TWI310038B - Pyy agonists and uses thereof - Google Patents

Description

1310038 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於PYY激動劑，特別是關於ΡΥΥ3·36變異體 . 及ΡΥΥ3-36和ΡΥΥ3 — 36變異體之聚乙二醇化衍生物，並關於 含有這類激動劑之組成物、編碼這類ΡΥΥ激動劑之分離 考 的核酸及這類激動劑或組成物於治療肥胖及其並存疾病， 或降低哺乳動物之食慾、減少食物之攝取或卡路里之攝取 ^ 的用途。 【先前技術】 ' 肥胖因其盛行率逐漸增加及與其相關之健康風險而爲 一種主要之公衛議題。再者，肥胖可能透過限制可動性及 降低身體耐久力，以及社交、學業和工作歧視來影響個人 之生活品質。 肥胖及超重通常係由體重指數（ΒΜΙ)定義，此値與總 φ 體脂相關且用來測量某些疾病之風險。ΒΜΙ係以身高（以 平方公尺計）除體重（以公斤計）來計算（公斤/平方公尺）。 超重通常定義爲ΒΜΙ爲25-29.9公斤/平方公尺，而肥胖通 常定義爲ΒΜΙ爲30公斤/平方公尺或更高。見，如：「 National Heart ， Lung ， and Blood Institute > Clinical Guidelines on the Identification ， Evaluation ， and Treatment of Overweight and Obesity in Adults， The Evidence Report，Washington，DC : U.S .Department of Health and Human Services ， NIH publication η o. 9 8 - -5- (2) I31Q038 4083(1998)」° 最近的硏究發現肥胖及與其相關之健康風險並不限於 成人，亦以令人驚訝的程度影響兒童及青少年。根據疾病 管制中心’自1970年代初期起，被界定爲超重之兒童及青 少年的比率已超過二倍，且現有約15%之兒童及青少年超 重。與類似年齡之正常體重的個體相較下，超重之兒童及 青少年出現心臟病之風險因子（諸如：高膽固醇及高血壓） φ 的頻率增加。再者，過去被視爲成人病之第2型糖尿病在 . 兒童及青少年中增加程度驚人。超重情況及肥胖與第2型 糖尿病密切相關。最近估計超重之青少年有70 %之機會成 爲超重或肥胖之成人。若父母中至少有一位超重或肥胖則 其機率增加爲80%。兒童本身所意識到之超重的最立即結 果爲社交歧視。 超重或肥胖之個體處於增加失調風險，該失調爲，諸 如：高血壓、脂血代謝障礙、第2型（非胰島素倚賴性）糖 φ 尿病、胰島素抗性、糖尿病無耐受力、高胰島素血症、冠 狀動脈心臟病、胸絞痛、充血性心臓衰竭、中風、膽結石 、膽囊炎、膽石病、痛風、骨關節炎、梗阻性睡眠窒息及 呼吸問題、膽囊病、某些型式之癌症（如：子宮內膜、乳 房、攝護腺及大腸）及精神病（諸如：抑鬱、飲食障礙、變 开夕之身體意象及自我眨低）。肥胖之負面健康結果使其成 爲美國可預防性死亡之第二主因並對社交帶來顯著之經濟 及心理影響。見，McGinnis Μ，Foege WH.， ^ Actual

Causes of Death in the United States» JAMA 270 ： 1310,038 ⑶ 2207-12 ， 1993 ° 肥胖現被視爲一種需要治療之慢性疾病，以減少與其 相關之健康風險。雖然減重爲重要之治療結果，但肥胖管 理的主要目標之一爲改良心血管及代謝値，以降低與肥胖 相關之疾病和死亡率。減重5 -1 〇 %顯示出可實質上改良代 謝値，如：血糖、血壓及脂質濃度。因此，一般相信減重 5-10 %可減少疾病和死亡率。 φ 目前可使用之管理肥胖的處方藥通常係藉由減少飲食 脂肪吸收（如：使用讓你酷（orlistat))來減重或藉由減少食 物攝入及/或增加能量消耗（如：使用西布曲明（sibutramine))來 使能量不足。尋找替代目前可使用之抗肥胖劑有數種途徑， 其中之一係聚焦在某些涉及調節飽足感的腸肽，諸如：肽 YY(PYY)。 ΡΥΥ爲荷爾蒙胰臟多肽（ΡΡ)族之一員（與ΡΡ及神經肽 Υ(ΝΡΥ)—起）。與其他同族成員相同，ΡΥΥ爲一種C端醯 φ 胺化之含36個胺基酸的肽。其爲原始從豬腸分離出之腸內 分泌肽（Tatemoto and Mutt > Nature 285·· 417-418，1980) ，據報導，其可在經由周圍途徑投服後可接著減少高脂肪 食物之攝耳又(Okada et a 1. > Endocrinology Supplement 180 ，1993)，並在經由周圍途徑投服後造成小鼠體重減少 (Morley and Flood，Life Sciences 41 : 2157-2165，1987) 。已知有多種貯存及循環之分子型 ΡΥΥ存在（Chen et al·,Gastroenterology 87 : 1 3 32- 1 3 3 8，1 9 84 ; and Roddy，et 尸epr 18 : 201-212，1 987)。這類型式之一， (4) 1310038 PYY3-36 ’係從人類大腸黏膜卒取物分離出（Eberlein et 10 : 797-803 ’ 1989)且目前已發現其爲人類 餐後血發中最主要之 PYY 型（Grandt et al.，i?egiW :15 1-15 9，1994)。據報導，ΡΥΥ3.36爲高親和力 ΝΡΥ Υ2 受體（Y2R)選擇性激動劑（Keire et a\., A m. J. Ph y s i ο 1. 9 : G126-G131，2000)。經由周 圍途徑投服PYY3-36據報導可顯著減少大鼠攝取食物及增 φ 加體重，可降低人類之食慾和攝取食物並減少小鼠攝取食 _ 物，但在Y2R-剔除小鼠中則無此作用，因食物攝入之作 用需要Y2R。在人類之硏究中發現注入PYY3.36可在24小 時中顯著降低食慾及減少攝取3 3 %之食物。注入Ρ Υ Υ 3.3 6 達到肽正常之餐後循環濃度，使ΡΥΥ3-36在15分鐘內達到 尖峰血清水準，再在30分鐘內快速降至基礎水準。據報導 ，在注入ΡΥΥ3-36後12小時內可顯著抑制食物之攝取，但 在12小時至24小時之期間則對攝取食物無實質上之效果。 φ 在大鼠之硏究中，重複IP投服ΡΥΥ3-36(每日注射二次， 共7天）可減少累積之食物攝取（Batterham，et 418 ： 650-654 ， 2002) ° 以多肽爲基礎之藥物常共價連接聚合物（諸如：聚乙 二醇），以延長其活體內半生期。然而，此通常導致生物 或藥學活性徹底損失（Shechter et al.leiiers 579: 2439-2444 ， 2005 ; Fuerteges and Abuchowski ， J.Control

Release 11 : 139-148，1990 ; Katre Adv.Drug Del.Sys.10 : 91-114，1993 ; Bailon and Berthold，Pharm.Sci.Technol Today 1 : -8 - 1310038

352-356’ 1996 ; Nucci et al.’Adv.Drug Dellivery Rev.6，1991 ; Delgado et al.,Critical Rev.Ther Drug Carrier Syst.9 ： 249-304， 1992 ； Fung et al.,Polym.Preprints 38 : 565-566，1997 ； Reddy ，Ann Pharmacother.34 : 915-923 ， 2000 ; Veronese ，

Biomaterials 22 : 405-417，2001)° 例如：S hechter 等人（

同上）報導藉由標準化學透過形成穩定之鍵來將PYY3.36進 行40kD聚乙二醇化（40kD PEG-PYY3.36)，可使其在以小鼠 (皮下注射）進行之食物攝取硏究中完全去活化。然而，其 亦報導 PYY3-36之可逆的聚乙二醇化（40kD PEG-FMS-PYY3-36)造成功能性半生期增加8倍（24小時對3小時）。亦 見PCT專利申請案第WO 2004/089279及WO 03/026591號 【發明內容】 本發明關於爲PYY3-36變異體之PYY激動劑。 在本發明之一種觀點中，PYY激動劑爲哺乳動物 PYY3.36之一種變異體，其中殘基10(麩胺酸）或殘基11(天 門冬胺酸）已被胺基酸"X"所取代（該X係選自下列：半胱 胺酸、賴胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及非天然胺基酸 )且具有可與親水性聚合物（如：聚乙二醇（PEG))結合之官 能，諸如：酮基、硫醇、羥基、羧基、或游離胺基官能， 這類變異體分別稱爲（E10X)PYY3-36或（DllX)YY3-36。 殘基"X"宜爲半胱胺酸，因此’其對應之變異體爲 (E10C)PYY3-36及（DllC)PYY3-36。 (6) 1310.03 8 在本發明之較佳實施態樣中，該PYY激動劑爲人類 PYY3.36(hPYY3-36)、犬 ΡΥΥ3-36、貓 PYY3.36 或豬 PYY3-36 之變異體，較宜爲hPYY3_36。 在本發明之較佳實施態樣中，該PYY激動劑爲具有 胺基酸序列 IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID NO. ·· 3]之多肽（E10C)hPYY3_36或其藥學上可接受之鹽 • ° 在另一種較佳之實施態樣中，該PYY激動劑爲具有 胺基酸序列 IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SE〇 IDNO·: 4]之多肽（DllC)hPYY3.36或其藥學上可接受之鹽 0 最合適的爲，該激動劑爲（E10C)hPYY3_36。 本發明之PYY激動劑宜與親水性聚合物（宜爲PEG) φ 結合。此激動劑宜爲單聚乙二醇化（即：激動劑對PEG之 比約 1 : 1)，該聚合物連接在（ei〇x)pyy3-36及（diix)pyy3-36 中之X的可結合官能，諸如：酮基、硫醇、羥基、羧基、 或游離胺基官能。該PEG可爲直線型、支鏈型或懸垂型 :較合適的爲直線型或支鏈型；最合適的爲直線型。 在直線型PEG中，PEG之一端被基團套組，該基團 在PEG與激動劑偶合之條件下爲惰性（如：醚基，宜爲甲 氧基）。以此方式（以甲氧基套住）終止之PEGS通稱爲 mPEGs。另一端經活化以與PYY激動劑偶合。類似地， -10 - 1310038 可用於本發明之支鏈型PEGs除了一端外所有端均以醚套 住’而未經醒套住之一端係經活化以供偶合。在一種實施 態樣中，該PEG之未經醚套住之一端係以連接PEG和官 能基之連接子部分（"L")套住’該官能基可與（Ε10χ)ΡΥΥ3.36 或（diix)pyy3-36中之胺基酸X的可結合官能反應，以產 生具有與X之可結合官能共價連接之PEG的共軛物。在 另一種實施態樣中，PEG係直接連接反應基，而不包含連 接子部分。這類PEGs通常稱爲π無連接子”PEGs。 在（E10C)PYY3.36及（D11C)PYY3.36多肽方面，該 peg 之未經醚套住之端宜附著在將PEG與馬來.酿亞胺或其他 將與半胱胺酸殘基之硫醇反應之基團相連接之連接子上， 以產生具有共價連接半胱胺酸硫醇基團之PEG的共軛物 〇 可與（£10〇1^丫¥3-36或（011(：)?¥丫3-36—起使用之合適 之反應性PEGs包括下列式所示之PEGs

mPEG - HN-COCH2l 及 mPEG

較合適的爲，該PEG爲上述之mPEG馬來醯亞胺， 其包括連接子部分-L-。不含連接子之PEG馬來醯亞胺亦 適合用於本發明，尤其是與（E10C)hPYY3-36或（D11C)PYY3_36 -11 - (8) 1310038 一起使用。這類不含連接子之PEG馬來醯亞胺可依Goodson and Katre Bio/Technology 8: 343-346, 1990中之描述製 得。 從（E10C)hPYY3.36 或（DllC)PYY3-36 與上示之 mPEG 之 偶合反應取得之共軛物描述於下列式中，其中-SR爲 (E10C)hPYY3_36 或（D11C)PYY3_36多肽，其中 s 爲半胱胺

酸硫醇基團之硫原子： mPEG—L—N J mPEG-S02CH2CH2SR 0 mPEG-HN-COCH2SR 及 mPEG—S-SR 連接子-L-僅用來將PEG與反應性官能基連接，因此 ，並無特別限制，但宜包括含有酯鍵、尿烷鍵、醯胺鍵、 φ 醚鍵、碳酸鍵或二級胺基之伸烷基。 在一種較佳之實施態樣中，尤其是直線型PEGS方面 ，連接子爲式-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r_所示之基團， 其中P爲從1至6之整數，宜爲1至3，更宜爲2或3，最 宜爲3且r爲從1至6之整數，宜爲1至3，更宜爲2或3，最 宜爲2。 較佳之連接子爲基團-(：112(：112(：1121'^0：〇(：112(：112-。 在另一種較佳之實施態樣中，尤其是支鏈型PEGS方 面’該連接子爲式-NHC(0)(CH2)s-所示之基團， -12 - I31Q038 Ο) 其中s爲從1至6之整數，宜爲1至3，更宜爲2或3，最 宜爲2。 較佳之連接子爲基團-NHC(0)CH2CH2-。 PEG可爲直線型或非直線型，如：支鏈型或懸垂型。 較合適的爲’該PEG爲直線型或支鏈型，宜爲直線型或 支鏈型mPEG馬來醯亞胺。該PEG應具有約lkD至約 5 0kD之重量平均分子量。較合適的爲，該平均分子量係 φ 約5kD至約45kD ;更合適的爲，約l〇-12kD至約40-45kD . ，或約20kD至約40-45kD。特別重要的爲如式1所示之直 線型mPEG，其具有約20kD.或約30kD之重量平均分子量 。該式2所示之甘油-支鏈型mPEG亦爲所欲者，且宜具有 約20kD或約43kD之重量平均分子量。 較佳之PEGs(其經適當活化以與（El〇C)hPYY3.36或 (DllC)PYY3 — 36之半胱胺酸硫醇基團結合）爲式1和2所示之 化合物。在式1之直線型mPEG中，η爲約175至800之整 φ 數；較合適的爲，約375至5Μ或約600至750，或約425至 475或約650至700’或約437至463或675至700。在式2所示 之甘油-支鏈型mPEG中，每個m約爲相同且爲約15〇至 5 〇〇之整數；較合適的爲，約160至285或約400至5 25，或 約200至250或約450至500。 -13- (10)1310038

CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2CH2NHCOCH2CH2N 1 CH2-(OCH2CH2)niOCH3 CH-(OCH2CH2)mOCH3

多種不同之PEGs(其經適當活化以與肽胺基酸之側鏈 中之靶的官能，如：酮基、硫醇、羥基、羧基、或游離胺 基官能結合）可從許多供應商購得，如：從日本東京NOF 公司或阿拉巴馬州Huntsville市Nektar治療劑公司購得 〇 本發明之另一種觀點係關於本PYY3-36變異體與聚乙 二醇之共飯物 在一種實施態樣中，該共軛物爲式3所示之化合物

SR 3 -14 - (11) 1310038 其中該mPEG部分爲直線型或支鏈型且具有約lkD至 50kD之重量平均分子量。較合適的爲5kD至約45kD;更 合適的爲，約10或12kD至約40或45kD ’或約20kD至約 40kD 或 45kD， L 爲式-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r-所示之基團’ 其中P爲從1至6之整數，宜爲1至3’更宜爲2或3’最 宜爲3;(如下列式4之描述）；且r爲從1至6之整數，宜爲 0 1至3，更宜爲2或3，最宜爲2。 或者，L爲式-NHC(0)(CH2)s-所示之基團， 其中s爲1至6之整數，宜爲1至3，更宜爲2或3，最宜 爲 2;且-SR 爲多肽（E10C)hPYY3-36 或（DllC)hPYY3.36，其 中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。 本發明之一種較佳之實施態樣爲式4所示之直線型 mPEG-PYY3_36變異體共軛物或其藥學上可接受之鹽， 〇

4 〇 其中η爲在約175至8 00之範圍內的整數；較合適的爲 ，約375至525或約600至750，或約437至463或約675至700 :且-SR 爲多肽（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3.36，其中 -15- (12) 1310038 S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。 較合適的爲，（CH2CH20)n部分具有約20kD或30kD之 重量平均分子量。其中-SR爲多肽（E10X)PYY3_36之共軛物 爲特別重要者。 本發明之另一種觀點係關於其中該PEG部分爲支鏈 型之共軛物。此類中之較佳共軛物包含甘油-支鏈型PEG 部分。特別重要的爲式5所示之化合物或其藥學上可接受 之鹽，

