JPH0771507B2 - 細菌からの顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子の抽出 - Google Patents

細菌からの顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子の抽出

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JPH0771507B2
JPH0771507B2 JP63503997A JP50399788A JPH0771507B2 JP H0771507 B2 JPH0771507 B2 JP H0771507B2 JP 63503997 A JP63503997 A JP 63503997A JP 50399788 A JP50399788 A JP 50399788A JP H0771507 B2 JPH0771507 B2 JP H0771507B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子
〔granulocyte/macrophage colony stimulating factor
（GM−CSF）〕をGM−CSF発現細菌から抽出する方法に関
する。
顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子は感染症お
よび癌に対する有効な治療薬であると考えられる。GM−
CSFの臨床試験および広範な使用は、十分量の材料を入
手することができず、天然源からGM−CSFを得るために
多大な経費を要するため遅れている。組換えDNA法を採
用して、GM−CSFを発現しうる細菌が形成された。たと
えば、デラマーター（DeLamarter）ら、EMBO J.,4,2575
−2581（1985）を参照されたい。この種の細菌の発酵に
よれば、天然のGM−CSF源を用いた場合より実質的に低
い価格で十分な量のGM−CSFが得られると期待される。
しかしGM−CSFを臨床的に用いるのにはGM−CSF発現細菌
の細胞成分または細菌破片により汚染されていない高純
度の材料が必要とされる。この種の不純物による汚染は
不都合な反応を生じるか、または再現性のない試験結果
を与える可能性がある。従ってGM−CSF発現細菌の細胞
から臨床用として十分なほど高い純度および収率でGM−
CSFを抽出することが主要な課題である。
発明の要約 本発明は、GM−CSF含有細菌細胞の懸濁液を酸および増
強剤で（enhancing agent）で、またはそれ自体が増強
剤である酸で処理し、実質的にすべての懸濁媒を細胞か
ら分離および廃棄し、処理済み細胞の第２懸濁液を調製
し、第２懸濁液を中和し、GM−CSF含有液を懸濁した細
胞から分離することによりGM−CSFをGM−CSF発現細菌か
ら高い収率および純度で抽出しうるという知見に基づ
く。本発明方法によればGM−CSFが細胞表面を機械的に
または酵素的に破壊する必要なしに細胞から得られる。
本発明方法は細胞成分による汚染を著しく減少させる様
式でGM−CSFを回収することができ、後続の精製がより
容易であり、経費がより低い。
死滅工程で用いる酸に、特定のpHで死滅を高め、かつ好
ましくは細胞からのGM−CSFの脱出を補助する“増強
剤”を補給する。
前記の節において“中和する”という語は、第２懸濁液
をほぼ中性（たとえばpH6.0〜8.0）または弱アルカリ性
（たとえば約pH9.0まで）となすことを意味する。
図面の簡単な説明 第１図はプラスミドpAKG−151の構成地図である。
詳細な説明 本発明は、GM−CSFをGM−CSF発現細菌細胞から抽出する
方法であって、 （ａ） GM−CSF含有細菌細胞の懸濁液を酸および増強
剤で、またはそれ自体が増強剤である酸で処理し； （ｂ） 実質的にすべての懸濁媒を処理済み細胞から除
去し； （ｃ） 処理済み細胞の第２懸濁液を調製し； （ｄ） 第２懸濁液を中和し；そして （ｅ） 懸濁した処理済み細胞からGM−CSF含有液を分
離する ことよりなる方法を提供する。
本発明方法を実施する際には、GM−CSF発現細胞の懸濁
液に酸を添加して、pHを細胞にとって致死的な値、すな
わち約1.5〜3.0、好ましくは約2.0〜2.2に調整する。本
発明に使用できる適切な酸の例は塩酸，硝酸，リン酸お
よび硫酸である。リン酸が好ましい酸である。
pH3.0の酸のみでも細菌を死滅させるが、完全な死滅に
必要な低いpH（pH1.5にまで低下した）は変性または分
解（たとえば脱アミノ化）によってGM−CSFに損傷を起
こす可能性がある。しかし“増強剤”を用いると、より
高いpH、たとえば特に2.0〜2.2において細菌を完全に死
