TWI650136B - 具有ＫＳＰ－抑制劑的抗體藥物接合物（ＡＤＣｓ） - Google Patents

具有ＫＳＰ－抑制劑的抗體藥物接合物（ＡＤＣｓ） Download PDF

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Abstract

本申請案係關於新穎的抗體藥物接合物(ADC)，這些ADC之活性代謝物，用於製備這些ADC之方法，這些ADC用於治療及/或預防疾病的用途，以及這些ADC用於製備醫藥品供治療及/或預防疾病，特別是過度增生及/或血管新生病症，例如癌症疾病的用途。此等治療可作為單一治療或另外與其他醫藥品或另外的治療方法組合來進行。

Description

具有KSP-抑制劑的抗體藥物接合物(ADCs)
本發明係關於紡錘體驅動蛋白(kinesin spindle protein)抑制劑之抗體藥物接合物(ADC)，這些ADC之活性代謝物，用於製備這些ADC的方法，這些ADC用於治療及/或預防疾病的用途，以及這些ADC用於製備醫藥品供治療及/或預防疾病，特別是過度增生及/或血管新生病症，例如癌症疾病的用途。此等治療可為單一治療或另外與其他醫藥品或另外的治療方法組合。
癌症疾病為不受控制的細胞在各種組織中生長之結果。在許多情況下這些新細胞深入現存的組織(侵入性生長)，或其轉移至遠端器官。癌症疾病發生於廣泛的各種器官中，且通常具有疾病之組織特異性過程。因此，「癌症疾病」名稱為一通稱，係描述一大群不同器官、組織和細胞類型之該定義疾病。
早期的腫瘤能以手術和放射線治療方法來移除。轉移的腫瘤一般僅可藉由化療劑給予減緩性治療。該情況下之目標係以達到改善生活品質和延長剩餘生命期之最適組合。
具有一或多個活性化合物分子之結合蛋白的接合物已為所知，特別是，其中一對抗腫瘤-相關抗原之內化抗體係經由一連接子與細胞毒性劑共價連接的抗體藥物接合物(ADC)形式。在將ADC導入腫瘤細胞後及後續與接合物解離，細胞毒性劑本身或由其所形成的細胞毒性代謝物在腫瘤細胞內釋放並可在其中直接或選擇性展現其作用。以此方式，與習用的化療相反，以明顯較狹窄的限制牽制對正常細胞的傷害[參見，例如J.M.Lambert,Curr. Opin.Pharmacol. 5,543-549(2005)；A.M.Wu and P.D.Senter,Nat.Biotechnol. 23,1137-1146(2005)；P.D.Senter,Curr.Opin.Chem.Biol. 13,235-244(2009)；L.Ducry and B.Stump,Bioconjugate Chem. 21,5-13(2010)]。因此，WO2012/171020描述了其中多數個帶毒體(toxophor)分子經由一聚合物連接子與一抗體相連接之ADC。就可能的帶毒體，WO2012/171020提及了，其中包括，物質SB 743921、SB 715992(Ispinesib)、MK-0371、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。
最後提到的物質為紡錘體驅動蛋白抑制劑。紡錘體驅動蛋白(KSP，亦稱為Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)為一種類驅動蛋白之動力蛋白，其為雙極有絲分裂紡錘體運作上所必須。抑制KSP導致有絲分裂停止且，經過一段相當長的期間，導致細胞凋亡(Tao等人，Cancer Cell 2005 Jul 8(1),39-59)。在首次發現的細胞穿透性KSP抑制劑Monastrol之後，KSP抑制劑本身已確立為一種新穎的化療劑(Mayer等人，Science 286：971-974,1999)，且其為許多專利申請案之主體(例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；和WO03/049527)。然而，因為KSP僅於有絲分裂階段期間在一段相當短的時間內展現其作用，因此KSP抑制劑必須在這些初始階段期間以夠高的濃度存在。
在此背景下，本發明之目標係提供在以相當低的濃度給藥後，展現細胞凋亡作用且可因此有利於癌症治療之物質。
為了達成此目標，本發明係提供具有一或多個活性化合物分子之結合子或其衍生物的接合物，該活性化合物分子為經由一連接子與結合子相連接之紡錘體驅動蛋白抑制劑(KSP抑制劑)。結合子較佳的為結合子蛋白或胜肽，特佳地，人類、人源化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段，特別是抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段，或抗-EGFR抗體或其抗原結合片段。特佳的係給予專一與TWEAKR的位置47胺基酸D(D47)結合之抗 -TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAKR抗體TPP-2090，或抗-EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)或尼妥珠單抗(nimotuzumab)。
本發明人已發現許多種連接結合子與KSP抑制劑之方法，用以達成上文所提及之目標。
根據本發明，紡錘體驅動蛋白抑制劑可具有下列之基礎結構I(sub)： 其中#a係代表連接分子其餘部份之鍵；R1a 係代表H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要係經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要係經-NH2 取代；R2a 和R4a 相互獨立地係代表H,-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 和R4a 共同代表(形成吡咯啶環)-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、NH2 、COOH、SO3 H、SH或OH，及其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基。
根據本發明，紡錘體驅動蛋白抑制劑可經由連接子藉由在R1a 、R2a 、R4a 或R10 之氫原子取代作用與結合子相連結。
與此結合子(或KSP抑制劑，因為常常有一個以上的KSP抑制劑與結合子相連接)連結之抑制劑，較佳地為下式(Ia)或(IIa)之化合物： 其中R1a 係代表H、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 和R4a 相互獨立地係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 和R4a 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要係經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要係經-NH2 取代，及Y5 係代表H 或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；R3a 係代表-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基或雜環烷基基團，較佳地C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵素化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘而Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R8a 係代表C1-10 -烷基或-(CH2 )0-2 -(HZ2 )，其中HZ2 係代表4-至7-員雜環，其具有至高二個選自N、O和S組成之群的雜原子；HZ係代表單-或雙環雜環，其可經一或多個由下列組成之群中選出的取代基取代：鹵素、C1-10 -烷基基團、C6-10 -芳基基團和C6-10 -芳烷基基團其視需要可經鹵素取代；其中-MOD係代表-(NR10 )n-(G1)o-G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO- 或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及 G2係代表一直鏈及/或支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中MOD基團較佳地係具有至少一個-COOH基；其中紡錘體驅動蛋白抑制劑係藉由在R1a 、R2a 、R3a 、R4a 、R8a 或R10 之氫原子取代作用，或視需要經由一HZ取代基，特別是經由R1a 、R2a 、R3a 、R4a 或R10 ，與連接子相連結，及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C (以X1 代表CH，X2 代表C及X3 代表N為較佳)；R1 係代表H、-L-#1、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 係代表-L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH，或OH；其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；、R4 係代表-L-#1、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中 R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-#1、-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳地-L-#1或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘而Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-#1、H、NH2 、NO2 、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、CF3 、-OCF3 、-CH2 F、-CH2 F、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基、NO2 、NH2 、COOH或鹵素(特別是F、Cl、Br)，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或-(CH2 )0-2 -(HZ2 )，其中HZ2 係代表4-至7-員雜環，其具有至高二個選自N、O和S組成之群的雜原子，其 中各基團可經-OH、CO2 H或NH2 或-L-#1取代；其中有1個或無任何R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 取代基係代表或(就R8 的情況)含有-L-#1，L係代表連接子及#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵，其中-MOD係代表-(NR10 )n-(G1)o-G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基；G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO- 或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及G2係代表直鏈及/或支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地係具有至少一個-COOH基；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
本發明之接合物可具有化學上易分解之連接子、酵素易分解的連接子或穩定的連接子。特佳的係給予穩定的連接子及可被細胞溶解酶(cathepsin)裂解之連接子。
本發明進一步係提供用於製備本發明接合物之方法，以及用於製備之前驅物和中間物。
製備本發明之接合物規則上係包括下列步驟： (i)製備一連接子前驅物，其視需要帶有保護基及具有一反應性基團能與結合子偶合；(ii)將連接子前驅物與視需要帶有保護基之低分子量KSP抑制衍生物接合(較佳地KSP抑制劑具有基礎結構I(sub)，特佳地式(Ia)及特別是式(IIa)之基礎結構，其中在這些化學式中仍未與連接子鍵結)，得到一視需要帶有保護基之反應性KSP抑制劑/連接子接合物；(iii)移除存在KSP抑制劑/連接子接合物中的任何保護基及(iv)將結合子與KSP抑制劑/連接子接合物接合，得到本發明之結合子/KSP抑制劑接合物。
反應性基團的連接亦可在視需要經保護的KSP抑制劑/連接子前驅接合物建構後進行。
依照連接子，琥珀醯亞胺-連接的ADC可，在接合後，根據流程26轉變成具有有利的穩定特性之開鏈的琥珀醯胺。
如上所說明，連接子前驅物與低分子量KSP抑制劑之接合可藉由在基礎結構I(sub)中的R1a 、R2a 、R4a 或R10 或式(Ia)中的R1a 、R2a 、R3a 、R4a 、R8a 或R10 ，或式(IIa)中的R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 或R10 之氫原子取代作用，以連接子來進行。在這些合成步驟中，在接合前，任何存在的功能性基團亦可以保護的形式存在。在接合步驟之前，藉由已知的胜肽化學方法移除這些保護基。接合可藉由各種路徑以化學方法來進行，如實例中流程7至31的示例方法所示。特言之，視需要可修飾用於接合連接子之低分子量KSP抑制劑，例如藉由導入保護基或離去基來促進取代作用。
特言之，本發明係提供可視需要與結合子接合之新穎的低分子量KSP抑制劑。這些KSP抑制劑或其結合子接合物具有下列通式(IIIa)： 其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C(以X1 代表CH，X2 代表C及X3 代表N為較佳)；R1 係代表H,-L-BINDER,-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 係代表-L-BINDER、H、-MOD、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH，或OH；其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或 -(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；R4 係代表-L-BINDER、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y3 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表-L-BINDER、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-BINDER、-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳地-L-BINDER，或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘而Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH (其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-BINDER,、H、NH2 、NO2 、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、CF3 、-OCF3 、-CH2 F、-CH2 F、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或-(CH2 )0-2 -(HZ2 )，其中HZ2 係代表4-至7-員雜環，其具有至高二個選自N、O和S組成之群的雜原子(較佳地氧呾)，其中各基團可經-OH、CO2 H或NH2 或-L-BINDER取代；其中L係代表連接子，及BINDER係代表結合子或其衍生物，其中結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連接，其中最多一個R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 代表基係代表-L-結合子；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基、NO2 、NH2 、COOH或鹵素(特別是F、Cl、Br)。
其中-MOD係代表-(NR10 )n-(G1)o-G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基；G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代 表-NHCO-或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及G2係代表直鏈及/或支鏈烴基基團其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、 苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地具有至少一個-COOH；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
本發明之詳細說明
本發明係提供具有一或多個活性化合物分子之結合子或其衍生物之接合物，該活性化合物分子為一經由連接子L與結合子相連接之紡錘體驅動蛋白抑制劑(KSP抑制劑)。
本發明之接合物係以下列通式表示
其中BINDER係代表結合子，較佳地抗體，L係代表連接子，KSP係代表KSP抑制劑，m係代表1至2之數字，較佳地1，及n係代表1至50之數字，較佳地1.2至20，及特佳地2至8。本處，m為每個連接子之KSP抑制劑數目而n為每個接合劑(BINDER)之KSP抑制劑/連接子接合物之數目的平均。因此存在接合物中的所有KSP之總和為m和n之乘積。KSP-L較佳地係具有如上所示之式(I)或(II)。結合子較佳地為結合子胜肽或蛋白，例如抗體。再者，連接子較佳地係與結合子胜肽或蛋白或其衍生物之不同胺基酸相連接。特佳的係與結合子的不同半胱胺酸殘基結合。
無任何限制，可組合使用之根據本發明可使用的結合子、根據本發明可使用的KSP抑制劑及根據本發明可使用的連接子，係描述於下。特言之，在各情況下較佳或特佳地所代表的結合子可與在各情況下較佳或特佳地所代表的KSP抑制劑組合使用，或視需要與在各情況下較佳或特佳地所代表 的連接子組合。
KSP抑制劑及其結合子接合物
低分子量KSP抑制劑已為所知，例如由WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；和WO03/049527。
一般而言，KSP抑制劑係具有下列基礎結構I(sub)： 其中#a係代表與分子其餘部份連接之鍵；R1a 係代表H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 和R4a 相互獨立地係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 和R4a 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、NH2 、COOH、SO3 H、SH或OH，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH， 其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基。
特別常遇到的為下列基礎結構II(sub) 其中#a、R1a 、R2a 、R4a 具有如同I(sub)中之相同意義，且R12a 和R13a 係代表H或R12a 和R13a 共同(形成哌啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、NH2 、COOH、SO3 H、SH或OH；其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代。
特言之，許多地KSP抑制劑係具有基礎結構II(sub)，其中R1a 、R2a 、R4a 、R12a 和R13a 係代表H。
根據本發明，可使用基礎結構I(sub)或基礎結構II(sub)之KSP抑制劑。依照本發明可使用的KSP抑制劑亦包括，例如伊斯平斯(ispinesib)(Cytokinetics/GSK)、MK-0731(Merck)、AZD4877(AstraZeneca)、ARRY-520(Array BioPharma)和ARQ 621(ArQule)。
依照本發明較佳的KSP抑制劑係具有下列基本結構：式(I)： 其中R1a 係代表H、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 和R4a 相互獨立地係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 和R4a 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、SH或OH，，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，R3a 係代表-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基或雜環烷基基團，較佳地C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3 個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘和Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R8a 係代表C1-10 -烷基；HZ係代表單-或雙環雜環，其可經一或多個由下列組成之群中選出的取代基取代：鹵素、C1-10 -烷基基團、C6-10 -芳基基團和C6-10 -芳烷基基團其可視需要經鹵素取代；其中-MOD係代表-(NR10 )n-(G1)o-G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO-或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及G2係代表直鏈及/或支鏈烴基基團，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經 -NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地具有至少1個-COOH基；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
根據本發明，此一紡錘體驅動蛋白抑制劑可藉由在R1a 、R2a 、R3a 、R4a 、R8a 或R10 之氫原子取代作用或視需要經由其中一個HZ之取代基，特別是經由R1a 、R2a 、R3a 、R4a 或R10 ，與連接子相連接。
式(I)之取代基較佳地係具有下列意義，其中這些較佳的意義較佳地係彼此組合：R1a 較佳地係代表H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 和R4a 相互獨立地較佳地係代表H、-COCHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 和R4a 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代而Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基。
R3 較佳地係代表視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團、較佳地-L-#1或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可視需要經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘而Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)。
R8a 較佳地係代表C1-10 -烷基。
HZ較佳地係代表單-或雙環雜環，其可經一或多個由下列組成之群中選出的取代基取代：鹵素、C1-10 -烷基基團、C6-10 -芳基基團和C6-10 -芳烷基基團其可視需要經鹵素取代。
在本發明內文中(亦即上式中以及下式中)C1-10 -烷基係代表具有1至10個碳原子之直鏈或支鏈烷基。可提及較佳的實例有：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、1-甲基丙基和第三丁基。
在本發明內文中C6-10 -芳基-係代表單-或雙環芳香同素環，例如苯基和萘基。
在本發明內文中C6-10 -芳烷基基團係代表單環芳香同素環，例如連接一C1-C4-烷基基團之苯基。示例的C6-10 -芳烷基基團為苯甲基。
在本發明內文中C5-10 -雜芳基係代表具有6至10個環原子之單-或雙環芳香雜環，其中該(等)環係含有一或二個由N、O、S、SO和SO2 組成之群中 選出的環雜原子且其係經由環碳原子或視需要環氮原子相連接。可提及的實例有吡啶基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、噻吩基、苯硫基、異唑基、異噻唑基、1,2,3-二唑基、呋呫基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、嗒基、吡咯基、三基、吲哚基、喹啉基、喹唑基、1,3-苯并二氧雜環戊烯、異吲哚基、吲唑基、1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶基、苯并三唑基、異喹啉基、辛啉基(cinolinyl)、呔基、喋啶基、奈啶基、苯并咪唑啉基、苯并噻唑啉基、苯并唑啉基、3,4-伸甲基二氧苯基及苯并[6]呋喃基。
在本發明內文中單-或雙環雜環係代表具有總計5至10個碳原子之單-或雙環雜環，其中該(等)環係含有1至3個由N、O、S、SO和SO2 組成之群中選出的環雜原子且其係經由環碳原子或視需要環氮原子相連接。可提及的實例有哌啶基、吡咯啉基、嗎福啉基、3,4-伸甲基二氧苯基和四氫呋喃基、 在本發明內文中鹵素原子係代表F、Cl、Br或I。
藉由在基礎結構I(sub)或基礎結構中II(sub)之R1a 、R2a 、R4a 或R10 ，或式(I)中HZ之R1a 、R2a 、R3a 、R4a 、R8a 或R10 的氫原子取代作用，式(I)化合物可以熟習一般技術者已知的方式與連接子相連結。特佳地，氫原子之取代作用係發生在R1a 、R2a 、R3a 、R4a 或在R2a 和R4a 所形成的吡咯啶環。此接合可藉由各種路徑以化學方法來進行，如實例中流程7至31的示例方法所示。特言之，視需要可修飾用於接合連接子之低分子量KSP抑制劑，例如藉由導入保護基或離去基來促進取代作用(使得在反應中該離去基，且並非氫原子，係經連接子取代)。以此方式得到的KSP抑制劑-連接子分子(其中連接子具有一反應性基團供與結合子偶合)然後可與結合子反應，得到本發明之結合子接合物。在實驗部份，此製程係以示例的方式藉由大量的實例來說明。
就R1a 較佳的為H、-COOH、-CONHNH2 、-(CH2 )1-3 NH2 、-CONZ“(CH2 )1-3 NH2 和-CONZ“CH2 COOH，其中Z“係代表H或NH2 。
就R2a 和R4a 較佳的為H，或R2a 和R4a 共同(形成一吡咯啶環)係代表CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H。
就R3a 較佳的為C1-10 -烷基-，其可經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n -烷基、SO2 -NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2 或NH2 取代(其中烷基較佳地為C1-3 -烷基)。
就R8a 較佳的為支鏈C1-5 -烷基基團，較佳地甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、1-甲基丙基和第三丁基。
就HZ較佳的為單-或雙環雜環，其可經一或多個由下列組成之群中選出的取代基取代：鹵素、C1-10 -烷基基團、C6-10 -芳基基團和C6-10 -芳烷基基團其可視需要經鹵素取代。
特佳地，HZ為經取代之吡咯、吡唑、咪唑、喹唑啉或二氫喹唑啉，其在鄰位(相對於R1a等取代基)上經視需要經取代之苯甲基基團取代。再者，經取代之吡咯、吡唑、咪唑或喹唑啉較佳地可經側氧(就二氫喹唑啉之情況)或經1或2個鹵素原子取代的苯基基團取代。特佳地，HZ為經取代之吡咯。
使用上較佳的KSP抑制劑為伊斯平斯(ispinesib)。另外較佳的KSP抑制劑為Arry-520。
其他特佳的化合物係具有下式(IIa)或(II)： 其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表N而X3 係代表C；(以X1 代表CH，X2 代表C，及X3 代表N為較佳)；R1 係代表H、-L-#1、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 係代表-L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；R4 係代表-L-#1、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH； 其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-#1、-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團、較佳地C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團其視需要係經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3 O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH((CH2 CH2 O)1-20 H)基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘和Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地為C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-#1、H、-MOD、NH2 、NO2 、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、CF3 、-OCF3 、-CH2 F、-CH2 F、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基、NO2 、NH2 、COOH或鹵 素(特別是F、Cl、Br)，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或-(CH2 )0-2 -(HZ2 )，其中HZ2 係代表4-至7-員雜環，其具有至高二個選自N、O和S組成之群的雜原子(較佳地氧呾)，其中各基團可經-OH、CO2 H或NH2 或L-#1取代；其中有1個或無任何R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 取代基係代表(或就含有R8 之情況)-L-#1,L係代表連接子及#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵，R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；其中-MOD係代表-(NR10 )n -(G1)o -G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO-或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及G2係代表a直鏈及/或支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中MOD基團較佳地係具有至少1個-COOH基；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
式(II)：
其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C R1 係代表H、-L-#1或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 和R4 相互獨立地係代表H、-L-#1、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、-L-#1、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ， 其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團、較佳地-L-#1或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表H、F、NH2 、NO2 、鹵素、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟 化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基或鹵素，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
藉由在R1 、R2 、R3 、R4 、R5 或R8 或在R2 和R4 所形成的吡咯啶環(R10 )之氫原子取代，以一般技術者已知的方式，其中並無任何R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 取代基係代表-L-#1之式(IIa)或(II)化合物，可與連接子相連結。由此得到式(IIa)或(II)之接合物，其中一個R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 或R10 取代基係代表-L-#1，L係代表連接子而#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵。若式(IIa)或(II)之KSP抑制劑係與結合子接合，則其中一個R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 或R10 取代基因此係代表-L-#1，其中L係代表連接子而#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵。此項在接合物的情況下其中一個R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 取代基係代表-L-#1，其中-L-#1係與結合子接合，例如抗體。特佳地，其中一個R1 和R3 取代基係代表-L-#1。此結合子較佳地為人類、人源化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段，特別是抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段或抗-EGFR抗體或其抗原結合片段。特佳地係給予專一與TWEAKR的位置47胺基酸D(D47)結合之抗-TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAKR抗體TPP-2090，或抗-EGFR抗體西妥昔單抗或尼妥珠單抗。
取代-L-#1，-L-#3基團亦可能存在化合物中，其中L係代表連接子而#3係代表與結合子或其衍生物結合之反應性基團。包括-L-#3之化合物為與結合子或其衍生物反應之反應性化合物。#3較佳地為與胺基或硫醇基反應形成一共價鍵之基團，較佳地與蛋白中的半胱胺酸。蛋白中的半胱胺酸殘基當然可自然存在蛋白中，或可藉由生化方法導入，或較佳地可藉由之前還原結合子的二硫化物來產生。
式(IIa)或(II)化合物，其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R10 取代基之一係代表-L-#1且其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C為特佳的，特別是該等其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N。特佳的係給予其中X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N之化合物。
就A，較佳的係給予CO(羰基)。
就R1 較佳的為-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2 、-(CH2 )1-3 NH2 、-CONZ“(CH2 )1-3 NH2 和-CONZ“CH2 COOH，其中Z“係代表H或NH2 。
就R2 和R4 較佳的為H、-L-#1，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H或-L-#。
就R3 較佳的為-L-#1或C1-10 -烷基-，其可視需要經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n -烷基、SO2 -NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2 或NH2 取代(其中烷基較佳地為C1-3 -烷基)。
就R5 較佳的為-L-#1、H或F。
就R6 和R7 ，相互獨立地，較佳的為H、(視需要氟化)C1-3 -烷基、(視需要氟化)C2-4 -烯基、(視需要氟化)C2-4 -炔基、羥基或鹵素。
就R8 較佳的為支鏈C1-5 -烷基基團，特別是式-C(CH3 )2 -(CH2 )0-2 -Ry 之基團，其中Ry 係代表-H、-OH、CO2 H、NH2 或-L-#1。特佳的係給予式-C(CH3 )2 -(CH2 )-Ry 之基團，其中Ry 係代表-H或-L-#1。
就R9 較佳的為H或F。
特佳的係給予式(IIa)或(II)之化合物，其中有1個或無任何R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 取代基係代表-L-#1，及其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C A係代表CO(羰基)；R1 係代表H、-COOH、-CONHNH2 、-(CH2 )1-3 NH2 、-CONZ“(CH2 )1-3 NH2 和-CONZ“CH2 COOH，其中Z“係代表H或NH2 ；R2 和R4 係代表H或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H或-L-#1；R3 係代表苯基基團，其可經鹵素(特別是F)或視需要氟化C1-3 -烷基單-或多取代，或係代表視需要氟化C1-10 -烷基基團其視需要可經-OY4 、-SY4 、-O-CO-Y4 、-O-CO-NH-Y4 、NH-CO-Y4 、-NH-CO-NH-Y4 、S(O)n -Y4 (其中n係代表0、1或2)、-SO2 -NH-Y4 、NH-Y4 或N(Y4 )2 取代，其中Y4 係代表H、苯基(視需要經鹵素(特別是F)或視需要氟化C1-3 -烷基單-或多取代)，或烷基(其中烷基基團可經-OH、-COOH及/或-NHCO-C1-3 -烷基取代且其中烷基較佳地係代表C1-3 -烷基)；其中特佳地R3 可經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n -烷基、SO2 -NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2 或NH2 取代(其中烷基較佳地係指C1-3 -烷基)R5 係代表H或F；R6 和R7 相互獨立地係代表H、(視需要氟化)C1-3 -烷基、(視需要氟化)C2-4 -烯基、(視需要氟化)C2-4 -炔基、羥基或鹵素；R8 係代表支鏈C1-5 -烷基基團；及 R9 係代表H或F。
再者，較佳的係當(單獨或組合)●R1 係代表-L-#1,COOH或H，●R2 和R4 相互獨立地係代表-L-#1或H或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H或-L-#1，●A係代表CO，●R3 係代表-(CH2 )OH、-CH(CH3 )OH、-CH2 SCH2 CH(COOH)NHCOCH3 、-CH(CH3 )OCH3 、苯基基團其可經1-3個鹵素原子、1-3個胺基基團或1-3個烷基基團取代(其可視需要鹵素化)，或係代表-L-#1，●R5 係代表-L-#1或H，●R6 和R7 相互獨立地係代表H、C1-3 -烷基或鹵素；特別是R6 和R7 係代表F；●R8 係代表C1-4 -烷基(較佳地第三丁基)；及/或●R9 係代表H，●其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R10 取代基之一係代表-L-#1時。
另外，根據本發明較佳的係當●R1 係代表-L-#1、COOH或H，●R2 和R4 相互獨立地係代表-L-#1或H或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H或-L-#1，●A係代表CO，●R3 係代表-(CH2 )OH、-CH(CH3 )OH、-CH2 SCH2 CH(COOH)NHCOCH3 、-CH(CH3 )OCH3 、苯基基團其可經1-3個鹵素原子、1-3個胺基基團或1-3個烷基基團取代(其可視需要鹵素化)，或係代表-L-#1，●R5 係代表-L-#1或H，●R6 和R7 相互獨立地係代表H、C1-3 -烷基或鹵素；特別是，R6 和R7 係代表F； ●R8 係代表C1-4 -烷基(較佳地第三丁基)；及●R9 係代表H，●其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R10 取代基之一係代表-L-#1時。
其他特佳的化合物係具有下式(IIIa)或(III)： 其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C(以X1 代表CH，X2 代表C而X3 代表N為較佳)；R1 係代表H、-L-BINDER、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH3 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、-COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代； R2 係代表H、-L-BINDER、-MOD、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R4 係代表H、-L-BINDER、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表-L-BINDER、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-BINDER、-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳地-L-#1或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3 O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、 -CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-BINDER、H、NH2 、NO2 、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、CF3 、-OCF3 、-CH2 F、-CH2 F、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基、NO2 、NH2 、COOH或鹵素(特別是F、Cl、Br)，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或-(CH2 )0-2 -(HZ2 )，其中HZ2 係代表4-至7-員雜環，其具有至高二個選自N、O和S組成之群的雜原子，其中各基團可經-OH、CO2 H或NH2 或-L-BINDER取代；R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；其中-MOD係代表-(NR10 )n -(G1)o -G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO-或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一直鏈及/或支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、 -NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地具有至少1個-COOH基；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
就式(IIIa)之KSP抑制劑的結合子接合物之情況，最多一個R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 代表基(另一種選擇，其中一種上述所給予的狀況)可代表-L-BINDER，其中L係代表連結子而BINDER係代表結合子或其衍生物，其中結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連結。
其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C，或X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C，或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C；R1係代表-L-BINDER、H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、 COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH；其中W係代表H或OH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 和R4 相互獨立地係代表-L-BINDER、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2)0-3 Z，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-BINDER或視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳地-L-#1，或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2)0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2)0-3 Z‘，及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH (其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-BINDER、H、F、NH2、NO2 、鹵素、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中L係代表連接子而BINDER係代表結合子或其衍生物，其中結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連接，R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基或鹵素，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
再者，根據本發明較佳的係給予下列KSP抑制劑及其結合子接合物： 其中X1 、X2 、X3 具有如同式(IIIa)或(III)中之相同意義(其中較佳地X1 係代表CH、X2 係代表C而X3 係代表N)，R1 、R2 、R4 、R5 、R6 、R7 、R8 和R9 具有如同式(IIIa)或(III)中之相同意義，A係代表CO，B係代表一單鍵，-O-CH2 -或-CH2 -O-和R20 係代表NH2 、F、CF3 或CH3 ，及n係代表0、 1或2。
其中X1 、X2 、X3 具有如同式(IIIa)或(III)中之相同意義(其中較佳地X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N)，A、R1 、R3 、R6 、R7 、R8 和R9 具有如同式(IIIa)或(III)中之相同意義，A較佳地係代表CO而R3 係代表-CH2 OH、-CH2 OCH3 、CH(CH3 )OH或CH(CH3 )OCH3 。
其中X1 、X2 、X3 具有如同式(IIIa)或(III)中之相同意義(其中較佳地X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N)，A、R3 、R6 、R7 、R8 和R9 具有如同式(IIIa)或(III)中之相同意義，其中A較佳地係代表CO而R3 係代表-CH2 -Sx -(CH2 )0-4 -CHY5 -COOH，其中x為0或1而Y5 係代表H或NHY6 ，其中Y6 係代表H或-COCH3 。
式(IIIe)： 其中X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N，A、R3 、R6 、R7 、R8 和R9 具有如同式(IIIa)或(III)中之相同意義而R1 係代表-L-BINDER。