CH2—(OCH2CH2)mOCH

• 其中各m約爲相同且爲在約1 5 0至5 0 0之範圍內的整 數；較合適的爲，約160至285或約400至525，或約200至 250 或約 450 至 500，且-SR 爲（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3-36 多肽，其中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。較合適的爲 ’各（CH2CH20)m部分具有在約9-llkD或約20-22kD範圍 內之重量平均分子量。較合適的爲，該（〇CH2CH2)m部分 之組合重量平均分子量爲約20kD或約43kD。其中-SR爲 多肽（E10C)hPYY3.36之共軛物爲特別重要者。 -16 - (13) 1310038 本發明亦提供特異結合包含SEQ ID NO : 3或SEQ ID N〇 : 4所示之胺基酸序列之多肽的單株抗體。在本發明此 觀點之一種實施態樣中，該多肽係在半胱胺酸殘基處聚乙 二醇化。 另外，本發明提供編碼本發明之多狀序列的多核苷酸 序列，較合適的爲其編碼SEQ ID NO : 3及SEQ ID NO : 4 〇 φ 在本發明之另一種實施態樣中係提供包含本發明之 PYY激動劑及藥學上可接受之載體的藥學組成物。在另一 種實施態樣中，該組成物亦包含至少一種額外之藥劑，其 可爲一種用來治療該組成物之主要適應症或該主要適應症 之並存疾病。該額外之藥劑宜爲一種抗肥胖劑。該組成物 宜包含治療上有效量之本發明PYY激動劑或治療上有效 量之本發明PYY激動劑與額外之藥劑的組合。 本發明亦提供治療哺乳動物體內由 Y2R激動劑調節 Φ 之疾病、病症或失調的方法，其包含經由周圍途徑投給需 要這類治療之哺乳動物一治療上有效量之本發明PYY激 動劑。本發明之PYY激動劑可單獨使用或與至少一種可 用來治療疾病、病症或失調或該疾病、病症或失調之並存 疾病的額外藥劑組合使用。哺乳動物體內由 Y 2 R激動劑 調節之疾病、病症或失調包括：肥胖及超重。這類疾病、 病症或失調之並存疾病似乎可經由治療這類疾病、病症或 失調而伴隨改良。本發明進一步提供治療需要這類治療之 哺乳動物之肥胖的方法，其包含經由周圍途徑投給哺乳動 -17- (14) 1310038 物一治療上有效量之本發明PYY激動劑。 本發明亦提供減少哺乳動物體重或促進減重（包括預 防或抑制體重增加）之方法，其包含經由周圍途徑投給哺 乳動物一控制重量或減少體重量之本發明ΡΥΥ激動劑。 本發明亦提供減少哺乳動物攝取食物之方法，其包含 經由周圍途徑投給哺乳動物一減少攝取食物量之本發明 ΡΥΥ激動劑。 φ 本發明亦提供引起哺乳動物之飽足感的方法，其包含 , 經由周圍途徑投給哺乳動物一引起飽足感之量的本發明 ΡΥΥ激動劑。 本發明亦提供減少哺乳動物體內攝取卡路里之方法， 其包含經由周圍途徑投給哺乳動物一減少攝取卡路里量之 本發明ΡΥΥ激動劑。該ΡΥΥ激動劑可單獨投服或與至少 一種額外之藥劑（如：抗肥胖劑）組合使用。 在此文所描述之各方法及附屬之申請專利範圍中，該 φ ΡΥΥ激動劑可單獨投服或與至少一種額外之藥劑（宜爲抗 肥胖劑）組合使用。 本ΡΥΥ激動劑及含彼之組成物亦可用來製造用於此 文所提及之治療應用中的藥物。 定義及縮寫 "藥學上可接受的"一詞意指該物質或組成物必須在化 學上及/或毒物學上與調和物包含之其它成分及/或欲藉其 治療之哺乳動物相容。 •18- (15) 1310038 ΠΡΥΥ激動劑"一詞意指任何可在活體內或活體外誘出 —或多種由ΡΥΥ(宜爲ΡΥΥ3_36)所誘出之效果的化合物。 "治療上有效量”一詞意指相關於治療前所測定或在載 齊1J t台療組中所測定之適當對照値而言可減少卡路里之攝取 、減輕體重及/或減少體脂之本發明PYY激動劑的量。 "哺乳動物"一詞意指人類及哺乳動物綱（如：伴侶哺 1動物 '動物園哺乳動物及食用哺乳動物）中擁有恆常機 Φ 制之所有其他動物界中的温血動物成員。伴侶哺乳動物之 . —些實例爲犬科（如：狗）、貓科（如：貓）及馬；食用哺乳 動物之一些實例爲豬、牛、羊，等。較合適的爲，該哺乳 動物爲人類或伴侶哺乳動物。最合適的爲，該哺乳動物爲 人類，男性或女性。 "治療中（treating)"、"治療（treat)”或"治療（treatment)"等 詞包含防止性（即預防性）及舒緩性治療。 ”周圍投藥” 一詞意指在中樞神經系統外投藥。周圍投 • 藥不包括直接給至腦部。周圍投藥包括，但不限於：血管 內、肌肉內、皮下、吸入、口服、舌下、腸內、直腸、透 皮或鼻內投藥。 適合用於本發明之非天然胺基酸通常爲除了該20種天 然胺基酸外之任何下列式所示之胺基酸（Cantor and Shimmel 5 Biophysical Chemistry ^ Part 1 > WH Freeman & Sons > San Fransisco，42-43，1980)，其中 R1爲任何取代 基，包含酮基、硫醇、經基、羧基、或游離胺基官能，例 如：那些美國專利申請案第2005/0208536號（其全文倂爲 -19- (16) 1310038 此文之參考資料）中所揭示者。 R1

H2N C02H 這類非天然胺基酸包括，例如：硫基酪胺酸、鳥胺酸 、锍基苯丙胺酸、3-或4-胺基苯丙胺酸、3-或4-乙醯基苯 丙胺酸、2-或3-羥基苯丙胺酸（鄰-或間-酪胺酸）、羥甲基 甘胺酸、胺乙基甘胺酸、1-甲基-1-锍乙基甘胺酸、胺乙 基硫乙基甘胺酸及巯乙基甘胺酸。許多可用於本發明之非 天然胺基酸均可在市面上購得。其他可藉由本技藝所已知 之方法製備。例如：硫基酪胺酸可藉由 Lu et 7173-7180，1997，（其倂爲此文 之參考資料）所描述之方法製備。 ”人類PYY ”或” hPYY ”一詞意指具有下列胺基酸序列 之36-胺基酸C-端醯胺化之多肽： YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:1] ”hPYY3.36”一詞意指該具有下列胺基酸序列之 C-端 34-mer hPYY ： IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:2] "(E10C)hPYY3.36 ”一詞意指其中該hPYY之麩胺酸殘 基10被半胱胺酸殘基所取代之C-端 34-mer hPYY，且其 具有下列胺基酸序列： IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:3], ”（DllC)hPYY3_36”一詞意指其中該hPYY之天門冬胺 -20- (17) 1310038 酸殘基11被半胱胺酸殘基所取代之 且其具有下列胺基酸序列： IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH, 發明之詳細說明 本發明關於爲PYY3-36變異體及 之PYY激動劑，其可具有至少一種 Φ 此之改良的化學或物理性質：降低之 漿停留期間、延長之活體內活性、增 定性、改良之溶解度及降低之抗原性 較佳之本發明PYY3-36變異體爲 一種較佳之變異體爲（D1 lC)hPYY3.36 之變異體可以合成方式及藉由重組及 實例中所描述之方式製備。 除了上述之取代（如：E10C及 φ ργγ激動劑亦可在其他胺基酸位置處 胺基酸取代。保留性取代可根據，如 非極性、極性-未帶電荷及極性-帶電 代其他爲親脂性非極性、極性-未帶1 胺基酸。較合適的爲，這類取代出現 胺基酸間。保留性胺基酸取代亦可依 酸間製造。 端 34-mer hPYY ’ [SEQ ID NO：4]. 其聚乙二醇化共軛物 選自下列，但不限於 清除速率、增加之血 加之效力、增加之穩 〇 (E10C)hPYY3-36。另 。這些及其他本發明 其他如下文和此文之 D11C)外，本發明之 包含一或，多種保留性 :下表製造。親脂性 荷之胺基酸可分別取 i荷或極性-帶電荷之 在下表第三欄之同列 下表所列在芳族胺基 -21 - (18) 1310038

脂族 非極性 GAP ILV 極性-未帶電荷 CSTM NQ 極性-帶電荷 DE KR 芳族 HFWY

合成之製備方法

本發明之PYY3-36變異體，如：（E10C)hPYY3.36及 (DllC)hPYY3_36可利用本技藝所已知之標準肽合成技術製 備，如：以芳族肽合成儀（如：型號433A ; Applied Biosystems Foster City, CA)，利用 tBoc 或 Fmoc 化學進行 固相肽合成反應。許多肽合成技術之摘要可在SiWM Phase Peptide Synthesis 2nd e d . (S t e w a r t. J . M . a m d Young， J.D.Pierce Chemical Company，Rockford，IL，1984)。中 找到。亦見 iSo/iii-jP/iase Orgflwic Syni/iesi'WBurgess，Κ·， John Wiley & Sons ' New York > NY，2000)—書及 Engels et 28 : 716-34，1989文獻。所有 上述參考資料倂爲此文之參考資料。 本發明之PYY3-36變異體宜與PEG結合。結合反應（ 稱爲聚乙二醇化反應）傳統上係在溶液中以莫耳過量之聚 合物進行，且不需考慮該聚合物連接蛋白質之位置。然而 ，這類通用技術大多已證明不適合用於將生物活性蛋白質 -22 - (19) 1310038 結合至非抗原性聚合物，而仍保留足夠之生物活性。一種 將PYY3.36激動劑變異體聚乙二醇化後仍維持其生物活性 的方法爲在偶合過程中大體上避免將變異體之任何與激動 劑之結合有關的反應基與靶的受體結合。本發明之一種觀 點係提供將聚乙二醇結合至本發明之ργγ3.36變異體激動 劑的特殊反應部位的方法，該部位實質上不會干擾受體結 合部位，而可保留高度活性。本發明之另一種觀點係將反 φ 應殘基插入ΡΥΥ3-36 ’以提供其激動劑變異體，此變異體 與聚乙二醇結合時可使活性之改變有限。 透過共價鍵之化學修改反應可在任何常用於生物活性 物質與活化之PEG的結合反應的合適條件下進行。結合 反應係在相當温和之條件下進行，以避免將PYY3-36變異 體激動劑去活化。温和條件包括將反應溶液之pH維持在 約3至10之範圍內並將反應温度維持在約〇°C至40 °C之範圍 內。與活化之PEG在聚乙二醇化條件下反應之PYY3_36變 φ 異體中之非靶的官能性宜以合適之保護基保護，該保護基 可在靶的官能性聚乙二醇化後移除。在以，如：PEG醛類 或PEG琥珀醯亞胺之試劑將游離胺基進行聚乙二醇化之 反應中通常係將pH維持在約3至10之範圍內，宜在約4至 7.5之範圍內。偶合反應宜在合適之緩衝液（pH3至10)，如 :磷酸鹽、MES、檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽或HEPES 中進行約1至48小時，而使用之温度係在約4°C至4〇°C之範 圍內。在利用，如：PEG馬來醯亞胺、PEG乙醯碾或PEG 正吡啶基二硫化物之試劑將硫醇基進行聚乙二醇化時宜將 -23 - (20) 131.0038 pH維持在約4至8之範圍內。PEG胺可用來將酮基（如：在 對·乙醯苯基丙胺酸中）聚乙二醇化，且可依Pillai et al.，J_Org.C/iem.45: 5 364-5 370，1980中之描述製備。 本發明之結合反應通常提供含有所需之單聚乙二醇化 PYY3-36變異體及未反應之ργγ3.36變異肽、未反應之PEG 的反應混合物或累積物且高分子量物種通常少於約20 %， 此反應混合物或累積物可包括含有超過一種PEG股及/或 φ 聚集之物種的共軛物。移除未反應之物種及高分子量物種 後回收主要含有單聚乙二醇化之ργγ3-36變異體的組成物 。已知該共軛物通常包含單一聚共軛物股，.該共軛物爲實 質上同質的。 所需之peg-pyy3.36變異體共軛物可藉由通常用於純 化蛋白質之習知方法，如：透析、鹽析、超瀘、離子交換 色層分析法、疏冰性交互作用色層分析法（HI C)、凝膠色 層分析法及電泳，從反應混合物中純化。離子交換色層分 φ 析法在移除任何未反應之PEG或未反應之PYY3_36變異體 方面特別有效。分離所需之ΡΥΥ3-36變異體共軛物可藉由 將含有混合之物種的反應混合物置於pH値爲約4至約10( 宜低於8以避免去醯胺化）之緩衝液中來作用。緩衝液宜含 有選自下列（但不限於此）之一或多種緩衝鹽：KC1，NaCl ，K2HP〇4 ， KH2P〇4 ， Na2HP04 ， NaH2P04 ， NaHC03 ， NaB04及 CH3C02Na。 若聚乙二醇化反應中所使用之緩衝系統與分離方法中 所使用者不同則該聚乙二醇化反應混合物需進行緩衝液交 -24- (21) 1310038 換/透析過濾或以足量之起始分離緩衝液稀釋。 將共軛物分餾成含有所需物種之累積物的方法宜利用 離子交換色層分析基質進行。這類基質可藉由電荷差異選 擇性地結合PEG-PYY3-36變異體共軛物，該電荷差異之變 化方式略可預測。例如：PYY3-36變異體之表面電荷係藉 由肽表面上可用之帶電基團的數目測定，該基團可與管柱 支撐物交互作用，不受PEG之存在影響。這些帶電基團 Φ 通常係作爲PEG聚合物之可能連接點。因此，PEG-PYY3-36 變異體共軛物將具有與其他存在物種不同之電荷，以容許 選擇性分離。 離子交換樹脂特別適合用於純化本PYY3-36變異體共 軛物。陽離子交換樹脂（如：磺丙基樹脂）可用於本發明之 純化方法中。適合用於本發明之陽離子交換樹脂的非限制 性列表包括：SP-hitrap®、SP Sepharose HP® 及 SP Sepharose®fast flow。亦可使用其他合適之陽離子交換樹 φ 脂，如：S及CM樹脂。 陽離子交換樹脂宜裝塡在管柱中，並藉習知方法平衡 。使用具有與PEG_結合ΡΥγ 3 3 6變異體的溶液相同之pH 及渗透度的緩衝液。洗提緩衝液宜含有一或多種選自下列 (但不限於此）之鹽類：CH3C02Na，HEPES，KC1，NaCl， K2HP〇4，KH2PO4，Na2HP〇4，NaH2P04 ’ NaHC03， NaB04 ’及（NH4)2C〇3。然後，讓該包含共軛物之溶液吸 附在吕柱上’而未反應之peg及一些筒分子量之物種並 未被保留°完成裝塡後，將具有逐漸增加之鹽濃度之洗提 -25 - (22) 1310038 緩衝液的梯度流體施放在管柱，以洗提出所需之PEG-結 合PYY3-36變異體的分液。在陽離子交換分離步驟後，該 洗提出之累積分液宜限於均勻之聚合物共軛物。然後，可 藉由習知技術將任何未結合之ΡΥΥ3-36變異體物種從管柱 中清洗去除。需要時可將單-及多-聚乙二醇化之ΡΥΥ3-36 變異體物種及較高分子量物種進一步經由另外之離子交換 色層分析法或尺寸排除色層分析法彼此分離。 Φ 利用數個逐漸增加濃度之等梯度步驟的技術可用來取 代線性梯度。數個逐漸增加濃度之等梯度洗提步驟可依序 洗提出多-聚乙二醇化/聚集之ΡΥΥ3-36變異體，再洗提出 單-聚乙二醇化之ΡΥΥ3-36變異體共軛物。亦可使用以pH 梯度爲基礎之洗提技術。洗提之温度範圍通常係在約4 °c 至約25 °C之間。PEG-PYY3_36變異體之洗提係藉由280nm 處之UV吸收進行監測。透過簡單之時間洗提略圖可完成 分液之收集。 重組表現 核酸分子 編碼（E10C)hPYY3.36多狀之核酸分子可包含一種下列 核酸序列（E10C取代之密碼子突變爲下方劃線者）： atcaaacccgaggctcccggctgtgacgcctcgccggaggagctgaaccgctactacgcciccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcg gtat(SEQ ID NO: 5);或 atcaaacccgaggctcccggctgcgacgcctcgccggaggagctgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagc ggtat (SEQIDNO: 6). 編碼卬11(：)1^¥¥3_36多肽之核酸分子可包含一種下列 核酸序列（D 11C取代之密碼子突變爲下方劃線者）： -26 - (23) .131.0038 atcaaacccgaggctcccggcgaatgtgcdcgccggaggagctgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcg gtat (SEQ ID NO: 7); ^ atcaaacccgaggctcccggcgaatgcgcctcgccggaggagctgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagc ggtat (SEQ ID NO: 8). 這些序列亦可在c端包含一終止密碼子（如：tga、taa ' 、tag)且可很容易地以多種不同之方法取得，包括，但不 限於：化學合成、將從cDNA取得之野生型hPYY多核苷

酸序列進行遺傳突變或基因組庫篩選、表現庫篩選及/或 cDNA之聚合酶鏈反應（PCR)增數。編碼（E10C)hPYY3-36及 φ (〇11(：)1^¥¥3.36變異體之核酸分子可利用定點突變、PCR . 增數或其他合適之方法製造，其中該引物具有所需之單點 突變。此文所描述.之重組DNA方法及致突變方法大多爲 Sambrook et al. ,Mo lecular Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)和

