TW201410700A - 快速純化大腸桿菌中重組蛋白幾丁聚醣酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種分離蛋白質之方法。詳言之，該方法是以選擇性沉澱法將雜蛋白固化沉澱，並留下目標蛋白的方法。尤其用以磷酸鹽類去除大腸桿菌的雜蛋白，有效分離重組蛋白幾丁聚醣酶的方法。本發明之方法經證實在無需合併其他純化方法之情況下，即可大幅增加重組蛋白幾丁聚醣酶的純度，達到快速、便捷、大量操作與降低成本的目的。
Description
本發明係關於一種分離蛋白質之方法，尤其是關於一種以選擇性沉澱法將基因重組後的宿主雜蛋白固化沉澱，而使重組蛋白以溶解態存在於溶液中的方法。
由於基因工程的成熟發展，使用基因重組的方式，將外來基因送入其他物種以進行蛋白質的大量生產，已經是一種廣泛應用且快速有效的方法。然而，由於宿主細胞內除了重組蛋白質之外，仍有許多宿主本身的蛋白質，所以須經由許多繁複的分離純化步驟，將重組蛋白質與宿主蛋白分離，增加許多製造過程的成本。
一般常用來分離純化蛋白質的方式包括：萃取、沉澱法、離子交換法、透析(dialysis)、膠體過濾法(gel filtration)、親合性層析法(affinity chromatography)、超過濾(ultrafiltration)、電泳法(electrophoresis)、離心法(centrifugation)等。依據酵素的特性，常常需要以多個純化步驟從粗萃取物中分離出目標重組蛋白質。然而，每個純化步驟不僅會增加製造成本，也可能使目標蛋白減損，使產率降低。因此，減少純化步驟是很重要的。
目前，親和性層析法是分離度極高的純化方法之一。一般而言，這類純化系統需要以融合蛋白質(fusion protein)的形式，將標記蛋白(Tag)連接於目標蛋白質之上，藉此標記蛋白提供在純化過程中的專一性結合，以單一管柱層析將目標蛋白分離出來。必要時，須再以特殊的酵素將標記蛋白與目標蛋白質截切、移除。然而，此方法的施行仍須要有專業昂貴的膠體管柱與試劑，加上處理容量低及操作不穩定等原因，尚未被廣泛應用在工業規模的酵素純化上。
沉澱法則是處理容量高、操作簡便與成本低廉的純化方法之一，常用來作為蛋白質濃縮或是初步分離的方法。此法主要是利用蛋白質溶解度特性的不同，以添加鹽類、極性或非極性溶液、聚合物、沉澱劑、
親和性配位基或是物理方法等，改變混合蛋白溶液中的離子強度、溫度、pH值等，使其產生沉澱的固相或是可溶性的液相而將之分離。其中較常用的方法包括：PEG沈澱法、三氯乙酸(TCA)沉澱法、丙酮沉澱法、酒精沉澱法與硫酸銨沈澱法等。
此類沉澱法中，三氯乙酸、丙酮與酒精沉澱法可有效沉澱蛋白質，但易造成蛋白質的不可逆變性現象而失去原有生物活性；反之，硫酸銨沈澱法可回復活性蛋白質(active form)，但分離率相對較差，需配合其他形式的純化方法，才得以獲得較純的蛋白質；此外，硫酸銨沈澱法在大量應用常會遭遇到氣體氨不當產生的困擾。
由於重組蛋白的不同特性，目前已有不少可產業利用的製備方式，例如：以酒精沉澱製備胜肽(US20100273983：Method of purifying peptides by selective precipitation)、以檸檬酸沉澱製備抗體(US8063189：Protein purification by citrate precipitation)。因此，適當的沉澱法可以是在產業上生產酵素的有效工序。
幾丁聚醣酶由於可做為生物防治以及應用在甲殼多醣的製備，其應用與需求近年來有日益增加的趨勢，然而，此酵素的大量生產仍是產業應用的最大瓶頸。
爰此，本發明揭露一種分離蛋白質之沉澱方法，藉由特定條件的磷酸緩衝液對大腸桿菌雜蛋白質的選擇性沉澱，可大量操作並有效去除宿主雜蛋白，留下目標重組蛋白--幾丁聚醣酶。
使用基因重組的方式，先將含目標重組蛋白的基因送入大腸桿菌以進行重組蛋白質的生產。大腸桿菌經繁殖及誘導生產之後，以100-800 mM pH 3-5之磷酸緩衝液處理菌體或胞內萃取物使其產生失活沉澱，再經離心工序，即可將大腸桿菌的雜蛋白去除，並留下重組蛋白--幾丁聚醣酶。以下較佳實施例並非完全表示本發明所能涵蓋之完全範圍。在此僅舉例解釋本發明。
現在參照以下非限制性實例說明本發明。該製程(如第1圖)包括以下步驟：
1、步驟1(培養基之備製)：Luria-Bertani培養基(LB medium)以滅菌釜高溫高壓滅菌。
2、步驟2(純種培養)：將單一菌落的重組大腸桿菌(指含有外來基因片段的重組大腸桿菌，如本發明實施例所採用之含有pET20b-csn質體之大腸桿菌BL21(DE3))接種至步驟1所製備的5 ml培養基內，並加入抗生素ampicillin至濃度達0.1 mg/ml。在攝氏37-42度下震盪培養12小時。
3、步驟3(菌株之繼代培養)：將步驟2之菌體轉移至100 ml LB-Amp medium於攝氏37-42度、培養4-8小時或分光光度計測菌體濃度達OD600nm吸光值至2.5。
4、步驟4(誘導培養)：轉移上述細菌細胞至500 ml LB-Amp medium(含1 mM IPTG)中，於攝氏37-42度培養2-4小時，或菌體濃度在OD600nm為2.0。