再者，較佳的為在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)化合物中(單獨或組合)：●Z係代表Cl或Br；●R1 係代表-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-CO-NY1 Y2 ，其中Y2 係代表-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘而Y1 係代表H、NH2 或-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z’；●Y1 係代表H，Y2 係代表-(CH2 CH2 O)3 -CH2 CH2 Z‘而Z‘係代表-COOH；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘而Z‘係代表-(CONHCHY4 )2 COOH；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘，Z‘係代表-(CONHCHY4 )2 COOH而其中一個Y4 基係代表異丙基而其他的為-(CH2 )3 -NHCONH2 ；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘，Z‘係代表-(CONHCHY4 )2 COOH而其中一個Y4 基係代表-CH3 而其他的為-(CH2 )3 -NHCONH2 ；●Y4 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代；●至少一個Y4 代表基係由異丙基和-CH3 組成之群中選出；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘，Z‘係代表-CONHCHY4 COOH而Y4 係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；●Y4 係代表胺基苯甲基；●R2 係代表-(CH2 )0-3 Z而Z係代表-SY3 ； ●R4 係代表-CO-CHY4 -NHY5 而Y5 係代表H；●R4 係代表-CO-CHY4 -NHY5 而Y5 係代表-CO-CHY6 -NH2 ；●Y4 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代。
再者，較佳的為在式(IIa)或(IIIa)中R1 、R2 或R3 係代表-MOD時，特別是當R4 係代表-L-#1或-L-BINDER時(特別是當-L為一可裂解的連接子時，其在-N-R4 或-N-L-#1或-L-BINDER直接裂解，使得R4 或L被H置換)。
特佳地R3 係代表-MOD而R1 或R4 係代表-L-#1或-L-BINDER，其中-MOD係代表-(NR10 )n -(G1)o -G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO-或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一直鏈及/或支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地具有至少1個-COOH基；特佳地，-MOD基團係具有(較佳地端點)-COOH基團，例如在一甜菜鹼基中。較佳地，-MOD基團係具有式-CH2 -Sx -(CH2 )0-4 -CHY5 -COOH，其中x為0或1，及Y5 係代表H或NHY6 ，其中Y6 係代表H或-COCH3 。
其他特佳的化合物係具有下式(IV)： 其中X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；R1 係代表-L-BINDER、H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 和R4 相互獨立地係代表-L-BINDER、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-BINDER、視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜 環烷基基團或-CH2 -Sx -(CH2 )0-4 -CHY5 -COOH，其中x為0或1，及Y5 係代表H或NHY6 ，其中Y6 係代表H或-COCH3 ，較佳地-L-BINDER或一C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-BINDER、H、F、NH2 、NO2 、鹵素、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中L係代表連接子而BINDER係代表結合子或其衍生物，其中該結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連接，R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基或鹵素，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類；其限制條件為R1 、R2 和R4 不能同時代表H。
再者，較佳的為在式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)中(單獨或組合)：●Z係代表Cl或Br；●R1 係代表-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-CO-NY1 Y2 ，其中Y2 係代表-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘而Y1 係代表H、NH2 或-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘；●Y1 係代表H，Y2 係代表-(CH2 CH2 O)3 -CH2 CH2 Z‘而Z‘係代表-COOH；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘而Z‘係代表-(CONHCHY4 )2 COOH；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘，Z‘係代表-(CONHCHY4 )2 COOH且一個Y4 代表基係代表異丙基而其他係代表-(CH2 )3 -NHCONH2 ；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘，Z‘係代表-(CONHCHY4 )2 COOH且一個Y4 代表基係代表-CH3 而其他係代表-(CH2 )3 -NHCONH2 ；●Y4 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代；●至少一個Y4 代表基係由異丙基和-CH3 組成之群中選出；●Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘，Z‘係代表-CONHCHY4 COOH且一個Y4 代表基係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；●Y4 係代表胺基苯甲基；●R2 係代表-(CH2 )0-3 Z而Z係代表-SY3 ；●R4 係代表-CO-CHY4 -NHY5 而Y5 係代表H；●R4 係代表-CO-CHY4 -NHY5 而Y5 係代表-CO-CHY6 -NH2 ；●Y4 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代。
再者較佳的係給予式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)或(IV)之化合物其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；或 X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表N而X3 係代表C；(以X1 代表CH，X2 代表C及X3 代表N為較佳)；R1 係代表H、-L-#1或-L-BINDER、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH3 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；R4 係代表H；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-#1或-L-BINDER、-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳地C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、 1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH((CH2 CH2 O)1-20 H)基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地為C1-10 -烷基)；R5 係代表H、-MOD、NH2 、NO2 、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、CF3 、-OCF3 、-CH2 F、-CH2 F、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基、NO2 、NH2 、COOH或鹵素(特別是F、Cl、Br)，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基或(視需要氟化)C4-10 -環烷基；其有1個或無任何R1 和R3 取代基係代表-L-#1或-L-BINDER，L係代表連接子而#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵，而BINDER係代表結合子，R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；其中-MOD係代表-(NR10 )n -(G1)o -G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO-或，則R10 不代表NH2 )； n為0或1；o為0或1；及G2係代表一直鏈及/或支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地具有至少1個-COOH基；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
再者較佳的係給予式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)或(IV)之化合物，其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH或CF，X2 係代表N而X3 係代表C；(以X1 代表CH，X2 代表C而X3 代表N為較佳)；R1 係代表H、-L-#1或-L-BINDER、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH3 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代； R2 係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；R4 係代表H；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-#1或-L-BINDER、-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳地C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH((CH2 CH2 O)1-20 H)基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地為C1-10 -烷基)；R5 係代表H、-MOD、NH2 、NO2 、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、CF3 、-OCF3 、-CH2 F、-CH2 F、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或 -(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H或鹵素(特別是F、Cl、Br)，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基；其中有1個或無任何R1 和R3 取代基係代表-L-#1或-L-BINDER，L係代表連接子，#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵，及BINDER係代表結合子，R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；其中-MOD係代表-CH2 -Sx -(CH2 )0-4 -CHY5 -COOH其中x為0或1，及Y5 係代表H或NHY6 ，其中Y6 係代表H或-COCH3 ，及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
再者較佳的係給予下列之化合物，其可視需要與酸，例如三氟乙酸共同存在。這些化合物可經由相當於R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 之位置，特別是R1 和R3 ，經由連接子與結合子相連接(其中一氫原子係經連接子取代)：N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-甲基丁醯胺(1：1)；N-(3-胺基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；(15S,19R)-15-胺基-19-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-羥乙醯基-20,20-二甲基-14-側氧-4,7,10-三-13,18-二氮二十一-1-酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基 -L-鳥胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-4-胺基-L-苯丙胺酸；N-{(1R)-1-[1-(3-胺基苯甲基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-胺基丙基)-2-羥基乙醯胺(1：1)；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸；N-[(3S)-3-胺基-4-肼基-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)；N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二胺基丁基]-2-羥基乙醯胺(1：1)；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸；(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯胺(2：1)；(1-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸；N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)；4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺(2：1)；N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)； L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)；L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)；N-(3-胺基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-[4-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)苯基]-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺；S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-[4-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)苯基]-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺； S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸；S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-L-半胱胺酸；S-{1-[6-(2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)-6-側氧己基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四-16-氮雜十六-1-醯基]-R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸；S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四-16-氮雜十六-1-醯基]-R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基} 高半胱胺酸；S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)己醯基]胺基}乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-L-半胱胺酸；N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-D-丙胺醯基)-L-離胺酸；N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2 -{N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸；N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸；N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-L-離胺酸；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲氧基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2,4-二氟苯甲醯胺； N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙醯胺；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸；(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯胺；4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸； N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-絲胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-丙胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}甘胺酸；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲醯胺；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙醯胺；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺；4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-氧代丁酸甲酯；4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-氧代丁酸；(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基]-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二氧雜-7,10,13,16-四-3,19-二氮雜二十一烷-1-酸； 4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺；N-乙醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-L-半胱胺酸；N-乙醯基-S-[2-([3-(L-丙胺醯基胺基)丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-側氧乙基]-L-半胱胺酸；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氫呋喃-2-甲醯胺；3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)丙酸；S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸；4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺；4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
根據本發明特佳的係給予下列式V、VI和VII之化合物，其中R1 、R2 、R3 、R4 和R5 具有上述所提及之意義(如所提及，例如式(IIa)或(IIIa))：
特佳的係給予式V、VI、VII之化合物，其中R1 和R係代表H或-L-#1；R2 和R4 相互獨立地係代表-L-#1或H，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，R10 係代表H或-L-#1；及R3 係代表CH2 OH、CH(CH3 )OH或-L-#1，其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R10 取代基之一係代表-L-#1。特佳的為對應的式VI化合物。
連接子
文獻中揭示了各種將有機分子與結合子，例如抗體共價偶合(接合)之選項(參見，例如K.Lang和J.W.Chin.Chem.Rev. 2014 ,114 ,4764-4806,M.Rashidian等人.Bioconjugate Chem. 2013 ,24 ,1277-1294)。根據本發明較佳的係給予KSP抑制劑經由抗體半胱胺酸殘基的一或多個硫原子(其為已存在 作為游離硫醇或由雙硫橋還原所產生)，及/或經由抗體離胺酸殘基的一或多個NH基團相連接之接合物。然而，亦可能經由酪胺酸殘基，經由麩醯胺酸殘基，經由非天然胺基酸殘基，經由游離羧基或經由抗體的糖殘基，連接KSP抑制劑與抗體。就偶合，係使用連接子。連接子可分類成可在活體內裂解的連接子群族和活體內穩定的連接子群族(參見L.Ducry和B.Stump,Bioconjugate Chem. 21 ,5-13(2010))。可在活體內裂解的連接子具有一可在活體內裂解的基團，其中，進而可區分出在活體內可化學性裂解之基團和在活體內可酵素性裂解的基團。「活體內可化學性裂解」及「活體內可酵素性裂解」係指連接子或基團在循環中為穩定的且僅在標的細胞中可被其中化學上或酵素上不同的環境所裂解(低pH；升高的麩胱甘肽濃度；溶酶體酵素的存在，例如細胞溶解酶或纖維蛋白溶酶(plasmin)，或糖苷酶例如，ß-葡萄糖醛酸酶)，因而釋放低分子量KSP抑制劑或其衍生物。活體內可化學性裂解的基團有，特別是雙硫基、腙、縮醛和縮醛胺；活體內可酵素性裂解的基團有，特別是2-8-寡肽基團，特別是二肽基團或糖苷。胜肽裂解位置係揭示於Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869，和Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8(1998 )3341-3346以及Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626中。這些包括，例如，纈胺酸-丙胺酸、纈胺酸-離胺酸、纈胺酸-瓜胺酸、丙胺酸-離胺酸和苯丙胺酸-離胺酸(視需要帶有另外的醯胺基團)。
活體內穩定的連接子係以高穩定性來區分(在血漿中24小時之後低於5%代謝物)且不具有上述之活體內可化學性或酵素性裂解的基團。
連接子-L-較佳地係具有下列(i)至(iv)的基本結構之一：
(i)-(CO)m -SG1-L1-L2-
(ii)-(CO)m -L1-SG-L1-L2-
(iii)-(CO)m -L1-L2-
(iv)-(CO)m -L1-SG-L2其中m為0或1；SG為活體內(化學性或酵素性)可裂解的基團(特別是雙硫 基、腙、縮醛和縮醛胺；或可被細胞溶解酶或纖維蛋白溶酶裂解的2-8-寡肽基團)，SG1為寡胜肽基團或較佳地二肽基團，L1相互獨立地係代表活體內穩定的有機基團，而L2係代表結合子之偶合基團或一單鍵。本處，偶合較佳地係與結合子的半胱胺酸殘基或離胺酸殘基結合。另一種選擇，偶合可與酪胺酸殘基、麩醯胺酸殘基或與結合子之非天然胺基酸結合。非天然胺基酸可含有，例如醛或酮基(例如甘胺酸甲酯或疊氮或炔基基團(參見Lan & Chin,Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins,Chem.Rev.2014,114,4764-4806)。
根據本發明特佳的係給予基本的連接子結構(iii)，特別是當結合子為一抗-TWEAKR抗體或抗-EGFR抗體時。經由代謝，投予具有基本連接子結構(iii)和偶合連接子與結合蛋白之半胱胺酸或離胺酸殘基的本發明接合物，產生了下式之半胱胺酸或離胺酸衍生物： 其中L1在各情況下係與低分子量KSP抑制劑連接，例如式(I)、(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)。
根據本發明特佳的亦給予基本的連接子結構(ii)和(iv)，特別是當連接係在位置(iii)，特別是當L1基團具有下列結構之一時：(a)-NH-(CH2 )0-4- (CHCH3 )0-4 -CHY5 -CO-Y7 ，其中Y5 係代表H或NHY6 ，其中Y6 係代表H或-COCH3 ，及Y7 係代表一單鍵或-NH-(CH2 )0-4 -CHNH2 -CO-，使得裂解後得到對應的結構-NH-(CH2 )0-4- (CHCH3 )0-4 -CHY5 -COOH或-NH-(CH2 )0-4- (CHCH3 )0-4 -CHY5 -CO-NH-(CH2 )0-4 -CHNH2 -COOH。(b)-CH2 -Sx -(CH2 )0-4 -CHY5 -CO-，其中x為0或1，及Y5 係代表H或NHY6 ，其中Y6係代表H或-COCH3 ，使得裂解後得到對應的結 構-CH2 -Sx -(CH2 )0-4 -CHY5 -COOH。
當L1在各情況下係與低分子量KSP抑制劑，例如式(I)、(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)之化合物，特別是在位置R4 相連接時，此實施例為較佳的。結合子較佳地為抗-TWEAKR抗體或抗-EGFR抗體。
若連接子係與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基相連接，則L2較佳地係衍生自與半胱胺酸的硫氫基反應之基團。這些包括鹵基乙醯基、馬來醯亞胺、吖環丙烷、丙烯醯基、芳基化合物、乙烯碸、吡啶基二硫化物、TNB硫醇及二硫化物還原劑。這些基團一般係以親電子方式與硫氫鍵反應，形成硫化物(例如硫醚)或雙硫橋。較佳的係給予穩定的雙硫橋。較佳地L2為 其中#1 係指與結合子之硫原子的連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及 R22 係代表COOH、COOR、COR、CONHR、CONR2 (其中R在各情況下係代表C1-3 -烷基)、CONH2 ，較佳地COOH。
就L2特佳的為： 或其中#1 係指與結合子之硫原子的連接點，#2 係指與活性化合物的連接點，x係代表1或2，而R22 係代表COOH、COOR、COR、CONHR(其中R在各情況下係代表C1-3 -烷基)、CONH2 ，較佳地COOH。當x=1及R22 係代表COOH時為較佳的。
在本發明之接合物或本發明之接合物的混合物中，連接結合子的半胱胺酸殘基之鍵係存在達較佳地80%以上，特佳地90%以上的程度(在各情況下係以連接子與結合子之連接鍵的總數為基準)，特佳地為式A3或A4二種結構之一。本處，式A3或A4之結構一般係共同存在，較佳地，以結合子之連接鍵的數目為基準，比率係從60：40至40：60。則其餘的鍵係以下列結構存在
根據本發明，L1較佳地係以下式代表#1 -(NR10 )n -(G1)o -G2-#2 其中R10 係代表H、NH2 或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或；(若G1係代表NHCO或，則R10 較佳地不為NH2 )n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基，其且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、-C(NH)NRy -、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx 係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，及/或3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳 地)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-，及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、 -NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2較佳地係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-、-CRx =N-O-(其中Rx 係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，及3-至10-員，例如5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中包括側鏈之烴基鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2中的其他插入基團，較佳地有 其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基。
本處，#1 為連接KSP抑制劑之鍵，而#2 為連接偶合基團與結合子之鍵(例如L2)。
伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團之直鏈或支鏈烴基一般係包括具有所述之個別碳原子數目的α,ω-二價烷基。可提及較佳的實例有：伸甲基、乙-1,2-二基(1,2-伸乙基)、丙-1,3-二基(1,3-伸丙基)、丁-1,4-二基(1,4-伸丁基)、戊-1,5-二基(1,5-伸戊基)、己-1,6-二基(1,6-伸己基)、庚-1,7- 二基(1,7-伸庚基)、辛-1,8-二基(1,8-伸辛基)、壬-1,9-二基(1,9-伸壬基)、癸-1,10-二基(1,10-伸癸基)。然而，烴基鏈中的伸烷基基團亦可為支鏈，亦即上述直鏈伸烷基基團的一或多個氫原子可視需要經C1-10 -烷基基團取代，因此形成側鏈。烴基鏈可進一步含有環狀伸烷基基團(環亞烷基)，例如1,4-環亞己烷或1,3-環亞戊烷。這些環狀基可為不飽和的。特言之，芳香基團(伸芳基基團)，例如伸苯基，可存在烴基基團中。反過來，環狀伸烷基基團和伸芳基團，一或多個氫原子可視需要經C1-10 -烷基基團取代。以此種方式，形成視需要的支鏈烴基鏈。此烴基鏈具有總計0至100個碳原子，較佳地1至50個，特佳地2至25個碳原子。
側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
烴基鏈可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-基團及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO- 或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)。
G2中另外的插入基團較佳地有
較佳地，此連接子係相當於下式：§-(CO)m-L1-L2-§§其中m為0或1；§係代表連接活性化合物之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，及L1和L2具有上述所給予之意義。
特佳地，L1具有式-NR11 B-，其中R11 係代表H或NH2 ；B係代表-[(CH2 )x -(X4 )y ]w-(CH2 )z -，w=0至20；x=0至5；x=0至5；y=0或1；z=0至5；及 X4 係代表-O-、-CONH-、-NHCO-或。
本發明較佳的連接子L係具有下式： 其中#3係代表連接活性化合物分子之鍵，#4係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，R11 係代表H或NH2 ；B係代表-[(CH2 )x -(X4 )y ]w -(CH2 )z -,w=0至20；x=0至5；y=0或1；z=1至5；及 X4 係代表-O-、-CONH-、-NHCO-或。
在式(I)或(II)之接合物中上述的連接子為特佳的，其中該連接子係藉由在R1 的氫原子取代或在R4 與可裂解的連接子SG1組合相結合，亦即R1 係代表-L-#1或R4 係代表-SG1-L-#1，其中#1係代表連接結合子之鍵。
根據本發明較佳的係進一步給予下列之連接子：在本發明之接合物或本發明接合物之混合物中，連接結合子的半胱胺酸殘基之鍵係存在，達到較佳地80%以上，特佳地90%以上的程度(在各情況下係以連接子與結合子之連接鍵的總數為基準)，特佳地為式A5或A6二種結構之一：
其中#1 係指與結合子之硫原子的連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及R22 係代表COOH、COOR、COR、CONHR(其中R在各情況下係代表C1-3-烷基)、CONH2 ，較佳地COOH。
本處，式A5或A6之結構一般係共同存在，較佳地，以結合子之連接鍵的數目為基準，比率係從60：40至40：60。則其餘的鍵係以下列結構存在
連接半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基之其他連接子-L-係具有下式： 其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，m為0、1、2或3；n為0、1或2；p為0至20；及L3係代表 其中o為0或1；及G3 係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-及3-至10-員(較佳地5-至10-員)芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
在上式中，較佳地m為1；p為0；n為0；及L3係代表 其中o為0或1；及G3 係代表-(CH2 CH2 O)s (CH2 )t (CONH)u CH2 CH2 O)v (CH2 )w -，其中s、t、v和w各自相互獨立地為0至20而u為0或1。
在上式§-(CO)m-L1-L2-§§中，較佳的L1基團為下列基團，其中r在各情況下相互獨立地係代表0至20之數字，較佳地0至15，特佳地1至20，特佳地2至10：
進一步的L1實例係如表C中所示，其中此基團係以方框標示。
連接子基團L1的實例係如下表A和A‘所示。此表進一步陳述哪些L2基團與這些L1實例為較佳組合，以及較佳的結合點(R1 -R5 )和較佳的m值，其在L1前面是否有羰基基團(參照§-(CO)m-L1-L2-§§)。這些連接子較佳地係與半胱胺酸殘基結合。第1欄進一步係陳述其中使用該所述的連接子之西妥昔單抗ADC的實例編號，但其同樣適用於帶有其他抗體之ADC的各列。若L2為琥珀醯亞胺或其衍生物，此醯亞胺，如上述，亦可完全或部份為水解開鏈的琥珀醯胺之形式。依照L1，此開鏈琥珀醯胺之水解多少可為明顯的或根本不存在。
*R2 和R4 形成一吡咯啶環，其係經連接子取代。
**特佳的，此行中所給予的L1係與選自下列之L2連接子相連接： 及/或 其中#1 係指與結合子之硫原子的連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，R22 較佳地係代表COOH。在本發明之接合物或本發明之接合物的混合物中，連接結合子的半胱胺酸殘基之鍵係存在達到較佳地80%以上，特佳地90%以上的程度(在各情況下係以連接子與結合子之連接鍵的總數為基準)，特別 是較佳地為式A7或A8二種結構之一。本處，式A7或A8之結構一般係共同存在，較佳地，以連接結合子之鍵的數目為基準，比率係從60：40至40：60。則其餘的鍵係以下列結構存在
**：表A之參見備註**。
***：當此L2結構存在時，可能同時有下式之L2結構：
具有對應連接子之接合物實例係具有下列結構，其中X1、X2、X3和L1具有上述所給予之意義，L2和L3具有如同L1之意義，AK1係代表經由半胱胺酸殘基相連接之抗體而n為1至10之數字。特佳的，AK1為一人類、人源化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段，特別是抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段或抗-EGFR抗體或其抗原結合片段。特佳的係給予專一與TWEAKR位置47的胺基酸D(D47)結合之抗-TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAKR抗體TPP-2090，或抗-EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)或尼妥珠單抗(nimotuzumab)。
若連接子係與離胺酸側鏈或離胺酸殘基相連接，則其較佳地係具有下式：-§-(SG)x -L4-CO-§§其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接胜肽或蛋白之鍵，x係代表0或1，SG係代表可裂解基團，較佳地2-8寡肽，特佳地二肽，及L4係代表一單鍵或-(CO)y -G4-基團，其中y係代表0或1，及G4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、 -SO2 NHNH-、-CONHNH-，及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
下表B係給予連接離胺酸殘基之連接子實例。此表進一步給予較佳的結合點(R1 -R5 )。第1欄係陳述其中使用該等對應連接子之實例編號。
具有對應連接子之接合物實例係具有下列結構，其中X1、X2、X3和L4具有上述所給予之意義，AK2係代表經由離胺酸殘基相連接之抗體而n為1至10之數字。特佳的，AK2為一人類、人源化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段，特別是抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段或抗-EGFR抗體或其抗原結合片段。特佳的係給予專一與TWEAKR位置47的胺基酸D(D47)結合之抗-TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAKR抗體TPP-2090，或抗-EGFR抗體西妥昔單抗或尼妥珠單抗。
根據本發明較佳的係進一步給予基本結構(i)、(ii)或(iv)，其中SG1或SG係代表可被細胞溶解酶裂解之基團，而L1和L2係具有上述所給予之意義。特佳的係給與下列基團：●-Val-Ala-CONH-(據此於丙胺酸的C端醯胺，裂解醯胺鍵)●-NH-Val-Lys-CONH-(於離胺酸的C端醯胺，裂解醯胺鍵)●-NH-Val-Cit-CONH-(於瓜胺酸的C端醯胺，裂解醯胺鍵)●-NH-Phe-Lys-CONH(於離胺酸的C端醯胺，裂解醯胺鍵)●-NH-Ala-Lys-CONH-(於離胺酸的C端醯胺，裂解醯胺鍵)●-NH-Ala-Cit-CONH-(於瓜胺酸的C端醯胺，裂解醯胺鍵)SG1或SG特佳地為或 或其中X係代表H或C1-10 -烷基基團，其視需要係經-NHCONH2 、-COOH、-OH、NH2 、-NH-CNNH2 或磺酸取代。
下表C係給予連接子基團-SG1-L1-或-L1-SG-L1-之實例，其中SG1和SG為可被細胞溶解酶裂解之基團。表C進一步係陳述那個L2基團為這些-SG1-L1-和-L1-SG-L1-實例的較佳組合，以及較佳的結合點(R1 -R5 )和較佳的m值，因此在L1前面是否有羰基基團(參照§-(CO)m-L1-L2-§§)。這些連接子較佳地係與半胱胺酸殘基結合。第1欄進一步係陳述實例編號，其係就其中使用對應連接子之西妥昔單抗ADC，以示例方式給予。其同樣適用於帶有其他抗體之對應的ADC。L1基團係以方框標示。然而這些L1基團可被上式§-(CO)m-L1-L2-§§中所給予的其中一個L1基團置換。若L2為琥珀醯亞胺或其衍生物，此醯亞胺，如上述，亦可完全或部份為水解開鏈的琥珀醯胺之形式。
表C
具有對基本結構(i)之接合物實例係具有下列結構，其中X1、X2和X3係具有上述所給予之意義，L4具有如同L1之意義，AK1係代表經由半胱胺酸殘基相連接之抗體而n為1至10之數字。特佳的，AK1為一抗 -TWEAKR抗體，特別是專一與TWEAKR位置47的胺基酸D(D47)結合之抗-TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAKR抗體TPP-2090。
KSP抑制劑-連接子-中間物及製備此接合物
本發明之接合物可藉由起初提供帶有連接子之低分子量KSP抑制劑來製備。然後將以此方式所得到的中間物與結合子(較佳地抗體)反應。
較佳地，就與半胱胺酸殘基結合，係將下列化合物之一與含半胱胺酸的結合子，例如抗體反應，其視需要就此目的部份還原： 其中R係代表-H或-COOH，其中K係代表直鏈或支鏈C1 -C6 烷基，其視需要經C1 -C6 -烷氧基或-OH取代，及其中X1 、X2 、X3 、SG1、L1、L2、L3和L4係具有如上述之相同意義。
此化合物可例如以其三氟乙酸鹽的形式來使用。就與結合子，例如抗體之反應，此化合物較佳地係以相對於結合子2-至12-倍的莫耳過量來使用。
較佳地，就與離胱胺酸殘基結合，係將下列化合物之一與含離胺酸的結合子，例如抗體反應： 其中X1 、X2 、X3 係具有如同式(II)之相同意義，而L4具有如同L1之相同意義，而L1具有如同上述之相同意義。
就中間物與半胱胺酸殘基結合，反應可如下列說明：
其他中間物和其他抗體可比照進行反應。
就中間物與離胱胺酸殘基結合，反應可如下列說明：
依照本發明，由此得到下列接合物：
依照連接子，琥珀醯亞胺連接的ADC，在接合後，可轉變成開鏈的琥珀醯胺，其具有有利的穩定性質。
此反應(開環)可在pH 7.5至9，較佳地pH 8，於25℃至37℃的溫度，例如以攪拌來進行。較佳的攪拌時間為8至30小時。
在上式中，X1 、X2 、X3 係具有如同式(II)之相同意義，SG1和L1係具有上述之相同意義，而L2、L3和L4係具有如同L1之相同意義；R和K具有上述之相同意義。AK1為經由半胱胺酸殘基結合之抗體，而AK2為經由離胺酸殘基結合之抗體。其中特佳的，AK1和AK2為抗-TWEAKR抗體，特別是專一與TWEAKR位置47的胺基酸D(D47)結合之抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAKR抗體TPP-2090。
結合子
在最廣義上，術語「結合子」請了解係指與存在特定目標細胞族群中之標靶分子相結合，以結合子/活性化合物接合物提出之分子。術語接合劑應以最廣泛的解釋來理解，並包括，例如卵磷酯、能與特定糖鏈結 合的蛋白以及磷脂質結合蛋白。此等結合子包括，例如高分子量蛋白(結合蛋白)、多肽或胜肽(結合胜肽)、非胜肽(例如適體(aptamer)(US5,270,163)參閱Keefe AD.，等人，Nat.Rev.Drug Discov.2010；9：537-550)，或維生素)及所有其他細胞結合分子或物質。結合蛋白為，例如抗體和抗體片段或抗體模擬物，例如親和體(affibody)、adnectin、抗運載蛋白(anticalin)、DARPin、高親和多聚體(avimer)、奈米抗體(nanobodies)(參閱Gebauer M.等人，Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13：245-255；Nuttall S.D.等人，Curr.Opinion in Pharmacology 2008；8：608-617)。結合胜肽有，例如配體-受體對之配體，例如配體-受體對VEGF/KDR之VEGF，例如配體-受體對運鐵蛋白/運鐵蛋白受體之運鐵蛋白，或細胞激素/細胞激素受體，例如配體-受體對TNFα/TNFα受體之配體TNFα。
文獻中亦揭示有機分子與抗體之各種共價結合(接合)選項。根據本發明較佳的係給予經由抗體半胱胺酸殘基的一或多個硫原子及/或經由抗體離胺酸殘基的一或多個NH相連接的帶毒體與抗體的接合物。然而，經由游離羧基基團或經由抗體的糖殘基結合帶毒體與抗體，亦為可能的。
「標靶分子」在最廣義上請了解係指存在目標細胞族群中並可為蛋白(例如生長因子之受體)之分子或非胜肽分子(例如糖或磷脂質)。較佳地其為一受體或抗原。
術語「胞外」標靶分子係描述與細胞相連及位於細胞外之標靶分子或位於細胞外之標靶分子部分，亦即結合子可在完整細胞上與其胞外標靶分子結合。胞外標靶分子可固定在細胞膜中或可為細胞膜之部分。熟習技術者已了解辨識胞外標靶分子之方法。對於蛋白，此項可經由測定跨膜區和此蛋白在膜中之定向來進行。這些資料通常係儲存在蛋白資料庫中(例如SwissProt)。
術語「癌標靶分子」係描述，相較於相同組織類型之非癌細胞，其係更豐富存在一或多種癌細胞種類上之標靶分子。相較於相同組織類 型之非癌細胞，較佳地此癌標靶分子係選擇性存在一或多種癌細胞類型上，其中選擇性係描述，相較於相同組織類型之非癌細胞，在癌細胞上至少為二倍豐富度(選擇型癌標靶分子)。使用癌標靶分子得以用本發明接合物進行選擇性癌細胞治療。
結合子可經由一鍵與連接子相連接。結合子之連接可經由結合子之雜原子來進行。可用於連接之本發明結合子的雜原子有硫(在一實施例中係經由結合子的硫氫基基團)、氧(依照本發明係藉由結合子的羧基或羥基基團)和氮(在一實施例中係經由結合子的一級或二級胺基團或醯胺基團)。這些雜原子可存在天然的結合子中或以化學方法或分子生物方法導入。根據本發明，結合子與帶毒體之連接對於結合子與標靶分子之結合活性僅有極少的影響。在一較佳的實施例中，此連接對於結合子與標靶分子之結合活性並無影響。
依照本發明，術語「抗體」係以最廣泛的意義理解並包括免疫球蛋白分子，實例有完整或經修飾單株抗體、多株抗體或多專一性抗體(例如雙專一性抗體)。免疫球蛋白較佳地係包括具有四條多肽鏈，二條重鏈(H鏈)和二條輕鏈(L鏈)之分子，其典型地係以雙硫橋連接。各重鏈包括一重鏈可變區(縮寫VH)和一重鏈恆定區。重鏈恆定區可包括，例如CH1、CH2和CH3三個區。各輕鏈包括一可變區(縮寫VL)和一恆定區。輕鏈之恆定區包括一個區(縮寫CL)。VH和VL區可進一步細分為具有超變異性之區域，亦稱為互補決定區(縮寫CDR)及具有低序列變異性之區域(架構區，縮寫為FR)。典型地，各VH和VL區係由三個CDR和至高四個FR所組成。例如，以下列胺基端至羧基端之順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體可由任何適合的物種來製得，例如兔、羊駝、駱駝、小鼠或大鼠。在一實施例中，該抗體為人類或鼠科來源之抗體。抗體，例如可為人類、人源化或嵌合的。
術語「單株」抗體係指從一群實質上同源的抗體得來之抗體，亦即該群族的個別抗體為相同，但是其中少數可能發生天然的突變。單株抗體以高專一性辨識單一抗原結合位。術語單株抗體並非指特殊的製造方法。
術語「全(intact)」抗體係指不僅包括一抗原結合區亦包括輕鏈和重鏈恆定區之抗體。恆定區可為天然生成的區域或具有許多胺基酸位置經改變之其變體。
術語「經修飾全」抗體係指經由其胺基端或羧基端，藉由共價鍵(例如胜肽鍵)與另外非源自抗體的多肽或蛋白融合之全抗體。再者，抗體可經修飾，使得在定義位置導入反應性半胱胺酸，用以促進與帶毒體結合(參見Junutula等人Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8)：925-32)。
術語「人類」抗體係指可得自人類之抗體或為合成的人類抗體。「合成的」人類抗體為其部分或整體可從合成的序列經電腦模擬，以人類抗體序列分析為基礎所得來之抗體。人類抗體可，例如由人類來源之抗體序列庫分離出的核酸所編碼。此一抗體之實例可參見Söderlind等人，Nature Biotech.2000,18：853-856。
術語「人源化」或「嵌合」抗體係描述由非人類和人類序列部份所組成的抗體。在這些抗體中，部分的人類免疫球蛋白序列(受體)被非人類免疫球蛋白之序列組份(供體)所取代。在許多案例中，供體為鼠科免疫球蛋白。就人源化抗體之情況，受體CDR之胺基酸係被供體之胺基酸取代。有時候，架構之胺基酸亦被對應的供體胺基酸取代。在某些案例中，人源化抗體含有並非存在受體或供體之胺基酸且其係於抗體最適化期間插入。就嵌合抗體之情況，供體免疫球蛋白之可變區係與人類抗體之恆定區融合。
