TW201219041A

TW201219041A - SiRNA targeting VEGFA and methods for treatment in vivo

Info

Publication number: TW201219041A
Application number: TW100126492A
Authority: TW
Inventors: Anja Smith; Angela Reynolds; Jon Chatterton; Xinyu Zhang
Original assignee: Dharmacon Inc; Alcon Res Ltd
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-27
Publication date: 2012-05-16
Also published as: WO2012015775A3; AR082411A1; ZA201300531B; RU2013102545A; AU2011282902B2; WO2012015775A2; US9150862B2; US8546349B2; MX2013000986A; AU2011282902A1; KR20130095737A; PH12013500187A1; JP2013539456A; UY33533A; US20140031414A1; EP2598639A2; CL2013000237A1; EP2598639A4; CA2804847A1; CN103068981A

Description

201219041 六、發明說明：相關申請案之交互參考本申請案主張2010年7月28日提出申請之 61/368,385美國臨時申請案之申請曰之利益，其全部現内容併入本文以資參考。示【發明所屬之技術領域】發明領域本發明係有關使用siRNA之用途。【先前技術】發明背景血管新生係涉及新血管生長之生理過程。此過程之要部分為產生血管内皮生長因子（“Vegf，，

“VEGFA”) ’其係由細胞產生之化學訊號，能刺激新血‘ 之生長。 S 當細胞分泌之VEGFA結合於—或多個同源受體(例如跨膜蛋白激酶 VEGFR1/FLT-1 及 VEGFR2/FLk_1/Kdr) 時，即啟動前述過程。VEGFA結合於跨膜蛋白質後，啟動訊號串級，最終導致新血管形成。血官新生係正常及活身體發育與調控之一部分。可惜’其亦與一些不為所欲之症狀，例如視網膜病變、牛皮癖、癌症、滲出型年齡相關性黃斑部病變(ARMD)、及類風澄性關節炎相關。於彼等以及其他狀況下，存在高量 VEGFA並伴隨血管形成增加。因此，#界正在探索針對控制VEGFA生產之治療策略之開發。 3 201219041 【發明内容】發明概述本發明係有關抑制VEGFA表現之組成物及方法，以及有關與過度表現VEGFA相關症狀之治療。因此，本發明提供用於引入完全或部分抑制VEGFA生產之siRNA之套組、siRNAs及方法。根據第一具體貫例，本發明提供抑制VEGFA表現之方法，该方法包括體内投與生物體(例如人類）siRNA，其中siRNA包含選自下述組成組群之序列：SEQIDN〇s: 2、 4、6、8、10、12、14、16、18、2〇、22、24、26、28、 44、46、48、50、52、54、 30、32、34、36、38、40、42、 74、76、78、80、 56、58、60、62、64、66、68、70、72、 82、84、86 與 88。根據第—具體實例，本發明提供抑制VEGFA表現之方^ ;該方法包括體外投與Si職，其中siRNA包含選自下述組成的組群之序列：SEQidn〇s: 12、14、16、18、20、？9 w 1 22、24、26、28、30、32、34、36、 38、40、42、44、/1。m ,, 、48、50、52、54、56、58、60、62、 64、66、68、70、79、π 2 74、76、78、80、82、84、86 盥 88 0 /、 χ -具體實例’本發明提供抑制vegfa表現根據前二具體實狀任一者投: ^ C及υ#：ίΓΚΝΑ具有—或多個Τ述修飾：意義股内j 有核錢以及意義股前兩個5,核皆酸上之2，_〇_: 201219041 ς ^如’ 2 基)修飾、反義股内所有c及〇核魏修飾及反義股位置i料酸之5’魏化。於若干 ^體貫例中，siRNA意義股内之所有c及U核苦酸上具 -〇-烷基修飾，及於反義股上具有至少一個2，_0_ 3。於若干具體實例中，siRNA具有—或多個i至“ =酸之突出端（—g)。於若干具體實例中，所有上，飾均存在’且只有彼等修#存在，因此，所有〇及A 核苷酸，位於意義股位置i及2者除外，均具有21 _ 〇 Η基。根據第四具體實例，本發明提供抑制vegfa表現之方法；該方法包括根據前三個具體實例之任一者投與 iRNA，其中siRNA具一或多個下述修飾：以C5連接子 (linker)連接之膽固醇基團，及於意義股6、13及19 一或多個位置上之誤配，其中意義股為19個核苷酸長，反義股亦為19個核魏長(不包含突出端）。意義股上之位置係，意，股之5,端起算’其中意義股之第一個5，核倾被鑑定為最5’之核苷酸，其與反義股上之核苷酸鹼基配對。因此，經由此界定，5’意義股突出端之核苷酸不包含於計數架構中。於若干彼等具體實例中，5,突出端不存在。於若干具體實例中，存在一或兩個丨至6個鹼基之3，突出端，或無突出端。於若干具體實例中，除了位置6、13及19 外’雙鏈區（duplex region)内有100%互補性。根據第五具體實例，本發明提供選自下述組成的組群之至少兩個 siRNA 之集合(po〇l) : SEQ IDNOs: 2、4、6、 8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 5 201219041 34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、 60、62、64、66、68、7〇、72、74、76、78、80、82、84、 86 與 88。根據第六具體實例，本發明提供一種醫藥組成物，其包含治療有效量之一或多種本文揭示之siRNA。根據第七具體實例，本發明提供一種醫藥組成物，其包含治療有效量之siRNA，其中siRNa由下述組成：（a) i9 至36個驗基長之反義股’其包含選自下述組成的組群之序列：SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、4〇、42、料、 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、7〇、 72、74、76、78、80、82、84、86 與 88 ;及(b) 19 至％個鹼基長之意義股，其中反義股與意義股形成17至3〇個鹼基對之雙鏈區，於雙鏈區内存在至少75%互補性。若 siRNA之雙鏈區長度大於19個鹼基對，則附加（意義及反義）序列係加至反義股之3’端及意義股之5，端。經由使用本文所述方法、siRNA及醫藥組成物，可有效地靜默VEGFA。詳細說明界定除非另行說明或文意明顯，否則下述術語及詞組具有下文提供之含義：、〃 2’修飾 2’修飾係指以另一基團例如_〇_曱基、乙基、_〇_ 201219041 正丙基、-〇-異丙基等之-〇-燒基團，或再一基團例如氟基，取代通常位於核糖核苷酸内核糖位置2,之經基。於若干具體實例中’出現-0-烷基修飾之處，相同_〇_炫基團出現於所有0-烧基修飾之核皆酸。其他類型之2,修佛為鹵素基團，例如2’氟基或2,溴基。

