TW480285B - Enzyme for converting a precursor of a polypeptide into the active form that induces IFN-γ production, the process therefor, and the uses thereof - Google Patents
Enzyme for converting a precursor of a polypeptide into the active form that induces IFN-γ production, the process therefor, and the uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- TW480285B TW480285B TW086110174A TW86110174A TW480285B TW 480285 B TW480285 B TW 480285B TW 086110174 A TW086110174 A TW 086110174A TW 86110174 A TW86110174 A TW 86110174A TW 480285 B TW480285 B TW 480285B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- asp
- ser
- lys
- glu
- lie
- Prior art date
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 title abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 153
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 39
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 33
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 claims description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 6
- XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N Asp-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N 0.000 claims description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 4
- BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N Arg-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 4
- OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 4
- UYCPJVYQYARFGB-YDHLFZDLSA-N Asn-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UYCPJVYQYARFGB-YDHLFZDLSA-N 0.000 claims description 4
- SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N 0.000 claims description 4
- RJONUNZIMUXUOI-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RJONUNZIMUXUOI-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 4
- XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 4
- NPMSEUWUMOSEFM-CIUDSAMLSA-N Glu-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N NPMSEUWUMOSEFM-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 4
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 4
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 4
- RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N 0.000 claims description 4
- NRQRKMYZONPCTM-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NRQRKMYZONPCTM-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 4
- KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N Lys-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims description 4
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 claims description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JWQWPTLEOFNCGX-AVGNSLFASA-N Phe-Glu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWQWPTLEOFNCGX-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 4
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 claims description 4
- AXOHAHIUJHCLQR-IHRRRGAJSA-N Ser-Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N AXOHAHIUJHCLQR-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 4
- XVWDJUROVRQKAE-KKUMJFAQSA-N Ser-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=CC=C1 XVWDJUROVRQKAE-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 4
- OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N Tyr-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims description 4
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 claims description 4
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 claims description 4
- XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 3
- MUZAUPFGPMMZSS-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N MUZAUPFGPMMZSS-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 3
- NTBDVNJIWCKURJ-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NTBDVNJIWCKURJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims description 3
- XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims description 3
- NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N Glu-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 claims description 3
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 3
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 3
- LQTGGXSOMDSWTQ-UNQGMJICSA-N Met-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O LQTGGXSOMDSWTQ-UNQGMJICSA-N 0.000 claims description 3
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101800001442 Peptide pr Proteins 0.000 claims description 3
- BNBBNGZZKQUWCD-IUCAKERBSA-N Pro-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 BNBBNGZZKQUWCD-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 3
- FHZJRBVMLGOHBX-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O FHZJRBVMLGOHBX-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 3
- OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 3
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 3
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 3
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 claims description 3
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 claims description 3
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 claims description 3
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 claims description 3
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 3
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MAZZQZWCCYJQGZ-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MAZZQZWCCYJQGZ-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N Ala-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OMSKGWFGWCQFBD-KZVJFYERSA-N 0.000 claims description 2
- PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)CN=C(N)N PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 2
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 2
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N Asp-Leu-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HKEZZWQWXWGASX-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 2
- LKVKODXGSAFOFY-VEVYYDQMSA-N Asp-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LKVKODXGSAFOFY-VEVYYDQMSA-N 0.000 claims description 2
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- UHVIQGKBMXEVGN-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UHVIQGKBMXEVGN-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 2