Current Protocols in Molecular B i ο I 〇 gy (Ausub t\ et al. ,eds. ’ Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994) 所提出者。當需要另一非天然胺基酸取代E10或Dll時可 鲁 利用，例如：美國專利申請刊物第2〇05/020853 6號（其倂 爲此文之參考資料）中所描述之方法，以重組方式表現這 ^ 類肽。 編碼hPYYs之胺基酸序列的核酸多核苷酸可藉由表 現選殖法來鑑疋，其係根據表現出之蛋白質的性質偵測陽 性選殖株。通常’核酸庫係藉由讓抗體或其他結合夥伴（ 如：受體或配體）結合那些表現並顯現在宿主細胞表面上 之選殖的蛋白質來進行篩選。該抗體或結合夥伴係以可偵 測之標示修改’以鑑定那些表現所需之選殖株的細胞。 -27- (24) 1310038 根據下列描述進行之重組表現技術可用來製造編碼 (ElOC)hPYY3.36及（DllC)hPYY3.36之多核苷酸並用來表現 所編碼之多肽。例如：本技藝之技術熟習人士可藉由將編 • 碼（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3_36變異體之胺基酸序列 . 的核酸序列插入合適之載體中很容易地大量製造所需之核 苷酸序列。然後，可使用該序列來製造偵測探針或增數引 物。或者，可將編碼（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3.36# φ 狀之胺基酸序列的多核苷酸插入表現載體中。將表現載體 、 引入合適之宿主中可大量製造編碼的（E10C)hPYY3.36或 (DllC)hPYY3.36變異體。 另一種用於取得合適合之核酸序列的方法爲聚合酶鏈 反應（PCR)。在此方法中係利用逆轉錄酶從多聚（A) + RNA 或總RNA製備cDNA。然後，將二種引物（其通常與編碼 (丑10(：)1^¥丫3.36或（〇11〇1^¥丫3-36變異體之胺基酸序列之 cDNA的二個不同區域互補）加入cDNA中，並加入聚合酶 φ (如：Taq聚合酶），該聚合酶可將二種引物間之cDNA區 增數。 . 另一種製備編碼（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3.36 變 異體之胺基酸序列的核酸分子的方法爲利用本技藝之技術 熟習人士所熟知之方法（如：Engels et al.，Angew.C/zem. /«ί/ 2S : 716-34，19 8 9所描述者）進行化學合成。這些方 法包括用於合成核酸之磷酸三酯、亞磷胺（phosphoamidite)及 膦酸酯方法。用於這類化學合成之較佳方法爲使用標準亞 磷胺化學之聚合物-支撐合成法。通常，該編碼（E10C)hPYY3.36 -28 - (25) 1310038 之胺基酸序列之DNA的長度約爲100個核苷酸。大於約100 個核苷酸之核酸可利用這些方法合成爲數個片段。然後可 將片段連接在一起以形成（E10C)hPYY3_36基因之全長核苷 酸序列。 編碼多肽之胺基端的DNA片段可具有ATG，其編碼 甲硫胺酸殘基。根據宿主細胞中所製造之多肽是否係從該 細胞中分泌出，此甲硫胺酸可能或可能不出現在成熟型之 Φ 斤10(：)1^丫丫3-36或（DllC)LP443-36上。編碼異白胺酸之密 碼子亦可作爲起始部位。亦可使用其他本技藝之技術熟習 人士所已知之方法。在某些實施態樣中，核酸變異體含有 已經過改造，以讓（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3.36在指 定之宿主細胞中有最佳表現之密碼子。特殊之密碼子改造 將取決於（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3.36以及選定之用 於表現的宿主細胞。這類"密碼子最優化"可藉多種不同之 方法進行，例如：選擇較適合用於在指定之宿主細胞中高 φ 度表現之基因的密碼子。亦可使用電腦演算法，此演算法 納入用於高度表現之細菌基因之密碼子偏好的密碼子頻率 表（諸如：Eco_high.Cod)，且可由威斯康辛大學包9.0版 (Genetics Computer Group，Madison,Wis.)提供。其他有 用之密碼子頻率表包括：''Celegans_high.cod，〃 ''Celegans_low.cod， "^ Drosophila_high.cod,// vv Human_high.cod,// ''Maize_high.cod,// and 'Yeast high.cod"。 載體及宿主細胞 -29- (26) 131.0038 利用標準接合技術將編碼（E10C)hPYY3-36* (DllC)hPYY3.36之胺基酸序列的核酸分子插入合適之表現 載體中。通常係選擇可在所使用之特殊宿主細胞中作用之 載體（即，該載體與宿主細胞之組織結構相容，以使基因 可增數及/或使基因表現）。編碼（E10C)hPYY3_36或 (DllC)hPYY3_36之胺基酸序列的核酸分子可在原核細胞、 酵母菌、昆蟲（桿狀病毒系統）及/或真核宿主細胞中增數/ φ 表現。表現載體之回顧，見：Meth.Enz.vol.l85(D.V.Goeddel， ed.，Academic Press，1990)。 通常，用於任何宿主細胞中之表現載體將含有用於保 持質體及用於選擇之序列並可表現外生性核苷酸序列。這 類序列（在某些實施態樣中總稱爲"側翼序列"）通常將包括 一或多種下列核苷酸序列：啓動因子、一或多種增强子序 列、複製起源、轉錄終止序列、含有捐贈者及接受者 DNA剪接部位之完整內插子序列、編碼用於分泌多肽之 φ 領導序列的序列、核糖體結合部位、聚腺苷酸化序列、用 於插入編碼欲表現之多肽的核酸的多連接子區及可選擇之 標記要素。這些序列各討論於下。 隨意地，該載體可含有"標籤"-編碼序列，即：位於 斤10(：)1^¥丫3-36或（〇11(：)1^¥丫3-36編碼序列之5'或3|端的 寡核苷酸分子；該寡核苷酸序列編碼聚His(諸如hexaHis) 或其他”標籤π，諸如：FLAG、ΗA(血球凝集素流行感冒病 毒）或myc(其抗體可購得）。此標籤通常會在多肽表現時融 合至多肽，且可作爲從宿主細胞中親和力純化 -30- (27) 131.0038 (E10C)hPYY3-36或（DllC)hPYY3.36的工具。親和力純化作 用可利用對抗該標籤之抗體作爲親和力母質’藉由’例如 :管柱色層分析法來完成。隨意地，接著藉由不同工具從 (E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3_36 移除標籤，諸如：使用 某些用於裂解之肽酶，如：以腸激酶分解FLAG標籤序列 之3·，該FLAG標籤序列爲SEQ ID NOs: 3-4中所示之一 種胺基酸序列的上游。 φ 側翼序列可爲同源（即：來自與宿主細胞相同之物種 及/或菌株）、異源（即：來自除宿主細胞外之物種或菌株） 、雜種（即：來自超過一種來源之側翼序列的組合）或合成 的，或者，該側翼序列可爲正常作用以調控PYY3.36之表 現之天然序列。側翼序列之來源可爲任何原核或真核有機 體、任何脊椎或非脊椎有機體或任何植物，只要該側翼序 列可在宿主細胞中作用且可被宿主細胞機構活化。 可用之側翼序列可藉由數種本技藝所熟知之方法中的 • 任一種取得。通常，此處所使用之側翼序列（除PYY基因 側翼序列外）先前已藉由繪製圖輿及/或限制核酸內切酶分 解來鑑定出，因此，可利用適當之限制核酸內切酶從正確 之組織來源中分離出。在一些情況中可能知道側翼序列之 全部核苷酸序列。此處，該側翼序列可利用此文中所描述 之用於合成核酸或選殖之方法合成。 當已知全部或僅一部分之側翼序列時，可利用PCR 及/或以來自相同或其他物種之合適的寡核苷酸及/或側翼 序列片段篩選基因庫來取得側翼序列。當未知側翼序列時 -31 - (28) (28)1310038 ，可從可能含有，如：編碼序列或甚至是其他基因之大片 DNA中分離出含側翼序列之DNA片段。分離時可藉由限 制核酸內切酶分解來製造適當之DNA片段，再利用瓊脂 糖凝膠純化、Qiagen®管柱色層分析法（Chatsworth，CA) 或其他本技藝之技術熟習人士所已知之方法分離出。選擇 合適之酶以完成此目的對本技藝之技術熟習人士而言將是 很容易的。 複製起源通常爲那些可購得之原核表現載體的一部分 ，該起源協助載體在宿主細胞中增數。在一些情況中，將 載體增數至一定複本數對完美表現（E10C)hPYY3.36或 (DllC)hPYY3_36而言很重要。若所選擇之載體不含有複製 起源部位時可根據已知序列以化學方式合成，再將其接合 入載體中。例如：來自質體pBR322(New England Biolabs ’ Beverly，ΜΑ)之複製起源適合用於大部分革蘭氏陰性細 菌，而哺乳動物細胞選殖載體可使用多種不同之起源（如 :SV40、多瘤、腺病毒、泡狀口炎病毒（VSV)或乳頭狀瘤 病毒’如：HP V或BPV)。一般而言，哺乳動物表現載體 並不需要該複製起源成分（如：通常係使用SV40起源，因 其含有早期啓動因子）。 轉錄終止序列通常位於多肽編碼區之3 '端並用來終止 轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列爲富含G_C之 片段，其後接著聚-T序列。雖然該序列很容易從集合庫 中選殖或甚至可以載體之一部分的型式購得，其亦可很容 易地利用合成核酸之方法（如：此文所描述者）合成。 -32- (29) 131.0038 可選擇之標記基因要素編碼宿主細胞在選擇性培養基 質中存活及生長時所必要之蛋白質。典型之選擇標記基因 編碼具下述功能之蛋白質：（a)提供原核宿主細胞對抗生 素或其他毒素（如：安苄青黴素、四環黴素或卡納黴素）之 抗性；（b)補充細胞之營養缺陷的不足；或（c)供應無法從 複合基質中取得之關鍵營養。較佳之可選擇性標記爲卡納 黴素抗性基因、安苄青黴素抗性基因及四環黴素抗性基因 φ 。亦可使用新黴素抗性基因在原核及真核宿主細胞中進行 選擇。 其他選擇基因可用來將可表現之基因增數。增數爲一 種過程，其中製造生長所必要之蛋白質時需求較大之基因 在重組細胞之連續世代的染色體中串聯重複。適合用於哺 乳動物細胞之可選擇性標記的實例包括：二氫葉酸還原酶 (DHFR)及胸腺核苷激酶。將哺乳動物細胞轉形株置於選 擇壓力下，在此選擇壓力下僅有轉形株因載體中所存有之 φ 選擇基因的造福而能獨特存活。選擇壓力之施加係藉由將 轉形細胞培養在其中該基質中之選擇劑濃度連續改變的情 況下，而使選擇基因及編碼（E10C)hPYY3_36或（DllC)hPYY3.36 的 DNA增數。因此，可由增數之 DNA合成增量之 (E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3-36。 核糖體結合部位通常爲開始轉譯mRNA所必要且其特 徵爲Shine-Dalgarno序列（原核細胞）或Kozak序列（真核 細胞）。該要素通常位於啓動因子之3 ’及欲表現之 (E10C)hPYY3_36 或（DllC)hPYY3-36 之編碼序列的 5’。該 -33 - (30) 131.0038

Shine-Dalgarno序列可有所變化但通常爲聚嘌哈（即：具 有高A-G含量）。現已鑑定出許多Shine-Dalgarno序列， 其各可利用此文所提出之方法很容易地合成並可用於原核 載體中。 領導或訊號序列可在宿主細胞外用來指揮（E10C)hPYY3_36 或（DllC)hPYY3_36。通常，編碼訊號序列之核苷酸序列係 位於（E10C)hPYY3-36或（DllC)hPYY3_36核酸分子之編碼區 φ 中或直接位於（E10C)hPYY3-36或（DllC)hPYY3-36編碼區之 5’端。現已鑑定出許多訊號序列，且任何可在選定之宿主 細胞中行使功能者均可與斤10(：)1^¥¥3-30或（〇11(：)1^¥¥3-36 核酸分子一起使用。因此，訊號序列與卩1〇〇：)1^¥¥3_36或 (DllC)hPYY3.36核酸分子可爲同源（天然產生）或異源。另 外，訊號序列可利用此文所描述之方法以化學方式合成。 在大部分情況中，經由存有訊號肽而從宿主細胞分泌出 (E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3_36可造成訊號肽從分泌出 • 之（E10C)hPYY3.36或（D1 lC)hPYY3.36移除。訊號序列可爲 載體之一種成分或可爲插入載體中之（El〇C)hPYY3_36或 (DllC)hPYY3-36核酸分.子的一部分。 可將編碼天然hPYY3.36訊號序列之核苷酸序列連結 (E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3 — 36編碼區，或者’可將編 碼異源訊號序列之核苷酸序列連結（El〇C)hPYY3 — 36或 (DllC)hPYY3-36編碼區。所選擇之異源訊號序列應爲可被 宿主細胞辨識及處理，即：由訊號肽酶裂解之序列。在不 會辨識及處理天然hPYY訊號序列之原核宿主細胞方面， •34- (31) .1310038 該訊號序列係被，例如：選自下列之原核訊號序列所取代 :鹼性磷酸酶、青黴素酶或熱穩定內毒素Π領導序列。在 酵母菌之分泌方面，天然hPYY訊號序列可被酵母菌轉化 • 酶、α因子或酸性磷酸酶領導序列所取代。在哺乳動物細 - 胞之表現中’天然訊號序列令人滿意，但其他哺乳動物訊 號序列仍可適用。 在許多情況中，核酸分子之轉錄作用可由載體中所存 ^ 有之一或多個內插子增加；此點特別適用於當多肽係在真 核宿主細胞（尤其是哺乳動物宿主細胞）中製造時。使用之 內插子可能天然存在於hPYY基因中，尤其當所使甩之基 因爲全長基因組序列或其片段時。當該內插子並非天然存 在於hPYY基因中（如：大部分之cDNA)時，該內插子可 從其他來源取得。因該內插子必須經過轉錄生效，內插子 相關於側翼序列及hPYY基因之位置通常很重要。因此， 當轉錄編碼（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3.36 之 cDNA 分 0 子時，內插子之較佳位置爲轉錄起始部位之3'及多聚-A轉 錄終止序列之5'。較合適的爲，該內插子係位於cDNA之 _ 一邊或另一邊（即5’或3')，如此其不會中斷該編碼序列。 可使用之內插子可來自任何來源，包括：病毒、原核及真 核（植物或動物）有機體，其先決條件爲該內插子與其插入 之宿主細胞相容。此文中亦包括合成之內插子。隨意地’ 載體中可使用超過一種內插子。 表現及選殖載體通常含有可被宿主有機體辨識且以可 操作方式連接編碼印1〇(：)1^丫¥3-36或（011(：)111>¥¥3.36之分 -35- (32) 1310038 子的啓動因子。啓動因子爲控制構造基因轉錄之位於構造 基因（一般在約100至1,000 bp之內）之起始密碼子上游（即 5 ’）的未轉錄序列。傳統上，啓動因子可分類成二種類別 之一：可誘導之啓動因子及構造性啓動因子。當可誘導之 啓動因子對培養條件中的一些變化（諸如：存有或不存有 營養或温度之變化）發生反應時便開始增加受其控制之 DNA的轉錄量。另一方面，構造性啓動因子起始連續之 φ 基因產物製造；亦即：對基因表現僅有些微或沒有控制。 本技藝熟知大量可被多種不同可能之宿主細胞辨識的啓動 因子。藉由限制酶分解可從DNA來源移除啓動因子，再 將所需之啓動因子序列插入載體中，以將合適之啓動因子 以可操作方式連接編碼（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3-36 之DNA。天然hPYY3.36啓動因子可用來指導（E10C)hPYY3-36或 (DllC)hPYY3.36核酸分子增數及/或表現。然而，與天然 啓動因子相較下，若異源啓動因子可允許較多之轉錄作用 φ 及產生較多表現出之蛋白質，且若其可與選擇使用之宿主 細胞系統相容時，異源啓動因子爲較佳者。 適合與原核細胞宿主一起使用之啓動因子包括：β -內 醯胺酶及乳糖啓動因子系統；大腸桿菌Τ7可誘導之RNA 聚合酶；鹼性磷酸酶；色胺酸（trp)啓動因子系統；及雜種 啓動因子，諸如：tac啓動因子。其他已知之啓動因子亦 適合。這些啓動因子之序列已發表，藉此可使本技藝之技 術熟習人士依需要利用連接子或接合子將其與所需之 DNA序列接合，以提供任何有用之限制部位。 -36- (33) 1310038 適合與酵母菌宿主一起使用之啓動因子亦爲本技藝所 熟知。酵母菌增强子可很方便地與酵母菌啓動因子一起使 用。適合與哺乳動物宿主細胞一起使用之啓動因子已爲人 所熟知，包括，但不限於那些從病毒之基因組取得者，諸 如：多瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒（如：腺病毒2)、牛乳 頭狀瘤病毒、鳥肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B 型肝炎病毒及最合適之猴病毒40(SV40)。其他合適之哺乳 % 動物啓動因子包括異源哺乳動物啓動因子，例如：熱休克 -啓動因子及肌動蛋白啓動因子。 在控制（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3-36之表現方面 具重要性之其他啓動因子包括，但不限於：SV40早期啓 動因子區（Bemoist and Chembon，Nature 290: 304-10， 1981) ; CM V啓動因子；包含在R0US肉瘤病毒之3 I長端重 複子中的啓動因子（Yamamoto et al.，Ce// 22 : 787-97， 1980);疱疹胸腺核苷激酶啓動因子（Wagner et ^ al ·，Pr〇c. iVfl "· A cad. Sci. [/· «S. A · 7 8 : 1 444 - 45，1 9 8 1);金屬 硫堇基因之調控序列（Brinster et 296: 39-42， 1982) ;原核表現載體，如：β-內醯胺啓動因子（乂出3_ Kamaroff et &l.,Proc.Natl.Acad > S ci. U. S .A .7 5 ： 3727-31 » 1978);或 tac 啓動因子（DeBoer et

Sci. U.S.A.SO ： 21-25，1983)。 可將增强子序列插入載體中以增加較高等真核細胞中 編碼（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3‘36 之 DNA 的轉錄。增 强子爲作用在啓動因子以增加轉錄之DNA的順式-作用要 -37 - (34) 1310038 素，其長度通常約爲10-300bp。增强子相當地倚賴方向及 位置。其被發現係在轉錄單位之5’及3'。現已知數種可從 哺乳動物基因取得之增强子序列（如：球蛋白、彈性蛋白 ' 酶、白蛋白、胎兒蛋白及胰島素）。然而，通常係使用 - 來自病毒之增强子。SV40增强子、巨細胞病毒早期啓動 因子增强子、多瘤增强子及腺病毒增强子爲用於活化真核 細胞啓動因子之示範性增强要素。雖然可將增强子剪接入 φ 載體中編碼（E10C)hPYY3-36或（DllC)hPYY3.36之核酸分子 . 的5 '或3 1位置處，但其通常係位於啓動因子之5 1位置處。 表現載體可從起始載體（如：市售之載體）建構。這類 載體可含或可不含所有需要之側翼序列。當此文所描述之 一或多種側翼序列並非早已存在載體中時，其可個別取得 後再接合入載體中。用於取得各側翼序列之方法爲本技藝 之技術熟習人士所熟知。 較佳之載體爲可與細菌、昆蟲及哺乳動物宿主細胞相 • 容者。這類載體包括，尤其是：pCRII、pCR3及pcDNA3.1(因 維特金（Invitrogen)，Carlsbad，CA)、pBSII (史崔塔金 (Stratagene)，La Jalla，CA)、pET15(諾瓦金（Novagen)， Madison，WI)、pGEX(法馬西亞（Pharmacia)生物技術， Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(克隆泰克（Clontech)，Palo Alto，CA)、pETL (布鲁貝克 n(BlueBacn)，因維特金）、 pDSR- a (PCT 申請案刊物第 WO 90/14363號）及 pFastBacDual(吉布可（Gibco)-BRL，Grand Island，NY)。 其他合適之載體包括，但不限於：黏接質體、質體或 -38 - (35) 1310038 修改之病毒，但需體察該載體系統必須與所選之宿主細胞 相容。這類載體包括，但不限於：質體，如：Bluescript® 質體衍生物（高複本數ColEl爲基礎之噬粒（phagemid)，史 崔塔金）、經設計用於選殖經T a q增數之p c R產物的P C R 選殖質體（如：TOPO®TA選殖®套組，PCR2.1®質體衍生 物’因維特金）及哺乳動物、酵母菌或病毒載體，諸如： 桿狀病毒表現系統（p B a c P A K質體衍生物，克隆泰克）。 鲁 建構好載體且將編碼（E10C)hPYY3-36S (D1 lC)hPYY3-36 多肽後之核酸分子插入載體中之適當位置後，可將完整之 載體插入供增數及/或多肽表現之合適宿主細胞中。可將 斤10〇1^¥丫3-36或（DllC)hPYY3.36#肽之表現載體藉由本 技藝所熟知之方法轉形入選定之宿主細胞中，這些方法係 如：轉染、感染、電穿孔、顯微注射、脂染、DEAE-葡聚 糖法或其他已知技術。所選擇之方法一部分爲欲使用之宿 主細胞類型的機能。這些及其他合適之方法爲本技藝之技 ^ 術熟習人士所熟知且列於，如：S a m b r ο o k e t a 1.，同上中。 宿主細胞可爲原核宿主細胞（如：大腸桿菌）或真核宿 主細胞（如：酵母菌、昆蟲或脊椎動物細胞）。宿主細胞在 適當之條件下培養時可合成（E10C)hPYY3_36或（DllC)hPYY3.36 多肽，此多狀可接著從培養基質中收集（若宿主細胞將其 分泌入基質中）或直接從製造彼之宿主細胞收集（若非爲分 泌出者）。適當之宿主細胞係根據不同因子選擇，如：所 需之表現水準、活性所需或必要之多肽修改（諸如糖化或 磷酸化）及摺疊成生物活性分子之容易度。 -39- (36) 1310038 本技藝已知多種合適之宿主細胞且其中有多種可從美 國菌種保藏中心（American Type Culture Collection(ATCC)， Manassas Va)(ATCC)取得。其實例包括，但不限於：哺乳 動物細胞，諸如：中國大頰鼠卵巢細胞（CHO)、CHO DHFR(-)細胞（Urlaub et 4216-20，1980)、人類胚胎腎（HEK)293 或 293T 細胞或 3T3 細胞。選擇合適之哺乳動物宿主細胞及用於轉形、培養、 φ 增數、篩選、製造產物和純化的方法爲本技藝所已知。其 他合適之哺乳動物細胞株爲猴子COS-1和COS-7細胞株， 以及C V -1細胞株。其他示範性之哺乳動物宿主細胞包括 :靈長類細胞株及齧齒動物細胞株，包括轉形之細胞株。 正常之二倍體細胞 '從原始組織之活體外培養衍生之細胞 株及原始移出物亦合適。候選細胞可遺傳上缺少該選擇基 因或可含有顯性作用之選擇基因。其他合適之哺乳動物細 胞株包括，但不限於：老鼠神經母細胞瘤 N 2 A細胞、 φ HeLa、老鼠L - 9 2 9細胞、從瑞士、B a 1 b - c或NIΗ小鼠、 ΒΗΚ或HaK大頰鼠細胞株衍生之3Τ3細胞株。這些細胞株 各爲蛋白質表現技藝中之技術熟習人士所已知且可取得者 〇 細菌細胞可類似地作爲合適之宿主細胞。例如：多種 不同之大腸桿菌株（如：HB101、DH5a 、DH10及 M C 1 0 6 1)爲生物技術領域中所熟知之宿主細胞。多種不同 之枯草桿菌、假單胞菌屬、其他桿菌屬及鏈黴菌屬亦可用 於此方法中。 -40 - (37) 1310038 多種本技藝之技術熟習人士所已知之酵母菌細胞菌株 亦可作爲表現斤10(：)11?丫¥3-36或（〇11(：)1^丫丫3.36多肽之宿 主細胞。較佳之酵母菌細胞包括，如：釀酒酵母 (•Sacc/iflromyces cerivisiae)及嗜甲醇酵母（Pi'c/iifl pasioris) 另外，當需要時，可使用昆蟲細胞系統來表現 (E10C)hPYY3.36S(DllC)hPYY3.36。這類系統描述於，如 :Kitts et al.,1993，Biotechniques 14 : 810-17; Lucklow ，Curr.Opin > Biotechnol，4 : 564-72，1 9 9 3 ；及 Lucklow et al..，J.Virol.，67: 4566-79，1993中。較佳之昆蟲細胞 爲Sf-9及Hi5(因維特金）。