“阿塞爾（Accell)” siRNA “阿塞爾”一詞係指較佳之siRNA結構，其包含：19 個核苷酸長之意義股’其具有：（1)位置1及2上(從5，端算起)之2’-〇-甲基修飾、（2)所有C及U上之2，_〇_甲基修飾及(3)經由C5連接子接合於3’端之膽固醇；2丨個核苷酸長之反義股’其具有5,磷酸修飾，於所有C&U上含2，F 修飾’與意義股配對時形成2核苷酸突出端，及於⑴突出端之2核賊間及⑵雙舰之最3,核聽與突出端之第 -個核純間含硫代磷酸修飾。此外’阿塞爾分子於位置 6、13及19 (從意義股之5’端算起)含有誤配。於所有情形下’彼等誤配係由替韻基取代意義核賊而產生。以此反義股保留與動子之完整互補性。關於額外詳、、、田資料，請參閱US2_/02〇9626Al，其揭示文以資參考。互補 “互補”-詞係指聚核㈣彼此形成驗基對之能力。驗基對通常岐向平行聚核聽股之㈣酸單元間之氫鍵形成。互補聚核苷酸股可以瓦生-克立克（伽跡Crick)方式(例如A對T、A對U、C對G) ’或以容許形成雙鏈之 201219041 任何其他方式形成鹼基對。如熟習此項技藝人士所知，於使用RNA㈣DNA時，尿射而非胸腺喷咬被認為係與腺核苷酸互補之鹼基。然而，於本發明文中以U表示時，除非另行說明，否則隱含其取代丁之能力。完美互補性或100%互補性係指一聚核苷酸股之每一核苦酸單元可與另-聚核㈣股之核#酸單元氫鍵結合之情況。小於完美互補性係指二股之若干，而非所有，核苦酉文單元可彼此虱鍵結合之情況。例如，就兩個2〇_聚體 biers)而言，若各股僅有兩個鹼基對可彼此氫鍵結合，則該聚核苷酸股展現10%互補性。於相同實例中，若各股有 18個驗基對可彼此氫鍵結合，則該聚核苷酸股展現9〇% 互補性。於若干具體實例中，雙鏈區内存在至少75。/。互補 f·生、至少80%互補性、至少90%互補性、至少95%互補性或100%互補性。接合基團揭示内容之接合基團（亦簡稱”接合物”)為直接或間接連接於核苷酸之基團，且可以各種方式靶入細胞中。例如，接合基團本質上可為脂質。因此，脂質係接合基團可包括陽離子性脂質、中性脂質、神經脂質、及脂肪酸包括硬脂酸、油酸、反油酸、亞麻油酸、反亞麻油酸、次亞麻油酸、與肉豆蔻酸。替代地，接合基團本質上可為蛋白質，包括為膜轉位(例如TAT、穿透汀(penetratin)、MAP)或陽離子性(例如聚(lys)、聚(arg)、聚(his)、聚(lys/arg/his)、或魚精蛋白）之胜肽。 201219041 替代地，接合基團可為，例如，靶向特定受體或本身能插入細胞膜中並被内吞途徑吸收之小分子。因此，以金剛烷、聚芳族烴(例如萘、菲、或芘）、大環物、類固醇^ 或其他化學支架為基礎之小分子均為本揭示内容中具力之接合物。 … 於又另一選擇中，接合基團可以陽離子性聚合物例如聚乙烯亞胺、樹枝狀聚合物、聚(烷基比啶鏘）鹽、或陽離子性白蛋白為基礎。於若干情形下，接合基團為受體之配體，或進而與受體相關之關聯分子；此類別包括膽汁酸、小分子藥物配體、維生素、適體、碳水化合物、胜肽（包括惟不限於激素、蛋白質、蛋白質片段、抗體或抗體片段）、病毒蛋白質（例如，殻體）、毒素(例如，細菌毒素）等；亦包括本質上為類固醇之接合物例如膽固醇、二氫膽固醇、膽烷酸、豆固醇、孕烯醇酮、黃體固酮、皮質酮、搭固_、睪固酮、雌二醇、麥角固醇等。本揭示内容之較佳接合基團為膽固醇 (CHOL)、二氫膽固醇（CHLN)、膽燒酸(chLA)、豆固醇 (STIG)、與麥角固醇(ERGO)。於又另一具體實例中’係修飾乾向特定受體之分子，以排除經接合之siRNA可能喪失於其他來源。舉例而言，將接合膽固醇之siRNA置於正常血清中時，顯著部分之此物質會與血清中之白蛋白及/或其他蛋白質結合，使siRNA 無法例如與LDLs相互作用。基於此因，可以針對持續與其忍指標乾(例如，LDL)結合或聯結，惟與祚意指結合夥伴(例如，血清白蛋白）具有較小親和力之方式修飾本揭示 201219041 内容之接合基團。雙鏈區 …雙一詞係指以瓦生-克立克鹼基配對或容許於二二η上互補之聚核苦酸間形成穩定雙键之任何其酸之區域。之—互補或貫質上互補之聚核脊 π-25雙個之實例包括料限於_個驗基對、個驗美對土 Μ I7·23個驗基對、18-30個驗基對、18~25 基對、及⑽個驗It 該範圍之互補性程度予以界1 驗基對長义，《及因此’由兩個分開之核魏股，反義股及音 = 重要的是要注意’各股於5，端或者％可： 3有:又鏈部分之核苦酸及不屬雙鏈部分之核苦叱俾肢反義股上與縣互叙所有 = 刀雙鍵區，因此於意義股上有互補之核㈣。^為部 =爾A，俾使反義股於其3，端及/或其$ ，思義股上雖無互補核㈣，惟於躲上具有互二有於反義版内核苦酸持續延伸部分之核苷酸。峻< 舉例而言，意義股可含19個核魏及反義個核苦酸。該反義股除了最3,兩個核普酸以外 ^ 21 酸可與該意義股之19個核芽酸互補，而反義股核苷苦酸整體延伸可與標乾之21個核苦酸延伸互補1個核反義股兩個最3’之核賴可經觸俾使不代地， 201219041 補，或隨機選擇或為便於處理，俾使其一或二者和與反義股其他19個核苷酸互補之核苷酸相鄰之標靶之二核苷酸互補或不互補。附加地’於不同具體實例中，雙鏈區内可能有例如1 個誤配、2個誤配、3個誤配、4個誤配、或5個誤配。誤配 “誤配”一詞包括於意義股之核苷酸與反義股之核苷酸間不發生瓦生-克立克鹼基配對之情況。誤配之實例包括惟不限於A對上G、C對上Α、ϋ對上C、IJ對上G、 A對上A、G對上G、C對上C、及ϋ對上U。連接子連接子為連接二或多個其他基團之基團。雖不希望被界定或慣例限制，惟於本申請案中連接子長度係由計算連結接合基團與連接子之原子，及與連接子連結之寡核苷酸終端碟酸基團之氧原子（由其將連接子連接於寡核苷酸)間，知距離所示原子數說明。例如，於接合基團經由胺基甲 =鍵結連接於連接子之具體實例中，連接子之長度係敘述離胺基甲酸鍵結之氮原子與磷酸鍵結之氧原子間最短距後=原子數。於出現環結構情形下，輯算代表最短路 a之％繞該環之原子為佳。接子I於本揭示内容之組成物及方法中使用之接合物-連、、’。構之非限制實例包括惟不限於以β•胺基二 I胺基_1，2-二醇類、羥基脯胺醇類、ω_胺基_烷醇〜乙醇胺類、β_羥基_u_二醇類、β_羥基_丨，2_二醇類、、^ 11 201219041 、β猶办二醇類、敌基戈醇類、官能基化基韻類、①· ，若=實:S二之位置，亦提供連接於支撐團連接基:=== 學上有所區隔:其===固體娜期間’在化習此項技®者壯之方法祕，根據一般熟中，以可移除之俘1其不於。成养核苷酸之第一步驟色團，可用以坪估遠土接1以保護。較佳為，此保護基為發為，#且廟°連接於固體支標物之接合基團；最佳 (晴基團係選自三笨甲基㈤、-甲氧三苯甲基 (TMT ^—甲-氧二苯甲基_切與三曱氧三苯甲基技蓺奏$ &基’較佳為二級經基，根據一般熟習此項之方法，以可與固體合成支撐物上之官能基共二之g ▲基化之繫鏈予以衍生化。較佳之繫鍵為，舉 =言’二賴例如琥轉、戊二酸、對酜酸、草酸、二，、與氫㈣’ 〇’_二乙酸。該繫鏈之—饋官能基與，土反應’以提供使用驗性試劑（氫氧化、破酸鹽或胺類）巧解之，鍵n_官能基通常經*與支樓物上之胺二能基形成醯胺鍵結而與合成切物反應。連接子亦可 ^寡核倾接合物上料其他符合f求之性f :增進之水 4 H、接合基團與寡核苦醆間最適之分離距離、柔勒性（或

12 201219041 缺乏）、特定位向、分支、及其他。較佳為，連接子與接合基團間之化學鍵為胺基甲酸鍵結；然而，替代之化學性亦隸屬本揭示内容之範圍内。與接合基團形成化學鍵之連接子上之官能基實例包括，惟不限於，輕基、胺、叛酸、缓酸齒化物、緩酸活性酯、叛基、氯羰基、咪唑羰基、硫醇、順丁烯二醯亞胺、齒烧基、磺醯基、烯丙基與炔丙基。連接子與接合物間形成之化學鍵之實例包括，惟不限於，以胺基甲酸類、醚類、酯類、醯胺類、二硫化物、硫醚類、碟酸二酯類、硫代鱗酸類、二硫代磷酸類、％醯胺類、項酸類、礙類、亞硪類、腺類、肼化物、肟、光不穩定鍵結、c_c鍵形成基團例如 Diels-Alder環加合配對或環閉合置換配對與Michael反應配對為基礎者。一般而言，接合基團具有天然或化學安置之S此基，然後以經選擇以有效且穩定地與接合基團上之官能基反應之官能基合成連接子。亦特別考慮使用具有相同長度，惟能與兩個或兩個以上接合物結合之連接子。於另-具體實例中，連接子可為核苦衍生物；此核苦可為’例如，核糖㈣、2，_去氧核糖㈣、或2，'經修飾之-2’-去氧核糖核’例如2，_〇_甲基或2,_氟基；亦可為，例如」阿拉伯刪或2，_經修飾之阿拉伯嶋。使用此項技藝者悉知之方法’ Μ及啊料可於驗基上特定位置經修飾以提供連接接合基團用之連接子及官能基。舉例而言’射核苦例如尿轴料，可使用乙 13 201219041 酸汞、鈀觸媒、及烯丙基試劑例如烯丙胺、烤丙醇、或丙烯酸，使尿嘧啶或胞嘧啶鹼基之位置5經修飾。替代地， 5-姨嘧咬類可以飽觸媒及炔丙基試劑例如炔丙胺、块丙醇或炔丙酸，使位置5經修飾。替代地，尿苦可經由以三。坐或磺醯氯活化’接著與二胺、胺基醇或胺基酸反應，使位置4經修飾。胞苷同樣地可利用以亞硫酸氫鹽處理，接著與二胺、胺基醇或胺基酸反應’使位置4經修飾。嗓B令类貝同樣地可使用類似之反應序列類型，使位置7、8或9經修飾。於較佳具體實例中，連接子係約3至約9個原子長。因此’連接子可為3、4、5、6、7、8、或9個原子長。較佳為’連接子係5、6、7或8個原子長。更佳為，連接子係5或8個原子長。最佳為連接子係直鏈C5連接子，亦即，使接合基團與連接子結合之原子，及與連接子連結之寡核苷酸終端磷酸基團之氧原子（由其將連接子連接^寡核苷酸）間，有5個碳原子。因此，於接合基團經由胺義曱酸鍵結與C5連接子結合處，胺基曱酸鍵結之氮原子與磷酸鍵結之氧原子間，有5個碳原子。一於一較佳具體實例中，接合基團為膽固醇，連接子為經由胺基甲酸基團連接於膽固醇之C5連接子（―種5碳連接子）’因而形成Chol-C5接合物-連接子；於經由磷^二酯鍵結連接於雙鏈之意義及/或反義寡核苷酸5，及/或3，端時’所得接合物-連接子-寡核苷酸具有下述結構： 201219041

於另一較佳具體實例中，接合基團為膽固醇，連接子為經由胺基曱酸基團連接於膽固醇之C3連接子，因而形成Chol-C3接合物·連接子；於經由磷酸二酯鍵結連接於意義及/或反義寡核苷酸5’及/或3’端時，所得接合物-連接子-寡核苷酸具有下述結構：

於另一較佳具體實例中，接合基團為膽固醇，連接子為經由胺基曱酸基團連接於膽固醇之C8連接子（一種8碳連接子），因而形成Chol-C3接合物-連接子；於經由礙酸二酯鍵結連接於意義及/或反義寡核苷酸5’及/或3'端時，所得接合物-連接子-寡核苷酸具有下述結構：

15 201219041 於另一較佳具體實例中，接合基團為膽固醇，連接子為經由胺基甲酸基團連接於膽固醇之PRO連接子（一種4 碳連接子），因而形成Chol-PRO接合物-連接子。於另一較佳具體實例中，接合基團為膽固醇，連接子為經由胺基曱酸基團連接於膽固醇之PIP連接子（一種6 碳連接子）’因而形成Chol-PIP接合物_連接子。於經由磷酸二酯鍵結連接於意義及/或反義寡核苷酸5，及/或3，端時，所得接合物·連接子-寡核苷酸具有下述結構：於另一較佳具體實例中，接合基團為膽固醇，連接子為經由胺基曱酸基團連接於膽固醇之C6_hp (亦稱為

”HP6")連接子（一種9碳連接子），因而形成Ch〇K：6-HP 接合物-連接子。於經由磷酸二酯鍵結連接於意義及/或反義寡核苷酸5,及/或3,端時，所得接合物_連接寡核苷酸具有下述結槿：人