- DWUKOTKSTDWGAE-BQBZGAKWSA-N Gly-Asn-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DWUKOTKSTDWGAE-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 2
- WZOGEMJIZBNFBK-CIUDSAMLSA-N His-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WZOGEMJIZBNFBK-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 claims description 2
- KVRKAGGMEWNURO-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KVRKAGGMEWNURO-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims description 2
- DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 2
- MGKFCQFVPKOWOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N MGKFCQFVPKOWOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- DTICLBJHRYSJLH-GUBZILKMSA-N Met-Ala-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DTICLBJHRYSJLH-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- KYXDADPHSNFWQX-VEVYYDQMSA-N Met-Thr-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O KYXDADPHSNFWQX-VEVYYDQMSA-N 0.000 claims description 2
- KXUZHWXENMYOHC-QEJZJMRPSA-N Phe-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXUZHWXENMYOHC-QEJZJMRPSA-N 0.000 claims description 2
- DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N 0.000 claims description 2
- DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- WSRWHZRUOCACLJ-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 WSRWHZRUOCACLJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 2
- RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N Pro-Thr-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N 0.000 claims description 2
- CTRHXXXHUJTTRZ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O CTRHXXXHUJTTRZ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 2
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 2
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CO XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- ZRSZTKTVPNSUNA-IHRRRGAJSA-N Val-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O ZRSZTKTVPNSUNA-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 2
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 claims 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N Ala-Met-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- SYAUZLVLXCDRSH-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N SYAUZLVLXCDRSH-IUCAKERBSA-N 0.000 claims 1
- YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Pro Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 1
- MUWDILPCTSMUHI-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)O MUWDILPCTSMUHI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 1
- JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims 1
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 claims 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 claims 1
- HBGFEEQFVBWYJQ-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HBGFEEQFVBWYJQ-KBPBESRZSA-N 0.000 claims 1
- CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N 0.000 claims 1
- QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N Pro-Gly-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N 0.000 claims 1
- DRKAXLDECUGLFE-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O DRKAXLDECUGLFE-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 1
- IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N Pro-Val-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N 0.000 claims 1
- WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 1
- HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N Tyr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O HVHJYXDXRIWELT-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims 1
- SJLVYVZBFDTRCG-DCAQKATOSA-N Val-Lys-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N SJLVYVZBFDTRCG-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 claims 1
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 claims 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 claims 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 claims 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 claims 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 244000309466 calf Species 0.000 description 10
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 10
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 3-chloroaminopropyl Chemical group 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- LPIARALSGDVZEP-SJVNDZIOSA-N (3s)-3-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LPIARALSGDVZEP-SJVNDZIOSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 2
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 2
- AEELXMHQIJJMKP-QWWZWVQMSA-N (2r,3r)-3-sulfanylbutane-1,2,4-triol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](S)CO AEELXMHQIJJMKP-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N Ala-Glu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N VBRDBGCROKWTPV-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N Ala-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N FSHURBQASBLAPO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N Asn-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- TWXZVVXRRRRSLT-IMJSIDKUSA-N Asn-Cys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TWXZVVXRRRRSLT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 101100285688 Caenorhabditis elegans hrg-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N Gly-Asp-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IWAXHBCACVWNHT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PFMUCCYYAAFKTH-YFKPBYRVSA-N Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN PFMUCCYYAAFKTH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OCRQUYDOYKCOQG-IRXDYDNUSA-N Gly-Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OCRQUYDOYKCOQG-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- BTSXLXFPMZXVPR-DLOVCJGASA-N Lys-Ala-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N BTSXLXFPMZXVPR-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IHITVQKJXQQGLJ-LPEHRKFASA-N Met-Asn-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N IHITVQKJXQQGLJ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- MSSXKZBDKZAHCX-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MSSXKZBDKZAHCX-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001100 Polydextrose Polymers 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-UHFFFAOYSA-N Polydextrose Polymers OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- YMDNFPNTIPQMJP-NAKRPEOUSA-N Ser-Ile-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O YMDNFPNTIPQMJP-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- ZZGPVSZDZQRJQY-ULQDDVLXSA-N Val-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O ZZGPVSZDZQRJQY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SJRUJQFQVLMZFW-WPRPVWTQSA-N Val-Pro-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O SJRUJQFQVLMZFW-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N alpha-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- OONHJKCKWRTEBL-UHFFFAOYSA-N chlorosulfonyloxymethylbenzene Chemical compound ClS(=O)(=O)OCC1=CC=CC=C1 OONHJKCKWRTEBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- KVJXEJFFQNSORF-UHFFFAOYSA-L disodium acetic acid diacetate Chemical compound [Na+].