(E 10C)hPYY3-36M (D1 lC)hPYY3.36^ Μ MB 包含（£10(：)11?¥¥3-36或（〇11(：)1^¥¥3-36表現載體之宿 主細胞株可利用本技藝之技術熟習人士所熟知之標準基質 φ 培養。該基質通常含有所有細胞生長及存活所必要之營養 。培養大腸桿菌細胞之合適基質包括’如：Luria肉湯 (LB)及/或Terrific肉湯（TB)。培養真核細胞之合適基質 包括：R 〇 s w e 11 P a r k M e m 〇 r i a I I π s t i t u t e 基質 1640(RPMI 1640)、Minimal Eessential 基質（MEM)及/或 Dulbecco's 修 改之Eagle基質（DMEM)，其均可依培養之特殊細胞株的 需要補充血清/及或生長因子。適合培養昆蟲之基質爲依 需要補充以酵母酸化物、乳清蛋白水解酶及/或胎牛血清 之Grace、基質。 -41 - (38) 1310038 通常’用於選擇性長成轉染或轉形細胞的抗生素或其 他化合物係以補充物之型式加入基質中。欲使用之化合物 將由存於質體上之可選擇之標記要素（該宿主細胞係藉此 轉形）規定。例如：當可選擇之標記要素爲卡納黴素抗性 時，加入培養基質中之化合物將爲卡納黴素。其他用於選 擇性生長之化合物包括：安苄青黴素、四環黴素及新黴素 〇 • 宿主細胞所製造之（E10C)hPYY3.36S (DiiC)hPYY3_36 多肽的量可利用本技藝已知之標準方法評估。這類方法包 括，但不限於：西方點墨分析、SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳 法、非變性凝膠電泳法、高效能液相色層分析（HPLC)分 離法、免疫沈澱法及/或活性分析，諸如：DNA結合凝膠 移動分析。 若斤10(：)1^¥¥3.36或（〇11〇1^¥¥3.36係設計成從宿主 細胞株分泌出，則大部分多肽可在細胞培養基質中找到。 φ 然而，若多肽並非從宿主細胞分泌出，則其將存於胞漿及 /或細胞核（在真核宿主細胞方面）中或在胞質液（在革蘭氏 陰性細菌宿主細胞方面）中。 在位於宿主細胞胞漿及/或細胞核（在真核宿主細胞方 面）中或胞質液（在細菌宿主細胞方面）中的（E10C)hPYY3_36 或（DllC)hPYY3_36方面，可利用任何本技藝之技術熟習人 士已知之標準技術從宿主細胞中萃取出胞內物質（包括： 革蘭氏陰性細菌之包涵物）。例如，可將宿主細胞溶胞， 以藉由法國壓（French Press) '均化及/或超音波和接下去 -42 - (39) 1310038 之離心處理釋出周質/胞漿內之內容物。 若（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3.36在胞質液中形成 包涵物，該包涵物通常與內及/或外細胞膜結合，因此’ 在離心後主要可在沈澱小九物質中找到。然後，可在極端 pH値下處理沈澱小九物質或在還原劑之存在下（諸如：在 鹼性pH下使用二硫代蘇糖醇或在酸性pH下使用羧乙基 膦），以離液劑（chaotropic agent)(諸如：清潔劑、胍、胍 φ 衍生物、脲或脲衍生物）處理沈澱小九物質以釋出、分裂 及溶解包涵物。然後，可利用凝膠電泳法、免疫沈澱法， 等分析溶解之（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3-36。若需要 分離該多肽則可利用標準方法（諸如：那些描述於此文及 描述於 Marston et 182 : 264-75，1990中者） 來完成。 在（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3.36表現時若所形成 之包涵物未達可觀程度，則在將細胞均質液離心後主要可 φ 在上清液中找到多肽。多肽可進一步利用如此文所描述之 方法從上清液分離出。 從溶液純化（E10C)hPYY3-36或（DllC)hPYY3.36可利用 多種不同技術完成。若已合成多肽而使其羧基或胺基端含 有標籤，如：六聚組胺酸9(Hexahistidine 9)或其他小肽， 如：FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven > CT)或 myc( 因維特金），則其可在單一步驟方法中藉由將溶液通過親 和力管柱進行純化，其中該管柱母質對標籤具高親和力。 例如：多聚組織胺以高親和力及特異性結合鎳。因此 -43 - (40) 1310038 ，可使用鎳之親和力管柱（諸如：Qiagen®鎳管柱）來進行 純化。見’如：Cwreni _Proioco/s JV/o/ecw/a?* βζ’ο/ogy § 10.11.8(Ausubel et a 1., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons， 1993)° 另外，可經由使用能特異辨識及結合（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3_36多肽之單株抗體來純化（E10C)hPYY3_36 或（DllC)hPYY3_36多肽。 φ 在其中較適合部分或完全純化（E10C)hPYY3_36或 (DllC)hPYY3_36多肽以使其部分或大體上不含污染物的情 況中可使用本技藝之技術熟習人士所已知之標準方法。這 類方法包括，但不限於：藉由電泳及接下去之電溶離法進 行分離、不同類型之色層分析法（親和力、免疫親和力、 分子篩及離子交換法）、HPLC及製備性等電聚焦法 ("Isoprime"機器 /技術，Hoefer Scientific，加州舊金山市） 。在一些情況中，可組合二或多種純化技術來增加純度。 • 本技藝已知多種其他用於製造多肽的方法且該方法可 用來製造（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3-36多肽。見，如 :Roberts et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94 ： 1 2297-303 ’ 1997，其描述製造mRNA及其編碼之肽間的融合蛋白質 的方法。亦見，Roberts，Cur.〇pin.Chem.Biol.3 ' 268-73 ，1999 ° 用於製造肽或多肽之方法亦描述於美國專利第 5,763，192; 5,814,476; 5,723,323及 5,817,483號中。該方 ^去涉及製造技巧推測之基因或其片段，然後將這些基因引 -44- (41) 1310038 入宿主細胞中，該宿主細胞再製造一或多種由此技巧推測 之基因所編碼之蛋白質。然後’筛選宿主細胞以鑑定那些 製造具所需活性之肽或多肽的選殖株。其他用於表現重組 肽之方法揭示於美國專利第6，103,495、6,210,925、 6,627,438和6，737,250號中。該方法係利用大腸桿菌及大 腸桿菌一般分泌途徑。該肽係融合至一訊號序列；因此， 該狀係經分泌出。 φ 另一用於製造肽或多肽之方法描述於PCT專利申請 文獻第 WO 99/15650號中。刊登之方法（稱爲任意活化用 於發現基因之基因表現）涉及藉由原位重組方法活化內生 性基因之表現或過量表現基因。例如：內生性基因之表現 係藉由將調控序列整合入靶的細胞來活化或增加內生性基 因之表現，該靶的細胞可藉由非同源或不合理之重組來活 化基因表現。先將靶的DNA進行放射照射並插入遺傳啓 動因子。啓動因子最後在基因前面放置一裂縫，起始基因 φ 轉錄。此造成所需肽或多肽之表現。 醯胺化 以合成或重組方式將肽醯胺化可藉由一種稱爲肽基-甘胺酸α -醯胺化一氧化酶（PAM)之酶完成。當利用細菌表 現系統重組製造（E10C)hPYY3.36* (DllC)hPYY3-36肽時， 該肽可利用重組PAM酶藉由玻管內反應將C端醯胺化。 該 PAM酶來源、其製造及純化方法以及可用來將 (E10C)hPYY3_36或（D1 lC)hPYY3.36肽醯胺化之方法描述於 -45 - (42) 1310038 ，例如：美國專利第 4,708,934、5,789,234和 6,3 1 9,685 號 中。 選擇性斤1〇〇1^丫丫3.36及（〇11(：)1^丫丫3.36抗體 特異結合（E10C)hPYY3.36 或（DllC)hPYY3.36多肽，在 半腕胺酸取代部位有或無聚乙二醇化（如此文所描述者）， 但不會選擇性結合天然hPYY3.36之抗體及抗體片段係在本 Φ 發明之範圍內。抗體可爲多株，包括單特異性多株；單株 ;重組；嵌合；人類化，如：經移植CDR者；人類；單 鏈；及/或雙特異性；以及其片段；變異體或衍生物。抗 體片段包括那些結合（£10(：)1^¥¥3-36或（〇11(：)1^¥¥3-36多 肽上之抗原結合部位之抗體部分。這類片段之實例包括藉 由酶性裂解全長抗體所產生之Fab及F(ab')片段。其他結 合片段包括那些藉由重組DNA技術（諸如：表現含有編碼 抗體可變區之核酸序列的重組質體）所產生者。 φ 針對斤1〇(：)11?¥¥3-36或（DllC)hPYY3.36多肽之多株抗 體一般係藉由在動物體內（如：兔子或小鼠）多次SC或IP 注射斤10〇1^¥¥3-36或（〇11〇11?丫¥3_36多肽及佐劑來製造 。亦可將（E10C)hPYY3_36 或（DllC)hPYY3.36多肽與一種在 欲免疫化之物種內具致免疫性之載體蛋白質（諸如：鎖孔 帽貝血青蛋白（keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白 、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑）結合。再者， 可使用凝集劑，如：明礬來增強免疫反應。免疫化後，爲 動物抽血並分析抗（E10C)hPYY3_36S (〇11〇1^?¥3_36抗體 -46 - (43) .1310038 之滴定度。 針對（E10C)hPYY3.36* (D1 lC)hPYY3-36多肽之單株抗 體係利用任何藉由培養中之連續細胞株製造抗體分子的方 法製造。適合用於製備單株抗體之方法的實例包括KQhler 等人，Nature256: 495-97，1975之雜交瘤方法及人類B 細胞雜父瘤方法（Kozbor，·7./»ίληΜηί?/.133 : 3001，1984 ; Brodeur et ζλ.,Monoclonal Antibody Production Techniwues and 籲 ，51-63(Marcel Dekker，Inc.，1987)。本發明亦提 供製造與（E10C)hPYY3-36或（DllC)hPYY3_36多肽反應之單株抗體 的雜交瘤細胞株。 藉由競爭性抑制作用測定單株抗體之特異性及親和力 的較佳方法可在 Harlow 和

Manual(Cold Spring Harbor Laboratories. 1989) ； Current

Protocols in Immunology(CoWigan et al.,eds. ' Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience，1993);及 Muller，Mei/i. φ Enzymol.92 589-601， 1988中找 SJ 。 本發明之嵌合型抗體可包含個別H及/或L免疫球蛋 白鏈。較佳之嵌合型Η鏈包含從特異於（£10(：)11?¥¥3-36或 (DllC)hPYY3-36多肽之非人類抗體之Η鏈衍生的抗原-結 合區，其連接至少一部分人類Η鏈C區（CH) ’諸如：CHi 或CH2。較佳之嵌合型L鏈包含從特異於（E10C)hPYY3-36 或（DllC)hPYY3-36多肽之非人類抗體之L鏈衍生的抗原-結合區，其連接至少一部分人類L鏈C區（CL)。本技藝已 知嵌合型抗體及用於製造嵌合型抗體之方法。見Cab 11 -47 - (44) 1310038 et a\.,Proc.Natl ，A c a d. S c i. U . S . A 81 : 3273-77， 1984 ； Morrison et al., J^roc. tJ,. A C3 cf. Sc/.U. S . A. 8 1 : 685 1 -55 » 19 84 ； Boulianne et al.,Nature 312 ： 643-46， 1984 ；

Neuberger et al.,Nature 314 ： 268-70， 1985 ； Liu et al.，尸roc. «Sci-.U.S.A. 84 : 343 9-43 ， 1987 ;及