術語互補決定區(CDR)如文中所用係指該等抗體可變區中與抗原結合所必須的胺基酸。典型地，各可變區具有三個CDR區，為CDR1、CDR2和CDR3。各CDR區可包括根據Kabat定義之胺基酸及/或根據Chotia所定義之超變異環之胺基酸。Kabat之定義係包括，例如輕鏈可變區之大約 24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)胺基酸位置及重鏈可變區之31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)胺基酸位置(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chotia之定義係包括，例如來自輕鏈可變區之大約26-32(CDR1)、50-56(CDR2)和91-96(CDR3)胺基酸位置及重鏈可變區之26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和96-101(CDR3)胺基酸位置的區域(Chothia和Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。在某些案例中，CDR可包括一來自Kabat和Chotia所定義的CDR區之胺基酸。
依照重鏈恆定區之胺基酸序列，抗體可分成不同的種類。有五種主要的全抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中數種可再分成另外的亞種(同型物)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同種類之重鏈恆定區係稱為[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε]、[gamma/γ]和[mu/μ]。抗體之三元結構和亞單位結構已為所知。
術語抗體/免疫球蛋白之「功能性片段」或「抗原結合抗體片段」係定義為抗體/免疫球蛋白之片段(例如IgG之可變區)，其又包括抗體/免疫球蛋白之抗原結合區。抗體之「抗原結合區」典型地係包括一或多個抗體之超變異區列如CDR、CDR2及/或CDR3區。然而，抗體之「架構」或「骨架」區亦可參與有關抗體與抗原之結合。架構區形成CDR之骨架。抗原結合區較佳地係包括至少4至103個可輕鏈變之胺基酸和5至109個可變重鏈之胺基酸，更佳地，3至107個輕鏈可變區之胺基酸和4至111個重鏈可變區之胺基酸，特佳地，完整的可變輕鏈和重鏈，亦即VL之1-109和VH之1至113胺基酸(編號係根據WO97/08320)。
本發明之「功能性片段」或「抗原結合抗體片段」係涵蓋(非絕對)Fab、Fab’、F(ab’)2 和Fv片段、雙抗體、單區抗體(DAb)、直鏈抗體、抗體的個別鏈(單鏈Fv，縮寫為ScFv)；和多專一性抗體，例如雙-和三-專一性抗體，例如由來自抗體片段C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann & S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag所形成。「多專一性」或「多功能性」抗體以外的抗體為該等具有相同結合位之抗體。多專一性抗體可對不同的抗原表位具專一性，或可對一個以上的抗原之表位具專一性(參見，例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt，等人，1991,J.Immunol.147：60 69；美國專利第4,474,893；第4,7 14,68 1號；第4,925,648號；第5,573,920號；第5,601,8 19號；或Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547 1553)。F(ab’)2 或Fab分子可經建構使發生在Ch1和CL區間的分子內雙硫鍵相互作用之數目可降低或另外完全防止。
「表位」係指任何能專一性與免疫球蛋白或T-細胞受體結合之蛋白决定簇。表位決定簇通常係由分子之化學活化表面基團所組成，例如胺基酸或糖側鏈或其組合，且通常具有一特異的三元結構性質以及明確的電荷性質。
「功能性片段」或「抗原結合抗體片段」可與非源自抗體之另外的多肽或蛋白經由其胺基端或羧基端，藉由共價鍵(例如胜肽連接鏈)融合。再者，抗體和抗原結合片段可藉由於定義位置導入反應性半胱胺酸加以修飾，以便於促進與帶毒體結合(參見Junutula等人Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8)：925-32)。
多株抗體可以本項技術之一般技術者已知的方法來製備。單株抗體可以本項技術之一般技術者已知的方法來製備(Köhler及Milstein,Nature,256,495-497,1975)。人類和人源化單株抗體可以本項技術之一般技術者已知的方法來製備(Olsson等人，Meth Enzymol.92,3-16或Cabilly等人US 4,816,567或Boss等人US 4,816,397)。
本項技術之一般技術者已知各種用於製備人類抗體和其片段之方法，例如藉由基因轉殖小鼠(N Lonberg和D Huszar,Int Rev Immunol. 1995；13(1)：65-93)或噬菌體表現技術(Clackson等人，Nature.1991 Aug 15；352(6336)：624-8)。本發明之抗體可藉由匯集大量健康自願者之大量抗體的胺基酸序列所組成之重組的抗體庫來獲得。抗體亦可藉由已知的重組DNA技術來製造。抗體之核酸序列可以慣用的定序來取得或可得自公共的資料庫。
「分離的」抗體或結合子係經純化以移除其他的細胞組成份。可能干擾診斷或治療用途之沾染的細胞組成份有，例如酵素、荷爾蒙或其他細胞之胜肽和非胜肽性組成份。較佳的抗體或結合子為，相對於抗體或結合子已純化至95%重量比以上程度者(例如以Lowry法，UV-Vis光譜或以SDS毛細管電泳測定)。再者，抗體係經純化至可能測定至少15個胺基端或內部胺基酸序列之胺基酸程度，或經純化至均質性，該均質性係以SDS-PAGE於還原或非還原條件所測(偵測可藉由馬考斯藍染色(Coomassie Blau staining)或較佳地以銀著色)。然而，抗體一般係以一或多個純化步驟來製備。
術語「專一性結合」係指與預定的抗原/標靶分子結合之抗體或結合子。抗體或結合子之專一性結合典型地係描述為具有至少10-7 M親和力(為Kd值；亦即，較佳地具有小於10-7 M之Kd值)之抗體或結合子，其中該抗體或結合子對於預定的抗原/標靶分子具有至少比對非專一性抗原/標靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)高二倍的親和力，其中非專一性抗原/標靶分子並非預定的抗原/標靶分子或密切相關之抗原/標靶分子。抗體較佳地係具有至少10-7 M(為Kd值；亦即，較佳地具有小於10-7 M之Kd值)，較佳地至少10-8 M，更佳地在10-9 M至10-11 M範圍內。Kd值可例如，藉由表面電漿共振光譜來測定。
本發明之抗體-藥物接合物同樣具有在這些範圍內之親和力。此親和力較佳地實質上不會受藥物接合之影響(一般，親和力下降少於一量級，換言之，例如最多從10-8 M變為10-7 M)。
依照本發明所用的抗體較佳地亦以高選擇性為著稱。當本發明抗體展現對標靶蛋白之親和力時，其比對無關的其他抗源，例如人類血清白蛋白，存有較佳至少2倍，較佳地5倍或更佳地10倍之高選擇性(親和力，例如可藉由表面電將共振光譜來測定)。
再者，所用的本發明抗體較佳地係具交叉反應性。為了能促進和提高闡明臨床前研究，例如毒性學或活性研究(例如於異種移植小鼠中)，若本發明所用的抗體不僅與人類標靶蛋白結合亦與用於研究中之物種的標靶蛋白結合為有利的。在一實施例中，本發明所用的抗體，除了人類標靶蛋白外，係與至少一另外物種之標靶蛋白交叉反應。就毒性學和活性研究，其較佳的係使用囓齒類家族、狗和非人類靈長類之物種。較佳的齧齒類物種為小鼠和大鼠。較佳的非人類靈長類物種為恆河猴、黑猩猩和長尾獼猴。
在一實施例中，本發明所用的抗體，除了人類標靶蛋白外，係與至少一種由下列組成之群中選出的另外物種之標靶蛋白交叉反應：小鼠、大鼠和長尾獼猴(Macaca fascicularis)。特佳的本發明所用的抗體除了人類標靶蛋白外，係至少與小鼠的標靶蛋白交叉反應。較佳的係給予交叉反應性之抗體，其對於另外非人類物種之標靶蛋白的親和力與對人類標靶蛋白的親和力之差異不大於50倍，更特佳地不大於10倍。
抗癌標靶分子之抗體
結合子，例如抗體或其抗原結合片段所針對之標靶分子，較佳地為癌標靶分子。術語「癌標靶分子」係描述，相較於相同組織類型之非癌細胞，其係更豐富存在一或多種癌細胞種類上之標靶分子。相較於相同組織類型之非癌細胞，較佳地此癌標靶分子係選擇性存在一或多種癌細胞類型上，其中選擇性係描述，相較於相同組織類型之非癌細胞，在癌細胞上至少為二倍豐富度(選擇型癌標靶分子)。使用癌標靶分子得以用本發明接合物進行選擇性癌細胞治療。
專一性對抗一抗原例如癌細胞抗原之抗體較佳地可由本項技術之一般技術者藉由其熟悉的方法(例如重組表現)或可由市面取得的(例如來自德國默克公司(Merck KGaA))方法來製備。用於癌症治療之已知的市售抗體之實例有Erbitux®(西妥昔單抗，Merck KGaA)、Avastin®(貝伐單抗，Roche)和Herceptin®(曲妥珠單抗，Genentech)。曲妥珠單抗為IgG1κ型之重組的人源化單株抗體，其在細胞分析中(Kd=5nM)係以高親和力與人類表皮生長因子之胞外區結合。該抗體係於CHO細胞中以重組來產生。
在一較佳的實施例中，此標靶分子為一選擇性癌標靶分子。
在一特佳的實施例中，此標靶分子為一蛋白。
在一實施例中，此標靶分子為胞外標靶分子。在一較佳的實施例中，此胞外標靶分子為一蛋白。
癌標靶分子已為熟習本項技術者所知。這些之實例係列於下文中。
癌標靶分子之實例有：
(1)EGF受體(NCBI參考序列NP_005219.2),SEQ ID NO：213(1210個胺基酸)：
>gi|29725609|ref|NP_005219.2|EGFR受體前驅物[智人] 胞外區以加底線標示。
(2)間皮素(mesothelin)(SwissProt登錄號Q13421-3),SEQ ID NO：214(622個胺基酸)：
>sp|Q13421-3|MSLN_HUMAN同型2之間皮素OS=智人GN=MSLN 其中間皮素係由胺基酸296-598所編碼。胺基酸37-286係編碼巨核細胞促進因子。間皮素係經由GPI錨繫在細胞膜中並位於胞外。
(3)碳酸酐酶IX(SwissProt登錄號Q16790),SEQ ID NO：215(459個胺基酸)：
>sp|Q16790|CAH9_HUMAN碳酸酐酶9 OS=智人GN=CA9 PE=1 SV=2胞外區以加底線標示。
(4)C4.4a(NCBI參考序列NP_055215.2；同義詞LYPD3),SEQ ID NO：216(346個胺基酸)：
>gi|93004088|ref|NP_055215.2| ly6/含PLAUR區蛋白3-前驅物[智人]成熟的胞外區以加底線標示。
(5)CD52(NCBI參考序列NP_001794.2),SEQ ID NO：217
>gi|68342030|ref|NP_001794.2| CAMPATH-1抗原-前驅物[智人] MKRFLFLLLTISLLVMVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS
(6)Her2(NCBI參考序列NP_004439.2),SEQ ID NO：218
>gi|54792096|ref|NP_004439.2|受體酪蛋白-蛋白激酶erbB-2同型a[智人]
(7)CD20(NCBI參考序列NP_068769.2),SEQ ID NO：219
>gi|23110987|ref|NP_068769.2| B-淋巴細胞抗原CD20[智人]
(8)淋巴細胞活化抗原CD30(SwissProt ID P28908)，SEQ ID NO：220
>gi|68348711|ref|NP_001234.2|腫瘤壞死因子受體超家族成員8同型1-前驅物[智人]
(9)淋巴細胞黏附分子CD22(SwissProt IDP20273 ),SEQ ID NO：221
>gi|157168355|ref|NP_001762.2| B-細胞受體CD22同型1-前驅物[智人]
(10)骨髓細胞表面抗原CD33(SwissProt IDP20138 ),SEQ ID NO：222
>gi|130979981|ref|NP_001763.3|骨髓細胞表面抗原CD33同型1-前驅物[智 人]
(11)跨膜糖蛋白NMB(SwissProt IDQ14956 ),SEQ ID NO：223
>gi|52694752|ref|NP_001005340.1|跨膜糖蛋白NMB同型a-前驅物[智人]
(12)黏附分子CD56(SwissProt ID P13591),SEQ ID NO：224
>gi|94420689|ref|NP_000606.3|神經黏附分子1同型1[智人]
(13)表面分子CD70(SwissProt ID P32970),SEQ ID NO：225
>gi|4507605|ref|NP_001243.1|CD70抗原[智人]
(14)表面分子CD74(SwissProt ID P04233),SEQ ID NO：226
>gi|10835071|ref|NP_004346.1| HLA第II類組織相容性γ鏈同型b[智人]
(15)B-淋巴細胞抗原CD19(SwissProt ID P15391),SEQ ID NO：227
>gi|296010921|ref|NP_001171569.1| B-淋巴細胞抗原CD19同型1-前驅物[智人]
(16)表面蛋白黏液素-1(SwissProt ID P15941),SEQ ID NO：228
>gi|65301117|ref|NP_002447.4|黏液素-1同型1-前驅物[智人]
(17)表面蛋白CD138(SwissProt ID P18827)，SEQ ID NO：229
>gi|29568086|ref|NP_002988.3|多配體聚糖(syndecan)-1-前驅物[智人]
(18)整合素αV(Genbank登錄號：NP_002201.1),SEQ ID NO：230
>gi|4504763|ref|NP_002201.1|整合素α-V同型1-前驅物[智人]
(19)畸胎癌-衍生生長因子1蛋白TDGF1(Genbank登錄號：NP_003203.1),SEQ ID NO：231
>gi|4507425|ref|NP_003203.1|畸胎癌-衍生生長因子1同型1-前驅物[智人]
(20)前列腺-專一性膜抗原PSMA(Swiss Prot ID：Q04609),SEQ ID NO：232
>gi|4758398|ref|NP_004467.1|麩胺酸羧基胜肽酶2同型1[智人]
(21)酪胺酸蛋白激酶EPHA2(Swiss Prot ID：P29317),SEQ ID NO：233
>gi|32967311|ref|NP_004422.2|ephrin型-A受體2-前驅物[智人]
(22)表面蛋白SLC44A4(Genbank登錄號：NP_001171515),SEQ ID NO：234
>gi|295849282|ref|NP_001171515.1|類膽鹼轉運體蛋白4同型2[智人]
(23)表面蛋白BMPR1B(SwissProt：O00238)
(24)轉運蛋白SLC7A5(SwissProt：Q01650)
(25)上皮前列腺抗原STEAP1(SwissProt：Q9UHE8)
(26)卵巢癌抗原MUC16(SwissProt：Q8WXI7)
(27)轉運蛋白SLC34A2(SwissProt：O95436)
(28)表面蛋白SEMA5b(SwissProt：Q9P283)
(29)表面蛋白LYPD1(SwissProt：Q8N2G4)
(30)內皮受體B型EDNRB(SwissProt：P24530)
(31)環指蛋白RNF43(SwissProt：Q68DV7)
(32)前列腺癌-相關蛋白STEAP2(SwissProt：Q8NFT2)
(33)陽離子通道TRPM4(SwissProt：Q8TD43)
(34)補體受體CD21(SwissProt：P20023)
(35)B-細胞抗原受體複合物-相關蛋白CD79b(SwissProt：P40259)
(36)細胞黏附抗原CEACAM6(SwissProt：P40199)
(37)二肽酶DPEP1(SwissProt：P16444)
(38)介白素受體IL20α(SwissProt：Q9UHF4)
(39)蛋白聚糖BCAN(SwissProt：Q96GW7)
(40)ephrin受體EPHB2(SwissProt：P29323)
(41)前列腺幹細胞-相關蛋白PSCA(Genbank登錄號：NP_005663.2)
(42)表面蛋白LHFPL3(SwissProt：Q86UP9)
(43)受體蛋白TNFRSF13C(SwissProt：Q96RJ3)
(44)B-細胞抗原受體複合物-相關蛋白CD79a(SwissProt：P11912)
(45)受體蛋白CXCR5(SwissProt：P32302)
(46)離子通道P2X5(SwissProt：Q93086)
(47)淋巴細胞抗原CD180(SwissProt：Q99467)
(48)受體蛋白FCRL1(SwissProt：Q96LA6)
(49)受體蛋白FCRL5(SwissProt：Q96RD9)
(50)MHC第II類分子Ia抗原HLA-DOB(Genbank登錄號：NP_002111.1)
(51)T-細胞蛋白VTCN1(SwissProt：Q7Z7D3)
(52)TWEAKR(SEQ ID NO：169(蛋白)；SEQ ID NO：170(DNA).
(53)淋巴細胞抗原(Swiss Prot：P11049)
(54)FGF受體2；FGFR2(Gene ID：2263；官方標記：FGFR2)。FGFR2受體發生在不同的剪接變體上(α、β、IIIb、IIIc)。所有的剪接變體皆可作為標靶分子。
(55)跨膜糖蛋白B7H3(CD276；Gene ID：80381.
(56)B細胞受體BAFFR(CD268；Gene ID：115650)
(57)受體白ROR 1(Gene ID：4919)
(58)表面受體IL3RA(CD123；Gene ID：3561)
(59)CXC趨化素受體CXCR5(CD185；Gene ID 643)
(60)受體蛋白合胞素(syncytin)(Gene ID 30816)
在本發明一較佳的主題中，癌標靶分子係由(1)-(60)癌標靶分子組成之群中選出，特別是(1)、(6)和(52)。
在本發明另一特佳的主題中，結合子係與由(1)-(60)癌標靶分子組成之群中選出之胞外癌標靶分子結合，特別是(1)、(6)和(52)。
在本發明另一特佳的主題中，結合子係專一與由(1)-(60)癌標靶分子組成之群中選出之胞外癌標靶分子結合，特別是(1)、(6)和(52)。在一較佳的實施例中，在與標靶細胞上的其胞外標靶分子結合後，此結合子由於結合而被標靶細胞內化。由此形成了結合子/活性化合物接合物，其可為一免疫接合物或ADC，而被標靶細胞吸收。然後結合子係在細胞內被處理，較佳的經溶酶體處理。
在一實施例中，此結合子為一結合蛋白。在一較佳的實施例中，此結合子為一抗體、抗原結合抗體片段、多專一性抗體或抗體模擬物。
較佳的抗體模擬物有親和體(affibody)、adnectin、抗運載蛋白(anticalin)、DARPin、高親和多聚體(avimer)和奈米抗體(nanobodies)。較佳的多專一性抗體為雙專一性和三專一性抗體。
在一較佳的實施例中，該結合子為抗體、抗原結合抗體片段，更佳地分離的抗體或分離的抗原結合抗體片段。
較佳的抗原結合抗體片段有Fab、Fab’、F(ab’)2 和Fv片段、雙抗體、DAb、直鏈抗體和scFv。特佳地為Fab、雙抗體和scFv。
在一特佳的實施例中，該結合子為抗體。特佳地為單株抗體或其抗原結合抗體片段。另外特佳的為人類、人源化或嵌合抗體或其抗原結合抗體片段。
與癌標靶分子結合之抗體或抗原結合抗體片段可由本項技術之一般技術者使用已知的方法，例如化學合成或重組表現來製備。用於癌標靶分子之結合子可從市面取得或可由本項技術之一般技術者，使用已知的方法，例如化學合成或重組表現來製備。另外製備抗體或抗原結合抗體片段之方法係描述於WO 2007/070538(參見第22頁“Antibodies”)中。熟習本項技術者已知如何匯集例如噬菌體表現庫(例如Morphosys HuCAL Gold)之方法及用於尋找抗體或抗原結合抗體片段(參見WO 2007/070538，第24頁ff和第70頁之AK實例1，第72頁之AK實例2)。使用B細胞之DNA庫製備抗體之另外的方法係描述於，例如26頁(WO 2007/070538)。人源化抗體之方法係描述於WO2007070538的第30-32頁和詳細描述於Queen，等人，Pros.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033,1989或於WO 90/0786中。再者，用於一般蛋白和特定抗體的重組表現方法已為熟習本項技術者所知(參見，例如Berger和Kimrnel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,Inc.)；Sambrook，等人，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabel等人[Eds.],Current Protocols,Green Publishing Associates,Inc./John Wiley & Sons,Inc.)；Harlow等人，(Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988,Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins(1998))；及Harlow，等人，(Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。熟習本項技術者了解用於表現蛋白/抗體所須之對應的載體、啟動子和訊息胜肽。一般性的方法亦描述於WO 2007/070538的第41-45頁。製備IgG1抗體之方法係描述於，例如WO 2007/070538之第74頁ff的實例6中。可在抗體與其抗原結合後，測量抗體內化之方法已為熟習本項技術者所了解並描述於例如WO 2007/070538的第80頁。熟習本項技術者能使用已用於製備碳酸酐酶IX(Mn)抗體之WO 2007/070538中所述的方法，來製備具有不同標靶分子專一性之抗體。
抗-EGFR抗體
與癌標靶分子EGFR結合之抗體的實例有西妥昔單抗(INN編號7906)、帕尼單抗(panitumumab)(INN編號8499)和尼妥珠單抗(nimotuzumab)(INN編號8545)。西妥昔單抗(藥物銀行登錄號DB00002)為於SP2/0小鼠骨髓瘤細胞中產生的嵌合抗-EGFR1抗體並由ImClone Systems公司/Merck KgaA/Bristol-Myers Squibb公司所販售。西妥昔單抗適用於治療帶有野生型K-Ras基因之轉移性、EGFR表現的大腸直腸癌。其具有10-10 M之親和力。
序列：
西妥昔單抗輕鏈(κ)，SEQ ID NO：235：
西妥昔單抗重鏈，SEQ ID NO：236：
帕尼單抗(INN編號8499)(藥物銀行登錄號DB01269)為專一性與人類EGF受體1結合之重組的單株人類IgG2抗體，並由Abgenix/Amgen公司所販售。帕尼單抗係源自基因轉殖小鼠(XenoMouse)之免疫接種。這些小鼠能製造人類免疫球蛋白(輕鏈和重鏈)。選擇產生抗EGFR抗體之專一性B-細胞選殖株，並將此選殖株以CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)無限增殖。將這些細胞用於製造100%人類抗體。帕尼抗體適用於治療對氟嘧啶(fluoropyrimidine)、奧沙利鉑(oxaliplatin)和伊立替康(irinotecan)之化學治療具抗藥性的EGFR-表現、轉移性大腸直腸癌。其具有10-11 M之親和力。
序列：
帕尼單抗 輕鏈(κ)，SEQ ID NO：237：
帕尼單抗 重鏈，SEQ ID NO：238：
尼妥珠單抗(INN編號8545)(EP 00586002,EP 00712863)為專一與人類EGF受體結合之人源化單株IgG1抗體並由YM BioScienecs公司(加拿大密西沙加)所販售。其係於非分泌性NSO細胞(哺乳動物細胞)中所產生。尼妥珠單抗係核准用於治療頭頸腫瘤、高度惡性星形細胞瘤和多型性神經膠母細胞瘤(EU和US未核准)和胰臟癌(罕用藥物，EMA)。其具有10-8 M之親和力。
尼妥珠單抗 輕鏈，SEQ ID NO：239：
尼妥珠單抗 重鏈，SEQ ID NO：240：
EGFR抗體之另外的實例係如下：
●扎魯木單抗(Zalutumumab)/2F8/HuMax-EGFr，來自Genmab A/S(WO 02/100348,WO 2004/056847,INN編號8605)
●萘昔木單抗(Necitumumab)/11F8,ImClone/IMC-11F8，來自ImClone Systems公司[Eli Lilly & Co](WO 2005/090407(EP 01735348-A1,US 2007/0264253-A1,US 7,598,350,WO 2005/090407-A1),INN編號9083)
●馬妥珠單抗(Matuzumab)/抗-EGFR MAb,Merck KGaA/抗-EGFR MAb,Takeda/EMD 72000/EMD-6200/EMD-72000和EMD-55900/MAb 425/單株抗體425，來自Merck KGaA/Takeda(WO 92/15683,INN編號8103(Matuzumab))
●RG-7160/GA-201/GA201/R-7160/R7160/RG7160/RO-4858696/RO-5083945/RO4858696/RO5083945，來自Glycart Biotechnology AG(Roche Holding AG)(WO 2010/112413-A1,WO 2010/115554)
●GT-MAB 5.2-GEX/CetuGEX，來自Glycotope GmbH(WO 2008/028686-A2(EP 01900750-A1,EP 01911766-A1,EP 02073842-A2,US 2010/0028947-A1)
●ISU-101，來自Isu Abxis Inc(ISU Chemical Co Ltd)/Scancell(WO 2008/004834-A1)
●ABT-806/mAb-806/ch-806/抗-EGFR單株抗體806，來自Ludwig Institute for Cancer Research/Abbott/Life Science Pharmaceuticals(WO 02/092771,WO 2005/081854和WO 2009/023265)
●SYM-004(含有二種嵌合IgG1抗體(992和1024))，來自Symphogen A/S(WO 2010/022736-A2)
●MR1-1/MR1-1KDEL，來自IVAX Corp(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)(Duke University)，(專利：WO2001/062931-A2)
●抗缺失突變體抗體，EGFRvIII，來自Amgen/Abgenix(WO 2005/010151,US 7,628,986)
●SC-100，來自Scancell Ltd(WO 01/088138-A1)
●MDX-447/EMD 82633/BAB-447/H 447/MAb,EGFR,Medarex/Merck KgaA，來自Bristol-Myers Squibb(US)/Merck KGaA(DE)/Takeda(JP),(WO 91/05871,WO 92/15683)
●抗-EGFR-Mab，來自Xencor(WO 2005/056606)
●DXL-1218/抗-EGFR單株抗體(癌)，InNexus，來自InNexus Biotechnology Inc.,Pharmaprojects PH048638。
在一較佳的實施例中，抗-EGFR抗體係由下列組成之群中選出：西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、扎魯木單抗、萘昔木單抗、馬妥珠單抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在一特佳的實施例中，抗-EGFR抗體係由下列組成之群中選出：西妥昔單抗、扎魯木單抗、萘昔木單抗和馬妥珠單抗。
熟習本項技術者，從上述抗體之CDR區，藉由序列變化，了解可用於製備另外的抗體之方法，這些另外的抗體對標靶分子具有類似或更佳的親和力及/或專一性。
在一另外的實施例中，該抗-EGFR抗體或抗原結合抗體片段係由下列組成之群中選出：包含任一下列抗體之三個輕鏈CDR區和三個重鏈CDR區的抗體或抗原結合抗體片段：西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、扎魯木單抗、萘昔木單抗、馬妥珠單抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在另一實施例中，抗-EGFR抗體或抗原結合抗體片段係由下列組成之群中選出：包含任一下列抗體之三個輕鏈CDR區和三個重鏈CDR區的抗體或抗原結合抗體片段：西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、扎魯木單抗、萘昔木單抗、馬妥珠單抗。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-碳酸酐酶IX抗體
與癌標靶分子碳酸酐酶IX結合之抗體的實例係描述於WO2007/070538-A2中(例如，申請專利範圍第1-16項)。
在一較佳的實施例中，抗-碳酸酐酶IX抗體或抗原結合抗體片段係由下列抗-碳酸酐酶IX抗體或抗原結合抗體片段組成之群中選出：3ee9(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(a))、3ef2(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(b))、1e4(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(c))、3a4(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(d))、3ab4(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(e))、3ah10(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(f))、3bb2(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(g))、1aa1(WO 2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(h))、5a6(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(i))和5aa3(WO2007/070538-A2之申請專利範圍第4項(j))。
抗-C4.4a抗體：
根據本發明，可使用C4.4a抗體。
C4.4a抗體和抗原結合片段之實例係描述於WO 2012/143499 A2中。WO 2012/143499 A2的所有抗體係以引用的方式併入本發明之說明書中，且其可用於本發明中。抗體的序列係列於WO 2012/143499 A2的表1中，其中各行係顯示第1欄所列的抗體可變輕鏈和可變重鏈之個別的CDR胺基酸序列。
在一實施例中，抗-C4.4a抗體或其抗原結合抗體片段，在與表現C4.4a之細胞結合後，被細胞所內化。
在另外的實施例中，抗-C4.4a抗體或抗原結合抗體片段包括至少1、2或3個2012/143499 A2之表1或WO 2012/143499 A2之表2中所列的CDR胺基酸序列。此等抗體之較佳的實施例同樣係列於WO 2012/143499 A2中並以引用的方式併入本文中。
抗-HER2抗體：
與癌標靶分子Her2結合之一抗體的實例為曲妥珠單抗(Genentech)。曲妥珠單抗為一用於(其中包括)治療乳癌之人源化抗體。
除了曲妥珠單抗(INN 7637,CAS編號：RN：180288-69-1)和帕妥珠單抗(pertuzumab)(Cas編號：380610-27-5)，其他與HER2結合之抗體的實例係如揭示於WO2009/123894-A2、WO200/8140603-A2或WO 2011/044368-A2中之抗體。抗-HER2接合物之實例為曲妥珠單抗-艾得辛(trastuzumab-emtansine)(INN No.9295)。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD20抗體：
與癌標靶分子CD20結合之一抗體的實例為利妥昔單抗(Genentech)。利妥昔單抗(CAS編號：174722-31-7)為用於治療非何杰金氏淋巴瘤之嵌合抗體。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD52抗體：
與癌標靶分子CD52結合之一抗體的實例為阿來組單抗(alemtuzumab)(Genzyme)。阿來組單抗(CAS編號：216503-57-0)為用於治療慢性淋巴性白血病之人源化抗體。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-間皮素抗體：
抗間皮素抗體係描述於，例如WO2009/068204中。所有描述於WO 2009/068204的抗體係以引用的方式併入本說明書中，使得這些抗體可用於文中所揭示的本發明之內文中。
本發明所用的抗間皮素抗體另外較佳地亦以與間皮素不變的結合著稱。不變結合其特徵在於，例如用於與間皮素之表位結合的本發明抗體，其不能被另外的胞外蛋白遮蔽。此一另外的胞外蛋白為，例如蛋白卵巢癌抗原125(CA125)。所用的抗體較佳的其特徵為其與間皮素結合，不會被CA125阻斷。
抗-CD30抗體
與癌標靶分子CD30結合並可用於治療癌症，例如何杰金氏淋巴癌之抗體的實例有布妥昔單抗(brentuximab)、伊妥木單抗(iratumumab)和揭示於WO2008/092117、WO2008/036688或WO2006/089232中之抗體。抗-CD30接合物之實例為布妥昔單抗-維多汀(brentuximab vedotine)(INN標號9144)。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD22抗體
與癌標靶分子CD22結合並可用於治療癌症，例如淋巴癌之抗體的實例有英妥珠單抗(inotuzumab)或伊帕珠單抗(epratuzumab)。抗-CD22接合物之實例為英妥珠單抗-奥唑米星(inotuzumab ozagamycin)(INN編號8574)，或抗-CD22-MMAE和抗-CD22-MC-MMAE(分別為CAS RN：139504-50-0和 474645-27-7)。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD33抗體
與癌標靶分子CD33結合並可用於治療癌症，例如淋巴癌之抗體的實例有吉妥單抗(gemtuzumab)或林妥珠單抗(lintuzumab)(INN7580)。抗-CD33接合物之實例為吉妥單抗-奧唑米星。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-NMB抗體
與癌標靶分子NMB結合並可用於治療癌症，例如黑色素瘤或乳癌之抗體的實例為格巴單抗(glembatumumab)(INN 9199)。抗-NMB接合物之實例為格巴單抗-維多汀(glembatumumab vedotine)(CAS RN：474645-27-7)。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD56抗體
與癌標靶分子CD56結合並可用於治療癌症，例如多發性骨髓瘤、小細胞肺癌MCC或卵巢癌之抗體的實例為羅佛單抗(lorvotuzumab)。抗-CD56接合物之實例為羅佛單抗-美登素(lorvotuzumab mertansine)(CAS RN：139504-50-0)。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD70抗體
與癌標靶分子CD70結合並可用於治療癌症，例如非何杰金氏淋巴癌或腎細胞癌之抗體的實例係揭示於WO2007/038637-A2或WO2008/070593-A2中。抗-CD70接合物之實例為SGN-75(CD70 MMAF)。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD74抗體
與癌標靶分子CD74結合並可用於治療癌症，例如多發性骨髓瘤之抗體的實例為米拉珠單抗(milatuzumab)。抗-CD74接合物之實例為米拉珠單抗-多柔比星(milatuzumab-doxorubicin)(CAS RN：23214-92-8)。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD19抗體
與癌標靶分子CD19結合並可用於治療癌症，例如非何杰金氏淋巴癌之抗體的實例係揭示於WO2008/031056-A2中。另外的抗體和抗-CD19接合物(SAR3419)之實例係揭示於WO2008/047242-A2。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-黏液素抗體
與癌標靶分子黏液素-1(mucin-1)結合並可用於治療癌症，例如非何杰金氏淋巴癌之抗體的實例有克利伐單抗(clivatuzumab)和揭示於WO2003/106495-A2、WO2008/028686-A2中之抗體。抗-黏液素接合物之實例係揭示於WO2005/009369-A2。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-CD138抗體
可用於治療癌症，例如多發性骨髓瘤之與癌標靶分子CD138結合的抗體及其接合物之實例係揭示於WO2009/080829-A1、WO2009/080830-A1中。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-整合素-αV抗體
與癌標靶分子整合素αV結合並可用於治療癌症，例如黑色素瘤、肉瘤或惡性腫瘤之抗體的實例有英妥木單抗(intetumumab)(Cas RN：725735-28-4)、阿昔單抗(abciximab)(Cas-RN：143653-53-6)、伊瑞西珠單抗(etaracizumab)(Cas-RN：892553-42-3)及揭示於US7,465,449、EP19859-A1、WO2002/012501-A1或WO2006/062779-A2中之抗體。抗-接合物之實例為 英妥木單抗-DM4和揭示於WO2007/024536-A2中之其他ADC。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-TDGF1抗體
與癌標靶分子TDGF1結合並可用於治療癌症之抗體的實例係揭示於WO02/077033-A1、US7,318,924、WO2003/083041-A2和WO2002/088170-A2中。抗-TDGF1接合物之實例係揭示於WO2002/088170-A2中。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-PSMA抗體
與癌標靶分子PSMA結合並可用於治療癌症，例如前列腺癌之抗體的實例係揭示於WO97/35616-A1、WO99/47554-A1和WO01/009192-A1和WO2003/034903中。抗-PSMA接合物之實例係揭示於WO2009/026274-A1和WO 2007/002222中。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-EPHA2抗體
與癌標靶分子EPHA2結合並可用於製備接合物及可用於治療癌症之抗體的實例係揭示於WO2004/091375-A2中。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-SLC44A4抗體
與癌標靶分子SLC44A4結合並可用於製備接合物及可用於治療癌症，例如胰臟癌或前列腺癌之抗體的實例係揭示於WO2009/033094-A2和US2009/0175796-A1中。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-HLA-DOB抗體
與癌標靶分子HLA-DOB結合之抗體的實例為Lym-1抗體(Cas-RN：301344-99-0)，其可用於治療癌症，例如非何杰金氏淋巴癌。抗-HLA-DOB接合物之實例係揭示於，例如WO2005/081711-A2中。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-VTCN1抗體
與癌標靶分子VTCN1結合並可用於製備接合物及用於治療癌症，例如卵巢癌、胰臟癌、肺癌或乳癌之抗體的實例係揭示於WO2006/074418-A2中。這些抗體和其抗原結合片段係以引用的方式併入本文中，且其可用於本發明之內文中。
抗-FGFR2抗體
根據本發明，可使用抗-FGFR2抗體。
抗-FGFR2抗體和抗原結合片段之實例係描述於中WO2013076186。WO2013076186的所有抗體係以引用的方式併入本發明之說明書中，且其可用於本發明中。抗體的序列係如WO2013076186之表9和表10所示。較佳的係給予衍生自稱為M048-D01和M047-D08抗體之抗體、抗原結合片段和抗體的變體。較佳的抗-FGFR2係與FGFR2的已知各種剪接變體結合。
在一實施例中，抗-FGFR2抗體或其抗原結合抗體片段在與表現FGFR2之細胞結合後，被細胞所內化。
在另一實施例中，抗-FGFR2抗體或抗原結合抗體片段包括至少1、2或3個WO2013076186之表9和表10所列的CDR胺基酸序列。此等抗體之較佳的實施例同樣係列於WO2013076186中並以引用的方式併入本文中。
抗-TWEAKR抗體
在一較佳的實施例中，當本發明之方法中係使用抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段時，此抗體或片段係由該下文所述的抗體或片段中選出。此 外，與TWEAKR結合的抗體已為熟習本項技術者所知，參見，例如WO2009/020933(A2)或WO2009140177(A2)。
本發明特別係關於具有抗體或其抗原結合抗體片段或其變體之接合物其導致TWEAKR(SEQ ID NO：169(蛋白)；SEQ ID NO：170(DNA))強力活化，在各種過度表現TWEAKR之癌細胞中造成強力引起細胞凋亡。
已描述的有關引發細胞凋亡之TWEAKR的促效活性和抑制抗-TWEAKR抗體(例如PDL-192)之增生有限且無法達到內生性配體TWEAK之效用。此缺乏的促效活性並非以降低的親和力為基礎，因為這些抗體在TWEAKR係以親和力結合，其相較於內生性配體TWEAK，係在類似的範圍(Michaelson JS等人，MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75；Culp PA等人，Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)，且即使具有較高結合親和力的抗體並不一定展現更有效的訊號傳遞活性(Culp PA，等人，Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)。此外，已顯示，已描述的抗體之抗腫瘤活性係依Fc效應子功能而定，且其顯示，ADCC在小鼠模型中就活體內效力上扮演一個重要角色。
產生抗-TWEAKR抗體
使用完整的人類抗體噬菌體庫(Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，藉由蛋白淘選(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005；23(3)：1105-16)，使用人類和小鼠TWEAKR之二聚性Fc-融合胞外區作為固定化標靶，分離本發明之TWEAKR-專一性人類單株抗體。鑑別11種不同的Fab噬菌體，並將對應的抗體選殖至哺乳動物EgG表現載體，其係提供無可溶性FAb之CH2-CH3區。在鑑別出較佳的抗體後，此等係表現作為全長IgG。這些結構，係例如過渡性表現在哺乳動物細胞中，如描述於Tom等人，Methods Express之第12章：Expression Systems edited by Micheal R.Dyson and Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007(參見AK-實例1)。以蛋白-A層析純化抗體並進一步藉由其與可溶性單體TWEAKR之結合親和力，使用 ELISA和BIAcore分析定性，如AK-實例2中所述。就測定抗-TWEAKR抗體之細胞結合特性，係以流式細胞儀於許多細胞株(HT29、HS68、HS578)檢測結合。進行NFκB受體基因分析，用以檢驗全部11種鑑別的抗體(人類IgG1)之促效活性。選取具有最高活體外活性的抗體(TPP-883)供進一步的活性和親和力成熟(詳情請參見AK-實例1)。偵測具有改良促效活性之單一取代變體：CDR-H3之G102T。最後，相較於最佳的單一取代變體G102T，以增加的親和力為基礎選擇7種變體。將其對應的DNA選殖至哺乳動物IgG表現載體並以上文所提的NF-κB受體基因分析來檢驗功能活性。最後，將得到的序列與人類生殖系列序列作比較，及調整對親和力無任何顯著效應之標準差和效用。藉由抗體庫篩選及藉由親和力及/或活性成熟，得到下列抗體。“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”和“TPP-1858”。
再者，本發明之抗體可藉由本項技術中已知的方法，例如抗體噬菌體庫篩選(參見，例如Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，完整建立的雜交瘤技術(參見，例如Köhler和Milstein Nature.1975 Aug 7；256(5517)：495-7)或小鼠的免疫接種，其中包括，hMAb小鼠之免疫接種(例如VelocImmune mouse®)來獲得。
抗-TWEAKR抗體之特定實施例
本發明之一實施例係提供在一或多種TWEAKR-表現細胞株中，顯現強力引發caspase 3/7之抗體或其抗原結合抗體片段或其變體。在一較佳的實施例中，該一或多種TWEAKR-表現細胞株係存在下列組成之群中：WiDr、A253、NCI-H322、HT29和786-O。「引發caspase 3/7」可藉由本項技術中已知的習用方法來測量，包括文中所描述的方法。在一實施例中，「引發caspase 3/7」係依照本發明以capase 3/7溶液(Promega,#G8093)使用活性測定並讀取VICTOR V(Perkin Elmer)上的冷光所測定。在培養時間結束時， 測定caspase 3/7活性及測定相較於未處理的細胞之caspase 3/7引發因子。當引發因子大於1.2，較佳地大於1.5，甚佳地大於1.8，甚佳地大於2.1，甚佳地大於2.5時，則抗體則稱為顯現「強力引發」caspase 3/7。所提供的為，相較於已述的促效抗體[例如PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]，以及相較於300ng/ml重組的人類TWEAK，在HT29細胞中導致較強引發caspase 3/7之抗-TWEAKR抗體。在癌細胞中引發caspase 3/7之強力活性亦在WiDr、A253、NIC-H322和786-O細胞中觀察到，其中在大多數的實驗中，所檢測的本發明抗體，相較於參考抗體[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)]和300ng/ml TWEAK，引發較高的變化因子。某些本發明抗體僅以中度親和力(>10nM)與TWEAKR結合，其明顯地低於內生性配體TWEAK之親和力，且相較於其他已知的促效抗體亦較低。此性質提供了進一步可能的利益，例如潛在更深入穿透至腫瘤中。
就此點而言，本發明之一實施例係提供在一新穎的表位與TWEAKR專一結合之抗體或其抗原結合抗體片段，其特徵為在TWEAKR(SEQ ID NO：169；亦參見圖1)的位置47(D47)選擇性與天門冬胺酸(D)結合。就辨識特定TWEAKR胺基酸對抗體相互作用之依賴性係與這些抗體所測定的促效活性相關。天然的配體TWEAK顯現有效的活化TWEAKR並依賴白胺酸46於TWEAKR之富含半胱胺酸區域中結合(Pellegrini等人，FEBS 280：1818-1829)。P4A8展現非常低的促效活性且至少與TWEAKR之富含半胱胺酸區域外的區域部分相互作用。PDL-192展現中度的促效活性並依賴R56與TWEAKR之富含半胱胺酸區域結合，但與TWEAK配體位置相反。本發明之抗體(例如TPP-2090)係依賴D47結合，而TWEAK係依賴L46結合。因此，TWEAK係與類似但不同的結合位置結合(圖7)。據此，對於以非常高促效活性結合之抗體，展現強力促效活性之本發明抗體係與新穎的表位結合(D47-依賴)。
在TWEAKR(SEQ ID NO：169)位置47(D47)之胺基酸對於本發明抗體之結合被視為重要的，其係表示，當抗體藉由將此殘基修改成丙胺酸，流失大於20%，另一種選擇大於30%，另一種選擇大於40%，另一種選擇大於50%，另一種選擇大於60%，另一種選擇大於70%，另一種選擇大於80%，另一種選擇大於90%另一種選擇100%之其ELISA訊號時，此抗體係與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47的D(D47)結合，如AK-實例2和圖6中所述。另一種選擇當此抗體相較於TPP-2203，對TPP-2614流失大於20%，另一種選擇大於30%，另一種選擇大於40%，另一種選擇大於50%，另一種選擇大於60%，另一種選擇大於70%，另一種選擇大於80%，另一種選擇大於90%，另一種選擇100%之其ELISA訊號時，則抗體係專一與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47的D(D47)結合。較佳地，當此抗體相較於TPP-2203，對TPP-2614流失大於80%之其ELISA訊號時，抗體係專一與TWEAKR(SEQ ID NO：169)之位置47的D(D47)結合。