[Na+].CC(O)=O.CC(O)=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O KVJXEJFFQNSORF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-O ethylaminium Chemical compound CC[NH3+] QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical group I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000001259 polydextrose Substances 0.000 description 1
- 229940035035 polydextrose Drugs 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N trifluralin Chemical compound CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O ZSDSQXJSNMTJDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 B7 五、發明說明（1 ) 本發明係關於一種處理多肽所用的酵素，更詳言之， 係關於一種將誘使在免疫力充份的細胞裡產生干擾素-γ (以 •下縮寫成” I F Ν - γ")之多肽前驅物轉化成活性形式的酵素 〇 先Α技藝的描述 本發明人成功地單離在免疫力充份的細胞裡產生 I F N - γ之多肽和編碼多肽的cDNA ，並且將其揭示在日 本專利公開案第27，1 89/96號和第1 93,098/96號。 多肽的特徵在於致使當做生物活性有用物質的製造， 藉由殺手細胞增強細胞毒性，和致使殺手細胞形成；可以 預期當做抗病毒劑、防腐劑、抗腫瘤劑和抗免疫劑使用。 據說，在人類的細胞裡，由基因表現而形成的多肽可 能被細胞內的酵素處理而部份地消化和將糖鏈加入其中。 要滿意地倂入製藥內的多肽可能要像人類細胞裡一般 地處理；如此的細胞具有較少目前製得多肽的缺點，如日 本專利申請案第269,1 05/96所揭示。本發明人致力地硏究 ，發現目前的多肽通常以前驅物形式存在於人類細胞裡， 分子量通常大約2f4,000道耳頓而且沒有生物活性。雖然不 限於目前的多肽，但一般知道大多數的組織介素通常以不 具生物活性的前驅物製得，然後藉由細胞之內的酵素處理 轉化成其活性形式。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -· I i l in ϋ I n 一--口’ a an n n n n I n I 赢 -4- 480285 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（2 ) 發明槪沭 以上述觀點觀之，本發明之第一目的係提供一種酵素 ’該酵素對多肽的前驅物作用，誘使在免疫力充份的細胞 •裡產生I F N - γ，以將前驅物轉化成誘使在免疫力充份的 細胞裡產生I F Ν - γ之活性形式。 本發明之第二目的係提供一種製造酵素的方法。 本發明之第三目的係提供一種將前驅物轉化成誘使在 免疫力充份的細胞裡產生I F Ν - γ之活性形式的方法。 本發明人致力於硏究達成目的並且發現一種從類細胞 株單離的酵素，該酵素對多肽的前驅物作用，.將前驅物轉 化成誘使在免疫力充份的細胞裡產生I F Ν - γ之活性形式 。他們確定酵素可以從人工增殖的細胞，尤其是人類紅細 胞生成素細胞製得，而且完成本發明。 本發明之第一目的係藉由一種將前驅物轉化成誘使在 免疫力充份的細胞裡產生I F Ν - γ之活性形式的酵素而達 成。 本發明之第二目的係製造酵素的方法而達成，該方法 包括培養在營養培養培養基中產生酵素之細胞，以及從所 得的培養物收集製得的酵素。 本發明之第三目的係藉由多肽轉化方法而達成，該方 法包括使酵素與前驅物接觸以將前驅物轉化成活性形式的 步驟。 ’ 所附圖式的簡單說明 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .1
訂---------線I -5- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 Α7 Β7 五、發明說明（3 ) 圖1係爲包含編碼本發明多肽前驅物之cDNA的重組 DNA pRCHuGF 結構。 圖2係爲一種顯不在螢幕上並爲Western Blotting看得 •見之凝膠電泳圖型的中間圖式，其顯示在本發明多肽前驅 物轉化成活性形式期間隨時間的變化。 在圖式裡，"PCMV"係表示細胞巨化病毒促進劑；而 "HUIGIF"係表示編碼本發明多肽前驅物的cDNA。 發明內容的詳細描述 如上所述，本發明係以發現將多肽前驅物轉化成誘使 在免疫力充份的細胞裡產生I F N - r之活性形式的酵素 而完成。本發明所稱的前驅物具有分子量大約2 4，0 0 0道耳 頓（以SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)在還原劑存在下 分析而得），而且以例如能夠產生多肽和藉由導入DNA，例 如具SEQ ID:5號之核苷酸序列包含編碼多肽的DNA轉化成 哺乳動物宿主細胞的形式存在。如此的前驅物在N終端區 域裡包含部份或全部SEQ ID:1號胺基酸序列，以及全部包 含所有SEQ ID:2號胺基酸序列（其中符號"Xaa"係爲"異 亮胺酸"或"蘇胺酸"）而且具有分子量1 8,000 - 1 9,500道 耳頓（以SDS-PAGE;在還原劑存在下分析而得）。 本發明所稱的酵素包括天然和人工製造的酵素，只要
* S 其製得誘使I F N - γ在免疫力充份的細胞裡產生的活性形 式而不限制特定起源和來源。可得自人類造血紅細胞生成 素細胞的本發明酵素通常具有下列物化性質： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —.-------—--------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -6- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 ____B7____ 五、發明說明（4 ) (1)分子量 顯示以SDS-PAGE分析的分子量約爲25,000和約 1 0,000道耳頓； . (2)部分胺基酸序列 具有一選自一群包括SEQ ID:4號的胺基酸序列（其中 符號"Xaa"係爲"異亮胺酸π或"蘇胺酸"）和SEQ ID:5號； 及 (3)抑制劑 由乙醯基門冬氨醯-L-谷醯基-L-二乙基戊醯胺- L- 天冬小酸（以下簡稱爲“Ac-YVAD-CHO”）及碘乙醯胺進行抑制 〇 酵素可以利用本發明方法使用細胞當做來源而製得。 任何天然細胞和人工所得的細胞株及來自天然細胞的轉形 細胞（t r a n s f 〇 r m a n t)可以當做來源。這些細胞株及轉形細胞 係特別有用於實施本發明。前者可以藉由從例如淋巴母細 胞、淋巴瘤、單核母細胞、單核細胞、骨髓母細胞、骨髓 細胞、顆粒性白細胞、巨噬細胞等人類造血細胞；包括例 如頷下腺癌、肺癌、巨大腸癌和結腸癌等腫瘤的表皮細胞 ;神經胚細胞和間質細胞建立而得。每個細胞株的例子爲 HBL-38 細胞、HL」60 細胞（ATCC CCL240)、K-562 細胞（ ATCC CCL243)、KG-1 細胞（ATCC CCL246)、Mo 細胞（ ATCC CRL8066)、THP-1 細胞（ATCC TIB202)和 U-937 細胞（ ATCC CRL1593.2)，如 Jun MINOWADA 在“癌症評論’’第 10 冊第1 - 1 8頁（1 9 8 8 )，從包括骨髓白血病、前骨髓細胞白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公嫠） · --------訂---------線·* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 480285 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7____ 五、發明說明（5 ) 血病、單核細胞、成人T -細胞白血病、頭髮細胞白血病 及其突變體等白血病和淋巴瘤衍生。因爲所有的這些細胞 株容易增殖並且高產率地產生本發明的多肽，所以其可以 •有利地用於本發明。尤其，例如HBL-38細胞、HL-60細胞 、KG-1細胞、THP-1細胞和U-937細胞等人類骨髓單核細 胞株係產率極高地產生本發明多肽。因此，其可以有利地 用於本發明。 上述的細胞株轉形細胞可以藉由將改由上述細胞株所 得編碼本發明多肽的DNA導入適當的哺乳動物宿主細胞。 如此宿主細胞的例子是表皮菌細胞株、間質細胞株、神經 母細胞株、造血細胞株，其係源自人、猴子、老鼠和倉鼠 而且照慣例當做宿主，例如包括3T3-細胞（ATCC CCL92) ，C127L 細胞(ATCC CRL 1616)，CH〇-K 1 細胞（ATCC CCL 61)，CV-1 細胞（ATCC CCL 70)，COS-1 細胞（ ATCC CRL 1 650)，海拉氏細胞（ATCC CCL 2)， M〇P-8細胞（ATCC CRL 1 709)及其變體細胞。將改酵素爲密 碼的DNA導入宿主細胞內的方法包括傳統的DEAE-聚葡萄 糖方法’磷酸耗方法，電穿孔法，電感法（·:Πρ〇£6(：Ηοη ) ，微生物注射和使用逆錄病毒，腺病毒，泡疹病毒和牛痘 病毒之病毒感染方'·法。在該情況裡，可以使用例如PCD， pcDL-SRa，pKY4，pCDM8，pCEV4，pME 18S 和 pSV2_gpt ，包括適當促進劑、增強劑、複製源、終端位置、接合序 列、聚腺苷酸作用序列及選擇記號物的載體。被觀察產生 活性形式的純系係藉由應用菌落雜交方法或在營養培養培 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —：------------------訂---------線·· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -8 - 480285 A7 B7 五、發明說明（6 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 養基裡培養之後從轉形細胞挑選所要的純系來選擇。使用 哺乳動物宿主細胞的重組DNA技術係詳細地揭示在"likken -Igaku-Bessatsu-Salbo-KogakuHandbook"Toshio KUROKI, 'Masaru TANIGUCHI 和 Mitsuo OSHIMURA (1992)編輯和 在"Jikken-Igaku-Bessatsu-Biomaterial Series 3，Genetic Cloning Experimental Method11，Takashi Y〇KOTA 和 Kenichi ARAI編輯，Yodo出版者編輯，日本東京（1 993 )。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的方法包括使製造酵素的細胞增殖和從已增殖 的細胞收集所製得的酵素。至於增殖細胞株的方法，不特 別地限制而且包括通常用於該領域裡的活體內及活體外增 殖方法。活體內方法係指在營養的培養培養基內增殖細胞 的方法，例如傳統用來培養哺乳動物細胞的方法。通常， 培養基包括緩衝水當做底質而例如鈉、鉀、鈣、磷和氯離 子等無機離子以及其它例如痕量元素、碳源、氮源、胺基 酸和維生素視細胞的新陳代謝性而需的物質。必要時，可 以將血淸、激素、細胞生長因子、和細胞附著因子倂入培 養基裡。如此培養基的例子包括199，DMEM，漢氏F1 2， IMDM 培養基，MCDB104，MCDB153，ΜΈΜ，RD， RITC80-7，RPMI 1 630，RPMI 1 640 和 WAJC404 培養基。 將細胞濃度約1 X 4 0 4 - 1 X 1 07細胞/毫升，較佳爲約 1 X 1 0 5 - 1 X 1 0 6細胞/毫升的細胞株移植至這些培養基裡 ▲ ，在約37 °C懸浮液或單層培養基裡培養1 - 7天，較佳 2 - 4天，然而必要時用新鮮的培養基更換。 