCGl=-C(=0)ZbRb 〇 11.如請求項1至4中任一項之化合物，其中-COZbRb代表 -COOH、 -COO-N i ,so3m M=H或暘離子 3 —COO-N -COCKCrCe)烷基、 } 157426.doc 201208689
    c〇〇O ，其中IG代表至少一個 12. 如請求項1至4中任一項之化合物，其中-SZa代表-SH或 -SSCCVCd烷基或-SS-雜芳基。 13. 如請求項1之化合物，其選自以下中之一者：
    157426.doc 201208689
    14. 一種製備偶聯物之方法，該方法由以下組成： (i)使以下物質接觸並反應： 視情況經緩衝之結合劑之水溶液’該結合劑視情況借助 修飾劑修飾， 及 如請求項1至13中任一項之式⑴化合物的溶液， 該式（I)化合物之化學基團RCG1對該結合劑上存在之 化學基團RCG2、尤其對抗體上存在之胺基具有反應 性’若適當’該修飾劑已引入該等化學基團RCG2， 以便利用共價鍵之形成將該式（I)化合物附接至該結合 劑； (ii)及隨後視情況分離步驟⑴中形成之該偶聯物與該 式（I)化合物及/或未反應結合劑及/或可能形成之任何聚 集物。 15.如請求項14之方法，其中： 在包含-SZa型反應性化學基團RCG1的式（I)衍生物存在 下，該結合劑包含： 157426.doc 201208689 在RCG1代表-SH之情形下，二硫化學基團； 在RCG1代表-823且2/只之情形下，硫醇化學基 團； 在RCG1代表-SH之情形下，馬來醯亞胺基或鹵代乙 醯胺基化學基團； 在包含-C(=0)-ZbRb型反應性化學基團RCG1之式⑴衍 生物存在下，該式（I)衍生物與該結合劑之胺基官能團、 尤其由抗體之離胺酸（Lys)殘基之側鏈產生之ε-胺基反 應。 16.如請求項14或15之方法，其中·· 在該反應性化學基團RCG1屬於-SH型時，及在該結合 劑具有胺基官能團、尤其由該等抗體離胺酸殘基之側鏈 產生之ε-胺基時，該結合劑借助修飾劑修飾，該修飾劑
    〇之化合物’其中R代表基團 ⑹-⑸烧基、芳基、雜芳基、（C3_C7)環烧基、（c4 Ci〇) 雜環烷基；
    之聚乙二醇化類似物或式 物，其中X3、X4、X5、父
    之磺酸類似 之磺酸類似 \代表Η或基團（〇ν(：6)烷基，χ】 157426.doc •10· 201208689 及x2代表-Η、-CONX8X9、-N〇2，X8及x9代表H或基團 (c丨-C6)烷基，X7代表或另—選擇為四級銨基 團’且a表示介於〇至4範圍内之整數且b表示介於〇至 2000範圍内之整數；或選自4_(Ν·馬來醯亞胺基曱基）環 己烷-1-曱酸琥珀醯亞胺基酯；4-(Ν-馬來酿亞胺基甲基） 環己烷-1-甲 醯亞胺基酯 Ο—N 0 Ο 酸硫代琥珀
    其中R代表基團 -環己基-(CH2)n-且n代表介於
    (CH2)n-、. -(CH2)n-環己基 _、 1至10範圍内之整數
    醯亞。胺基酯；3-(Ν-溴乙醯胺基）丙酸琥珀醢亞胺基醋 0 〇 ，b為介於〇與2〇00之間之整數； 在該反應性化學基團RCG1屬於-SZa型且Ζ#Η時，及 在該結合劑具有胺基官能團、尤其由該等抗體離胺酸殘 基之側鏈產生之ε-胺基時，該結合劑借助選自下式化合 物之修飾劑修飾， 157426.doc 201208689
    其中： Hal代表鹵素原子； x10代表_素原子或基團_C00Xi4、硝基、未經取代 或經鹵化之（c丨-CO烷基、未經取代或經鹵化之（C1_C8)烷 氧基、未經取代或經鹵化之（C2_Cs)烯基、未經取代或經 齒化之（C2_cs)炔基、未經取代之（C3_C8)環烷基 '未經取 代或經一至三個選自以下之取代基取代之芳基：胺基、 鹵素原子、未經取代或經齒化之基團（Ci_c8)烷基、未經 取代或經_化之（CrCs)烷氧基； Χπ、X】2、X〗3各自獨立地代表氫原子或另一選擇為 可代表; 或Χίο與Xn—起形成（C^C5)伸烷基環，其未經取代 或經1至5個基團烷基取代； 或XlG或Xn與X!2 —起形成（C!-C5)伸燒基環，其未經 取代或經1至5個基團（Ci-CJ烷基取代， 且Xu係-H或基團（CKC8)烷基， 或 Χίο-Xi1=Xi2 = Xi3=H ; 在該反應性化學基團RCG1屬於-SH型時，及在該結合 劑具有硫醇官能團時’尤其在藉由突變或或藉由具有胺 基官能團之結合劑之化學修飾引入半胱胺酸後，該結合 劑經修飾以使其硫醇官能團轉化為二硫官能團，更具體 而言借助選自式
    157426.doc •12- 201208689 之修倚劑來修飾，其中Χι及χ2代表_H、_c〇N：^\ -N〇2 ’又8及乂9代表Η或基團（Ci_c6)烷基。 17. —種偶聯物，其可經由如請求項14至16中任一項之方 獲得。 18. —種偶聯物溶液’其可經由如請求項14至16中任一項 方法獲得或包含如請求項17之偶聯物。 19. 一種如請求項1至13中任一項之式⑴衍生物的用途， 用於製備下式之二聚體在M之對位共價附接之結合劑 或 法 之 其
    20. 如請求項19之用途’其中該結合劑係抗體。 21. 如請求項19或20之用途，其中該二聚體具有下式：
    22.如請求項1至4及13中任一項之化合物，其用作抗癌劑 23_如請求項17之偶聯物，其用作抗癌劑。 24_如請求項18之偶聯物溶液，其用作抗癌劑。 157426.doc -13· 201208689 25. —種式P2之化合物， Q-(CH2CH20)k-CH2CH2G
    其中： L、L2、Q、k、ALK、ALK'及G係如請求項1至9中任 一項所定義； LG及LGW戈表離去基團； X'代表 RCG1。 26. —種如請求項25之化合物之用途，其在如請求項1至13 中任一項之化合物之製備中用作中間體化合物。 27. —種結合劑，在如請求項1至13中任一項之化合物與該 結合劑反應後，下式之二聚體在Μ之對位共價附接至該 結合劑：
    28. 如請求項27之結合劑，其對位於癌細胞或與腫瘤相關之 基質細胞上的抗原或抗原之群組具有親和性。 29. 如請求項27或28之結合劑，其係抗體，較佳單株抗體。 157426.doc -14-
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