在本申請書中，有關下列本發明之參考抗體，係如下表中所示：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、“TPP-1858”。
TPP-2090為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：2之重鏈區和一對應SEQ ID NO：1之輕鏈區。
TPP-2149為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：12之重鏈區和一對應SEQ ID NO：11之輕鏈區。
TPP-2093為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：22之重鏈區和一對應SEQ ID NO：21之輕鏈區。
TPP-2148為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：32之重鏈區和一對應SEQ ID NO：31之輕鏈區。
TPP-2084為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：42之重鏈區和一對應SEQ ID NO：41之輕鏈區。
TPP-2077為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：52之重鏈區和一對應SEQ ID NO：51之輕鏈區。
TPP-1538為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：62之重鏈區和一對應SEQ ID NO：61之輕鏈區。
TPP-883為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：72之重鏈區和一對應SEQ ID NO：71之輕鏈區。
TPP-1854為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：82之重鏈區和一對應SEQ ID NO：81之輕鏈區。
TPP-1853為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：92之重鏈區和 一對應SEQ ID NO：91之輕鏈區。
TPP-1857為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：102之重鏈區和一對應SEQ ID NO：101之輕鏈區。
TPP-1858為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：112之重鏈區和一對應SEQ ID NO：111之輕鏈區。
TPP-2090為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：10之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：9之輕鏈可變區。
TPP-2149為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：20之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：19之輕鏈可變區。
TPP-2093為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：30之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：29之輕鏈可變區。
TPP-2148為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：40之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：39之輕鏈可變區。
TPP-2084為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：50之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：49之輕鏈可變區。
TPP-2077為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：60之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：59之輕鏈可變區。
TPP-1538為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：70之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：69之輕鏈可變區。
TPP-883為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：80之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：79之輕鏈可變區。
TPP-1854為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：90之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：89之輕鏈可變區。
TPP-1853為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：100之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：99之輕鏈可變區。
TPP-1857為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：110之重鏈可變 區和一對應SEQ ID NO：109之輕鏈可變區。
TPP-1858為：一抗體，其係包括一對應SEQ ID NO：120之重鏈可變區和一對應SEQ ID NO：119之輕鏈可變區。
較佳的抗-TWEAKR抗體之實施例為下列：
1.專一與TWEAKR(SEQ ID NO：169)位置47之D結合的抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段。
2.根據實施例1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為一促效抗體。
3.根據實施例1或2之抗體或其抗原結合片段，其包括：一可變重鏈，其包括：(a)一重鏈之CDR1，其係由包括式PYPMX之胺基酸序列(SEQ ID NO：171)所編碼，其中X為I或M；(b)一重鏈之CDR2，其係由包括式YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO：172)之胺基酸序列所編碼，其中X為S或K；及(c)一重鏈之CDR3，其係由包括式GGDTYFDYFDY之胺基酸序列(SEQ ID NO：173)所編碼；和一可變輕鏈，其包括：(a)一輕鏈之CDR1，其係由包括式RASQSISXYLN之胺基酸序列(SEQ ID NO：174)所編碼，其中X為G或S；(b)一輕鏈之CDR2，其係由包括式XASSLQS之胺基酸序列(SEQ ID NO：175)所編碼，其中X為Q、A或N；及(c)一輕鏈之CDR3，其係由包括式QQSYXXPXIT之胺基酸序列(SEQ ID NO：176)所編碼，其中在位置之X為T或S。在位置6之X為T或S而在位置8之X為G或F。
4.根據任何前述實施例之抗體或其抗原結合片段，其包括：a.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：6所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：7所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：8所示之重鏈的可變CDR3序列，以及 一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：3所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：4所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：5所示之輕鏈的可變CDR3序列，或b.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：16所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：17所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：18所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：13所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：14所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：15所示之輕鏈的可變CDR3序列，或c.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：26所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：27所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：28所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：23所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：24所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：25所示之輕鏈的可變CDR3序列，或d.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：36所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：37所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：38所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：33所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：34所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：35所示之輕鏈的可變CDR3序列，或e.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：46所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：47所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：48所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：43所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：44所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：45所示之輕鏈的可變CDR3序列，或f.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：56所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：57所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：58所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：53所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：54所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：55所示之輕鏈的可變CDR3序列，或g.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：66所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：67所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：68所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：63所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：64所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：65所示之輕鏈的可變CDR3序列，或h.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：76所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：77所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：78所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：73所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：74所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：75所示之輕鏈的可變CDR3序列，或i.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：86所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：87所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：88所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：83所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：84所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：85所示之輕鏈的可變CDR3序列，或j.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：96所示之重鏈的可變CDR1 序列，如SEQ ID NO：97所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：98所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：93所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：94所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：95所示之輕鏈的可變CDR3序列，或k.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：106所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：107所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：108所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：103所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：104所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：105所示之輕鏈的可變CDR3序列，或l.一可變重鏈，其係包括如SEQ ID NO：116所示之重鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：117所示之重鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：118所示之重鏈的可變CDR3序列，以及一可變輕鏈，其係包括如SEQ ID NO：113所示之輕鏈的可變CDR1序列，如SEQ ID NO：114所示之輕鏈的可變CDR2序列以及如SEQ ID NO：115所示之輕鏈的可變CDR3序列。
5.根據任何前述實施例之抗體或其抗原結合片段，其包括：a.一如SEQ ID NO：10所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：9所示之輕鏈的可變序列，或b.一如SEQ ID NO：20所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：19所示之輕鏈的可變序列，或c.一如SEQ ID NO：30所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：29所示之輕鏈的可變序列，或d.一如SEQ ID NO：40所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：39所示之輕鏈的可變序列，或 e.一如SEQ ID NO：50所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：49所示之輕鏈的可變序列，或f.一如SEQ ID NO：60所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：59所示之輕鏈的可變序列，或g.一如SEQ ID NO：70所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：69所示之輕鏈的可變序列，或h.一如SEQ ID NO：80所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：79所示之輕鏈的可變序列，或i.一如SEQ ID NO：90所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：89所示之輕鏈的可變序列，或j.一如SEQ ID NO：100所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：99所示之輕鏈的可變序列，或k.一如SEQ ID NO：110所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：109所示之輕鏈的可變序列，或l.一如SEQ ID NO：120所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：119所示之輕鏈的可變序列。
6.根據任何前述實施例之抗體，其為一IgG抗體。
7.根據任何前述實施例之抗體，其包括：a.一如SEQ ID NO：2所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列，或b.一如SEQ ID NO：12所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：11所示之輕鏈序列，或c.一如SEQ ID NO：22所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：21所示之輕鏈序列，或d.一如SEQ ID NO：32所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：31所示之輕鏈序列，或 e.一如SEQ ID NO：42所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：41所示之輕鏈序列，或f.一如SEQ ID NO：52所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：51所示之輕鏈序列，或g.一如SEQ ID NO：62所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：61所示之輕鏈序列，或h.一如SEQ ID NO：72所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：71所示之輕鏈序列，或i.一如SEQ ID NO：82所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：81所示之輕鏈序列，或j.一如SEQ ID NO：92所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：91所示之輕鏈序列，或k.一如SEQ ID NO：102所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：101所示之輕鏈序列，或l.一如SEQ ID NO：112所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：111所示之輕鏈序列。
8.根據任何前述實施例之抗原結合片段或根據任何前述實施例之抗體的抗原結合片段，其為一scFv、Fab、Fab'片段或一F(ab')2片段。
9.根據任何前述實施例之抗體或抗原結合片段，其為一單株抗體或其抗原結合片段。
10.根據任何前述實施例之抗體或抗原結合片段，其為一人類、人源化或嵌合抗體或抗原結合片段。
特佳的係給予抗-TWEAKR抗體TPP-2090。
同位素、鹽類、溶劑化物、同位素變體
本發明亦涵蓋本發明化合物之所有適合的同位素變體。請了解，本發明化合物之同位素變體在本處係指一化合物，其中至少一個本發明化合物 中的原子與另一個相同原子數但原子量與自然界正常或主要發生的原子量不同的原子交換。可併入本發明化合物之同位素的實例為該等氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘之同位素，例如2 H(氘)、3 H(氚)、13 C、14 C、15 N、17 O、18 O、32 P、33 P、33 S、34 S、35 S、36 S、18 F、36 Cl、82 Br、123 I、124 I、129 I和131 I。本發明化合物特別的同位素變體，例如，更特言之，該等其中併入一或多個放射性同位素者，可能有利於，例如作用機制或藥物在身體內的分佈之研究；由於製備和偵測較容易，以3 H或14 C同位素標定之化合物特別適合此目的。此外，併入同位素，例如氘，可造成某些治療上的利益，如化合物較大的代謝穩定性，例如延長在身體內的半衰期或降低所需的有效劑量；本發明化合物之此等修飾作用因此，在某些情況下，亦構成本發明之較佳實施例。本發明化合物之同位素變體可藉由熟習本項技術者已知的方法，例如藉由下述之方法及操作實例中所述的製程，使用個別試劑及/或起始化合物之對應的同位素修飾作用，加以製備。
本發明內文中較佳的鹽類為本發明化合物之生理上可接受鹽類。亦涵蓋雖然本身不適合醫藥應用，然而可用於，例如分離、純化本發明化合物之鹽類。
本發明化合物之生理上可接受鹽類涵蓋無機酸、羧酸和磺酸之酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸、馬來酸及苯甲酸之鹽類。
本發明化合物之生理上可接受鹽類亦涵蓋習用鹼之鹽類，例如及較佳地鹼金屬鹽類(例如鈉和鉀鹽)、鹼土金屬鹽類(例如鈣和鎂鹽)或衍生自氨或有機胺具有1至16個碳原子之銨鹽，例如及較佳地乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、二甲基胺基乙醇、普卡因、二苯甲基胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎福啉、精胺酸、離胺酸及1,2-乙二胺。
本發明內文中之溶劑化物係描述為該等經由與溶劑分子配位，形成固體或液體狀態複合物之本發明化合物形式。水合物為一種特定的溶劑化物形式，其中係與水配位。在本發明內文中較佳的溶劑化物為水合物。
此外，本發明亦涵蓋本發明化合物之前藥。術語「前藥」在本處係指本身為生物上活化或非活化，但於其停留在體內期間(例如，藉由代謝或水解)轉變為本發明化合物之化合物。
特定實施例
下列實施例為特佳的：
實施例A：
下式之ADC
其中KSP-L-為一下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)或下式(IIf)之化合物，此結合子為一之抗-TWEAKR抗體(特佳地專一與TWEAKR的位置47胺基酸D(D47)結合之抗-TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAK R抗體TPP-2090)，而n為1至10之數字： 其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C； X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N；X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C；A係代表CO(羰基)；R1 係代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2 、-(CH2 )1-3 NH2 、-CONZ“(CH2 )1-3 NH2 和-CONZ“CH2 COOH，其中Z“係代表H或NH2 ；R2 和R4 係代表H或-L-#1，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H或-L-#1；R3 係代表-L-#1或C1-10 -烷基-，其視需要係經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n -烷基、SO2 -NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2 或NH2 取代(其中烷基較佳地為C1-3 -烷基)；R5 係代表-L-#1、H或F；R6 和R7 相互獨立地係代表H、(視需要氟化)C1-3 -烷基、(視需要氟化)C2-4 -烯基、(視需要氟化)C2-4 -炔基、羥基或鹵素；R8 係代表一支鏈C1-5 -烷基基團其可經-L-#1取代；及R9 係代表H或F，其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、R8 和R10 取代基之一係代表-L-#1，及-L-係代表連接子而#1係代表連接抗體之鍵，及此ADC之鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
此連接子較佳地為一下列之連接子§-(CO)m-L1-L2-§§其中m為0或1；§係代表連接KSP之鍵及§§係代表連接抗體之鍵，及 L2係代表 其中#1 係指與抗體硫原子之連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及L1係以下式表示#1-(NR10 )n -(G1)o -G2-#2 其中R10 係代表H,NH2 或C1 -C3 -烷基；G1係代表-NHCO-或；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-及3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個 由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
本處，#1 為連接KSP抑制劑之鍵而#2 為連接結合基團至結合子之鍵(例如L2)。
實施例B：
一下式之ADC
其中KSP-L-為一下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或下式(IIg)之化合物，此結合子為一抗體，而n為1至10之數字：
其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N；X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C；A係代表CO(羰基)；R1 係代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2 、-(CH2 )1-3 NH2 、-CONZ“(CH2 )1-3 NH2 和-CONZ“CH2 COOH，其中Z“係代表H或NH2 ；R2 和R4 係代表H或-L-#1，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H或-L-#1； R3 係代表-L-#1或一C1-10 -烷基-，其視需要係經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n -烷基、SO2 -NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2 或NH2 取代(其中烷基較佳地為C1-3 -烷基)；R5 係代表-L-#1、H或F；R6 和R7 相互獨立地係代表H、(視需要氟化)C1-3 -烷基、(視需要氟化)C2-4 -烯基、(視需要氟化)C2-4 -炔基、羥基或鹵素；R8 係代表一支鏈C1-5 -烷基基團；及R9 係代表H或F，其中R1 、R2 、R3 、R4 、R5 和R10 取代基之一係代表-L-#1，及-L-係代表連接子而#1係代表連接抗體之鍵，其中-L-係以下式表示§-(CO)m-L1-L2-§§其中m為0或1；§係代表連接KSP之鍵及§§係代表連接抗體之鍵，及L2係代表
其中 #1 係指與抗體硫原子之連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及L1係以下式表示#1 -(NR10 )n -(G1)o -G2-#2 其中R10 係代表H,NH2 或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-或；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-及3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1 連接KSP抑制劑之鍵及#2 為連接偶合基團至抗體之鍵(例如L2)，及此ADC之鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
實施例C：
一下式之ADC
其中KSP-L-為具有下列基礎結構I(sub)之化合物，此結合子為一抗-TWEAKR抗體(較佳地專一與TWEAKR的位置47胺基酸D(D47)結合之抗-TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAK R抗體TPP-2090)、抗-HER2抗體或抗-EGRF抗體(較佳地尼妥珠單抗)，而n為1至10之數字：
其中#a係代表連接分子其餘部份之鍵；R1a 係代表-L-#1、H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 和R4a 相互獨立地係代表H、-L-#1、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 和R4a 共同係代表(形成一吡咯啶環)-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表-L-#1、H、NH2 、COOH、SO3 H、SH或OH，及其中Z係代表-H、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH，其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；其中R1a 、R2a 、R4a 或R10 取代基之一係代表-L-#1，-L-係代表連接子而#1係代表連接抗體之鍵，其中-L-係以下式表示§-(CO)m-L1-L2-§§其中 m為0或1；§係代表連接KSP之鍵及§§係代表連接抗體之鍵，及L2係代表
其中#1 係指與抗體硫原子之連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及L1係以下式表示#1 -(NR10 )n -(G1)o -G2-#2 其中R10 係代表H、NH2 或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-或；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-及3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)， 其中側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1 為連接KSP抑制劑之鍵及#2 為連接偶合基團至抗體之鍵(例如L2)，及此ADC之鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
實施例D：
一下式之ADC
其中KSP-L-為一下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或下式(IIh)之化合物，此結合子為一抗體，而n為1至10之數字：
其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N；X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C；A係代表CO(羰基)；R1 係代表-L-#1；R2 和R4 係代表H，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H； R3 係代表C1-10 -烷基-，其視需要係經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n -烷基、SO2 -NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2 或NH2 取代(其中烷基較佳地為C1-3 -烷基)，或-MOD；其中-MOD係代表-(NR10 )n -(G1)o -G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO- 或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地具有至少1個-COOH基；R5 係代表H或F；R6 和R7 相互獨立地係代表H、(視需要氟化)C1-3 -烷基、(視需要氟化)C2-4 -烯基、(視需要氟化)C2-4 -炔基、羥基或鹵素；R8 係代表a支鏈C1-5 -烷基基團；及R9 係代表H或F，其中-L-係代表連接子而#1係代表連接抗體之鍵，其中-L-係以下式表示 §-(CO)m-L1-L2-§§其中m為0或1；§係代表連接KSP之鍵及§§係代表連接抗體之鍵，及L2係代表
其中#1 係指與抗體硫原子之連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及L1係以下式表示#1 -(NR10 )n -(G1)o -G2-#2 其中R10 係代表H、NH2 或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-或；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、 -SO2 NHNH-、-CONHNH-、-CRx =N-O-(其中Rx 係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)及3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中包括任何側鏈之烴基鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1 為連接KSP抑制劑之鍵及#2 為連接結合基團至抗體之鍵(例如L2)，及此ADC之鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
實施例E：
一下式之ADC
其中KSP-L-為一具有下列基礎結構I(sub)之化合物，此結合子為尼妥珠單抗，而n為1至10之數字：
其中#a係代表連接分子其餘部份之鍵；R1a 係代表-L-#1、H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 和R4a 相互獨立地係代表H、-L-#1、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 和R4a 共同係代表(形成一吡咯啶環)-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表-L-#1、H、NH2 、COOH、SO3 H、SH或OH，及其中Z係代表-H、 -CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；其中R1a 、R2a 、R4a 或R10 取代基之一係代表-L-#1，-L-係代表連接子而#1係代表連接抗體之鍵，其中-L-係以下式表示§-(CO)m-L1-L2-§§其中m為0或1；§係代表連接KSP之鍵及§§係代表連接抗體之鍵，及L2係代表
其中#1 係指與抗體硫原子之連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及L1係以下式表示 #1 -(NR10 )n -(G1)o -G2-#2 其中R10 係代表H、NH2 或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-或；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-及3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1 為連接KSP抑制劑之鍵及#2 為連接結合基團至抗體之鍵(例如L2)，及此ADC之鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
在此實施例中，KSP-L-較佳地係具有下式：
其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或 X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH或CF,X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C(以X1 代表CH，X2 代表C及X3 代表N為較佳)；R1 係代表H、-MOD或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘(例如-(CH2 )0-3 Z‘)或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 係代表H、-MOD、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、SH，或OH；其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；R4 係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，較佳地H，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH； 其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-#1，R5 係代表H、NH2 、NO2 、鹵素(特別是F、Cl、Br)、-CN、CF3 、-OCF3 、-CH2 F、-CH2 F、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基、NO2 、NH2 、COOH或鹵素(特別是F、Cl、Br),R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或-(CH2 )0-2 -(HZ2 )，其中HZ2 係代表4-至7-員雜環，其具有至高2個由N、O和S組成之群中選出的雜原子，其中各基團可經-OH、CO2 H或NH2 取代；L係代表連接子而#1係代表連接抗體或其衍生物之鍵，其中-MOD係代表-(NR10 )n -(G1)o -G2-H，其中R10 係代表H或C1 -C3 -烷基； G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表-NHCO-或，則R10 不代表NH2 )；n為0或1； o為0或1；及G2係代表一直鏈及/或支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中-MOD基團較佳地具有至少1個-COOH基；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
實施例F：
下列通式之化合物：
其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C，或X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N；R1 係代表H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH；其 中W係代表H或OH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 和R4 相互獨立地係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 和R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團、較佳地C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表H、F、NH2 、NO2 、鹵素、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、 鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 和Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；R6 和R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基或鹵素，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
實施例G：
本發明亦提供下列通式之結合子/活性化合物：
其中BINDER係代表結合子(較佳地：抗體)或其衍生物(較佳地：半胱胺酸殘基)，較佳地一抗體，L係代表連接子，WS係代表活性化合物，較佳地一KSP抑制劑，例如式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或(IIh)其中之一的本發明KSP抑制劑，m係代表1至2之數字，較佳地1，而n係代表1至50之數字，較佳地1.2至20之數字，及較佳地2至8，其中L具有下列結構之一。本處，m為每個連接子之活性化合物分子之數目而n為每個結合子(BINDER)之活性化合物/連接子接合物的數目平均。因此存在接合物中的所有SW之總和為m和n之乘積。
WS為在動物中，較佳地在人類中具有局部或全身性治療作用之活性化合物。這些活性化合物一般係具有低於5kDa之分子量，較佳地低於1.5kDa。較佳的活性化合物為抗增生物質，例如細胞毒性或抑制細胞的物質、血管新生之抑制劑、細胞週期抑制劑、PI3激酶或m-TOR抑制劑、MAPK訊號 級聯路徑之抑制劑、HDAC抑制劑、蛋白酶體之抑制劑、PARP抑制劑、Wnt/Hedgehog訊號級聯路徑抑制劑及RNA聚合酶抑制劑。細胞毒性物質有，其中包括，DNA-結合或嵌入物質、DNA-烷化物質、微管安定物質或-不穩定物質、鉑化合物及拓樸異構酶I抑制劑。示例的DNA-結合物質有，例如，蒽環類例如多柔比星(doxorubicin)或柔紅黴素(daunorubicin))。示例的DNA-烷化劑物質，例如卡奇黴素(calicheamicins)、替莫唑胺(temozolomide)或環磷醯胺(cyclophosphamide)及衍生物。示例的微管安定或不穩定劑物質有，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西它賽(docetaxel)、美登素(maytansinoide)和奧利他汀(auristatin)、tubulysins、長春鹼、伊波希隆(epothilone)及其衍生物。美登素的實例有美登素(maytansin)、美登醇(maytansinol)、DM-1和DM-4(參見，例如美國專利US5208020)。奧利他汀之實例有奧利他汀E、單甲基奧利他汀E(MMAE)、奧利他汀F、單甲基奧利他汀F(MMAF)和dolastin(其中，其中包括，WO 09/117531、WO 2005/081711、WO 04/010957；WO02/088172或WO01/24763)。長春鹼之實例有長春新鹼(vincristine)和長春鹼(vinblastine)。伊波希隆之實例有伊波希隆A、B、C、D、E或F(參見，其中包括，WO 98/13375；WO2004/005269；WO 2008/138561；WO 2009/002993；WO 2009/055562；WO 2009/012958；WO2009/026177；WO 2009/134279；WO 2010/033733；WO2010/034724；WO 2011/017249；WO2011/057805)。鉑化合物之實例有順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)。拓樸異構酶I抑制劑之實例有喜樹鹼及衍生物。血管新生抑制劑之實例有MetAP2抑制劑，例如烟黴醇(fumagillol)。細胞週期抑制劑之實例有CDK抑制劑(例如BMS-387032或PD0332991)、Rho激酶抑制劑，例如GSK429286、PLK抑制劑例如，volasertib，aurora激酶抑制劑，例如AZD1152或MLN805Z。MAPK訊號級聯路徑之抑制劑的實例有，其中包括，MEK抑制劑(例如PD0325901)、Ras抑制劑、JNK抑制劑、B-Raf抑制劑(例如SB590885)或p38 MAPK抑制劑(例如SB202190)。HDAC抑制劑之 實例有belinostat和givinostat。PARP抑制劑之實例有iniparib和olaparib。RNA聚合酶抑制劑之實例有抑胺肽酶肽(amatoxin)，例如α-鵝膏蕈鹼(alpha-amantin)、三羥基毒傘肽(amanin)和一羥基毒傘肽醯胺(amanullin)。特佳的活性化合物有長春鹼、奧利他汀、美登素、tubulysin、倍癌黴素(duocarmycin)、激酶抑制劑、MEK抑制劑和KSP抑制劑。
本處，L係代表下式A3和A4其中之一
其中#1 係指與結合子硫原子的連接點，#2 係指與活性化合物的連接點，x係代表1或2，及R22 係代表COOH、COOR、COR(其中R在各情況下係代表C1-3 -烷基)、CONH2 、Br，較佳地COOH。
L1具有如上之相同意義。較佳地，-L1-#2係以下式表示：#3 -(NR10 )n -(G1)o -G2-#2 其中#3係指與氮原子的連接點，R10 係代表H、NH2 或C1 -C3 -烷基；G1係代表-NHCO-、-CONH-或(其中，若G1係代表NHCO 或，則R10不代表NH2 )，n為0或1； o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、-C(NH)NRy -、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基，其各自可經NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx 係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)及/或3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O 和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
另外在G2中可插入的基團較佳地有
其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基。
在本發明之接合物或本發明之接合物的混合物中，連接結合子半胱胺酸殘基之鍵係存在達較佳地80%以上，特佳地90%以上的程度(在各情況下係以連接子與結合子之連接鍵的總數為基準)，為式A3或A4二種結構之一。
帶有式A3或A4之連接子的接合物可藉由分別將結合子與下式A3‘和A4‘的適當溴衍生物偶合來獲得：
這些式A3‘或A4‘之溴衍生物可藉由將HOOCCH2 CHBrCOOR22 或HOOCCHBrCH2 COOR22 與結合子的胺基團反應來獲得，如下列流程30至32中以例示的方式所說明。
[a)：2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽(BEP),DCM，吡啶，RT；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃,EDTA；c)3-4當量的TCEP,PBS緩衝劑；d)PBS緩衝劑，20h RT.]