使用非人類溫血動物的活體內方法包括將通常取自兔 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公茇） -9 - 480285 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) 子的抗胸抗體注入新生齧齒類（例如老鼠、裸鼠、大鼠、 大裸鼠、天竺鼠和朝鮮鼠）以降低其免疫反應’然後皮下或 腹膜內注入每支隻動物約丨X丨〇 5 - 1 x 1 〇8細胞可以產生 •本發明酵素的培養基，或將人類細胞置入埋在動物裡動物 營養體液可以循環的擴散室內’然後依傳統方式餵食動物 2 - 1 0星期。在餵食期間內，移植的細胞增殖’然而收集 動物體液。其後，收集腫瘤塊、腹水或體液或培養基內之 懸浮液形式的增殖細胞，而且必要時’收集到的細胞係分 散在適當的培養基內並用適當的培養基沖洗，接著回收所 要的酵素。相對於活體外增殖方法，活體內方法以較低成 本、勞力及時間提供所需數量的細胞爲其優點。舉例來說 ，日本專利申請案第5 4，1 5 8 / 8 1號詳細地揭示活體內增殖 方法。 酵素可以從增殖的細胞收集得到’其係藉由用超聲波 處理已從培養基或整體培養基分離之細胞，或藉由將細胞 浸漬在細胞分裂所用的低滲培養基裡’然後利用該領域裡 純化酵素的傳統技術，例如透析、過濾、濃縮、分離沈澱 、離子交換色層分離法、凝膠過濾色層分離法、吸附色層 分離法、等電點性色層分離法、疏水性色層分離法、逆相 色層分離法、親和性色層分離法、凝膠電泳和等電點聚焦 法處理所得的細胞碎片或此等細胞碎片和培養基上層淸液 > 的混合物。這些純化方法其中二種或更多種可以組合使用 。定言之，使用對本發明酵素有效之單株抗體的免疫親和 性色層分離法以最低成本和勞力產生相當高純度的酵素。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --^----------^^衣--------訂--------"·線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -10- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 __ B7 五、發明說明（8 ) 視細胞種類和培養條件而定，當所得的酵素在細胞增殖期 間內細胞外分泌時酵素可以從培養基上層淸液獲得，。 在本發明裡，本發明酵素的活性係依下列單位測試： •根據Douglas K. Miller等人在M生物化學期刊"第268冊第 24號第1 8,062- 1 8,069頁（ 1 993);將395微升包含10重量/ 體積％蔗糖、2mM二硫蘇糖醇和0.1重量/體積％ 3 - [(3 -氯胺基丙基）二甲基四氨]-1-丙磺酸（以下簡稱"CHAPS")的25 mM Hepes緩衝液（酸鹼値7.5)置入容器內，與100微升測 試的酵素溶液和5微升10 mM N_(N-乙醯基-酪氨醯基）-2-氨 基異戊酸-丙胺醯-天冬胺酸-7 -胺基-4 -甲基香豆素醯胺溶 液混合，接著在30 °C下培育一個小時。在反應期間裡，以 澄淸器偵測由激發波長3 5 5毫微米光而發出的460毫微米之 螢光強度來偵測反應進行時所釋出的7-胺基4-甲基香豆素 含量。酵素的單位活性係定義爲每分鐘在這些反應條件下 一微微莫耳（pmol)7-胺基-4-甲基香豆素。 本發明係提供一種將藉由將前驅物與酵素接觸而使前 驅物轉化成活性形式的方法；舉例來說，將已由上述方法 單離的本發明酵素·與前驅物接觸或將編碼酵素的DNA和包 含編碼前驅物之核苷酸區域的DNA兩者導入適當的哺乳動 物宿主細胞內以表>現兩者DNA。前者方式裡，產生多肽前 驅物的細胞或那些需要而且能夠藉由轉化而產生前驅物的 細胞係在營養的培養培養基裡栽培。上述方法獲得的酵素 係與所得的培養基接觸，或加入自培養基分離或未分離的 細胞，或必要時在如此條件下分裂細胞之後加入所得之細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ --------^---------線 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -11 - 480285 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _______Β7 _ 五、發明說明（9 ) 胞碎片或混合物。共存或加入之酵素的充份數量係爲前驅 物的等莫耳數或更低數量的，而且混合物在允許·酵素作用 於前驅物的溫度和酸鹼値下培育，直到轉化成活性形式。 •特別地，在溫度大約4 °C -40 °C較佳爲約37 °C，而酸鹼値 大約6-9，較佳爲7 - 8之下進行。在後者方式裡，改酵素 爲密碼的DNA和改多肽前驅物爲密碼的DNA兩者皆導入適 當的哺乳動物宿主細胞內轉化；所得轉化的細胞係產生所 需前驅物及酵素二者而不必要本發明酵素。對於如此經轉 化細胞而言，其可以僅整體地在使本發明酵素作用於前驅 物使其轉化成活性形式的溫度下培育，或必要時在均質化 成細胞碎片之後培育。
包含活性形式的所得培養基可以使用整體當做I F N - γ誘導物，而且通常培養基裡的細胞被超聲波、細胞溶解 酵素及/或表面活性劑分裂，接著藉由過濾，離心沉澱法等 從那些所得的細胞和細胞碎片分離出多肽並純化已分離的 多肽。在純化時，沒有細胞或細胞碎片培養基係藉由該領 域裡傳統用來純化生物活性物質的純化方法，例如鹽析、 透析、過濾，濃縮、分離沈澱、離子交換色層分離法、凝 膠過瀘色層分離法、吸附色層分離法、等電點性色層分離 法、疏水性色層分離法、逆相色層分離法、親和性色層分 離法、凝膠電泳和等電點聚焦法。必要時，這些純化方法 > 其中二種或多種方法可以組合使用。所得的純化多肽可以 濃縮和親液化成液體或固體產物。單株抗體’如日本專利 公開案第2 3 1,5 9 8/96號（本發明之相同申請人）所揭示， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —-------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -12- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 Α7 --Β7 五、發明說明（1〇 ) 可以有利地用來純化多肽：舉例來說，使用單株抗體的親 和性色層分離法可以利用最低成本和勞力產生相當純的所 需多肽。 • 如上所述，本發明方法獲得的活性形式誘使I F N - γ 產生爲有用生物活性物質的活性，增強殺手細胞的細胞毒 性而且誘使殺手細胞產生。因此，多肽在處理及/或避免 I F Ν - γ及/或殺手細胞感受性疾病時發揮強大的活性。 因爲本發明方法獲得的活性形式具有強大的I F Ν — γ誘導 力’所以通常僅用相當小的數量就可以誘使所需量的 I F Ν - γ產生。即使當高劑量服入體內，活性形式也幾乎 完全不導致嚴重的副作用，因爲其毒性極低，而且具有實 際使用時該多肽緩和地誘使所需量的I F Ν - γ產生而不用 嚴格控制劑量的功效。日本專利申請案第28,722/96號（本 發明相同的申請人）係詳細地揭示活性形式當做感受性疾病 試劑的用途。 下列各項實施例係解釋本發明： 實施例 1 將新生大鼠腹膜內注入兔子抗胸抗血淸以降低其免疫 反應，然後注射其嘴側皮下組織每隻大鼠約5 X 1 0 5細胞 ΤΗΡ-1細胞（ATCC ΤΙΒ202)，依傳統方式餵食動物3個星期 > 。取出在大鼠裡皮下形成每個約1 5克重的腫瘤塊，然後依 傳統方式懸浮在RPMI 1 640培養基（酸鹼値7.4)裡並沖洗， 得到已增殖的細胞。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —,------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -13- 480285 Α7 Β7 五、發明說明（11 ) 用10倍體積包含10 氯化鉀、1.5 mM氯化鎂和 0·1 mM乙二胺-N，N，N‘，Ν’-四乙酸二鈉的冰驟冷20 mM Hepes緩衝液（酸鹼値7.4)沖洗，並在3倍體積相同緩衝液 •的新鮮緩衝液裡冰驟冷條件下靜置2 0分鐘，並在_ 2 0 °C冷 凍。將經冷凍的小腫瘤塊融解，與1 mM苯基甲基磺基氯化 物、1微克/毫升甲一亮一亮一精三肽和10微克/毫升胃蛋 白抑制素A混合，然後藉由鐵弗龍均質器均質化。經分裂 的細胞係以2,000 X克離心10分鐘以獲得上層淸液，再次 以上述類似方式處理並離心以得到一之後與上述上層淸液 ρ ο ο 1 e d的上層淸液。經ρ ο ο 1 e d的上層淸液係與乙二胺_ N，N，N‘，N、四乙酸二鈉鹽混合，得到濃度6 mM，經 24,000 X克離心20分鐘去除細胞碎片及進一步地以 1 00,000 X克離心60分鐘形成微粒體和細胞溶質溶離份， 接著收集後者的溶離份。 將硫酸銨加入所收集的溶離份，得到冰驟冷條件下飽 和程度40%，並攪拌及離心混合物以得到一上層淸液。進 一步地將硫酸銨加入上層淸液中，獲的飽和程度8 0 %，攪 拌並離心以收集之後溶解在包含1 0體積/體積％甘油/、0.1 重量/體積％CHAPS和2 mM二硫蘇糖醇的三-HC1緩衝液（酸 鹼値7.8)的沉澱物'|。將溶液注入滲析袋並在4 °C下以相同且 新鮮的緩衝液滲析1 6個小時。將滲析袋的內溶液離心，獲 得之後飼進塡充“DEAE 5PW”（一種由日本東京Tosoh公司市 售離子交換色層分析法所用的樹脂）已用相同且新鮮緩衝 液平衡之管柱內的上層淸液，接著飼進從0 Μ增加到0.5Μ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -14- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 B7__ 五、發明說明（12 ) 的線性梯度氯化鈉緩衝液，接著收集以氯化鈉濃度大約 0.04-0.09M沖提的溶離份。 收集到的溶離份係用包含5體積/體積％甘油、0.1重量 "體積％CHAPS和2mM二硫蘇糖醇的Hepes緩衝液（酸鹼値 7.4)稀釋1.5倍體積，將稀釋液藉由加入稀釋氫氯酸調 至酸鹼値7.4，然後飼進塡充“3-3£?1^11〇3£”（一種由瑞典阿 薩拉Pharmacia LKB生物技術公司市售離子交換色層分析法 所用的凝膠）已用相同且新鮮緩衝液平衡之管柱內，接著將 從0 Μ增加到0.5M的線性梯度氯化鉀緩衝液飼進管柱中， 接著收集以氯化鉀濃度大約〇.〇4 - 0.09Μ沖提的溶離份。 將溶離份以包含5體積/體積％甘油、0.1重量/體積％ CHAPS和2 mM二硫蘇糖醇的Hepes緩衝液（酸鹼値7.4) pooled並滲析16個小時，然後飼進塡充“MONO S”（一種由 瑞典阿薩拉Pharmacia LKB生物技術公司市售離子交換色層 分析法所用的管柱）已用相同且新鮮緩衝液平衡之管柱內， 接著將包含0.5M氯化鉀的相同且新鮮緩衝液飼進管柱中。 收集、pooled並濃縮從“MONO S”管柱沖提並具有本發 明酵素活性的溶離份。將濃縮物飼進“SUPERDEX 200”（一 種由瑞典阿薩拉Pharmacia LKB生物技術公司市售凝膠色層 分析法所用的管柱％已經用包含5體積/體積％甘油、0.1重 量/體積％CHAPS和2 mM二硫蘇糖醇的Hepes緩衝液（酸鹼 値7.4)平衡），接著將相同且新鮮緩衝液飼進管柱中。收集 具有本發明酵素活性的溶離份，pooled溶離份並濃縮混合 物，得到1毫升含有9,000單位/毫升酵素的溶液，每隻大鼠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） —.-------------------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •15- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 一一 B7 五、發明說明（13) 的產率約4 5個單位。 ΜΜΜΛ. ‘酵_素的分子量 塡充24毫升“SUPERDEX 75HR”（一種由瑞典阿薩拉
Pharmacia LKB生物技術公司市售凝膠過濾色層分析法所用 的凝膠）的管柱係用經磷酸鹽緩衝的生理食鹽水（以下簡稱 “p B S ”）’然後飼進2 0 0微升實施例1 -1的酵素溶液，並在監 視沖提物裡的酵素活性時以〇 · 5毫升/分鐘的速度飼進新鮮 的PBS。在PBS裡溶解適量當做凝膠過濾色層分析法所用 分子計號物之具有分子量67,000道耳頓的小牛血淸淸蛋白 、分子量43，000道耳頓的卵蛋白、分子量25,〇〇〇道耳頓的 胰凝乳蛋白原A和分子量1 3，7 0 0道耳頓的核糖核酸A，而 且溶液係以類似酵素溶液所用的方式處理，不同的是沖提 物裡的白質濃度係藉由相對波長2 8 0毫微米卻沒有測得酵 素的吸收程度來監測。以酵素的色層方析圖和分子記號物 的沖提位置爲基礎計算，結果本發明酵素具有約3 0，0 0 0道 耳頓的分子量（以凝膠過濾色層分析法測得）。 將來自“SUPERDEX 75HP”含有本發明酵素的沖提物濃 縮，並且根據U· fK. Lemuli在"自然"第227冊第680-685 頁（1 9 7 0)裡所報告的方法，在當做還原劑.的2重量/體積二 ▲ 硫蘇糖醇存在下於SDS-聚丙烯醯胺凝膠裡電泳分析。使用 由美國加洲Santa Cruz生物技術公司市售的抗人類ICE-P20 抗體和抗人類ICE-plO抗體，凝膠以一般方式免疫著色並用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --.---------I - ------訂·II 丨 —丨丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -16- 480285 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（14 ) ELC KIT”（一種美國阿靈頓Amersham國際集團分公司的產 物）’以偵測對應分子量大約25,000和約1 0,000道耳頓位置 的二個單獨蛋白質帶。本實驗所用的分子記號物係爲具有 •分子量67,000道耳頓的小牛血淸淸蛋白，分子量45,000道 耳頓的卵蛋白，分子量30,000道耳頓的碳酸脫水酶，分子 量20，100道耳頓的大豆胰蛋白抑制劑和分子量i4,4〇〇道耳 頓的α-乳白蛋白。 