Ο-p»AA.〇lig〇

OH 核苦酸除非另行指明m練”―詞係指核糖核苦酸 =去氧核糖㈣酸或其修飾形式，以及其類似物。核普酸 I括嘌呤類，例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤、及其衍生物與類似物’以及喊啶類，例如胞嘧啶、尿^啶、胸S嘴 201219041 啶、及其衍生物與類似物。於若干具體實例中，所有核苷酸係選自經修飾或未經修飾之a、cG、或u之組群。核苷酸類似物包括於鹼基、糖及/或磷酸鹽之化學結構具修飾之核㈣’包括惟不限於，姐位置5之修飾、嗓呤位置8之修飾、胞細環以之歸、及5_漠尿較之取代；及糖位置2,之修飾，包括惟减於，糖經修飾之核糖核苷酸，其中2，_0H被例如h、〇r、r、齒基、SH、 SR、丽2、NHR、NR:、或CN (其中R為烧基)之基團置換。核㈣類似物亦意欲包括|有驗基例如肌苦、辦苦 (qU_me)、黃嘌呤’糖例如2'曱基核糖，非天然磷酸二醋鍵結例如甲基膦_、硫代磷•及胜肽之核苦酸。經㈣讀祕指已被4乡個料或㈣之置換或加入經修飾之核苷酸鹼基例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧咬、胸腺做、尿射、黃料、崎、㈣苷。可包含有關驗基基團經修狀核㈣之修饰_之括惟不限於，單獨或組合之縣化、自化、硫醇化、胺化、醯胺化、或乙酿化之驗基。更具體之實例包括，例如，5· 丙炔基尿苦、5-丙炔基胞苦、卜甲基腺嗓吟、6•甲基鳥嗓 ^、_，-二曱基腺料、2_丙基腺心、2-丙基鳥嗓吟、 2_胺基腺料、丨_甲基綺、3·曱基尿苷、5·甲基胞苷、 5_曱基尿*、及於位置5經修飾之其他㈣酸，5_(2_胺基）丙基尿普、5-齒基胞苷、5·函基尿替、4_乙酿基胞皆、^ 曱基腺㈣、2·甲基腺核苷、3·曱基胞芽、卜甲基料、 2·甲基鳥料、7_甲基鳥核m甲基鳥_、5-甲胺 17 201219041 基乙基尿皆、5·甲氧基尿苦、脱氮㈣酸例如7脱氮腺核皆、6-偶氮尿苦、6•偶氮胞苦、卜偶氮胸普、5_甲基冬硫基尿苷、其他硫代鹼基例如2_硫代尿苷與4_硫代尿苷及 2·硫代胞_、二氫尿*、假尿苦、辮普、古料、萘基及 n代m ’何〇_及N•絲化之料與較例如勝甲基腺核#、5·甲It甲基尿普、尿芽5_氧乙酸、吼咬·4· 綱、°比。^2""晒、苯基及經修飾之苯基例如胺基苯酴或2,4,6-三甲氧苯、具G_鉗核¥酸作用之經修飾之胞做、8_經取代之腺* 7與鳥嗓吟、5_經取代之尿喷咬與胸腺癌咬、。丫疋、緩絲絲料酸、舰基舰基核苦酸、與燒羰二烧土化，核#酸。經修傅之核賊亦包括有關糖基團經 >飾之彼等核苷酸，以及具有不是核糖基之糖或其類似物苷酸例如’糖基團可為，或以甘露糖、阿拉伯糖、，比南糖、半礼口比喃糖、4，·硫代核糖、及糖或碳環為基礎者。长奴〜奴包括此項技藝已知為一般驗其硝基•或水㈣：f:惟不限於3粉叫、5. 取代核糖基㈣胺基種類進兴广地’核苷醆一詞亦包括具有可偵測標籤之彼箸 =舉例而言如放射性或螢光基團質量標籤。％核苷酸之製藥上可接受之載劑製藥上可接受之載劑，’一詞意指供傳送本揭示 201219041 之組成物至生物體例如動物或人類之製藥上可接受之鹽、溶劑、懸浮劑或媒介物。載劑可為液體、半固體^固體，且常與稀釋劑、賦形劑、或鹽同義地使用。‘‘製藥上可接受’’一詞意指所揭示之任何組成、賦形劑、載劑、稀釋劑或成分係適於人類及/或動物使用而無不適之^害副作用（例如毒性、隔離及過敏反應）之具相稱合理利益比者。參閱 Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition

Osol, A. Ed. (1980)。 ’ 核糖核苷酸與核糖核酸 “核糖核苷酸”與“核糖核酸”(RNA)等詞係指包含至少一個核糖核苷酸單元之經修飾或未經修飾之核苷酸或聚核苷酸。核糖核苷酸單元包含連接於核糖基團位置2，之羥，(該核糖基團於位置1，以N_糖苷鍵結連接含氮鹼基），^ 容許鍵結於另一核苷酸或排除鍵結之基團。意義股/反義股 “意義股” 一詞係指包含與例如信使RNA或DNA序列之標靶核酸序列完全或部分相同之聚核苷酸。“反義股，，一 =係指包含與例如信使RNA或DNA序列之標乾核酸序列完全或部分互補之聚核苷酸。 •〜，、、丨貝q π代内序列時，除非另行指明，則係為意義股，及隱含互補之反義股。於雙鏈s_a(由 :分離股形成)中，-股可能為意義股，另一股可能為反義股。若突出端存在，則“音義 ‘·、、出^之核魏序列部分。同樣地，“反意義區，，—詞係指 201219041 反義股而非突出端區之核苷酸序列部分°若siRNA為 shRNA，則非二分離股，“意義區”係具有與標靶序列有完全或部分相同序列之部分雙鏈區’“反意義區”係具有與標靶序列及意義區完全或部分互補之核皆酸序列。意義股及反義股長度之實例為19-36個鹼基、19-30 個鹼基、19-25個鹼基及19-23個鹼基；彼等股之長度包括可能之突出端區。

siRNA “siRNA”一詞係指誘發RNA干優(RNAi)途徑之小的抑制RNA雙鏈。於本文中使用之彼等分子長度可不同（通常為17-30個鹼基對加上突出端），及含有與反義股中其標乾mRNA不同程度之互補性。若干而非全部siRNA於意義股及/或反義股之5,或3,端上具有無配對之突出端鹼基。“siRNA”一詞包括二分離股之雙鏈，以及除非另行指明’則包括可形成包含雙鏈區之髮夾構造之單股（稱為 shRNA) ° “Stable “siStable” 一詞係指與特定雙键相關之化學修飾模式。具體而言，siStable siRNA包含下述結構：意義股為 19個核苷酸長且具有（1)位置丨及2上(從5,端算起）之 2’·〇-曱基修飾，及(2)所有C及u上之2’-〇-曱基修飾；反義股為21個核苷酸長，具有5，磷酸修飾，於所有c及 11上含2’F修飾，與意義股配對時形成2核苷酸突出端，及於（1)突出端之2核苷酸間及(2)雙鏈區之最3,核苷酸與 201219041 突出端之第一個核苷酸間含硫代磷酸修飾。相關細節，參閱 US 2007/0269889 A1。標靶 “標靶’’一詞於整個文件中以各種不同形式使用，係由

其使用時之上下文所界定。“標靶mRNA”係指特定siRNA

可針對之信使RNA。“標靶序列，，及“標靶部位，，係指mRNA 内’ siRNA之意義股對其顯示不同程度之同一性，反義股展現不同程度之互補性之序列。“siRNA標一詞可意指 siRNA所針對之基因、mRNA、或蛋白質。同樣地，“標靶靜默”可意指基因、或對應之mRNA或蛋白質之狀態。治療有效量 " 丄碼VEGFA-特異性siRNA序列之組成物之“治療有效量（亦即有效劑量），為抑制至少1〇〇/〇由標靶 f因編碼之纽表現之量。於特定具體實例巾，較高之抑 ::分比’例如’至少15、至少2〇、至少3〇、至少4〇、熟ϊΓ鼓f少75、至少85、至少9〇%或更高可能較佳。需之判:B t將察知’特定因素可影f有效地治療對象所前之包括惟不限於疾病或疾患之嚴重性、先 -療、泫對象之一般健康及/或年齡、及目 =療=二成物，治ΐ有效量治療對象時可包括單暫表=療。於计_下，可能需要siRNA之短

siRNA 以分析表現對象適當劑1之用於誘發表現之物質組成物之適當劑量取^於有關欲難表現或活性之 201219041 分子（編碼s i RN A之序列）之效 :=1如人人類或其他== 紅毛觀、人猿、猴子等，或狗、描 ^ = :，：調整'咬多嶋多肽之表現或活性。醫平生可以例如先可開列相對低劑量之處方’隨後增加劑旦亩到獲得適當反應。此外，Μ里’直量標準係取纽各種m任何蚊對象之特殊劑該對象之年齡、體=因二5所用特^化合物之活性，間，投與路徑，分m康、性別、及飲食，投與時或活性之减。'任何藥·合，及欲調整表現 VEGFA-特異性 VEGFA之升高表現相治療有效量係用於治療與惟不限於，牛皮癬、癌4 =、疾病、或疾患’包括’ 形成、異常靖斤生:視網】炎、眼睛新血管營渗漏、視網膜水腫、糖 / ' 、丙寺別是增殖性糖尿病視網膜病變）、糖尿病性黃斑部水腫、滲出型年齡 )= 膜缺血相狀後遺症、及目找觸血管形成。見、，周較佳具體實例 j參照較佳讀實例糾本發明。麟具體實例之呈現係為了有助於瞭解本發明而不擬，及決不應對本發明構成於閱讀本揭示内容後，為—般熟f技藝人士顯見之厂口口 '修飾及對等物均隸屬本發明之精神與範内0 再者，本揭不内容並非用於執行RNA干擾之組成物或方法之人門。熟習此項技藝人士已知之基本概念並未詳 201219041 細提及。根據第一具體實例，本發明提供於體内降低VEGFA 表現之方法；該方法包括投與生物體siRNA，其中siRNA 包含選自 SEQ ID NOs: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、 72、74、76、78、80、82、84、86 與 88 之序列。對象可為擁有RNAi路徑之任何生物體，包括，惟不限於哺乳動物、鳥類或爬蟲類。哺乳動物之實例包括，惟不限於人類、猴子、人猿、黑猩猩、狗、貓、小鼠、及大鼠。此外，由意義股及反義股形成之雙鏈可包含至少一個突出端，每一突出端包含至少一個核苷酸。該突出端可位於，例如：意義股之5'端；意義股之3'端；意義股之5'及3'端；反義股之5'端；反義股之3'端；反義股之5'及3'端；意義股之5'端及反義股之5’端；或意義股之3’端及反義股之3'端。於若干具體實例中，突出端長度為6個或6個以下核苷酸，於較佳具體實例中，突出端出現於反義股之3'端， 23 201219041 亦即連接於反義區最3,之核苷酸。更佳為，反義股3,端上大出4之長度為2個核苷酸。突出端中核苷酸之驗基可以任意方式進行選擇，亦即突出端核苷酸可能會或不會與標乾mRNA驗基配對。為方便及簡單計，二核苷酸突出端通常為UU突出端（惟亦可考慮aa、GG、CC、AC、CA、 AG、GA、GC、與CG二核芽酸突出端，及其他，參閱