滅させることができ、この場合GM−CSFに対する損傷の
可能性ははるかに低い。遺伝子工学的に処理された微生
物の抑制を保証するのには、この段階ですべての細菌を
死滅させることがきわめて好ましい。
増強剤自体が酸、たとえばトリクロロ酢酸であってもよ
く、その場合これは死滅工程で用いられる唯一の酸であ
ってもよい。
増強剤の使用は細菌細胞の死滅を補助するだけでなく、
抽出されたGM−CSFの収率を改善するのに役立つことが
多い。適切な増強剤の例にはケイオトロープ イオン
（chaotropic ion）（またはそれらを供与する化合
物）、たとえばトリクロロ酢酸，過塩素酸塩，チオシア
ネートおよびグアニジニウム；非ケイオトロープ塩、た
とえば塩化ナトリウム，リン酸ナトリウム；および非イ
オン性ケイオトロープ類、たとえば尿素が含まれる。ケ
イオトロープイオンが好ましい増強剤である。トリクロ
ロ酢酸はきわめて好ましい増強剤である（細胞密度、pH
および塩組成などの変数に応じて約0.1〜2.0M）。
増強剤がケイオトロープイオンである場合、これはケイ
オトロープ塩、たとえばチオシアン酸ナトリウムもしく
は塩化グアニジウムとして、またはケイオトロープ酸、
たとえばトリクロロ酢酸もしくは過塩素酸として添加す
ることができる。ケイオトロープ酸を用いる場合、他の
酸の使用はより少量であるか、または不必要である。
本発明方法の酸化工程の一形態においては、リン酸を懸
濁液に添加してpHを約４〜５、好ましくは4.5に低下さ
せ、次いでトリクロロ酢酸を添加してpHを約2.0に低下
させる。
温度が低すぎる場合、細菌は酸処理中に十分な速度で死
滅しないであろう。温度が高すぎると、GM−CSFが変化
する可能性がある。酸処理のための温度範囲は約10〜約
40℃、好ましくは約25℃とすべきである。
細胞懸濁液を酸で、また増強剤で処理したのち、本発明
方法の後続工程はすべて約０〜約40℃、好ましくは０〜
４℃の温度で行われる。
細菌細胞を死滅させるために細胞懸濁液を酸（および増
強剤）で処理したのち、ミクロ炉過、遠心分離などによ
り、好ましくは遠心分離により細胞を処理液から分離
し、緩衝剤水溶液または水に再懸濁する。ペレットの再
懸濁に使用しうる緩衝剤の例はリン酸ナトリウム，リン
酸カリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン塩酸塩である。好ましい緩衝剤はリン酸ナトリウム
および特にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩
酸塩である。
細胞懸濁液をpH約6.0〜9.0、好ましくは7.2〜7.6に中和
する。中和工程で使用できる適切な塩基の例は水酸化ナ
トリウム，水酸化カリウムなどである。
組換えDNA法によりGM−CSFを産生すべく変化させること
ができ、次いで本発明方法によりそれからGM−CSFを抽
出しうる細菌の例は大腸菌（E.coli），枯草菌（Bacill
us subtilis），ストレプトミセス，ケリカラー（Strep
tomyces coelicolor）などである。好ましい細菌は大腸
菌である。
本発明方法は、種々の形のGM−CSF、たとえばヒトGM−C
SF〔リー（Lee）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,4
060−4064（1985）〕、またはネズミGM−CSF〔バーゲス
（Burgess）ら、J.Biol.Chem.,Vol.252,1988−2033（19
77）〕を発現する細菌について利用できる。
以下の例は本発明を詳細に説明するものである。当業者
には本発明の目的および意図から逸脱することなく材料
および方法を変更しうることは明らかであろう。
実施例 この例で用いたヒトGM−CSF発現プラスミドpAKG−151は
約3800塩基対からなり、下記の配列を含む（第１図参
照）： （ａ） ompAシグナル配列に結合した二重タンデムプロ
モーターlpp/lac;グラエブ（Ghrayeb）ら、EMBO J.,Vo
l.3（10）,2437−2442（1984）。
（ｂ） 成熟Hu−GM−CSFのコード配列；リー（Lee）
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,4360−4364（1985
年７月）。このコード配列の５´末端はompAシグナルコ
ード配列の３´末端に融合している。
（ｃ） lacリプレッサーの発現に関するlac i遺伝子；
ファラボーグ（Farabaugh）,Nature,Vol.274,765−769
（1978年８月24日）。
（ｄ） プラスミドpVU208から誘導された温度感受性レ
プリコン、rep cop Ts;ハッカート（Hakkart）ら、Mol.