實施例3 酵素的部分胺基酸序歹丨丨 將含有實施例1所得之本發明酵素的酵素溶液以包含5 體積/體積％甘油、〇.1重量/體積％CHAPS和2 mM二硫蘇糖 醇的Hepes緩衝液（酸鹼値7.4)滲析，並藉由離心冷凝器濃 縮。將濃縮物依傳統方式以SDS-PAGE使用15重量/體積％ 和2重量/體積％二硫蘇糖醇當做還原劑的凝膠濃度分離， 將經分離的蛋白質轉化成聚二氟乙烯膜並用Coomassie Bnmant Blue著色，接著剪下對應分子量約25,000和約 1 0,000道耳頓的著色帶。 蛋白質組份分別依傳統方式從cut凝膠取出，並以 “MODEL 47 3 A”（二種美國福斯特城市應用生物系統所售的 蛋白質序列器）分析胺基酸序列，顯示從具分子量約25,〇〇〇 道耳頓之著色帶取出的組份具有SEQ ID:4號胺基酸序列作 爲部分胺基酸序列，其中記號” Xaa"(—種胺基酸）係爲"異 亮胺酸"或"蘇胺酸"，而從具分子量約10,000道耳頓之著 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —.------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -17- 經濟部智慧財產局員工¾費合作社印製 480285 A7 ____ B7 五、發明說明（15 ) 色帶取出的組份在N-終端區域裡具有SEQ ID:5胺基酸序列 。那些數據顯示本發明的酵素包含2個不同分子量副單位 (subunit ) 〇 實施例4-1 前驅物的製備 在0.5毫升反應管裡放置10微升10 X PCR緩衝液、1 微升2.5 mM dNTP、0.5微升5單位/微升Taq DNA聚合溶 液和1毫微克日本專利Kokai第193，098/96號（本發明相同 的甲請人）揭示的重組DNA pHIGIF。將具5‘-AAGGCCAGTG TGCGTGGCCTGGACAGTCAGCAAGG-3’和 5 * - AC AGC C AGTGT GATGGCTAGTCTTCGTTTTGAACAG-3’之核普酸序歹[J 的寡核 苷酸加入混合物，其係以編碼多肽前驅物之cDNA的SEQ ID :7序列爲基礎，每個數量爲20微微莫耳並用殺菌蒸餾水 加體積至1 00微升而化學合成。所得的混合物係以傳統的 方式在94 °C裡連續培育30個循環一分鐘，60 °C培育一分 鐘和72 °C培育一分鐘，以使PCR反應。使用日本Takara Shuzo 公司市售的"丁 AKARA PCR AMPLIFICATION KIT"當 做PCR反應所用的試劑。 反應產物以傳1統的方式用限制酵素（Bst XI)切開並將 0.1微克具約800基對（base pair)之所得的.DNA碎片置入容 器內，溶入所需量的殺菌蒸餾水，與10毫微克“pRc/CMV”( 一種 Invitrogen BV，NV Leek Netherlands 巾售的質粒載體 ，其已經用限制酵素Bst XI切開並具有適量的1〇 X連接緩 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —·------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -18- 480285 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 _ 五、發明說明（16 ) 衝液和T4連接）混合，與1〇 mM ATP混合直到最後濃度爲 ImM，接著在16 °C培育混合物18個小時以將DNA碎片導 入質粒載體pRC/CMV。將如此獲得的重組DNA導入大腸 •桿菌JM 109菌株內而獲得轉形細胞，該轉形細胞然後培育 成包含50微克/毫升安匹西林的1^-13]：〇1;11(酸驗値7.2)並在37 °C培育1 8個小時。其後，那些增殖的細胞係從培養基裡收 集並且用鹼性SDS方法處理以萃取出重組DNA。重組DNA 命名爲"p R C H u G F"並使用雙脫氧方法分析核苔酸序列，顯示 其具有圖1所示的結構。如圖1所示，重組DNA pRCHuGF 具有cDNA HuIGIF，其包含編碼多肽前驅物之SEQ ID:7的 核苷酸序列，連接到細胞巨大病毒促進劑PCMV之啓動子 下游處。 將取自中國倉鼠之CHO-K1細胞（ATCC CCL 61)的種 子培養基移植進入用10體積/體積％初生小牛血淸補充的漢 氏F12培養基（酸鹼値7.2)裡，並培育增殖。其後，收集那 些增殖的細胞，用磷酸鹽生理緩衝液（以下簡稱"PBS")沖洗 並懸浮在PBS裡，得到細胞密度1 X 107細胞/毫升。將0.8 毫升的懸浮液和10微克重組DNA pRCHuGF放置在然後冰 驟冷10分鐘的小池裡，置入“GENE PULSERTM”（一種日本東 京日本Bio-Rad實驗室所售的electroporation裝置），並用 排放脈沖管一次倒入，接著迅速地拿出小池並且冰驟冷10 ▲ 分鐘。其後，將細胞懸浮液從小池回收，放入用1 〇體積/體 積％初生小牛血淸補充的漢式F12培養基（酸鹼値7.2)內培 育，在37 °C 5體積/體積％C02的保溫箱裡培育3天，然後 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —·------------------訂--------1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 19- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 B7 五、發明說明（17 ) 在相同條件下與G418混合，得到400微克/毫升的最後濃 度並在上述條件下培育3天。從大約1 00個菌落選擇四十 八個菌落，將選擇的菌落其中一些放入散佈用1 0體積/體積 初生小牛血淸補充之漢氏F12培養基（酸鹼値7.2)培養 盤中培育，並且如上所述的類似方式栽培一星期。其後， 那些盤中每個井裡的細胞係藉由每個井裡加入包含5.1 mM 氯化鎂、0.5重量/體積％脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate) 、1重量/體積％“N〇NIDET P-40”（一種表面活性劑）、10微 克/毫升抗蛋白酶酸和0.1重量/體積％SDS的10mM三HC1緩 衝液（酸鹼値8.5)。 將50微升整份之所得的細胞溶解物放入容器，接著將 50微升甘油和得到最後濃度2重量/體積％之數量的二硫蘇 糖醇加入容器裡，並將容器保持在37 °C —小時。其後，細 胞溶解物裡的多肽係藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法分離 ’而以傳統的方式將在凝膠裡分離的多肽轉移到硝化纖維 膜’在先前所得雜種瘤H-1菌株（如日本專利Kokai第 23 1，598/96(本發明相同的申請人）所揭示對多肽產生單株抗 體）的培養基上層淸液裡浸漬一個小時，而且用包含〇.〇5重 量/體積％tween 20的20 mM三-HC1緩衝液（酸鹼値7.5) 沖洗，除去過量的單株抗體。硝化纖維膜係浸在含有兔子 抗鼠免疫球蛋白抗體貼上山癸過氧物標鑛.的P B S裡一個小 時，用包含0.05重量/體積％Tween 20的20 mM三- HC1緩衝 液（酸鹼値7.5)沖洗50 mM三-HC1緩衝液（酸鹼値7.5) ，並浸在包含0.005重量/體積％過氧化氫和0.3毫克/毫升 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -20- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 _ B7 五、發明說明（18) 二胺基聯苯胺的5〇111^[三4(：1緩衝液（酸鹼値7.5)裡染色 。基於染色的程度，選擇更製得多肽前驅物的轉形細胞純 系而且命名其爲"RCHuGF"。 • 將轉形細胞RCHuGF置入正方形培養瓶內培育，該正 方形培養瓶裡分佈漢氏F12培養基（酸鹼値7.2)與400微 克/毫升G41 8和10體積/體積％初生小牛血淸並在37 °C 5 體積/體積％(：02保溫箱裡培育一星期，然而依要求更換新 鮮的培養基。其後，以適量的"TRYPSIN-EDTA"(—種胰蛋 白，由生命技術領域的美國紐約GIBCO實驗室公司市售） 分離那些附著在瓶壁上的細胞，並用P B S沖洗已分離的細 胞，此外用包含10 mM氯化鉀、1.5 mM氯化鎂和0.1 mM 乙二胺-N，Ν，Ν' N，-四乙酸二鈉的冰驟冷20 mM Hepes寧 衝液（酸鹼値7.4)沖洗，並在3倍體積相同緩衝液的新鮮緩 衝液裡靜置20分鐘。然後用傳統的方式，以10,000 X克 離心30分鐘分裂那些細胞，獲得一包含多肽前驅物的上層 淸液。前驅物得到分子量大約24,000道耳頓（以SDS-聚丙烯 醯胺凝膠電泳分析）並在N-終端區域裡具有SEQ ID:1胺基 酸序列。 實施例 4-2 1 前驅物的轉化 > 基質溶液係藉由將實施例4-1的多肽前驅物溶解在1〇〇 mM包含10體積/體積％甘油、0.1重量/體積％ CHAPS和2mM 二硫蘇糖醇的1^?6$緩衝液（酸鹼値7.4)以得到濃度50〇11“ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------—------訂---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -21 - 480285 A7 -—------ B7 五、發明說明（19 ) ’並與3 5 0單位/毫升實施例1的酵素溶液混合，接著在37 °C下培育而製得。在開始培育後〇分鐘，1()分鐘，30分鐘 ’一小時，3小時，6小時和1 8小時時，每次的取樣時間 去出 部分反應混合物樣品並與碘：乙酸胺混合，得到最後 濃度2 0 0微克/毫升以使反應暫時中止。使用單株抗體的 Western Blooting 方法，如日本專利 Kokai 第 231，098/96 號 所揭示（本發明相同的申請人），係應用在反應混合物以硏究 前驅物轉化成活性形式期間隨時間的變化。 每次取樣時間所收集每個樣品裡的活性形式含量係藉 由使用來自人類急性骨髓性白血病的單核.細胞株當做夠用 的細胞（KG-1細胞（ATCC CCL 246))的生物測試法來估計。 生物測試法敘述如下：KG-1細胞細懸浮在用1 0體積/體積 %初生小牛血淸補充的R Ρ ΜI 1 6 4 0培養基（酸驗値7.4 )，得 到細胞密度1.5 X 106細胞/毫升，並且將細胞懸浮液以0.1 毫升/井的數量分佈在96個井的微孔板裡。將上述反應混合 物在用10體積/體積％初生小牛血淸補充的RPMI 1 640培養 基（酸鹼値7.4)稀釋之後以0.1毫升/井的體積加入微孔板裡 ，接著在37 °C 5體積/體積％C02保溫箱裡培育24小時。在 培育完成之後，取出微孔板之井裡0.1毫升整份上層淸液並 使用傳統酵素免疫f測試法作I F N - γ的定量分析。結果 示於表1。表1裡I F Ν - γ的含量係在轉換成有關美國國 j 家健康協會（ΝΙΗ)獲得之I F Ν - γ標準（Gg23-901-530)的國 際單位之後表示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11訂---- !線赢 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22- 480285 A7 __ B7 五、發明說明（2〇 ) 表1 反應時間（分鐘） I F N - γ含量（IU/毫升） 0分鐘 280 1 0分鐘 750 30分鐘 1,000 1小時 1,800 3小時 3,100 6小時 3,900 1 8小時 4,200 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如圖2的Western Blotting方法所示，在該反應條件下 ，具有分子量大約24,000道耳頓的蛋白質帶（相當於前驅物 )在反應開始之後逐漸地消失高達3個小時，然而具有分子 量大約1 8,200道耳頓的蛋白質帶出現。表1所示的I f N - γ含量非常符合該結果；作爲反應產物的I F Ν ~ γ生 產力因爲具有分子量大約1 8,200道耳頓的蛋白質帶（相當於 前驅物）而逐漸地增加。這些結果係顯示酵素作用於多肽前 驅物，形成一誘使免疫力充份的細胞裡產生I F Ν - γ自勺活 性形式。 實施例4-3 I 11 1 丨_一___ > 活性多肽的物化性質 實施例4-3(a) 活性多肽的純化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -23 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 ____ B7 五、發明說明（21) 將在實施例4-2裡培育1 8小時之後的反應混合物以1 0 mM磷酸鹽緩衝劑（酸鹼値6.8)滲析，飼進”0£八£5?界"柱（ 一種日本東京Tosoh公司市售之離子交換色層分離法所用 •的凝膠，已經用10 mM磷酸鹽緩衝劑（酸鹼値6.8)平衡）， 並且飼進10 mM磷酸鹽緩衝液（酸鹼値6.8)裡從0 Μ增加 到0.5Μ的線性梯度氯化鈉緩衝液，接著收集以氯化鈉濃度 大約0.2 - 0.3 Μ沖提的溶離份。 將那些溶離份放入並以PBS滲析，而且飼進已經藉由 使用單株抗體根據日本專利Kokai第23 1,598/96號（本發明 的相同申請人）之方法提供一免疫親和性色層分離法所用的 凝膠而製得的柱裡，將凝膠注入塑膠圓筒形柱內，並用 PBS沖洗該柱。將100 mM甘胺酸-HC1緩衝液（酸鹼値2.5 )飼進該柱裡以收集含有誘使免疫勝任細胞裡產生I F N -γ之活性形式溶離份。那些溶離放入並以殺菌蒸餾水滲析， 利用膜濾器濃縮並且親液化，獲得固體形式之經純化的多 肽。 實施例4-3(b) 多肽的分子量 根據U· K. Ldmuli在"自然”第227冊第680-685頁（1970 )裡所報告的方法，將實施例4 -1裡經純化的多肽在當做還 原劑的2重量/體積二硫蘇糖醇存在下於聚丙烯醯胺凝膠裡 電泳分析，以顯示符合大約1 8,000- 1 9,500道耳頓位置裡的 主要帶。那些數據係顯示酵素作用於具有分子量24,000道 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 線_ -24- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7