Vermeulen 以 α/. (2005) RNA 11 (5): 674-682)。較佳為，突出端之核苷酸間，以及雙鏈之終端核苷酸與突出端之第一個核苷酸間之鍵結係硫代磷酸鍵結。於一特佳具體實例中，反義股包含位於反義股3,端之UU突出端，其以硫代磷酸鍵結連接3,端U於第二個U核苷酸，及以硫代磷酸鍵結連接第二個U核苷酸於反義股之下一個核苦酸方向）。於若干具體實例中’意義股之5’端及/或意義股之3, 端及/或反義股之5,端及/或反義股之3’端包含終端碟酸。較佳為，終端磷酸位於反義股之5’端。於若干具體實例中，不存在經修飾之核苷酸（亦即，每一核糖之位置2,具ΟΗ基團）。於其他具體實例中，有一個或一個以上之化學修飾。例如，可能存在下述修飾之一或多個或全部： (Ό意義股位置1與2及所有C核苷酸，與所有υ 核苷酸之2，-〇-烷基修飾（例如’ 0-甲基、〇_乙基、0-正丙基、0-異丙基等）； (2)接合基團，其中該接合基團包含、實質上由、或 24 201219041 係由連接子與例如膽固醇基團之接合基團構成，且該連接子軸於㈣股最後-個核苷酸之位置3’ ； (3) 反義麟有CM核㈣之2，氟基料或於反義股上之至少一個2，·〇_烷基修飾； (4) 於反義股第-個核替酸位置5，之魏化及於若干具體實例中所有其他核芽酸可 (5) —或多個突出端；及 ⑹與各股上任-突出端之㈣酸相關之硫代磷酸修飾。右干，、體實例中於犬出端存在處之…可能出現2，-〇修錦，反義股上之= 現2’i基修飾。於其他具體實例中，2，僅出現於雙鏈區之核苷酸内。 -氟基修飾能期望每—股所有前述之2，^外’若干具體實例中，可括或者任何突丨端區+者）修飾現’則包可能期望每一或任一股上少:而： = 飾。當少於所有αυ經修^有CA U含有前述修總數為，舉例而言，絕信可選擇C及U修飾之或3至6個經修飾，或^例如1至8個或2至7個例如，除了 i個之外、盼了例如就未經修飾之個數界定，了 4個之外、除了 5個:2個之外、除了 3個之外、除外、除了 8個之外之所有、除了 6個之外、除了 7個之例中，可能以-或多魅—或U經修飾。於其他具體實将疋位置不進行2,修飾較佳，例 25 201219041 3、4、5、6、7 l〇、11、12、13 如，於1、2 14、15、16、17、18 及若存在之 19、2〇、2卜 22、23 24、25、26、27、28、29、或3G之-或多個位置。一般熟習此項技藝人士將察知，較佳為各股含有至少一個c或 U核苷酸。附加地，若干具體實例中，於反義股上，可能以 0-30 或 0-25 或 0-23 或 0-19 或 1_30 或 1-25 或 123 或 1-19 或 3-30 或 3-25 或 3-23 或 3_19 或 5_30 或 5_25 或 5j3 或 5-19 或 7-30 或 7-25 或 7-23 或 7-19 或 10-30 或 ΐ〇·25 或10-23或10-19或8_15或1(Μ2個核皆酸上具有2，氣夷基團較佳。經修飾之㈣酸可全為射、全為。票。令或為i 咬與嗓呤之組合。於轩具體實财，反義股上所有核皆酸具有2’氟基且此股可具有至少—個射、至少一個々 =、全為㈣、全為討或錢與料之組合。進於 =干具體實例中’任―突出端核㈣(若存在）上有敗 ^。同S他·^體實例中，突出端核普酸不包括彼等修 ° ，右干具體實例中，於意義股上，可能g 〇 3n 或㈣或7-i 19或㈣或Μ5或5_23或Μ 或_或81^或7_19或㈣或1〇·25或1㈣如，Μ·甲Α ^ 1G·12個核苷酸上具有2，办烧基(例嗓呤或為經修飾之核苷酸可全為啊、全為上所有核料ιΓΓ合Γ奸具物种，意義股啶、至小一伽/、有0_烷基且此股可具有至少一個嘧個嘌呤、全為嘧啶、全為嘌呤或嘧啶與嘌呤之 ^ ； 26 201219041 組合。進一步於若干具體實例中，任一突出端核苷酸(若存在）上有2’-0-烷基，而於其他具體實例中，突出端核苷酸不包括彼等修飾。於反義股上具有至少一個2’-0-烷基修飾之具體實例中，可能有例如，1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、 1至3、或1至2個修飾。其他具體實例中，可能有正好卜 2、3、4、5、6、7、8、9、或10個此類修飾。彼等至少一個修飾可例如位於3’反義突出端區及/或位於雙鏈區内從反義股5’端算起之該股之1至8、1至7、1至6、1至 5、1至4、1至3、或1至2之1或多個位置。舉非限制實例而言，於反義股之1、2、3、4、5、6、 7或8任何位置可具有單一 2’-0-烷基修飾（例如，甲基）。替代地，UU突出端中兩個核苷酸之一或彼等二核苷酸可具有單一 2’-0-烷基修飾。2’-0-烷基修飾之其他組合包括惟不限於位置1與2、1與3、1與4、1與5、1與6、1 與7、1與8、2與3、2與4、2與5、2與6、2與7、2 與8、3與4、3與5、3與6、3與7、3與8、4與5、4 與6、4與7、4與8、5與6、5與7、5與8、6與7、6 與8、7與8、1與UU突出端中兩個核苷酸之一或彼等二核苷酸、2與UU突出端中兩個核苷酸之一或彼等二核苷酸、3與UU突出端中兩個核苷酸之一或彼等二核苷酸、4 與UU突出端中兩個核苷酸之一或彼等二核苷酸、5與UU 突出端中兩個核苷酸之一或彼等二核苷酸、6與UU突出端中兩個核苷酸之一或彼等二核苷酸、7與UU突出端中 27 201219041 :===::酸、或8與再者，於若干具體實例中，反義股上出現至少_個 2 _〇-燒基修飾’其位置之選擇係使得僅有A或G驗美人有該修飾，㈣使得所有C及U驗基魏基修飾。ς: 他具體實例中’-或多個C或U驗基含有2，办絲修飾。於彼等情形下’可設計siRNA，俾使未具2，·㈣基修飾之任何C及U鹼基具有2,氟基修飾。於若干具體實例中，siRNA含有17_3〇個驗基對長、或18-30個鹼基對長、或19-30個鹼基對長、或19_23個驗基對長”戈19-21個驗基對長、或18_23個驗基對長之雙鏈區。當雙鏈區為17個鹼基對長，並提供19聚體^義序列時，反義19聚體3,端之二鹼基可能形成突出端。於雙鏈區内可能有100%互補性或小於1〇〇%互補性’例如’至少80%互補性、至少85%互補性、至少9〇% 互補性、或至少95❶/〇互補性。於一具體實例中，除了於意" 義股位置6或於位置13、或於位置19、或於位置6與13 或於位置13與19或位置6與19、或於位置6、13與19 之外，有100%互補性。此實例中，於指明之(諸)位置存在誤配。誤配係藉由改變意義股核苷酸之同一性引入雙鏈中。以此方式，反義股與標靶mRNA之區域保留1〇〇%互補性。再者，如本文所用之股内之位置編號係指該核普酸相對於雙鏈區之第一個，亦即，最5,核苷酸之位置。因此’ 意義股之位置1為意義股之最5’位置，而反義股之位置1

28 201219041 為反義股之最5,位置；位置2為緊鄰各別股位置丨下游（戒 3’）之位置。如上所述，於若干具體實例中，係於意義股中引入誤配。若干情形下，於誤配位置引入之核苷酸具有與正常結合於该特定意義股核苷酸之反義股中之核苷酸相同之同性或化學性質。因此，舉例而言，一雙股分子，意義股中含19個核苷酸及反義股中含19個核苷酸而各股上無突出端，若於意義股位置6 (從該股5,端算起）引入誤配，則意義股該位置之核苷酸不會以瓦生_克立克方式與反義股位置14之核苷酸配對。再者，若反義股位置14之核苷酸為例如“C，，，則於意義股位置6引入“C”即可達成誤配。彼荨改變之結果，於意義股位置6之核苦酸不再與例如 mRNA “乾區之對應核皆酸具有同一性。然而，於例如位置Η之反義核苷酸將保留對標靶區上之核苷酸之互補性。雙鏈寡核苷酸複合物上接合基團之位置可視接合之股或諸股(例如，意義股、反義股、或意義及反義股二者）、於該股内經修飾之位置或諸位置（亦即，該股或諸股内之核苷酸位置）、及經修飾之核苷酸上之位置（例如，糖、鹼基）而不同。接合基團可置於一或多股之5，及/或3,端上。例如’接合基團可置於意義股之5,端及/或意義股之3,端及 /或反義股之3'端。接合基團可經由碟酸二酯鍵連接於股之 5·及/或3’端。於較佳具體實例中，接合基團係經由磷酸二酉曰鍵連接於思義股之一或一端，更佳為連接於意義股之31 端。 29 201219041 置。此二，；^ *亦可連接於意義股及/或反義股之内部位之位置5、’皰^酸上多個位置’包括料之位置5、胞苦 7、鳥核苷之4之位置4、鳥核苷之位置7、腺核苷之位置核糖之:立C、_之位置8、腺核芽之位置6、於連接接合物於4=之位置5,、及核糖之位置3’，均可用