Harlow and Lane，同上。 亦可根據本技藝已知之方法，經由適當聯結個別多肽 φ 鏈來製造具有具相同或相異可變區結合特異性之嵌合型Η 鍵及L鍵的選擇性結合劑。見，如：Ci/rreni Proioco/s ι·« Molecular Biol o gy (Ausubel et a 1., e d s . ， Green Publishers Inc.and Wiley and Sons，1994)及 Harlow and Lane，同上 。利用此方法，將表現嵌合型H鏈（或其衍生物）之宿主細 胞與表現嵌合型L鏈（或其衍生物）之宿主細胞分別培養， 再分別回收該免疫球蛋白鏈並將其聯結。或者，可將宿主 細胞共同培養再讓鏈在培養基質中自發性聯結，然後回收 φ 組合之免疫球蛋白鏈。 在另一種實施態樣中，本發明之單株抗體爲”人類化” 抗體。用於將非人類抗體人類化的方法爲本技藝所熟知。 見’美國專利第5,585,089和5,693,762號。一般而言，人 類化抗體具有一或多個從非人類來源引入其中之胺基酸殘 基。人類化可，如：利用（Jones et al.，1986，JVaii/re 321 :522-25; Richmann et al.,1998 5 Nature 332 : 323-27; Verhoeyen et al., 1 9 8 8 1 Science 239: 1534-36)之技藝中 所描述之方法’以至少一部分齧齒類互補決定區（CD R)取 -48 - (45) 1310038 代對應之人類抗體區來進行。 經由規避製造單株抗體來創造抗體分子抗原結合區（ 即Fab或可變區片段）之重組〇ΝΑ變體的技術係包含在本 發明之範圍內。此技術係從取自免疫化動物之免疫系統細 胞萃取抗體-特異性傳訊RNA分子，再將其轉錄成cDNA 。然後’將該cDN A選殖入細菌表現系統。一種適合執行 本發明之這類技術的實例係使用噬菌體λ載體系統，其具 φ 有使表現之Fab蛋白質移行至周質區（介於細菌細胞膜及 .細胞壁之間）或分泌出的領導序列。個人可快速製造及篩 選大量之那些結合抗原的功能性Fab片段。這類（E10C)hPYY3_36-或（DllC)hPYY3.36-結合分子（對（E10C)hPYY3.36或（DllC)hPYY3-36 多肽具特異性之Fab片段）特別包含在此文所使用之"抗體"一詞 內。 本發明亦包含所硏發之用於藉由DNA剪接來製造嵌 合型抗體的技術，其係將來自具合適抗原-特異性之老鼠 9 抗體分子的基因與來自具合適生物活性（如：活化人類補 體及傳介抗體-倚賴性細胞性細胞毒性（ADCC)之能力）之人類抗 體分子的基因剪接在一起。Morrison et al./roc.iVai/.Acflii.Sci·. C/.5.A.81 : 6851-55，1984 ; Neuberger et al.’iVfliwre，312 : 604-08，1 984。藉由此技術製造之選擇性結合劑（諸如：抗體）係在 本發明之範圍內。 本發明並不限於小鼠或大鼠之單株抗體；事實上，可 使用人類抗體。這類抗體可利用人類雜交瘤取得。因此， 結合（El〇C)hPYY3-36或（DllC)hPYY3_36多肽之全然的人類 -49 - (46) 1310038 抗體亦包含在本發明內。這類抗體可經由以（El〇C)hPYY3.36 或（011(：)1^¥¥3_36抗原（隨意地結合載體）免疫接種可製造 人類抗體之集庫而不製造內生性免疫球蛋白的基因轉殖動 物（如：小鼠）來製造。見’如：Jakobovits et al./roc. Natl.Acad.Sci. U. S. A . 9 0 ' 2551 -55 ， 19 9 3 ； Jakobovits et a 1. ,Na tur e 3 6 2 ： 2 5 5-5 8，1993 ； Bruggemann et z\ .,Y ear in I mmuno .1 '· 3 3-40 » 1993。 _ 本發明亦包含結合（E10C)hPYY3-36 或（DllC)hPYY3-36 多肽之人類抗體。這類抗體可利用能製造人類抗體之集庫 而不製造內生性免疫球蛋白的基.因轉殖動物（如：小鼠）， 以隨意地結合載體之（丑1〇(：)1^丫丫3-36或（〇11(：)1^丫¥3-36多 肽抗原（即，具有至少6個連續胺基酸）將其免疫化來製造 。見，如：Jakobovits et al_,1993 同上；Jakobovits et . ,Natur e 362 : 255-58，19 9 3 ； Bruggermann et al.,1993 ，同上。在一種方法中係使編碼動物之重及輕免疫球蛋白 φ 鏈的內生性基因位失能，再將編碼人類重及輕鏈蛋白質的 基因位插入其基因組中以製造這類基因轉殖動物。然後， 將經部分修改（即，具有少於完全互補之修改）之動物交叉 飼育以取得具有全部所需之免疫系統修改的動物。當接受 免疫原後，這些基因轉殖動物製造具人類（而非，如：老 鼠）胺基酸序列之抗體，其包含對這些抗原具免疫特異性 之可變區。見，PCT專利申請文獻第W0 96/33735和W0 94/026〇2號。其他方法描述於美國專利第5,545,807號、 ?(^專利申請文獻第评0 91/10741和\¥0 90/04036號及£? -50 - (47) 1310038 專利第Ο 546 073 B1及PCT專利申請文獻第w〇 92/03918 號中。人類抗體亦可藉由將重組DNA在宿主細胞中表現 或在此文所描述之雜交瘤細胞中表現來製造。 在一種替換之實施態樣中亦可從噬體-顯示庫製造人 類抗體（Hoogenboom et al.，J.Mo/.227 : 381，1991 ; M ar ks e t al ·，入 Mo/. β io Z. 2 22 : 5 8 1，1 9 9 1 )。這些方法係模 擬免疫選擇’其係將抗體集庫顯示在絲狀噬菌體之表面上 φ 再經由噬菌體與選擇之抗原的結合情形來選擇噬菌體。一 種這類技術描述於PCT專利申請文獻第wo 9 9/1 0494號中 ’其描述利用這類方法分離MPL-及msk-受體之高親和力 及功能性激動抗體的方法。 嵌合型、移植CDR及人類化抗體通常係藉由重組方 法製造。將編碼該抗體之核酸分子引入宿主細胞中並利用 此文所描述及本技藝已知之物質及程序表現之。在較佳之 實施態樣中係在哺乳動物宿主細胞（如：C Η Ο細胞）中製造 φ 抗體。單株（如：人類）抗體可藉由在宿主細胞中表現重組 DNA或在此文所描述之雜交瘤細胞中表現重組DNA來製 造。 本發明之抗-(E10C)hPYY3.36 及抗-(DllC)hPYY3_36 抗 體可用於任何已知之分析方法中，諸如：用於偵測及定量 (丑10(：)1^¥丫3.36和（〇11(：)11?丫丫3.36多肽之競爭性結合分析 、直接和間接三明治分析及免疫沈澱分析（Sola， Mo no clonal Antibodies · A Manual of Techniques ， 147-158(CRC Press，Inc.1987))，以及多肽純化法。該抗體將 -51 - (48) 1310038 以適合所使用之分析方法的親和力結合（E10C)hPYY3.36* (DllC)hPYY3.36多肽。 本發明之PYY激動劑可以用於本發明方法之藥學上 • 可接受之酸加成鹽之型式提供。本發明之代表性藥學上可 - 接受之酸加成鹽包括：氫氯化物、氫溴化物、氫碘化物、 硝酸鹽、硫酸鹽、重硫酸鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異菸 鹼酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酸性檸 Φ 檬酸鹽、酒石酸鹽、泛酸鹽、重酒石酸鹽、抗壞血酸鹽、 _ 琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽黄酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽 、葡醛酸鹽、蔗.糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、 甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽、巴諾 酸鹽、棕櫊酸鹽、丙二酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果 酸鹽、硼酸鹽、六氟磷酸鹽、萘酸鹽、葡萄庚酸鹽、乳糖 酸鹽及月桂基磺酸鹽，等。當該變異體係作爲製備PEG-PYY3-36變異體共軛物之中間物時，該非聚乙二醇化變異 φ 體之鹽類不需爲藥學上可接受之鹽。 本發明之PYY激動劑通常係以藥學組成物之型式投 _ 服。該藥學組成物可爲適合經由如下列途徑投服之型式： 口服（如：錠劑、膠囊、藥九、粉末、溶液、懸浮液）、經 腸胃道外途徑注射（如：無菌溶液、懸浮液或乳劑）、鼻內 投服（如：霧狀滴，等）、直腸投服（如：栓劑）或透皮（如： 貼布）。該藥學組成物可爲具精確劑量，適合單次投服的 單位劑型。該藥學組成物將包含習知之藥學載體及作爲活 性成分之本發明PYY激動劑。另外，其可包含其他藥劑 -52- (49) 1310038 、佐劑，等。 製備生物活性肽之不同藥學組成物的方法爲藥學技藝 中所熟知。例如，見：美國專利申請文獻第2005/0009748 號（供口服）；及第 200 4/0 157 7 77號、第 2005/0002927 號及 第2005/0215475號（供穿透黏膜投服，如：鼻內或口腔投 月艮）。亦見：.· Γ/ie Praci/ce 〇/ P/iarmacy ， Lippincott Williams and Wilkins，Baltimors，MD，20th e d.2 0 0 0 ° 本發明之PYY激動劑可與其他用於治療此文所描述 之疾病狀態或病症之藥劑一起使用。因此，本發明亦提供 包含投服本發明之化合物與其他藥劑之治療方法。 可與本發明之PYY激動劑組合使用之合適藥劑包括 其他抗肥胖劑，諸如：大麻素-l(cannabinoid-l)(CB-l)拮 抗劑（諸如··利莫那班（r i m ο n a b a n t) )、11 β -羥基類固醇脫 氫酶-1(第1型Ιΐβ-HSD)抑制劑、MCR-4激動劑、縮膽囊 φ 素-A(ch〇lecystokinin-A)(CCK-A)激動劑、一元胺再攝取 抑制劑（諸如：西布曲明（s i b u t r a m i n e ))、類交感神經作用 劑、β3腎上腺素受體激動劑、多巴胺受體激動劑（諸如： 溴隱亭（bromocriptine))、黑色素細胞-刺激性荷爾蒙受體 類似物、5HT2c受體激動劑、黑色素濃縮荷爾蒙拮抗劑' 瘦素、瘦素類似物、瘦素受體激動劑、加拉寧（galanin)拮 抗劑、脂酶抑制劑（諸如：四氫利泊司他汀（tetrahydrolipstatin) ，即歐利斯塔（olistat))、厭食劑（諸如：對鈴蟾肽 (b0mbesin)激動劑）、神經肽_γ受體拮抗劑（如：NPYY5受 -53 - (50) 1310038 體拮抗劑）、擬甲狀腺素劑、脫氫表雄酮或其類似物、糖 皮質激素受體激動劑或拮抗劑、歐瑞辛（orexin)受體拮抗 劑、似高血糖肽-1受體激動劑、睫狀神經營養因子（諸如 :Axokine™，其可從 Regeneron Pharmaceuticals， Inc.Tarry town j NY and Procter & Gamble Company ! Cincinnati，OH取得）、人類艾可提（agouti)相關蛋白質 (AGRP)抑制劑、格瑞林（ghrelin)受體拮抗劑、組織胺3 φ 受體拮抗劑或逆轉激動劑、神經介肽（neuromedin)U受體 激動劑、ΜΤΡ/ΑροΒ抑制劑（如：腸-選擇性MTP抑制劑， 諸如：德洛塔派（d i r 1 〇 t a p i d e ))，等。 可與本發明之PYY激動劑組合使用之較佳抗肥胖劑 包括：CB-1受體拮抗劑、腸-選擇性MTP抑制劑、CCKa 激動劑、5HT2c受體激動劑、NPY Y5受體拮抗劑、歐利 斯塔、西布曲明。用於本發明方法之較佳CB-1受體拮抗 劑包括：利莫那班（SR141716A，亦知其商標名爲 φ AcompliaTM)，其可從Sanofi-Synthelabo取得或可依美國 專利第5,624,941號中之描述製備；#-(六氫吡啶-1-基）-1-(2,4-二氯苯基）-5-(4-碘苯基）·4-甲基-1H-吡唑-3-羧醯胺 (AM251)，其可從 TocrisTM，Ellisville，MO 取得；[5-(4-漠苯基）-1-(2,4·二氯苯基）-4 -乙基-六氯卩比卩定基 吡唑-3-羧醯胺](SR147778)，其可依美國專利第6,645,985 號中之描述製備；(六氫吡啶-1-基）·4,5-二苯基-1-甲基 咪唑-2-羧醯胺、#-(六氫吡啶-1-基）-4-(2,4-二氯苯基）-5-(4-氯苯基）-1-甲基咪唑-2-羧醯胺、(六氫吡啶-1-基）- -54- (51) 1310038 4,5-二_(4·甲苯基）-1-甲基咪唑-2-羧醯胺、iV-環己基-4,5-二-(4-甲苯基）-1-甲基咪唑-2-羧醯胺、#-(環己基）-4-(2,4· 二氯苯基）-5-(4-氯苯基）-1-甲基咪唑-2-羧醯胺及(苯基 )-4-(2,4-二氯苯基）-5-(4-氯苯基）-1-甲基咪唑-2-羧醯胺， 其可依PCT專利申請文獻第WO 03/075660號中之描述製 備；1-[9-(4-氯苯基）-8-(2-氯苯基）-9H-嘌呤-6-基]-4-乙胺 基-六氫吡啶-4_羧酸醯胺之氫氯酸鹽、甲磺酸鹽及苯磺酸 φ 鹽，其可依美國專利申請文獻第2004/0092520號中之描述 製備；1-[7-(2-氯苯基）-8-(4 -氯苯基）-2 -甲基-吡唑並[1,5-3][1，3,5]三畊-4-基]-3-乙胺基-吖丁啶-3-羧酸醯胺及1-[7-(2-氯苯基）-8-(4-氯苯基）-2 -甲基-吡唑並[l，5-a][l,3,5]三 畊-4-基]-3-甲胺基-吖丁啶-3-羧酸醯胺，其可依美國專利 申請文獻第2〇(H/0157839號中之描述製備；3-(4-氯苯基）-2-(2-氯苯基）-6-(2，2-二氟丙基）-2,4,5,6 -四氫-吡唑並[3,4-c]吡B定-7 -酮’其可依美國專利申請文獻第2〇〇5/〇1〇1592號 # 中之描述製備；2-(2-氯苯基）· -6-(2,2,2-三氟乙基）_3_(4-二氟甲基-苯基）-2,6 -二氫-卩比哗並[4,3-d]喃D定-7-酮，其可 依美國專利申請文獻第^(^/0^48^號中之描述製備； (S)-4-氯-N-{[3-(4-氯苯基）-4-苯基-4,5-二氫-吡唑-1_基卜 甲胺基-伸甲基}-苯磺醯胺（SLV-319)及（s)_N_{[3パ4_氯苯 基）-4-苯基·4,5_二氫·吡唑基]•甲胺基-伸甲基}-4三氟 甲基-本磺醯胺（SLV-326),其可依PCT專利申請文獻第 WO 02/076949號中之描述製備；N -六氫吡啶基_ 5 _ (4 _溴 苯基）-1-(2,4-二氯苯基）_4_乙基吡唑-3_羧醯胺，其可依美 -55 - (52) 1310038 國專利案第6,432,984號中之描述製備；1-[雙-(4-氯苯基）· 甲基]-3-[(3,5 -二氟苯基）-甲擴醯基-伸甲基]-吖丁 D定’其可 依美國專利案第6,5 18,264號中之描述製備；2-(5-(三氟甲 基）吡啶-2-基氧基）-Ν-(4-(4·氯苯基）-3-(3-氰苯基）丁 -2-基 )-2-甲基丙醯胺，其可依PCT專利申請文獻第 wo 04/048317號中之描述製備；4·{[6-甲氧基-2-(4_甲氧苯基 )_1_苯並呋喃-3-基]羰基}苄腈（LY-320135)， 其可依美國 φ 專利案第5,747,524號中之描述製備；1-[2-(2,4·二氯苯基 )-2-(4-氯苯基）-苯並[1,3]二鸣唑-5-磺醯]-六氫吡啶’其可 依WO 04/013120中之描述製備；及[3 -胺基- 5- (4 -氯苯基）-6-(2,4-二氯苯基）-呋喃[2,3-b]吡啶-2-基]-苯基-甲酮，其 可依PCT專利申請文獻第WO (M/012671號中之描述製備 〇 可用於本發明之組合物、藥學組成物及方法中之較佳 腸-作用MTP抑制劑包括：德洛塔派（（S)-N-{2-[苄基（甲基 •)胺基]-2-酮基-1-苯乙基}-1-甲基-5-[(4’-三氟甲基）[1Λ'_聯 苯基]-2-羧醯胺基]-1H-吲哚-2-羧醯胺）及1-甲基-5-[(4'-三 氟甲基-聯苯基-2-羰基）-胺基]-1H-吲哚-2-羧酸（胺甲醯基-苯基-甲基）-醯胺，其可利用美國專利案第6,720,35 1號中 描述之方法製備；（S)-2-[(4'-三氟甲基-聯苯基-2-羰基）胺 基]-喹啉-6-羧酸（戊基胺甲醯基-苯基-甲基）-醯胺，（S)-2-[(4'-第二-丁基-聯苯基-2-類基）-胺基]-唾琳-6-殘酸{[(4_ 氟-苄基）-甲基-胺甲醯基]-苯基-甲基}-醯胺及（S)-2-[(4’·第 三-丁基-聯苯基-2-羰基）-胺基]-喹啉-6-羧酸[(4-氟-苄基胺 -56 - (53) 1310038 甲醯基）-苯基-甲基]-醯胺，其均可利用美國專利申請文獻 第 2005/0234099A1 號中之描述製備；（-)-4 - [ 4 - [ 4 - [ 4-[[(2S,4R)-2-(4-氯苯基）-2-[[(4 -甲基-4H-1，2,4·三唑 _3_ 基） 硫烷基]甲基-1，3 -二噚烷-4-基]甲氧基]苯基]六氫啦哄-1· 基]苯基]-2-(lR)-l -甲基丙基]-2,4·二氫_3丑_1，2,4-三唑_3_ 酮（亦稱爲米特塔派（Mitratapide)或Rl〇3757)’其可依美 國專利案第5,521，186和5,929,075號中之描述製備；及因 • 普利塔派（implitapide)(BAY13-9952) ’其可依美國專利案 第6,265，431號中之描述製備。最佳者爲德洛塔派、米特 塔派、（S)-2-[(4'_三氟甲基-聯苯基-2-羰基）-胺基]-喹啉-6-羧酸（戊基胺甲醯基-苯基-甲基）-醯胺、（S)-2_[(4'_第三-丁 基-聯苯基-2-羰基）胺基]-喹啉-6-羧酸{[(4_氟-苄基）-甲基_ 胺甲醯基]-苯基-甲基}-醯胺或（S)-2-[(4'_第三-丁基-聯苯 基-2-羰基）-胺基]-喹啉-6 -羧酸[(4-氟-苄基胺甲醯基）-苯 基-甲基]-醯胺。較佳之NPY Y5受體拮抗劑包括：2-酮基-φ Ν-(5·苯基吡畊基）螺[異苯並呋喃-1(3H)，4'-六氫吡啶]-Γ-羧醯胺，其可依美國專利申請文獻第2〇〇2/0151456號中之 描述製備；及3-酮基-N-(5-苯基-2-吡哄基）-螺[異苯並呋 喃-1(3H),4’-六氫吡啶]-1，-羧醯胺；3-酮基-N、7-三氟甲基 吡啶並[3,2-b]吡啶-2-基）-螺[異苯並呋喃-1(3H),[4'-六氫吡 啶]-1'_羧醯胺；N-[5-(3-氟苯基）-2-嘧啶基]-3-酮基螺-[異 苯並呋喃·1(3Η)，4'-六氫吡啶]-Γ-羧醯胺；反酮基-N-(5-苯基-2-嘧啶基）]螺[環己烷-1，1'(3'Η)-異苯並呋喃]-4-羧 醯胺；反-3-酮基-N-[l-(3-喹啉基）-4-咪唑基]螺[環己烷- -57- (54) 131.0038 1，1'(3'H)-異苯並咲喃]_4_竣醯胺；反-3'_酮基-N_(5 -苯基-2-吡畊基）螺[4-氮雜異苯並肤喃- W311)，1'·環己院]_4^竣醯 胺；反-N-[5-(3-氟苯基）-2-嘧啶基]-3-酮基螺[5-氮雜異苯 並咲喃_1(3H)，1’-環己院]-4'-竣醯胺；反-N-[5-(2-氟本基）- 2- 嘧啶基]_3_酮基螺[5_氮雜異苯並11夫喃-環己院卜 4'-羧醯胺；反_N-[l-(3,5-二氟苯基）-4-咪哩基]-3-酮基螺 [7-氮雜異苯並呋喃_1(3H)，1I_環己院]-4’_竣醯胺；反_3_酮 φ 基-N-(l-苯基-4_吡唑基）螺[4-氮雜異苯並呋喃-1(3Η)，Γ-環 己烷]-4，-羧醯胺；反-Ν-Ρ-Ρ-氟苯基）_3_吡唑基]·3·酮基 螺[6-氮雜異-苯並呋喃dPH)，1'-環己烷]_4'·羧醯胺；反_ 3- 酮基-N-(l-苯基_3_吡唑基）螺[6_氮雜異苯並呋喃-1(3H)，1'-環己院]-4'-殘醯胺；及反-3_酮基-N-(2_苯基_ 1,2,3-三唑-4-基）螺[6-氮雜異苯並呋喃-1(3 H)，l'-環己烷]-4·-羧醯胺，其均可依pCT專利申請文獻第WO 03/082190 號中之描述製備；及其藥學上可接受之鹽類和酯類。所有 φ 上述列舉之美國專利及文獻均倂爲此文之參考資料。 在本發明之方法觀點中係將本發明之P YY激動劑單 獨或與一或多種其他藥劑組合’以本技藝所知之任何習知 之經周圍途徑投服的方法分別或一起經由周圍途徑投給個 體。因此，：PYY激動劑或組合物可經下列途徑投給個體： 腸胃道外途徑（如：靜脈內、腹膜內、肌肉內或皮下）、鼻 內、口服、舌下、口腔內、吸入（如：藉霧狀滴）、直腸（ 如：藉栓劑）或透皮。經腸胃道外途徑投服爲較佳之投服 方法，而皮下投服爲較佳之經腸胃道外途徑投服方法。 -58- (55) 1310038 一般而言’適合供經腸胃道外注射之組成物包括：藥 學上可接受之無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或 乳劑及供重建成無菌之可注射液或分散液之無菌粉末。合 適之水性及非水性載體或稀釋液（包括溶劑和載劑）的實例 包括：水、乙醇、多元醇（丙二醇、聚乙二醇、甘油，等） 、其合適之混合物、三甘油脂（包括：蔬菜油，如：橄檀 油）及可注射之有機酯類，諸如：油酸乙酯。 φ 這些供經腸胃道外途徑注射之組成物亦可含有賦形劑 ’諸如：防腐劑、濕潤劑、助溶劑、乳化劑及分散劑。預 防組成物被微生物污染可藉不同抗菌及抗黴菌劑（例如： 對羥基過苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸，等）達成。 亦可能需要包含等張劑，例如：糖類、氯化鈉，等。延長 可注射之藥學組成物的吸收可經由使用可延遲吸收之作用 劑（如：一硬脂酸鋁及凝膠）來達成。 