5、步驟5(取得菌體)：將上述培養菌液離心(8,400 g，10 min，4℃)獲得菌體。
6、步驟6(懸浮、破菌與選擇性沉澱)：以25 ml 300 mM磷酸緩衝液懸浮、超音波破菌、離心(8,400 g，20 min，4℃)，上層液即為可溶的重組蛋白質。
在步驟6中，不同溶液的濃度與pH值對此發明分離出重組蛋白幾丁聚醣酶(分子量約27 kDa)之影響如第2至第5圖所示。第2圖與第3圖為300 mM磷酸緩衝液pH值3.0至8.0進行選擇性沉澱影響後上清液之分析結果；由此實驗可看出，磷酸緩衝液pH越低，上清液所獲得的蛋白質濃度越低，酵素活性略為下降，表示目標蛋白質純度越高，並在pH 4.5時會得到一最大比活性。第4圖與第5圖則為不同濃度的pH 4.5磷酸緩衝液對選擇性沉澱影響之分析結果；結果顯示，磷酸緩衝液濃度越高，上清液所獲得的蛋白質濃度越低，酵素活性略為
下降，表示目標蛋白質純度越高，並在350 mM之後得到一穩定的最大比活性。
當利用300 mM pH 4.5的磷酸緩衝液對500 ml大腸桿菌進行選擇性沉澱可得重組蛋白幾丁聚醣酶的純度至80%以上。
M‧‧‧蛋白質分子量標準品
C‧‧‧誘導生產重組蛋白之大腸桿菌全蛋白
■‧‧‧實驗組的蛋白質濃度
◆‧‧‧實驗組的酵素活性
▲‧‧‧實驗組的比活性
□‧‧‧對照組的蛋白質濃度
◇‧‧‧對照組的酵素活性
△‧‧‧對照組的比活性
第1圖 快速純化大腸桿菌中重組蛋白幾丁聚醣酶流程圖。
3：純種培養含有重組質體之菌體(如實施例步驟2與步驟3)；4：大量培養含有重組質體之菌體並以IPTG誘導其生產幾丁聚醣酶(如實施例步驟4)；5：施以離心工序以回收菌體(如實施例步驟5)；6A：加入磷酸緩衝液(如實施例步驟6)；6B：超音波破菌；6C：離心；SS：離心後之上清液，亦即為可溶的目標蛋白所在；P：離心後大腸桿菌雜蛋白之沉澱物。
第2圖 不同pH值的300 mM磷酸緩衝液對選擇性沉澱影響之SDS-PAGE分析圖
M：蛋白質標準品；C：對照組，菌體以20 mM、pH 7.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱的上清液；1：菌體以pH 3.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；2：菌體以pH 4.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；3：菌體以pH 4.5磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；4：菌體以pH 5.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；5：菌體以pH 6.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；6：菌體以pH 7.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；7：菌體以pH 8.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液。
第3圖 磷酸緩衝液pH值對選擇性沉澱影響之量化分析圖。
■：以20-800 mM、pH 4.5磷酸緩衝液做選擇性沉澱後，上清液的蛋白質濃度；◆：以20-800 mM、pH 4.5磷酸緩衝液做選擇性沉澱後，上清液的相對酵素活性；▲：以20-800 mM、pH 4.5磷酸緩衝液做選擇性沉澱後，上清液的比活性(U/mg)。
□、◇、△分別為對照組的濃度、相對活性(原始酵素活性122 U/ml)以及比活性。
第4圖 pH 4.5磷酸緩衝液濃度對選擇性沉澱影響之SDS-PAGE分析圖。
M：蛋白質標準品；C：對照組，以20 mM、pH 7.0磷酸緩衝液處理的上清液。
1：菌體以20 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；2：菌體以100 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；3：菌體以200 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；4：菌體以250 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；5：菌體以300 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；6：菌體以350 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；7：菌體以400 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；8：菌體以500 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；9：菌體以600 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；10：菌體以700 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液；11：菌體以800 mM磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液。
第5圖 緩衝液濃度對選擇性沉澱影響之量化分析圖。
■：以20-800 mM、pH 4.5磷酸緩衝液做選擇性沉澱後，上清液的蛋白質濃度；◆：以20-800 mM、pH 4.5磷酸緩衝液做選擇性沉澱後，上清液的酵素活性；
▲：以20-800 mM、pH 4.5磷酸緩衝液做選擇性沉澱後，上清液的比活性(U/mg)。
□、◇、△分別為對照組的濃度、相對活性(原始酵素活性122 U/ml)以及比活性。
不同pH值的300 mM磷酸緩衝液對選擇性沉澱影響之SDS-PAGE分析圖
M‧‧‧蛋白質標準品
C‧‧‧對照組，菌體以20 mM、pH 7.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱的上清液
1‧‧‧菌體以pH 3.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液
2‧‧‧菌體以pH 4.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液
3‧‧‧菌體以pH 4.5磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液
4‧‧‧菌體以pH 5.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液
5‧‧‧菌體以pH 6.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液
6‧‧‧菌體以pH 7.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液
7‧‧‧菌體以pH 8.0磷酸緩衝液進行選擇性沉澱後的上清液
Claims (7)
- 一種分離純化蛋白質之方法，包含以下的步驟：a.)提供一重組大腸桿菌(指含有外來基因片段的重組大腸桿菌)；b.)將誘導生產重組蛋白後的重組大腸桿菌菌體，以鹽類溶液懸浮；c.)利用超音波破菌；d.)過濾雜質藉以取得目標蛋白。
- 如專利申請範圍第1項所述之方法，其中步驟b之鹽類溶液為100-800 mM，pH 3-5之磷酸鹽溶液。
- 如專利申請範圍第1項所述之方法，其中步驟c可以為其他破菌方法，如冷凍/解凍、化學法、酵素法、高壓法等。
- 如專利申請範圍第1項所述之方法，其中步驟b、c可同時進行。
- 如專利申請範圍第1項所述之方法，其中步驟d可以為離心法、沉降法、過濾法等固液分離方法。
- 如專利申請範圍第1項所述之方法，其中步驟d的目標蛋白可以為幾丁聚醣酶、幾丁質酶、胃蛋白酶、10個胺基酸以內的短鏈胜肽、70個胺基酸以內的聚胜肽、胰蛋白酶、脂肪分解酶、轉氨酶、葡萄糖氧化酶、超氧歧化酶、酪胺酸氧化酶、纖維素水解酶、玻尿酸分解酶、耐酸性酵素等。
- 如專利申請範圍第3項所述之磷酸鹽溶液，可以為鉀鹽、鈉鹽或鉀鈉鹽混合之磷酸鹽溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101133239A TW201410700A (zh) | 2012-09-12 | 2012-09-12 | 快速純化大腸桿菌中重組蛋白幾丁聚醣酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101133239A TW201410700A (zh) | 2012-09-12 | 2012-09-12 | 快速純化大腸桿菌中重組蛋白幾丁聚醣酶的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201410700A true TW201410700A (zh) | 2014-03-16 |
Family
ID=50820719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| TW101133239A TW201410700A (zh) | 2012-09-12 | 2012-09-12 | 快速純化大腸桿菌中重組蛋白幾丁聚醣酶的方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TW201410700A (zh) |
-
2012
- 2012-09-12 TW TW101133239A patent/TW201410700A/zh unknown
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