方法=體例中’本發明提供基因靜默之方法，該 ID NOs* 2 > 4入細胞至少一種slRNA，其包含選自SEQ 26、28 : 30、;26、、二〇、12、14、16、18、20、22、24、 34、36、38、40、42、44、46、48、50、 56 58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、減8〇 84、86與88之序列°SiRNA可藉由容許被動攝入siRNA ’或經由使用載體而引入。本文揭示之任何方法及套組均可使用單分子 siRNA、纟一分離聚核苷酸股組成之仙财、或其組合。再者，本文揭示之任何方法均可於使用各種不同操作步驟之基因靜默中使用。於—非限制實例中，可同時投與把向相同基因之二或多種siRNA。單獨趣八之情形下，可於單-劑量或單-轉染、多4劑量中、或視情況而定，投與二或多種siRNA。於具體實例中，本發明提供使用抑制基因表現及/或活ϋ之化合物製造用於治療與過度表現VEGFA 相關疾患之藥劑之用途。該藥劑可，例如，經口、非經腸 (包括皮下、肌内、靜脈内）、經直腸、經皮膚、經頻、或 201219041 經鼻投與。該藥劑可包含本文所述之任何一或多種化合物。干擾RNA可藉由眼睛組織注射例如眼球周圍、結膜、德濃氏囊下(subtenon)、前房内、玻璃体内、眼球内、次網膜、副結膜、眼球後、或管内注射；藉由使用導管或其他安置裝置例如視網膜顆粒、眼球内插入、栓劑或包含多孔、無孔、或凝膠材質之植入物直接施加於眼睛；利用局部眼藥水或軟嘗；或藉由在盲管或植入緊鄰輩膜（經輩膜）或於鞏膜（鞏膜内）或眼睛内之緩釋型裝置直接傳送至眼睛。前房内注射可經由角膜進入眼前房，以容許藥劑到達小樑網狀組織。管内注射可進入靜脈採集通道引流許萊姆氏(Schlemm's)管中或進入許萊姆氏管中。供眼藥傳送時，干擾RNA可與眼科學上可接受之防腐劑、共溶劑、界面活性劑、黏度增強劑、穿透增強劑、緩衝亦、氣化鈉、或水結合，以形成水性、無菌之眼用懸浮液或溶液。溶液調配劑可使干擾RNA溶於生理上可接受之等張緩衝水溶液中予以製備。進一步地，該溶液可包含可接受之界面活性劑以幫助溶解干擾RNA。黏度建造劑，例如羥甲纖維素、羥乙纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、或類似物可添加於本發明組成中，以增進化合物之保持力。口為了製備無菌眼用軟膏調配劑，乃使干擾RNA與於適當媒介物例如礦油、液態羊毛脂、或白凡士林中之^腐刈、。。無菌眼用凝膠調配劑，可根據此項技藝中已知之 31 201219041 方法，使干擾RNA懸浮於以例如CARBOP〇L®-940 (BF Goodrich，Charlotte, NC)或類似物之組合物製備之親水性基底中予以製備。舉例而言，VISCOAT® (Alcon Laboratories, Inc.，Fort Worth, TX)可用於眼球内注射。於干擾RNA較少滲入眼睛之情形下，本發明之其他組成可含有滲透增強劑例如聚氧乙烯蓖麻油及TWEEN® 80(聚氧乙唏山梨醇針單月桂酸酯，Sigma Aldrich，St. Louis，MO)。本發明亦提供醫藥組成物，其包含於製藥上可接受載劑中之本發明siRNA。因此，於另一具體實例中，本發明係針對包含治療有效量siRNA之醫藥組成物，其中siRNA 由下列組成：（a)形成雙鏈區之意義股及反義股，其中雙鏈區為17-30個鹼基對長，及包含具有選自包括下述組群之序列之反義區·· SEQ ID NOs: 2、4、6、8、1〇、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、 68、70、72、74、76、78、80、82、84、86 與 88 ;及(b) 與反義區100%互補或於一或多個位置具有誤配之意義區。於一實例中，該分子由意義股及反義股組成，彼等形成19個鹼基雙股複合物及位於意義區位置6、13或19之講配，其中該等位置係界定為相對於為雙鏈區一部份之意義股之最5核苷酸。由上文轉達之所有說明，可採用下述修飾：意義區位置1與2及所有（：與11具有2，_〇_Me修饰，意義區之所有其他2’位置具有2，-〇η基，其中反義區之所有C與U經2、F修飾，反義區之所有其純皆酸具 32 201219041 有2 OH基’及反義區位置丨之核苦酸被構酸化及有而突^連接於反義區之3,端，其中突出端之二«酸間以及犬出端之第-個核㈣與反義股之雙鏈區最3，反義核普酉文間之核賊間鍵結為硫代魏鍵結；及膽固醇基團經由C5連接子連接於意義區之3，端。於又另一具體實例中’ S1RNA具有如前述之相㈣徵，惟反義股具有至少一個2’-0-修飾而非2，-F修飾。製藥上可接受之载劑可包含一或多種賦形劑，如媒介物佐劑、pH調整及緩衝劑、張力調整劑、穩定劑與潤濕劑。再者，於若干具體實例中，siRNA係呈微膠囊傳送，例如利用凝聚技術或利用膠態藥物傳送系統（例如脂質體、微球體、微乳液、奈米粒？、及奈米膠囊或微乳液) 中之界面聚合(例如’分別為經甲纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基曱醇化物)微膠囊）。

s漏A可利用任何目前已知或將成為已知及從閱讀本揭示内容，熟習此項技藝人士錢與本發明有關之可用於賦能siRNA ?越細胞膜之方&，被引入細胞或生物體中。彼等方法包括，惟不限於，任何方式之轉》，舉例而言’如’使用DEAE-聚葡萄糖、鱗_、陽離子脂質/脂質體、Μ胞、運用壓力、顯微注射、電穿孔、免疫穿孔、使用載體(例如病毒、質體、黏質體、喔菌體）、細胞融合、及聚核魏與特定接合物植體(例如抗體、抗原、或受體)之偶合、被動引人、添加促進其攝人之基團等之轉染。於另-具體貫例中，本發明之特徵為使躲向siRNA 33 201219041 之VEGFA製造用於治瘃之藥劑之用途：牛皮癖、^抑制或改善下述一或多種症狀企管形成、1常血管新/症、類風祕關較、眼睛新糖尿病視_錢(_ ^_血管料、視網膜水腫、尿病性黃斑部水腫、殊屮疋"殖性糖尿病視網膜病變）、糖網膜缺血相關之後_ Μ齡相雜黃斑部病變、與視趣之接受者可為例如？眼後段新血管形成。本發明 s_AU量或多種疾患折磨的人。分係由待治療生物之年治療纽量至少部 — +岭、體重及罹病之症狀或嚴重性決疋0 本發明siRNA之實例可包含選自seqidn〇sh ;8、10、12、14、16、m24、26、28、30、、34、36、38、40、42、44、46 48 5〇、52、54、56、、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、 4、86與88之反義序列及表1中對應之意義股。表1顯示如實施例部分所述之體外測試之42個未經 Γ隻免之siRNA之靜默活枓。 SEQ ID NO: 上:意義股，5，~>3, 下:反義股，5，+ 3,

1 UACUAAAUCUCUCUCCUUU 2 AAAGGAGAGAGAIJIJTJAGIIA

3 ACAGAACGAUCGAUACAGA 4 UCUGUAUCGAUCGUUCUGU 5 CGACAGAACAGUCCUUAAU AUUAAGGACUGUUCUGUCG

GAAGAGACACAUUGUUGGA %VEGFA RNA 殘留 41.6 22.5 19.9 22.3 %VEGFA 蛋白質殘留 50.0 20.6 21.2 21.4 34 201219041 8 UCCAACAAUGUGUCUCUUC vegfa 2.5 9 GUCACUAGCUUAUCUUGAA 10 UUCAAGAUAAGCUAGUGAC 13.6 31.6 vegfa 2.6 11 CAGCACACAUUCCUUUGAA 12 UUCAAAGGAAUGUGUGCUG 57.3 44.4 vegfa 2.9 13 GGAGACCACUGGCAGAUGU 14 ACAUCUGCCAGUGGUCUCC 24.1 37.5 VEGFA 2.11 15 GCUCGGUGCUGGAAUUUGA 16 UCAAAUUCCAGCACCGAGC 51.0 35.1 vegfa 2.12 17 GAAAGACAGAUCACAGGUA 18 UACCUGUGAUCUGUCUUUC 20.8 27.8 vegfa 2.14 19 CCAGAAACCUGAAAUGAAG 20 CUUCAUUUCAGGUUUCUGG 31 22.5 vegfa 2.15 21 GAGAAGAGACACAUUGUUG 22 CAACAAUGUGUCUCUUCUC 36.6 20.5 vegfa 2.17 23 CGACAAAGAAAUACAGAUA 24 UAUCUGUAUUUCUUUGUCG 40.8 40.0 vegfa 2.18 25 GGGCAAAUAUGACCCAGUU 26 AACUGGGUCAUAUUUGCCC 12.2 39.8 vegfa 2.19 27 GAAGAGAAGAGACACAUUG 28 CAAUGUGUCUCUUCUCUUC 43.3 21 vegfa 2.20 29 GAAACCAGCAGAAAGAGGA 30 UCCUCUUUCUGCUGGUUUC 47.6 44 vegfa 2.21 31 GAUCACAGGUACAGGGAUG 32 CAUCCCUGUACCUGUGAUC 44.8 33.1 vegfa 2.22 33 GGAAAGAGGUAGCAAGAGC 34 GCUCUUGCUACCUCUUUCC 52 53.3 vegfa 2.23 35 GAGAUGAGCUUCCUACAGC 36 GCUGUAGGAAGCUCAUCUC 88.5 14.7 vegfa 2.24 37 GAUCAAACCUCACCAAGGC 38 GCCUUGGUGAGGUUUGAUC 30.8 11.3 Vegfa 2.25 39 CAACAAAUGUGAAUGCAGA 40 UCUGCAUUCACAUUUGUUG 22.0 5.52 vegfa 3.1 41 AAAUGAAGGAAGAGGAGAC 42 GUCUCCUCUUCCUUCAUUU 16.2 9 vegfa 3.2 43 AAUGCAGACCAAAGAAAGA 44 UCUUUCUUUGGUCUGCAUU 25.3 11.5 vegfa 3.3 45 ACAUAGGAGAGAUGAGCUU 46 AAGCUCAUCUCUCCUAUGU 16.3 14.3 vegfa 3.4 47 ACGACAAAGAAAUACAGAU 48 AUCUGUAUUUCUUUGUCGU 32.6 52.4 35 201219041 vegfa 3.5 49 AGACACACCCACCCACAUA 50 UAUGUGGGUGGGUGUGUCU 17.6 26.1 vegfa 3.6 51 AGACAUUGCUAUUCUGUUU 52 AAACAGAAUAGCAAUGUCU 31.4 25.7 vegfa 3.7 53 AGAGAAAAGAGAAAGUGUU 54 AACACUUUCUCUUUUCUCU 23.4 9.8 vegfa 3.8 55 AGCACACAUUCCUUUGAAA 56 UUUCAAAGGAAUGUGUGCU 26.6 42 vegfa 3.9 57 CAAAUGUGAAUGCAGACCA 58 UGGUCUGCAUUCACAUUUG 45.8 35.4 vegfa 3.10 59 CACACAUUCCUUUGAAAUA 60 UAUUUCAAAGGAAUGUGUG 39.3 28.3 vegfa 3.11 61 CAGAACAGUCCUUAAUCCA 62 UGGAUUAAGGACUGUUCUG 22.9 34.4 vegfa 3.12 63 CAGAGAAAAGAGAAAGUGU 64 ACACUUUCUCUUUUCUCUG 30.1 30.7 vegfa 3.13 65 CCAGCACAUAGGAGAGAUG 66 CAUCUCUCCUAUGUGCUGG 34.7 22.3 vegfa 3.16 67 CGAGAUAUUCCGUAGUACA 68 UGUACUACGGAAUAUCUCG 32.8 61 vegfa 3.17 69 CUACUGUUUAUCCGUAAUA 70 UAUUACGGAUAAACAGUAG 40.9 55.2 vegfa 3.18 71 CUGAAAUGAAGGAAGAGGA 72 UCCUCUUCCUUCAUUUCAG 43.5 43 vegfa 3.19 73 GAAAUGAAGGAAGAGGAGA 74 UCUCCUCUUCCUUCAUUUC 42.7 48.3 vegfa 3.20 75 GAACAGUCCUUAAUCCAGA 76 UCUGGAUUAAGGACUGUUC 25.9 30.9 vegfa 3.21 77 GAGAGAUGAGCUUCCUACA 78 UGUAGGAAGCUCAUCUCUC 64.6 33 vegfa 3.22 79 GAGAUAUUCCGUAGUACAU 80 AUGUACUACGGAAUAUCUC 60.5 61.3 vegfa 3.23 81 GAGGCAGAGAAAAGAGAAA 82 UUUCUCUUUUCUCUGCCUC 26.9 32.4 vegfa 3.24 83 GAUAUUAACAUCACGUCUU 84 AAGACGUGAUGUUAAUAUC 37.8 73.5 vegfa 3.25 85 GCACACAUUCCUUUGAAAU 86 AUUUCAAAGGAAUGUGUGC 18.8 38.1 vegfa 3.26 87 GCGGAUCAAACCUCACCAA 88 UUGGUGAGGUUUGAUCCGC 30 33.5 8 36 201219041 表2顯示未經修飾及siStabie修飾形式之siRNA挑選物之靜默活性。明確言之，D及E攔之數據得自於24小時之未修飾分子^ F、G、Η、及I攔之數據得自於72小時之siStable修飾分子。F及G攔之數據得自siRNA以 A B c D E F G Η I 蛋白蛋白 SEQ RNA 質 siStable siStable RNA 質參照 ID 上：意義股，5’·>3， ic5〇 ic5〇 % RNA %蛋白 IC5〇 IC50 序列 NO：下：反義股，5’今3’ (nM) (nM) 殘留質殘留 (nM) (nM) vegfa 1 UACUAAAUCUCUCUCCUUU 2.1 2 AAAGGAGAGAGAUUUAGUA 0.31 0.51 17 41 4.78 2.35 vegfa 41 AAAUGAAGGAAGAGGAGAC 3.1 42 GUCUCCUCUUCCUUCAUUU 5.2 0.82 18 12 0.36 0.15 vegfa 43 AAUGCAGACCAAAGAAAGA 3.2 44 UCUUUCUUUGGUCUGCAUU 0.93 0.17 10 9 0.4 0.37 vegfa 45 ACAUAGGAGAGAUGAGCUU 3.3 46 AAGCUCAUCUCUCCUAUGU 0.43 0.59 11 10 0.82 0.77 vegfa 51 AGACAUUGCUAUUCUGUUU 3.6 52 AAACAGAAUAGCAAUGUCU 0.81 0.94 28 31 23 3.17 vegfa 53 AGAGAAAAGAGAAAGUGUU 3.7 54 AACACUUUCUCUUUUCUCU 1.3 0.46 10 10 0.26 0.46 vegfa 59 CACACAUUCCUUUGAAAUA 3.10 60 UAUUUCAAAGGAAUGUGUG 1.05 0.97 13 20 0.26 0.17 vegfa 63 CAGAGAAAAGAGAAAGUGU 3.12 64 ACACUUUCUCUUUUCUCUG 4.6 1 10 15 0 11 〇 21 vegfa 75 GAACAGUCCUUAAUCCAGA 3.20 76 UCUGGAUUAAGGACUGUUC 2 0.62 9 28 Π ^ 1 Λ vegfa 81 GAGGCAGAGAAAAGAGAAA \J · J J 3.23 82 UUUCUCUUUUCUCUGCCUC 1.4 1.2 14 45 2.2 2.7 ~--- 該明確列舉之siRNA以及含彼等之醫藥組成物與使用彼等之方法。本發明亦包括與彼等類似，惟於意義股之位置 6或位置13或位置19,或於意義股之位置6與_者咬 37 201219041 位置13與19二者或位置6與19二者，或於意義股6、13 與19所有二個位置具有不同鹼基之siRNA。因此於彼三位置之任一位置，其中於表i或2中有互補於以八時，可插入U、C、或G’其中於表1或2中有互補於A之U 時’可插入A、C、或G，其中於表1或2中有互補於G 之C時’可插入U、A、或G，其令於表1或2中有互補於C時之G時，可‘u、c、或A;更進—步地，任何彼等siRNAs可含突出端區，例如UU3,反義突出端及/或 UU 3’意義突出端。 n步實例而言’於具體實例中，本發明係針對得自表2之S1RNA’或針訝與表2siRNA之不同處在於意義股具有位於位置6、13及19之三誤配核苷酸而於反義上具有相對核苷酸之siRNA，例如，含有vegfa 3 7之意義及反義序列之siRNA，惟意義股具有位於位置6、13、及 19之三個誤配核苷酸。於若干具體實例中，係挑選誤配俾使一或多個，例如，二或三個誤配鹼基與相對股上之鹼基相同，且無其他誤配鹼基存在雙鏈中。舉非限制實例而言’用於vegfa3.7之雙鏈可為 SS- AGAGA(ikAGAGA'〇AGUGa§> 3f (SEQ ID No· Q1 ^ AS- 3，UCUCUUUUCUCUUUCACAA 5， (SEQ ID No：" 54) 踅蟪，可於意義股或反義股上含3,突出端。舉非限制實例而言，可能存在二㈣出端可存在意義股“ 反義股上；存在反義股而非意義股上；存在兩股上或兩股

S 38 201219041 皆無。可建構各突出端，使於突出端之核苷酸間具有標準核苷酸間鍵結及雙鏈適當股3’端之標準鍵結，或於突出端中’突出端二核苷酸間，以及突出端之第一個核苷酸與該股雙鏈區最3’反義核苷酸間之鍵結為硫代構酸鍵結。因此，例如，前節之vegfa 3.7雙鏈，SEQ ID No: 54，可能含有於突出端之核苷酸間或突出端與SEQ ID No: 54之3, 間不含硫代填酸鍵結，或於·-或二彼等位置可能有硫代磷酸鍵結之UU 3’反義突出端。除非另行指明，否則前述各具體實例之各特徵可與任何其他具體實例銜接使用，除非此等用途與該具體實例不相容或不一致。經一定程度之詳細說明本發明後，於下文將提供實施例。彼等實施例決不擬及不應對申請專利之範圍構成侷限。【實施方式】實例實例1 :體外研究之一般技術供研究之siRNA挑選針對能靶向所有VEGFA變異體之siRNA收集物 (NM_001025366、NM_003376、NM_001025367、 NM_001025368、NM—001033756、NM_001025369、 NM_001〇25370)進行鑑定。表1提供siRNA之列表及意義與反義股序列(5’+3，）。 39 201219041 欲評估各siRNA之相對功能，使用2，ACE化學合成諸序列（美國專利案No· 6,008,400 ;美國專利案No. 6，111，086 ;美國專利案 No. 6,590,093 ; Scaringe (2000) Methods in Enzymology 3\Ί：3-\^ ； ScaringQ (2001) Methods 23(3):206-217) ’然後使用廠商操作步驟(於96槽格式中，每槽10,000個細胞，1〇〇 nM siRNA，每槽0.2微升 DharmaFECT 1) ’利用脂質媒介之轉染法，轉染進入海拉氏(HeLa)細胞(ATCC ’ #CCL-2)中。轉染72小時後，測定整體細胞活力及於mRNA與蛋白質層次之標靶減弱。所有分析進行三重複’針對挑選之一組siRNA，進行劑量曲線(0.001、0.(H、0.1、1.0、1〇.〇、及 1〇〇 nM)，以確定 siRNA/ 標靶mRNA對之ICso。所有實驗均包括正及負對照組，係由無靶向對照組（NTC #5 意義股序列： 5,-UGGUUUACAUGUCGACUAAUU-3, (SEQ ID NO: 89)) 及正對照組靶向 PPIB (意義股序列： 5’-ACAGCAAAUUCCAUCGUGU-3,（SEQ ID NO: 90))組成。註：用於此等研究之正對照分子含有下述修飾：意義股於從該股5’端算起之前兩個核苷酸上含有2，_〇_甲基修飾；反義股含有5’磷酸基；意義及反義股二者均於3’端含有2核苷酸UU突出端。標乾mRNA及蛋白質減弱(knockdown)分析使用分支 DNA 分析法（QuantiGene Screen Kit， Panomics)測定轉染72小時後之標乾mRNA減弱。以PPIB 之表現作為參照mRNA，將標靶mRNA減弱進一步標準 201219041 化至對應之無靶向對照組(NTC)。針對轉染72小時後之轉染細胞上澄液進行VEGFA ELISA分析，以評估蛋白質表現。使用50微升上澄液，根據廠商指示(Human VEGFA ELISA 套級，Thermo Scientific)進行 ELISA。於分光光度計上頃取450 nM之吸光度。將數據標準化至對應之NTC 對照組。細胞活力分析轉染72小時後，利用刃天青分析法評估細胞活力。直接添加刀天青至培養液中，培育該培養盤M 5小時後’於 Wallac VICTOR 2 (Perkin Elmer Life Sciences)培養盤測讀儀上(530 nm激發’ 590 nm發射，曝光1秒)測量鸯光。將數據標準化至對應之NTC對照組。供研究之siRNA設計體外研究測試之siRNA結構包括：（1)標準未經修挪之設計（19個鹼基對雙鏈’意義及反義股二者3’端上之突出端）、及穩定化設計（19個鹼基對雙鏈；意義股修錦. 核苦酸1與2上(從該股之5’端算起)之2’-〇-曱基修飾力σ 上所有C與U上之2’-0-曱基修飾；反義股修飾：5,端检苷酸上之磷酸、所有C與U上之2’ F修飾、3’端上之^ 核苦酸(UU)突出端、及突出端二核苷酸間、雙鏈之第—（最 3，)核苦酸與突出端之第一核皆酸間之硫代構酸核替駿門修飾）。供體内研究之siRNA包括下述设a十· . 19 bp雙鏈 201219041 • 思義股修飾 •核皆酸1與2上(從該股之5,端算起)之2，-0-曱基修_ •所有C與U上之2，-〇_曱基修飾 •以C5連接子接合於3,端之膽固醇（參閱2009年 8月20日公告之美國專利公告案 2009/0209626，其揭示内容併入本文以資參考) • 反義股修飾 • 5 ’填酸