[a)：2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽(BEP),DCM，吡啶，RT；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃,EDTA；c)3-4當量的TCEP,PBS緩衝劑；d)PBS緩衝劑，20h RT.]
實施例H：
本發明亦提供下列通式之結合子/活性化合物：
其中BINDER係代表結合子(較佳地：抗體)或其衍生物(較佳地：半胱胺酸殘基)，較佳地一抗體，L係代表連接子，WS係代表活性化合物，較佳地一KSP抑制劑，例如式(II)、(IIa)、(III)或(IIIa)其中之一的本發明KSP抑制劑，m係代表1至2之數字，較佳地1，而n係代表1至50之數字，較佳地1.2至20之數字，及較佳地2至8，其中L具有下列結構之一。本處，m為每個連接子之活性化合物分子之數目而n為每個結合子(BINDER)之活性化合物/連接子接合物的數目平均。因此存在接合物中的所有SW之總和為m和n之乘積。
本處，L係代表： 其中#1 係指與結合子硫原子的連接點，#2 係指與活性化合物的連接點，及R22 係代表COOH、COOR、COR(其中R在各情況下係代表C1-3 -烷基)、CONH2 、Br，較佳地COOH。與結合子硫原子的鍵連因此可具有下列結構之一：
在每個活性化合物/結合子接合物含有一個以上的活性化合物分子WS之活性化合物/結合子接合物之情況下，二種式A1及/或A2之結構可存在活性化合物/結合子接合物終。因為本發明之活性化合物/結合子接合物可為不同的活性化合物/結合子接合物之混合物，這些混合物亦可能包括式A1或式A2或式A1和A2之活性化合物/結合子接合物。
L5 為選自-(CH2 )m -(CHRS )n -(OCH2 CH2 )o -(X)p -(CH2 )q -之基團，其中m、n、o、p和q相互獨立地具有下列數值：m=0-10；n=0或1；o=0-10；p=0或1；及q=0-10，其中m+n+o=1-15，較佳地1-6。X係代表一5-或6-員芳香或非 芳香雜環或同素環，較佳地-C6 H4 -或-C6 H10 -。RS 係代表一酸基團，較佳地-COOH或SO3 H。
L6 為選自-CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、和之基團，其中r為1、2或3。
L7 為一單鍵或選自來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個(較佳地1至10個)碳原子之直鏈或支鏈烴基之基團且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NRy -、-NRy CO-、-C(NH)NRy -、CONRy -、-NRy NRy -、-SO2 NRy NRy -、-CONRy NRy -(其中Ry 係代表H、苯基、C1 -C10 -烷基、C2 -C10 -烯基或C2 -C10 -炔基、其各自可經NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx =N-O-(其中Rx 係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基)及/或3-至10-員，較佳地5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由N、O和S、-SO-或-SO2 -組成之群中選出的雜原子(較佳地)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
L5 較佳地為-(CH2 )m -(CHRS )n -(OCH2 CH2 )o -(X)p -(CH2 )q -基團，其中m=1-3、n=0、o=0-7、p=0及q=0或1。特佳的係給予-(CH2 )m -(CHRS )n -(OCH2 CH2 )o -(X)p -(CH2 )q -基團，其中m=1或2、n=0、o=0或1、p=0及q=0或1。
L6 較佳地為選自-CONH-和-NHCO-之基團。
L7 較佳地為一單鍵或-[(CH2 )x -(X4 )y ]w-(CH2 )z -，其中w=0至20； x=0至5；y=0或1；z=1至5；及 X4 係代表-O-、-CONH-、-NHCO-或。
特佳地，L7 為一單鍵或-[(CH2 )x -NHCO-)]基團，其中x=1至5。
特佳地，-L5 -L6 -L7 -係代表-(CH2 )m -(CHRS )n -(OCH2 CH2 )o -(X)p -(CH2 )q -NHCO-[(CH2 )x -NHCO-)]，其中m=1或2、n=0、o=0或1、p=0，及q=0或1，及x=1-5。
然而，此二個結構亦可能共同存在本發明之接合物中。
根據本發明，這些活結合子/性化合物接合物可由下式之化合物來製備 其中L具有下式A‘： 較佳地，A‘轉變成A係藉由在具有7.5至8.5，較佳地8之pH的pH緩衝劑中攪拌，於低於37℃的溫度，較佳地10至25℃，於高達40小時的期間內，較佳地1至15小時，來進行。
實施例I：
一下式之抗體接合物
其中R2、R4和R5係代表H；R3係代表-CH2 OH；R1係代表-L1-L2-BINDER，其中L1係代表 其中#2係代表與L2的連接處，而#1係代表於其他連接之連接處；及L2係代表下式A5或A6之一或二者：
其中#1 係指與結合子硫原子的連接點，#2 係指與L1 基團的連接點，及 R22 係代表COOH、COOR、COR、CONHR(其中R在各情況下係代表C1-3-烷基)、CONH2 ，較佳地COOH。
在本發明之接合物或本發明之接合物的混合物中，連接結合子的半胱胺酸殘基之鍵係存在達較佳地80%以上，特佳地90%以上的程度(在各情況下係以連接子與結合子之連接鍵的總數為基準)，特佳地為式A5或A6二種結構之一。
本處，式A5或A6之結構一般係共同存在，較佳地，以結合子之連接鍵的數目為基準，比率係從60：40至40：60。則其餘的鍵係以下列結構存在
此結合子較佳的為一結合蛋白或胜肽，特佳地一人類、人源化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段，特別是抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段，或抗-EGFR抗體或其抗原結合片段。特佳的係給予專一與TWEAKR位置47的胺基酸D(D47)結合之抗-TWEAKR抗體(SEQ ID NO：169)，特別是抗-TWEAKR抗體TPP-2090，或抗-EGFR抗體西妥昔單抗或尼妥珠單抗。就結合子的另一種選擇，亦可有半胱胺酸殘基存在。
治療用途
可使用本發明化合物治療之過度增生疾病包括，特別是癌症和腫瘤疾病之群。在本發明內文中，請了解這些係指，特別是下列疾病(但不限於此)：乳腺癌和乳腺腫瘤(乳腺癌包括乳管和小葉形式，亦為原位)、呼吸道腫瘤(小細胞和非小細胞癌、支氣管癌)、腦腫瘤(例如腦幹和下視丘之腫瘤、星細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、膠質細胞瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤和神經上皮細胞瘤及松果體腫瘤)、消化器官之腫瘤(食道、胃、膽、小腸、大腸、 直腸和肛門癌)、肝腫瘤(其中包括，肝細胞癌、膽管細胞癌和混合肝細胞及膽管細胞癌)、頭頸區之腫瘤(喉頭、下咽、鼻咽、口咽、嘴唇和口腔癌、口黑瘤)、皮膚腫瘤(基底細胞癌、刺狀細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、惡性黑素瘤、非黑色素皮膚癌、梅克爾細胞皮膚癌、肥大細胞腫瘤)、軟組織之腫瘤(其中包括，軟組織癌、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤)、眼睛之腫瘤(其中包括，眼內黑色素瘤和視網膜母細胞瘤)、內分泌和外分泌腺之腫瘤(例如甲狀腺和副甲狀腺、胰臟和唾腺之腫瘤、腺癌)、泌尿道之腫瘤(膀胱、陰莖、腎、腎盂和輸尿管之腫瘤)和生殖器官之腫瘤(女性的子宮內膜、子宮頸、卵巢、陰道、外陰和子宮之腫瘤，及男性前列腺和睪丸之腫瘤)。這些亦包括實體形式和循環血液細胞之血液、淋巴系統和骨髓的增生性血液疾病，例如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，如急性骨髓性、急性淋巴母細胞性、慢性淋巴細胞性、慢性粒細胞性和髮細胞白血病，以及AIDS-相關的淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和中樞神經系統之淋巴瘤。
這些人類中完整記述之疾病亦可以類似病因發生於其他哺乳動物並可同樣的以本發明之化合物來治療。
以本發明化合物治療上述癌症疾病係包括治療實體腫瘤和治療其轉移或循環形式。
在本發明內文中，術語「治療(treatment或treat)」係以其習用的意義來使用並係指以打擊、減低、減弱或緩解疾病或健康異常為目的來看護、照顧及護理病患，並改善受此疾病衝擊，例如癌症事件的生活狀況。
本發明進一步係提供本發明化合物用於治療及/或預防病症，特別是上述病症之用途。
本發明進一步係提供本發明化合物用於製備醫藥品供治療及/或預防病症，特別是上述病症之用途。
本發明進一步係提供本發明化合物於治療及/或預防病症，特別是上述病症之方法中的用途。
本發明進一步係提供使用一有效量之至少一種本發明化合物，供治療及/或預防病症，特別是上述病症之方法。
本發明化合物可單獨使用，或若需要與一或多種其他的藥理活性物質組合，只要此組合不會導致不欲的及不可接受的副作用。本發明因此進一步係提供包括至少一種本發明化合物和一或多種另外的活性化合物之醫藥品，特別是供治療及/或預防上述疾病。
例如，本發明化合物可與已知的抗過度增生、細胞生長抑制或細胞毒性物質組合，用於治療癌症。適合的組合活性化合物之實例包括：131I-chTNT、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龍(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地白介素(aldesleukin)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、alisertib、阿利維甲酸(alitretinoin)、alpharadin(鐳-223氯化物)、六甲蜜胺(altretamine)、胺基格魯米特(glutethimide)、AMP-514、胺柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿加來必(arglabin)、三氧化砷(arsenic trioxide)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、AT9283、阿西替尼(axitinib)、氮胞啶(azacitidine)、巴厘昔單抗(basiliximab)、貝洛替康(belotecan)、苯達莫司汀(bendamustin)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、、貝沙羅汀(bexaroten)、比卡魯胺(Bicalutamide)、比生群(Bisantrene)、博來黴素(bleomycin)、BMS-936559、博舒替尼(Bosutinib)、硼替佐米(bortezomib)、(brentuximab vedotin)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、卡巴他賽(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、亞葉酸鈣(calcium folinate)、左旋亞葉酸鈣(calcium levofolinate)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib(蛋白酶體抑制劑)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡妥索單抗(catumaxomab)、塞來昔布(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯地孕酮 (chlormadinone)、氮芥(chlormethine)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribin)、唑來膦酸(clodronic acid)、克羅拉濱(clofarabine)、copanlisib、克立他酶(crisantaspase)、克佐替尼(crizotinib)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、CYC116、環丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、阿法達貝泊汀(darbepoetin-alfa)、達拉非尼(dabrafenib)、達魯舍替(danusertib)、達沙替尼(dasatinib)、柔紅黴素(daunorubicin)、地西他濱(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素融合二毒素(denileukin diftitox)、地諾單抗(denosumab)、地洛瑞林(deslorelin)、二溴螺氯銨(dibrospidium chloride)、多西它賽(docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星+雌酮(estrone)、依庫珠單抗(eculizumab、依決洛單抗(edrecolomab)、依利醋銨(elliptinium acetate)、艾曲波帕(eltrombopag)、內皮抑素(endostatin)、ENMD-2076、依諾他濱(enocitabine)、表柔比星(epirubicin)、環硫雄醇(epitiostanol)、阿法依伯汀(epoetin-alfa)、倍他依泊汀(epoetin-beta)、依鉑(eptaplatin)、eribulin、厄洛替尼(erlotinib)、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依託泊苷(etoposide)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法屈唑(fadrozole)、非格司亭(filgrastim)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、福美坦(formestane)、福莫司汀(fotemustine)、氟維司群(fulvestrant)、硝酸鎵、加尼瑞克(ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉姆單抗(gemtuzumab)、glutoxim、戈舍瑞林(goserelin)、組織胺二鹽酸鹽、組氨瑞林(histrelin)、羥基脲、I-125粒子、伊班膦酸(ibandronic acid)、替伊莫單抗(ibritumomab-tiuxetan)、依魯替尼(ibrutinib)、伊達比星(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊馬替尼(imatinib)、咪喹莫德(imiquimod)、INCB24360、英丙舒凡(improsulfan)、干擾素-α 、干擾素-β 、干擾素-γ 、伊匹木單抗(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan、伊沙匹隆(ixabepilone)、lambrolizumab、蘭瑞肽(lanreotide)、拉帕替尼(lapatinib)、來那度胺(lenalidomide)、來格司亭 (lenograstim)、香菇多糖(lentinan)、來曲唑letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin、左旋咪唑(levamisole)、麥角乙脲(lisuride、洛鉑(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼達明(lonidamine)、馬索羅酚(masoprocol)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、美雄烷(mepitiostane)、巰嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、甲基氨基酮戍酸(Methyl aminolevulinate)、甲睾酮(methyltestosterone)、米伐木肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、miriplatin、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴衛矛醇(mitolactol)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、MLN-8054、Mps1抑制劑(揭示於WO2013/087579，特言之實例01.01，WO2014/131739，特言之實例2)、奈達鉑(nedaplatin、奈拉濱尼洛替尼(nelarabine)、奈莫柔比星(nemorubicin)、尼祿替尼(nilotinib)、尼魯米特(nilutamide)、尼妥珠單抗、尼莫司汀(nimustine)、二胺硝吖啶(nitracrine)、nivolumab、NMS-P715、NMS-P937、奧法木單抗(ofatumumab)、奧美拉唑(omeprazole)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、p53基因治療、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、palbociclib、帕利夫明(palifermin)、鈀-103粒子、帕米膦酸(pamidronic acid)、帕尼單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、培門冬酶(pegaspargase)、PEG-倍他依泊汀(PEG-epoetin-beta)(甲氧基-PEG-倍他依泊汀)、培非司亭(pegfilgrastim)、Peg-干擾素-α-2b、培美曲塞(pemetrexed)、噴他佐辛(pentazocin)、噴司他丁(pentostatin)、培洛黴素(peplomycin)、培磷醯胺(perfosfamide)、溶鏈菌素(picibanil)、吡柔比星(pirarubicin)、普樂沙福(plerixafor)、普卡黴素(plicamycin)、聚胺葡糖(poliglusam)、聚磷酸雌二醇(polyestradiol phosphate)、多糖-K、ponatinib、葉吩姆鈉(porfimer-sodium、普拉曲沙(pralatrexate)、潑尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、喹高利特(quinagolide)、R763、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫司汀(ranimustine)、雷佐生 (razoxane)、refametinib、regorafenib、利塞膦酸(risedronic acid)、利妥昔單抗(rituximab)、羅米地新(romidepsin)、romiplostim、roninciclib、盧梭替尼(ruxolitinib)、沙格司亭(sargramostim)、西普魯塞-T(sipuleucel-T)、西佐喃(sizofiran)、索布佐生(sobuzoxane)、甘氨雙唑鈉(sodium glycididazole)、SNS-314、索拉非尼(sorafenib、鏈佐星(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、他拉泊芬(talaporfin)、他米巴羅汀(tamibarotene)、他莫昔芬(tamoxifen)、他索納明(tasonermin)、替西白介素(teceleukin)、替加氟(tegafur、替加氟+吉美嘧啶+奧替拉西(tegafur+gimeracil+oteracil)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、坦羅莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮(testosterone)、替曲膦(tetrofosmin)、沙利度胺(thalidomide)、塞替派(thiotepa)、胸腺法新(thymalfasin)、TKM-PLK1、硫鳥嘌呤(tioguanine)、托西莫單抗(tocilizumab)、曲貝替定(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫單抗(tositumomab)、陶紮色替(tozasertib)、他比特定(trabectedin)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、trastuzumab emtansine、曲奧舒凡(treosulfan)、維甲酸(tretinoin)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林(triptorelin)、曲磷胺(trofosfamide)、色胺酸、烏苯美司(ubenimex)、戍柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、維司力農(vesnarinone)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、長春瑞濱(vinorelbin)、volasertib、伏林司他(vorinostat)、伏氯唑(vorozol)、XL228、釔-90玻璃微珠、淨司他丁(zinostatin)、淨司他丁斯酯(zinostatin-stimalamer)、唑來膦酸(zoledronic acid)、佐柔比星(zorubicin)。
此外，本發明之化合物可與，例如能與下列標靶結合之結合子組合：OX-40、CD137/4-1BB、DR3,IDO1/IDO2、LAG-3,CD40。
此外，本發明之化合物亦可與放射線治療及/或手術介入組合使用。
一般而言，可以本發明化合物與其他細胞抑制或細胞毒性活性劑的組合實行下列目標： ●相較於以個別的活性化合物治療，對減緩腫瘤生長、降低其大小或甚至完全消除具改良活性；●比單一治療之情況，使用較低劑量化療劑之可能性；●相較於個別給藥，具極少副作用之更耐受治療的可能性；●可能治療更廣泛的腫瘤疾病；●對治療達到較高的反應率；●相較於目前標準治療，病患存活時間更長。
此外，本發明化合物再者亦可與放射線治療及/或手術介入組合使用。
本發明進一步係提供包括至少一種本發明化合物，典型地以及一或多種惰性、無毒、醫藥上可接受賦形劑之醫藥品，及其用於上述目的之用途。
本發明化合物可全身性及/或局部作用。就此目的，其可以適合之方式來給藥，例如非經腸，可能藉由吸入或為植入物或支架。
本發明化合物可以適合這些給藥路徑之給藥形式來投予。
非經腸給藥可繞過吸收步驟(例如靜脈內、動脈內、心內、脊椎內或腰內)或包括吸收(例如肌肉內、皮下、皮內、經皮或腹膜內)。適合非經腸投予之給藥形式包括溶液、懸浮液、乳液或凍乾物形式之注射和輸液調配物。非經腸給藥為較佳，特別是靜脈給藥。
一般而言，已發現在非經腸給藥之情況下有利的為給予約0.001至1mg/kg體重，較佳地0.01至0.5mg/kg體重之量，以便達到效果。
然而可能須偏離上述之量，特別是依體重、給藥路徑、個體對活性化合物之取向、調配物的性質和給藥進行的時間點或間隔而定。因此，在某些情況下以低於上述最小量即足夠，而在其他的情況下則必須超過所述之上限量。就給予相當大量的情況下，適當的係將這些量分成數個個別的劑量分散於一天中。
圖1： 不同物種之富含TWEAKR半胱胺酸-區(胺基酸34至68)的比對(數字係顯示包括訊號序列之全長結構中的胺基酸位置；SEQ ID NO：169)。
圖2： A-TWEAKR(SEQ ID NO：169)結構之示意圖。此圖係顯示胞外區(胺基酸28-80)(SEQ ID NO：168)包括富含半胱胺酸區(36-67)，跨膜區-TM(81-101)和胞內區(102-129)。TPP-2202-完整的膜外區域(28-80)，與hIgG1的Fc區融合。TPP-2203-具有截斷N-端和C-端之胞外區(34-68)，與hIgG1的Fc區融合。雙硫橋Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64係以黑色條線表示。N-端上和C-端上，TPP-2203比未經修飾的富含半胱胺酸區分別多出2個胺基酸和多出1個胺基酸，以確保妥適的摺疊。TPP-1984-胞外區具有C-端截斷(28-68)，與HIS6標記融合。全部3個結構係顯示相當的與本發明抗體及PDL-192(TPP-1104)之結合性。P4A8(TPP-1324)僅與全長的胞外區結合(TPP-2202)。
B-胞外區之胺基酸序列：已公開該胺基酸64為TWEAK配體結合所必須；及如本處所測定，胺基酸47為結合本發明抗體所必須。
圖3： TWEAKR膜外區域與抗體和參考抗體之相互作用。所顯示的為以TWEAKR-Fc融合蛋白塗覆(TPP-2202,1μg/ml)及以0.08μg/ml(空心長條)和0.03μ/ml(實心長條)之生物素化IgG作為可溶性結合夥伴之ELISA結果。使用鏈黴親和素-HRP和Amplex Red基質進行偵測。Y為「ELISA訊號強度[Rfu]；X為「受試抗體組成」：a為「TPP-2090」；b為「TPP-2084」；c為「PDL-192(TPP-1104)」；d為「P4A8(TPP-1324)」；e為「P3G5(TPP-2195)」；f為「136.1(TPP-2194)」；h為「ITEM1」；i為「ITEM4」；j為小鼠同型對照組；k為人類同型對照組。所有受檢測的抗體在80ng/ml濃度時皆顯示飽和的結合。
圖4： TWEAKR之富含半胱胺酸區與本發明抗體和參考抗體之相互作用。所顯示的為以TWEAKR(34-68)-Fc融合蛋白塗覆(TPP-2203,1μg/ml)及以0.08μg/ml(空心長條)和0.03μ/ml(實心長條)之生物素化IgG作為可溶性 結合夥伴之ELISA結果。偵測係使用鏈黴親和素-HRP和Amplex Red基質來進行。X為受試抗體組成：a為「TPP-2090」；b為「TPP-2084」；c為「PDL-192(TPP-1104)」；d為「P4A8(TPP-1324)」；e為「P3G5(TPP-2195)」；f為「136.1(TPP-2194)」；h為「ITEM1」；i為「TEM4」；j為小鼠同型對照組；k為人類同型對照組。所有受檢測的抗體在80ng/ml濃度時皆顯示飽和的結合。
圖5： TWEAKR(28-68)與本發明抗體和參考抗體之相互作用。所顯示的為以TWEAKR(28-68)-HIS塗覆(TPP-1984,1μg/ml)及以0.08μg/ml(空心長條)和0.03μ/ml(實心長條)之生物素化IgG作為可溶性結合夥伴之ELISA結果。偵測係使用鏈黴親和素-HRP和Amplex Red基質來進行。X為受試抗體組成：a為「TPP-2090」；b為「TPP-2084」；c為「PDL-192(TPP-1104)」；d為「P4A8(TPP-1324)」；e為「P3G5(TPP-2195)」；f為「136.1(TPP-2194)」；h為「ITEM1」；i為「ITEM4」；j為小鼠同型對照組；k為人類同型對照組。所有受檢測的抗體在80ng/ml濃度時皆顯示飽和的結合。
圖6： A-富含半胱胺酸-區之丙胺酸掃描。就PDL-192(TPP-1104)(X)-和TPP-2090(Y)-結合，分析TWEAKR(34-68)-Fc之突變蛋白。將S37A、R38A、S40A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A和L65A突變蛋白表現在HEK293細胞(黑色菱形)。塗覆PFL192(TPP-1104)及TPP-2090(1μg/ml)並加入HEK293發酵液之8-倍稀釋的上清液供TWEAKR蛋白結合。X為「PDL-192/TTP-1104相互作用之ELISA強度[Rfu]」，Y為「TPP-2090相互作用之ELISA強度[Rfu]」。TPP-2090(Y)顯示對D74A-TWEAKR突變蛋白(封閉方框)結合下降，及PDL-192(TPP-1104)(X)顯示對R56A結合下降(點狀方框)。
B-Y為「正常化至野生型結合訊號[%]之結合%」，1為「TPP-2090」；2為「PDL-192(TPP-1104)」；3為「P4A8(TPP-1324)」。(1μg/ml)，加入 250ng/ml之TWEAKR變體，經由抗-HIS HRP偵測。與野生型結構相較，TTP-2090顯示低於5%結合。
圖7： 如Pellegrini等人所公開的TWEAKR膜外區域之NMR結構(FEBS 280：1818-1829)。TWEAK結合係依L46而定(Pellegrini等人)，TTP-2090結合係依D47而定，而PDL-192係與R56結合。PDL-192結合與TWEAK配體結合位置相反，TPP-2090直接與TWEAK配體位置結合。
 實例
下列實例係說明本發明。本發明不限於此等實例。
除非另有說明，否則下列試驗和實例中的百分比為重量百分比；分量為重量份。在各案例中，液體/液體溶液之溶劑比例、稀釋比例和濃度數據係以體積為基準。
合成路徑：
作為操作實例之示例，下列流程係顯示產生此等操作實例之示例性合成路徑：
a)三光氣，THF，於氬氣下
[a)：EDCI,HOBT，二異丙基乙基胺，RT；b)乙醇，哌啶，甲基胺，水，RT；c)HATU，二異丙基乙基胺，RT；d)TFA,DCM,RT]
[a)：例如EDCI,HOBT，二異丙基乙基胺，DMF,RT；b)例如DCM/TFA 20：1,RT；c)例如HATU，二異丙基乙基胺，DMF,RT；d)例如TFA,DCM,RT]
[a)：例如2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽，二異丙基乙基胺，DCM,RT；b)例如2M LiOH溶液，THF，水，RT,HPLC分離結構異構物；c)例如EDCI,HOBT,二異丙基乙基胺，DMF,RT；d)例如TFA,DCM,RT]
[a)：例如H2 ,Pd-C,EtOH,RT；b)例如對-硝基苯甲基溴，K2 CO3 ,DMF；c)例如乙醇，40%濃度甲基胺溶液之水中溶液，50℃；d)例如二亞硫酸鈉，THF，水，50℃；e)例如HATU，二異丙基乙基胺，DMF,RT；f)例如哌啶，40%濃度甲基胺溶液之水中溶液，乙醇，50℃；g)例如二異丙基乙基胺，DMF,RT；h)例如哌啶，DMF,RT；i)TFA,DCM,RT]
[a)：例如Et3 N,DMF,RT；b)例如H2 ,Pd-C,EtOH/乙酸乙酯/THF(1：1：1),RT；c)例如4-甲基嗎福啉，DMF,RT；d)例如HATU,HOAt，二異丙基乙基胺，DMF,RT；e)例如TFA,RT]
[a)：例如NaBH(OAc)3 ,HOAc，二氯甲烷，RT；b)例如氯乙醯基氯，NEt3 ,DCM,RT；c)例如Cs2 CO3 ,DMF,50℃；d)例如1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1),T3P(R) ，二異丙基乙基胺，MeCN,RT；e)例如TFA,RT]
[a)：例如甲磺酸氯化物，NEt3 ，二氯甲烷，0℃；b)例如NaN3 ,DMF,40℃；c)例如H2 ,Pd-C,EtOH/乙酸乙酯(1：1),RT；d)例如TBAF,THF,RT；e)例如1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮，NEt3 ,CaCO3 ,1,4-二烷，RT；f)例如N-濾琥珀醯亞胺，TEMPO，四-正丁基氯化銨，氯仿，0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)；g)例如NaBH(OAc)3 ,HOAc，二氯甲烷， RT；h)例如氯乙醯基氯，NEt3 ,DCM,RT；i)例如TBAF,THF，水，RT；j)例如4-甲基嗎福啉，DMF,RT；k)例如TFA,RT]
[a)：例如甲醛，Na2 CO3 ，水，RT；b)例如Ac2 O，吡啶，THF,RT；c)例如丙二酸二-第三丁酯，KOtBu,THF,RT；d)例如LiBH4 ,THF,RT；e)例如TBDMSCl,咪唑，DCM,RT；f)例如戴斯-馬汀過碘烷(Dess-Martin periodinane),DCM；g)例如三乙氧基硼氫化鈉，AcOH,DCM,RT；h)例如nBu4 NF,THF,RT；i)例如SOCl2 ,THF,RT；j)例如AcSK,nBu4 NI,DMF,90℃；k)例如NaOH,MeOH,THF,RT；l)例如TCEP，二烷，RT；m)例如分離表異構物；n)例如 6N鹽酸，THF,RT o)例如Mal-dPEG(3)-Mal,PBS緩衝劑，ACN,RT]
[a)：例如Mal-dPEG(3)-Mal,PBS緩衝劑，ACN,RT]
[a)：例如BF3 OEt2 ,THF,0℃；b)：例如亞硝酸異戊酯，-10℃,0.5h；c)：例如2-氯-3-氧代丁酸甲酯，吡啶，水，-5℃；d)：例如NEt3 ，甲苯，RT；e)：例如Et3 SiH,TFA,RT；f)：例如LiBH4 ,THF,60℃；g)：例如戴斯-馬汀過碘烷， DCM,RT；h)：例如(R)-(+)-甲基-2-丙亞磺醯胺，異丙醇鈦(IV),THF,RT；i)：例如第三-BuLi，戊烷，THF，-78℃；j)：例如HCl於二烷中，THF,MeOH,RT；k)：例如3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛，NaB(OAc)3 H,AcOH,DCM,RT；l)：例如2-氯-2-側氧乙酸乙酯，NEt3 ,DCM,RT；m)：例如甲基胺，水，EtOH,50℃]
[a)：例如N-(第三丁氧基羰基)-5-側氧-L-正纈胺酸第三丁酯，NaB(OAc)3 H,AcOH,DCM,RT；b)：例如2-氯-2-側氧乙酸乙酯，NEt3 ,DCM,RT；c)：例如甲基胺，水，EtOH,60℃；d)：例如THF,DCM,50℃；e)：例如Boc2 O,NEt3 ,DCM,RT；f)：例如三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1),HATU,二異丙基乙基胺，DMF,RT；f)：例如TFA,DCM,RT]
[a)：例如三乙氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM,RT；b)例如乙醯氧基乙醯氯，NEt3 ，DCM,RT；c)例如LiOH,THF/水，RT；d)例如H2 ,Pd-C,EtOH,RT；e)例如 Teoc-OSu,NEt3 ，二烷，RT；f)例如Fmoc-Cl，二異丙基乙基胺，二烷/水2：1,RT]
[a)：例如三乙氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM,RT；b)例如乙醯氧基乙醯氯，NEt3 ,DCM,RT；c)例如LiOH，甲醇，RT；d)例如TFA,DCM,RT；e)例如Boc2 O,二異丙基乙基胺，DCM,RT]
[a)：例如苯甲基溴，Cs2 CO3 ,DMF,RT；b)例如Pd(dppf)2 Cl2 ,DMF,Na2 CO3 ,85℃；c)例如LiAlH4 ,THF,0℃；MnO2 ,DCM,RT；d)例如Ti(iOPr)4 ,THF,RT；e)例如tBuLi,THF,-78℃；MeOH,NH4 Cl；f)例如HCl/1,4-二烷]
流程26：經由水解琥珀醯胺合成半胱胺酸-連接的ADC此方法特別是用於其中L1=CH2 之ADC，將這些ADC轉變成開鏈連結形式。
[a)：三乙氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM,RT；b)乙醯氧基乙醯氯，二異丙基乙基胺，DCM,RT；c)LiOH,MeOH,RT；d)三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)HATU,DMF，二異丙基乙基胺，RT；e)氯化鋅，三氟乙醇，50℃,EDTA.]