五、發明說明（22 ) 耳頓的多肽前驅物’將其轉化成分子量比前驅物低的活性 形式。本實驗所用的分子記號物係爲具有分子量67，000道 耳頓的小牛血淸淸蛋白，分子量45,000道耳頓的卵蛋白， 分子量30,000道耳頓的碳酸脫水酶’分子量sqjqo道耳頓 的大豆胰蛋白抑制劑和分子量1 4,400道耳頓的α_乳白蛋白 〇 意例 4-3(c) 終端區域裡多肽的胺基酸序列 使用"MODEL 47 3 A"(—種美國福斯特城市應用生物系 統所售的蛋白質序列器）的傳統分析顯示實施例4_丨裡經純 化的多肽在N-終端區域裡具有SEQ ID:3的胺基酸序列。那 些數據顯示酵素作用於多肽前驅物，將在天冬胺酸3 6和酪 胺酸37之間的多肽鍵切開。 實施例5 抑制劑對酵素的活性 在實施例4-2前驅物所用的傳統方法裡，實施例1的本.· 發明酵素係與5μΜ Ac-YVAD-CH〇或650μΜ碘乙醯胺混合 並在3 7 °C下反應31個小時。每個反應混合物係以SDS-PAGE 使用15重量/體積％凝膠在2重量/體積％二硫蘇糖醇存在下 分離，並以如日本專利Kokai第231，098/96號所揭示（本發 明相同的申請人）使用單株抗體的W e s t e r η B1 ο 〇 t i n g方法分 析，結果顯示每個凝膠未測得對應活性形式的帶。這表示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .------------------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -25- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 B7 五、發明說明（23 )
Ac-YVAD-CHO和碘乙醯胺當做活性抑制齊!!作用於本發明的 酵素。 ^實施例 6 將U-937細胞（ATCC CRL 1 593.2)(—種來自人類組織細 胞淋巴瘤的骨髓單核細胞株）懸浮在含於約1 0毫升設有具孔 徑0.5微米之薄膜過濾器的塑膠圓筒擴散室內的RpMI 1640 培養基裡。擴散室係埋入然後依傳統方式餵食4個星期的 成兔體內，再將擴散室從兔子體內取出。從擴散示收集經 增殖的細胞，用P B S沖洗並以類似實施例1的方式分裂， 接著純化混合物以獲得產率約每隻兔子5個單位的本發明 酵素。 實施例7 酵素的製備 將HL-60細胞（ATCC CCL240)(—種來自人類前骨髓細 胞白血病的骨髓單核細胞株）懸浮在用1〇體積/體積％初生小 牛血淸補充的RPMI 1640培養基（酸鹼値7.2) ’得到細胞密 度3 X 1 05細胞/毫升，並且在37 °C 5體積/體積％C〇2保溫箱 裡培育3個星期，1然而要用相同且新鮮的培養基更換。從 培養基收集已增殖的細胞，用PBS沖洗並依類似實施例1 的方式均質化，接著純化所得的產物以獲得產率約每升培 養基30個單位的本發明酵素。 由實施例2-5方法所得之酵素物化性質的分析結果顯示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） --------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -26- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 Α7 __ Β7 五、發明說明（24 ) ’酵素展現與實施例1相同的酵素活性、分子量和部分胺 基酸序列，而酵素活性被Ac-YVAD-CH〇和碘乙醯胺抑制。 如上所述，本發明係以酵素作用於誘使在免疫力充份 •的細胞裡產生I F N - γ之多肽前驅物而形成活性形式的最 初發現爲基礎而完成。本發明使用如此的酵素活性並且能 夠製造當做在人體內也得到類似處理之有用製藥的多肽， 藉由（1)將酵素與本質上產生多肽的細胞或與從哺乳動物宿 主細胞產生的多肽前驅物接觸，該哺乳動物宿主細胞已藉 由含改多肽爲密碼之區域的DNA導入而轉化，或（π)將改酵 素爲密碼的DNA或含改多肽爲密碼之區域的DNA兩者導入 哺乳動物宿主機細胞內。該酵素可以藉由本發明方法使用 細胞當做來源製造所需要的數量。 具有這些有用功能和活性的本發明將對該領域極有貢 獻的重要發明。 當舉例說明且描述本發明特別具體實施例的時候，熟 習此項技藝者將作各種不同的其他變化和改良卻未脫離本 發明之精神範疇。因此諸如此類的變更和改良皆包涵所附 的申請專利範圍裡。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —.------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -27- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 B7 _ 五、發明說明（25 ) 序列表 (1 ) S E Q ID N 〇：1 資料： (i )序列特徵： • ( A )長度：4 1胺基酸 (B)種類：胺基酸 (D)拓樸學：直線型 (ϋ)分子類型：肽 (ν )片段類型：Ν -終端片段 (xi) S E Q ID Ν Ο ·· 1 序列說明： SEQ ID ΝΟ:1:
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys lie Asn Phe Val Ala Met 1 5 10 15
Lys Phe 工le Asp Asn Thr Leu Tyr Phe lie Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30
Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu 35 40 (2) SEQ ID N〇：2資料： (i)序列特徵： (A )長度：1 9 3胺基酸 (B)種類：胺基酸 (D)拓樸學：直線型 (ϋ)分子類型：肽 (xi ) S E Q 1 ID N〇：2序列說明： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —·------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -28- 480285 A7 B7五、發明說明（26 ) SEQ 工D N0:2:
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys 工le Asn Phe Val Ala Met —35 —30 -25 Lys Phe lie Asp Asn Thr Leu Tyr Phe lie Ala Glu Asp Asp Glu Asn -20 -15 -10 -5 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie 1 5 10 Arg Asn Leu Asn Asp Gin Val Leu Phe 工le Asp Gin Gly Asn Arg Pro 15 20 25 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 30 35 40 Thr lie Phe lie lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met 45 50 55 60 Ala Val Thr lie Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys 65 70 75 Glu Asn Lys lie lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie 80 85 90 Lys Asp Thr Lys Ser Asp 工le lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly 95 100 105 His Asp Asn Lys Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 110 115 120 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys 125 130 135 140 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu 145 150 155 (3 ) S E Q ID 1^〇：3資料： (i )序列特徵= (A )長度：5胺基酸 (Β )種類：胺基酸 (D )拓樸學：直線型 (ϋ )分子類型：肽 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (v )片段類型：N -終端片段 (xi ) S E Q J ID N〇：3序列說明： SEQ ID NO:3:
Tyr Phe Gly Lys Leu 1 5 (4 ) S E Q ID N〇：4 資料： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 _____B7____ 五、發明說明（27 ) (i )序列特徵： (A )長度：1 9胺基酸 (B )種類：胺基酸 ’ （D )拓樸學：直線型 (ϋ )分子類型：肽 _ (ν )片段類型：Ν -終端片段 (X i ) S E Q ID N〇：4序列說明： SEQ ID NO:4:
Xaa Pro Ala Met Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Gly Asn Val Lys Leu 1 5 10 15
Cys Ser Leu (5 ) SEQ ID N 〇·· 5 資料·· (i )序列特徵： (A )長度：1 4胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓樸學：直線型 (ϋ)分子類型：肽 (ν )片段類型：Ν -終端片段 (xi ) S E Q ID N〇：5序列說明： SEQ 工D N0:5:
Ala 工le Lys Lys Ala His 工le Glu Lys Asp Phe lie Ala Phe 15 l〇 i (6 ) SEQ ID N 〇·· 6 資料： (i )序列特徵： (A )長度·· 1 5 7胺基酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） . -1------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -30 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 A7 B7 五、發明說明（28) (B )種類：胺基酸 (D )拓樸學：直線型 (ϋ)分子類型：肽 . (X i ) S E Q ID N〇：6序列說明·· i SEQ ID N0:6:
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 丨 15 10 15
Asp Gin Val Leu Phe 工le Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95
Ser Asp lie 工le Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110 I
Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu ： 115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 工le Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140
Gly Asp Arg Ser 工le Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 ； (7 ) S E Q ID N〇：7 資料： (i )序列特徵： (A )長度：.5 7 9鹼基對 (B )種類：核酸 (D )拓濮學：直線型