投給個體之本發明PYY激動劑之劑量係根據多種因 Φ 子有所變化’這些因子包括：投服模式、個體之年齡及體 重、疾病之嚴重性 '欲治療之病症或失調及投服之PYY 激動劑的藥學活性。特殊患者之劑量範圍及理想劑量的測 定方法爲本技藝之一般技術人士所熟知。 在經腸胃道外途徑投服方面，在以非-聚乙二醇化變 異體爲基礎之給藥攝生法中，本發明PYY激動劑可以約 0.01微克/公斤至約10毫克/公斤/劑量之劑量水準投給人類 個體。例如：在30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36S 面’在以（E10C)hPYY3.36爲基礎之給藥攝生法中，經腸胃 -59- (56) 1310038 道外途徑給藥之水準係約0.01微克/公斤至約；L0毫克/公斤/ 劑量’宜爲約0.05毫克/公斤至約1.0毫克/公斤/劑量，或 約0.05或0.1毫克/公斤至約1.〇毫克/公斤/劑量，或約〇·05 或0.1毫克/公斤至約0.3或0.5毫克/公斤/劑量。例如：85毫 克之30Κ mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36 (其具有約 34024道耳吞，30K Da PEG加非聚乙二醇化肽之分子量 4024)之劑量等於1〇毫克之以非聚乙二醇化（E10C)hPYY3_36 • 爲基礎的劑量。給藥攝生法可爲每日一或多個劑量，宜在 用餐前投服，特別是，投服30K mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3.36 或 20K mPEG 馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36 時，較佳之給藥攝生法爲一週內2或3次或每週一次或每10 至14天一次。 本發明之實施態樣藉由下列實例說明。然而，需了解 本發明之實施態樣並不限於這些實例之特殊細節，本技藝 之一般技術人士可了解其他變異體或可鑑於本揭示內容及 φ 附屬之申請專利範圍而清楚明白。所有此文所列之參考資 料倂爲此文之參考資料。 【實施方式】 實例1 直線型30K 及20K mPEG 及20K 馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3-36 此實例提供實質上同質之單聚乙二醇化且帶有連接在 殘基10處之mPEG(30K或20K)的（E10C)hPYY3-36之製備方 -60 - (57) 1310038 法。 (a) (E10C)hPYY3_36之製備方法 使用自動狀合成儀（433A型；Applied Biosystems， Foster City，CA) ’利用Fmoc策略，以2-(1Η-苯並三唑-1-基）-l，l,3,3-四甲鋸六氟磷酸酯（HBTU)活化（Fastmoc， 0.15毫莫耳循環）’藉固相法合成（El〇C)hPYY3_36。用於 • Asn、Gin、Cys和His之側鏈保護基爲Trt ;用於Ser、 Thr和Tyr之側鏈保護基爲tBu ;用於Lys之側鏈保護基 爲Boc ;用於Asp和Glu之側鏈保護基爲OtB.u ;而用於 Arg之側鏈保護基爲Pbf。以9毫升三氟醋酸（TFA)、0.5克 苯酚、〇·5毫升H20、0.5毫升硫代甲苯醚及0.25毫升1,2-乙二硫醇之混合物在室温下處理4小時，將肽-樹脂裂解完 成。將狀在冰冷之乙醚中沈澱並以乙醚清洗之，將其溶解 在 DMSO 中並在 Waters Deltapak C18，15 微米，100A， φ 50 x 300 毫米 ID 管柱（目錄編號 WAT011801，Waters， Milford，ΜΑ)上，利用在30分鐘內從100%溶劑 A : 0%溶 劑B至70 %溶劑A : 30%溶劑B之線性梯度，流速爲80毫 升/分，藉由逆相HPLC進行純化。溶劑A爲0.1%TFA(三 氟醋酸）水溶液。溶劑B爲在乙腈中之0.1%TFA溶液。藉 ESI-MS確認純化之肽的分子量（MAvg = 4024)並藉由逆相 HPLC評估純度（第1圖）。 (b) 直線型30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3-36之製備方 -61 - (58) 1310038 法 將約3O,O0OMW之直線型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright ME-300M A，N O F C o r p o r a t i ο η，東京，日本）選 擇性地偶合至（E10C)hPYY3_36之殘基10處之半胱胺酸的氫 硫基上。將肽直接加入溶解在20mM HEPES(史格馬 (Sigma)公司，St.Louis，ΜΟ)，ρΗ7·0 中或 20mM 醋酸鈉（ 史格馬化學公司，St.Lonis，MO)，pH4.5中之直線型30K φ mPEG馬來醯亞胺中，使直線型30K mPEG馬來醯亞胺與 (E10C)hPYY3.36肽立即反應，以產生1毫克/毫升肽濃度且 該相關 mPEG : (E10C)hPYY3-36之莫耳比約爲1 : 1。在 室温、黑暗中進行反應0.5-24小時。將在HEPES，ρΗ7·0 中之反應物在20mM醋酸鈉，ρΗ4.5中稀釋，以終止反應 並立即在陽離子交換色層分析法中純化。將在20mM醋酸 鈉，pH4.5中之反應物直接塡在陽離子交換色層分析管柱 上。藉由SEC-HPLC評估反應產物（第2圖）。 (c)直線型30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36之純化方 法。 利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 二醇化（E10C)hPYY3-36物種純化至>95%。利用陽離子交換 色層分析法從未修改之（E10C)hPYY>36及具較大分子量之 物種中純化出單聚乙二醇化之（E10C)hPYY3-36。將典型之 直線型30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36反應混合物 (10毫克蛋白質）（如上述）在SP Sepharose Hiltrap管柱（5 -62 - (59) 1310038 晕升）（Amersham Pharmacia Biotech 5 GE Healthcare * Piscataway’ NJ)(其係在 20mM 醋酸鈉，pH4.5(緩衝液 A) 中平衡）上進行分餾。以緩衝液A將反應混合物稀釋7倍， 並以2.5毫升/分之流速裝塡在管柱上。以5-10管柱體積之 緩衝液A清洗管柱。接著，將不同（E10C)hPYY3_36物種在 20管柱體積之O-lOOmM線性NaCl梯度中從管柱洗提出。 藉由28〇nm(A28Q)處之吸收監測洗提液並收集合適大小之 φ 分液。藉®sds-page進行評估，依聚乙二醇化程度累積 分液（第3圖）。然後，在Centriprep 3濃縮器（Amicon技術 公司，Northborough，MA)中，或者，利用 Vivaspin 10K 濃縮器(Vivascience Sartorius Group ， Hannover ， Germany)將純化之累積液濃縮成0.5-5毫克/毫升。藉由比 較RP HPLC尖峰面積與PYY3-36之標準曲線（未顯示）來測 定純化之累積液的蛋白質濃度，或者，利用由實驗衍生之 消退係數，藉由280nm處之吸收測定純化之累積液的濃度 φ 。如第6圖所示，利用 SEC-HPLC製作聚乙二醇化之 (E10C)hPYY3-36之純化的累積液的略圖。 (d)直線型20K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36之製備方 法 將約20,000MW之直線型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright ME-200MA，NOF Corporation)選擇性地偶合至 (E10C)hPYY3_36殘基10處之半胱胺酸的氫硫基上。將肽直 接加入溶解在20mM醋酸鈉（史格馬化學公司，St.Louis， -63- (60) 1310038 MO)，ρΗ4·5中之直線型20K mPEG馬來醯亞胺中，使直線 型20K mPEG馬來醯亞胺與（E10C)hPYY3-36肽立即反應， 以產生1毫克/毫升肽濃度且該相關 mPEG : (ElOC)hPYY3-36之莫耳比約爲1.3 : 1。在室温、黑暗中進 行反應60分鐘，再在4°C下反應16小時。將在20mM醋酸 鈉，pH4.5中之反應物直接塡在陽離子交換色層分析管柱 上。藉由SEC-HPLC評估反應產物。 (e)直線型20K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36之純化方 法。 利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 二醇化（E10C)hPYY3_36物種純化至>95%。利用陽離子交換 色層分析法將單聚乙二醇化之（£10(：)11?¥丫3-36與游離？£〇 、未修改之（E10C)hPYY3.36及具較大分子量之物種分開。 將典型之直線型20K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36反 ^ 應混合物（20毫克蛋白質）（如上述）在SP Sepharose Hiltrap 管柱（5 毫升）（Amersham Pharmacia Biotech， G E Healthcare)(其係在20mM醋酸鈉，ρΗ4·5(緩衝液 Α)中平 衡）上進行分餾。以1.0毫升/分之流速將反應混合物裝塡在 管柱上。以4管柱體積之緩衝液A清洗管柱，流速爲2.5毫 升/分。接著，以2.5毫升/分之流速從管柱洗提出在25管柱 體積之〇-200mM線性NaCl梯度中之不同（E10C)hPYY3_36 物種。藉由28〇nm(A28G)處之吸收監測洗提液並收集合適大 小之分液。藉SEC-HPLC進行評估，依聚乙二醇化程度累 -64 - (61) 1310038 積分液。然後，利用 Vivaspin 10K濃縮器（Vivascience Sartorius Group)將純化之累積液濃縮成0.5-5毫克/毫升。 利用由實驗衍生之消退係數，藉由280nm處之吸收測定純 化之累積液的蛋白質濃度。全部過程所產生之一元20K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36的產量爲38%。利用 SEC-HPLC 測定之一元 20K mPEG 馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36 之純化的累積液爲9 6 %純度。 實例2 直線型30K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36 此實例說明實質上同質之單聚乙二醇化且帶有連接在 殘基11處之mPEG的（DllC)hPYY3_36之製備方法。 (a) (DllC)hPYY3.36之製備方法 使用自動肽合成儀（433A型；Applied Biosystems， φ Foster City，CA)，利用 Fmoc 策略，以 2-(1Η-苯並三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲鋸六氟磷酸酯（HBTU)活化（Fastmoc， 0.15毫莫耳循環），藉固相法合成（DllC)hPYY3.36。用於 Asn、Gin、Cys和His之側鏈保護基爲Trt;用於Ser、 Thr和Tyr之側鏈保護基爲tBu ;用於Lys之側鏈保護基 爲Boc ;用於Asp和Glu之側鏈保護基爲OtBu ;而用於 Arg之側鏈保護基爲Pbf。以9毫升三氟醋酸（TFA)、0.5克 苯酚、0.5毫升H20、0.5毫升硫代甲苯醚及0.25毫升1，2-乙二硫醇之混合物在室温下處理4小時，將肽-樹脂裂解完 -65- (62) 1310038 成。將肽在冰冷之乙醚中沈澱並以乙醚清洗之，將其溶解 在 DMSO 中並在 Waters Deltapak C18，15 微米，ΙΟΟΑ， 50x300 毫米 ID 管柱（目錄編號 WAT011801，Waters， Milford，ΜΑ)上，利用在30分鐘內從100%溶劑 A: 0%溶 劑B至70 %溶劑A : 30%溶劑B之線性梯度，流速爲80毫 升/分，藉由逆相HPLC進行純化。溶劑A爲0.1%TFA(三 氟醋酸）水溶液。溶劑B爲在乙腈中之0.1 % TFA溶液。藉 φ ESI-MS確認純化之肽的分子量（MAvg = 4038)並藉由逆相 HPLC評估純度（第4圖）。 (b)直線型30K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36之製備方 法 將約30,000MW之直線型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright ME-300MA，NOF Corporation Tokyo，Japan) 選擇性地偶合至（〇11(：)11?¥丫3_36之殘基11處之半胱胺酸的 φ 氫硫基上。將肽直接加入溶解在20mM HEPES(史格馬化學 公司，St.Louis，MO)，pH7.0中之直線型30K mPEG馬來 醯亞胺中，使直線型30 K mPEG 馬來醯亞胺與 (DllC)hPYY3.36肽立即反應，以產生1毫克/毫升肽濃度且 該相關之mPEG : (DllC)hPYY3.36之莫耳比約爲1 : 1。 在室温、黑暗中進行反應0.5-24小時。將反應混合物在 20mM醋酸鈉，ΡΗ4·5中稀釋以終止反應並立即在陽離子 交換色層分析法中純化。藉由SEC-HPLC評估反應產物（ 第5圖）。 -66 - (63) 1310038 或者，不依上述將直線型30K mPEG馬來醯亞胺溶解 在HEPES中，藉由將肽直接加入溶解在20mM醋酸鈉（史 格馬化學公司，St.Louis’ MO)，pH4.5中之30K mPEG馬 來醯亞胺中，使30K mPEG馬來醯亞胺與（DllC)hPYY3-36 肽立即反應，以產生1毫克/毫升肽濃度且該相關mPEG : (DllC)hPYY3-36之莫耳比約爲1: 1。在室温、黑暗中進行 反應0.5-24小時。將反應物直接塡在陽離子交換色層分析 φ 管柱上。藉由SEC-HPLC評估反應產物。 (c)直線型30K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3_36之純化方 法。 利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 二醇化（〇11(：)1^丫丫3.36物種純化至>95%。利用陽離子交換 色層分析法從未修改之（〇11〇1^丫丫3.36及具較大分子量之 物種中純化出單聚乙二醇化之（D1 lC)hPYY3.36。將典型之 Φ 直線型3〇K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3_36反應混合物 (10毫克蛋白質）（如上述）在SP-Sepharose Hiltrap管柱（5毫 升）（Amersham Pharmacia Biotech ， G E Healthcare ， Piscataway，NJ)(其係在 20mM 醋酸鈉，pH4.5(緩衝液 A) 中平衡）上進行分餾。以緩衝液A將pH7.0之反應混合物 稀釋7倍，並以2.5毫升/分之流速裝塡在管柱上。以5-10管 柱體積之緩衝液 Α清洗管柱。接著，將不同 (E10C)hPYY3-36物種在20管柱體積之0-100mM線性NaCl 梯度中從管柱洗提出。藉由280nm(A28Q)處之吸收監測洗 -67- (64) 1310038 提液並收集合適大小之分液。藉SEC HP LC進行評估，依 聚乙二醇化程度累積分液。然後，在Vi v asp in 10K濃縮 器（Vivascience Sartorius Group)中將純化之累積液濃縮成 0.5-5毫克/毫升。藉由比較RP HPLC尖峰面積與PYY3-36 之標準曲線（未顯示）來測定純化之累積液的蛋白質濃度。 如第7圖所示，利用 SEC-HPLC製作聚乙二醇化之 (DllC)hPYY3_36之純化的累積液的略圖。 或者，將來自上述（b)之ρΗ4·5反應物以2.5毫升/分之 流速直接裝塡在管柱上，並利用由實驗衍生之消退係數藉 由在28 0 nm處之吸收測定純化之累積液的濃度。 實例3 支鏈型43K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36 此實例說明實質上同質之單聚乙二醇化且帶有連接在 殘基10處之mPEG的（E10C)hPYY3-36之製備方法。 (a)支鏈型43K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36之製備 方法 將約43,OOOMW之支鏈型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright GL2-400MA > N0F Corporation Tokyo，Japan) 選擇性地偶合至依實例1(a)中之描述製備之（E10C)hPYY3_36 殘基10處之半胱胺酸的氫硫基。 將肽直接加入溶解在20mM HEPES，pH7.0 (史格馬化 學公司，St. Louis ’ MO)中之支鏈型43K mPEG馬來醯亞胺 -68- (65) (65)1310038 ，使支鏈型43K mPEG馬來醯亞胺與（E10C)hPYY3-36肽立 即反應，以產生1毫克/毫升肽濃度且該相關 mPEG : (E10C)hPYY3_36之莫耳比約爲1 : 1。在室温、黑暗中進行 反應0.5-24小時。將在HEPES，pH7.0中之反應物在20mM 醋酸鈉，ΡΗ4·5中稀釋，以終止反應並立即在陽離子交換 色層分析法中純化。藉由SEC-HPLC評估反應產物（第8圖 )° 或者，將肽直接加入溶解在20mM醋酸鈉（史格馬化學 公司，St.Louis，ΜΟ)，ρΗ4·5中之支鏈型43K mPEG馬來 醯亞胺中，使支鏈型43K mPEG 馬來醯亞胺與 (E10C)hPYY3_36肽立即反應，以產生1毫克/毫升肽濃度且 該相關mPEG : (E10C)hPYY3_36之莫耳比約爲1 : 1。將 反應物直接塡在陽離子交換色層分析管柱上。 (b)單聚乙二醇化之支鏈型43K mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3_36之純化方法。 利用單一陽離子交換色層分析步驟將單聚乙二醇化之 (E10C)hPYY3.36物種與未修改之（E10C)hPYY3-36及具較大 分子量之物種分開。將典型之支鏈型43 K mPEG馬來醯亞 胺（E10C)hPYY3-36反應混合物（1〇毫克蛋白質）（如上述）在 SP Sepharose Hiltrap 管柱（5 毫升）（Amersham Pharmacia Biotech，GE Healthcare)(其係在 20mM 醋酸鈉，pH4.5(緩 衝液A)中平衡）上進行分餾。以緩衝液A將pH7.0之反應 混合物稀釋10倍’並以2.5毫升/分之流速裝塡在管柱上。 以5 -1 0管柱體積之緩衝液Α清洗管柱。接著，將不同 -69- (66) 1310038 (E10C)hPYY3_36物種在20管柱體積之〇-l〇〇mM線性NaCl 梯度中從管柱洗提出。藉由280nm(A28O)處之吸收監測洗 提液並收集合適大小之分液。藉SEC-HPLC進行評估，依 聚二醇化程度累積分液。然後，在Centriprep 3濃縮器 (Amicon Technology Corporation)中，或者，利用 Vivaspin 10K 濃縮器（Vivascience Sartorius Group)將純化 之累積液濃縮成0.5-5毫克/毫升。藉由胺基酸分析定量純 φ 化之累積液的蛋白質濃度。如第9圖所示，利用 SEC-HPLC製作單聚乙二醇化之支鏈型43K mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3_36之純化之累積液的略圖。 或者，藉由比較RP HPLC尖峰面積與PYY3.36之標準 曲線（未顯示），或利用由實驗衍生之消退係數藉由280ηηι 處之吸收測定蛋白質濃度。 實例4 此實例考量帶有連接在殘基10處之直線型12kD mPEG 或支鏈型20kD mPEG之實質上同質之單聚乙二醇化 (E10C)hPYY3_36的製備方法，並考量帶有連接在殘基11處 之直線型20kD mPEG、直線型12kD mPEG或支鏈型20kD mPEG之實質上同質之單聚乙二醇化 備方法 (a)直線型12K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36之製備 方法 -70- (67) 1310038 將約12,000MW之直線型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright ME-120MA，NOF Corporation)選擇性地偶合至 (E10C)hPYY3_36殘基10處之半胱胺酸的氫硫基上。藉由將 肽直接加入溶解在20mM醋酸鈉（史格馬化學公司），ρΗ4·5 中之直線型12K mPEG馬來醯亞胺中，使直線型12Κ mPEG 與（E10C)hPYY3-36肽立即反應，以產生1毫克/毫升肽濃度 且該相關mPEG : (E10C)hPYY3.36之莫耳比約爲1 : 1。在 φ 室温、黑暗中進行反應0.5-24小時。將在20mM醋酸鈉， pH4.5中之反應物直接塡在陽離子交換色層分析管柱上。 藉由SEC-HPLC或SDS-PAGE評估反應產物。 (b)直線型12K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36之純化方 法。