[a)：HATU,DMF，二異丙基乙基胺，RT；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃,EDTA.]
[a)：三乙氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM,RT；b)乙醯氧基乙醯氯，三乙基胺，DCM,RT；c)LiOH,MeOH,RT；d)三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)HATU,DMF，二異丙基乙基胺，RT；e)氯化鋅，三氟乙醇，50℃,EDTA.]
[a)：2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽(BEP),DCM，吡啶，RT；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃,EDTA；c)3-4當量的TCEP,PBS緩衝劑；d)PBS緩衝劑，20h RT.]
[a)：2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽(BEP),DCM，吡啶，RT；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃,EDTA；c)3-4當量的TCEP,PBS緩衝劑；d)PBS緩衝劑，20h RT.]
A.實例
縮寫及首字母縮寫：
若於本揭示文的內容中在描述反應時未給予溫度，則通常應假設為室溫。
HPLC和LC-MS法：
方法1(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 1mm；移動相A：1l of水+0.25ml的99%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.25ml的99%濃度甲酸；梯度：0.0min 90% A→1.2min 5% A→2.0min 5% A烘箱：50℃；流速：0.40ml/min；UV偵測：208-400nm.
方法2(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters,BEH300,2.1 x 150mm,C18 1.7μm；移動相A：1l of水+0.01%甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→1.5min 2% B→8.5min 95% B→10.0min 95% B；烘箱：50℃；流速'：0.50ml/min；UV偵測：220nm
方法3(LC-MS)：
MS儀器：Waters(Micromass)QM；HPLC儀器：Agilent 1100系列；管柱：Agilent ZORBAX Extend-C18 3.0 x 50mm 3.5微米；移動相A：1l的水+0.01mol的碳酸銨，移動相B：1l的乙腈；梯度：0.0min 98% A→0.2min 98% A→3.0min 5% A→4.5min 5% A；烘箱：40℃；流速：1.75ml/min；UV偵測：210nm
方法4(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters,HSST3,2.1 x 50mm,C18 1.8μm；移動相A：1l的水+0.01%甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 10% B→0.3min 10% B→1.7min 95% B→2.5min 95% B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：210nm
方法5(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 1mm；移動相A：1l的水+0.25ml的99%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.25ml的99%濃度甲酸；梯度：0.0min 95% A→6.0min 5% A→7.5min 5% A烘箱：50℃；流速：0.35ml/min；UV偵測：210-400nm.
方法6(LC-MS)：
儀器：Micromass Quattro Premier配有Waters UPLC Acquity；管柱：Thermo Hypersil GOLD 1.9μ 50 x 1mm；移動相A：1l的水+0.5ml的50%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.5ml的50%濃度甲酸；梯度：0.0min 97% A→0.5min 97% A→3.2min 5% A→4.0min 5% A；烘箱：50℃；流速：0.3ml/min；UV偵測：210nm.
方法7(LC-MS)：
儀器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50 x 2.1mm；移動相A：1l的水+0.25ml的99%濃度甲酸；移動相B：1l的乙腈+0.25ml的99%濃度甲酸；梯度：0.0min 90% A→0.3min 90% A→1.7min 5% A→3.0min 5% A；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：205-305nm.
方法8(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters,HSST3,2.1 x 50mm,C18 1.8μm；移動相A：1l的水+0.01%甲酸；移動相B：11的乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→2.0min 2% B→13.0min 90% B→15.0min 90% B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：210nm
方法9：LC-MS-製備式純化法用於實例181-191(方法 LIND-LC-MS-Prep)
MS儀器：Waters；HPLC儀器：Waters(管柱Waters X-Bridge C18,19mm x 50mm,5μm，移動相A：水+0.05%氨，移動相B：梯度之乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV偵測：DAD；210-400nm).
或：
MS儀器：Waters；HPLC儀器：Waters(管柱Phenomenex Luna 5μ C18(2)100A,AXIA Tech.50 x 21.2mm，移動相A：水+0.05%甲酸，移動相B：梯度之乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV偵測：DAD；210-400nm).
方法10：LC-MS分析法用於實例181-191(LIND_SQD_SB_AQ)
MS儀器：Waters SQD；HPLC儀器：Waters UPLC；管柱：Zorbax SB-Aq(Agilent),50mm x 2.1mm,1.8μm；移動相A：水+0,025%甲酸，移動相B：乙腈(ULC)+0.025%甲酸；梯度：0.0min 98%A-0.9min 25%A-1.0min 5%A-1.4min 5%A-1.41min 98%A-1.5min 98%A；烘箱：40℃；流速：0.600ml/min；UV偵測：DAD；210nm.
方法11(HPLC)：
儀器：HP1100系列
管柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e,50-4.6mm,型號1.51450.0001，預管柱Chromolith Guard Cartridge套組，RP-18e,5-4.6mm，型號1.51470.0001
梯度：流速5ml/min注射量5μl
溶劑A：HClO4 (70%濃度)溶於水(4ml/l)
溶劑B：乙腈開始20% B 0.50min 20% B 3.00min 90% B 3.50min 90% B 3.51min 20% B 4.00min 20% B
管柱溫度：40℃
波長：210nm
對於其製備並未明確描述於下文中的所有反應物或試劑，其係由市售一般可取得的來源所購得。對於其製備同樣並未描述於下文，且並非市售或由非一般性可取得的來源所獲得的其他反應物或試劑，係給予其中描述其製備之公開的文獻作為參考。
起始化合物和中間物：
中間物C1
三氟乙酸-(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(1：1)
標題化合物係如WO2006/002326中所述加以製備。
中間物C2
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基} 胺基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸第三丁酯
將4.22g(14.5mmol)的N-(第三丁氧基羰基)-L-高絲胺酸第三丁酯溶於180ml的二氯甲烷，及然後加入3.5ml的吡啶和9.2g(21.7mmol)的1,1,1-三乙醯氧基-1λ5 ,2-苯并碘雜唑-3(1H)-酮。將反應於RT攪拌1h及然後以500ml的二氯甲烷稀釋並以10%濃度硫代硫酸鈉溶液萃取二次及然後以5%濃度檸檬酸連續萃取二次及以10%濃度碳酸氫鈉溶液萃取二次。將有機層分離出，以硫酸鎂乾燥及然後於減壓下乾燥。將殘餘物以乙醚處理，並加入HCl(溶於乙醚之溶液)。將沉澱濾出及然後將濾液濃縮並以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到3.7g(93%)的(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸第三丁酯，無進一步純化將其用於下個步驟。(Rf ：0.5(DCM/甲醇95/5).
將3.5g(9.85mmol)的中間物C1溶於160ml的DCM，並加入3.13g(14.77mmol)的三乙氧基硼氫化鈉和0.7ml的乙酸。於RT攪拌5min後，加入3.23g(11.85mmol)的(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸第三丁酯並將反應於RT另再攪拌30min。然後於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於乙腈/水中處理。將沉澱的固體濾出並乾燥，得到5.46g(84%)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.5min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.13min；MS(ESIpos)：m/z=613(M+H)+ .
中間物C3
(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸
將5.46g(8.24mmol)的中間物C2溶於160ml的DCM，及然後加入4.8ml的三乙基胺和2.2ml(20.6mmol)的乙醯氧基乙醯氯。將反應於RT攪拌至隔夜及然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中處理並以飽和的碳酸氫鈉溶液萃取三次及然後以飽和的氯化鈉溶液萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥及然後濃縮。將殘餘物以管柱層析於Biotage/Isolera(SNAP 340g)上使用移動相環己烷/乙酸乙酯2：1純化。由此得到4.57g(75%)的醯化中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.49min；MS(ESIpos)：m/z=713(M+H)+ .
將1g(1.36mmol)的此中間物溶於20ml的DCM，並加入20ml的TFA。於RT攪拌5h後，將混合物濃縮並將殘餘物以正戊烷濕磨二次。在各情況下，將正戊烷傾析出並將剩餘的固體於高真空下乾燥。由此得到1.1g的(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-胺基丁酸/三氟乙酸(1：1)。LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=557(M+H)+ 。
將0.91g(1.57mmol)的此中間物溶於70ml的DCM，並加入3.43g(15.7mmol)的二碳酸二第三丁酯和4.1ml的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌30min後，將反應以DCM稀釋並以5%濃度檸檬酸萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥並濃縮。將殘餘物以正戊烷濕磨二次及在各情況下，將正戊烷傾析出。將剩餘的固體以乙腈/水1：1冷凍乾燥，得到1.11g的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.55min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.3min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+ .
中間物C4
(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸/三氟乙酸(1：1)
5.46g(8.24mmol)的中間物C2溶於160ml的DCM，並加入4.8ml的三乙胺和2.2ml(20.6mmol)的乙醯氧基乙醯氯。將反應於RT攪拌至隔夜及然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中處理並以飽和的碳酸氫鈉溶液萃取三次及然後以飽和的氯化鈉溶液萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥及然後濃縮。將殘餘物以管柱層析於Biotage/Isolera(SNAP 340g上使用移動相環己烷/乙酸乙酯2：1純化。由此得到4.57g(75%)的醯化中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.49min；MS(ESIpos)：m/z=713(M+H)+ .
將1.5g(2.035mmol)的此中間物置於50ml的乙醇中處理，並加入5.8ml的40%濃度甲胺水溶液。將反應於50℃攪拌4h及然後濃縮。將殘餘物置於DCM中處理並以水清洗二次。將有機層以硫酸鎂乾燥及然後濃縮。將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到1.235mg的此中間物，將其進一步反應無進一步純化。
將1.235mg(1.5mmol)的此中間物溶於15ml的DCM，並加入15ml的TFA。於RT攪拌4h後，將混合物濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮並將殘餘物以乙腈冷凍乾燥。由此得到1.04g(quant) 的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=515(M+H)+ .
中間物C5
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸
將0.9g(1.24mmol)的中間物C4溶於60ml的DCM，並加入2.7g(12.5mmol)的二碳酸二第三丁酯和3.3ml的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌45min後，將反應濃縮並將殘餘物置於乙醚中處理並加入正戊烷直到混合物開始變混濁。將反應冷卻至0℃及然後傾析。再一次將正戊烷加到殘餘物中並將混合物傾析。將剩餘的固體以乙腈/水1：1冷凍乾燥，得到0.95g(quant)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.5min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.27min；MS(ESIpos)：m/z=615(M+H)+ .
中間物C6
{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-肼基-1-氧丁-2-基}胺甲酸三氟乙酸鹽/第三丁酯(1：1)
將150mg(0.16mmol)的中間物C3溶於21ml的DMF，及然後加入37.2mg(0.19mmol)的N -(3-二甲基胺基丙基)-N '-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、37mg(0.243mmol)的1-羥基苯并三唑、85μl的N ,N -二異丙基乙基胺及最後45mg(0.18mmol)的市售9H-茀-9-基甲基肼羧羧酯。將反應於RT攪拌至隔夜及然後於減壓下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮並將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到60mg(41%的理論值)經保護的中間物。
HPLC(方法11)：Rt =2.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.47min；MS(ESIpos)：m/z=893(M+H)+ .
將60mg(0.067mmol)的此中間物溶於19ml的乙醇，並加入681μl的哌啶和386μl的40%濃度甲胺水溶液。將反應於50℃攪拌18h及然後濃縮。將殘餘物置於中乙腈/水2：1處理並TFA以調整至pH 2。然後將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到25mg(51%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.2min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.27min；MS(ESIpos)：m/z=629(M+H)+ .
中間物C7
1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸/三氟乙酸 (1：1)
將0.2g(0.305mmol)的中間物C3溶於80ml的DCM，加入0.125g(0.46mmol)的2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽(BEP)、94mg(0.61mmol)的市售乙基肼基乙酸酯鹽酸鹽和159μl的N,N -二異丙基乙基胺，及然後將混合物於RT攪拌1h。然後將乙酸乙酯和水加入反應混合物中，並進行分層。將有機層以飽和的氯化鈉溶液萃取及然後以硫酸鎂乾燥萃取，過濾並濃縮。將殘餘物於減壓下乾燥及進一步反應無純化。就此，將其置於20ml的四氫呋喃中處理，並加入10ml的水和3.2ml的2N氫氧化鋰溶液。將反應於RT攪拌1h及然後使用TFA調整至pH 7。然後將反應濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。就此項，標題化合物係從較早溶離的區域異構物分離出。將對應的溶離份組合。凍乾及乾燥，得到19.7g(8%的理論值於2個步驟中)的標題化合物為無色泡沫。
HPLC(方法11)：Rt =2.4min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.22min；MS(ESIpos)：m/z=687(M+H)+ .
區域異構物的結構指派係在分離區域異構物後，於保護的中間物階段，以分開的實驗藉由NMR光譜來進行。保護的中間物(1-{(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸乙酯之標題化合物具有下列之1H NMR光譜：
1 H NMR(500MHz,DMSO-d6 )：δ=7.8(m,2H),7.4-7.2(m,6H),7.08(m,1H), 6.73(d,1H),5.6(s,1H),5.25和4,89(2d,2H),4.89和4.77(2d,2H),4.62(t,1H),4.32和3.78(2d,2H),4.1(t,2H),3.62-3.47(m),2.13(s,3H),1.41和0.72(2m,2H),1.3(s,9H),1.18(t,3H),0.92(s,9H).
中間物C8
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸
將293mg(0.41mmol)的中間物C3溶於25ml的DMF，及然後加入144mg(0.75mmol)的N -(3-二甲基胺基丙基)-N '-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、128mg(0.83mmol)的1-羥基苯并三唑、218μl的N ,N -二異丙基乙基胺和最後70mg(0.5mmol)的市售3-甲氧基-3-氧代丙烷-1-氯化銨。將反應於RT攪拌4h及然後於減壓下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到177mg(53%的理論值)保護的中間物。
HPLC(方法11)：Rt =2.6min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.33min；MS(ESIpos)：m/z=742(M+H)+ .
將177mg(0.22mmol)的此中間物置於20ml的甲醇中處理，並加入2.8ml的2N氫氧化鋰溶液。將反應於RT攪拌18h。然後將混合物濃縮，將殘餘物置於中處理水並將溶液使用5%濃度檸檬酸調整至pH 5。然後將混合物以DCM萃取二次並將有機層以硫酸鎂乾燥及濃縮。最後將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥，得到133mg(81%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.3min；
LC-MS(方法3)：Rt =7.4min；MS(ESIpos)：m/z=686(M+H)+ .
中間物C9
(6S)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-4,7-二側氧-3,11,14,17-四氧雜-5,8-二氮雜二十烷-20-酸
在第一步驟，將70mg(0.114mmol)的中間物C5與32mg(0.114mmol)的3-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸第三丁酯於15ml的DMF中，在44mg(0.228mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、35mg(0.228mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物和60μl的N,N -二異丙基乙基胺的存在下，進行偶合。
將反應於RT攪拌至隔夜並將產物以製備式HPLC純化。由此得到33mg(33%的理論值)保護的中間物。將其以1.1ml的三氟乙酸於11ml的二氯甲烷中攪拌1h，後續處理後得到26mg(98%)的全保護化合物。
最後，將中間物置於2ml的DCM中處理並在各情況下藉由加入10mg的二碳酸二第三丁酯和79μl的N,N -二異丙基乙基胺二次於RT攪拌3天，導入第三丁氧基羰基保護基。將產物以製備式HPLC純化，得到16.4mg(66%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.3min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.22min；MS(ESIpos)：m/z=818(M+H)+ .
中間物C10
{3-[{(1R)-1-[1-(3-胺基苯甲基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯
標題化合物係由中間物C1以6個步驟所製備：在第一步驟，將1g(2.77mmol)的中間物C1和0.864g(5mmol)的(3-氧丙基)胺甲酸第三丁酯於100ml的甲醇中混合，並加入400ml的乙酸和1.288g(13.9mmol)的硼烷-吡啶複合物。將反應於RT攪拌3天。然後將混合物於減壓下濃縮並將殘餘物以快速層析於矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/乙酸乙酯9：1->二氯甲烷/甲醇95：5)。將適當的溶離份濃縮並於於高真空下乾燥，得到1.255g(80%的理論值)的N-烷化中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.0min；MS(ESIpos)：m/z=513(M+H)+ .
將1.255g(2.2mmol)的此中間物溶於50ml的DCM，及然後加入1.2ml的三乙胺和0.52ml(4.85mmol)的乙醯氧基乙醯氯。將反應於RT攪拌至隔夜及然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中處理並以飽和的碳酸氫鈉溶液萃取三次及然後以飽和的氯化鈉溶液萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥及然後濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。
由此得到593mg(41%的理論值)的醯化中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.4min；MS(ESIpos)：m/z=613(M+H)+ .
將993mg(0.91mmol)的此中間物溶於100ml的乙醇及，加入60mg的 10%鈀活性碳後，在RT於標準氫氣壓下氫化3min。然後將催化劑過濾出並於減壓下移除溶劑。由此得到494mg(91%的理論值)的去苯甲基化咪唑衍生物為一實質無色的油狀物。LC-MS(方法1)：Rt =1.17min；MS(ESIpos)：m/z=523(M+H)+ .
起初將150mg(0.25mmol)的此中間物注入15ml的DMF，並加入69.2mg(0.5mmol)的碳酸鉀。於RT攪拌15min後，加入60mg(0.28mmol)的對硝基苯甲基溴並將混合物攪拌至隔夜。然後於減壓下移除溶劑，及將殘餘物置於乙酸乙酯中處理並以飽和的碳酸氫鈉溶液萃取。將有機層以飽和的氯化鈉溶液清洗，於旋轉蒸發器上濃縮並以製備式HPLC純化。將適當的溶離份於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物以1,4-二烷冷凍乾燥。由此得到169mg(quant.)的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.39min；MS(ESIpos)：m/z=658(M+H)+ .
將165mg(0.251mmol)的此中間物置於30ml的乙醇中處理，並加入0.35ml的40%濃度的甲胺水溶液。將反應於50℃攪拌55h，然後再次加入相同量的甲基胺溶液。攪拌10h後，將反應於減壓下濃縮。將蒸餾液以乙醚再蒸餾二次及然後將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到148mg(89%的理論值)的此中間物。
LC-MS(方法6)：Rt =2.97min；MS(ESIpos)：m/z=616(M+H)+ .
將98mg(0.15mmol)的此前驅物溶於15ml的THF，及然後於RT加入569mg(3.27mmol)二亞硫酸鈉之6ml水中溶液。於50℃攪拌後8h，再次加入相同量的二硫亞磺酸鹽-溶於1ml的H2 O。於50℃再次攪拌16h後，將反應冷卻至RT並以乙酸乙酯萃取。將有機層濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將殘餘物以1,4-二烷凍乾，得到44.5mg(47%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.24min；MS(ESIpos)：m/z=586(M+H)+ .
中間物C11
R/S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-高半胱胺酸/三氟乙酸鹽(1：1)
最初將990.0mg(2.79mmol)的(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺注入15.0ml的二氯甲烷中，並加入828.8mg(3.91mmol)的三乙氧基硼氫化鈉和129.9mg(3.21mmol)的乙酸，及將混合物於RT攪拌5min。加入溶於15.0ml的二氯甲烷之698.1mg(3.21mmol)的2-(三甲基矽基)乙基(3-氧丙基)胺甲酸酯(中間物L58)，並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物乙酸乙酯以稀釋並將有機層在各情況下以飽和的碳酸鈉溶液和飽和的NaCl溶液清洗二次。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物使用矽膠純化(移動相：二氯甲烷/甲醇100：2)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到1.25g(73%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.09min；MS(ESIpos)：m/z=556(M+H)+ .
將151.4mg(1.5mmol)的三乙胺和161.6mg(1.43mmol)的氯乙醯氯加到400.0mg(0.65mmol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸中。將反應混合物於RT攪拌至隔夜中。將乙酸乙酯加到反應混合物中並將有機層以水清洗三次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。將有機層以硫酸鎂乾燥並於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物使用矽膠純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯3：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到254.4mg(57%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.49min；MS(ESIneg)：m/z=676(M+HCOO- )- .
將117.4mg(0.19mmol)的2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯溶於10.0ml的異丙醇，並加入928.4μl的1M NaOH和50.2mg(0.37mmol)的DL-高半胱胺酸。將反應混合物於50℃攪拌4.5h。將乙酸乙酯加到反應混合物中並將有機層以飽和的碳酸氫鈉溶液和sat.NaCl溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到75.3mg(48%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.24min；MS(ESIpos)：m/z=731(M+H)+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.40(m,1H),0.75-0.91(m,11H),1.30(m,1H),1.99-2.23(m,2H),2.63-2.88(m,4H),3.18-3.61(m,5H),3.79-4.10(m,3H),4.89(d,1H),4.89(d,1H),5.16(d,1H),5.56(s,1H),6.82(m,1H),6.91(s,1H),6.97(m,1H),7.13-7.38(m,6H),7.49(s,1H),7.63(m,1H),8.26(s,3H).
中間物C12
R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基]高 半胱胺酸
此合成係類似合成中間物C11使用(2S)-4-側氧-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯(中間物L57)和中間物C52作為起始物來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =1.18min；MS(ESIpos)：m/z=775(M+H)+ .
中間物C13
9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸
將90.0mg(0.15mmol)的中間物C16和43.6mg(0.23mmol)的6-(乙醯基硫烷基)己酸溶於9.0ml的甲醇，並加入一滴的水和73.9mg(0.54mmol)的碳酸鉀。將反應混合物於50℃攪拌4h及然後以乙酸乙酯稀釋。將有機層 以水/飽和的NaCl溶液和飽和的NaCl溶液清洗及隨後以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上層析(移動相：二氯甲烷/甲醇=100：2)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到標題化合物為83%的理論值。
LC-MS(方法1)：Rt =1.44min；MS(ESIpos)：m/z=701(M+H)+ .
中間物C14
R/S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-側氧乙基]高半胱胺酸
起初將100.0mg(0.17mmol)的{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯(中間物C16)注入4.0ml的異丙醇中，及加入276.5mg(0.85mmol)的1M NaOH溶液及45.9mg(0.34mmol)的D/L-高半胱胺酸。將反應混合物於50℃攪拌1h。將反應混合物以乙酸乙酯稀釋。將有機層以飽和的碳酸氫鈉溶液及sat.NaCl溶液清洗。以硫酸鎂乾燥，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。
由此得到92.6mg(66%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.07min；MS(ESIpos)：m/z=688(M+H)+ .
中間物C15
[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯
將750.0mg(2.11mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)溶於15.0ml的二氯甲烷，及加入626.0mg(2.95mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及139μl(2.43mmol)的HOAc，並將混合物於RT攪拌5min。然後加入420.3mg(2.43mmol)的(3-氧丙基)胺甲酸第三丁酯(合成係根據文獻製程J.Med.Chem.2003,46,3536)，及將混合物於RT攪拌至隔夜。加入乙酸乙酯並將反應混合物以飽和的碳酸鈉溶液萃取二次。將有機層以sat.NaCl溶液清洗及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上層析(移動相：環己烷/乙酸乙酯=4：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到881.0mg(82%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.07min；MS(ESIpos)：m/z=513[M+H]+ .
中間物C16
{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯
起初將373.4mg(0.73mmol)的[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯(中間物C15)注入5.0ml的二氯甲烷中，並加入169.5mg(1.68mmol)的三乙胺及181.0mg(1.60mmol)的氯乙醯氯。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入乙酸乙酯並將混合物重複以水萃取。將有機層以sat.NaCl溶液清洗及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上層析(移動相：二氯甲烷/甲醇=100：0.5)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到336.0mg(75%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.48min；MS(ESIpos)：m/z=589[M+H]+ .
中間物C17
9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸
起初將50.0mg(0.09mmol)的{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯(中間物C16)注入2.0ml的DMF，並加入69.1mg(0.21mmol)的碳酸銫及28.8mg(0.10mmol)的1-硫烷基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸。將混合物於50℃攪拌至隔夜。加入水並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到25.1mg(35%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.42min；MS(ESIpos)：m/z=835[M+H]+ .
中間物C18
[22-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十五烷-25-基]胺甲酸第三丁酯
起初將21.0mg(0.03mmol)的9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸(中間物C17)和5.8mg(0.0.3mmol)的1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)注入1.0ml的乙腈中，並加入26.1mg(0.20mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及20.9mg(0.03mmol)的T3P(50%溶於乙酸乙酯)。將混合物於RT攪拌至隔夜.將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到19.7mg(79%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.42min；MS(ESIpos)：m/z=835[M+H]+ .
中間物C19
(13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-10-硫雜-7,13-二氮-2-矽十六烷-16-基)胺甲酸第三丁酯
起初將58.5mg(0.10mmol)的{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯(中間物C16)注入2.0ml的DMF，中並加入44.0mg(0.20mmol)的2-(三甲基矽基)乙基(2-硫烷基乙基)胺甲酸酯(中間物L39)和64.7mg(0.20mmol)的碳酸銫。將混合物於50℃攪拌4h.以46.6mg(0.079mmol)的中間物C16重複反應。將二個反應混合物組合及直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到98.0mg(71%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.62min；MS(ESIpos)：m/z=774[M+H]+ .
中間物C20
三氟乙酸/[3-({[(2-胺基乙基)硫烷基]乙醯基}{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯
起初將98.0mg(0.13mmol)的(13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-10-硫雜-7,13-二氮-2-異十六烷-16-基)胺甲酸第三丁酯(中間物C19)注入2.0ml的DMF/第三丁醇(9：1)中，並加入96.2mg(0.63mmol)的CsF。將混合物於90℃攪拌16h。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物凍乾。由此得到57.1mg(61%的理論值)的標題化合物。此化合物亦包括對應的亞碸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.08min；MS(ESIpos)：m/z=630[M+H]+ .
中間物C21
[38-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧雜-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-35-硫雜-4,32,38-三氮雜四十一烷-41-基]胺甲酸第三丁酯
起初將57.1mg(0.08mmol)的三氟乙酸/[3-({[(2-胺基乙基)硫烷基]乙醯基}{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯(中間物C20)注入3.0ml的DMF中，並加入53.0mg(0.08mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七-1-基}丙醯胺及15.5mg(0.15mmol)的三乙胺。將混合物於RT攪拌16h。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物凍乾。由此得到49.7mg(49%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1204[M+H]+ .
中間物C22
[38-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-35-氧化物-3,31,37-三氧雜-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-35 λ 4-硫雜-4,32,38-三氮四十一烷-41-基]胺甲酸第三丁酯
標題化合物係由合成中間物C21中的副產物所形成。由此得到15.5mg(15%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.25min；MS(ESIpos)：m/z=1220[M+H]+ .
中間物C23
3-胺基-4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯立體異構物之混合物
起初將411.2mg(1.15mmol)的3-甲醯基-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(中間物L28)和339.7mg(0.96mmol)的 N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)注入6.0ml的二氯甲烷中，並加入68.9mg(1.15mmol)的HOAc，及將混合物於RT攪拌1h。加入405.2mg(1.91mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及將混合物於RT攪拌2h。於減壓下蒸發溶劑並將乙酸乙酯和水加到殘餘物中。以乙酸乙酯萃取水層三次。將組合的有機層以sat.NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物使用Biotage Isolera純化(矽膠，管柱50g SNAP，流速40ml/min，石油醚/乙酸乙酯)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到541.5mg(81%的理論值)的化合物3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.24及1.29min；MS(ESIpos)：m/z=698[M+H]+ .
將541.5mg(0.78mmol)的3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯溶於13.0ml的二氯甲烷，及加入180.6mg(1.78mmol)的三乙胺。將反應溶液冷卻至0℃，加入233.1mg(1.71mmol)的乙醯氧基乙醯氯並將混合物於RT攪拌16h。另外加入180.6mg(1.78mmol)的三乙胺及233.1mg(1.71mmol)的乙醯氧基乙醯氯，及將混合物於RT另再攪拌80h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於水及乙酸乙酯間分溶。以乙酸乙酯萃取水層三次。將組合的有機層以sat.NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物使用Biotage Isolera純化(矽膠，管柱50g SNAP，流速40ml/min，石油醚/乙酸乙酯)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到529.2mg(86%的理論值)的化合物3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.53及1.56min；MS(ESIpos)：m/z=798[M+H]+ .
起初將529.2mg(0.66mmol)的3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入10.0ml的DMF/第三丁醇(9：1)中，並加入503.7mg(3.32mmol)的CsF。將反應混合物於90℃攪拌16h。將反應混合物置於水及乙酸乙酯間分溶。以乙酸乙酯萃取水層三次。將組合的有機層以sat.NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物使用Biotage Isolera純化(矽膠，管柱50g SNAP，流速25ml/min，二氯甲烷/甲醇)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到172.4mg(40%的理論值)的化合物3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-胺基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.05及1.35min；MS(ESIpos)：m/z=654[M+H]+ .
起初將172.4mg(0.26mmol)的3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-胺基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入4.5ml的甲醇/水(2：1)中，並加入80.2mg(0.58mmol)碳酸鉀並將混合物於RT攪拌16h。將反應混合物置於水及乙酸乙酯間分溶。以乙酸乙酯萃取水層三次。將組合的有機層以sat.NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到116.0mg(72%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.01min及1.03min；MS(ESIpos)：m/z=612[M+H]+ .
中間物C24
三氟乙酸/3-(胺基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(1：1)
將26.8mg的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)溶於3.0ml的二氯甲烷，及加入5.2mg(0.09mmol)的HOAc和22.4mg(0.11mmol)的三乙氧基硼氫化鈉並將混合物於RT攪拌5min。加入62.4mg(0.09mmol)的3-甲醯基-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(中間物L29)並將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到57.6mg(91%的理論值)的化合物三氟乙酸/3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.25及1.27min；MS(ESIpos)：m/z=712[M+H]+ .
起初將77.0mg(0.11mmol)的3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入1.5ml的二氯甲烷中，並加入21.9mg(0.22mmol)的三乙胺。然後於0℃加入29.5mg(0.22mmol)的乙醯氧 基乙醯氯及將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於乙酸乙酯中處理。將有機層在各情況下以水、飽和的碳酸氫鈉溶液及sat.NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑。以77.0mg(0.11mmol)的3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯重複反應。將組合的殘餘物於矽膠上純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯=2：1)。由此得到171.1mg(85%的理論值)的化合物3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.56及1.57min；MS(ESIpos)：m/z=812[M+H]+ .
起初將30.0mg(0.04mmol)的3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入0.5ml的TBAF溶液(1M之THF溶液)中。將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到25.0mg(92%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.98min；MS(ESIpos)：m/z=626[M+H]+ .
中間物C25
4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-羧酸
起初將171.4mg(0.48mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C1)注入4.0ml的二氯甲烷中，並加入248.5mg(0.72mmol)的3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-甲醯基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(中間物L30)和34.8mg(0.58mmol)的HOAc。將反應混合物於RT攪拌1h。加入204.4mg(0.97mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及將混合物於RT攪拌60h。於減壓下移除溶劑並將殘餘物使用Biotage Isolera純化(矽膠，管柱25g SNAP，流速25ml/min,石油醚/乙酸乙酯)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到267.0mg(77%的理論值)的化合物3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.49min；MS(ESIpos)：m/z=683[M+H]+ .
將267.0mg(0.39mmol)的3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸溶於5.0ml的二氯甲烷中，並加入91.0mg(0.90mmol)的三乙胺及將混合物冷卻至0℃。加入117.4mg(0.86mmol)的乙醯氧基乙醯氯，並將混合物於RT攪拌16h。另再加入593.4mg(5.87mmol)的三乙胺及427.0mg(3.13mmol)的乙醯氧基乙醯氯，及將混合物於RT另再攪拌10h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30； 10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。然後於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到216.3mg(71%的理論值)的化合物3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.70及1.72min；MS(ESIpos)：m/z=783[M+H]+ .
起初將216.3mg(0.28mmol)的3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入4.0ml的THF中，並加入16.6mg(0.28mmol)的HOAc及361.1mg(1.38mmol)的TBAF溶液(1M之THF溶液)。將反應溶液於RT攪拌4h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。然後於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到94.0mg(51%的理論值)的化合物3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=669[M+H]+ .
起初將52.0mg(0.08mmol)的3-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入4.0ml的PBS緩衝劑/乙腈(9：1)中，並加入1.2mg(0.01mmol)的TEMPO。然後同時加入14.1mg(0.16mmol)的亞氯酸鈉之1.0ml的水溶液及115.8μl的(0.16mmol)10%濃度次氯酸鈉溶液。將反應混合物於RT攪拌16h。將反應混合物倒入10%濃度亞硫酸鈉溶液中，並加入乙酸乙酯。以乙酸乙酯萃取水層三次及將組合的有機層以飽和的NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物用於下個合成步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=683[M+H]+ .
起初將103.0mg(0.15mmol)的4-{[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]甲基}-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-羧酸注入4.5ml的甲醇/水(2：1)中，並加入45.9mg(0.33mmol)碳酸鉀及將混合物於RT攪拌3h。將反應混合物置於水及乙酸乙酯間分溶。以乙酸乙酯萃取水層三次及將組合的有機層以飽和的NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並標題化合物用於下個合成步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =1.35min；MS(ESIpos)：m/z=641[M+H]+ .
中間物C26
[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基]胺甲酸第三丁酯
起初將590mg(1.69mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及155μl(2.70mmol,162mg)的乙酸注入30ml的二氯甲烷中，並將混合物於RT攪拌30min。然後逐滴加入溶於40ml二氯甲烷之600mg(1.687mmol)的(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(係由三氟乙酸/(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1：1)藉由以1N氫氧化鈉水溶液萃取所得來)和750mg(2.362mmol)的(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-甲醯基丙基)胺甲酸第三丁酯。將混合物於RT攪 拌2h。然後加入乙酸乙酯，將混合物以飽和的碳酸鈉溶液清洗並將有機層濃縮。將殘餘物以製備式HPLC分離(移動相：ACN/水，梯度)。由此得到510mg(46%的理論值)的目標化合物為非對映異構物混合物。
異構物1：
LC-MS(方法1)：Rt =1.36min(51%)；MS(EIpos)：m/z=657[M+H]+ .
異構物2：
LC-MS(方法1)：Rt =1.41min(49%)；MS(EIpos)：m/z=657[M+H]+ .
中間物C27
乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酯
起初將510mg(0,776mmol)的[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基]胺甲酸第三丁酯注入30ml的二氯甲烷中，並加入181mg(249μl,1.786mmol)的三乙胺及219mg(1.553mmol)的2-氯-2-側氧乙酸乙酯。將反應混合物於RT攪拌2h及然後以飽和的碳酸氫鈉溶液清洗。將有機層以硫酸鈉乾燥並於旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物以製備式HPLC分離(移動相： ACN/水，梯度)。由此得到290mg(49%的理論值)的目標化合物為表異構物混合物。
異構物1：
LC-MS(方法1)：Rt =1.70min；MS(EIpos)：m/z=757[M+H]+ .
異構物2：
LC-MS(方法1)：Rt =1.72min；MS(EIpos)：m/z=757[M+H]+ .
中間物C28
乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-(羥基甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酯
將285mg(0.376mmol)的乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酯溶於5ml的THF。加入452μl(0.452mmol)四-正丁基氟化銨之THF中的1M溶液，並將反應混合物於RT攪拌3h。將反應混合物以製備式HPLC分離(移動相：ACN/水，梯度)並凍乾。由此得到214mg(81%的理論值，純度根據LC/MS=92%)的目標化合物為表異構物混合物。
異構物1：
LC-MS(方法1)：Rt =1.37min；MS(EIpos)：m/z=643[M+H]+ .
異構物2：
LC-MS(方法1)：Rt =1.40min；MS(EIpos)：m/z=643[M+H]+ .
中間物C29
乙酸2-([3-(乙醯基硫烷基)-2-{[(第三丁氧基羰基)胺基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-氧代乙酯
起初將210mg(0.301mmol)的乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-2-(羥基甲基)丙基}胺基)-2-氧代乙酯注入8ml的無水THF，於RT逐滴加入溶於8ml的無水THF之178mg(1.503mmol,109μl)的亞硫醯氯並將混合物於RT攪拌40min。將反應混合物於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。將殘餘物置於16ml的無水DMF中處理，加入172mg(1.503mmol)的硫代乙酸鉀及133mg(0.361mmol)的四-正丁基碘化銨並及將混合物於90℃攪拌2h。冷卻後，加入水並以乙酸乙酯萃取混合物。將有機層於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水，梯度)並凍乾。由此得到155mg(69%的理論值，純度根據LC/MS=94%)的目標化合物為表異構物混合 物。
異構物1：
LC-MS(方法1)：Rt =1.50min；MS(EIpos)：m/z=701[M+H]+ .
異構物2：
LC-MS(方法1)：Rt =1.51min；MS(EIpos)：m/z=701[M+H]+ .
中間物C30
[二硫烷二基雙(2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙-3,1-二基)]雙胺甲酸二-第三丁酯
起初將1.220g(1.010mmol，純度根據LC/MS=58%)的乙酸2-([3-(乙醯基硫烷基)-2-{[(第三丁氧基羰基)胺基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-氧代乙酯注入30ml的THF中，並加入30ml的甲醇、10ml的1N氫氧化鈉水溶液及將混合物於RT攪拌2h。加入水並將反應混合物以二氯甲烷萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥並於旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水，梯度)。由此得到390mg(54%的理論值，純度根據LC/MS=86%)的目標化合物為非對映異構物混合物。
Isomers：
LC-MS(方法1)：Rt =1.81min；MS(EIpos)：m/z=1232[M+H]+ .
中間物C31
3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-(硫烷基甲基)丙基}胺甲酸第三丁酯
將390mg(0.272mmol，純度根據LC/MS=86%)的[二硫烷二基雙(2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙-3,1-二基)]雙胺甲酸二第三丁酯置於20ml的1,4-二烷及10ml的PBS緩衝劑中處理，並加入234mg(0.817mmol)的3,3',3"-磷烷三基三丙酸鹽酸鹽(1：1)。將混合物於RT攪拌16h。然後將反應混合物於旋轉蒸發器上濃縮及以二氯甲烷濕磨，並將濾液濃縮及於高真空下乾燥。將殘餘物溶於8ml的異丙醇及以對掌層析純化(管柱：250x30mm填入Daicel Chiralpak AZ-H，移動相：異己烷/異丙醇=90：10)。由此得到目標化合物的二個溶離份。溶離份1含有181.2mg(50%的理論值)的異構物1及溶離份2產生90.2mg(25%的理論值)的異構物2。
異構物1：
對掌HPLC(管柱：250x4.6mm，填入Diacel Chiralpak AZ-H，移動相：異己烷.乙醇90：10)：Rt =6.98min.
LC-MS(方法1)：Rt =1.47min；MS(EIpos)：m/z=617[M+H]+ .
異構物2：
對掌HPLC(管柱：250x4.6mm，填入Diacel Chiralpak AZ-H，移動相：異己烷.乙醇90：10)：Rt =9.39min.
LC-MS(方法1)：Rt =1.47min；MS(EIpos)：m/z=617[M+H]+ .
中間物C32
N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物1)
將123mg(199.42μmol)的{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-(硫烷基甲基)丙基}胺甲酸第三丁酯(異構物1)溶於2ml的THF及以10ml的半濃縮鹽酸於RT攪拌1h。將反應溶液於氬氣下脫氣及然後凍乾。由此得到108mg(98%的理論值)的目標化合物。
異構物1
LC-MS(方法1)：Rt =0.95min；MS(EIpos)：m/z=517[M+H]+ .
中間物C33
N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物2)
將123mg(199.42μmol)的{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-(硫烷基甲基)丙基}胺甲酸第三丁酯(異構物2)溶於2ml的THF及以10ml的半濃縮鹽酸於RT攪拌1h。將反應溶液於氬氣下脫氣及然後凍乾。由此得到58mg(63%的理論值，純度根據LC/MS=91%)的目標化合物。
異構物2
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=517[M+H]+ .
中間物C34
[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯
起初將3.790g(10.02mmol)的(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(由三氟乙酸/(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1：1)以1N氫氧化鈉水溶液萃取所得來)、3.186g(15.04mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及690μl(12.03mmol,722mg) 注入100ml的二氯甲烷中。將混合物於RT攪拌5min。
然後加入4.687g(27.06mmol)的(3-氧丙基)胺甲酸第三丁酯，並將混合物於RT攪拌16h。將反應混合物以稀釋二氯甲烷及以飽和的碳酸氫鈉溶液清洗。將有機層以硫酸鈉乾燥並於旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物藉由層析於矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/乙酸乙酯，梯度=4：1→1：1)。由此得到2.57g(48%的理論值，純度根據LC/MS=96%)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.00min；MS(EIpos)：m/z=513[M+H]+ .
中間物C35
{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯
起初將200mg(0.38mmol)的[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯注入9ml的無水二氯甲烷中，並於RT加入120μl(0.86mmol,87mg)的三乙胺。在RT，逐滴加入溶於1ml無水二氯甲烷之83mg(0.45mmol)的4-硝基苯甲醯氯，並將混合物於RT攪拌1h。加入水，並將混合物於旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)及乾燥。由此得到181mg(73%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.47min；MS(EIpos)：m/z=662[M+H]+ .
中間物C36
{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯
起初將170mg(0.26mmol)的{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯注入10ml的乙酸中。加入143mg(2.57mmol)的鐵粉，並將混合物於50℃攪拌16h。冷卻後，加入水並將混合物以乙酸乙酯萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥並於旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物於HV下乾燥。由此得到154mg(77%的理論值，純度根據LC/MS=82%)的目標化合物。
LC-MS(方法5)：Rt =4.73min；MS(EIpos)：m/z=632[M+H]+ .
中間物C37
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺
將38.6mg(0.05mmol,LC/MS純度=82%)的{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯溶於無水DMF，並加入24.8mg(0.06mmol)的HATU及13.0mg(0.10mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將混合物於RT攪拌5min，加入63mg(0.06mmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸並將混合物於RT攪拌3h。加入7.5mg(0.06mmol)的3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt)，並將混合物攪拌16h。加入19.1mg(0.05mmol)的HATU，及將混合物於50℃攪拌2h。冷卻後，將反應混合物直接以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)。由此得到6.5mg(9%的理論值，純度根據LC/MS=83%)的目標化合物。
LC-MS(方法2)：Rt =7.89min；MS(EIpos)：m/z=1200.6[M+H]+ .
中間物C38
2-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮
起初將300.0mg(0.84mmol)的2-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(中間物C1)注入4.0ml的二氯甲烷中，並加入58.3mg(0.97mmol)的HOAc及250.4mg(1.18mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及將混合物於RT攪拌5min。加入197.2mg(0.97mmol)的3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物以乙酸乙酯稀釋並將有機層以飽和的碳酸鈉溶液清洗二次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上純化(移動相：乙酸乙酯/環己烷1：5)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到333.3mg(70%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.05min；MS(ESIpos)：m/z=543[M+H]+ .
中間物C39
乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酯
起初將332.3mg(0.61mmol)的2-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(中間物C38)注入8.0ml的二氯甲烷中，並加入142.5mg(1.35mmol)的三乙胺。於0℃，加入184.0mg(1.35mmol)的乙醯氧基乙醯氯，並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物以乙酸乙酯稀釋及將有機層以飽和的碳酸氫鈉溶液清洗二次及以sat.NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下 蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上純化(移動相：乙酸乙酯/環己烷1：3)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到367.1mg(63%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.42min；MS(ESIpos)：m/z=643[M+H]+ .
中間物C40
N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺
起初將583.1mg(0.91mmol)的2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧乙酸乙酯(中間物C39)注入15.0ml的乙醇中，並加入1.41g(18.15mmol)的甲胺(40%水中溶液)。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以甲苯共蒸餾三次。將殘餘物於矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇=100：5)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到324.9mg(73%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=471[M+H]+ .
中間物C41
三氟乙酸/L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺(1：1)
起初將50.0mg(0.11mol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)和30.4mg(0.11mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸酯注入2.0ml的DMF中，並加入32.2mg(0.32mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入19.1mg(0.32mmol)的HOAc，並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到38.0mg(56%)的化合物[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧丙-2-基]胺甲酸第三丁酯
LC-MS(方法1)：Rt =1.26min；MS(ESIpos)：m/z=642[M+H]+ .
起初將33.6mg(0.05mmol)的[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧丙-2-基]胺甲酸第三丁酯注入3.0ml的二氯甲烷中。加入119.4mg(1.05mmol)的TFA並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到32.8mg(96%)的化合物三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺 (1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=542[M+H]+ .
起初將29.5mg(0.05mmol)的三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺(1：1)和14.1mg(0.05mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸注入1.0ml的DMF中，並加入18.2mg(0.18mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜及直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到23.1mg(69%)的化合物N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.30min；MS(ESIpos)：m/z=741[M+H]+ .
將19.4mg(0.03mmol)的N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺溶於1.5ml的二氯甲烷中，並加入59.7mg(0.52mmol)的TFA。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入119.4mg(1.04mmol)的TFA，並將混合物於RT再次攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ,流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到19.2mg(97%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.96min；MS(ESIpos)：m/z=641[M+H]+ .
中間物C42
2,5-二氟苯重氮四氟硼酸鹽
起初注入3.00g(21.16mmol,2.68ml)的三氟化硼-乙醚複合物，於0℃緩慢地逐滴加入溶於27ml無水THF的1.37g(10.58mmol)2,5-二氟苯胺。於-10℃，逐滴加入溶於3ml無水THF之1.61g(13.75mmol,1.85ml)的亞硝酸異戊酯溶液，並於相同的溫度持續攪拌30min。加入15ml的乙醚並將沉澱的重氮鹽濾出，以少許乙醚清洗及於高真空下乾燥。由此得到2.27g的目標化合物(94%的理論值)。
LC-MS(方法6)：Rt =0.24min；MS(ESIpos)：m/z=141[M]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=8.11-8.17(m,1H),8.36-8.43(m,1H),8.69-8.73(m,1H).
中間物C43
氯[2-(2,5-二氟苯基)亞肼]乙酸甲酯
於氬氣壓下，起初將3.63g(24.13mmol)的2-氯-3-氧代丁酸甲酯注入100ml的水中，並於-5℃加入48.90g(618.19mmol,50.00ml)的吡啶及將混合物於此溫度攪拌10min。然後於-5℃，加入5.00g(21.94mmol)的2,5-二氟苯重氮三氟硼酸鹽，產生橙色的懸浮液。將混合物於此溫度攪拌30min並將反應以水稀釋及以二氯甲烷萃取三次。將組合的有機層以飽和的氯化鈉溶液清洗，以硫酸鈉乾燥，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。由此得到5.52g的目標化合物(97%的理論值，純度根據LC/MS=96%).
LC-MS(方法1)：Rt =1.03min；MS(ESIpos)：m/z=249[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=3.85(s,3H),6.88-6.94(m,1H),7.16-7.21(m,1H),7.31-7.37(m,1H),10.00(s,1H).
中間物C44
4-苯甲醯基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-羧酸甲酯
將3.50g(13.52mmol)的氯[2-(2,5-二氟苯基)亞肼]乙酸甲酯(純度根據LC/MS 96%)溶於9ml的無水甲苯，加入2.61g(14.87mmol)的(2E)-3-(二甲基胺基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮及3.01g(29.73mmol),4.14ml)的三乙胺並將混合物於室溫攪拌16h。將反應混合物於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物以製備式HPLC分離(移動相：ACN/水含有0.1%甲酸，梯度)。由此得到1.79g(39%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.07min；MS(ESIpos)：m/z=343[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=3.86(s,3H),7.44-7.50(m,1H),7.55-7.72(m,4H),7.81-7.87(m,3H),8.80(d,1H).
中間物C45
[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇
起初將3.18g(8.92mmol)的4-苯甲醯基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-羧 酸甲酯(純度根據LC/MS=96%)注入50ml的三氟乙酸中，逐滴加入8.74g(75.13mmol,12ml)的三乙基矽烷並將混合物於室溫攪拌1h。將反應混合物於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。將得到的殘餘物置於120ml的無水THF中處理，並於0℃逐滴加入2.89g(33.63mmol,33.63ml)的硼烷-四氫呋喃複合物。將混合物於RT攪拌至隔夜。由於轉換率低，另再加入12.33ml(12.33mmol)的1M硼氫化鋰之THF溶液。將混合物於室溫攪拌1h，於60℃攪拌30min及於80℃攪拌2h。於0℃，將反應小心地以60ml的飽和的碳酸氫鈉溶液終止反應。將混合物在各情況下以100ml的乙酸乙酯萃取，將組合的有機層以硫酸鈉乾燥並於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到2.67g(76%的理論值，純度=96%)的目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt =2.79min；MS(ESIpos)：m/z=329[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=3.91(s,2H),4.45(d,2H),6.51(s,1H),7.18-7.23(m,2H),7.27-7.32(m,4H),7.46-7.53(m,1H),7.60-7.65(m,1H),7.95(d,1H).
中間物C46
4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛
將2.66g(8.50mmol)的[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇(純度96%)溶於150ml的二氯甲烷。並一次加入少許4.33g(10.20mmol)的戴斯-馬汀過碘烷。將混合物於室溫攪拌2h，然後加入100ml的半濃縮碳酸氫鈉溶液及100ml的10%濃度硫代硫酸鈉溶液及將混合物攪拌20min。 將有機層分離出，以硫酸鈉乾燥並於高真空下濃縮。由此得到2.35g(88%的理論值，純度=95%)的目標化合物。
LC-MS(方法7)：Rt =1.49min；MS(ESIpos)：m/z=299[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=4.12(s,2H),7.17-7.21(m,1H),7.27-7.31(m,4H),7.37-7.42(m,1H),7.57-7.62(m,1H),7.75-7.78(m,1H),8.22(d,1H),10.06(s,1H).
中間物C47
(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
將2.35g(7.56mmol)的4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛溶於25ml的無水THF中，並加入1.10g(9.08mmol)的(R)-(+)-2-甲基-2-丙亞磺醯胺及4.73g(16.64mmol)的異丙醇鈦(IV)。將反應混合物於室溫攪拌16h，及加入20ml的飽和氯化鈉溶液及30ml的乙酸乙酯。然後加入約3g的kieselguhr，及將混合物於回流下沸騰1h。將混合物過濾及將有機層從濾液中分離出。以乙酸乙酯萃取水層並將組合的有機層以飽和的氯化鈉溶液清洗，以硫酸鈉乾燥清洗，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。進一步使用此殘餘物無進一步純化。
於氬氣壓下，將殘餘物溶於60ml的無水THF並冷卻至-78℃，及逐滴加入14.5ml(23.24mmol)的第三丁基鋰之戊烷溶液(c=1.6mol/l)。將反應於-78℃攪拌℃ 3h及然後以5ml的甲醇及15ml的飽和氯化銨溶液終止反應。 攪拌下，讓反應混合物升至室溫(約30min.)。以乙酸乙酯萃取混合物及以飽和的氯化鈉溶液萃取有機層，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。進一步使用此殘餘物無進一步純化。
將殘餘物置於30ml的THF及6ml的甲醇中處理，加入6ml(24.00mmol)的4N氯化氫之二烷溶液並將混合物於室溫攪拌1h。然後加入15ml的飽和的碳酸鈉溶液，並以乙酸乙酯混合物萃取。將有機層分離出，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。將殘餘物以製備式HPLC分離(移動相：ACN/水，梯度)。由此得到目標化合物的二個溶離份。第一溶離份得到1.31g(72%的理論值，LC/MS純度=97%)及第二溶離份0.37g(17%的理論值，LC/MS純度=83%)的產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=356[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.91(s,9H),1.71(s,2H),3.59(s,1H),3.87(s,2H),7.17-7.32(m,6H),7.45-7.51(m,1H),7.61-7.65(m,1H),7.84(s br,1H).
中間物C48
(2S)-4-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸第三丁酯
將1.28g(3.35mmol,LC/MS純度93%)的(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶於100ml的無水二氯甲烷，並加 入261mg(4.35mmol,250μl)的乙酸及1.14g(4.34mmol)的三乙氧基硼氫化鈉，於室溫攪拌5分鐘後，接著加入1.19g(4.35mmol)的(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸第三丁酯。將混合物於室溫攪拌15min，於旋轉蒸發器上濃縮，以乙腈和水作後續處理及以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)。由此得到1.64g(80%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.10min；MS(ESIpos)：m/z=613[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=1.01(s,9H),1.32(s,9H),1.35(s,9H),1.80-1.89(m,1H),2.01-2.11(m,1H),2.54-2.71(m,2H),3.75-3.81(m,1H),3.90(s,2H),4.18(d,1H),7.13(d,1H),7.20-7.24(m,1H),7.28-7.34(m,5H),7.52-7.58(m,1H),7.76-7.80(m,1H),8.10(s br,1H),8.23(s br,1H).
中間物C49
(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸
將225mg(0.37mmol)的(2S)-4-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸第三丁酯溶於10ml的無水二氯甲烷中，並加入156mg(1.54mmol)的三乙胺。於0℃，加入125mg(0.92mmol)的乙醯氧基乙醯氯及將混合物於RT攪拌16h。另再加入251mg(1.84mmol)的乙醯氧基乙醯氯及186mg(1.84mmol)的三乙胺，並將混合物於RT攪拌3h。加入少許二氯甲烷並以飽和的碳酸氫鈉溶液及 飽和的氯化鈉溶液清洗混合物。將有機層以硫酸鈉乾燥，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。將殘餘物置於10ml的乙醇中處理，加入0.91ml(12.67mmol)的40%濃度甲胺水溶液並將混合物於50℃攪拌3h。將混合物於旋轉蒸發器上濃縮，將殘餘物置於二氯甲烷中處理及將有機層以水清洗二次。將有機層以硫酸鈉乾燥，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。將殘餘物置於2ml的二氯甲烷中處理，加入2ml(25.96mmol)的三氟乙酸並將混合物於50℃攪拌4h。將混合物於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物於高真空下乾燥。將殘餘物置於10ml的無水二氯甲烷中處理，加入298mg(2.95mmol)的三乙胺及429mg(1.97mmol)的二碳酸二第三丁酯並將混合物於RT攪拌1h。將混合物於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水，梯度)。由此得到62mg(27%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.32min；MS(ESIpos)：m/z=615[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.91(s,9H),1.32(s,9H),2.64-2.72(m,4H),3.50-3.58(m,1H),3.72(dd,2H),4.07-4.22(m,2H),4.47-4.54(m,1H),5.75(s,1H),6.84-6.89(m,1H),7.15-7.30(m,6H),7.47-7.53(m,1H),7.70-7.75(m,1H),8.09-8.13(m,1H),11.66(s br,1H).