(ϋ)分子類型：cDNA至mRN.A > (i x )特性 (A )名稱/關鍵字··引導肽 (B)位置：1..108 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------- *訂---- 4. -31 - 480285 A7 B7 五、發明說明（29 ) (C )鑑定方法：S (A )名稱/關鍵字：成熟肽 (B )位置：1 〇 9 · · 5 .7 9 • ( C )鑑定方法：S (X i ) S E Q ID N〇：7序列說明： —.------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 SEQ 工D NO:7: ATG Met AAA Lys CTG Leu AGA Arg CTA Leu ACC Thr 45 GCT Ala GAG Glu AAG Lys CAT His CTA Leu 125 GAG Glu GAC Asp GCT Ala -35 TTT Phe GAA Glu AAT Asn TTT Phe 30 ATA lie GTA Val AAC Asn GAT Asp GAT Asp 110 GCT Ala GAT Asp GCT GAA CCA GTA GAA Ala Glu Pro Val Glu -30 ATT GAC AAT ACG CTT 工le Asp Asn Thr Leu TCA GAT Ser Asp TTG AAT Leu Asn 15 GAA GAT Glu Asp TTT ATT Phe lie ACT ATC Thr lie AAA Lys ACA Thr 95 AAT Asn TGT Cys GAA Glu ATT lie 80 AAA Lys AAG Lys GAA Glu TTG Leu TAC TTT GGC Tyr Phe Gly 1 GAC CAA GTT Asp Gin Val ATG Met ATA lie TCT Ser 65 ATT lie AGT Ser ATG Met AAA Lys GGG Gly 145 ACT Thr AGT Ser 50 GTG Val GAT Asp 35 ATG Met AAG Lys TCC TTT Ser Phe GAC ATC Asp lie CAA Gin GAG Glu 130 GAT Asp TTT Phe 115 AGA Arg AGA Arg GAC Asp TAC Tyr AAG Lys CTC Leu 20 TCT Ser TAT Tyr TGT Cys AAG Lys ATA lie 100 GAA Glu AAT TGC Asn Cys TTT ATA Phe lie CTT GAA Leu Glu 5 TTC ATT Phe lie GAC TGT Asp Cys AAA GAT Lys Asp GAG AAA Glu Lys 70 GAA Glu 85 TTC Phe TCT Ser GAC CTT Asp Leu TCT ATA Ser lie ATC AAC TTT GTG lie Asn Phe Val -25 GCT GAA GAT GAT Ala Glu Asp Asp -10 TCT Ser GAC Asp AGA Arg AGC Ser 55 ATT lie AAA Lys CAA Gin GAT Asp 40 CAG Gin TTA Leu GGA Gly 25 AAT Asn TCA Ser 10 AAT Asn GCA Ala CCT AGA Pro Arg TCA AYT CTC Ser Xaa Leu GCA ATG Ala Met GAA AAC Glu Asn -5 GTC ATA Val lie CGG CCT Arg Pro CCC CGG Pro Arg GGT ATG Gly Met 60 TCC TGT Ser Cys 75 ATG AAT CCT CCT Met Asn Pro Pro TTT Phe TCA Ser TTT Phe ATG Met 150 CAG Gin TCA Ser AAA Lys 135 TTC Phe AGA Arg TAC Tyr 120 CTC Leu AGT Ser 105 GAA Glu ATT lie ACT GTT Thr Val GAT AAC ATC Asp Asn lie 90 GTC CCA GGA Val Pro Gly GGA TAC TTT Gly Tyr Phe TTG AAA Leu Lys CAA AAC Gin Asn 155 AAA Lys 140 GAA Glu 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 579 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -32-
Claims (1)
- 480285 —-----BB C8 ' iti] /L· 申請專利範圍 1 · 一種在免疫勝任細胞中誘使I f N 一 γ之多肽前驅 物轉化成活性形式的酵素，該酵素具有下列物化性質： (1) 分子量 SDS-PAGE分析顯示分子量約爲25,000和約10,000 道耳頓； (2) Ν-終端胺基酸序列 具有選自SEQ ID:4的胺基酸序列（其中符號"Xaa"係 爲"異亮胺酸"或"蘇胺酸，，）或SEQ ID:5的胺基酸序列；及 SEQ ID:4: Xaa Pro Ala Met Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Gly Asn Val Lys Leu 1 5 l〇 15 Cys Ser Leu SEQ ID:5 請 先· 閱- 讀 背 面# 之 注 意 事 項 再 填 本 頁 % 訂 鳙 I I Ala lie Lys Lys Ala His lie Glu Lys Asp Phe lie Ala Phe 1 5 10 ' · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3)抑制劑 可被碘乙醯胺及乙醯基-L -門冬氨醯-L-谷醯基-L- — 乙基戊醯胺-L -天冬小酸抑制。 2 •根據申請專利範圍第1項之酵素，該酵素將該前 驅物之N終端區域內SEQ ID:1中所含天冬胺酸36與酪胺酸37 之間的肽鍵切開； SEQ ID:1： 二, —— Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys lie Asn Phe Val Ala Met 1 · 5 10 15 Lys Phe lie Asp Asn Thr Leu Tyr Phe lie Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu. 35 40 t紙張尺度適用中_家標準（CNS)A4規格⑽"297公^ -33-480285 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 ·根據申請專利範圍第1項之酵素’ SE〇ID: 2胺基酸序列之該前驅物，將其轉 域裡具有SE〇ID:3胺基酸序列的活性形式’ 記號"Xaa"係爲"異亮胺酸"或M穌胺酸， SEQ ID:2: 其係作用於具 化成在N -終端區 SEQ ID N〇：2 中 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys lie -35 -30 Lys Phe 工le Asp Asn Thr Leu Tyr Phe 工le Ala -20 -15 -10 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser 1 5 Arg Asn Leu Asn Asp Gin Val Leu Phe lie Asp 15 20 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg 30 35 Thr lie Phe lie lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser 45 50 55 Ala Val Thr lie Ser Val Lys Cys Glu Lys lie 65 70 Glu Asn Lys lie 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn 80 85 Lys Asp Thr Lys Ser Asp lie 工le Phe Phe Gin 95 100 His Asp Asn Lys Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Asn Phe Val -25 Glu Asp Asp Lys Leu Ser 10 Gin Gly Asn 25 Asp Asn Ala 40 Gin Pro Arg Ser Xaa Leu Pro Pro Asp 90 Arg Ser Val 105 Tyr Glu Gly Ala Met Glu Asn - 5 Val lie Arg Pro Pro Arg Gly Met 60 Ser Cys 75 Asn lie Pro Gly Tyr Phe 110 115 120 j Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys j 125 130 135 140 ： Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser He Met Phe Thr Val Gin Asn Glu ' __.----------—------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 145 150 155 Asp SEQ ID:3 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Tvr Phe Gly Lys Leu· 1 5 4 ·根據申請專利範圍第1項之酵素，其係從人類造 血細胞獲得。 5 · —種當做酵素的蛋白質，該酵素係在免疫勝任細 胞內誘使I F N - γ之多肽前驅物轉化成活性形式’該蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-34 480285 A8 B8 C8 D8 六、申j青專利範圍 質具有下.列物化性質： (1)作用 該酵素將該前驅物Ν-終端區域中完整或部分之SEQ ID Ν0 :1所含之天冬胺酸3 6與和酪胺酸3 7之間的肽鍵切開 (2) 分子量 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析顯示的分子量約爲 25,000和約10,000道耳頓； (3) N-終端胺基酸序列 具有·選自SEQ ID:4的胺基酸序列（其中符號”xaa"係 爲"異亮胺酸"或"蘇胺酸"）或SEQ ID:5的胺基酸序列； (4) 抑制劑 可被乙醯基-L-門冬氨醯-L-谷醯基-L-二乙基戊醯胺-L -天冬-1-酸及碘乙醯胺抑制；及 (5) 製造的細胞 可從人類造血細胞獲得。 6 . —種製造如申請專利範圍第1項之酵素的方法， 該方法包括使製造該酵素的細胞增殖及從已增殖的細胞收 集所製得的酵素。 7 .根據申請專利範圍第6項的方法，其中該細胞係 爲人類紅細胞生成素細胞。 .， 8 ·根據申請專利範圍第6項的方法，其包括將該細 胞移植至非人類溫血動物身上’及增殖該細胞並獲得動物 體液。 •------------.— (請，先閱讀背名之注意事項寫本頁) 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） -35- 480285 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 9 ·根據申請專利範圍第8項的方法，其中該動物係 爲齧齒類。 1 0 ·根據申請專利範圍第6項的方法’，其中該酵素 係藉由一或多種選自下列之方法收集，包括鹽析、透析、 過濾，濃縮、分離沈澱、離子交換色層分離法、凝膠過濾 色層分離法、吸附色層分離法、等電點性色層分離法、疏 水性色層分離法、逆相色層分離法、親和性色層分離法、 凝膠電泳及等電點聚焦法。 1 1 · 一種製造如申請專利範圍第5項之蛋白質的方 法，該方法包括增殖該人類造血細胞，及自增殖和從已增 殖的細胞收集所製得的酵素。 1 2 ·根據申請專利範圍第1 1項的方法，其中該細 胞係爲人類紅細胞生成素細胞。 1 3 ·根據申請專利範圍第1 1項的方法，其包括將 該細胞移植至非人類溫血動物身上，及增殖該細胞並獲得 動物體液。 1 4 ·根據申請專利範圍第1 3項的方法，其中該動 物係爲齧齒類。 1 5 ··根據申請專利範圍第1 1項的方法，其中該蛋 白質係藉由一或多種選自下列之方法收集，包括鹽析、透 析、過濾，濃縮、分離沈澱、離子交換色層分離法、凝膠 ▲ V 過濾色層分離法、吸附色層分離法、等電點性色層分離法 、疏水性色層分離法、逆相色層分離法、親和性色層分離 法、凝膠電泳和等電點聚焦法。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .丨丨.丨·丨I% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -36 - 480285 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 6 · —種轉化多肽的方法，其包括將申請專利範圍 第1項的酵素與在免疫勝任細胞中誘使產生干擾素之多肽 前驅物接觸，藉以將該前驅物轉化成活性形式。 1 7 ·根據申請專利範圍第1 6項的方法’其中該刖 驅物包括SEQ ID:2的胺基酸序列，其中記號"Xaa"係爲"異 亮胺酸"或"蘇胺酸"。 1 8 ·根據申請專利範圍第1 6項的方法’其中該活 性形式在Ν-終端區域包括SEQ ID:3的胺基酸序列。 1 9 .根據申請專利範圍第1 6項的方法’其中該活 性形式包括SEQ ID:6的胺基酸序列，其中記號"Xaa"係爲" 異亮胺酸"或"蘇胺酸"； SEQ ID:6 : ------------------------------------------------------------------- I —— . · - _ ! Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn ; 1 5 10 15 Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 工le Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 6〇 Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys! 100 105 110 Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala CysGlu1 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu! 130 135 140 I Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin A'sn Glu Asp· 145 150 · 155 I 2 0 · —種轉化多肽的方法，其包括將申請專利範圍 第6項的蛋白質與在免疫勝任細胞內誘使產生干擾素-γ之多 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . t：填寫本π 訂---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 480285 8888 ABCD A、申請專利範圍 肽前驅物接觸，藉以將該前驅物轉化成活性形式。 2 1 .根據申請專利範圍第2 0項的方法，其係將該 前驅物N-終端區域中完整或部份之SEQ ID Ν〇··1所含之天 冬胺酸36與酪胺酸37之間的肽鍵切開。 2 2 .根據申請專利範圍第2 0項的方法，其中該前 驅物包括SEQ ID:2的胺基酸序列.，其中記號"Xaa"係爲π 異亮胺酸"或"蘇胺酸”。 2 3 ·根據申請專利範圍第2 0項的方法，其中該活 性形式在Ν-終端區域裡具有SEQ ID:3的胺基酸序列。' 2 4 .根據申請專利範圍第2 0項的方法，其中該活 性形式具有SEQ ID:6的胺基酸序列，其中記號” Xaa”係 爲"異亮胺酸"或"蘇胺酸"。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS〉A4規格（210><297公釐） -38-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20769196 | 1996-07-19 | ||