Gen.Genet.;Vol.183,326−332（1981）。
（ｅ） アミノグリコシド−３´−ホスホトランスフェ
ラーゼIIの発現に関するkanr遺伝子；ベック（Beck）
ら、Gene19,327−336（1982）。
プラスミドpAKG−151を宿した大腸菌294株の培養を２
のバフル付き振とうフラスコに入れた200mlのブロス中
で30℃において行う。ブロスは30g/のカゼイン水解
物、20g/の酵母エキス、20g/のグリセリン、10mg/
のカナマイシン、5g/のKH2PO4、1g/のMgSo4・7H2
O、0.1ml/の消泡剤、および水からなる。水酸化ナト
リウムにより初期pHを7.0に調整する。培養物の細胞濃
度が約４の光学濃度単位（光路1cm,660μｍ）に達する
まで撹拌する。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド0.4mMを添加し、約３時間発酵を続け、光学濃度単位
約９の細胞濃度を達成する。次いで85％リン酸を添加し
てpH4.0となしたのち、50％トリクロロ酢酸を添加してp
H2.0となす。酸性化した懸濁液を30℃で１時間撹拌し、
懸濁液を遠心分離し、上澄液を廃棄し、細菌ペレットを
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH8.5またはトリス・HCl
緩衝液、pH8.5に再懸濁する。得られた懸濁液のpHを1N
水酸化ナトリウムでpH7.0〜7.5に調整する。この中性懸
濁液の最終バイオマス濃度を光学濃度単位約30の未処理
培養物に対応すべく調整する。中性懸濁液を４℃で30分
間撹拌し、遠心分離し、ペレットを廃棄する。上澄液は
抽出された組換えヒト顆粒球・マクロファージ・コロニ
ー刺激因子（GM−CSF）を含有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−70984（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．４，Ｎｏ．12（1986）Ｐ．1078−1082 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖ ｏｌ．４，Ｎｏ．10（1985）Ｐ．2575− 2581 Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．69，Ｎｏ．１ （1987．１）Ｐ．43−51

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因
    子（GM−CSF）をGM−CSF発現細菌細胞から抽出する方法
    であって、 （ａ） GM−CSF含有細菌細胞の懸濁液を酸でpH約1.5〜
    3.0に処理し、その際、酸の細胞死滅効果は、“増強
    剤”すなわち特定のpHにおける死滅を増大させる薬剤の
    使用によって高められ、該増強剤が酸と組み合わせて、
    またはそれ自体が酸である場合は単独で使用され、そし
    て該増強剤はカオトロピックイオン、非カオトロピック
    塩または尿素であり； （ｂ） 実質的にすべての懸濁媒を細胞から除去し； （ｃ） 処理済み細胞の第２懸濁液を調製し； （ｄ） 第２懸濁液を中和し；そして （ｅ） 懸濁した細胞からGM−CSF含有液を分離する ことよりなる方法。
  2. 【請求項２】工程（ａ）の懸濁液がpH約2.0〜2.2に酸性
    化される、請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】工程（ａ）の懸濁液が塩酸、硝酸、硫酸、
    または好ましくはリン酸で処理される、請求の範囲第１
    項に記載の方法。
  4. 【請求項４】カオトロピックイオンが過塩素酸塩、チオ
    シアネート、グアニジニウム、および特にトリクロロア
    セテートから選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】非カオトロピック塩が塩化ナトリウムおよ
    びリン酸ナトリウムから選ばれる、請求の範囲第１項に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】工程（ａ）が約10〜40℃、好ましくは約25
    ℃の温度で行われる、請求の範囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】第２懸濁液が水酸化ナトリウムで中和され
    る、請求の範囲第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】第２懸濁液がpH約６〜９、好ましくは約7.
    2〜7.6に中和される、請求の範囲第１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】工程（ｂ）〜（ｅ）が約０〜40℃、好まし
    くは約０〜４℃の温度で行われる、請求の範囲第１項に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】細胞が枯草菌、ストレプトミセス・ケリ
    カラー、および特に大腸菌から選ばれる、請求の範囲第
    １項に記載の方法。
JP63503997A 1987-05-11 1988-05-11 細菌からの顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子の抽出 Expired - Lifetime JPH0771507B2 (ja)

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DE (1) DE3869195D1 (ja)
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