•所有C與u上之2, F •3’端上之2核苷酸(uu)突出端 •突出端二核苷酸間、雙鏈之第一（最3，)核苷酸與突出端之第一核苷酸間之硫代磷酸核苷酸間修飾此外’位置6、13、及19之誤配已被併入用於體内研究之分子中。於所有情形下’ siRNA兩股間之誤配，可藉由改變意義股之核苷酸至與該位置典型配對鹼基（反義股上）具同一性而達成。因此，例如，若意義股位置6之意義-反義配對正常地為U-A，則利用轉變配對成為A_A將可引入誤配。同樣地，若意義股位置6之意義·反義配對為G-C’則誤配為C-C。以此方式，可將誤配併入雙鏈中，惟反義股仍保持意指標把之逆向互補。實例2 :體外及體内研究結果所有序列之體外測試表現示於表1。觀察到多個序列

42 201219041 (包括，例如，Vegfa2.2、2_3、2.4、2.12、3.卜 3.2、3.3、 3.5、與3.7)於RNA及蛋白質二層次均提供大於之基因減弱。此外’以穩定化設計測試該集合之子集，發現其整體表現相當於或優於未經修饰狀態所觀察者（見，例如’ vegfa2.1、3.2、3.3)。如表2所示，於未經修飾及修飾狀態二者中，RNA減弱之IC5〇為約〇·ι 1 +23nM不等，而蛋白質減弱之1〇5〇為〜〇. 17 3· 17nM不等。根據彼等結果，使用先前敘述之體内設計(稱為“阿塞爾”)再合成Vegfa 3.2與3.7二序列。彼等實驗之結果可參照隨附圖示進一步說明。圖1A及1B說明於大鼠視網膜玻璃體内（ιντ)注射阿塞爾VEGFA siRNAs 72小時後，分別對VEGFA mRNA及蛋白質表現之影響。路易斯(Lewis)大鼠接受再懸浮於IX siRNA緩衝液(Dharmacon)中之阿塞爾VEGFA 3.2、阿塞爾VEGFA 3.7或阿塞爾無標向對照#l (NTC1) siRNAs之 10微克IVT注射(OD)。阿塞爾NTC1 siRNA意義股序列為 5’-UGGUUAACAUGUCGACUAA-3，(SEQ ID NO: 92) ;阿塞爾 NTC1 siRNA 反義股序列為 5，-UUAGUCGACAUGUAAACCAUU-3，(SEQ ID NO: 93) 。對側眼睛(OS)未經處理。注射72小時後收集眼睛，並解剖分離視網膜。（1A)使用Trizol (Invitrogen)抽取總 RNA，並以 Taqman qRT-PCR 分析法(Applied Biosystems) 測定VEGFA及β-肌動蛋白（ACTB)之mRNA量。將VEGFA mRNA表現標準化至β-肌動蛋白表現。（1B)使用RIPA緩 43 201219041 衝液(Pierce)抽取蛋白質，並以ELISA(R&D Systems)測定大鼠VEGFA蛋白質量。將VEGFA蛋白質表現量標準化至以BCA分析法(Pierce)測定之總蛋白質量。數據以平均值(η = 6) 士標準偏差（誤差槓）表示。*，對NTC1之P < 0.0(Η。二 VEGFA siRNAs 顯著地減少 VEGFAmRNA 之表現，VEGFA 3.7亦顯著地減少VEGFA及蛋白質。NTC1 對照siRNA對VEGFA表現之影響即使有，也很小。圖2顯示於大鼠視網膜中，阿塞爾VEGFA 3.2 siRNA 及對照siRNA間劑量反應曲線之比較。路易斯大鼠接受再懸浮於IX siRNA緩衝液(Dharmacon)中之阿塞爾VEGFA 3.2或阿塞爾NTC1對照siRNA之1-25微克IVT注射 (OD)。對側眼睛(OS)未經處理。注射72小時後收集眼睛，並解剖分離視網膜。使用Trizol Plus (Invitrogen)抽取總 RNA，並以 Taqman qRT-PCR 分析法(Applied Biosystems) 測定VEGFA及β-肌動蛋白之mRNA量。將VEGFA mRNA 表現標準化至β-肌動蛋白mRNA。數據以榡準化VEGFA mRNA表現(η = 6)之平均OD:OS比（經處理眼睛對未經處理眼睛VEGFA量之比率）土標準偏差（誤差槓）表示^ ，對阿塞爾NTC1之尸< 0.05 ; ，尸< 〇.〇1。增加阿塞爾 VEGFA siRNA 3.2之玻璃體内(IVT)注射量，導致於25微克時達到VEGFA mRNA表現實質上完全靜默之劑量反應。圖3A及3B顯示於大鼠視網膜中’阿塞爾veGFA 3.7 siRNA及對照siRNA間劑量反應曲線之比較。路易斯大鼠

44 201219041 接受再懸浮於IX siRNA缓衝液(Dharmacon)中之阿塞爾 VEGFA 3.7或阿塞爾VEGFA 3.7切割位置誤配(CS MM) 對照siRNAs之1-50微克IVT注射（OD)。阿塞爾VEGFA 3.7 CS MM對照siRNA，除了與VEGFA mRNA標靶序列之3-核苷酸誤配外，具有與阿塞爾VEGFA 3.7 siRNA相同之序列。阿塞爾VEGFA 3.7 CS MM siRNA意義股序列為 5，-AGAGAUAACUCAUAGUGUA-3’（SEQ ID NO: 94) ;阿塞爾VEGFA 3.7 CS MM siRNA反義股序列為 55 - AAC ACUUUGAGUUUUCUCUUU-35 (SEQ ID NO: 95) 。對侧眼睛(OS)未經處理。注射72小時後收集眼睛，並解剖分離視網膜。（3 A)使用Trizol (Invitrogen)抽取總 RNA ’ 並以 Taqman qRT-PCR 分析法(Applied Biosystems) 測定VEGFA及β_肌動蛋白之mRNA量。將VEGFA mRNA 表現標準化至β-肌動蛋白mRNA表現。（3B)使用RIPA缓衝液(Pierce)抽取蛋白質，並以ELISA (R&D Systems)測定大鼠VEGF-A量。將VEGFA蛋白質表現量標準化至以 BCA分析法(Pierce)測定之總蛋白質量。數據以標準化 VEGFA mRNA或蛋白質表現(n = 6)之平均OD:OS比土標準偏差（誤差槓）表示。*，尸< 〇.〇3 ; ，尸< 0.0002 ; #，户< 0.005。低至5微克劑量之阿塞爾VEGFA 3.7 siRNA之玻璃體内注射’於mRNA以及蛋白質層次均引致VEGFA 表現顯著地減少。於25微克時，阿塞爾VEGFA 3.7 siRNA 展現達到> 70% VEGFA mRNA表現抑制及約80% VEGFA 蛋白質表現抑制之劑量反應。對照siRNA亦觀察到非 45 201219041 RNAi傳介之VEGFA表現抑制；此影響VEGFA蛋白質比 VEGFA mRNA 不顯著。圖4A及4B顯示阿塞爾VEGFA 3 7 siRNA之持續作用時間。路易斯大鼠接受再懸浮於1χ siRNA緩衝液 (Dharmacon)中之阿塞爾VEGFA 3 7 siRNA或阿塞爾 NTC1對照siRNA之25微克Ιντ注射(〇D)。對側眼睛（〇s) 未經處理。收集注射卜3、7、14、28、42、及56天後之眼睛，並解剖分離視網膜。如先前實例所述，評估vegfa mRNA (4A)及VEGFA蛋白質（4B)之表現。數據以標準化 VEGFA mRNA或蛋白質表現(n = 6)之平均〇D:〇s比土標準偏差（誤差槓）表示。*，對NTC1之户<〇.001 ; #，尸< 0.002。阿塞爾VEGFA 3.7 siRNA之玻璃體内注射於24小時内引起mRNA及蛋白質表現之顯著抑制；抑制可持續數週。圖5A及5B分別顯示於大鼠氧誘發性視網膜病變 (OIR)模式（修飾自 Penn ei a/·, PW36:724_731, 1994)中，VEGFA蛋白質表現及視網膜前新血管形成之抑制。經14天50 %與10 % 〇2間之循環後，使初生Sprague Dawley大鼠暴露於室内空氣(21 % 〇2) 7天（產後15·21 天’ Ρ15-Ρ21)。於Ρ15及Ρ18天’使動物接受再懸浮於ιχ

siRNA 緩衝液(Dharmacon)中之阿塞爾 VEGFA siRNA 3 7 或阿塞爾VEGFA 3.7 CS MM對照siRNA之25微克IVT 注射(OS)。以媒介劑（1X siRNA緩衝液）處理對側眼睛 (OD)。注射容量1微升。於P21天收集眼睛，並解剖分離 46 201219041 視網膜。（5A)使用ripa緩衝液(Pierce)抽取蛋白質，並以 ELISA (R&D Systems)測定 VEGFA 蛋白質量。將 VEGFa 蛋白質表現量標準化至以BCA分析法(Pierce)測定之總蛋白裊蓋。數據以標準化VEGFA蛋白質表現(n == 7)之平均值士標準偏差（誤差槓）表示。*，/><〇〇3。（5B)使視網膜於ίο%中性緩衝福馬林中固定24小時，進行ADp酶染色’並以全形封閉固定於載玻片上。使用Nikon C〇〇lScope® 取得影像，評估每一視網膜12區段之每一區段是否存在新血官形成，以得到時鐘小時計分（clockhour score) (η = 6-8)。# ’ Ρ < 0.05。阿塞爾 vEGFA 3.7 siRNA 引起 vEGFA 蛋白貝表現顯著減少（〜40 %)，導致約88 0/〇之視網膜前新血管形成之抑制。阿塞爾VEGFA3.7 cs MM對照siRNA 對VEGFA表現或新血管形成無顯著影響。熟習此項技藝人士知道，由針對大鼠進行之觀察推斷至人類為一般悉知。【圖式簡單說明】圖1A及B說明於大鼠中經修飾呈阿塞爾分子之二 VEGFA siRNAs經由玻璃體内（IVT)注射傳送之體内靜默活性。圖2係siRNA ’ VEGFA 3.2 (經修娜呈阿塞爾分子)劑量反應曲線之表示法。 —圖3A及3B為另一 siRNA，VEgfa 3 7 (經修飾呈阿塞爾分子）劑量反應曲線之表示法。 47 201219041 圖4A及4B說明於大鼠中經修飾呈阿塞爾分子之 siRNA，VEGFA3.7經由IVT注射傳送之長達8週之持續作用。 5 B說明於大鼠之㈣發性視網顧變(〇】R) 模式中，、經修飾呈阿塞爾分子之_Α VEGFA表現及視網膜前新血管形成之抑制^ 48 201219041 序列表 <110> Smith, Anja

Reynolds, Angela Chatterton, Jon E.