| JP9156062A JPH1080270A (ja) | 1996-07-19 | 1997-05-30 | ポリペプチドをプロセッシングする酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW480285B true TW480285B (en) | 2002-03-21 |
Family
ID=26483905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW086110174A TW480285B (en) | 1996-07-19 | 1997-07-17 | Enzyme for converting a precursor of a polypeptide into the active form that induces IFN-γ production, the process therefor, and the uses thereof |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5879942A (zh) |
| EP (1) | EP0819757B1 (zh) |
| JP (1) | JPH1080270A (zh) |
| KR (1) | KR100682713B1 (zh) |
| DE (1) | DE69739280D1 (zh) |
| TW (1) | TW480285B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4004088B2 (ja) * | 1995-09-26 | 2007-11-07 | 株式会社林原生物化学研究所 | 免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 |
| TW515843B (en) * | 1996-07-25 | 2003-01-01 | Hayashibara Biochem Lab | Process for producing an active polypeptide inducing interferon-γ production |
| EP1013763B1 (en) * | 1997-08-07 | 2011-02-02 | Toray Industries, Inc. | Canine interleukin 18 production method |
| PL366134A1 (en) * | 2000-06-15 | 2005-01-24 | Smithkline Beecham Corporation | Method for preparing a physiologically active il-18 polypeptide |
| EP2261244A3 (en) | 2003-04-15 | 2011-02-23 | Glaxosmithkline LLC | Human il-18 substitution mutants and their conjugates |
| CN104161353B (zh) * | 2014-07-31 | 2015-11-11 | 黑金刚（福建）自动化科技股份公司 | 一种鞋面的自动化喷胶设备及自动喷胶方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2016015B (en) * | 1978-01-22 | 1982-05-06 | Hayashibara Co | Method of preparing interferon and preparations containing interferon |
| JPS5654158A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-14 | Hitachi Ltd | Control system for call waiting |
| JP2926409B2 (ja) * | 1989-05-22 | 1999-07-28 | 株式会社林原生物化学研究所 | 癌転移抑制因子の製造方法 |
| DE69229252T2 (de) * | 1991-08-16 | 1999-12-16 | Merck & Co., Inc. | DNS, welche das Interleukin-1B-Vorläufer-Converting-Enzym kodiert |
| JP3109018B2 (ja) * | 1994-07-14 | 2000-11-13 | 株式会社林原生物化学研究所 | インターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 |
| DE69519454T2 (de) * | 1994-07-14 | 2001-05-03 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo, Okayama | Protein, das Interferon-Gamma Herstellung induziert und monoklonaler Antikörper dagegen |
| JP2724987B2 (ja) * | 1994-11-15 | 1998-03-09 | 株式会社林原生物化学研究所 | インターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド |
| JP2952750B2 (ja) * | 1995-02-23 | 1999-09-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | モノクローナル抗体 |
| TW464656B (en) * | 1994-11-15 | 2001-11-21 | Hayashibara Biochem Lab | Interferon-gamma production inducing polypeptide monoclonal antibody, and agent for interferon-gamma susceptive disease |
| TW515843B (en) * | 1996-07-25 | 2003-01-01 | Hayashibara Biochem Lab | Process for producing an active polypeptide inducing interferon-γ production |
-
1997
- 1997-05-30 JP JP9156062A patent/JPH1080270A/ja not_active Withdrawn
- 1997-07-17 TW TW086110174A patent/TW480285B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-07-18 EP EP97305377A patent/EP0819757B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-18 DE DE69739280T patent/DE69739280D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-18 US US08/896,605 patent/US5879942A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-19 KR KR1019970033890A patent/KR100682713B1/ko not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0819757B1 (en) | 2009-03-04 |
| KR100682713B1 (ko) | 2007-12-10 |
| KR970065710A (ko) | 1997-10-13 |
| US5879942A (en) | 1999-03-09 |
| EP0819757A2 (en) | 1998-01-21 |
| DE69739280D1 (de) | 2009-04-16 |
| EP0819757A3 (en) | 1999-10-13 |
| JPH1080270A (ja) | 1998-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR910002692B1 (ko) | 수정 호르몬의 제조방법 | |
| AU729880C (en) | Recombinant vascular endothelial cell growth factor D (VEGF-D) | |
| TW458984B (en) | Novel mutant hIL-4 proteins as antagonists or partial agonists of human interleukin 4 | |
| Jost et al. | Annexin II contains two types of Ca2+-binding sites | |
| CA2189774A1 (en) | Recombinant hk2 polypeptide | |
| EP0782584A1 (en) | Il-1 receptor antagonists with enhanced inhibitory activity | |
| JPS6140221A (ja) | 腫瘍壊死因子 | |
| CA2041439A1 (en) | Muteins of the granulocyte colony stimulating factor (g-csf) | |
| KR100397244B1 (ko) | 거핵구분화인자 | |
| WO2003004057A1 (en) | Ephrin and eph receptor mediated immune modulation | |
| IE61574B1 (en) | Bifunctional proteins | |
| Welker et al. | Human mast cells produce and differentially express both soluble and membrane‐bound stem cell factor | |
| JPH05503512A (ja) | 白血球接着阻害因子としての［ａｌａ ｉｌ―８］↓７↓７ | |
| AU622125B2 (en) | Neutrophil-activating factor | |
| TW480285B (en) | Enzyme for converting a precursor of a polypeptide into the active form that induces IFN-γ production, the process therefor, and the uses thereof | |
| Higgins et al. | Interleukin 1 beta propeptide is detected intracellularly and extracellularly when human monocytes are stimulated with LPS in vitro. | |
| Kamogashira et al. | Site-specific mutagenesis of the human interleukin-1β gene: structure-function analysis of the cysteine residues | |
| KR20000075749A (ko) | 신규의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호하는 ｄｎａ 및 그용도 | |
| EP0517925A1 (en) | Novel megakaryocyte amplifier and production thereof | |
| WO1990002183A1 (en) | Production of a novel lymphokine exhibiting differentiation inhibitory activity | |
| CN86108955A (zh) | 新的细胞生长调节因子 | |
| KR20010043090A (ko) | 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 ｃＤＮＡ및 그 용도 | |
| WO1992017500A1 (fr) | Nouveau facteur d'amplification de megacaryocytes et son procede de production | |
| JP4010606B2 (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| KR920002312B1 (ko) | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GD4A | Issue of patent certificate for granted invention patent | ||
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |