RS50966B - Agonisti pyy i njihova upotreba - Google Patents

Abstract

Polipeptid (E10C)nPYY3-36, naznačen time što ima amino kiselinu sekvence IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID No.:3] ili njenufemaceutski prihvatljivu so.Prijava sadrži još 22 zavisna patentna zahteva.

Description

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na agoniste PYY, još preciznije na PYY3_36varijante i to pegilirane derivate PYY3-36i PYY3-36varijanti, na kompozicije koje sadrže ove agoniste,

izolovane nukleinske kiseline koje enkodiraju ovakve agoniste PYY, i na upotrebu ovih agonista ili kompozicija u tretmanu gojaznosti i bolesti povezane sa njom, ili za smanjenje apetita, unosa hrane ili unosa kalorija kod sisara.

Poreklo pronalaska

[0002]Gojaznost je osnovna briga javnog zdravlja zbog povećanja prevalence i zdravstvenih

rizika povezanih sa njom. Osim toga, gojaznost može negativno da utiče na kvalitet života osoba zbog ograničene mobilnosti i smanjenja fizičke izdržljivosti, kao i zbog socijalne, akademske i poslovne diskriminacije.

[0003]Gojaznost i prekomerna težina se generalno definišu preko indeksa telesne mase (BMI),

koji je u korelaciji sa ukupnom telesnom masnoćom i služi kao mera rizika za izvesna oboljenja. BMI se izračunava kada se težina u kilogramima podeli sa visinom u metrima kvadratnim

(kg/m<2>). Prekomerna težina se obično definiše kao vrednost BMI od 25-29.9 kg/m<2>, a gojaznost se obično definiše kao vrednost BMI od 30 kg/m<2>ili više. Videti, na primer, National Heart,

Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment Over\veight and Obesitv in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: U.S. Department

Health i Human Services, NIH publikacija broj 98-4083 (1998).

[0004]U savremenim studijama je nađeno da gojaznost i zdravstveni rizici povezani sa njom

nisu ograničeni na odrasle osobe, već su takođe obuhvaćena i-deca4 adolescenti u iznenađujuće velikom broju. U skladu sa Centrom za kontrolu bolesti, procenat dece i adolescenata koja pripadaju grupi sa povećanom težinom je više nego dvostruko uvećan u odnosu na rane 1970-te

godine, a približno 15% dece i adolescenata u ovom trenutku ima prekomernu težinu. Faktori rizika za bolesti srca, kao što su visoki holesterol i visoki krvni pritisak se javljaju mnogo češće kod dece i adolescenata sa prekomernom težinom u odnosu na subjekte normalne težine istih godina. Takođe, dijabetes tip 2, ranije smatran kao bolest odraslih, se dramatično povećava kod dece i adolescenata. Stanja prekomerme težine i gojaznosti su blisko povezana sa dijabetesom tip 2. Nedavno je procenjeno da adolescenti sa prekomernom težinom imaju 70% šansi da postanu odrasle osobe sa prekomernom težinom ili gojazne. Verovatnoća se povećava do približno 80% ukoliko jedan od roditelja ima prekomernu težinu ili je gojazan. Najdirektnija posledica prekomerne težine, kako su sama deca primetila, je socijalna diskriminacija.

[0005] Osobe sa prekomernom težinom ili gojazne osobe su pod povećanim rizikom za oboljenja kao što su hiperterrzija, dislipidemija, dijabetes tip 2 (nezavistan od insulina), rezistencija insulina, netolerancija na glukozu, hiperinsulinemija, bolest krvnih sudova srca, angina pektoris, kongestivno oštećenje srca, slog, angina pektoris, kamen u žučnoj kesi, holescititis, holelitijaze, giht, osteoartritis, opstruktivni zastoj u disanju u toku sna i respiratorni problemi, oboljenje žučne kese, izvesni oblici kancera (na primer, endometrijuma, dojke, prostate i kolona) i psihološki poremećaji (kao što su depresija, poremećaj uzimanja hrane, izopačena slika tela i nedostatak samopoštovanja). Negativne posledice gojaznosti na zdravlje čine je drugim vodećim uzrokom smrti koja može da se spreči u Sjedinjenim Državama i predstavlja značajan ekonomski i psihološki efekat u društvu. Videti, McGinnis M, Foege WH., "Actual Causes Death in the United States," JAMA 270:2207-12, 1993.

[0006] Gojaznost se danas smatra hroničnom bolešću koja zahteva tretman kako bi se smanjila njena povezanost sa zdravstvenim rizicima. Mada je gubitak težine važan rezultat tretmana,

jedan od glavnih ciljeva tretiranja gojaznosti je da se poboljšaju kardiovaskularne i metaboličke vrednosti kako bi se smanjili morbiditet i mortalitet povezani sa gojaznošću. Pokazano je da gubitak telesne težine od 5-10% može značajno da poboljša metaboličke vrednosti, kao što su sadržaj glukoze u krvi, krvni pritisak i koncentracije lipida. Zbog toga se veruje da smanjenje telesne težine od 5-10% može da smanji morbiditet i mortalitet.

[0007] Trenutno raspoloživi lekovi koji se propisuju za tretiranje gojaznosti, generalno smanjuju težinu smanjenjem apsorpcije unete masnoće, kao kod orlistata, ili stvaranjem energetskog deficita smanjenjem unosa hrane i/ili povećanjem utroška energije, kao što se vidi kod sibutramina. Istraživanja alternativa za trenutno raspoloživa sredstva protiv gojaznosti su krenula u više pravaca, od kojih je jedan fokusiran na izvesne peptide creva koji su implicirani u moduliranje sitosti kao što je peptid YY (PYY).

[0008] PYY je član pankreatične polipeptidne (PP) familije hormona (zajednosa PP i neuropeptidom Y (NPY)). Kao i kod drugih članova familije, PYY je peptid od 36 amino kiselina sa amido grupom na C-završetku. To je endokrini peptid creva koji je prvo izdvojen iz intestinuma svinje (Tatemoto and Mutt, Nature 285:417-418,1980) a zatim je objavljeno da smanjuje unos hrane bogate mašću kod pacova nakon periferne primene (Okada i saradnici, Endocrinologv Supplement 180,1993) i dovodi do gubitka telesne težine kod miševa nakon periferne primene (Morlev and Flood, Life Sciences 41:2157-2165, 1987). Poznato je da postoji veliki broj molekularnih oblika PYY u depoima i u cirkulaciji (Chen i saradnici, Gastro-enterology 87:1332-1338,1984; i Roddy, i saradnici, Regul Pept 18:201-212,1987). Jedan od tih oblika, PYY3_36, je izolovan iz mukoznih ekstrakta kolona ljudi (Eberlein i saradnici, Peptids 10:797-803,1989) i nađeno je daje predominantan oblik PYY u humanoj postprandijalnoj plazmi (Grandt i saradnici, Regul. Pept. 51:151-159, 1994). Objavljeno je daje PYY3.36

selektivni agonist visokog afiniteta za NPY Y2 receptor (Y2R) (Keire i saradnici, Am. J.

Phvsiol. Gasrointest. Liver Phvsiol. 279:G126-G131, 2000). Objavljeno je da periferna primena PYY3.36značajno smanjuje uzimanje hrane i dobitak na težini kod pacova, smanjuje apetit i unos hrane kod ljudi i smanjuje unos hrane kod miševa ali ne kod miševa bez Y2R, što ukazuje daje za efekat unosa hrane potreban Y2R. U studijama na ljudima, nađeno je da infuzija PYY3_36značajno smanjuje apetit i smanjuje unos hrane za 33% u toku 24 sata. Infuzija PYY3-36u toku 15 minuta dostiže normalnu postprandijalnu cirkulatomu koncentraciju peptida što dovodi do postizanja pika PYY3_36vrednosti u serumu, a nakon toga brzo opadanje na osnovne vrednosti u toku 30 minuta. Zabeleženo je daje došlo do značajne inhibicije unosa hrane u periodu od 12-

sati nakon PYY3_36infuzije, ali u osnovi nije bilo efekta na unos hrane u periodu od 12-sati do 24-sata. U ispitivanju pacova, ponovljena primena PYY3.3g IP (injekcije dva puta dnevno u toku 7 dana) je kumulativno smanjila unos hrane (Batterham, i saradnici, Nature 418:650-654, 2002).

[0009] Lekovi na bazi polipeptida su često kovalentno vezani za polimere kao što su polietilen glikoli kako bi se produžio njihov polu-životin vivo.Međutim, to često dovodi do drastičnog gubitka biološke i farmakološke aktivnosti (Shechter i saradnici, FEBS Letters 579:2439-2444, 2005; Fuerteges i Abuchovvski, J. Control Release 11:139-148, 1990; Katre, Adv. Drug Del. Sys. 10:91-114, 1993; Bailon i Berthold, Pharm. Sci. Technol. Today 1:352-356, 1996; Nucci i saradnici, Adv. Drug Delivery Rev. 6, 1991; Delgado i saradnici, Critical Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9:249-304, 1992; Fung i saradnici, Polym. Preprints 38:565-566,1997; Reddy, Ann. Pharmacother. 34:915-923, 2000; Veronese, Biomaterials 22:405-417,2001). Na primer, Shechter i saradnici,supra,su objavili da 40 kD pegilacija PYY3-36 standardnim hemijskim - - - - postupcima, preko formiranja stabilne veže (40 kĐ PEG-PYY3.3ć), dovodi do njegove.potpune inaktivacije u studijama unosa hrane sa miševima (s.c. injekcija). Međutim, takođe su objavili da reverzibilna pegilacija PYY3o6 (40 kD PEG-FMS-PYY3_36) ima za rezultat osam puta povećan funkcionalni polu-život (24 sata u odnosu na 3 sata). Videti takođc PCT patentne prijave broj WO 2004/089279 i WO 03/026591.

Kratak sadržaj pronalaska

[0010] Ovaj pronalazak se odnosi na agoniste PYY koji su varijante hPYY3.36-

[0011] U jednom aspektu ovog pronalaska, agonist PYY je varijanta humanog PYY3.36u kome

je ostatak 10 (glutamatna kiselina) ili ostatak 11 (aspartatna kiselina) zamenjeni sa cisteinom koji ima funkcionalnost koja je konjuktabilna sa hidrofilnim polimerom kao stoje polietilen glikol

(PEG).

[0012] Stoga su odgovarajuće varijante (E10C)PYY3-36i (Dl 1C)PVV3.36.

[0013] U preferiranom aspektu pronalaska, agonist PYY je polipeptid (E10C)hPYY3.36, koji ima sekvencu amino kiseline IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID NO:3], ili njene farmaceutski prihvatljive soli.

[0014] U još jednom preferiranom aspektu, agonist PYYje polipeptid (Dl lC)hPYY3.36 koji ima sekvencu amino kiseline IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID NO:4], ili njene farmaceutski prihvatljive soli.

[0015] Najpoželjnije, agonist je (E10C)hPYY3.36.

[0016] Agonist PYY iz pronalaska je preferirano konjugovan sa hidrofilnim polimerom, preferirano sa PEG. Agonist je preferirano monopegilovan, to jest, odnos agonista i PEG je približno 1:1, koji je vezan za odgovarajuću funkcionalnu grupu.

[0017] PEG može da bude ravan, račvast ili viseći; još poželjnije, ravan ili račvast; a

najpoželjnije, ravan.

[0018] U ravnim PEG-ovima, jedan završetak PEG je zatvoren grupom koja je inertna pod uslovima udvajanja PEG-a sa agonistom, na primer, etarska grupa, preferirano metoksi grupa. PEG-ovi sa ovakvim završetkom (sa metoksi grupom) se često označavaju kao mPEG-ovi. Drugi kraj je aktiviran za udvajanje sa agonistom PYY. Slično tome, sa račvastim PEG-ovima korisnim u ovom pronalasku, svi završetci osim jednog su zatvoreni etarskom grupom, a završetak koji nije zatvoren etarskom grupom je aktiviran za udvajanje. U jednom aspektu, krajevi PEG-a koji nisu zatvoreni etarskom grupom su završeni sa vezujućim radikalom ("L") koji povezuje PEG sa funkcionalnom grupom reaktivnom sa odgovarajućom funkcionalnom grupom amino kiseline cisteina, čime se stvara konjugat koji ima PEG kovalentno vezan za njegovu odgovarajuću funkcionalnu grupu.. U još jednom aspektu, PEG je direktno vezan ža reaktivnu grupu, bez uključivanja vezujućeg radikala. Ovakvi PEG-ovi se često nazivaju PEG-ovi "bez linkera".

[0019]Za (E10C)hPYY3.36i (Dl lC)hPYY3.36 polipeptide, završetak PEG-a koji nije zatvoren etarskom grupom je preferirano vezan za linker koji vezuje PEG za maleimidnu ili drugu grupu koja reaguje sa tiol grupom cistein ostatka da se nagradi konjugat koji ima PEG kovalentno vezan za tiol grupu cisteina. U pogodne reaktivne PEG-ove za upotrebu sa (E10C)hPYY3-36ili (Dl 1C)PYY3.36 spadaju PEG-ovi formula

mPEG-S02CH=CH2, mPEG-HN-COCH2I i

[0020]Preferirano, PEG je prethodno opisani mPEG maleimid koji uključuje linker radikal -L-. PEG maleimidi bez linkera su takođe pogodni za upotrebu u ovom pronalasku, posebno sa (E10C)hPYY3-36ili (Dl 1C)PYY3.36- Ovakvi PEG maleimidi bez linkera mogu da se izrade kako je opisano u Goodson i Katre, Bio/Technology 8:343-346,1990.

[0021]Konjugati dobijeni udvajanjem (E10C)hPYY3.36ili (Dl 1C)PYY3.36 polipeptida sa prethodno pokazanim mPEG-ovima su opisani u narednim formulama, pri čemu je -SR (E10C)hPYY3O6ili (Dl 1C)PYY3.36 polipeptid u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina:

mPEG-S02CH2CH2SR, V .

mPEG-HN-COCH2SR i mPEG-S-SR.

[0022] Linker -L- ima jedinu funkciju da omogući vezivanje PEG-a za reaktivnu funkcionalnu grupu i stoga nije posebno ograničen, ali, preferirano, obuhvata alkilen grupu koja ima estarsku vezu, uretansku vezu, amidnu vezu, etarsku vezu, karbonatnu vezu ili sekundarnu amino grupu.

[0023] U preferiranom aspektu, posebno za ravne PEG-ove, linker je grupa formule

-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r-

u kojoj je p ceo broj od 1 do 6, preferirano, 1 do 3, još poželjnije 2 ili 3, a najpoželjnije 3, a r je ceo broj od 1 do 6, preferirano, 1 do 3, još poželjnije, 2 ili 3, a najpoželjnije, 2.

Preferirani linker je -CH2CH2CH2NHCOCH2CH2- grupa.

[0024] U još jednom preferiranom aspektu, posebno za račvaste PEG-ove, linker je grupa formule

-NHC(0)(CH2)s-

u kojoj je s ceo broj od 1 do 6, preferirano, 1 do 3, još poželjnije, 2 ili 3, najpoželjnije, 2. Preferirani linker je -NHC(0)CH2CH2- grupa.

[0025] PEG može da bude ravan ili neravan, na primer, račvast ili viseći. Preferirano, PEG je ravan ili račvast, preferirano, ravan ili račvast mPEG maleimid. Glicerol-račvasti mPEG maleimid je preferirani ravčasti PEG. Preferirano, PEG je ravan mPEG maleimid. PEG bi trebalo da ima prosečnu molekulsku težinu u rasponu od približno 1 kD do približno 50 kD. Preferirano, prosečna molekulska težina je u rasponu od približno 5 kD do približno 45 kD; još poželjnije, približno 10-12 kD do približno 40-45 kD, ili približno 20 kD do približno 40-45 kD. Od posebnog interesa je ravan mPEG, kako je pokazano u Formuli 1, koji ima prosečnu molekulsku težinu od približno 20 kD ili približno 30 kD. Glicerol-račvasti mPEG Formule 2 je takođe od interesa i, preferirano, ima prosečnu molekulsku težinu od približno 20 kD ili približno 43 kD.

[0026] Preferirani PEG-ovi, odgovarajuće aktivirani za konjugaciju sa tiol grupom cisteina iz

(E10C)hPYY3-36ih (D11 C)PYY3.36, su jedinjenja Formula 1 i 2. U ravnom mPEG-u Formule 1, nje ceo broj u rasponu od približno 175 do 800; preferirano, približno 375 do 525 ili približno 600 do 750, ili približno 425 do 475 ili približno 650 do 700, ili približno 437 do 463 ili 675 do 700. U glicerol-račvastom mPEG-u Formule 2, svaki m je aproksimativno isti i predstavlja ceo broj u rasponu od približno 150 do 500; preferirano, približno 160 do 285 ili približno 400 do 525. ili približno 200 do 250 ili 450 do 500. a

[0027]Veliki broj različitih PEG-ova, odgovarajuće aktiviranih za konjugaciju sa ciljanim funkcionalnim grupama u bočnom lancu peptida amino kiselina, na primer, sa keto, tiol, hidroksil, karboksil ili slobodnim amino funkcionalnim grupama, su komercijalno raspoloživi od brojnih dobavljača, na primer, od NOF Corporation, Tokyo, Japan, ili Nektar Therapeutics Corporation, Huntsville, AL.

[0028] Još jedan aspekt ovog pronalaska se odnosi na konjugate prisutnih PYY3.36varijanti i polietilen glikola.

[0029] U jednom aspektu, konjugat je jedinjenje Formule 3 gde je mPEG radikal ravan ili račvast i ima prosečnu molekulsku težinu u rasponu od približno 1 kD do 50 kD, preferirano, 5 kD do približno 45 kD, još poželjnije, približno 10 kD ili 12 kD do približno 40 ili 45 kD, ili približno 20 kD do približno 40 kD ili 45 kD, L je grupa formule

-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r

u kojoj je p ceo broj od 1 do 6; preferirano, 1 do 3; još poželjnije, 2 ili 3; najpoželjnije, 3; (kako je opisano u niže datoj Formuli 4); a r je ceo broj od 1 do 6; preferirano, 1 do 3; još poželjnije, 2 ili 3, najpoželjnije, 2; ili je L grupa formule

-NHC(0)(CH2)s-

u kojoj je s ceo broj od 1 do 6; preferirano, 1 do 3; još poželjnije, 2 ili 3; najpoželjnije 2; a -SR je polipeptid (E10C)hPVV3-36ili (Dl lC)hPYY3_36 u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina.

[0030] Preferirani aspekt pronalaska je linearni konjugat mPEG-PYY3-36varijante Formule 4

gde je n ceo broj u rasponu od približno 175 do 800; preferirano, približno 375 do 525 ili. _. približno 600 do .750, ili približno 437 do 463 ili približno 675 do 700; a -SR je polipeptid (E10C)hPVV3-36 ili (Dl 1C)1iPYY3.36 u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina; ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Preferirano, (CH2CH20)„ radikal ima prosečnu molekulsku težinu

od približno 20 kD ili 30 kD. Konjugat u kome je -SR polipeptid (E10C)hPYY3.36je od posebnog interesa.

[0031]Naredni aspekt pronalaska se odnosi na konjugate u kojima je PEG radikal račvast. Preferirani konjugati u ovoj kategoriji uključuju glicerol-račvasti PEG radikal. Od posebnog interesa je konjugat Formule 5

u kome je svaki m aproksimativno isti i predstavlja ceo broj u rasponu od približno 150 do 550; preferirano, približno 160 do 285 ili približno 400 do 525, ili približno 200 do 250 ili približno 450 do 500, a -SR je (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Preferirano, svaki (CH2CH20)mradikal ima prosečnu molekulsku težinu u rasponu od približno 9-11 kD ili približno 20-22 kD. Preferirano, kombinovana prosečna molekulska težina (CH2CH20)mradikala je približno 20 kD ili približno 43 kD. Od posebnog interesa je konjugat u kome je -SR polipeptid (E10C)hPYY3-36-[0032]Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid koji sadrži sekvencu amino kiseline kako je pokazano u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4. U jednom otelotvorenju ovog aspekta pronalaska, polipeptid je pegilovani cistein ostatak.

[0033]Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotidne sekvence koje enkodiraju polipeptidne sekvence iz pronalaska, preferirano, enkodiraju SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.

[0034]U još jednom aspektu pronalaska, dataje farmaceutska kompozicija koja uključuje agonist PYY iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U još jednom aspektu, kompozicija takođe uključuje najmanje jedno dodatno farmaceutsko sredstvo, koje može da bude sredstvo korisno u tretmanu primarnerindikacije za kompoziciju ili u slučajevima pratećih stanja primarne indikacijerDodatno farmaceutsko sredstvo je preferirano sredstvo protiv gojaznosti. Kompozicija preferirano uključuje terapeutski efektivnu količinu agonista PYY iz pronalaska ili terapeutski efektivnu količinu kombinacije agonista PYY iz pronalaska i dodatnog farmaceutskog sredstva.

[0035] Takođe je data upotreba prisutnih jedinjenja u izradi medikamenta koji se koristi u

postupku za tretiranje bolesti, stanja ili poremećaja kod sisara moduliranih sa agonistom Y2R,

koji uključuje perifernu primenu na sisani kome je takav tretman potreban terapeutski efektivne količine agonista PYY iz pronalaska. Agonist PYY iz pronalaska može da se koristi sam ili u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim farmaceutskim sredstvom koje je korisno u tretmanu bolesti, stanja ili poremećaja ili pratećih bolesti, stanja ili poremećaja. Bolesti, stanja ili poremećaji koje modulira agonist Y2R kod sisara obuhvataju gojaznost i prekomernu telesnu težinu. Prateći poremećaji ovakvih bolesti, stanja ili poremećaja bi mogli da se poboljšaju tretmanom ovih bolesti, stanja ili poremećaja. Dalje je data upotreba ovih jedinjenja u izradi medikamenta za upotrebu u postupku lečenja gojaznosti kod sisara kojima je potreban ovakav tretman, koji uključuje perifernu primenu na sisarima terapeutski efektivne količine agonista PYY iz ovog pronalaska.

[0036] Takođe je obezbeđen postupak za redukovanje težine ili za podsticanje gubitka težine (uključujući sprečavanje ili inhibiciju povećanja težine) kod sisara, koji uključuje perifernu primenu na sisarima količine agonista PYY iz ovog pronalaska za kontrolu težine ili za smanjenje težine.

[0037] Takođe je dat postupak za smanjenje unošenja hrane kod sisara, koji uključuje perifernu primenu na sisaru agonista PYY iz ovog pronalaska u količini koja smanjuje unošenje hrane.

[0038] Takođe je dat postupak za indukciju osećaja sitosti kod sisara, koji uključuje perifernu primenu na sisaru agonista PYY iz pronalaska, u količini koja indukuje osećaj sitosti.

[0039] Takođe je dat postupak za smanjenje unošenja kalorija kod sisara, koji uključuje

perifernu primenu na sisaru agonista PYY iz pronalaska u količini koja smanjuje unošenje kalorija. Agonist PYY može da se primeni sam ili u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim farmaceutskim sredstvom, preferirano sredstvom protiv gojaznosti.

[0040] U svakom od ovde opisanih postupaka i u dodatnim patentnim zahtevima, agonist PYY može da se primeni sam ili u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim farmaceutskim sredstvom, preferirano sredstvom protiv gojaznosti.

[0041] Prisutni agonisti PYY i kompozicije koje ih sadrže su takođe korisni u proizvodnji medikamenta za ovde pomenute terapeutske aplikacije.

Definicije i skraćenice

[0042] Izraz "farmaceutski prihvatljiv" označava da supstanca ili kompozicija mora da bude hemijski i/ili toksikološki kompatibilna ili sa drugim sastojcima koji sačinjavaju formulaciju i/ili sa sisarom koji se tretira sa njom.

[0043] Naziv" agonist PYY " označava bilo koje jedinjenje koje utiče na jedan ili više efekata izazvanih sa hPYY3.36,in vivoiliin vitro.

[0044] Izraz "terapeutski efektivna količina" označava količinu agonista PYY iz ovog pronalaska koja smanjuje unos kalorija, smanjuje telesnu težinu i/ili smanjuje masno tkivo organizma u odnosu na odgovarajuće kontrolne vrednosti određene pre tretmana ili sa grupom tretiranom vehikulumom.

[0045] Naziv "sisar" označava ljude kao i sve druge toplokrvne članove životinjskog carstva koji poseduju homeostatski mehanizam u klasi sisara, na primer, sisari kućni ljubimci, sisari divlje životinje i sisari domaće životinje. Neki primeri sisara kućnih ljubimaca su kanini (na primer, psi), feline (na primer, mačke) i konji; neki primeri sisara koji služe za ishranu su svinje, goveda, ovce i slično. Preferirano, sisari su ljudi ili domaće životinje. Najpoželjnije, sisari su ljudi, muškarci ili žene.

[0046] Nazivi "tretiranje", "lečenje" ili "tretman" obuhvataju i preventivni, to jest, profilaktički, i palijativni tretman.

[0047] Naziv "periferna primena" označava primenu izvan centralnog nervnog sistema. Periferna primena ne obuhvata direktnu primenu na mozak. Periferna primena obuhvata, ali bez ograničenja na, intravaskularnu, intramuskularnu, subkutanu, inhalacionu, oralnu, sublingvalnu, enteralnu, rektalnu, transdermalnu ili intra-nazalnu primenu.

[0048] Naziv "humani PYY" ili "hPYY" označava 36-amino kiselina na čijem je C-završetku ubačen polipeptid koji ima sledeću sekvencu amino kiselina:

YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEC ID NO:l]

[0049] Naziv "hPYY3-36<M>označava 34-mer sa hPYY na C-završetku koji ima sledeću sekvencu amino kiselina: IK-PEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID NO:2]

[0050] Naziv "(E10C)hPYY3.36" označava 34-mer hPYY sa C-završetkom u kome je ostatak 10 glutamatne kiseline u hPYY zamenjen sa cistein ostatkom i koji ima sledeću sekvencu amino kiseline: IKPEAPGCDASPEELNRYYASL-RHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID NO:3j. [0051 ] Naziv "(D11 C)hPYY3.36" označava 34-mer hPYY sa C-završetkom u kome je ostatak 11 aspartatne kiseline u hPYY zamenjen sa cistein ostatkom i koji ima sledeću sekvencu amino kiseline: IKPEAPGECASPEELNRYYASL-RHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID NO:4]. _

Kratak opis crteža

[0052] Slika 1 je reverzno fazna HPLC koja beleži prečišćavanje (E10C)hPYY3-36peptida naZorbax Eclipse XDB-C8 koloni.

Slika 2 je veličina inhibicije HPLC koja beleži linearni 30KmPEG maleimid plus (E10C)hPYY3.36, reaktivne mešavine na Shodex 804 SEC koloni.

Slika 3 je fotografija SDS PAGE frakcija od SP Hitrap prečišćavanja linearnog 30K mPEG maleimid (E10C)hPYY3_36- MW= standardne molekulske težine; L= punjenje kolone; FT= protok; 4-23 = frakcije eluacije.

Slika 4 je reverzno fazna HPLC koja beleži prečišćavanje (D11 C)hPYY3_36 peptida na Zorbax Eclipse XDB-C8 koloni.

Slika 5 je veličina inhibicije HPLC koja beleži linearni 30KmPEG maleimid plus (Dl lC)hPYY3.36, reaktivne mešavine na Shodex 804 SEC koloni.

Slika 6 je veličina inhibicije HPLC koja beleži iskazivanje profila eluacije prečišćenog linearnog 30K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36produkta na Shodex 804 SEC koloni.

Slika 7 je veličina inhibicije HPLC koja beleži iskazivanje profila eluacije prečišćenog linearnog 30K mPEG maleimid (Dl lC)hPYY3.36 produkta na Shodex 804 SEC koloni.

Slika 8 je je veličina inhibicije HPLC koja beleži glicerol-račvasti 43K mPEG maleimid plus (E10C)hPYY3-36 reaktivne mešavine na Shodex 804 SEC koloni.

Slika 9 je veličina inhibicije HPLC koja beleži iskazivanje profila eluacije prečišćenog glicerol - račvastog 43K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36produkta na Shodex 804 SEC koloni.

Slika 10 je grafik inhibicije kumulativnog unošenja hrane kod miševa koji gladuju, nakon intraperitonealne (IP) injekcije.

Slika 10A pokazuje efekat doze nativnog PYY3.36u poređenju sa grupom sa vehikulumom. Slika 10B pokazuje efekat doze linearnog 30K mPEG maleimid (E10C)hPVV3.36-

Slika 11 pokazuje efekat IP injekcije glicerol-račvastog 43K mPEG maleimid (E10C)PYY3.36na unošenje hrane kod miševa koji gladuju u poređenju sa vehikulumom i linearnim 30K mPEG maleimid (E10C)PYY3-36. Slika 11A je grafički prikaz koji pokazuje odgovor u toku 6 sati nakon injekcije. Slika 11B je grafički prikaz koji upoređuje efekte u toku 24 sata nakon injekcije.

Slika 12 pokazuje efekte IP injekcije vehikuluma, PYY3-36i linearnog 30K mPEG maleimid (E10C)PYY3-36na spontano hranjene miševe. Slika 12A pokazuje efekat na unošenje hrane, a Slika 12B pokazuje efekat na telesnu težinu.

Slika 13 pokazuje efekte subkutane (SC) injekcije vehikuluma, PYY3-36i linearnog 30K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36na spontano hranjene miševe. Slika 13A pokazuje efekat na unošenje hrane, a Slika 13B, pokazuje efekat-.naJ:elesnu težinu. 1

Slika 14 pokazuje izloženost plazme na!PYY kod miševa nakon IP injekcije od 0.1 mg/kg. Slika 14A pokazuje vrednosti PYY u plazmi nakon injekcije hPYY3-36a Slika 14B pokazuje vrednosti PYY u plazmi nakon injekcije linearnog 30K mPEG maleimid (E10C)hPYY3_36.

Slika 15 je grafik krivih kao odgovora na koncentraciju za PYY3.36ili linearni 30K mPEG maleimid (E10C)PVV3.36dobijen od Scintillation Proximity Assay (SPA), gde ligandi konkurišu sa I-PYY1.36 za vezivanje za Y2R koji se pojavljuje na KAN-TS ćelijama.

Slika 16 je grafik krivih kao odgovora na koncentrciju za PYY3-36ili linearni 30K mPEG maleimid (E10C)PYY3-36dobijen iz ispitivanja vezivanja GTPgama[<35>S] sa Y2R, koji se pojavljuju na KAN-TS membranama.

Detaljan opis pronalaska

[0053JOvaj pronalazak se odnosi na agoniste PYY koji su varijante hPYY3_36i njihove pegilirane konjugate, koji mogu da imaju najmanje jednu poboljšanu hemijsku ili fiziološku osobinu izabranu od, ali bez ograničenja na, smanjene brzine klirensa, povećane dužine prisustva u plazmi, prolongirane aktivnostiin vivo,povećane potencije, povećane stabilnosti, poboljšane rastvorljivosti i smanjene antigeničnosti.

[0054]Preferirana PYY3-36varijanta iz pronalaska je (E10C)hPYY3-36. Naredna preferirana varijanta je (Dl lC)hPYY3-36. Ove varijante iz pronalaska mogu da se izrade sintetički i rekombinantno i drugim načinima, kako je opisano u daljem tekstu i ovde datim Primerima ili analognim postupcima.

Sintetička izrada

[0055] PYY3.36 varijante iz ovog pronalaska, na primer, (E10C)hPYY3.36i (Dl lC)hPYY3.36, mogu da se izrade standardnim tehnikama sinteze peptida koje su poznate u tehnici, na primer, sintezom čvrste faze peptida izvršenom sa automatskim sintisajzerom peptida (na primer, model 433A; Applied Biosystems, Foster City, CA) koristeći tBoc ili Fmoc hemijska sredstva. Kratak opis velikog broja tehnika sinnteze peptida koje su raspoložive, mogu da se nađu u Solid Phase Peptid Synthesis, drugo izdanje. (Stevvart, J.M. i Young, J.D., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984). Videti takođe knjigu Solid-phase Organic Synthesis (Burgess, K., John Wiley & Sons, New York, NY, 2000) i članak Engels i saradnici, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716- 34, 1989. Sve ove navedene reference su ovde inkorporirane kao reference.

[0056]PYY3-36varijante iz pronalaska su preferirano konjugovane sa PEG. Reakcije konjugacije, odnosno reakcije pegilacije, u prošlosti su se izvodile u rastvoru ša molarnim viškom polimera'i bez obzira gde će se polimer vezati za protein. Međutim, ovakve~opste tehnike su se pokazale kao neadekvatne za konjugaciju bioaktivnih proteina za ne-antigenične polimere uz zadržavanje dovoljne bioaktivnosti. Jedan način zadržavanja bioaktivnosti agonista PYY3-36varijante nakon pegilacije je da se u znatnoj meri izbegne, u procesu udvajanja, konjugacija bilo koje reaktivne grupe varijante koja je u vezi sa vezivanjem agonista za ciljani receptor. Aspekt ovog pronalaska je da obezbedi proces konjugacije polietilen glikola sa agonistom PYY3-36varijante iz pronalaska na specifičnim reaktivnim položajima koji nisu u velikoj meri umešani sa položajem(ima) vezivanja receptora, kako bi se zadržao visok nivo aktivnosti. Nareni aspekt ovog pronalaska je ubacivanje reaktivnih ostataka u PYY3-36da se obezbedi agonist njegovih varijanti za konjugaciju sa polietilen glikolom uz ograničeno remećenje aktivnosti.

[0057] Hemijska modifikacija preko kovalentne veze može da se izvrši pod bilo kojim pogodnim uslovima generalno prihvaćenim u reakciji konjugacije biološki aktivne supstance sa aktivranim PEG. Reakcija konjugacije se izvodi pod relativno blagim uslovima kako bi se izbegla inaktivacija agonista PYY3_36varijante. Blagi uslovi uključuju održavanje pH reaktivnog rastvora u rasponu od približno 3 do 10 i reaktivnu temperaturu u rasponu od približno 0° to 40°C. Ne-ciljane funkcionalne grupe u PYY3-36varijantama koje su reaktivne sa aktiviranim PEG pod uslovima pegilacije, se preferirano zaštite sa odgovarajućom zaštitnom grupom koja se lako uklanja nakon pegilacije na ciljanoj funkcionalnoj grupi. U procesu pegilacije slobodnih amino grupa sa reagensima kao što su PEG aldehidi ili PEG sukcinimidi, obično se održava pH u rasponu od približno 3 do 10, preferirano približno 4 do 7.5. Reakcija udvajanja se preferirano izvodi u odgovarajućem puferu (pH 3 do 10), na primer, fosfata, MES, citrata, acetata, sukcinata ili HEPES, u toku približno 1 do 48 sati, na temperaturi u rasponu od približno 4° do 40°C. U procesima pegilacije tiolne grupe u kojima se koriste reagensi kao što su PEG maleimidi, PEG vinil sulfoni ili PEG ortopiridil disulfidi, preferirano se održava pH u rasponu od približno 4 do 8. PEG amini su pogodni u pegilaciji keto grupa, na primer, kod p-acetilfenilalanina i mogu da se izrade kako su opisali Pillai i saradnici, J. Org. Chem. 45:5364-5370,1980.

[0058]Reakcijama konjugacije iz ovog pronalaska se obično dobijaju reaktivne mešavine ili

grupe koje sadrže željenu mono-pegiliranu PYY3_36varijantu kao i neželjenu PYY3.36varijantu peptida, neizreagovani PEG i obično manje od približno 20% vrste PEG-a sa velikom molekulskom težinom, koji mogu da obuhvate konjugate koji sadrže više od jedne niti PEG i/ili agregatne vrste. Nakon uklanjanja neizreagovanih vrsta i vrsta sa velikom molekulskom težinom, izdvoje se kompozicije koje sadrže primarno mono pegilirane PYY3-36varijante. Uzimajući u obzir da konjugati uglavnom uključuju nit jednog polimera, konjugati su u najvećoj meri homologni. - .... - ;

[0059]Željeni konjugat PEG-PYYa-36 varijante.može da.se prečisti iz reaktivne mešavine uobičajenim postupcima koji se obično koriste za prečišćavanje proteina, kao što su dijaliza, izdvajanje soli, ultrafiltracija, hromatografija jonskom izmenom, hidrofobna interaktivna hromatografija (HIC), hromatografij a na silika gelu i elektroforeza. Hromatografij a jonskim izmenjivačima je posebno efikasna u uklanjanju bilo kog neizreagovanog PEG-a ili neizreagovane PYY3_36varijante. Razdvajanje željenog konjugata PEG-varijanti može da se izvede stavljanjem reaktivne mešavine, koja sadrži izmešane vrste, u rastvor pufera koji ima pH od približno 4 do približno 10, preferirano ispod 8, kako bi se izbegla deamidacija. Rastvor pufera preferirano sadrži jednu ili više pufernih soli izabranih od, ali bez ograničenja na, KCI, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04i CH3C02Na.

[0060] Ukoliko se u reakciji pegilacije koristi drugačiji puferni sistem od pufera koji je korišćen

u procesu razdvajanja, pegilacija reaktivne mešavine se vrši sa puferom koji je izmenjen/dijafiltriran ili je razblažen sa dovoljnom količinom pufera za započinjanje razdvajanja.

[0061] Podela konjugata u grupe koje sadrže željene vrste se preferirano izvodi koristeći

medijum za hromatografij u jonskim izmenjivačem. Ovakav medijum je sposoban da selektivno vezuje konjugate PEG-PYY3-36varijante preko razlika u naelektrisanju, koje varira na neki predvidljiv način. Na primer, površina naelektrisanja PYY3-36varijante se određuje pomoću broja raspoloživih naelektrisanih grupa na površini peptida koje su sposobne za interakciju sa osnovnom kolonom u kojoj nema prisustva PEG-a. Ove naelektrisane grupe obično služe kao potencijalna tačka vezivanja PEG polimera. Stoga će konjugati PEG-PYY3-36varijanta imati različito naelektrisanje od drugih prisutnih vrsta, čime se omogućava selektivno izdvajanje.

[0062] Smole jonskih izmenjivača su posebno preferirane za prečišćavanje ovde datih konjugata PEG-PYY3.36varijante. Smole katjonskih izmenjivača, kao što su sulfopropil smole, se koriste u postupku prečišćavanja u ovom pronalasku. Ne-ograničavajuća lista smola katjonskih izmenjivača pogodnih za upotrebu u ovom pronalasku uključuje SP-hitrap®, SP Sepharose HP® i SP Sepharose® brzog protoka. Takođe mogu da se koriste druge pogodne smole katjonskih izmenjivača, na primer S i CM smole.

[0063] Smola katjonskog izmenjivača se preferirano pakuje u kolonu i uravnoteži uobičajenim načinima. Koristi se pufer koji ima isti pH i osmolitet kao i rastvor PEG-a koji konjuguje PYY3_36varijantu. Pufer za eluaciju preferirano sadrži jednu ili više soli izabranih od, ali bez ograničenja na, CH3C02Na, HEPES, KCI, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04i (NH4)2C03. Konjugat koji se nalazi u rastvoru se nakon toga adsorbuje na kolonu, sa neizreagovanim PEG i nekim vrstama velike molekulske težine koje se nisu zadržale. Nakon završetka punjenja, gradijent brzine pufera za eluaciju sa povećanom koncentracijom soli " se propusti kroz kolonu da eluira željenu frakciju konjugata PEG- PYY3-36varijanta. Eluirane, grupisane frakcije su preferirano ograničene na iste konjugate polimera nakon faze razdvajanja izmenom jona. Bilo koja vrsta ne konjugovane PYY3-36varijante može nakon toga da se ispere iz kolone uobičajenim tehnikama. Ukoliko se želi, vrste mono i višestruko pegiliranih PYY3-36varijanti i vrste sa velikom molekulskom težinom mogu dalje da se razdvoje jedni od drugih naknadnom hromatografij om jonskim izimenjivačem ili hromatografij om prema veličini.

[0064]Tehnike koje koriste višestruke izokratične faze povećanja koncentracije mogu da se koriste umesto linearnog gradijenta. Faze višestruke izokratične eluacije za povećanje koncentracije će za rezultat da imaju sekvencijalnu eluaciju konjugata multi-pegiliranih/nagomilanih, a nakon toga mono-pegiliranih PYY3-36varijanti. Takođe mogu da se koriste tehnike eluacije na bazi pH gradijenata. Raspon temperature za eluacije je generalno između približno 4°C i približno 25°C. Eluacija PEG-PYY3-36 varijanti se prati pomoću UV apsorpcije na 280 nm. Sakupljanje frakcija može da se postigne preko jednostavnih profila vremena eluacije.

Pojavljivanje rekombinante

Molekule nukleinske kiseline

[0065]Molekule nukleinske kiseline koje enkodiraju (E10C)hPYY3-36polipeptid mogu da uključe sledeće sekvence nukleinske kiseline (kod mutacije za supstituciju E10C nije podvučen):

[0066]Molekule nukleinske kiseline koje enkodiraju (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid mogu da uključe sledeće sekvence nukleinske kiseline (kod mutacije za supstituciju Dl 1C nije podvučen):

[0067]Ove sekvence mogu takođe da uključe kod stop (na primer, tga, taa, tag) na C-terminalnom završetku i mogu lako da se dobiju različitim putevima, uključujući, bez ograničenja, hemijske sinteze, genetsku mutaciju različitih tipova sekvenci hPYY poli-nukleotida dobijenih od cDNA ili pregledom genomičkih podataka, pregledom podataka pojavljivanja i/ili amplifikacijom cDNA reakcijom lanca polimeraze (PCR). Molekule nukleinske kiseline koje enkodiraju (E10C)hPYY3.36i (Dl lC)hPYY3.36 varijante mogu da se produkuju korišćenjem mutageneza usmerenih na određeno mesto, amplifikacijom PCR ili drugih odgovarajućih postupaka, gde prajmer(i) ima željenu tačku mutacije. Ovde opisani postupci rekombinantne DMA i postupci mutageneza su generalno oni koje su dali Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1989) i u Current Protocols in Molecular Biologv (Ausubel i saradnici, eds., Green Publishers Inc. i Wiley and Sons 1994). Ukoliko se želi daje neka druga sintetički dobijena amino kiselina supstituisana za E10 ili Dl 1, takav peptid može rekombinantno da se pojavi koristeći postupke koji su otkriveni, na primer, u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2005/0208536, ovde inkorporiranoj u referenci.

[0068] Polinukleotidi nukleinske kiseline koji enkodiraju sekvencu amino kiseline hPYYs mogu

da se identifikuju pojavom kloniranja koja uključuje detekciju pozitivnih klona na bazi osobina pojavljenog proteina. Uobičajeno, pregledaju se datoteke nukleinskih kiselina vezivanjem antitela ili drugog partnera vezivanja (na primer, receptor ili ligand) za proteine klona koji se nagomilavaju i pojavljuju na površini ćelija domaćina. Anatitelo ili vezujući partner se modifikuje obeležavanjem koje može da se detektuje kako bi se identifikovale one ćelije u kojima se pojavljuje željeni klon.

[0069] Tehnike pojavljivanja rekombinanta izvedene u skladu sa niže datim opisima mogu da se

koriste za produkciju (E10C)hPYY3.36 i (Dl lC)hPYY3.36 koji enkodiraju polinukleotide i za pojavu enkodiranih polipeptida. Na primer, ubacivanjem sekvence nukleinske kiseline koja enkodira sekvencu amino kiseline (E10C)hPYY3_36ili (Dl lC)hPYY3.36varijante u odgovarajući vektor, stručnjak sa iskustvom u tehnici može jednostavno da produkuje velike količine sekvence željenog nukleotida. Sekvence mogu nakon toga da se koriste za generisanje sondiranja detekcije ili amplifikacijuprajmera. Alternativno, polinukleotid koji enkodira sekvencu amino kiseline

(E10C)hPYY3.36,ili (D11 Ć)hP YY3.36 polipeptida može da se ubaci u pojavljeni vektor.

Uvođenjem pojavljenog vektora u odgovarajućeg domaćina enkodirana (E10C)hPYY3.36 ili (Dl !C)hPYY3-36:varijanta može da se produkuje u veiikim količinama.

[0070] Naredni postupak za dobijanje odgovarajuće sekvence amino kiseline je reakcija lanca polimeraze (PCR). U ovom postupku, cDNA se izradi od poli(A)+RNA ili ukupne RNA

koristeći enzim reverznu transkriptazu. Dva prajmera, obično komplementarna sa dva različita regiona cDNA koja enkodira sekvencu amino kiseline (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 varijante, se nakon toga dodaju u cDNA zajedno sa polimerazom, kao što je Taq polimeraza i polimeraza proširuje cDNA region između dva prajmera.

[0071] Naredni način za izradu molekule nukleinske kiseline koja enkodira sekvencu amino kiseline (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 varijante je hemijska sinteza pomoću postupaka koji su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici, kao što su opisali Engels i saradnici, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716- 34, 1989. Ovi postupci uključuju fosfotriestarski, fosforamiditni i H-fosfonatni postupak za sintezu nukleinske kiseline. Preferirani postupak za ovakvu hemijsku sintezu je sinteza podržana polimerom, koristeći standardna fosforamiditna hemijska jedinjenja. Uobičajeno, DNA koja enkodira sekvencu amino kiseline (E10C)hPYY3.36ima dužinu od približno sto nukleotida. Nukleinske kiseline duže od približno 100 nuklcotida mogu da se sintetišu u nekoliko fragmenata koristeći ove postupke. Fragmenti mogu nakon toga da se spoje zajedno da formiraju nukleotidnu sekvencu ukupne dužine (E10C)hPYY3.36gena.

[0072] DNA fragment koji enkodira amino završetak polipeptida može da ima ATG, koji

enkodira metionin ostatak. Ovaj metionin može da bude ili da ne bude prisutan u zrelom obliku (E10C)hPYY3.36ili (DIIC) LP443-36, u zavisnosti da lije peptid produkovan u matičnoj ćeliji konstruisan za sekreciju iz te ćelije. Kao početni položaj može takođe da se koristi kod koji enkodira izoleucin. Takođe mogu da se koriste i drugi postupci poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. U izvesnim aspektima, nukleinska kiselina varijanti sadrži kodone koji su izmenjeni za optimalno pojavljivanje (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36u datoj ćeliji domaćinu. Određene izmene kodona će zavisiti od (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 i ćelije domaćina izabrane za pojavljivanje. Ovakva "optimizacija kodona" može da se izvede različitim postupcima, na primer, selekcijom kodona koji su preferirani za upotrebu u genima koji se nalaze u velikom broju u datoj ćeliji domaćinu. Kompjuterski algoritmi koji inkorporiraju tabele frekvencije kodona, kao stoje "Eco_high.Cod" za kodone preferirane za pojavljivanje u velikom broju bakterijskih gena mogu da se koriste i mogu da se nabave od Universitv Wisconsin Package Version 9.0 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Druge korisne tabele frekvencije kodona obuhvataju "Celegans_ high.cod," "Celegans_low.cod," "Drosophila-high.cod," "Human-high.cod," "Maizejiigh.cod," i "Yeast_high.cod." . _.'

Vektori i ćelije domačni

[0073]Molekula nukleinske kiseline koja enkodira sekvencu amino kiseline (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36 je umetnuta u odgovarajući vektor pojavljivanja koristeći standardne tehnike ligacije. Vektor se obično bira tako da bude funkcionalan u određenim ćelijama domaćinima koje se koriste (to jest, vektor je kompatibilan sa mehanizmom ćelije domaćina tako da može da se izvrši amplifikacija gena i/ili pojavljivanje gena). Molekula nukleinske kiseline koja enkodira ekvencu amino kiseline (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3-36 može da se amplifikuje/pojavi u prokariotičnim ćelijama domaćina, kvascu, insektima (bakulovirus sistemu) i/ili eukariotičnim ćelijama domaćina. Za pregled vektora pojavljivanja, videti Meth. Enz, tom 185 (D. V. Goeddel, ed., Academic Press, 1990).

[0074]Uobičajeno, vektori pojavljivanja koji se koriste u bilo kojim ćelijama domaćina sadrže sekvence za podršku plazmidu i za kloniranje i pojavljivanje sekvenci egzogenih nukleotida. Ovakve sekvence, zbirno označene kao "bočne sekvence" u izvesnim aspektima obično obuhvatajujednu ili više od sledećih sekvenci nukleotida: promoter, jednu ili više sekvenci pojačivača, original replikacije, sekvencu transkriptivne terminacije, komplet intron sekvencu koja sadrži davaoca i primaoca na mestu spajanja, sekvencu koja enkodira vodeću sekvencu za izlučivanje polipeptida, položaj vezivanja ribozoma, sekvencu poliadenilacije, polilinker region za uključivanje nukleinske kiseline koja enkodira pojavljivanje polipeptida i selektivan marker element. Svaka od ovih sekvenci je diskutovana u daljem tekstu.

[0075]Opciono, vektor može da sadrži "tag" koji enkodira sekvencu, to jest, molekulu oligonukleotida koja se nalazi na 5' ili 3' kraju (E10C)hPYY3.36ili the (Dl lC)hPYY3-36 kodirane sekvence; sekvenca oligonukleotida enkodira poliHis (such as heksaHis), ili neki drugi "tag" kao što su FLAG, HA (hemaglutinin influenca virus), ili myc za koje postoje komercijalno raspoloživa antitela. Ovaj tag se obično spaja sa polipeptidom nakon pojave polipeptida i može da služi kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3-36 od ćelije domaćina. Afinitetno prečišćavanje može da se izvrši, na primer, hromatografij om na koloni koristeći kao matriks afiniteta antitela suprotna sa tag. Opciono, tag može skoro u potpunosti da se ukloni iz prečišćenog (E10C)hPYY3-36 ili (Dl lC)hPYY3_36 različitim načinima, kao što je korišćenje izvesnih peptidaza za cepanje, na primer, enterokinaze za asimilaciju 3' sekvence FLAG taga, koja je jedna od rastućih sekvenci amino kiseline kako je pokazano u SEQ ID NOs: 3-4.

[0076]Bočne sekvence mogu da budu homolozi (to jest, od istih vrsta i/ili sojeva kao osnovne ćeije), heterolozi (to jest, od vrsta koje-se razlikuju od vrsta ili sojeva ćelije domaćina), hibrid (to jest, kombinacija bočnih sekvenci iz više od jednog izvora) ili sintetičke, ili bočne sekvence mogu da budu prirodne sekvence koje normalno imaju ulogu u regulaciji pojavljivanja hPYY3.36-Izvor bočnih sekvenci može da bude bilo koji prokariotični ili eukariotični organizam, bilo koji organizam kičmenjaka ili bezkičmenjaka, ili bilo koja biljka, pod uslovom da bočna sekvenca može da funkcioniše u ili može da se aktivira mehanizmom ćelije domaćina.

[0077] Korisne bočne sekvence mogu da se dobiju bilo kojim od više postupaka koji su dobro poznati u tehnici. Uobičajeno, bočne sekvence koje su ovde korisne, za razliku od bočnih sekvenci PYY gena, moraju prethodno da se identifikuju preslikavanjem i/ili restrikcijom asimilacije endonukleaze i stoga mogu da se izoluju iz izvora odgovarajućeg tkiva koristeći odgovarajuću restrikciju endonukleaza. U nekim slučajevima, može da se zna potpuna sekvenca nukleotida bočne sekvence. Ovde, bočna sekvenca može da se sintetiše postupcima koji su ovde opisani za sintezu ili kloniranje nukleinske kiseline.

[0078] Kada je poznata cela ili samo deo bočne sekvence, ona može da se dobije koristeći PCR

i/ili pretraživanjem genomičnih podataka sa pogodnim oligonukleotidom i/ili koristeći fragment bočne sekvence od iste ili različitih vrsta. Kada bočna sekvenca nije poznata, fragment DNA koji sadrži bočnu sekvencu može da se izoluje od većeg dela DNA koji može da sadrži, na primer, kodiranu sekvencu ili čak drugi gen ili gene. Izolovanje može da se izvrši restrikcijom asimilacije endonukleaze da produkuje odgovarajući DNA fragment, a nakon toga izolovanjem koristeći prečišćavanje na agarnom gelu, hromatografij u na Qiagen® koloni (Chatsworth, CA) ili druge postupke poznate stručnjaku sa iskustvom. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će lako da izabere pogodne enzime za postizanje ovog cilja.

[0079] Original koji se replicira je obično deo onih prokariotičnih vektora pojavljivanja koji su nabavljeni komercijalno i original pomaže u amplifikaciji vektora u osnovnoj ćeliji.

Amplifikacija vektora u izvestan broj kopija može, u nekim slučajevima, da bude važna za optimalno pojavljivanje (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36. Ukoliko izbor vektora ne sadrži mesto replikacije originala, on može da bude hemijski sintetizovan na bazi poznate sekvence i povezan u vektor. Na primer, replikacija originala iz plazmida pBR322 (Ne\v England Biolabs, Beverlv, MA) je pogodna za većinu gram-negativnih bakterija, a različiti originali (na primer, SV40, polioma, adenovirus, vezikularni stomatitisni viru (VSV) ili papilomavirusi kao što su

HPV ili BPV) su korisni za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, komponenta replikacije originala nije potrebna za pojavljivanje vektora kod sisara (na primer, SV40 original se često koristi samo zbog toga što sadrži rani promoter).

[0080] Sekvenca terminacije transkripcije se obično nalazi na 3' završetku polipeptida koji kodira region i služi za transkripciju završetka. Obično, transkripcija sekvence završetka u :-- ;-■ prokariotičnim ćelijama je G-C bqgat fragment praćen, sa poli- T sekvencom;:Mada se sekvenca jednostavno klonira iz datoteke ili je čak komercijalno raspoloživa kao deo vektora, može takođe lako da se sintetiše postupcima za sintezu nukleinske kiseline, kao što su ovde opisani postupci.

[0081 ]Element izabranog marker gena enkodira protein neophodan za preživljavanje i rast ćelije domaćina koja raste u izabranom medijumu za kulturu. Uobičajeno izabrani marker geni enkodiraju proteine koji (a) su nosioci rezistencije na antibiotike ili druge toksine, na primer, ampicilin, tetraciklin ili kanamicin za prokariotične ćelije domaćina; (b) su komplementi auksotrofične deficijencije ćelije; ili (c) snabdevaju kritičnim hranljivim materijama koje nisu raspoložive iz kompleksa medijuma. Preferirani selektivni markeri su kanamicin rezistentni gen, ampilicilin rezistentni gen i tetraciklin rezitentni gen. Neomicin rezistentni gen može takođe da se koristi za selekciju u prokariotičnim i eukariotičnim osnovnim ćelijama.

[0082]Drugi izabrani geni mogu da se koriste za amplifikaciju gena koji će se pojaviti. Amplifikacija je proces u kome se geni za kojima postoji velika potreba u produkciji proteina kritičnih za rast, u tandemu ponavljaju unutar hromozoma postepenog generisanja rekombinatnih ćelija. Primeri pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara obuhvataju dihirofolat reduktazu (DHFR) i timidin kinazu. Transformisane ćelije sisara se podvrgnu izabranom pritisku pri čemu su samo transformanti potpuno adaptirani da prežive selekciju gena prisutnom u vektoru. Pritisak selekcije je određen uzgajanjem transformisanih ćelija pod uslovima u kojima se koncentracija izabranog sredstva u medijumu uspešno menja, i na taj način dovodi do amplifikacije i izabranog gena i DNA koja enkodira (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36. Kao rezultat, iz amplificirane DNA se sintetišu povećane količine (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36.

[0083]Mesto vezivanja ribozoma je obično neophodno za translaciju uvođenja mRNA i

karakteriše se Shine-Dalgarno sekvencom (prokarioti) ili Kozak sekvencom (eukarioti). Element se obično nalazi na položaju 3' za promoter i na položaju 5' za kodiranje sekvence (E10C)hPYY3.36ili (D11 C)hPYY3_36 koja će se pojaviti. Shine-Dalgarno sekvenca se menja ali je obično polipurin (to jest, ima visok A-G sadržaj). Identifikovan je veliki broj Shine-Dalgarno sekvenci,

od kojih svaka može lako da se sintetiše ovde navedenim postupcima i koriste se u prokariotičnom vektoru.

[0084] Vodeća, ili signalna sekvenca, može da se koristi za usmeravanje (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 izvan ćelije domaćina. Uobičajeno, sekvenca nukleotida koja enkodira signalnu sekvencu, se nalazi u kodirajućem regionu (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36 molekule nukleinske kiseline, ili direktno na 5' završetku (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36 kodirajućeg regiona. Identifikovan je veliki broj signalnih sekvenci i bilo koja od njih koja je funkcionalna u izabranoj osnovnoj ćeliji, može da se koristi u konjukciji sa (ElGC)hPYY3-36 ili (Dl lC)hPYY3.'36molekulom nukleinske kiseline. Na taj način, signalna sekvenca može da bude homologna ?-(prirodno dobijena) ili heterologna za (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36molekulu nukleinske kiseline. Dodatno, signalna sekvenca može hemijski da se sintetiše ovde opisanim postupcima. U većini slučajeva, sekrecija (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36 iz ćelije domaćina u prisustvu signalnog peptida će dovesti do uklanjanja signalnog peptida iz izlučenog (E10C)hPYY3_36ili (Dl lC)hPYY3-36. Signalna sekvenca može da bude komponenta vektora ili može da bude deo (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36 molekule nukleinske kiseline koja je uključena u vektor.

[0085] Sekvenca nukleotida koji enkodira nativnu signalnu sekvencu hPYY3.36može da se nalazi

u kodirajućem regionu (E10C)hPYY3_36ili (Dl lC)hPYY3.36 ili sekvenca nukleotida koja enkodira signalnu sekvencu heterologa može da se nalazi u kodirajućem regionu (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3-36. Izabrana heterologna signalna sekvenca treba da bude ona koja je prepoznatljiva i može da se izradi, to jest, može da se čepa peptidazom signala iz ćelije domaćina. Za prokariotične ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne stvaraju signalne sekvence nativnog hPYY, signalna sekvenca se supstituiše izabranom prokariotičnom signalnom sekvencom, na primer, iz grupe vodeće alkalne fosfataze, penicilaze, ili termo stabilnog enterotoksina II. Za sekreciju kvasca, signalna sekvenca nativnog hPYY može da se supstituiše vodećom kvasnom invertazom, alfa faktorom ili kiselom fosfatazom. U pojavljivanju ćelija sisara, nativna signalna sekvenca je zadovoljavajuća, mada mogu da budu pogodne i druge signalne sekvence sisara.

[0086] U mnogim slučajevima, transkripcija molekule nukleinske kiseline je povećana u prisustvu jednog ili više introna u vektoru, ovo je posebno tačno kada se polipeptid produkuje u eukariotičnim osnovnim ćelijama, posebno u osnovnim ćelijama sisara. Upotreba introna može prirodno da se dešava unutar hPYY gena, posebno kada je korišćeni gen genomična sekvenca potpune dužine ili njen fragment. Kada se intron ne stvara prirodno unutar gena, (kao kod većine cDNAs), intron može da se dobije iz drugog izvora. Položaj introna u odnosu na bočne sekvence i na hPYY gen je generalno važan, jer intron mora da bude transkriptovan kako bi bio efikasan. Prema tome, kada je (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 koji enkodira molekulu cDNA transkriptovan, preferirani položaj za intron je 3' za početni položaj transkripcije i 5' za poli-A transkripciju završetka sekvence. Preferirano, intron ili introni se nalaze na jednoj ili na drugoj strani (to jest, 5' ili 3') cDNA, tako da ne ometaju kodiranje sekvence. Može da se koristi bilo koji intron iz bilo kog izvora, uključujući viruse, prokariotične i eukariotične (biljne i životinjske) organizme, pod uslovom da su kompatibilni sa osnovnom ćelijom u koju se uključuju. Ovde su takođe obuhvaćeni i sintetički introni. Opciono, u vektoru može da se koristi više od jednog introna. - -

[0087] Pojavljeni i klonirani vektori obično sadrže promoter koji je prepoznatljiv za organizam domaćin i vektori kloniranja obično sadrže promoter koga prepoznaje organizam domaćin i operativno su vezani za molekulu koja enkodira (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3-36. Promoteri su netranskriptovane sekvence locirane iznad (to jest, 5') u odnosu na početni kodon strukturnog gena (generalno u okviru približno 100 do 1000 bp) koji kontroliše transkripciju strukturnog gena. Promoteri su uobičajeno grupisani u jednu ili dve klase: induktibilni promoteri i konstitutivni promoteri. Induktibilni promoteri iniciraju povećane vrednosti transkripcije iz DNA pod njihovom kontrolom kao odgovor na neke izmene u uslovima kulture, kao što je prisustvo ili odsustvo nutricijenta ili promena temperature. Konstitutivni promoteri, s druge strane, iniciraju kontinualnu produkciju produkta gena, to jest, postoji mala ili ne postoji nikakva kontrola pojavljivanja gena. Poznat je veliki broj promotera, prepoznatljivih od strane različitih potencijalnih ćelija domaćina. Odgovarajući promoter je operativno vezan za DNA koja enkodira (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 uklanjanjem promotera iz izvora DNA restriktivnom resorpcijom enzima i uključivanjem sekvence željenog promotera u vektor. Sekvenca nativnog hPYY3.36promotera može da se koristi za usmeravanje amplifikacije i/ili pojavljivanja (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36 molekule nukleinske kiseline. Međutim, preferiranje heterologni promoter, ukoliko dozvoljava veću transkripciju i veći prinos pojavljenog proteina u poređenju sa nativnim promoterom i ukoliko je kompatibilan sa sistemom ćelije domaćina koja je izabrana za upotrebu.

[0088] Promoteri pogodni za uptrebu sa prokariotičnim domaćinima uključuju beta-Iaktamaza i laktoza promoter sisteme;E. coliT7 induktibilnu RNA polimerazu; alkalnu fosfatazu; triptofan (trp) promoter sistem; i hibridne promotere kao što je tac promoter. Takođe su pogodni i drugi poznati bakterijski promoteri. Njihove sekvence su objavljene i stoga je stručnjaku sa iskustvom u tehnici omogućeno da ih veže za željenu DNA sekvencu, koristeći linkere ili adaptere prema potrebi, da se obezbedi bilo koji koristan restriktivni položaj.

[0089] Odgovarajući promoteri za upotrebu u kvascu kao domaćinu su takođe dobro poznati u tehnici. Prednost je kada se pojačivači kvasca koriste sa promoterima kvasca. Odgovarajući promoteri za upotrebu sa ćelijama domaćinima sisara su dobro poznati i obuhvataju, ali se ne ograničavaju samo na, one promotere koji su dobijeni od genom virusa, kao što su polioma virus, virus ptičijih boginja, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), papiloma virus goveda, sarkoma — virus ptica, citomegalovirus, retrovirusi, virus hepatitisa-B, a najpoželjnije od Simian Virus 40 (SV40). Drugi odgovarajući promoteri sisara obuhvataju heterologne promotere sisara, na primer, promoteri šoka od visoke temperature i aktin promoter.

[0090] Drugi promoteri koji mogu da budu od interesa u kontroli pojavljivanja (E10C)hPYY3-3.6ili (Dl lC)hPYY3^6obuhvataju, alrse ne ograničavaju samo na: prorri6tćt''pdčeth6g:regioha '' SV40 (Bemoist i Chambon, Nature 290:304-10, 1981); CMV promoter; promoter koji se nalazi u 3' dužeg završetka ponavljanja Rous virusa sarkoma (Yamamoto i saradnici, Cell 22: 787-97, 1980); promoter herpes timidin kinaze (Wagner i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45, 1981); regulatorne sekvence metalotionin gena (Brinster i saradnici, Nature 296:39-42, 1982); pojavljivanje prokariotičnih vektora kao stoje beta-laktamaza promoter (Villa-Kamaroff i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-31, 1978); ili tac promoter (DeBoer

i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25, 1983).

[0091]Pojačane sekvence mogu da budu uključene u vektor zbog povećanja transkripcije u veće eukariote DNA koja enkodira (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36- Pojačivači su cis-delujući elementi DNA, obično dužine približno 10-300 bp, koji deluju na promoter da poveća transkripciju. Pojačivači su relativno orijentisani i nezavisni od položaja. Nađeni su na 5' i 3' za transkripcionu jedinicu. Poznato je nekoliko sekvenci pojačivača raspoloživih od gena sisara (na primer, globin, elastaza, albumin, alfa- feto-protein i insulin). Uobičajeno se međutim koristi pojačivač iz virusa. SV40 pojačivač, promoter pojačivač ranog citomegalovirusa, polioma pojačivač i pojačivači adenovirusa su primeri koji pojačavaju elemente za aktivaciju eukariotičnih promotera. Mada pojačivač može da se ubaci u vektor na položaju 5' ili 3' na (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.3<5 koji enkodiraju molekulu nukleinske kiseline, obično se nalazi na položaju 5' promotera.

[0092]Vektori pojavljivanja mogu da se konstruišu od početnog vektora kao stoje komercijalno raspoloživi vektor. Ovakvi vektori mogu da sadrže ili da ne sadrže sve željene bočne sekvence. Kada jedna ili više od ovde opisanih bočnih sekvenci nije već prisutna u vektoru, mogu pojedinačno da se dobiju i vežu u vektor. Postupci koji se koriste za dobijanje svake od bočnih sekvenci su dobro poznati stručnjaku sa iskusvom u tehnici.

[0093]Preferirani su oni vektori koji su kompatibilni sa ćelijama domaćinima bakterija, insekata

i sisara. Ovakvi vektori obuhvataju, između ostalog, pCRII, pCR3, i pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, VVI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (CIontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alfa (PCT Prijava objavljena pod brojem WO 90/14363) i pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY).

[0094]U druge pogodne vektore spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, kozmidi, plazmidi ili modifikovani virusi, ali je jasno da sistem vektora mora da bude kompatibilan sa izabranom ćelijom domaćinom. U ovakve vektore spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, plazmidi kao što su Bluescript® derivati plazmida (veliki broj kopija ColEl na bazi. fagemida, Stratagene),-PCR- - - koji kloniraju plazmide koncipirani zakloniranje Taq-amplificirane PCR produkte:;(naprimer,:;,L TOPO® TA Cloning® Kit, PCR2.1® derivati plazmida, Invitrogen), i vektore sisara, kvasca ili

virusa kao što je bakulovirus sistem pojavljivanja (pBacPAK derivati plazmida, Clontech).

[0095]Nakon što je vektor konstruisan i molekula nukleinske kiseline koji enkodira

(E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3-36 polipeptid uneta na odgovarajuće mesto vektora,

kompletiran vektor može da se unese u odgovarajuću ćeliju domaćina za amplifikaciju i/ili pojavljivanje polipeptida. Transformacija vektora pojavljivanja za (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3_36 polipeptid u izabranu ćeliju domaćina može da se izvrši dobro poznatim postupcima, uključujući postupke kao što su transfekcija, infekcija, elektroporacija, mikroinjekciranje, lipofekcija, DEAE-dekstran postupak ili druge poznate tehnike. Izbor postupka delimično zavisi od tipa ćelije domaćina koja se koristi. Ovi postupci i drugi pogodni postupci su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici i navedeni su, na primer, u Sambrook i saradnici,kao prethodno.

[0096]Ćelije domaćini mogu da budu prokariotične ćelije domaćini (kao što jeE. coli)ili

eukariotične ćelije domaćini (kao što su ćelije kvasca, insekta ili kičmenjaka). Ćelija domaćin,

kada se zaseje pod odgovarajućim uslovima, sintetiše (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid koji nakon toga može da se sakupi iz medijuma za kulturu (ukoliko se ćelija domaćin izlučuje u medijum) ili direktno iz ćelije domaćina koja ga produkuje (ukoliko se ne izlučuje).

Izbor odgovarajuće ćelije domaćina će da zavisi od različitih faktora, kao što su željeni nivo pojavljivanja, modifikacije polipeptida koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što su glikozilacija ili fosforilacija) i lako slaganje u biološki aktivnu molekulu.

[0097]Brojne pogodne ćelije domaćini su poznate u tehnici i većinom su raspoložive od

American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va. Primeri obuhvataju, ali se ne ograničavaju samo na, ćelije sisara, kao što su ćelije ovarijuma Kineskog hrčka (CHO), CHO DHFR(-) ćelije (Urlaub i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:4216-20,1980), humane embrione ćelije bubrega (HEK) 293 ili 293T ćelije, ili 3T3 ćelije. Izbor odgovarajućih ćelija domaćina sisara i postupci za transformaciju, uzgajanje, amplifikaciju, pregled, produkciju produkta i prečišćavanje su poznati u tehnici. Druge pogodne ćelijske linije sisara su COS-1 i COS-7 ćelijske linije majmuna i CV-1 ćelijska linija. Drugi primeri ćelija domaćina sisara obuhvataju ćelijske linije primata i ćelijske linije glodara, uključujući transformisane ćelijske linije. Takođe su pogodne normalne diploidne ćelije, ćelijske vrste dobijene iz kulture primarnog tkivain vitro,kao i primarni eksplanti. Konkurentne ćelije mogu da budu genotipično deficijentne u selekciji gena ili mogu da sadrže dominantno delujući selektivni gen. Druge pogodne ćelijske linije sisara obuhvataju, ali se ne ograničavaju samo na, ćelije"neufoblastorrie"

•-N2A miševa; HeLa, L-929 ćelije miša; 3T3 linije dobijene^ bđ Šwišs,'Balb-ć ili NIH miša, BHK ili HaK ćelijske linije hrčka. Svaka od ovih ćelijskih linija je poznata i raspoloživa za stručnjaka -

sa iskustvom u tehnici pojavljivanja proteina.

[0098] Kao pogodne ćelije domaćini slično su korisne i bakterijske ćelije. Na primer, različiti

sojeviE.coli (na primer, HB101, DH5a, DH10 i MC1061) su dobro poznati kao ćelije domaćini u oblasti biotehnologije. Različiti sojeviB. subtilis, Pseudomonasspp., otherBacillusspp., iStreptomycesspp. mogu takođe da se koriste u ovom postupku.

[0099] Mnogi sojevi ćelija kvasca koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici su takođe raspoloživi kao ćelije domaćini za pojavljivanje (E10C)hPYY3_36i (Dl lC)hPYY3.36 polipeptida.

U preferirane ćelije kvasca spadaju, na primer,Saccharomyces cerivisaeiPichia pastoris.

[0100] Dodatno, kada se želi, sistemi ćelija insekata mogu da se koriste za pojavljivanje (E10C)hPYY3.36i (Dl lC)hPYY3.36. Ovakvi sistemi su opisani, na primer, od strane Kitts i saradnika, 1993, Biotechniques 14:810-17; Lucklovv, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-72,1993; i Lucklovv i saradnici, J. Virol., 67:4566-79, 1993. Preferirane ćelije su Sf-9 i Hi5 (Invitrogen).

Produkcija ( E10C) hPYY3. 36 i ( Dl lC) hPYY3. 36polipeptida

[0101] Linija ćelije domaćina koja uključuje vektor pojavljivanja (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 može da se uzgaja koristeći standardni medijum koji je dobro poznat stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Medijum obično sadrži sve hranljive materije neophodne za rast i preživljavanje ćelija. Pogodan medijum za uzgajanje ćelijaE. coliobuhvata, na primer, Luria Broth (LB) i/ili Terrific Broth (TB). Pogodan medijum za uzgajanje eukariotičnih ćelija obuhvata Rosvvell Park Memorial Institute medijum 1640 (RPMI 1640), Minimal Essential Medium (MEM) i/ili Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), od kojih svi mogu da budu obogaćeni sa serumom i/ili faktorima rasta, ukoliko je potrebno za uzgajanje određene ćelijske linije. Odgovarajući medijum za kulture insekata je Grace-ov medijum obogaćen sajistolatom, laktalbumin hidrolizatom i/ili serumom fetusa govečeta, ukoliko je potrebno.

[0102] Uobičajeno, kao suplement u medijumu se dodaje antibiotik ili drugo jedinjenje korisno

za selektivni rast transfektovanih ili transformisanih ćelija. Koje će se jedinjenje koristiti zavisiće od izabranog marker elementa koji se nalazi na plazmidu sa kojim se ćelija domaćin transformiše. Na primer, kada je izabrani marker element rezistentan kanamicin, jedinjenje koje se dodaje u medijum sa kulturom će biti kanamicin. U druga jedinjenja za selektivni rast spadaju ampicilin, tetraciklin i neomicin.

[0103] Količina (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptida produkovanog od strane ćelije domaćina može da se proceni standardnim postupe ima koji su poznati u tehnici: U ovakve ? - postupke spadaj U, bez ograničenj a, analiza Western mrij a, ^lektroforeza na SDS ~ - ? poliakrilamidnom gelu, elektroforeza ne-denaturisanog gela, razdvajanje Visoko Efikasnom Tečnom Hromatografij om (HPLC), imunoprecipitacija i/ili ispitivanje aktivnosti kao stoje ispitivanje pomeranja DNA koju vezuje gel.

[0104]Ukoliko je (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 koncipiran tako da se izlučuje iz ćelijske linije domaćina, najveći deo polipeptida može da se nađe u medijumu ćelijske kulture. Međutim, ukoliko se polipeptid ne izlučuje iz ćelija domaćina, nalaziće se u citoplazmi i/ili nukleusu (za eukariotične ćelije domaćina) ili u citozolu (za gram-negativne bakterijske ćelije domaćine).

[0105]Za (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 koje se nalaze u cipoplazmi i/ili nukleusu ćelije domaćina (za eukariotične ćelije domaćine) ili u citozolu (za bakterijske ćelije domaćine), intracelularni materijal (uključujući ubacivanje tela za gram-negativnu bakteriju) može da se ekstrahuje iz ćelije domaćina pomoću bilo koje standardne tehnike poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Na primer, ćelije domaćini mogu da se liziraju kako bi oslobodile sadržaje periplazme/citoplazme pomoću French prese, homogenizacijom i/ili sonizacijom, a nakon toga centrifugiranjem.

[0106]Ukoliko (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 formiraju ubačena tela u citozolu, ubačena tela često mogu da sc vežu sa unutrašnje i/ili spoljašnje strane ćelijskih membrana i na taj način da se primarno nađu u peletiranom materijalu nakon centrifugiranja. Peletirani materijal može nakon toga da se tretira pod ekstremnim vrednostima pH ili sa kaotropičnim sredstvom kao što su deterdžent, gvanidin, derivati gvanidina, urea ili derivati uree, u prisustvu redukcionog sredstva, kao stoje dithiothreitol, pri baznom pH ili kao stoje tris karboksietil fosfm pri kiselom pH, za oslobađanje, prekidanje veza i solubilizaciju ubačenih tela. Solubilizirani (E10C)hPYY3.36ili (D11 C)hPYY3_36 mogu nakon toga da se ispitaju elektroforezom gela, imunoprecipitacijom ili slično. Ukoliko se želi da se izoluje polipeptid, izolacija može da se izvrši standardnim postupcima kao što su ovde opisani i kao što su opisali Marston i saradnici, Meth. Enz. 182:264-75,1990.

[0107]Ukoliko se ubačena tela ne formiraju u značajnom stepenu nakon pojavljivanja (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3-36, onda se polipeptid primarno nalazi u supematantu nakon centrifugiranja ćelijskog homogenata. Nakon toga, polipeptid može da se izoluje iz supernatanta postupcima kao što su ovde opisani postupci. - —

[0108]Prečišćavanje (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3-36 iz rastvora može da se izvrši pomoću različitih tehnika. Ukoliko je polipeptid sintetizovan tako da sadrži tag kao što je Heksahistidin 9

ili druge male peptide kao što su FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) ili myc (Invitrogen) ili na karboksilnom ili amino završetku, može da se prečisti jednofaznim procesom'propuštanjem rastvora kroz afinitetriu kolonu gde'matrikš kolone ima veliki afinitet' za tag, „'i^. ^ ■: - •

[0109]Na primer, polihistidin ima veliki afinitet i specifičnost za vezivanje za nikl. Prema tome,

afinitetna kolona nikla (kao što su Qiagen® nikl kolone) mogu da se koriste za prečišavanje.

Videti, na primer, Current Protocols in Molecular Biologv § 10.11.8 (Ausubel i saradnici, eds., Green Publishers Inc. i Wiley i Sons, 1993).

[0110] Dodatno, (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36polipeptid može da se prečisti

korišćenjem monoklonalnog antitela koje je sposobno da specifično prepozna i da se veže za (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid.

[0111] U situacijama kada je preferirano da se delimično ili potpuno prečiste (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36polipeptid tako daje delimično ili skoro potpuno oslobođen kontaminata, mogu da se koriste standardni postupci koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Ovakvi postupci obuhvataju, bez ograničenja, razdvajanje elektroforezom a nakon toga elektroeluacijom, različite tipove hromatografije (afinitetna, imunoafinitetna, molekularna sita i jonski izmenjivači), HPLC i preparativno izoelektrično fokusiranje ("Isoprime" mašina/tehnika, Hoefer Scientific, San Francisco, CA). U nekim slučajevima, mogu da se koriste dve ili više tehnika prečišćavanja kako bi se postigla povećana čistoća.

[0112] Brojni dodatni postupci za produkciju polipeptida su poznati u tehnici i ti postupci mogu

da se koriste za produkciju (E10C)hPYY3.36i (D11 C)hPYY3.36polipeptida. Videti, na primer, Roberts i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-303,1997, koji opisuju produkciju fuzije proteina između mRNA i njenog enkodiranog peptida. Videti takođe, Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-73, 1999.

[0113] Procesi za produkciju peptida ili polipeptida su takođe opisani u U.S. patentima broj: 5,763,192: 5,814,476; 5,723,323; i 5,817,483. Proces uključuje produkciju stohastičnih gena ili njihovih fragmenata, a nakon toga uvođenje ovih gena u ćelije domaćine koje produkuju jedan ili više proteina enkodiranih od strane stohastičnih gena. Ćelije domaćini se nakon toga snimaju kako bi se identifikovali oni klonovi koji produkuju peptide ili polipeptide sa željenom aktivnošću. Drugi procesi za pojavljivanje rekombinantnog peptida su otkriveni u U.S. patentima broj: 6,103,495, 6,210,925, 6,627,438, i 6,737,250. Proces koristiE. colii opšti put sekrecijeE. coli.Peptid se spoji sa signalnom sekvencom i na taj načinje peptid praktično spreman za sekreciju.

[0114] Drugi postupak za produkciju peptida ili polipeptida je opisan u PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem WO 99/15650. Objavljeni proces, nazvan direktna aktivacija pojavljenog gena za otkrivanje gena, uključuje aktivaciju pojavljivanja endogenog gena ili prekomernog pojavljivanja gena postupcima rekombinacijein situ.Na primer, pojavljivanje endogenog gena je: ": aktivirano ili poyećano integrafijomjegulatorne sćkvencć.usiljami:Ćelijukbjaje sposobna da■"■ • aktivira pojavljivanje gena pomoću ne-homologa ili nelegitimnom rekombinacijom. Ciljana

DNA se prvo podvrgne radijaciji i ubaci se genetički promoter. Promoter eventualno označi

mesto prekida na čelnom delu gena, inicirajući transkripciju gena. Ovo dovodi do pojavljivanja željenog peptida ili polipeptida.

Amidacija

[0115]Amidacija peptida, dobijenih ili sintetički ili rekombinantno, se izvodi enzimom

nazvanim peptidil-glicin alfa-amidaciona monooksigenaza (PAM). Kada se (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 peptidi produkuju rekombinantno koristeći sistem bakterijskog pojavljivanja, peptidi mogu na C-završetku da budu amidirani reakcijomin vitrokoristeći rekombinantni PAM enzim. Izvor PAM enzima, postupci za njegovu produkciju i prečišćavanje i postupci koji mogu da se koriste za amidaciju (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 peptida su opisani, na primer, u U.S. patentima broj: 4,708,934, 5,789,234 i 6,319,685.

Selektivna( E10OhPYY^ i ( Dl lQhPYYyjg antitela

[0116]Antitela i fragmenti antitela koja specifično vezuju (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36

polipeptide, sa ili bez pegilacije na položaju supstitucije cisteina (kako je ovde opisano), ali ne vezuju selektivno prirodni hPYY3.36, su obuhvaćeni okvirom ovog pronalaska. Antitela mogu da budu poliklonalna, uključujući monospecifična poliklonalna; monoklonalna; rekombinantna;

himerična; humanizirana, kao što je graftovan CDR; humana; jednog lanca; i/ili bispecifična; kao i njihovi fragmenti, varijacije ili derivati. Fragmenti antitela uključuju one delove antitela koji se vezuju za epitop na (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptidu. U primere ovakvih fragmenata spadaju Fab i F(ab') fragmenti generisani enizmatičkim cepanjem antitela potpune dužine. U druge fragmente koji se vezuju spadaju oni koji su generisani tehnikama rekombinacije DNA, kao što je pojavljivanje rekombinantnih plazmida koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje enkodiraju varijabilne regione antitela.

[0117]Poliklonalna antitela usmerena na (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid se

generalno produkuju u životinjama (na primer, zečevi ili miševi) pomoću višestrukih SC ili IP injekcija (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36polipeptida i pomoćnog sredstva. Može da bude korisno da se (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid konjuguje sa nosačem proteina koji je umunogeničan za vrste koje se imuniziraju, kao što je hemocijanin ključni faktor prilepka, serum albumina, tiroglobulin govečeta, ili inhibitor tripsina soje. Takođe, sredstva za agregaciju

kao stoje stipsa se koriste za pojačavanje imunog odgovora. Nakon imunizacije, .životinjama se - ispusti krv, a serum se ispituje na titar,anti^(E10C)hPYY3.36 ili anti-(Dl 1 C)hPYY3-36 antitela. _? _____

[0118]Monoklonalna antitela usmerena ka (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3-36 polipeptidima se dobijaju koristeći bilo koji postupak koji obezbeđuje produkciju molekula antitela pomoću kontinuiranih ćelijskih linija u kulturi. Primeri odgovarajućih postupaka za izradu monoklonalnih antitela obuhvataju hibridoma postupke, Kohler i saradnici, Nature 256: 495-97,1975, i postupak hibridomahumane B-ćelije (Kozbor, J. Immunol. 133:3001,1984; Brodeuri saradnici,

Monoclonal Antibodv Production Techniques i Applications, 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). Pronalaskom su takođe obezbeđeni hibridomi ćelijskih linija koji produkuju monoklonalna

antitela reaktivna sa (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptidima.

[0119] Preferirani postupci za određivanje specifičnosti i afiniteta monoklonalnog antitela

kompetitivnom inhibicijom mogu da se nađu u Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Current Protocols in Immunologv (Colligan i saradnici, eds., Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, 1993); and Muller, Meth. Enzvmol. 92:589-601, 1988.

[0120] Himerična antitela iz ovog pronalaska mogu da obuhvate pojedinačne H i/ili L lance

imunoglobulina. Preferirani himerični H lanac uključuje region vezivanja antigena dobijen od H lanca ne-humanog antitela specifičnog za (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid koji je vezan najmanje za deo humanog H lanca C regiona (CH), kao ašto su CHiili CH2. Preferirani himerični L lanac uključuje region vezivanja antigena dobijen od L lanca ne-humanog antitela specifičnog za (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid koji je vezan najmanje za deo humanog L lanca C regiona (CL). Himerična antitela i postupci za njihovu produkciju su poznati u tehnici. Videti Cabillv i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3273-77, 1984; Morrison i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-55, 1984; Boulianne i saradnici, Nature 312:643-46, 1984; Neuberger i saradnici, Nature 314:268- 70, 1985; Liu i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-43, 1987; i Harlovv i Lane,supra.

[0121] Sredstva za selektivno vezivanje imaju himerične H lance i L lance istog ili različitog

regiona koji se specifično vezuje, mogu takođe da se izrade odgovarajućim grupisanjem pojedinačnih lanaca polipeptida, u skladu sa postupcima koji su poznati u tehnici. Videti, na primer, Current Protocols in Molecular Biologv (Ausubel i saradnici, eds., Green Publishers Inc.

i Wiley i Sons, 1994) i Harlow i Lane,supra.Koristeći ovaj pristup, ćelije domaćini u kojima se pojavljuju himerični H lanci (ili njihovi derivati) se uzgajaju odvojeno od ćelija domaćina u kojima se pojavljuju himerični L lanci (ili njihovi derivati), a lanci imunoglobulina se odvojeno izdvajaju i nakon toga grupišu. Alternativno, ćelije domaćini mogu da budu zajedno uzgajane i - lanci ostave da se spontano grupišu u medijumu za kulturu, a nakon toga se izdavaja grupisani ;;

imunogl obulin.

[0122] U narednom aspektu, monoklonalno antitelo iz pronalaska je "humanizirano" antitelo.

Postupci za humanizaciju ne-humanih antitela su dobro poznati u tehnici. Videti U.S. patente

broj 5,585,089 i 5,693,762. Generalno, humanizirano antitelo ima jedan ili više ostataka amino kiseline uvedenih u njih iz izvora koji nije human. Humanizacija može da se izvrši, na primer, postupcima koji su opisani u tehnici (Jones i saradnici, 1986, Nature 321:522-25; Riechmann i saradnici, 1998, Nature 332:323- 27; Verhoeven i saradnici, 1988, Science 239:1534-36), supstitucijom najmanje dela komplementarno-određenog regiona glodara (CDR) sa odgovarajućim regionima humanog antitela.

[0123] Tehnike za stvaranje verzija rekombinantne DNA molekula antitela sa regionima koji vezuju antigen (to jest, Fab ili fragmenti varijabilnog regiona) koji zaobilaze generisanje monoklonalnih antitela su obuhvaćeni okvirom ovog pronalaska. U ovoj tehnici, molekule RNA prenosioci specifičnog antitela se ekstrahuju iz ćelija imunog sistema uzetih od imunizirane životinje i transkriptovane u cDNA. cDNA se nakon toga klonira u sistem bakterijskog pojavljivanja. Jedan primer ovakve tehnike pogodne za primenu ovog pronalaska koristi bakteriofag lambda sistem vektora koji ima vodeću sekvencu koja izaziva nagomilavanje Fab proteina za migraciju u periplazmični prostor (prostor između membrane bakterijske ćelije i zida ćelije) ili za sekreciju. Ovaj može brzo da generiše i prati veliki broj funkcionalnih Fab fragmenata za one koji vezuju antigen. Ovakve molekule koje vezuju (E10C)hPYY3-36- ili (Dl lC)hPYY3-36 (Fab fragmenti specifični za (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptide)

su posebno obuhvaćeni pod nazivom "antitelo" kako se ovde koristi.

[0124]Takođe, u okviru ovog pronalaska su tehnike razvijene za produkciju himeričnih antitela spajanjem gena iz molekule antitela miša odgovarajuće specifičnosti za antigen, zajedno sa genima iz molekule humanog antitela odgovarajuće biološke aktivnosti (kao što je sposobnost da aktivira humani komplement i stvori celularnu citotoksičnost u zavisnosti od antitela (ADCC)). Morrison i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-55, 1984; Neuberger i saradnici, Nature, 312:604-08, 1984. Sredstva za selektivno vezivanje, kao što su antitela produkovana

ovom tehnikom, su obuhvaćena okvirom pronalaska.

[0125] Razumljivo je da pronalazak nije ograničen na monoklonalna antitela miševa ili pacova; u stvari, mogu da se koriste humana antitela. Ova antitela mogu da se dobiju korišćenjern humanih hibridoma. Sva humana antitela koja vezuju (E10C)hPVV3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptide su stoga obuhvaćena pronalaskom. Ova antitela se produkuju imuniziranjem sa (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3-3g antigenom (opciono konjugovanim za nosač) trans-geničnih životinja (na primer, miševa) sposobnih da produkuju repertoar humanih antitela bez produkcije endogenog ;"£imunoglobulina:. Videti, na primery JakobovitsJ- saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2551-55, 1993; Jakobovits i saradnici, Nature 362:255-58, 1993; Bruggemann i saradnici, Year in

Immuno. 7:33-40,1993.

[0126]Pronalaskom su takođe obuhvaćena humana antitela koja vezuju (E10C)hPYY3.36ili (Dl lC)hPYY3.36polipeptide. Korišćenjem transgeničnih životinja (na primer, miševa) koje su sposobne da produkuju repertoar humanih antitela bez produkcije endogenog imunoglobulina, ova antitela se produkuju imunizacijom sa (E10C)hPYY3.36or (Dl lC)hPVV3.36 polipeptid anatigenom (to jest, koji ima najmanje 6 graničnih amino kiselina), opciono konjugovanih za nosač. Videti, na primer, Jakobovits i saradnici, 1993supra;Jakobovits i saradnici, Nature 362:255-58, 1993; Bruggermann i saradnici, 1993,supra.U jednom postupku, ove transgenične životinje se produkuju onesposobljavanjem endogenih loci koje enkodiraju njihove teške i lake lance imunoglobuina i umetanjem loci koji enkodira humani teški i laki lanac proteina u njihovom genomu. Delimično modifikovane životinje, to jest, one koje nemaju potpunu modifikaciju komplementa se nakon toga ukrštaju da se dobije životinja koja ima sve željene modifikacije imunog sistema. Kada se primeni imunogen, ove transgenične životinje produkuju antitela sa sekvencama humane (pre nego, na primer, miševi) amino kiseline, uključujući varijabilne regione koji su imunospecifični za ove antigene. Videti PCT patentne prijave publikovane pod brojevima: WO 96/33735 i WO 94/02602. Dodatni postupci su opisani u U.S. patentu broj 5,545,807, PCT patentnim prijavama publikovanim pod brojevima: WO 91/10741 i WO 90/04036, i u EP patentu broj 0 546 073 BI i PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem WO 92/03918. Humana antitela mogu takođe da se produkuju pojavljivanjem rekombinantne

DNA u ćelijama domaćinima ili pojavljivanjem u ćelijama hibridoma, kako je ovde opisano.

[0127]U alternativnom aspektu, humana antitela mogu takođe da se produkuju iz datoteka faga (Hoogen-boom i saradnici, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks i saradnici, J. Mol. Biol. 222:581, 1991). Ovi procesi imitiraju imunu selekciju preko pokazivanja repertoara antitela na površini filamenata bakteriofaga, a nakon toga selekcijom faga preko vezivanja za izabrani antigen. Jedna od ovakvih tehnikaje opisana u PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem \VO 99/10494,

koja opisuje izdvajanje visoko afinitetnih i funkcionalnih agonističnih antitela za MPL- i msk-receptore koristeći ovaj pristup

[0128]Himerična, DR graftna i humanizirana antitela se obično produkuju rekombinatnim postupcima. Nukleinske kiseline koje enkodiraju antitela su umetnute u ćelije domaćina i nagomilavaju se koristeći materijale i procedure koje su ovde opisane i koje su poznate u tehnici.

U preferiranom aspektu, antitela se produkuju u osnovnim ćelijama sisara, kao što su CHO

ćelije. Monoklonalna (na primer, humana) antitela mogu da^sej^rodukujjj pojavljivanjem rekombinatne DNA u ćelijama domaćinima ili:pojavljivanjem u.hibridoma ćelijama, kako je-" - ovde opisano.

[0129]Anti-(E10C)hPYY3-36i anti-(Dl lC)hPYY3-36 antitela iz pronalaska mogu da se koriste u bilo kom poznatom postupku ispitivanja, kao što su ispitivanja kompetitivnog vezivanja, direktna i indirektna umetnuta ispitivanja, ispitivanja imunoprecipitacije (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual Techniques, 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)) za pronalaženje i kvantifikaciju (E10C)hPYY3.36i (Dl lC)hPYY3.36 polipeptida, kao i za prečišavanje polipeptida. Antitela će vezivati (E10C)hPVV3.36ili (Dl lC)hPYY3.36 polipeptide afinitetom koji je odgovarajući za metod ispitivanja koji se koristi.

[0130]PYY agonisti iz pronalaska mogu da se dobiju u obliku soli dobijenih dodavanjem farmaceutski prihvatljive kiseline za upotrebu u postupku aspekta ovog pronalaska. Reprezentativne farmaceutski prihvatljive soli dobijene dodavanjem kiseline ovih jedinjenja obuhvataju hidrohloridne, hidrobromidne, hidrojodidne, nitratne, sulfatne, bisulfatne, fosfatne, kisele fosfatne, izonikotinatne, acetatne, laktatne, salicilatne, citratne, kisele citratne, tartaratne, pantotenatne, bitartaratne, askorbatne, sukcinatne, maleatne, gentizinatne, fumaratne, glukonatne, glukuronatne, saharatne, formatne, benzoatne, glutamatne, metansulfonatne, etansulfonatne, benzensulfonatne, p-toluensulfonatne, pamoatne, palmitatne, malonatne, stearatne, lauratne, malatne, boratne, heksafluorofosfatne, naftilatne, glukoheptonatne, laktobionatne i laurilsulfonatne soli i slično. Soli ne-pegiliranih varijanti ne moraju da budu farmaceutski prihvatljive kada se ta varijanta koristi kao međuproizvod u izradi konjugata PEG-PYY3.3ć varijante.

[0131]Agonisti PYY iz ovog pronalaska se generalno primenjuju u obliku farmaceutske kompozicije. Farmaceutska kompozicija može, na primer, da bude u obliku pogodnom za oralnu primenu, (na primer, tableta, kapsula, pilula, prašak, rastvor, suspenzija), za parenteralnu injekciju (na primer, sterilan rastvor, suspenzija ili emulzija), za intranazalnu primenu (na primer, za aerosol kapi, itd), za rektalnu primenu (na primer, supozitorije) ili za transdermalnu primenu (na primer, flaster). Farmaceutska kompozicija može da bude u jediničnim doznim oblicima pogodnim za pojedinačnu primenu precizno određene doze. Farmaceutska kompozicija obuhvata uobičajeni farmaceutski nosač i agonist PYY iz pronalaska kao aktivni sastojak.

Dodatno, može da uključi drugo farmaceutsko sredstvo, pomoćne materije, itd.

[0132]Potupci za izradu različitih farmaceutskih kompozicija bioaktivnih peptida su dobro

poznati u farmaceutskoj tehnici. Na primer, videti U.S. patentnu prijavu objavljenu pod brojem 2005/0009748 (za oralnu primenu); i 2004/0157777, 2005/0002927 i 2005/0215475 (za transmukozalnu primenu, na primer, intranazalna ili bukalna primena). Videti takođ&Remington=—- - The Practice Pharmacv, Lippincott Williams i Wilkins, Baltimore; MDj 20th ed. 2000.;^

[0133]Agonisti PYY iz ovog pronalaska mogu da se koriste u konjukciji sa drugim farmaceutskim sredstvima za tretman ovde opisanih bolesti ili stanja. Stoga su postupci za tretman koji uključuju primenu jedinjenja iz ovog pronalaska u kombinaciji sa drugim farmaceutskim sredstvima takođe obezbeđeni ovim pronalaskom.

[0134]U pogodna farmaceutska sredstva koja mogu da se koriste u kombinaciji sa agonistima

PYY iz ovog pronalaska spadaju druga sredstva protiv gojaznosti kao što su antagonisti kanabinoida-l(CB-l) (kao što je rimonabant), inhibitori 1 lp-hidroksi steroid dehidrogenaze-1(1 lp-HSD tip 1), agonisti MCR-4, agonisti holecistokinina-A (CCK-A), inhibitori ponovnog pojavljivanja monoamina (kao što je sibutramin), simpatomimetička sredstva, agonisti p3adrenergičnog receptora, agonisti dopamin receptora (kao što je bromokriptin), analozi receptora melanocit-stimulirajućeg hormona, agonisti 5HT2c receptora, antagonisti melanin koncentrujućeg hormona, leptin, analozi leptina, agonisti leptin receptora, antagonisti galanina, inhibitori lipaze (kao stoje tetrahidrolipstatin, to jest orlistat), anorektična sredstva (kao što je agonist bombezina), antagonisti neuropeptid-Y receptora (na primer, antagonisti NPY Y5 receptora), tiromimetička sredstva, dehidroepiandrosteron ili njegov analog, agonisti ili antagonisti glukokortikoidnog receptora, antagonisti oreksin receptora, agonisti glukagon-slično peptidu-1 receptora, cilijami neurotrofični faktori (kao što je Axokine™ raspoloživ od firme Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY i Procter & Gamble Companv, Cincinnati,

OH), inhibitori humanog proteina povezanog sa agouti (AGRP), antagonisti grelin receptora, antagonisti ili inverzni agonisti histamin 3 receptora, agonisti neuromedin U receptora, inhibitori MTP/ApoB (na primer, inhibitori selektivnog MTP za creva, kao što je dirlotapid) i slično.

[0135]Preferirana sredstva protiv gojaznosti za upotrebu u kombinaciji sa agonistima PYY iz

ovog pronalaska obuhvataju antagoniste CB-1 receptora, inhibitore MTP selektivne za creva, agoniste CCKa, agoniste 5HT2c receptora, antagoniste NPY Y$receptora, orlistat i sibutramin. Preferirani antagonisti CB-1 receptora za upotrebu u postupcima iz ovog pronalaska uključuju: rimonabant (SR141716A takođe poznat pod trgovačkim imenom Acomplia™) koji je raspoloživ od firme Sanofi-Svnthelabo ili može da se izradi na način kako je opisano u U.S. patentu broj 5,624,94 l;N-(piperidin-l-il)-l-(2,4-dihlorofeniI)-5-(4-jodofenil)-4-metil-lH-pirazol-3-karboksamid (AM251) koji je raspoloživ od firme Tocris™, Ellisville, MO; [5-(4-bromofenil)-l-(2,4-dihloro-fenil)-4-etil-N-(l-piperidinil)-lH-pirazol-3-karboksamid) (SR147778) koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentu broj 6,645,985; N-(piperidin-l-il)-4,5-difenil-l-metilimidazol-2-karboksamid, N-(piperidin-l -il)-4-(2,4-dihlorofenil)-5-(4-hlorofenil)-l - metilimidazol-2-karboksamid, N-(piperidin-1 -il)-4,5-di-(4-metilfenil)-1 -metilimiđazol-2'-karboksamid, Nicikloheksil-4,5-di-(4-metiife"nil)-l -metilimidazol-2-karboksamid, N-(cikloheksil)-4-(2,4-dihlorofenil)-5-(4-hlorofenil)-.l-metilimidazol-2-karboksamid i N-(fenil)-4-

(2,4-dihlorofenil)-5-(4-hIorofenil)-l-metilimidazol-2-karboksamid koji može da se izradi kako je opisano u PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem WO 03/075660; hidrohloridna,

mesilatna i besilatna so amida l-[9-(4-hloro-fenil)-8-(2-hloro-fenil)-9H-purin-6-il]-4-etilamino-piperidin-4-karboksilne kiseline koja može da se izradi kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2004/0092520; amid l-[7-(2-hloro-fenil)-8-(4-hlorofenil)-2-metil-pirazolo[l,5-a][l,3,5]triazin-4-il]-3-etil-amino-azetidin-3-karboksilne kiseline i amid l-[7-(2-hloro-fenil)-8-(4-hloro-fenil)-2-metil-pirazolo[l,5-a][l,3,5] triazin-4-il]-3-metilamino-azetidin-3. karboksilne kiseline koji mogu da se izrade kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2004/0157839; 3-(4-hloro-fenil)-2-(2-hloro-fenil)-6-(2,2-difluoro-propil)-2,4,5,6-tetrahidro-pirazolo [3,4-c]piridin-7-on koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2004/0214855; 3-(4-hloro-fenil)-2-(2-hloro-fenil)-7-(2,2-difluoro-propil)-6,7-dihidro-2H,5H-4-oksa-l,2,7-triaza-azulen-8-on koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2005/0101592; 2-(2-hloro-fenil)-6-(2,2,2-trifluoroetil)-3-(4-trifluorometil-fenil)-2,6-dihidro-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-on koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2004/0214838; (S)-4-hloro-N-{[3-(4-Woro-fenil)-4-fenil-4,5-dihidro-pirazol-l-il]-metilamino-metilen}-benzensulfonamid (SLV-319) i (S)-N-{[3-(4-hlorofenil)-4-fenil-4,5-dihidro-pirazol-l-il]-metilamino-metil-en}-4-trifluorometil-benzensulfonamid (SLV-326) koji mogu da se izrade kako je opisano u PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem WO 02/076949; N-piperidino-5-(4-bromofenil)-l-(2,4-dihlorofenil)-4-etilpirazol-3-karboksamid koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentu broj 6,432,984; l-[bis-(4-hloro-fenil)-metil]-3-[(3,5-difluoro-fenil)-metansulfonil-metilenj-azetidin koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentu broj 6,518,264; 2-(5-(trifiuorometiI) piridin-2-iloksi)-N-(4-(4-hlorofenil)-3-(3-cijanofenil)butan-2-il)-2-metilpropanamid koji može da se izradi kako je opisano u PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem WO 04/048317; 4-{[6-metoksi-2-(4-metoksifenil)-l-benzofuran-3-il]karbonil} benzonitril (LY-320135) koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentu broj 5,747,524; 1-[2-(2,4-dihlorofenil)-2-(4-fluorofenil)-benzo[l,3]dioksol-5-sulfonil]-piperidin koji može da se izradi kako je opisano u WO 04/013120; i [3-amino-5-(4-hlorofenil)-6-(2,4-dihlorofenil)-furo[2,3-b]piridin-2-il]-fenil-metanon koji može da se izradi kako je opisano u PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem WO 04/012671.

[0136] Preferirani inhibitori MTP koji deluje u tankom crevu za upotrebu u kombinacijama, farmaceutskim kompozicijama i postupcima iz pronalaska uključuju-dirlotapid ((S)-N-{2-[benzil(metil)amino]-2-okso-l -feniletil} -1 -metil-5: {4;-(txifluprprnetil)[ l.J.'-hife.nil,]^-karboksamido]-lH-indol-2-karboksamid) i (karbamoil-fenil-metil)-amid 1 -metil-5-[(4'-trifluorometil-bifenil-2-karbonil)-amino]-lH-indol-2-karboksilne kiseline koji mogu da se izrade postupcima koji su opisani u U.S. patentu broj 6,720,351; (pentilkarbamoil-fenil-metil)-amid (S)-2-[(4'-trifluorometil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kvinolin-6-karboksilne kiseline, ([(4-fluoro-benzil)-metil-karbamoil)-fenil-metil}-amid (S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-karbonil)-aminoj-kvinolin-6-karboksilne kiseline i [(4-fluoro-benzilkarbamoil)-fenil-metil]-amid (S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kvinolin-6-karboksilne kiseline koji mogu da se izrade kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2005/0234099A1, (-)-4-[4-(4-[4-[[(2S,4R)-2-(4-hlorofenil)-2-[[(4-metil-4H-l,2,4-triazol-3-il)sulfanil]metil-l,3-dioksolan-4-il]metoksi]fenil]piperazin-l-il]fenil]-2-(lR)-l-metilpropil]-2,4-dihidro-3H-l,2,4-triazol-3-on (takođe poznat kao Mitratapid ili Rl 03757) koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentima broj 5,521,186 i 5,929,075; i implitapid (BAY 13-9952) koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentu broj 6,265,431. Najpoželjniji su dirlotapid, mitratapid, (pentilkarbamoil-fenil-metil)-amid (S)-2-[(4'-trifluorometil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kvinolin-6-karboksilne kiseline, {[ (4-fluoro-benzil)-metil-karbamoil]-fenil-metil}-amid (S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kvinolin-6-karboksilne kiseline ili [(4-fluoro-benzilkarbamoil)-fenil-metil]-

amid (S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kvinolin-6-karboksilne kiseline. U

preferirane antagoniste NPYY5 receptora spadaju: 2-okso-N-(5-fenilpirazinil)spiro[izobenzofuran-l(3H),4'-piperidin]-l'-karboksamid koji može da se izradi kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem 2002/0151456; i 3-okso-N-(5-fenil-2-pirazinil)-spiro[izobenzofuran-l(3H), 4'-piperidin]-r-karboksamid; 3-okso-N-(7-trifluorometilpirido[3,2-b]piridin-2-il)-spiro-[izobenzofuran-l(3H), 4'-piperidin]-l'-karboksamid; N-[5-(3-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oksospiro-[izobenzofuran-l(3H), -[4'-piperidin]-l'-karboksamid; trans-3'-okso-N-(5-fenil-2-pirimidinil)]spiro[cikloheksan-l,r(3'H)-izobenzofuran]-4-karboksamid;^rara-3'-okso-N-[l-(3-kvinolil)-4-imidazolil]spiro[cikloheksan-l,l'(3'H)-izobenzofuran]-4-karboksamid; trans-3-okso-N-(5-fenil-2-pirazinil)spiro[4-azaizobenzofuran-l(3H), l'-cikloheksan]-4'-karboksamid; trans-N-[5-(3-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oksospiro[5-azaizobenzofuran-l(3H), l'-cikloheksan]-4'-karboksamid; trans-N-[5-(2-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oksospiro[5-azaizobenzofuran-l(3H), l'-cikloheksan]-4'-karboksamid; trans-N-[l-(3,5-difluorofenil)-4-imidazolil]-3-oksospiro[7-azaizobenzofuran-

1(3H), l'-cikloheksan]-4'-karboksamid; trans-3-okso-N-(l-fenil-4-pirazolil) spiro[4-azaizobenzofuran-l(3H),r-cikloheksan]-4'-karboksamid; trans-N-[l-(2-fluorofenil)-3-pirazolil]-3-oksospiro[6-azaizobenzofuran-l(3H), 1 -cikloheksan]-4'-karboksamid; trans-3-okso-N-(I-fenil-3-pirazolil)spirO[6-azaizobenzofuran-l(3H), 1-Cikloheksan]-4'-karbbkš;amidVi'trairs^3-okš^^ : .

(2-fenil-l,2,3-triazol-4-il)spiro[6-azaizobenzofuran-l(3H),r-cikloheksan]-4'-karboksamid, koji

svi mogu da se izrade kako je opisano u PCT patentnoj prijavi objavljenoj pod brojem WO 03/082190; i njihove farmaceutski prihvatljive soli i estri.

[0137]U postupcima aspekata ovog pronalaska, agonist PYY iz pronalaska, sam ili u

kombinaciji sa jednim ili više drugih farmaceutskih sredstava se periferno primenjuje na subjektu, posebno ili zajedno, bilo kojim prihvatljivim postupkom za perifernu primenu koji je poznat u tehnici. U skladu sa tim, agonist PYY ili kombinacija mogu da se na subjektu primenjuju parenteralno (na primer, intravenozno, intraperitonealno, intramuskularno ili subkutano), intranazalno, oralno, sublingvalno, bukalno ili inhalacijom (na primer, aerosol), rektalno (na primer, supozitorije) ili transdermalno. Parenteralna primena je preferirani postupak primene, a subkutana primena je preferirani postupak parenteralne primene.

[0138]Kompozicije pogodne za parenteralne injekcije generalno uključuju farmaceutski prihvatljive sterilne vodene ili nevodene rastvore, disperzije, suspenzije ili emulzije i sterilne praškove za rekonstituciju u sterilne injektibilne rastvore ili disperzije. Primeri pogodnih vodenih ili nevodenih nosača ili razblaživača (uključujući rastvarače ili vehikulume) uključuju vodu, etanol, poliole (propilene glikol, polietilen glikol, glicerol i slično), njihove odgovarajuće mešavine, trigliceride, uključujući biljna ulja kao što je maslinovo ulje i injektibilne organske estre kao što je etil oleat.

[0139]Ove kopozicije za parenteralne injekcije mogu takođe da sadže ekscipijente kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, solubilizaciju, emulgovanje i dispergovanje. Za sprečavanje kontaminacije mikroorganizmima, kompozicije mogu da sadrže različita antibakterijska i antifungalna sredstva, na primer, parabene, hlorobutanol, fenol, sorbatnu kiselinu i slično. Takođe mogu da budu potrebna izotonična sredstva, na primer, šećeri, natrijum hlorid i slično. Odložena apsorpcija injektibilnih farmaceutskih kompozicija može da se postigne upotrebom sredstava sposobnih da odlože apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatine.

[0140]Agonisti PYY iz ovog pronalaska se primenjuju na subjektu u dozi koja varira u

zavisnosti od brojnih faktora, kao što su način primene, godine i težina subjekta, ozbiljnost bolesti, stanje i poremećaj koji se tretira i farmakološka aktivnost agoniste PYY koji se primenjuje. Određivanje raspona doze i optimalno doziranje za određenog pacijenta je dobro poznato stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u tehnici.

[0141]Za parenteralnu primenu, agonisti PYY iz ovog pronalaska mogu da se primene na humanom subjektu u dozi u rasponu od približno 0.01 ug/kg do približno 10 mg/kg/doza u režimu doziranja na bazi ne-pegilirane varijante. Na primer, za 30K mPEG ~- ~ maleimid(E10C)hPYY3.36?vrednost parenteralnogdoziranja'će biti -u-rasponu od približno 0.01 ug/kg do približno 10 mg/kg/doza u režimu doziranja na bazi (E10C)hPYY3.36, preferirano u rasponu ođ približno 0.05 mg/kg do približno 1.0 mg/kg/doza, ili približno 0.05 ili 0.1 mg/kg do približno 1.0 mg/kg/doza, ili približno 0.05 ili 0.1 mg/kg do približno 0.3 ili 0.5 mg/kg/doza. Na primer, doza 85 mg 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3-36, koji ima molekulsku težinu od približno 34024 Da (30 k Da PEG plus 4024, molekulska težina ne-pegiliranog peptida), je ekvivalentna sa 10 mg ne-pegiliranog, na bazi (E10C)hPYY3-36. Režim doziranja može da bude jedna ili više doza dnevno, preferirano pre obroka, ili, posebno za 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3-36ili 20K mPEG maleimid(E10C)hPYY3-36, preferiranje režim doziranja od 2 ili 3 puta nedeljno ili jedanput nedeljno ili jedanput svakih 10-14 dana. [0142JAspekti ovog pronalaska su ilustrovani u niže datim primerima. Međutim, treba razumeti da se za stručnjaka sa uobičajenim iskustvom u tehnici aspekti ovog pronalaska ne ograničavaju specifičnim detaljima ovih primera, jer su poznate njihove druge varijante, ili u svetlu datih otkrića i priloženih patentnih zahteva. Sve navedene reference su ovde inkorporirane u referencama.

PRIMERI

Primer 1

Linearni 30K i 20K mPEG i 20 K Maleimid ( E10C) hPYYy^

[0143]Ovaj primer obezbeđuje izradu potpuno homogenog monopegiliranog (E10C)hPYY3-3636

sa mPEG (30K ili 20K) vezanim na ostatku 10.

(a) Izrada ( E10C) hPYY^

[0144](E10C)PYY3-36se sintetiše postupkom čvrste faze korišćenjem Fmoc strategije sa aktivacijom 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametil uronijum heksafluorofosfata (HBTU)

(Fastmoc, 0.15 mmol ciklus) koristeći automatski sintisajzer peptida (model 433A; Applied Biosvstems, Foster City, CA). Kao zaštitne grupe bočnog lanca se koriste Trt za Asn, Gln, Cys i His; tBu za Ser, Thr i Tyr; Boe za Lys; OtBu za Asp i Glu; i Pbf za Arg. Cepanje veze peptid-smola se vrši mešavinom od 9mL trifluoroacetatne kiseline (TFA), 0.5 g fenola, 0.5mL H2O, 0.5mL tioanizola i 0.25mL 1,2 etanditiola, na sobnoj temperaturi, u toku 4 h. Peptid se istaloži u ledeno hladnom etil etru i ispere sa etil etrom, rastvori u DMSO i prečisti reverzno faznom HPLC na Waters Deltapak Cl8,15um, 100A, 50x300mmID koloni (Cat# WAT011801, Waters, Milford, MA) koristeći linearni gradijent od 100% rastvarača A: 0% rastvarača B do 70% rastvarača A : 30% rastvarača B, u toku 30 minuta, pri brzini protoka od 80 mL /min. Rastvarač-.A je 0.1% vodeni rastvor TFA (trifluoroacetatne kiseline). Rastvarač Bje 0.1% rastvor TFA u acetonitrilu. Molekularna masa prečišćenog peptida je potvrđena sa ESI-MS (MAvg=4024), a čistoća je ispitana reverzno faznom HPLC (Slika 1).

( V)Izrada linearnog 30K mPEG maleimid ( ElOahPTVVjg

[0145]Linearni mPEG maleimid reagens od približno 30,000MW (Sunbright ME-300MA, NOF Corporation, Tokyo, Japan) je selektivno udvojen sa (E10C)hPYY3.36na sulfhidril grupi cisteina na ostatku 10. Linearni 30K mPEG maleimid, rastvoren u 20 mM HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7.0, ili, alternativno, 20mM natrijum acetatu (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, trenutno reaguje sa (E10C)hPYY3-36peptidom direktnim vezivanjem peptida da se dobije peptid u koncentraciji od 1 mg/mL i relativni molarni odnos mPEG : (E10C)hPYY3.36od približno 1:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5-24 sata. Reakcije u HEPES pH 7.0 se zaustavljaju razblaživanjem sa 20mM natrijum acetatom pH 4.5, uz trenutno prečišćavanje hromatografij om izmene kafjona. Reakcije u 20mM natrijum acetatu, pH 4.5, se prenesu direktno na kolonu za hromatografij u izmenom katjona. Produkti reakcije se ispituju pomoću SEC-HPLC (Slika 2).

(c) Prečišćavanje linearnog 30K mPEG maleimid ( E10QhPYY3z3fi

[0146]Pegilirane (E10C)hPYY3_36vrste se iz reaktivne mešavine prečiste do >95% u fazi hromatografije izmenom pojedinačnog jona. Mono-pegilirani (E10C)hPYY3-36se izdvaja iz nemodifikovanog (E10C)hPYY3-36i vrsta sa većom molekulskom težinom pomoću hromatografije izmenom katjona. Tipična reaktivna mešavina linearnog 30KmPEG maleimid E10C) I1PVV3-36(10 mg proteina), kako je prethodno opisano, se razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna mešavina se 7X razblaži sa puferom A i prenese u kolonu uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Kolona se ispere sa 5-10 zapremina kolone puferom A. Nakon toga, različite (E10C)hPYY3-36vrste se eluiraju iz kolone u 20 zapremina kolone linearnim NaCl gradientom od 0-100 mM. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280) a frakcije odgovarajuće veličine se sakupe. Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, kako je procenjeno pomoću ®SDS-PAGE (Slika 3). Prečišćene grupe se nakon toga koncentruju do 0.5-5 mg/mL u Centriprep 3 koncentratom (Amicon Technologv Corporation, Northborough, MA) ili, alternativno, koristeći Vivaspin 10K koncentrator (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Germany). Koncentracija proteina prečišćene grupe se određuje upoređivanjem RP HPLC oblasti pika za PYY3-36standardnu krivu (nije pokazana) ili, alternativno, koncentracija prečišćene grupe se određuje apsorpcijom na 280nm koristeći eksperimentalno dobijen koeficijent ekstinkcije. Prečišćena grupa pegiliranog (E10C)hPYY3.36se profiliše pompću SEC-HPLC, kako je pokazano na Slici 6.

(d) Izrada linearnog 20K mPEG maleimid ( E10C) hPYY3-36 ...,

(0147]Linearni mPEG maleimidni reagens od približno 20,000 MW (Sunbright ME-200MA,

NOF Corporation) se selektivno udvoji sa (E10C)hPYY3.36na sulfhidrilnoj grupi cisteina na ostatku 10. Linearni 20K mPEG maleimid, rastvoren u 20mM natrijum acetatu (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, trenutno reaguje sa (E10C)h PYY3.36 peptidom direktnim vezivanjem peptida da se dobije koncentracija peptida od 1 mg/mL i relativni molarni odnos mPEG:(E10C)hPYY3.36od približno 1.3:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj temperaturi, u toku 60 minuta, a nakon toga 16 sati na 4°C. Reakcije u 20 mM natrijum acetatu,

pH 4.5, se izvode direktno hromatografij om izmene katjona. Produkti reakcije se ispituju pomoću SEC-HPLC.

(e) Prečišćavanje linearnog 20K mPEG maleimid ( E10C) hPYY3z2£

[0148]Pegilirane (E10C)hPYY3.36vrste se iz reaktivne mešavine prečiste do >95% u fazi hromatografije izmenom pojedinačnog jona. Mono-pegilirani (E10C)hPYY3.36se odvoji od slobodnog PEG, nemodifikovanog (E10C)hPYY3.36i vrsta sa većom molekulskom težinom pomoću hromatografije izmenom katjona. Tipična reaktivna mešavina linearnog 20K mPEG maleimid E10C) hPVV3.36(20 mg proteina), kako je prethodno opisano, se razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna mešavina se prenese u kolonu uz brzinu protoka od 1.0 mL/min. Kolona se ispere sa 4 zapremine kolone sa puferom A uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Nakon toga, različite (E10C)hPYY3.36vrste se eluiraju iz kolone u 25 zapremina kolone linearnim NaCl gradientom od 0-200 mM uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280), a frakcije odgovarajuće veličine se sakupe. Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, kako je procenjeno pomoću SEC-HPLC. Prečišćene grupe se nakon toga koncentruju do 0.5-5 mg/mL koristeći Vivaspin 10K koncentrator (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Germany). Koncentracija proteina prečišćene grupe se određuje apsorpcijom na 280nm koristeći eksperimentalno dobijen koeficijent ekstinkcije. Ukupan prinos u procesu prečišćavanja mono 20K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36 je 38%. Pomoću SEC-HPLC je određeno daje prečišćena grupa mono 20K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.3695% čista.

Primer 2

Linearni 30K mPEG Maleimid ( DllC) hPYY3. 3ft.._

[0149]Ovaj primer pokazuje izradu potpuno homogenog rhonopegiliranog (Dl lC)hPYY3.36sa mPEG vezanog za ostatak 11.

(a) Izrada ( DUQhPYYy^

[0150](Dl lC)PYY3-36 se sintetiše postupkom čvrste faze korišćenjem Fmoc strategije sa aktivacijom 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametil uronijum heksafluorofosfata (HBTU)

(Fastmoc, 0.15 mmol ciklus) koristeći automatski sintisajzer peptida (model 433A; Applied Biosvstems, Foster City, CA). Kao zaštitne grupe bočnog lanca se koriste Trt za Asn, Gln, Cys i His; tBu za Ser, Thr i Tyr; Boe za Lys; OtBu za Asp i Glu; i Pbf za Arg. Cepanje veze peptiđ-smola se vrši mešavinom od 9mL trifluoroacetatne kiseline (TFA), 0.5 g fenola, 0.5mL H20, 0.5mL tioanizola i 0.25mL 1,2 etanditiola, na sobnoj temperaturi, u toku 4 h. Peptid se istaloži u ledeno hladnom etil etru i ispere sa etil etrom, rastvori u DMSO i prečisti reverzno faznom HPLC na Waters Deltapak C18, 15um, 100A, 50x300mmID koloni (Cat# WAT011801, Waters, Milford, MA) koristeći linearni gradijent od 100% rastvarača A: 0% rastvarača B do 70% rastvarača A : 30% rastvarača B, u toku 30 minuta, pri brzini protoka od 80 mL /min. Rastvarač Aje 0.1% vodeni rastvor TFA (trifluoroacetatne kiseline). Rastvarač Bje 0.1% rastvor TFA u acetonitrilu. Molekularna masa prečišćenog peptida je potvrđena sa ESI-MS (MAvg=4038), a čistoća je ispitana reverzno faznom HPLC (Slika 4).

(b) Izrada linearnog 30K mPEG maleimida ( Dl lQhPYYv«

[0151]Linearni mPEG maleimid reagens od približno 30,000MW (Sunbright ME-300MA, NOF Corporation, Tokyo, Japan) je selektivno udvojen sa (Dl lC)hPYY3.36 na sulfhidril grupi cisteina na ostatku 11. Linearni 30K mPEG maleimid, rastvoren u 20 mM HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7.0 odmah reaguje sa (Dl lC)hPYY3-36 peptidom direktnom adicijom peptida da se dobije peptid u koncentraciji od 1 mg/mL i relativni molarni odnos mPEG: (Dl lC)hPYY3-36

od približno 1:1. Reakcija se izvodi bez prisustva svetla, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5-24

sata. Reakcije se zaustavljaju razblaživanjem sa 20mM natrijum acetatom, pH 4.5, uz trenutno prečišćavanje hromatografij om izmene katjona. Produkti reakcije se ispituju sa SEC-HPLC

(Slika 5).

[0152] Alternativno, umesto rastvaranja linearnog 30K mPEG maleimida u HEPES, kako jc prethodno opisano, rastvori se u 20 mM rastvoru natrijum acetata (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4.5, i odmah reaguje sa (Dl lC)hPYY3.36 peptidom direktnom adicijom peptida da se dobije koncentracija peptida od 1 mg/mL i relativni molami odnos mPEG:(Dl 1 C)hPYY3.36 od približno 1:1. Reakcija se izvodi bez prisustva svetla, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5-24 sata. Reakcije se podvrgnu direkno hromatografij i izmenom jona^Produkti reakcije se ispituju pomoću SEC-HPLC. ; , ... ,

(c) Prečišćavanje linearnog 30K mPEG maleimida ( Dl lQhPYY3^fi

[0153] Pegilirane (Dl lC)hPYY3-36vrste se iz reaktivne mešavine prečiste do >95% u fazi hromatografije izmenom pojedinačnog jona. Mono-pegilirani (Dl lC)hPYY3-36se izdvaja od nemodifikovanog (Dl lC)hPYY3-36 i vrsta sa većom molekulskom težinom pomoću hromatografije izmenom katjona. Tipična reaktivna mešavina linearnog 30KmPEG maleimid (Dl lC)hPYY3.36 (10 mg proteina), kako je prethodno opisano, se razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna mešavina čiji je pH 7.0 se razblaži 7X sa puferom A i prenese u kolonu uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Kolona se ispere sa 5-10 zapremina kolone puferom A. Nakon toga, različite (Dl lC)hPYY3-36 vrste se eluiraju iz kolone u 20 zapremina kolone linearnim NaCl gradijentom od 0-100 mM. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280) a odgovarajuće veličine frakcija se sakupe. Frakcije se grupišu po stepenu pegilacije, kako je utvrđeno pomoću SEC HPLC. Prečišćene grupe se nakon toga koncentruju do 0.5-5 mg/mL u Vivaspin 10K koncentratom (Vivascience Sartorius Group). Koncentracija proteina prečišćene grupe se određuje upoređivanjem RP HPLC oblasti pika sa PYY3-36standardnom krivom (nije pokazana). Prečišćena grupa pegiliranog (Dl lC)hPYY306se profiliše pomoću SEC-HPLC kako je pokazano na Slici 7.

[0154] Alternativno, reakcije na pH 4.5, iz (b) kao gore, se prenesu direktno na kolonu uz brzinu protoka od 2.5 mL/min, a koncentracija prečišćene grupe se određuje apsorpcijom na 280 nm koristeći eksperimentalno dobijen koeficient ekstinkcije.

Primer 3

Račvasti 43K mPEG Maleimid ( E10C) hPYY^ fi

[0155] Ovaj primer pokazuje izradu potpuno homogenog monopegiliranog (E10C)hP YY3_36 sa mPEG vezanim na ostatku 10.

(a) Izrada račvastog 43K mPEG maleimid ( E10C) hPYY?.^

[0156] Račvasti mPEG maleimid reagens od približno 43,000 MVV (Sunbright GL2-400MA, NOF Corporation, Tokyo, Japan) se selektivno udvaja sa (E10C)hPYY3_36, izrađenim kako je opisano u Primerul(a), na sulfhidril grupi cisteina ostatka 10.

[0157] Račvasti 43K mPEG maleimid, rastvoren u 20 mM HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7.0, trenutno reaguje sa (E10C)hPYY3-36peptidom direktnom adicijom peptida da se dobije-koncentracija peptida od 1 mg/mL i relativni molarni odnos mPEG:(E10C)hPYY3-36 od približno 1:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5-24 sata. Reakcije u HEPES, pH 7.0, se-prekidaju razblaživanjem sa 20mM natrijum acetatom, pH ~~' -;

4.5, uz trenutno prečišćavanje hromatografijom izmenom katjona. Produkti reakcije se analiziraju pomoću SEC-HPLC (Slika 8).

[0158]Alternativno, račvasti 43K mPEG maleimid, je rastvoren sa 20mM natrijum acetatom (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4.5, i odmah reaguje sa (E10C)hPYY3-36peptidom direktnom adicijom peptida, da se dobije koncentracija peptida od 1 mg/mL, a relativni molarni odnos mPEG:(E10C)hPYY3.36 je približno 1:1. Reakcije se prenose direktno na ispitivanje hromatografiom izmenom katjona.

(b) Prečišćavanje mono pegiliranog račvastog 43K mPEG maleimid ( E10C) hPYY3I36

[0159]Mono pegilirane račvaste 43KmPEG maleimid (E10C)hPYY3-36vrste se odvoje od nemodifikovanog (E10C)hPYY3.36a vrste većih molekulskih težina se koriste u fazi hromatografije izmenom katjona. Tipična račvasta 43K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36reaktivna mešavina (10 mg proteina), kako je prethodno opisano, sa razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL)(Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivne mešavine sa pH 7.0 se razblaže 10X sa puferom A i prenesu na kolonu uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Kolona se ispere sa 5-10 zapremina kolone sa puferom A. Odmah zatim, različite vrste (E10C)hPYY3.36se eluiraju iz kolone u 20 zapremina kolone linearnim NaCl gradijentom od 0-100 mM. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280) i frakcije odgovarajuće veličine se sakupe. Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, kako se procenjuje pomoću SEC-HPLC. Prečišćene grupe se nakon toga koncentruju do 0.5-5 mg/mL u Centriprep 3 koncentratom (Amicon Technologv Corporation) ili alternativno, korišćenjem Vivaspin 10K koncentratora (Vivascience Sartorius Group). Koncentracija proteina prečišćene grupe se kvantifikuje ispitivanjem amino kiselina. Prečišćena grupa mono pegiliranog račvastog 43 K mPEG maleimid (E10C)hPYY3-36se profiliše korišćenjem SEC-HPLC kako je pokazano na Slici 9.

[0160]Alternativno, koncentracija proteina se određuje upoređivanjem RP HPLC oblasti pika na standardnoj krivoj za PYY3-36(nije pokazano) ili apsorpcijom na 280 nm, korišćenjem eksperimentalno dobijenog koeficijenta ekstinkcije.

Primer 4

[0161]Ovaj primer obuhvata izradu potpuno homogenih monopegiliranih (El 0C)hPYY3.36sa linearnim 12 kD mPEG-om, ili račvastim 20 kD mPEG-om, vezanim za ostatak 10 i obuhvata izradu potpuno homogenih monopegiliranih (Dl lC)hPYY3-36 sa linearnim 20 kD mPEG-om, linearnim 12 kD mPEG, ili račvastim 20 kD mPEG-om, vezanim na ostatku 11.

(a) Izrada linearnog 12K mPEG maleimid ( E10QhPYYvM

[0162]Linearni mPEG maleimid reagens od aproksimativno 12,000 MW (Sunbright ME-120MA, NOF Corporation) je selektivno udvojen sa (E10C)hPYY3_36na sulfhidril grupi cisteina ostatka 10. Linearni 12KmPEG maleimid, rastvoren sa 20mM natrijum acetatom (Sigma Chemical) pH 4.5, odmah reaguje sa (E10C)hPYY3_36peptidom direktnom adicijom peptida da se dobije koncentacija peptida od 1 mg/mL i relativni molarni odnos mPEG:(E10C)hPYY3.36od približno 1:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5 do 24 sata. Reakcije u 20 mM natrijum acetatu, pH 4.5, se prenose direktno na hromatografiju izmenom katjona. Produkti reakcije se procenjuju pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

(b) Prečišćavanje linearnog 12K mPEG maleimid ( E10C) hPYY^ fi

[0163]Pegilirane (E10C)hPYY3_36vrste se iz reaktivne mešavine prečiste do >95% koristeći

fazu hromatografije izmenom pojedinačnog jona. Mono-pegiHrani (E10C)hPYY3-36se izdvaja od slobodnog PEG-a, nemodifikovanog (E10C)hPYY3-36i vrsta veće molekulske težine, koristeći hromatografiju izmenjivača katjona. Tipična reaktivna mešavina linearnog 12K mPEG maleimid (E10C)hPYY3_36(10 mg proteina), kako je prethodno opisano, se razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL)(Amersham Pharmacia Biotech,GE Healthcare) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna mešavna se propusti kroz kolonu uz brzinu protoka od 1.0 mL/min. Kolona se ispere sa 4 zapremine kolone puferom A uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Nakon toga, različite (E10C)hPYY3.36vrste se eluiraju iz kolone u 25 zapremina kolone sa linearnim NaCl gradijentom od 0-200 mM uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280) a frakcije odgovarajuće veličine se sakupe. Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, kako je procenjeno pomoću SEC-HPLC. Prečišćene grupe se nakon toga koncentruju do 0.5-5 mg/mL koristeći Vivaspin 10K koncentrator(Vivascience Sartorius Group). Koncentracija proteina prečišćene grupe se određuje apsorpcijom na 280 nm koristeći eksperimentalno određen koeficijent ekstinkcije. Prečišćena grupa 12K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36se profiliše pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

(c) Izrada račvastog 20K mPEG maleimid ( E10C) hPYY1.ifi

[0164]Račvasti mPEG maleimid reagens od aproksimativno 20,000 MW (Sunbright GL2-200MA, NOF Corporation) je selektivno udvojen sa (E10C)hPYY3_36na sulfhidril grupi cisteina

ostatka 10. Račvasti 20K mPEG maleimid, rastvoren u 20 mM natrijum acetatu (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, odmah reaguje sa (E10C)hPYY3.36peptidom direktnom

adicijom peptida; da sc dobije koncentracija peptida odi mg/mL i realtivni molarni odnos mPEG: (E10C)hPYY3-36od približno 1:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj

temperaturi, u toku 0.5 do 24 sata. Reakcije u 20 mM natrijum acetatu, pH 4.5, se prenesu direktno na hromatografiju izmenom katjona. Produkti reakcije se procenjuju pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE. (d) Prečišćavanje račvastog 20K mPEG maleimid ( E10C) hPYYi.™

[0165] Pegilirane (E10C)hPYY3-36vrste se iz reaktivne mešavine prečiste do >95% koristeći

fazu hromatografije izmenom pojedinačnog jona. Mono-pegilirani (E10C)hPYY3-36se izdvoji od slobodnog PEG-a, nemodifikovanog (E10C)hPYY3.36i vrsta veće molekulske težine koristeći hromatografiju izmenom kajtona. Uobičajena reaktivna mešavina račvastog 20K mPEG

maleimid (E10C)hPYY3-36(10 mg proteina), kako je prethodno opisano, se razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL)(Amersham Pharmacia Biotech,GE Healthcare) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna mešavina se propusti kroz kolonu uz brzinu protoka od 1.0 mL/min. Kolona se ispere sa 4 zapremine kolone puferom A uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Nakon toga, različite (E10C)hPYY3.36vrste se eluiraju iz kolone u 25 zapremina kolone linearnim NaCl gradijentom od 0-200 mM pri brzini protoka od 2.5 mL/min. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280) a frakcije odgovarajuće veličine se sakupe.

Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, kako je procenjeno pomoću SEC-HPLC.

Prečišćena grupa se nakon toga koncentrje do 0.5-5 mg/mL koristeći Vivaspin 10K koncentrator (Vivascience Sartorius Group). Koncentracija proteina prečišćene grupe se određuje apsorpcijom na 280 nm koristeći eksprementalno određeni koeficienat ekstinkcije. Prečišćena grupa 20K mPEG maleimida (E10C)hPYY3.36se profiliše pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

(e) Izrada linearnog 20K mPEG maleimida ( DllQhPYY^

[0166]Linearni mPEG maleimid reagens od aproksimativno 20,000 MW (Sunbright ME-200MA, NOF Corporation) je selektivno udvojen sa (Dl lC)hPYY3-36 na sulfhidril grupi cisteina ostatka 11. Linearni 20K mPEG maleimid, rastvoren u 20 mM natrijum acetatu (Sigma Chemical) pH 4.5, odmah reaguje sa (Dl lC)hPYY3.36 peptidom direktnom adicijom peptida da se dobije koncentracija peptida od 1 mg/mL i relativni molarni odnos mPEG:(Dl lC)hPYY3.36 od približno 1:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5 do 24 sata. Reakcije u 20 mM natrijum acetatu, pH 4.5, se direktno prenose na hromatografiju izmenom katjona. Produkti reakcije se procenjuju pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

(f) Prečišćavanje linearnog 20K mPEG maleimida ( Dl lC) hPYY3-3fi

[0167]Pegilirane (D11 C)hPYY3.36 vrste se prečiste iz reaktivne mešavine do >95% koristeći fazu hromatografije izmenom pojedinačnih jona. Mono-pegilirani (D11 C)hPYY3_36 se odvoji od slobodnog PEG-a, nemodifikovanog (Dl lC)hPYY3_36 i vrsta veće molekulske težine pomoću hromatografije izmenom katjona. Uobičajena reaktivna mešavina 20K mPEG maleimida (Dl lC)hPYY3.36(10 mg proteina), kako je prethodno opisano, se razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL)(Amersham Pharmacia Biotech,GE Healthcare) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna mešavina se propusti kroz kolonu uz brzinu protoka od 1.0 mL/min. Kolona se ispere sa 4 zapremine kolone puferom A uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Nakon toga, različite (Dl lC)hPYY3.36 vrste se izeluiraju iz kolone u 25 zapremina kolone linearnim NaCl gradijentom od 0-200 mM uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280) a frakcije odgovarajuće veličine se sakupe. Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, kako je procenjeno pomoću SEC-HPLC. Prečišćene grupe se nakon toga koncentruju do 0.5-5 mg/mL, koristeći Vivaspin 10K koncentrator (Vivascience Sartorius Group). Koncentracija proteina prečišćene grupe se određuje apsorpcijom na 280 nm koristeći eksperimentalno određeni koeficijent ekstinkcije. Prečišćena grupa 20KmPEG

maleimid (DllC)hPYY3.36se profiliše pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

(g) Izrada linearno<g>12K mPEG maleimid ( Dl 1 C) hPYY3^

[0168]Linearni mPEG maleimid reagens od aproksimativno 12,000 MW (Sunbright ME-

120MA, NOF Corporation) je selektivno udvojen sa (Dl lC)hPYY3.36 na sulfhidril grupi cisteina na ostatku 10. Linearni 12K mPEG maleimid, rastvoren sa 20mM natrijum acetatom (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, odmah reaguje sa (Dl lC)hPYY3.36peptidom direktnom

adicijom peptida da se dobije koncentracija peptida od 1 mg/mL i relativan molarni odnos mPEG:(D 11 C)hPYY3.36od približno 1:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5 do 24 sata. Reakcije u 20 mM natrijum acetatu, pH 4.5, se direktno prenesu na hromatografiju izmenom katjona. Produkti reakcije se procenjuju pomoću SEC-

HPLC ili SDS-PAGE.

(h) Prečišćavanje linearnog 12K mPEG maleimid ( DllC) hPYYyy,

[0169]Pegilirane (Dl lC)hPYY3.36 vrste su prečišćene iz reaktivne mešavine do >95% koristeći fazu hromatografij e izmene pojedinačnih jona. Mono-pegilirani (Dl lC)hPYY3.36 se izdvoji od slobodnog PEG, nemodifikovanog (D11 C)hPYY3.36 i vrsta veće molekulske težine, hromatografijom izmenom katjona. Uobičajena reaktivna mešavina linearnog 12KmPEG maleimid (Dl lC)hPYY3.36 (10 mg proteina), kako je prethodno opisano, se razdvoji na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL)(Amersham Pharmacia Biotech,GE Healthcare) uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna-mešavina se prenese na kolonu uz brzinu protoka od 1.0 mL/min. Kolona se ispere sa 4 zapremine kolone puferom A uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Nakon toga, različite (Dl lC)hPYY3.36 vrste se eluiraju iz kolone u 25 zapremina kolone linearnog NaCl gradijenta od 0-200 mM, uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280) a frakcije odgovarajuće veličine se sakupe. Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, što se procenjuje pomoću SEC-HPLC. Prečišćene grupe se nakon toga koncentruju do 0.5-5 mg/mL koristeći Vivaspin 10K koncentrator (Vivascience Sartorius Group). Koncentracija proteina prečišćene grupe se određuje apsorpcijom na 280 nm koristeći eksperimentalno određen koeficijent ekstinkcije. Prečišćena grupa 12K mPEG

maleimid (Dl lC)hPYY3.36 se profiliše pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

(i) Izrada račvastog 20K mPEG maleimid ( Dl lC) hPYY3. ¥

[0170] Račvasti mPEG maleimid reagens od aproksimativno 20,000 MW (Sunbright GL2-200MA, NOF Corporation) je selektivno udvojen sa (Dl lC)hPYY3.36 na sulfhidril grupi cisteina ostatka 10. Račvasti 20K mPEG maleimid, rastvoren u 20 mM rastvoru natrijum acetata (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4.5, odmah reaguje sa (Dl lC)hPYY3.36 peptidom direktnom adicijom peptida, da se dobije koncentracija peptida od 1 mg/mL i relativni molarni odnos mPEG: (Dl lC)hPYY3.36 od približno 1:1. Reakcije se izvode bez prisustva svetlosti, na sobnoj temperaturi, u toku 0.5 do 24 sata. Reakcije u 20 mM rastvoru natrijum acetata, pH 4.5, se direktno prenesu na hromatografiju izmenom katjona. Produkti reakcije se procene pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

( i) Prečišćavanje račvastog 20K mPEG maleimid ( Dl lC) hPYY3:3fi

[0171] Pegilirane (Dl lC)hPYY3.36 vrste se prečiste iz reaktivne mešavine do >95% koristeći

fazu hromatografije izmenom pojedinačnih jona. Mono-pegilirani (Dl lC)hPYY3.36 je izdvojen od slobodnog PEG, nemodifikovanog (Dl lC)hPYY3.36 i vrsta veće molekulske težine pomoću hromatografije izmenom katjona. Tipična reaktivna mešavina račvastog 20K mPEG maleimid (Dl lC)hPYY3.36 (10 mg proteina), kako je prethodno opisano, je razdvojena na SP-Sepharose Hitrap koloni (5 mL)(Amersham Pharmacia Biotech. GE Healthcare), uravnoteženoj sa 20 mM natrijum acetatom, pH 4.5 (Pufer A). Reaktivna mešavina se propusti kroz kolonu uz brzinu protoka od 1.0 mL/min. Kolona se ispere sa 4 zapremine kolone puferom A uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Nakon toga, različite (Dl lC)hPYY3.36 vrste se eluiraju iz kolone u 25 zapremina kolone linearnim NaCl gradijentom od 0-200 mM, uz brzinu protoka od 2.5 mL/min. Eluant se prati apsorpcijom na 280 nm (A280), a frakcije odgovarajuće veličine se sakupe. Frakcije se grupišu prema stepenu pegilacije, kako je procenjeno pomoću SEC-HPLC. Prečišćene grupe se

nakon toga koncentruju do 0.5-5mg/ mL,pomoću Vivaspin 10K koncentratora(VivasGience— Sartorius Group):-Koncentracija proteina prečišćene grupe je određena apsorpcijom na 280"nrn koristeći eksperimentalno određen koeficijent ekstinkcije. Prečišćena grupa račvastog 20K ..

mPEG maleimid (Dl lC)hPYY3.36je profilisana pomoću SEC-HPLC ili SDS-PAGE.

Primer 5

Biohemiiska karakterizacija

[0172] (E10C)hPYY3.36, (Dl lC)hPYY3-36 i pegilirani oblici (E10C)hPYY3.36i (Dl lC)hPYY3.36 se karakterišu različitim biohemijskim postupcima, uključujući elektrosprej masenu spektrometriju (ESI-MS), SDS-PAGE i SEC HPLC i RP HPLC, tim redom.

(A) Elektrosprej jonizaciona masena spektrometrija (ESI-MS) se izvodi na 1100 serija LC/MSD elektrosprej masenom spektrometru (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) u pozitivnom

modalitetu (Primer l(a), 2(a)).

(B) Reverzno fazna hromatografij a za analizu (E10C)hPYY3-36peptida (Slike 1 i 4) se izvodi na ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6X150mm, 5mm koloni (Cat # 993967-906, Agilent

Technologies, Palo Alto, CA) koristeći linearni gradijent od 100 % rastvarač A, 0 % rastvarač B do 95% rastvarač A , 5% rastvarač B u toku 3 minuta, a nakon toga od 95 % rastvarač A, 5 % rastvarač B do 50% rastvarač A, 50% rastvarač B u toku 12 minuta uz brzinu protoka od 1.5 ml/minut (Primer 1 (a)). Rastvarač A je 0.1% vodeni rastvor TFA. Rastvarač Bje 0.1% rastvor TFA u acetonitrilu. Reverzno fazna hromatografij a za kvantifikaciju pegiliranog (E10C)hPYY3_

36i (Dl 1C)PYY3.36 (nije pokazana) se izvodi na Vydac Cl8 (2.1x250 mm) koloni (Cat # 218MS552, Vydac, Hesperia, CA) koristeći linearni gradijent od 80% rastvarač A, 20%

rastvarač B do 40% rastvarač A, 60% rastvarač B u toku 48 minuta uz brzinu protoka od 0.2 mL/minut. (Primer 1C, 2C). Rastvarač A je 0.1% vodeni rastvor TFA. Rastvarač B je 0.085% rastvor TFA u acetonitrilu.

(C) Veličina izdvajanja visoko efikasnom tečnom hromatografij om (SEC-HPLC)

Reaktivne mešavine linearnog 30K ili račvastog 43 K mPEG ili sa (E10C)hPYY3_36ili

(Dl lC)hPYY3-36 , njihove grupe dobijene prečišćavanjem na izimenjivačima katjona i finalni prečišćeni produkti se ispituju pomoću ne-denaturisane SEC-HPLC (Primer l(b) i (c), 2(b) i (c)). Analairtička ne-denaturisana SEC-HPLC se izvodi koristeći Shodex KW804 ili TSK G4000PWXL (Tosohaas) u 20 mM rastvoru fosfata, pH 7.4, 150 mM NaCl, pri brzini protoka od 1.0 mL/minut (opciono Superdex 200 7.8 mm X 30 cm, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). Pegilacija znatno povećava hidrodinamičku zapreminu proteina što za rezultat ima promenu u ranijem vremenu.retencije. U reaktivnim mešavinama 30K mPEG malehjiidaplus (E10C)hPYY3-36 dobijeni mali pik je u korelaciji sa ostatkom nemodifikovanog (E10C)hPYY3-36, kao i novi pikovi koji su u saglsnosti sa pegiliranim vrstama peptida (Slika 2). Nove vrste su

dobijene u reaktivnim mešavinama 30K mPEG (Dl lC)hPYY3-36i račvastog 43K mPEG (E10C)hPYY3-36sa veoma malo preostalog nemodifikovanog (Dl lC)hPYY3_36 ili (E10C)hPYY3-36(Slike 5 i 8). Ove pegilirane i ne-pegilirane vrste se razdvoje SP-Sepharose hromatografij om, a dobijene prečišćene mono mPEG (E10C)hPYY3.36i mPEG (Dl lC)hPYY3.36 vrste se nakon toga u javljaju u eluatu kao pojedinačni pik na ne-denaturisanoj SEC čistoće>

95%, (Slike 6, 7 i 9). Faza SP-Sepharose hromatografije efikasno uklanja slobodne mPEG, (E10C)hPYY3.36ili (D11 C)hPYY3.36 i vrste većih molekulskih težina iz monopegiliranog 30K i račvastog 43K mPEG(E 10C)hPYY3.36 ili mPEG (Dl lC)hPYY3.36-

(D) SDS PAGE

SDS-PAGE (Primer 1 (c)) se takođe koristi za procenu reakcije, prečišćavanja frakcija izmenom

katjona, (Slika 3) i konačnih prečišćenih produkata. SDS-PAGE se izvodi na 1 mm debelim 10-NuPAGE gelovima (Invitrogen, Carlsbad, CA) pod uslovima redukcije i ne-redukcije i obojenih pomoću Novex Colloidal Coomassie™ G-250 kita za bojenje(Invitrogen, Carlsbad, CA).

Biološke analize

[0173] Korist agonista PYY iz ovog pronalaska kao farmaceutski aktivnih sredstava za

smanjenje porasta težine i u tretmanu gojaznosti kod sisara (posebno ljudi), može da se pokaže aktivnošću agonista u uobičajenim analizama i niže opisanimin vi troiin vivoispitivanjima. Ovakva ispitivanja takođe obezbeđuju način kojima se aktivnost agonista PYY iz ovog pronalaska može da uporedi sa aktivnostima poznatih jedinjenja.

Studije unosa hrane

[0174] Ispitivanje ponovnog uzimanja hrane nakon gladovanja: C57BL/6J mužjaci miševa (The Jackson Laboratorv, Bar Harbor, ME) se smeste po 2 u kavezu. Čuvaju se u ciklusu dan : noć 12:12 (dan od 5:00 pre podne do 5 .00 posle podne), hrane se peletiranom RMH3000 Purina hranom za glodare (Research Diets, Inc., Nevv Brunsvvick, NJ), a vodu uzimaju po potrebi. Miševi su stari 7-8 nedelja i ostave da se prilagode 10 dana pre studije. Na dan studije, miševi su stari 9-12 nedelja. Dan pre početka studije, miševi se prenesu u kaveze sa svežom prostirkom i bez hrane, ali im se ostavi slobodan pristup vodi. Ostave se bez hrane u toku noći (20-24 sata). Na dan studije, miševima se dozira IP injekcija (zapremina doze = 5 mL/kg),-vrate se^i svojeTcaveze, a prethodno odmerena hrana im se odmah unese u kavez. Vehikulum koji se koristi za doziranje je. 20 mM rastvOr Na acetata, pH 4.5, 50 mM rastvor NaCl a doza se izračunava-za aktivni PYY entitet bez pegilacije. Ispituju se kontrolni vehikulum, nativni PYY, 30K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36 i 43K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36u tri doze (0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg i 1.0 mg/kg). Hrana se ponovo izmeri na 2, 4, 6, i 24 sata nakon doziranja. Prostirka se proverava na rastur hrane, koji se meri i uključuje u izračunavanja. Kumulativno unošenje hrane se izračunava sabiranjem težine hrane u svakoj tački vremena od početka merenja hrane. Procenat (%) inhibicije se izračunava na sledeći način: (Fltretman - Flvehikulum)/Flvehikulum<*>100.

[0175]Slika 10 pokazuje 6-časovno kumulativno unošenje hrane nakon IP injekcije tri doze nativnog PYY3.36(Slika 10A) i 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3-36(Slika 10B). Oba, i nativni PYY3.36i 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36pokazuju smanjenje u kumulativnom unošenju hrane u toku 6 sati, u zavisnosti od doze.

[0176]43K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36takođe dovodi do smanjenja kumulativnog unošenja hrane u toku 6 sati (Slika 11 A) i u toku 24 sata (Slika 11 B) u zavisnosti od doze. Međutim, efekat 43K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36na smanjenje kumulativnog unošenja hrane nije toliko veliki u poređenju sa 30KmPEG maleimid(E10C)hPYY3.36sa istom dozom (0.1 mg/kg) i nakon 6 sati i nakon 24 sata.

[0177]Efekti 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.3g na ponovno unošenje hrane nakon gladovanja, nakon injekcije od 0.1 mg/kg (SC) je takođe upoređen sa efektima 30K maleimid(Dl lC)hPYY3.36. Dok 30K mPEG maleimid (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid dovodi do redukcije kumulativnog unošenja hrane (FI) u stoku 24 sata ispitivanja, kako je pokazano u niže datoj tabeli, efekat nije tako veliki kako se očekuje za 30K maleimid(E10C)hPYY3.36.

[0178]Efekti linearnog 20K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36se upoređuju sa 30K mPEG maleimiđ(E 10C)hPYY3.36 (oba iz Primera 1). U jednoj studiji, u kojoj je doza od 0.1 mg/kg (IP) injekcirana mužjacima miša, rezultati su kako je pokazano u niže datoj taoeli.

[0179]Slično tome, u drugoj studiji u kojoj su poređeni efekti uzimanja linearnog 20K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36, 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36, nakon doze od 0.1 mg/kg (SC), rezultati su kako je pokazano u niže datoj tabeli.

[0180]Ispitivanje spontanog unosa hrane:C57BL/6J mužjaci miševa (The Jackson

Laboratorv) se pojedinačno zatvore u kavez i ostave 2 nedelje da se prilagode pre studije. Drže se na ciklusu dan/noć, 12/12, hrane se usitnjenom hranom po želji i imaju slobodan pristup vodi. Dan pre doziranja, miševi se prenesu u komore za unos hrane i ostave 1 dan za prilagođavanje. Narednog dana, miševima se daju doze IP ili subkutanom (SC) injekcijom neposredno pre gašenja svetla (4:00 posle podne). Unos hrane se automatski prati u intervalima od 10 minuta u toku celog tretmana, a telesna težina se meri svakog dana. Rezultati su pokazani za IP injekciju nativnog PYY3.36i 30K mPEG maleimid (E10C)hPYY3.36(Slika 12) i za SC injekciju nativnog PYY3.36i 30K PEG maIeimid(E10C)hPYY3-36(Slika 13). Dok oba, i nativni PYY3.36i 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36dovode do trenutnog smanjenja kumulativnog unosa hrane u poređenju sa miševima tretiranim vehikulumom, efekat smanjenja unosa hrane izazvan sa 30K

mPEG maleimid(E10C)hPYY3.3ćtraje mnogo duže nego efekat do koga dovodi nativni PYY3.36. Zajedno sa efektom mnogo dugotrajnijeg unosa hrane, 30K mPEG ma leimid(E10C)hPYY3-36

takođe pokazuje produženo prisustvo u plazmi nakon jedne injekcije (0.1 mg/kg, IP) (Slika 14). Dok nativni PYY3-36ima brzinu klirensa od 16 ml/min/kg i Cmaxod 38 nM, 30K mPEG

maleimid(E10C)hPYY3-36ima brzinu klirensa od 0.2 ml/min/kg i Cmax267 nM. Vrednosti PYY

u plazmi miševa se mere korišćenjem kita za radioimuno ispitivanje hPYY (Linco Research,

Inc., St. Louis, MO).

[0181]Ispitivanje mini- pumpi sa ob/ ob miševima:Mužjaci ob/ob miševa (The Jackson Laboratorv), stari 8-9 nedelja (n=26), se održavju na normalnoj hrani i implatiraju im se 14-dnevne osmotičke mini-pumpe (Alza Corp., Mountain View, CA) kojima se primenjuju ili vehikulum (fiziološki rastvor), PYY3.36(0.1 mg/kg/dan), ili 30K PEG maleimid(E10C)hPYY3-36(0.03 mg/kg/dan). Težina hrane i telesna težina se mere svakoga dana. Kompozicija telesne masnoće se određuje na dan 0 i na dan 13. Uzorci krvi su uzeti na kraju studije. Nisu pokazane značajne razlike u unosu hrane, telesnoj težini ili kompoziciji telesne masnoće za ove grupe. Sadržaj PYY u plazmi je određen na završetku studije radioimunoispitivanjem, kako je prethodno opisano. U grupi tretiranoj nativnim PYY3_36, izmerene vrednosti PYY u plazmi su 15±2 ng/ml; u grupi tretiranoj sa 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36, vrednosti PYY u plazmi su 132±22 ng/ml.

Studije vezivanjain vitro

SPA za vezivanje liganda:

[0182]SPA za merenje vezivanja liganda kompetitivnom zamenom radioobeleženog PYY iz Y2 receptora i korišćenjem mikrosfera koje sadrže scintilant (SPA perlice) obložene sa lecitinom aglutinina klice pšenice (WGA) dobijenim od Amersham Biosciences (Cat. No. RPNQ 0085). Suspenzije KAN-TS humanih neuroblastoma ćelija u kojima se na površini pojavljuju Y2 receptori (Fuhlendorf i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 182-186, 1990) se pripremaju pomoću pufera za sakupljanje ćelija sačinjenog od 50 mM Hepes pufera (pH 7.4), 145 mM

NaCl, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukoze, 0.1% BSA, 5% DMSO i Roche inhibitora proteaze. SPA ispitivanja se vrše u formatu sa 96 otvora u triplikatu koristeći 50, 000

ćelije/otvor,<125>I-PYY (40,000 cpm/ otvor) i SPA perlice (0.5mg/otvor) u puferu za ispitivanje sačinjenom od 50mM Hepes pufera, pH 7.4, lmM MgCl2, 2.5mM CaCl2, 0.1% (m/v) BSA, 0.025% (m/v) bacitracina i 0.025% natrijum azida. Test ligandi u različitim koncentracijama (0.032 do 500nM) se dodaju u mešavinu za ispitivanje koja se nakon toga inkubira 16-24h, na sobnoj temperaturi, uz mućkanje. Ploče se ostave da stoje jedn sat, a nakon toga broje na MicroBeta® Trilux detektoru (Perkin Elmer, Boston, MA). Rezultati za hPYY3-36 i 30K mPEG maleimid(E 10C)hP YY3.36 Primera T su pokazani na SI ići 15

Ispitivanje vezivanja GTPvf<35>Sl za NPY Y2R receptore

[0183] Ispitivanje funkcionalnosti je ispitivanje vezivanja GTPy [<35>S] koje se izvodi u NEN Flash pločama (format sa 96 otvora). Membrane su izrađene od KAN-TS ćelija, kako su opisali Bass i saradnici, Mol. Pharm. 50: 709-715, 1990. Ispitivanje vezivanja GTPy [ S] se izvodi u FlashPlate™ formatu sa 96 otvora u duplikatu, koristeći 100 pM GTPy [<35>S] i 10 ug membrane po otvoru u puferu za ispitivanje sačinjenom od 50 mM Tris HC1, pH 7.4, 3 mM MgCl2, pH 7.4, 10 mM MgCl2,20 mM EGTA, 100 mM NaCl, 5 uM GDP, 0.1 % albumina seruma govečeta i sledećih inhibitora proteaze: 100 u.g/mL bacitracina, 100 ue/mL benzamidina, 5 ug/mL aprotinina, 5 p.g/mL leupeptina. Mešavina za ispitivanje se nakon toga inkubira sa povećanjem koncentracije test jedinjenja (kriva izrađena sa 6 tačaka koncentracije; log razblaženja u rasponu od 10-<12>M do 10-<5>M) u toku 60 min, na 30° C. FlashPlates™ se nakon toga 10 minuta centrifugiraju na 2000Xg. Stimulacija vezivanja GTPy [<35>S] se nakon toga kvantifikuje koristeći Microbeta™ detektor. Izračunavanja EC50i suštinske aktivnosti se vrše pomoću Prism proizvođača Graphpad. Rezultati za hPYY3.36 i 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36Primera 1 su pokazani na Slici 16. Vrednosti EC50za 30K mPEG maleimid(E10C)hPYY3.36i 20KmPEG maleimid(E10C)hPYY3.36Primera 1 su uporedive (na primer, 4.3 nM i 4.6 nM kada su mereni u istoj analizi).

LISTING SEKVENCI

[0184]

Claims (23)

1. Polipeptid (E10C)nPYY3-36, naznačen time što ima amino kiselinu sekvence IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID No.:3] ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

2. Polipeptid (Dl lC)hPYY3-36 naznačen time što ima amino kiselinu sekvence IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQ ID No.:4] ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

3. Konjugat, naznačen time što uključuje polietilen glikol (PEG) i polipeptid (E10C)hPYY3-36ili (DllC)hPYY3.36.

4. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 3, naznačen time što ima Formulu 3 gde je PEG metoksi PEG i linearan je ili račvast i ima prosečnu molekulsku težinu u rasponu od približno 1 kD do 50 kD, Lje grupa formule -0(CH2)pNHC(0)(CH2)r- u kojoj su svaki p i r nezavisno ceo broj od 1 do 6, ili je L grupa formule -NHC(0)(CH2)s- u kojoj je s ceo broj od 1 do 6, i -SR je polipeptid (E10C)hPYY3-36ili (Dl lC)hPYY3-36 u kojima je S atom sumpora tiol grupe cisteina. .

5. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačen time što je mPEG linearan.

6. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačen time što ima Formulu 4 • - gde je n ceo broj u rasponu od približno 600 do 750, a -SR je polipeptid (El 0C)hPYY3.36u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina.

7. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačen time što ima Formulu 4 gde je n ceo broj u rasponu od približno 375 do 525, a -SR je polipeptid (E10C)hPYY3.38u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina.

8. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačen time što (OCH2CH2),, radikal ima prosečnu molekulsku težinu od približno 20 kD.

9. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačen time što ima Formulu 4 gde je n ceo broj u rasponu od približno 600 do 750, a -SR je polipeptid (Dl lC)hPYY3.3o u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina.

10. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili patentnim zahtevom 9, naznačen time što (OCFbCFk),! radikal ima prosečnu molekulsku težinu od približno 3 0 kD. ---

11. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačen time što je mPEG račvast.

12. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačen time što je mPEG glicerol-račvast.

13. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačen time što ima Formulu 5 gde je svaki m aproksimativno isti i predstavlja ceo broj u rasponu od približno 450 do 500, a - SR je (E10C)hPYY3-36polipeptid u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina.

14. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačen time što ima Formulu 5 gde je svaki m isti i predstavlja ceo broj u rasponu od približno 450 do 500, a -SR je (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina.

15. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 13 ili patentnim zahtevom 14, naznačen time što svaki (OCFbCFb),!! radikal ima prosečnu molekulsku težinu u rasponu od približno 20 kD do 22 kD.

16. Glicerol-račvasti 43k mPEG maleimid (El 0C)hPYY3-36konjugat, naznačen time što ima — Formulu 5 - - - --- • gde je svaki m aproksimativno isti a -SR je (E10C)hPYY3.36polipeptid u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

17. Glicerol-račvasti 43kmPEG maleimid (D11 C)hPYY3.36 konjugat, naznačen time što ima Formulu 5 gde je svaki m aproksimativno isti, a -SR je (Dl lC)hPYY3.36 polipeptid u kome je S atom sumpora tiol grupe cisteina, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

18. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje polipeptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, ili konjugat u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 3-17 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač.

19. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 18, naznačena time što dalje uključuju drugo sredstvo koje je sredstvo protiv gojaznosti.

20. Upotreba polipeptida u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, ili konjugata u skladu sa bilokojim patentnim zahtevom 3-17, ili njegove farmaceutski prihvatljive^ soli u proizvodnji medikamenta za lečenje gojaznosti ili stanja prekomerne telesne težine kod sisara ili za inhibiciju povećanja težine, za redukciju unošenja hrane ili za redukciju unošenja kalorija kod sisara.

21. Polinukleotid, naznačen time što enkodira polipeptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2.

22. Monoklonalno antitelo, naznačeno time što se specifično vezuje za polipeptid koji uključuje amino kiselinu sekvence kako je pokazano u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4.

23. Monoklonalno antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 22, naznačeno time što je navedeni polipeptid pegiliran na cistein ostatku.