利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 二醇化（E10C)hPYY3-36物種純化至>95%。利用陽離子交換 φ 色層分析法將單聚乙二醇化之斤10〇1^¥¥3_36與游離？£0 、未修改之（E10C)hPYY3-36及具較大分子量之物種分開。 將典型之直線型12K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3-36反 應混合物（10毫克蛋白質）（如上述）在SP Sepharose Hiltrap 管柱（5 毫升）（Amersham Pharmacia Biotech > GE

Healthcare)(其係在20mM醋酸鈉，ρΗ4·5(緩衝液A)中平 衡）上進行分餾。以1.0毫升/分之流速將反應混合物裝塡在 管柱上。以4管柱體積之緩衝液A，以2.5毫升/分之流速清 洗管柱。接著，將不同（E10C)hPYY3.36物種以2.5毫升/分 -71 - (68) 1310038 之流速，在25管柱體積之0-200mM線性NaCl梯度中從管 柱洗提出。藉由280nm(A28())處之吸收監測洗提液並收集 合適大小之分液。藉SEC-HPLC進行評估，依聚乙二醇化 程度累積液。然後，利用 Vivaspin 10K濃縮器（ Vivascience Sartorius Group)將純化之累積液濃縮成 0.5-5 毫克/毫升。利用由實驗衍生之消退係數，藉由280nm處 之吸收測定純化之累積液的濃度。利用 SEC-HPLC或 φ SDS-PAGE 製作 12K mPEG 馬來醯亞胺（ElOC)hPYY3.36之 純化之累積液的略圖。 (c)支鏈型20Κ mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36之製備方 法 將約20,OOOMW之支鏈型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright GL2-200MA，NOF Corporation)選擇性地偶合 至（E10C)hPYY3-36殘基10處之半胱胺酸的氫硫基上。將肽 φ 直接加入溶解在2〇mM醋酸鈉（史格馬化學公司，St.Louis ，ΜΟ)，ρΗ4·5中之支鏈型20K mPEG馬來醯亞胺中，使支 鏈型20K mPEG馬來醯亞胺與（E10C)hPYY3-36肽立即反應 ，以產生1毫克/毫升肽濃度且該相關mPEG: (E10C)hPYY3.36之 莫耳比約爲1 : 1。在室温、黑暗中進行反應0.5至24小時 。將在20mM醋酸鈉，pH4.5中之反應物直接塡在陽離子 交換色層分析管柱上。藉由SEC-HPLC或SDS-PAGE評估 反應產物。 -72- (69) 1310038 (d) 支鏈型20K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3-36之純化方 法。 利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 二醇化（E10C)hPYY3-36物種純化至>95%。利用陽離子交換 色層分析法將單聚乙二醇化之斤10〇1^¥¥3.36與游離？£0 、未修改之（E10C)hPYY3.36&具較大分子量之物種分開。 將典型之支鏈型20K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36反 ^ 應混合物（10毫克蛋白質）（如上述）在SP Sepharose Hiltrap 管柱（5 毫升）（Amersham Pharmacia Biotech，GE Healthcare)( 其係在20mM醋酸鈉，ρΗ4·5(緩衝液A)中平衡）上進行分 餾。以1.0毫升/分之流速將反應混合物裝塡在管柱上。以 4管柱體積之緩衝液A清洗管柱，流速爲2.5毫升/分。接 著，以2.5毫升/分之流速從管柱洗提出在25管柱體積之0-200mM線性NaCl梯度中之不同（E 1 0C)hP Y Y3 .36物種。藉 由280nm(A28())處之吸收監測洗提液並收集合適大小之分 φ 液。藉SEC-HPLC進行評估，依聚乙二醇化程度累積分液 。然後，利用 Vivaspin 10K 濃縮器（Vivascience Sartorius Group)將純化之累積液濃縮成0.5-5毫克/毫升。利用由實 驗衍生之消退係數，藉由280nm處之吸收測定純化之累積 液的蛋白質濃度。利用SEC-HPLC或SDS-PAGE製作支鏈 型20K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36之純化之累積液 的略圖。 (e) 直線型20K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3-362製備方 •73- (70) 1310038 法 將約20,000MW之直線型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright ME-200MA 5 NOF Corporation)選擇性地偶合至 (DllC)hPYY3-36殘基11處之半胱胺酸的氫硫基上。藉由將 狀直接加入溶解在20mM醋酸鈉（史格馬化學公司），pH4.5 中之直線型20K mPEG馬來醯亞胺中，使直線型20K mPEG 與（DllC)hPYY3-36肽立即反應，以產生1毫克/毫升肽濃度 • 且該相關 mPEG: (DllC)hPYY3.36之莫耳比約爲1 : 1。 在室温、黑暗中進行反應0.5-24小時。將在20mM醋酸鈉 ，pH4.5中之反應物直接塡在陽離子交換色層分析管柱上 。藉由SEC-HPLC或SDS-PAGE評估反應產物。 (f)直線型20K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36之純化方 法。 利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 • 二醇化之（DllC)hPYY3.36物種純化至>95%。利用陽離子交 換色層分析法將單聚乙二醇化之（DllC)hPYY3_36與游離 PEG、未修改之（〇110：)1^¥¥3.36及具較大分子量之物種分 開。將典型之直線型20K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36 反應混合物（10毫克蛋白質）（如上述）在 SP Sepharose Hiltrap 管柱（5 毫升）（Amersham Pharmacia Biotech，GE Healthcare)(其係在20mM醋酸鈉，pH4.5(緩衝液A)中平 衡）上進行分餾。以1.0毫升/分之流速將反應混合物裝塡在 管柱上。以4管柱體積之緩衝液A，2.5毫升/分之流速清洗 -74 - (71) 1310038 管柱。接著，將不同（DllC)hPYY3-36物種以2.5毫升/分之 流速，在25管柱體積之0-200mM線性NaCl梯度中從管柱 洗提出。藉由在280nm(A28〇)處之吸收監測洗提液並收集 合適大小之分液。藉SEC-HPLC進行評估，依聚乙二醇化 程度累積分液。然後’利用Vivaspin 10K濃縮器（Vivascience Sartorius Group)將純化之累積液濃縮成0.5-5毫克/毫升。 利用由實驗衍生之消退係數藉由280nm處之吸收測定純化 φ 之累積液的濃度。利用SEC-HPLC或SDS-PAGE製作20K mPEG馬來醯亞胺 （DllC)hPYY3.36之純化之累積液的略 圖。 (g)直線型12K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3_36之製備方 法 將約12,000MW之直線型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright ME-120MA，NOF Corporation)選擇性地偶合至 φ (DllC)hPYY3.36殘基11處之半胱胺酸的氫硫基上。將肽直 接加入溶解在20mM醋酸鈉（史格馬化學公司，St.Louis， MO)，pH4.5中之直線型12K mPEG馬來醯亞胺中，使直線 型12K mPEG馬來醯亞胺與（DllC)hPYY3-36肽立即反應， 以產生1毫克/毫升肽濃度且該相關mPEG: (DllC)hPYY3-36之 莫耳比約爲1: 1。在室温、黑暗中進行反應0.5至24小時 。將在20mM醋酸鈉，PH4.5中之反應物直接塡在陽離子 交換色層分析管柱上。藉由SEC-HPLC或SDS-PAGE評估 反應產物。 -75- (72) 1310038 (h)直線型12K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3-36之純化方 法。 利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 二醇化（〇11(：)11?¥丫3-36物種純化至>95%。利用陽離子交換 色層分析法將單聚乙二醇化之（D11C)hPYY3-3 6與游離ΓEG 、未修改之（DllC)hPYY3-36及具較大分子量之物種分開。 • 將典型之直線型12K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36反 應混合物（10毫克蛋白質）（如上述）在SP Sepharose Hiltrap 管柱（5 毫升）(Amersham Pharmacia Biotech，GE Healthcare)(其 係在20mM醋酸鈉，pH4.5(緩衝液 A)中平衡）上進行分餾 。以1.0毫升/分之流速將反應混合物裝塡在管柱上。以4 管柱體積之緩衝液A清洗管柱，流速爲2.5毫升/分。接著 ，以2.5毫升/分之流速從管柱洗提出在25管柱體積之〇-200mM線性NaCl梯度中之不同（DllC)hPYY3-36物種。藉 φ 由280nm(A28Q)處之吸收監測洗提液並收集合適大小之分 液。藉SEC-HPLC進行評估，依聚乙二醇化程度累積分液 。然後，利用 Vivaspin 10K 濃縮器（Vivascience Sartorius Group)將純化之累積液濃縮成0.5-5毫克/毫升。利用由實 驗衍生之消退係數，藉由280nm處之吸收測定純化之累積 液的蛋白質濃度。利用 SEC-HPLC或 SDS-PAGE製作 12K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3-36之純化之累積液的 略圖。 -76- (73) 1310038 (i) 支鏈型20K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36之製備 方法

將約20,000MW之支鏈型 mPEG馬來醯亞胺試劑 (Sunbright GL2-200MA，NOF Corporation)選擇性地偶合 至（DllC)hPYY3.36殘基10處之半胱胺酸的氫硫基上。藉由 將狀直接加入溶解在20mM醋酸鈉（史格馬化學公司）， pH4.5中之支鏈型20K mPEG馬來醯亞胺中，使支鏈型20K • mPEG與（DllC)hPYY3_36肽立即反應，以產生1毫克/毫升 肽濃度且該相關mPEG: (DllC)hPYY3-36之莫耳比約爲1 :1。在室温、黑暗中進行反應0.5-24小時。將在20mΜ醋 酸鈉，ρΗ4.5中之反應物直接塡在陽離子交換色層分析管 柱上。藉由SEC-HPLC或SDS-PAGE評估反應產物。 (j) 支鏈型20Κ mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36之純化方 法。 # 利用單一離子交換色層分析步驟從反應混合物將聚乙 二醇化（〇11<：)1^¥¥3.36物種純化至>95%。利用陽離子交換 色層分析法將單聚乙二醇化之（DllC)hPYY3.36與游離PEG 、未修改之（DllC)hPYY3.36及具較大分子量之物種分開。 將典型之支鏈型20K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36反 應混合物（10毫克蛋白質）（如上述）在SP Sepharose Hiltrap 管柱（5 毫升）（Amersham Pharmacia Biotech，GE Healthcare)(其 係在20mM醋酸鈉’ pH4.5(緩衝液a)中平衡）上進行分餾。 以1 ·0毫升/分之流速將反應混合物裝塡在管柱上。以4管 -77- (74) 1310038 柱體積之緩衝液A，以2 · 5毫升/分之流速清洗管柱。接著 ’將不同（DllC)hPYY3·36物種以2.5毫升/分之流速，在25 管柱體積之〇-200mM線性NaCl梯度中從管柱洗提出。藉 由280nm(A28〇)處之吸收監測洗提液並收集合適大小之分 液。藉SEC-HPLC進行評估，依聚乙二醇化程度累積分液 。然後，利用 Vivaspin 10K 濃縮器（Vivascience Sartorius Group)將純化之累積液濃縮成0.5-5毫克/毫升。利用由實 φ 驗衍生之消退係數，藉由280nm處之吸收測定純化之累積 液的濃度。利用SEC-HPLC或SDS-PAGE製作支鏈型20K mPEG馬來醯亞胺 （DllC)hPYY3_36之純化之累積液的略 圖。 實例5 生化特性之測定 藉多種不同之生化方法，包括：電噴霧質譜分析 • (ESI-MS)、 SDS-PAGE 和 SEC HPLC 以及 RP HPLC 分另！J 令則 定（E10C)hPYY3.36、（DllC)hPYY3.36及聚乙二醇化型之 (£10(：)11?¥丫3.36和（〇11(：)1^丫丫3-36之特性。 (A) 電噴霧離子化質譜分析（ESI-MS)係在1100系列 LC/MSD 電噴霧質譜儀（Agilent Technologies，Palo Alto, CA)上，正電壓模式中進行（實例1(a)、2(a))。 (B) 在 Zorbax Eclipse XDB-C8 ’ 4.6x150 毫米、5毫 米管柱（目錄編號 993967-906 ’ Agilent Technologies ’ Palo Alto，CA)上，以1.5毫升/分之流速，利用在3分鐘內 -78 - (75) 1310038 從10 0 %溶劑A，0 %溶劑B至9 5 %溶劑A，5 %溶劑B之線 性梯度，再變更爲1 2分鐘內從9 5 %溶劑A，5 %溶劑B至 5 0%溶劑A，50 %溶劑B之線性梯度，進行逆相色層分析 以分析（E10C)hPYY3_36肽（第1及4圖）。溶劑A爲0.1%TFA 水溶液。溶劑B爲在乙腈中之〇. 1 %TFA溶液。 用於定量聚乙二醇化之（E10C)hPYY3.36及（DllC)hPYY3_36 的逆相色層分析（未顯示）係在Vydac C18(2.lx250毫米）管 柱（目錄編號 218MS552，Vydac，Hesperia，CA)上，以 0.2 毫升/分之流速，利用在48分鐘內從80%溶劑 A，20%溶劑 B至40%溶劑A，60%溶劑B之線性梯度進行（實例1C及 2C)。溶劑A爲0.1%TFA水溶液。溶劑B爲在乙腈中之 0.085%TFA 溶液。 (C)尺寸排除高效能液態色層分析法（SEC-HPLC) 利用非變性SEC-HPLC (實例1(b)及（c)、2(b)及（c))評 • 估直線型30K或支鏈型43K mPEG與（E10C)hPYY3-36或 (DllC)hPYY3_36之混合物、其陽離子交換純化累積液及最 終之純化產物。利用在20mM磷酸鹽pH7.4、150mM氯化 鈉中之 Shodex KW8 04或 TSK G4000PWXL (Tosohaas)，以 1.0毫升/分之流速進行分析性非變性SEC-HPLC (可選擇性 地使用 Superdex200 7.8毫米 X30公分，Amersham Bioscience ，Pi scat away，NJ)。聚乙二醇化作用可大量增加蛋白質之流 動體積而使保持時間往前移動。在30K mPEG馬來醯亞胺加 (E10C)hPYY3_36之反應混合物中可觀察到對應於殘餘之未 -79- (76) 1310038 修改的（E10C)hPYY3.36之小峯以及對應於聚乙二醇化之肽 物種的新峯（第2圖）。在30K mPEG(DllC)hPYY3-36及支鏈 型43K mPEG (E10C)hPYY3-36之反應混合物（其中剩餘非常少 之未修改之（〇11(：)11?丫¥3.36或（£10(：)11?¥¥3-36)中可觀察到新 物種（第5和8圖）。藉由SP-Sepharose色層分析法將這些聚 乙二醇化及非聚乙二醇化之物種分餾，接著，所產生之純化 的單 mPEG (E10C)hPYY3_36及 mPEG (DllC)hPYY3-36物種顯 • 示出係在非變性SEC上以單峯之型式（>95%純度）洗提出（第 . 6、7和9圖）。SP-Sepharose色層分析步驟有效地將游離 mPEG、（E10C)hPYY3-36 或（DllC)hPYY3.36及較大分子量之 物種從單聚乙二醇化之直線型30K及支鏈型43K mPEG (E10C)hPYY3.36或 mPEG(DllC)hPYY3_36移除。

(D)SDS PAGE 亦可使用SDS PAGE(實例1(c))來評估反應物、陽離 • 子交換純化法之分液（第3圖）及最終純化產物。在還原及 非還原條件下，在1毫米厚ΙΟ-NuPAGE凝膠（因維特金， Carlsbad，CA)上進行 SDS PAGE 並利用 Novex Colloidal CoomassieTMG-250染色套組（因維特金，Carlsbad，CA)染 色。 生物分析 本發明之PYY激動劑於作爲減少哺乳動物（尤其是人 類）體重增加及治療肥胖之藥學活性劑上的用途可藉由該 -80- (77) 1310038 激動劑在習知分析及下述活體外及活體內分析中之活性證 明。這類分析亦提供一種方法’藉由此法可將本發明之 PYY激動劑的活性與已知化合物之活性相比較。 食物攝取硏究 由空腹引起之再進食分析：將C57BL/6J雄性小鼠 (The Jackson實驗室，Bar Harbor，ME)飼養在籠中，毎 • 籠2隻。將小鼠養在12 : 12光：暗循環中（5 : 00ΑΜ開燈 ，5 : 00ΡΜ關燈）並餵食九狀RMH3000 Purina齧齒動物食 品（.Research Diets，Inc·，New Brunswick，NJ)且讓其可 隨意暍水。當小鼠7-8週大時，在硏究前讓小鼠適應至少 10天。在硏究當天，小鼠爲9-12週大。開始硏究前一天， 將小鼠置於提供新床舖，無食物，但可隨意接近水的籠內 。讓小鼠空腹一整夜（2〇-24小時）。硏究當天，經ip注射 給予小鼠藥物（劑量體積=5毫升/公斤），再將小鼠送回籠 Φ 內並將預先稱重之食物立即置於籠內。所使用之給藥載劑 爲20mM醋酸鈉，pH4.5，50mM NaCl，並計算未聚乙二醇 化之活性PYY實體的劑量。測試三種劑量（〇.；[毫克/公斤 、0.3毫克/公斤及1.0毫克/公斤）之載劑對照組、天然ργγ 、30〖1^£〇馬來醯亞胺口10(：)11?丫丫3-36及431«：111?£〇馬 來醯亞胺（E10C)hPYY3_36。在給藥後2、4、6及24小時重 新測量食物重量。檢查床舖上之溢出食物，將其稱重並包 含在計算中。從起始食物重量減去各時間點之食物重量來 目十算累積之食物攝取量。藉（FI洽療-FI載劑）/FI β劑*1〇〇來計 -81 - (78) 1310038 算抑制百分比。 第10圖顯示在經IP注射給予小鼠三種劑量之天然 PYY(第 10A 圖）及 30K mPEG 馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36( 第10B圖）後6小時之累積攝取量。天然PYY及30K mPEG 馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36均顯示出在6小時之期間內， 小鼠之累積之食物攝取量呈現劑量倚賴性減少。 43〖11^£〇馬來醯亞胺（丑10(：)11?¥丫3.36亦顯示出在6小 % 時（第11A圖）及24小時（第11B圖）之期間內小鼠之累積之 食物攝取量呈現劑量倚賴性減少。然而，6小時及24小時 後，43K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36減少食物攝取 量之效果均未如相同劑量（0.1毫克/公斤）之30K mPEG馬 來醯亞胺卩10(：)1^¥丫3.36般有效。 亦比較注射0.1毫克/公斤（SC)後，30K mPEG馬來醯 亞胺 （E10C)hPYY3.36與 30K mPEG 馬來醯亞胺 (011<3)11?¥¥3.36對由空腹引起之再進食的效果。如下表所 % 示，雖然30K mPEG馬來醯亞胺（DllC)hPYY3.36肽確實使 小鼠在24小時之期間內累積之食物攝取量（FI)減少，但 其效果未若30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36般有效 % % % 治療 2小嚇I 變化 4小時R 變化 6小時FI 變化 24小時η 載劑 平均値 2.03 0.00 2.93 0.00 4.06 0.00 1079 0.00 SEM 0.16 8.06 0.22 7.46 0.46 11.30 0.67 6.23 E10C 平均値 1.89 -6.99 2.16 -26.21 2.45 -39.62 8.04 -25.48 SEM 0.27 13.45 0.27 9.09 0.26 6.33 0.88 8.14 D11C 平均値 2.14 5.22 2.56 •12.56 3.09 -24.02 9.08 -15.88 SEM 0.15 7.30 0.23 7.72 0.27 6.68 0.42 3.88 -82- (79) 1310038 比較直線型20K mPEG馬來醯亞胺（丑10(：)11?丫丫3_36與 30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36(二者均在實例1中） 之效果。在一種硏究中，在雄性小鼠中注射0.1毫克/公斤 (IP)之劑量，結果如下表所示。 相對於載劑治療組之累積食物攝取量之％變化