Zhang, Xinyu <120>以VEGFA為標靶之siRNA及體内之治療方法

<130> DHARMA 0061-PCT <150> 61/368,385 <151> 2010-07-28 <160> 95 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 1 uacuaaaucu cucuccuuu <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 2 aaaggagaga gauuuagua <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 3 acagaacgau cgauacaga <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 4 ucuguaucga ucguucugu <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 5 cgacagaaca guccuuaau <210> 6 第1頁 201219041 <ζι \ > i y <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 6 auuaaggacu guucugucg <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 7 gaagagacac auuguugga <210> 8 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 8 uccaacaaug ugucucuuc <210> 9 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 9 gucacuagcu uaucuugaa <210> 10 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 10 uucaagauaa gcuagugac <210〉 11 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 1 1 cagcacacau uccuuugaa <210> 12 <21 1> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 12 uucaaaggaa ugugugcug 201219041 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213>人工序巧 <220> <223>合成 <400> 13 ggagaccacu ggcagaugu <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 14 acaucugcca guggucucc <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 15 gcucggugcu ggaauuuga <210> 16 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 16 ucaaauucca gcaccgagc <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 17 gaaagacaga ucacaggua <210> 18 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成 <400> 18 uaccugugau cugucuuuc <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 201219041 <400> 19 ccagaaaccu gaaaugaag <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 20 cuucauuuca gguuucugg

列序 A工 195人 2 1 R ^ > > > > 0 12 3 2 2 2 2 V V < V <220> <223>合成 <400> 21 gagaagagac acauuguug <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 22 caacaaugug ucucuucuc <210> 23 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 23 cgacaaagaa auacagaua <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 24 uaucuguauu ucuuugucg <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 25 gggcaaauau gacccaguu > > > > 0 12 3 1 u n 2 2 2 2 < V V < 26 19 RNA 人工序列 <220> 201219041 <223>合成 <400> 26 aacuggguca uauuugccc <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 27 gaagagaaga gacacauug <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 28 caaugugucu cuucucuuc <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 29 gaaaccagca gaaagagga <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 30 uccucuuucu gcugguuuc <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 31 gaucacaggu acagggaug <210> 32 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 32 caucccugua ccugugauc <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 201219041 <220> <223>合成 <400> 33 ggaaagaggu agcaagagc <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成 <400> 34 gcucuugcua ccucuuucc <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 35 gagaugagcu uccuacagc <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 36 gcuguaggaa gcucaucuc <210> 37 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 37 gaucaaaccu caccaaggc <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 38 gccuugguga gguuugauc <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 39 caacaaaugu gaaugcaga <210> 40 <211> 19 201219041 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 40 ucugcauuca cauuuguug <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 41 aaaugaagga agaggagac <210> 42 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 42 gucuccucuu ccuucauuu > > Λ Λ 0 12 3 11 11 1 n 2 2 2 2 < < < < 43 19 RMA 人工序列 <220> <223>合成 <400> 43 aaugcagacc aaagaaaga <210> 44 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <4〇〇> 44 ucuuucuuug gucugcauu <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 45 acauaggaga gaugagcuu <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 46 aagcucaucu cuccuaugu 201219041 <21ϋ> 47 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 47 acgacaaaga aauacagau <210> 48 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 48 aucuguauuu cuuugucgu

<210> 49 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <4〇〇> 49 agacacaccc acccacaua <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 50 uaugugggug ggugugucu <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 51 agacauugcu auucuguuu <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 52 aaacagaaua gcaaugucu <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成 <400> 53 201219041 agagaaaaga gaaaguguu 19 <210> 54 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 54 aacacuuucu cuuuucucu 19 <210> 55 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 55 agcacacauu ccuuugaaa 19 <210> 56 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 56 uuucaaagga augugugcu 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 57 caaaugugaa ugcagacca 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 58 uggucugcau ucacauuug ] 9 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 59 cacacauucc uuugaaaua 19 <210> 60 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成第9頁 201219041 <400> 60 uauuucaaag gaaugugug <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 61 cagaacaguc cuuaaucca <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 62 uggauuaagg acuguucug <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 63 cagagaaaag agaaagugu <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 64 acacuuucuc uuuucucug <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 65 ccagcacaua ggagagaug <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 66 caucucuccu augugcugg <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列第10頁 201219041 <220> <223>合成 <400> 67 cgagauauuc cguaguaca 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 68 uguacuacgg aauaucucg 19 <210〉 69 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 69 cuacuguuua uccguaaua 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 70 uauuacggau aaacaguag 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 71 cugaaaugaa ggaagagga 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400〉 72 uccucuuccu ucauuucag 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 73 gaaaugaagg aagaggaga 19

<210> 74 <211〉 19 <212> RNA 第Π頁 201219041 i 入工序列 <220> <223>合成 <400> 74 ucuccucuuc cuucauuuc <210> 75 <211〉 19 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 75 gaacaguccu uaauccaga <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 76 ucuggauuaa ggacuguuc <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 77 gagagaugag cuuccuaca <210> 78 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉合成 <400> 78 uguaggaagc ucaucucuc <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 79 gagauauucc guaguacau <210> 80 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 80 auguacuacg gaauaucuc <210> 81 第12頁 201219041 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 81 gaggcagaga aaagagaaa <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 82 uuucucuuuu cucugccuc <210> 83 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 83 gauauuaaca ucacgucuu <210> 84 <211〉 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> S4 aagacgugau guuaauauc <210> 85 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 85 gcacacauuc cuuugaaau <210> 86 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 86 auuucaaagg aaugugugc <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 87 gcggaucaaa ccucaccaa 第13頁 201219041 <210> 88 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 88 uuggugaggu uugauccgc <210> 89 <211> 21 <212> RNA <213〉人工序列 <220> <223>合成 <400> 89 ugguuuacau gucgacuaau u <210> 90 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <221> misc_feature <222> 1 2~ <223> 2’ 0 曱基 <400> 90 acagcaaauu ccaucgugu <210> 91 <21i> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 91 agagauaaga gauagugua <210> 92 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 92 ugguuaacau gucgacuaa <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 93 uuagucgaca uguaaaccau u <210> 94 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列第14頁 201219041 <220> <223>合成 <400> 94 agagauaacu cauagugua <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>合成 <400> 95 aacacuuuga guuuucucuu u 第15頁

Claims

201219041 七、申請專利範圍： 1. 一種於體内降低VEGFA表現之方法，該方法包括投與對象siRNA，其中siRNA包含選自SEQIDNOs:2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、 54 ' 56、58、60、62、64、66、68、70、72 ' 74、76、 78、80、82、84、86、與 8 8 之序列。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中對象為哺乳動物。 3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中對象為人類。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中siRNA由17-30 個鹼基對長之雙鏈區與無突出端區、一個突出端區或兩個突出端區組成，其中各突出端區有6個或6個以下驗基。 5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中siRNA為具有 17-30個驗基對長的雙鏈區之shRNA。 6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中，siRNA包含： (a)—意義股、及(b)—反義股，其中該意義股及該反義股各為19-36個核苷酸長，及該反義股包含選自SEQ ID NOs: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、 72、74、76、78、80、82、84、86、與 88 之序列。 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中： 1 201219041 (a) 於該意義股内，位置1及2之核苷酸，且所有C核苷酸及所有U核苷酸具有2’-0-曱基修飾，及該意義股之所有其他核苷酸具有 2’OH基；及 (b) 於該反義股内，所有C核苷酸及所有U核苷酸具有2’氟基修飾，該反義股之所有其他核苷酸具有2’OH基，及該反義股位置1之核苷酸經5’磷酸化。 8. 根據申請專利範圍第7項之方法，其中反義股最3’之二鹼基為UU。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中反義股長度為 21個鹼基。 10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中意義股為19個鹼基長，且反義股及意義股形成19個鹼基對長之雙鏈區。 11. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中siRNA進一步包含連接於意義股3’端之膽固醇基團，且該膽固醇基團係經由C5連接子連接，及其中雙鏈區於意義股位置 6、13及19含有誤配，其中該等位置係相對於意義股之5’端而界定，及意義股不含5’突出端區。 12. 根據申請專利範圍第7項之方法，其中siRNA進一步包含連接於意義股3’端之膽固醇基團，且該膽固醇基團係經由C5連接子連接，及其中雙鏈區於意義股位置 6、13及19含有誤配，其中該等位置係相對於意義股 201219041 之5’端而界定，及意義股不含5’突出端區。 13. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中反義股為21 個驗基長。 14. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中意義股為19 個鹼基長，且反義股及意義股形成19個鹼基對長之雙鍵區。 15. 根據申請專利範圍第14項之方法，其中反義股包含 SEQ ID NO: 54。 16. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中於意義股内位置6、13、及19之該等誤配核苷酸與反義上相對核苷酸為相同驗基。 17. —種醫藥組成物，其包含治療有效量之siRNA，其中 siRNA包含： (a) 長度為19至36個鹼基之之反義股，其具有選自下述組成之組群之序列：SEQ ID NOs: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、 44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、 64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、 84、86、與 88， (b) 長度為19至36個鹼基之意義股，其中反義股及意義股形成17至30個鹼基對之雙鏈區，且該雙鏈區内至少75%互補。 18. 根據申請專利範圍第17項之醫藥組成物，其中雙鏈區 201219041 内，於6、13或19之一或多個位置有誤配，其中該等位置係相對於意義股之5’端而界定。 19. 根據申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其中於意義股内，位置1及2與所有C及U具有2’-OMe修飾，且意義股之所有其他位置具有2’-OH基，及其中反義股之所有C及U具有2’-氟基修飾，反義股之所有其他核苷酸具有2’-OH基，及反義股位置1之核苷酸經填酸化。 20. 根據申請專利範圍第19項之醫藥組成物，其中意義股為19個鹼基長，反義股為21個鹼基長，及反義股最3’ 之二鹼基為UU突出端。 21. 根據申請專利範圍第20項之醫藥組成物，其中膽固醇基團經由C5連接子連接於意義區之3’端。