治療 2小時FI 4小時FI 6小時FI 24小時FI 48小時FI 30K E10C -56 -65 -78 -47 -20 20K E10C -65 -73 -79 -36 -17 類似地，在第二種硏究中，比較給予〇 . 1毫克/公斤劑 量（SC)後，直線型20 K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36 、30 K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36的餵食效果，結 果顯不於下表。 治療 2小時FI 4小時FI 6小時FI 24小時FI 48小時FI 72小時FI 30K E10C -13 -24 -29 -20 -12 -2 20K E10C -45 -55 -58 -28 -14 -5 • 相對於載劑治療組之累積食物攝取量之％變化 S C注身! 「後之血漿PYY濃度如下： 治療 2小時 4小時 6小時 24小時 3 0小時 48小時 30K E10C 15 1±58 204±48 308±29 139±27 79±14 40±6 20K E10C 110±21 186±37 204±14 62±16 45±12 13±3 -83- (80) 1310038 自發性食物攝取分析：將 C57BL/6J雄性小鼠（The Jackson實驗室）個別飼養在籠中，使其在硏究BLI適應2週 。將其養在12: 12光：暗循環中，並隨意餵食粉末狀食 品且可自由暍水。在給藥前一天，將小鼠置於食物攝取室 中並使其適應一天。第二天，就在關燈前（4 : 00ΡΜ)以IP 或皮下（SC)途徑給予小鼠藥物。在全部期間每隔10分鐘自 動監測食物之攝取情形且每日測量體重。所顯示者爲IP注 • 射天然PYY3-36及30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3-36(第 12圖）及 SC注射天然 ？¥丫3-36及30〖mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3-36(第13圖）之結果。與載劑-治療組相較下， 雖然天然PYY3-36及30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3-36二 者可立即減少累積之食物攝取量，但由30K mPEG馬來醯 亞胺01〇〇1^¥¥3_36引起之減少食物攝取量之有效期較由 天然ΡΥΥ3 ·3 6引起之有效期延長很多。結合較持久之食物 攝取效果外，30Κ mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36亦顯 0 示在單次注射（〇·1毫克/公斤，IP)後血漿暴露延長（第14圖 )。雖然天然PYY3_36具有I6毫升/分/公斤之清除率及38nM 之 Cmax ’但 30K mPEG 馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36 具有 0.2 毫升/分/公斤之清除率及267nM之Cmax。利用hPYY放射 免疫分析套組（Linco Research，Inc·，St.Louis，M0)在小 鼠中測量血漿ργγ値。 以Ob/ob小鼠進行之迷你啷筒分析：讓8_9週大之雄 性〇b/ob小鼠（The Jackson實驗室）維持正常飲食並植入 14-天渗透性迷你卿筒（Aiza Corp.，Mountain View，CA) • 84 - (81) 1310038 ，其可用來給予載劑（生理食鹽水）、PYY3-36(〇.l毫克/公 斤/天）或3 01<：?£0馬來醯亞胺斤10(：)1^¥¥3.36(0.03毫克/公 斤/天）。每日測量食物重量及體重。在第〇天及第13天測 定體脂組成物。在硏究結束時採取血液樣本。這些群組之 食物攝取量、體重或體脂組成物均無顯著差異。在硏究結 束時依前述藉由放射免疫分析測定血漿PYY。在天然 PYY3-36治療組中，測得之血漿PYY量爲15±2奈克/毫升； φ 在30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36S療組中，測得 之血漿PYY量爲133±22奈克/毫升。 活體外結合硏究 配體結合之SPA : 用於分析配體結合之SPA係測量從Y2受體競爭性取 代經放射標不之PYY且係使用自Amersham Biosciences( 目錄編號RPNQ 0085)取得之含有閃燦劑（SPA小珠）並以 # 外源凝集素麥胚素（WGA)塗覆的微粒進行。利用由下列各 項組成之細胞收成緩衝液製備在其細胞表面上表現Y 2受 體之KAN-TS人類神經母細胞瘤細胞的懸浮液（Fuhlendorf et ^l^Proc.NatLAcad Sci, USA, 8 7 : 1 8 2- 1 86 ， 1990)： 50mM Hepes 緩衝液（ρΗ7·4)、145mM NaCl、2.5mM CaCl2 、ImM MgCl2、lOmM 葡萄糖、0.1%BSA、5%DMS0 及羅 氏（Roche)蛋白酶抑制劑。在96槽版式中利用50,000細胞/ 槽、125I-PYY(40,000 cpm/槽）及 S P A 小珠（〇. 5 毫克 /槽）， 在由下列各項組成之分析緩衝液中進行S P A分析，複製 -85- (82) 1310038 三份：50mM Hepes 緩衝液（pH7.4)、ImM MgCl2、2.5mM CaCl2、0.1%(重量/體積）BSA、0.025%(重量/體積）枯草桿 菌素及0.025%疊氮化鈉。將多種不同濃度（0.032至500nM) 之測試配體加入分析混合物中，再將其在室温中温育1 6 -24小時，並一邊搖動。讓分析盤靜置1小時，再利用 M i c r ο B e t a ® T r i 1 u X 偵測器（p e r k i η E1 m e r，麻州波 士頓市）計 算之。hPYY3_36及實例1之30K mPEG 馬來醯亞胺 φ (E10C)hPYY3-36的結果顯示在第15圖中。 NPY Y2R受體處之GTRY[35S]結合分析 功能分析爲在 NEN Flashplates(96槽版式）中運作之 GTRy[35S]結合分析。依 Bass et al.，Moi._P/iarm.50: 709-715，1990中之描述從KAN-TS細胞製備細胞膜。在96槽 FlashPlatesTM版式中使用在分析緩衝液中之1〇〇ρΜ GTRY[35S]及10微克膜/槽進行GTRY[35S]結合分析，並複 • 製二份，該分析緩衝液係由50mM Tris Hcl，pH7.4、3mM MgCl〗，ρΗ7·4、10mM MgCl2、20 mM EGTA、100 mM NaCl、5μΜ GDP、0.1%牛血清白蛋白及下列蛋白酶抑制劑 所組成：100微克/毫升之枯草桿菌素、100微克/毫升之苄 脒、5微克/毫升之抗蛋白酶肽、5微克/毫升之亮抑酶肽 (leupeptin)。然後，將分析混合物與逐漸增加濃度之測試 化合物（6·點濃度曲線；1〇·12Μ至10_5M之對數稀釋液）一 起在30°C培育60分鐘。然後，將 FlashPlatesTM在2000又笆 離心10分鐘。利用Micr〇betaTM偵測器定量對GTRY[35S] -86- (83) 1310038 結合之刺激。EC5Q及內在活性之計算値係使用 Graphpad 之Prism計算。hPYY3.36及實例1之30K mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3-36之結果顯示於第16圖中。實例1之30K mPEG 馬來醯亞胺（E10C)hPYY3.36及20K mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3.36之EC5G値彼此相當（如：在相同分析中所 測量到的爲4 · 3 η Μ及4 · 6 η Μ )。 φ 【圖式簡單說明】 第 1圖爲純化之（E10C)hPYY3.36 肽在 Zorbax Eclipse XDB-C8管柱上的逆相HPLC圖樣。

I 第2圖爲直線型30K mPEG 馬來醯亞胺加 (E10C)hPYY3_362反應混合物在Shodex 804 SEC管柱上 的尺寸排除HPLC圖樣。 第3圖爲來自直線型30K mPEG 馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3_362 SPHitrap 純化作用之分液的 SDSPAGE • 相片。MW =分子量標準；L =管柱裝載物；FT =通過之流； 4-23 =洗提分液。 第 4圖爲純化之（DllC)hPYY3-36狀在 Zorbax Eclipse XDB-C8管柱上的逆相HPLC圖樣。 第5圖爲直線型30K mPEG 馬來醯亞胺加 (DllC)hPYY3.36之反應混合物在Shodex 804 SEC管柱上 的尺寸排除HPLC圖樣。 第6圖爲在Shodex 8〇4 SEC管柱上追蹤顯示出直線型 30 K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36產物之洗提略圖的 -87- (84) 1310038 尺寸排除HPLC。 第7圖爲顯示出直線型30K mPEG馬來醯亞胺 (DllC)hPYY3-36產物在Shodex 804 SEC管柱上之洗提略 圖的尺寸排除HPLC圖樣。 第8爲甘油-支鏈型43K mPEG 馬來醯亞胺加 (E10C)hPYY3.36之反應混合物在Shodex 804 SEC管柱上 的尺寸排除HPLC圖樣。 φ 第9圖爲顯示出純化之甘油-支鏈型43K mPEG馬來醯 亞胺（E10C)hPYY3-36產物在 Shodex 804 SEC管柱上之洗 提略圖的尺寸排除HPLC圖樣。 第10圖爲經由腹膜內（IP)注射後，在空腹小鼠體內對 累積性食物攝取之抑制情形的圖形。第10A圖顯示出與載 劑組相較下，天然PYY3-36之劑量效果。第10B圖顯示出 直線型30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36之劑量效果 〇 • 第11圖顯示與載劑組及直線型30K mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3-36相較下，IP注射甘油-支鏈型43k mPEG 馬來醯亞胺（£10(：)1^丫丫3_36後在空腹小鼠體內對累積性食 物攝取之效果。第11A圖爲顯示出注射後6小時期間內之 反應的線型圖。第1 1 B圖爲比較注射後24小時期間內之效 果的條形圖。 第12圖顯示出IP注射載劑、？丫丫3.36及直線型30K mPEG馬來醯亞胺（E10C)hPYY3_36後，對自發性空腹小鼠 之效果。第12A圖顯示對食物攝取之效果，第12B圖顯示 -88- (85) .1310038 對體重之效果。 第13圖顯示出皮下（SC)注射載劑、Ργγ3_36及直線型 30Κ mPEG馬來醯亞胺（El〇C)hPYY3.36後，對自發性空腹 小鼠之效果。第13A圖顯示對食物攝取之效果，第13B圖 顯示對體重之效果。 第14圖顯示在IP注射0.1毫克/公斤後，小鼠血漿暴露 於PYY之情形。第14A圖顯示注射hPYY3_3d^之血漿 φ PYY量，第14B圖顯示注射直線型30K mPEG馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3-36後之血漿 PYY 量。 第15圖爲來自親近閃燦檢測法（Scintillation Proximity Assay)(SPA)之 PYY3-36或直線型 30K mPEG 馬來 醯亞胺（E10C)hPYY3-36之濃度反應曲線圖，其中該配體與 爭結合表現在KAN-TS細胞上之Y2R。 第16圖爲以表現在 KAN-TS膜上之 Y2R進行之 GTRy[35S]結合分析的ΡΥΥ3-36或直線型30K mPEG馬來醯 φ 亞胺（E10C)hPΥΥ3.36之濃度反應曲線圖。 -89- 、1310038 10 15

Arg Tyr Tyr λ1〇3 sen Leu Arg His Leu Asn Leu val ,h〇r Arg Gln

Arg Tyr

Λ > Λ > 012 3 1111 2222 V V V V 4 34 PRT 現代人 <400> 4 lie Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu cys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin

Arg Tyr <210> 5 <211> 102 <212> DNA <213>現代人 <400> 5 atcaaacccg aggctcccgg ctgtgacgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at 60 102 <210> 6 <211> 102 <212> DNA <213>現代人 <400> 6 atcaaacccg aggctcccgg ctgcgacgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at 60 102 <210> 7 <211> 102 <212> DNA <213>現代人 <400> 7 atcaaacccg aggctcccgg cgaatgtgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at 60 <210> 8 <211> 102 <212> DNA <213>現代人 -2- 102 60 1310038 <400> 8 102 atcaaacccg aggctcccgg cgaatgcgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at

-3-

Claims (1)

1. |公告本 1310038 1 . (1) 十、申請專利範圍 附件2A: 第951031 272號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 民國9 8年1月19日修正 1 . 一種具有胺基酸序列 IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ 10>^0.:3]之多肽（£10〇1^丫丫3_36或其藥學上可接受之鹽 2 . —種具有胺基酸序列 IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ 10>10.:4]之多肽（0 11(：)11?丫丫3-36或其藥學上可接受之鹽

   其中PEG爲甲氧基PEG(mPEG)且爲直線型或支鏈型 ，並具有約lkD至50kD之重量平均分子量 1 —種共軛物，其包含直鏈或支鏈型聚乙二醇（PEG) 和多肽（£10(：)1^丫丫3-36或（〇11(：)11?丫丫3-36，其中該？丑〇係 可選擇地經由連接子共價連接（E10C)hPYY3-36或 (DllC)hPYY3-36之半胱胺酸硫醇基的硫原子。 2 如申請專利範圍第3項之共軛物，其具有式3 (2) 1310038 L 爲式-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r-所示之基團’ 其中P和r各別爲1至6之整數， 或L爲式-NHC(0)(CH2)s-所示之基團’ 其中s爲1至6之整數，且-SR爲多肽（E10C)hPYY3-36 或（DllC)hPYY306，其中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子 〇 5·如申請專利範圍第4項之共軛物，其中該mPEG爲 直線型。 6 ·如申請專利範圍第5項之共軛物，其具有式4 CH3(0CH2CH2)n0CH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2N

   其中 η 爲約600至75 0之整數且-SR 爲多肽 (ElGC)hPYY3_36，其中s爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。 7.如申請專利範圍第6項之共軛物，其中該 (OCH2CH2)n部分具有約30kD之重量平均分子量。 8 如申請專利範圍第5項之共軛物，其具有式4 -2- 1310038

   CH3(0CH2CH2)n0CH2CH2CH2NHC(0)CH2CIV 其中 n 爲約3 75至525之整數且-SR爲多肽 (E10C)hPYY3.36，其中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。 9.如申請專利範圍第8項之共轭物，其中該 (〇CH2CH2)n部分具有約20 kD之重量平均分子量。 10.如申請專利範圍第5項之共軛物，其具有式4

   CH3(0CH2CH2)n0CH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2N 其中 η 爲約600至750之整數且-SR 爲多肽 (D1 lC)hPYY3.36，其中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。 1 1 .如申請專利範圍第1 〇項之共軛物，其中該 (OCH2CH2)n部分具有約30 kD之重量平均分子量。 1 2 .如申請專利範圍第4項之共軛物，其中該mPEG爲 甘油-支鏈型。 1 3 .如申請專利範圍第1 2項之共軛物，其具有式5 (4) 1310038

   CH2—(〇CH2CH2)mOCH3 CH-(OCH2CH2)mOCH3

   其中每個m約略相同且爲約45 0至5 00之整數， 爲（E10C)hPYY3-36多肽，其中S爲半胱胺酸硫醇基圍 原子。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之共軛物，其中 (OCH2CH2)m部分具有約20kD至22kD之重量平均芡 〇 1 5 .如申請專利範圍第〗2項之共軛物，其具有式5 CH2—(〇CH2CH2)mOCH3 且-SR 3之硫 每個 、子量 CH- (OCH2CH2)mOCH3 CH2 -NHC(0)CH2CH2N 5 SR 其中每個m皆相同且爲約450至500之整數，且- SR爲 (DllC)hPYY3.36多肽，其中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原 (5) 1310038 子。 1 6.如申請專利範圍第1 5項之共軛物，其中每個 (OCH2CH2)m部分具有約20kD至22kD之重量平均分子量 〇 17. —種甘油-支鏈型43K mPEG 馬來醯亞胺 (E10C)hPYY3_36共軛物或其藥學上可接受之鹽，該共軛物 具有式5

   CH2—(〇CH2CH2)mOCH3 CH——(OCH2CH2)mOCH3

   其中每個m約略相同且- SR爲（E10C)hPYY3.36多肽， 其中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。 18. —種甘油-支鏈型43K mPEG 馬來醯亞胺 (DllC)hPYY3_36共軛物或其藥學上可接受之鹽，該共軛物 具有式5 (6) 1310038 CH2-—(OCH2CH2)mOCH3 CH--(〇CH2CH2)mOCH： CH2

   其中每個m約略相同且- SR爲（D1 lC)hPYY3_36多肽’ 其中S爲半胱胺酸硫醇基團之硫原子。 1 9. 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第1或2 項之多肽或如申請專利範圍第3至1 8項中任一項之共軛物 或其藥學上可接受之鹽及藥學上可接受之載體。 2 0.如申請專利範圍第19項之藥學組成物’其進一步 包含抗肥胖劑。 21. —種如申請專利範圍第1或2項之多肽或如申請專 利範圍第3至18項中任一項之共軛物或其藥學上可接受之 鹽於製造供治療哺乳動物之肥胖症或超重病症或供抑制哺 乳動物增加體重、減少食物攝取或減少卡路里攝取的藥物 上之用途。 2 2 . —種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1或2 項之多肽。 民國98年1月19日修正 TlinnQQ附件4Α·_第 95103474 號專利申請案 ,IJiUUJS 中文圖式替換頁 十一、圖式 S6ZU ε9ε·ΐ4- 9Ζ0 01 %年/月/日修正替換頁 画

   0 !'0 OCHI, 0000 00 寸 Τ009 009οοζ rnvE 1310038

   •1310038

   ο :0 60-ooCNl οοε 00 寸 idve -1310038

   ¾¾

   φ 〇〇Ό2 0°-竺0-91,00·寸 l· ooi oo_CH 0§ 00·9 03 00_3 1310038

   Β9 嫉

   φ ΟΟΌονΙοοί 00·9π 00·Η osl· oo_CH 00·8 §·9 00·寸 00_3 •1310038

   w卜狒

   oodcvloocoT-oocdT-opHooCNil. oodl. oocdooCD05 ooCNi 1310038

   ορΟΝΟΟοοτ-οοΌτ-οσΗOOCNJT—OPCHOOOOOOCD03 oocsi < 1310038

   祖6贼

   00Ό3 oocoT-ooCDl. 00_H ooCNiT-oodl· OOOOOOCD05 oocvl 1310038 B30I 贼

   9Lo (fr/)SE#0 寸 eCNl ®νΞ狹

   9lo (&令)酲雔 寸Co 3X- 0 coco-ε ΛΛέ (οοχ—3)ίκθ 麵嵌啤οϋϋα,Ε >locovh:<<i/Ktt#0〆 II ^005- 1¾ Is ^.0 JTcofo-co>-AdMoCHUJ)iws塵^atCDLUdE >10co\tr<4/K_ 5 +I — coco—coAAdtJ^^/^wcoO.CDsxxdMt-^/sro. PI . (职)_ia蠛 鬆魈-hJig蛛 HST—Η蛛

   CDS AAdroom)似頭癲恡_、oUJd£ >100寸lt<4/帜wo· D coSAAdMooLD)越商塵^lal0LiJQ.£ >100寸lt<4孩wcoo0 CDSAAdMoos)盤Hfi^!HI9LUd£>ico寸\t-<4/傾ws 画 CDSAAdMoom)潜1¾應^al〇liiOL£>10co\t<4/w*s 画 00 i @_震 義Ν—' SVII 被

   鬆敏β35蛛 男-ε AAdMoos^Hs^ilclLiJdE >ιε 寸lt<4/ww5 男^,^^40°山)你园鱷嵌啤03山£>100寸此<4/^_000 CDSAAdMoos)¾¾ 嫿^Κιουϋα-Ε >lco寸此句碌爾一ο § 910寸OOCNIτ-0 附件4A:第 95103474 號專利申請案 UXUUJO 中文圖式替顚 民國98年1月19 aaCXII 躲

   寸 ε04 〜曰修正替換頁 0.0 (|細§ ο (8=u)疆 VCNII 铖

   ε τ 00 V i ss^ (oolSAAd^ooElgtsl^^ttlollJdE^^-^^wro-^elstQ.LJoossHii^^HtsdESlt^/wwcoO. oo=u) 99-〇〇>->-0.400^^^鱷长啤9山〇.£茗〇〇^^/^爾8.0^^{寸^男-〇〇>->-〇.1|0°山)^^嫿¥||〇山〇.11^0〇〇^<</^»5. (8=u) s>->-Q.\t<<!/职Wl-Ό I (e=u) 9ε-ε>->-0_χ:(oomps鹽嵌ilsdE Μοε4/<</^_ ε〇Ό. 蘅鐮皿^ 1310038 附件 4A:第 95 103474 中文圖式替換頁 號專利申請案 民國98年1月19日修正 月 轉 頁 SPQCOI 姝

   寸 Co τ o £ s Omn-E —s^.o · (OONU) 9s>->-QL殳 0°3)越商騸-^BIsdE >10co\t;<4/wf ·0 -(οο=ιι)9ε-ε>->-α.μοου])®^鱷^MOUJdE >loe-i/<4/^wsO-i (g=u)®®- svcol 贼

   寸 ζ ε ο r雲S .(ΐ)9ε-ε>-Λ^(ΟΟΕ)®^^!κιϋΪΕ>ιοεϋΓ<</^»5— • s s ^oos^s^om^E ^ Is s.o f (H<)酲盤-N班嫌龜 1310038

   (iav「/)5El#H 安*7| HVH姝

   (寧 R)SE#a 910寸cocsll· 0 j_QQT—AAd^-g 1310038 co-l·iaogoll 9°?coAAd 9SAAd(0CH3) 6ΙΓ5ICOIAIoLUdE >1000v eLOi 躲

   ΙΛΙ9ldUJd3 οδ〇Ί Z 丨00- 6_ οτ—丨 9丨 u. 1310038 CN1S ilu) OSOI 9ε-εΛΛ1 · 9co_coAAdoCH 山) Z.CHrolAloLUdE >1000v

   -0 -SOJ OLO lpl 丁 001- InCNJr— LhCN— 1ΛΙ【malldllld】 ΟΤ-ΟΟΊ寸-9-9· Ζ~ 8—^oT—-T—TCNlTετ AAd lAIUOOT-%