中間物C50
[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧丁-2-基]胺甲酸第三丁酯
將60mg(0.1mmol)的(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸溶於10ml的無水DMF中，並加入74mg(0.20mmol)的HATU。將74mg(0.29mmol)的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)分開溶於2ml的無水DMF，加入38mg(0.29mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺並將此混合物逐滴加到反應混合物中。將反應於RT攪拌3d。將混合物直接以製備式HPLC純化。移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)。由此得到9.3mg(13%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=737[M+H]+ .
中間物C51
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸
首先，將中間物C47，類似中間物C2，以N-{(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧丁醯基}-β-丙胺酸苯甲基酯還原性烷化。其次，然後將胺基基團，如中間物C27所述，以2-氯-2-側氧乙酸乙酯進行醯化，及然後將二個酯基團以2M氫氧化鋰之甲醇溶液水解。由此得到23mg的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.24min；MS(ESIpos)：m/z=686(M+H)+ .
中間物C52
(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
起初將10.00g(49.01mmol)的4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯注入100.0ml的DMF中，並加入20.76g(63.72mmol)的碳酸銫及9.22g(53.91mmol)的苯甲基溴。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物置於水及乙酸乙酯間分溶並以乙酸乙酯萃取水層。將組合的有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。以90.0g的4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯重複反應。將二個組合的反應以製備式RP-HPLC純化(管柱：Daiso 300x100；10μ，流速：250ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到125.15g(87%的理論值)的化合物1-苯甲基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.18min；MS(ESIpos)：m/z=295[M+H]+ .
於氬氣下，起初將4.80g(16.32mmol)的1-苯甲基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯注入DMF中，並加入3.61g(22.85mmol)的(2,5-二氟苯基)硼酸、19.20ml的飽和的碳酸鈉溶液及1.33g(1.63mmol)的[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]-二氯鈀(II)：二氯甲烷。將反應混合物於85℃攪拌至隔夜。將反應混合物經由矽藻土過濾及以乙酸乙酯清洗濾餅。以水萃取有機層及然後以飽和的 NaCl溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物於矽膠上純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯100：3)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到3.60g(67%的理論值)的化合物1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯。
LC-MS(方法7)：Rt =1.59min；MS(ESIpos)：m/z=328[M+H]+ .
起初將3.60g(11.00mmol)的1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯注入90.0ml的THF中，並於0℃加入1.04g(27.50mmol)的氫化鋰鋁(2.4M之THF溶液)。將反應混合物於0℃攪拌30分鐘。於0℃，加入飽和的酒石酸鉀鈉溶液，及將乙酸乙酯加到反應混合物中。以飽和的酒石酸鉀鈉溶液萃取有機層三次。以飽和的NaCl溶液清洗有機層一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物溶於30.0ml的二氯甲烷。加入3.38g(32.99mmol)的氧化錳(IV)並將混合物於RT攪拌48h。另再加入2.20g(21.47mmol)的氧化錳(IV)並將混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物以矽藻土過濾及以二氯甲烷清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將此殘餘物2.80g的(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)無進一步純化用於下個合成步驟。
LC-MS(方法7)：Rt =1.48min；MS(ESIpos)：m/z=298[M+H]+ .
起初將28.21g(94.88mmol)的1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛與23.00g(189.77mmol)的(R)-2-甲基丙-2-亞磺醯胺注入403.0ml的無水THF中，並加入7.42g(237.21mmol)的異丙醇鈦(IV)及將混合物於RT攪拌至隔夜。加入500.0ml的飽和的NaCl溶液及1000.0ml的乙酸乙酯，並將混合物於RT攪拌1h。將混合物經由矽藻土過濾及將濾液以飽和的NaCl溶液清洗二次。將有機層以硫酸鎂乾燥，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物使用Biotage Isolera純化(矽膠，管柱1500+340g SNAP，流速200ml/min，乙酸乙酯/環己烷1：10)。
LC-MS(方法7)：Rt =1.63min；MS(ESIpos)：m/z=401[M+H]+ .
起初於氬氣下將25.00g(62.42mmol)的(R)-N-{(E/Z)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]伸甲基}-2-甲基丙-2-亞磺醯胺注入無水THF中，並冷卻至-78℃。然後於-78℃加入12.00g(187.27mmol)的第三丁基鋰(1.7M溶於丙烷之溶液)並將混合物於此溫度攪拌3h。於-78℃，然後連續加入71.4ml的甲醇及214.3ml的飽和氯化銨溶液，並讓反應混合物升溫至RT並於RT攪拌1h。將混合物以乙酸乙酯稀釋及以水清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物(R)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙-2-亞磺醯胺無進一步純化用於下個合成步驟。
LC-MS(方法6)：Rt =2.97min；MS(ESIpos)：m/z=459[M+H]+ .
起初將28.00g(61.05mmol)的(R)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙-2-亞磺醯胺注入186.7ml的1,4-二烷中，並然後加入45.8ml的HCl之1,4-二烷溶液(4.0M)。將反應混合物於RT攪拌2h及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：(管柱：Kinetix 100x30；流速：60ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發乙腈並將二氯甲烷加到水性殘餘物中。以碳酸氫鈉溶液清洗有機層及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到16.2g(75%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt =2.10min；MS(ESIpos)：m/z=338[M-NH2 ]+ ,709[2M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.87(s,9H),1.53(s,2H),3.59(s,1H),5.24(d,2H),6.56(s,1H),6.94(m,1H),7.10(d,2H),7.20(m,1H),7.26(m,2H),7.34(m,2H),7.46(m,1H).
中間物C53
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
首先，將中間物C52，類似中間物C2，以(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁酸苯甲基酯還原性烷化。然後將二級胺基基團，如中間物C27所述，以2-氯-2-氧乙酸乙酯進行醯化，及然後將二個酯基團以2M氫氧化鋰之甲醇溶液水解。將此方式得到的中間物溶於乙醇，加入鈀碳(10%)並將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化1h。將去保護的化合物置於二烷/水2：1中處理及在最後的步驟使用9H-茀-9-基甲基氯碳酸酯，在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下，導入Fmoc保護基。
LC-MS(方法1)：Rt =1.37min；MS(ESIpos)：m/z=734(M-H)- .
中間物C54
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁醯基]-β-丙胺酸
首先，將中間物C52，類似中間物C2，以N-[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-氧丁醯基]-β-丙胺酸苯甲基酯還原性烷化。然後將二級胺基基團，如中間物C27所述，以2-氯-2-氧乙酸乙酯進行醯化。將此方式得到的中間物溶於乙醇，加入鈀碳(10%)並將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化1h。然後將二個酯基團以2M氫氧化鋰之甲醇溶液水解。將去保護的化合物置於二烷/水2：1中處理及在最後的步驟使用9H-茀-9-基甲基氯碳酸酯，在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下，導入Fmoc保護基。由此得到48mg的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.38min；MS(ESIpos)：m/z=807(M+H)+ .
中間物C55
2-[3-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮
將340mg(0.96mmol)的(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶於7ml的無水DCM，並於RT加入69mg(1.15mmol,60μl)乙酸及284mg(1.34mmol)的三乙氧基硼氫化鈉。將混合物攪拌15min，及然後加入233mg(1.15mmol)的3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛。將混合物於RT攪拌4.5h。另再加入233mg(1.15mmol)的3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛、69mg(1.15mmol,60μl)乙酸及284mg(1.34mmol)的三乙氧基硼氫化鈉，並將混合物於RT攪拌7h。加入乙酸乙酯並以飽和的碳酸鈉溶液清洗反應混合物。將有機層濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化二次[1.)移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度；2.)移動相：ACN/水+1% TFA+1.0% NEt3 )]。由此得到108mg(21%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.96min；MS(ESIpos)：m/z=543[M+H]+ .
中間物C56
乙酸2-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酯
起初將102mg(0.19mmol)的2-[3-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮注入2ml的無水DCM中，並於RT加入44mg(0.43mmol)的三乙胺。於0℃，加入溶於1ml無水DCM之31mg(0.23mmol)的乙酸2-氯-2-氧代乙酯。將 混合物於RT攪拌40min。另再加入溶於0.5ml無水DCM之26mg的乙酸2-氯-2-氧代乙酯及19mg(0.19mmol)的三乙胺，並將混合物於RT攪拌60min。
加入水，將混合物於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)。由此得到106mg(88%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.37min；MS(ESIpos)：m/z=643[M+H]+ .
中間物C57
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-氧丁-2-基}胺甲酸第三丁酯(1：1)
標題化合物係根據標準方法藉由將中間物C49與9H-茀-9-基甲基(2-胺基乙基)胺甲酸酯在HATU存在下偶合及後續以哌啶移除保護基所製備。由此得到14mg的標題化合物(40%的理論值於2個步驟中)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.98min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+ .
中間物C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸
首先，將中間物C52，類似中間物C2，以(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁酸苯甲基酯還原性烷化。然後將二級胺基基團，如中間物C27所述，以2-氯-2-氧乙酸乙酯進行醯化，及然後將二個酯基團以2M氫氧化鋰之甲醇溶液水解。將此方式得到的中間物溶於乙醇，加入鈀碳(10%)並將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化1h。
將500mg(0.886mmol)該完全去保護的中間物置於60ml的二烷中處理，並加入253mg(0.975mmol)的1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮及198μl的三乙胺。於RT攪拌24h後，將反應濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合，於減壓下濃縮及於高真空下乾燥，得到312mg(50%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt =4.61min；MS(ESIpos)：m/z=658(M+H)- .
中間物C59
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
起初，將(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丁酸苯甲基酯之二級胺基基團以(2S)-2-甲氧基丙醯氯(中間物C53之中間物)，在三乙胺的存在下，如中間物C53所述進行醯化。將此方式得到的中間物置於乙醇中處理，加入鈀碳(10%)並將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化1h。將去保護的化合物置於二烷/水2：1中處理及在最後的步驟使用9H-茀-9-基甲基氯碳酸酯，在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下，導入Fmoc保護基。
LC-MS(方法1)：Rt =1.39min；MS(ESIpos)：m/z=764(M-H)- .
中間物C60
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
此合成係類似中間物C53來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =1.41min；MS(ESIpos)：m/z=750(M+H)+ .
中間物C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-β-丙胺酸
標題化合物係藉由將60mg(0.091mmol)的中間物C58與ß-丙胺酸甲酯偶合，接著以2M氫氧化鋰溶液裂解所製備。由此於2個步驟得到67mg(61% 的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.29min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+ .
中間物C62
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-D-丙胺酸
標題化合物係類似中間物C61由中間物C58及D-丙胺酸甲酯所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =1.32min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+ .
中間物C63
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-氧丁-2-基}胺甲酸第三丁酯(1：1)
合成此中間物在第一步驟係以50mg(0.075mmol)的中間物C3與26.2mg(0.082mmol)的9H-茀-9-基甲基(2-胺基乙基)胺甲酸鹽酸鹽(1：1)，在28.7mg(0.15mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、22.9mg(0.15mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及39μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下開始。於RT攪拌18h後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到45mg(65%的理論值)的此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.51min；MS(ESIpos)：m/z=921(M+H)+ .
將45mg(0.049mmol)的此中間物置於10ml的乙醇中處理，並加入176μl的40%濃度的甲胺水溶液。將反應於50℃攪拌，6h後及9h後加入相同量的甲胺溶液。於50℃另再攪拌14h後，另再加入700μl的甲胺溶液，及另再攪拌20h後，最後將混合物濃縮。將殘餘物置於DCM中處理及以水清洗。將有機層濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物於高真空下乾燥，得到32mg(99%的理論值)的{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-氧丁基-2-基}胺甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =0.95min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+ .
中間物C64
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-氧丁基-2-基}胺甲酸 2-(三甲基矽基)乙基酯(1：1)
標題化合物係由中間物C58類似中間物C63所製備。
HPLC(方法11)：Rt =2.4min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.01min；MS(ESIpos)：m/z=700(M+H)+ .
中間物C65
(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-(羥乙醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二側氧-5-氧雜-7,10-二氮-2-矽十四烷-14-酸
起初將215mg(0.59mmol)的中間物L66注入25ml的二氯甲烷中，並加入377mg(0.89mmol)的戴斯-馬汀過碘烷及144μl(1.78mmol)的吡啶。將混合物於RT攪拌30min。然後將反應以300ml的二氯甲烷稀釋及將有機層在各情況下以10%濃度Na2 S2 O3 溶液、10%濃度檸檬酸溶液及飽和的碳酸氫鈉溶液清洗二次。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。由此得到305mg的醛，將其反應無進一步純化。
將175mg(0.49mmol)的中間物C52溶於50ml的二氯甲烷，並加入147mg(0.69mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及32.5μl的乙酸。於RT攪拌5min後，加入上述214mg(0.593mmol)的醛，並將反應於RT攪拌至隔夜。本處，取代預期的產物，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-1-(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)丁-2-基]胺甲酸2-(三甲基矽基)乙基酯。因為此醯亞胺亦可轉變成標題化合物，所以將反應濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將含醯亞胺的適當溶離份組合物後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到195mg(58%)的上述名稱之醯亞胺。
LC-MS(方法5)：Rt =3.32min；MS(ESIpos)：m/z=667(M+H)+ .
將65mg(97.5μmol)的此醯亞胺置於15ml的二氯甲烷中處理，並加入367μl(3.4mmol)的乙醯氧基乙醯氯及595μl的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌30min後，無加熱於減壓下將反應濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合，蒸發溶劑及於高真空下乾燥後，得到28mg(37%的理論值)的(8S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十四烷-13-基乙酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.44min；MS(ESIpos)：m/z=767(M+H)+ .
將28mg(37μmol)的此中間物溶於3ml的甲醇中，並加入548μl的2M氫氧化鋰溶液。於RT攪拌10min後，以三氟乙酸將反應調整至pH 4及然 後濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合，蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥，得到26mg(96%的理論值)的標題化合物為白色固體。
LC-MS(方法1)：Rt =1.33min；MS(ESIpos)：m/z=743(M+H)+ .
中間物C66
[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-{[2-(甘胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-氧丁-2-基]胺甲酸2-(三甲基矽基)乙基酯
首先，由N-[(苯甲基氧基)羰基]甘胺酸及(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯，根據經典的胜肽化學法(HATU偶合及Boc移除)，製備三氟乙酸/{2-[(2-胺基乙基)胺基]-2-側氧乙基}胺甲酸苯甲酯(1：1)。
將13mg(0.036mmol)的此中間物和25mg(0.033mmol)的中間物C58置於3ml的DMF中處理，並加入19mg(0.05mmol)的HATU及17μl的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌10min後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到17.8mg(60%的理論值)的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.36min；MS(ESIpos)：m/z=891(M+H)+ .
將17mg(0.019mmol)的此中間物溶於10ml的乙醇，加入鈀碳(10%)及將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化2h。將催化劑濾出，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到9mg(62%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.03min；MS(ESIpos)：m/z=757(M+H)+ .
中間物C67
[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸9H-茀-9-基甲基酯
起初將605.3mg(1.71mmol)的(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中間物C52)注入10.0ml的二氯甲烷中，並加入506.7mg(2.39mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及117.9mg(1.96mmol)的乙酸並將混合物於RT攪拌5min。加入溶於10.0ml二氯甲烷之580.0mg(1.96mmol)的9H-茀-9-基甲基(3-氧丙基)胺甲酸酯(中間物L70)並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。以乙酸乙酯稀釋反應混合物及將有機層在各情況下以飽和的碳酸鈉溶液及飽和的NaCl溶液清洗二次。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑清洗二次。將殘餘物於矽膠上純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯3：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到514.7mg(46%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.10min；MS(ESIpos)：m/z=634(M+H)+ .
中間物C68
[3-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯
此合成係類似合成化合物中間物C67來進行。
1000.0mg(2.81mmol)的(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中間物C47)
835.0mg(3.94mmol)的三乙氧基硼氫化鈉
194.0mg(3.24mmol)的乙酸
560.0mg(3.24mmol)的(3-氧丙基)胺甲酸第三丁酯
由此得到695.8mg(48%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.02min；MS(ESIpos)：m/z=513(M+H)+ .
中間物C69
11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七烷-17-酸
起初將117.0mg(0.19mmol)的(2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯(中間物C70)和21.6mg(0.20mmol)的3-硫烷基丙酸注入3.0ml的甲醇中，並加入89.5mg(0.65mmol)的碳酸鉀並將混合物於50℃攪拌4h。將反應混合物以乙酸乙酯稀釋及將有機層以水及飽和的NaCl溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。將殘餘物無進一步純化用於下個合成步驟。由此得到106.1mg(73%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.42min；MS(ESIneg)：m/z=700(M-H)- .
中間物C70
(2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯
起初將908.1mg(1.63mmol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(參見中間物C11之合成)和545.6mg(5.39mmol)的三乙胺注入10.0ml的二氯甲烷中，並將混合物冷卻至0℃。於此溫度，加入590.5mg(5.23mmol)的氯乙醯氯並將混合物於RT攪拌至隔夜。以乙酸乙酯稀釋反應混合物及將有機層在各情況下以飽和的碳酸氫鈉溶液及飽和的氯化銨溶液清洗三次。以飽和的NaCl溶液清洗有機層及以硫酸鎂乾燥。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到673.8mg(65%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.53min；MS(ESIneg)：m/z=676(M+HCOO- )- .
中間物C71
S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將536.6mg(4.43mmol)的L-半胱胺酸懸浮於2.5ml的水與531.5mg(6.33mmol)的碳酸氫鈉。加入溶於25.0ml異丙醇之400.0mg(0.63mmol)的2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯(中間物C70)及1.16g(7.59mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯。將反應混合物於50℃攪拌1.5h。將乙酸乙酯加到反應混合物中，並將有機層重複以飽和的碳酸氫鈉溶液清洗及以sat.NaCl溶液清洗一次。將有機層以硫酸鎂乾燥，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到449.5mg(86%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.20min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+ .
中間物C72
(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二側氧-5-氧雜-7,10-二氮-2-矽十四烷-14-酸
起初將90mg(0.212mmol)的中間物L72注入6ml的二氯甲烷中，並加入86μl(1.06mmol)的吡啶及135mg(0.318mmol)的戴斯-馬汀過碘烷。將混合物於RT攪拌30min。然後將反應以30ml的二氯甲烷稀釋並將有機層以10%濃度Na2 S2 O3 溶液清洗二次及以5%濃度檸檬酸溶液清洗一次。將有機 層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將此方式得到的醛反應無進一步純化。
將63mg(0.177mmol)的中間物C52溶於15ml的二氯甲烷中，並加入52.4mg(0.247mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及20.2μl的乙酸。於RT攪拌5min後，加入上述89.6mg(0.212mmol)的醛，並將反應於RT攪拌20min。將反應於減壓下濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化，將適當的溶離份組合後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到71mg(53%的理論值於二個步驟中)的(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二側氧-5-氧雜-7,10-二氮-2-矽十四烷-14-酸苯甲基酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.21min；MS(ESIpos)：m/z=761(M+H)+ .
將70mg(92μmol)的此中間物置於15ml的二氯甲烷中處理，將混合物冷卻至10℃並加入54μl的三乙胺及25.5μl(0.23mmol)的乙醯氧基乙醯氯。於RT攪拌1h後，加入相同量的酸氯化物及三乙胺，及於RT另再攪拌1小時後，再加入一次。然後將反應於RT另再攪拌30min及然後於減壓下濃縮，並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合，蒸發溶劑和將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到46.5mg(59%的理論值)的醯化中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.53min；MS(ESIpos)：m/z=861(M+H)+ .
將46mg(53μmol)的此中間物溶於5ml的甲醇中，並加入2.7ml的2M氫氧化鋰溶液。於RT攪拌10min後，將反應以乙酸調整至pH 3-4及然後以15ml的水稀釋。以乙酸乙酯萃取水層及將有機層以硫酸鎂乾燥並濃縮。將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥，於高真空下乾燥殘餘物後，得到37mg(90%的理論值)的標題化合物為白色固體。
LC-MS(方法1)：Rt =1.32min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+ .
中間物C73
S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙 基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基矽基)丙醯基]-L-半胱胺酸
起初將619mg(0.86mmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)注入8.8ml的二氯甲烷中，並加入87mg(0.86mmol)的三乙胺及224mg(0.86mmol)的N-[2-(三甲基矽基)乙氧基羰基氧基]吡咯啶-2,5-二酮。1h後，加入45mg(0.17mmol)的N-[2-(三甲基矽基)乙氧基羰基氧基]吡咯啶-2,5-二酮。將反應混合物於RT攪拌1h。將混合物於減壓下濃縮，將殘餘物置於二氯甲烷中處理及然後將有機層以水及飽和的碳酸氫鈉溶液清洗二次。將有機層以硫酸鎂乾燥，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。使用此殘餘物無進一步純化。由此得到602mg(71%，純度87%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.58min；MS(ESIpos)：m/z=861(M+H)+ .
中間物L1
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)
標題化合物係藉由經典的胜肽化學法由市售(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸及(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.19min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.17min；MS(ESIpos)：m/z=198(M+H)+ .
中間物L2
三氟乙酸/rel-(1R,2S)-2-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環丙甲醯胺(1：1)
標題化合物係由50mg(0.214mmol)市售的順式-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-環戊羧酸及60mg(0.235mmol)同樣的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由與EDC/HOBT偶合及隨後以TFA去保護所製備。由此得到36mg(38%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.17min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+ .
中間物L3
三氟乙酸/(1S,2R)-2-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由50mg(0.214mmol)市售的(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸與72mg(0.283mmol)同樣的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由與EDC/HOBT偶合及隨後以TFA去保護所製備。由此得到13mg(16%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.2min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+ .
中間物L4
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)環己烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係藉由經典的胜肽化學法由市售1-[(4-{[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]羰基}環己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮及(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.26min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.25min；MS(ESIpos)：m/z=280(M+H)+ .
中間物L5
三氟乙酸/N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-β-丙胺醯胺(1：1)
標題化合物係藉由經典的胜肽化學法由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮及N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.22min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.22min；MS(ESIpos)：m/z=260(M+H)+ .
中間物L6
三氟乙酸/第三丁基-N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
標題化合物係藉由，在EDC/HOBT的存在在，先將市售的6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸與部份保護的胜肽L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸第三丁酯偶合，以經典的胜肽化學法所製備。接著在胺基基團於溫和條件下藉由於RT在5%濃度三氟乙酸之DCM溶液中攪拌去保護，其得到產率37%之標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.29min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.62min；MS(ESIpos)：m/z=566(M+H)+ .
中間物L7
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係根據經典的胜肽化學法由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮藉由，在HATU存在下，連續與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸偶合，以TFA去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸酯偶合，以TFA去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸酯偶合及另外以TFA去保護所製備。由此得到32mg的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.31min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.47min；MS(ESIpos)：m/z=516(M+H)+ .
中間物L8
三氟乙酸/L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係根據經典的胜肽化學法由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮，藉由連續與N2 -(第三丁氧基羰基)-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸，在HATU的存在下偶合，以TFA去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁 氧基羰基)-L-丙胺酸酯偶合及另再以TFA去保護所製備。由此得到171mg的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.23min；
LC-MS(方法7)：Rt =0.3min；MS(ESIpos)：m/z=417(M+H)+ .
中間物L9
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物L7由市售的(4-胺基苯基)乙酸甲酯所製備。由此得到320mg的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.45min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.48min；MS(ESIpos)：m/z=493(M+H)+ .
中間物L10
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-rel-N6 -{[(1R,2S)-2-胺基團戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：2)
標題化合物係由中間物L6，藉由與順式-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-環戊羧酸以EDC/HOBT偶合及隨後以TFA去保護所製備。由此得到12mg(52%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.45min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.73min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+ .
中間物L11
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{[(1S,2R)-2-胺基團戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：2)
標題化合物係由中間物L6藉由與(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸以EDC/HOBT偶合及隨後以TFA去保護所製備。由此得到11 mg(39%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.45min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.74min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+ .
中間物L12
三氟乙酸/1-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
將381mg(2.46mmol)的2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸甲酯加到溶於7ml二烷/水1：1之228mg(1.12mmol)的[2-(2-胺基乙氧基)乙基]胺甲酸第三丁酯中。然後加入1.2ml的飽和碳酸氫鈉溶液並將反應於RT攪拌。總計攪拌5天後，另再加入2個相同量的碳酸氫鈉溶液，將反應以三氟乙酸進行酸化作後續處理，於旋轉蒸發器上濃縮及以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合，於減壓下移除溶劑並將殘餘物以乙腈/水1：1冷凍乾燥。
將殘餘物置於3ml的二氯甲烷中處理，並加入1ml的三氟乙酸。於RT攪拌15min後，於減壓下移除溶劑並將殘餘物以乙腈/水1：1冷凍乾燥。由此得到70mg(67%的理論值於二個步驟)的標題化合物為樹脂狀殘餘物。
HPLC(方法11)：Rt =0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.18min；MS(ESIpos)：m/z=185(M+H)+ .
中間物L13
三氟乙酸/N2-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物係藉由(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸與N6-(第三丁氧基羰基)-L-1離胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)在EDC/HOBT的存在下偶合及隨後類似中間物L6，溫和地移除第三丁氧基羰基保護基所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.42min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.43min；MS(ESIpos)：m/z=340(M+H)+ .
中間物L14
三氟乙酸/1-[2-(4-胺基哌-1-基)-2-側氧乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
標題化合物係類似中間物L2於二個步驟由哌-1-基胺甲酸第三丁酯及(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.2min；
LC-MS(方法3)：Rt =0.25min；MS(ESIpos)：m/z=239(M+H)+ .
中間物L15
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙醯胺(1：1)
將2.93g(10.58mmol)的3-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸第三丁酯溶於100ml的二烷/水1：1，並加入3.28g(21.15mmol)的2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸甲酯及飽和的碳酸氫鈉溶液直到達到6-7之 pH。將溶液於RT攪拌30min及然後於減壓下蒸發1,4-二烷。然後加入200ml的水，並將混合物在各情況下以300ml的乙酸乙酯萃取三次。將有機層組合，以硫酸鎂乾燥及過濾。濃縮，得到3-(2-{2-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸第三丁酯為棕色油狀物，然後將其於高真空下乾燥。
HPLC(方法11)：Rt =1.5min；
LC-MS(方法3)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=375(M+NH4 )+ .
將此中間物以標準的方法轉化(以TFA去保護，與(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯偶合及另外以TFA去保護)成為標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.2min；
LC-MS(方法3)：Rt =0.25min；MS(ESIpos)：m/z=344(M+H)+ .
中間物L16
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸
將535mg(1.73mmol)市售的1-{6-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧己基}-1H-吡咯-2,5-二酮及930ml的N ,N -二異丙基乙基胺加到266mg(1.33mmol)的L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸之24ml的DMF溶液中。將反應以超音波浴處理24h及然後於減壓下濃縮至乾。將剩餘的殘餘物以製備式HPLC純化並將適當的溶離份濃縮及將殘餘物於高真空下乾燥後，得到337mg(50%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.4min；
LC-MS(方法3)：Rt =0.58min；MS(ESIpos)：m/z=468(M+H)+ .
中間物L17
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物係藉由起初將172mg(0.37mmol)的中間物L16與125mg(0.37mmol)的N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)在EDC/HOBT及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合，及然後於溫和條件下藉由於RT在10%濃度三氟乙酸之DCM溶液中攪拌2h去保護所製備。以乙腈/水冷凍乾燥，於二個步驟得到194mg(49%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.1min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.58min；MS(ESIpos)：m/z=652(M+H)+ .
中間物L18
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係由(4-胺基苯基)乙酸甲酯，類似中間物L7，連續根據經典的胜肽化學法藉由連接N2 -(第三丁氧基羰基)-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸，在HATU的存在下，以TFA去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁氧 基羰基)-L-丙胺酸酯偶合，以TFA去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸酯偶合及另外以TFA去保護所製備。由此得到330mg的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.29min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.41min；MS(ESIpos)：m/z=465(M+H)+ .
中間物L19
三氟乙酸/L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-(4-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}苯基)-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係由1,4-對苯二胺，連續根據經典的胜肽化學法所製備。在第一步驟，將942mg(8.72mmol)的1,4-對苯二胺以0.8g(2.9mmol)的N2 -(第三丁氧基羰基)-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸，在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下，單醯化。在第二步驟，以類似方式，將二級苯胺基團以(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸，在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下醯化。以TFA去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸酯偶合及另外然後以TFA去保護，於三個另外的合成步驟，由此路徑得到148mg標題合物，。
LC-MS(方法1)：Rt =0.21min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+ .
LC-MS(方法4)：Rt =0.2min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+ .
中間物L20
三氟乙酸/L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物根據經典的胜肽化學法，類似中間物L8，由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮藉由連續與N2 -(第三丁氧基羰基)-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸，在HATU的存在下偶合，以TFA去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸酯偶合及另外以TFA去保護所製備。由此得到171mg的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.28min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.39min；MS(ESIpos)：m/z=445(M+H)+ .
中間物L21
L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧乙基)苯基]-L-離胺醯胺
標題化合物係根據經典的胜肽化學法，由市售0.42g(2.56mmol)的(4-胺基苯基)乙酸甲酯，藉由連續與N6 -(第三丁氧基羰基)-N2 -[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-離胺酸，在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合，以哌啶去保護，與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺酸酯在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後於10%鈀活性碳上氫解移除苯甲基氧基羰基保護基所製備。由此得到360mg(32%的理論值於4個步驟)的標 題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.73min；MS(ESIpos)：m/z=493(M+H)+ .
中間物L22
三氟乙酸/N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(2S)-2-胺基-3-甲氧基-3-氧丙基]苯基}-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係由N-(第三丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙胺酸連續根據經典的胜肽化學法所製備。將2.5g(8.06mmol)的此起始物在第一步驟先轉化成銫鹽及然後以碘烷於DMF中轉變成甲酯。
於甲醇中於10%鈀活性上氫解，然後將硝基基團轉變成胺基基團。
然後將以此方式產生的胺基基團以N5 -胺甲醯基-N2 -[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-鳥胺酸於DMF中，在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下，醯化。在下個步驟，以哌啶於DMF中移除Fmoc基團。
然後於DMF中以N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸，在1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、1-羥基-1H -苯并三唑水合物及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下進行偶合及最後以三氟乙酸移除第三丁氧基羰基基團。
HPLC(方法11)：Rt =1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.77min；MS(ESIpos)：m/z=673(M+H)+ .
中間物L23
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙胺醯胺(1：1)
標題化合物係由市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由與N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸在EDCI/HOBT及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以三氟乙酸去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.19min。
中間物L24
三氟乙酸/1-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環丙甲醯胺(1：1)
將114mg(0.67mmol)市售的1-[(第三丁氧基羰基)胺基]環丙-羧酸溶於25ml的DCM中，加入110mg(0.623mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)和395μl的N ,N -二異丙基乙基胺並將混合物冷卻至-10℃。然後加入217mg(0.793mmol)的2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽並將混合物於RT攪拌2h。然後以乙酸乙酯稀釋混合物及連續以10%濃度檸檬酸、飽和的碳酸氫鈉溶液及飽和的氯化鈉溶液萃取，然後以硫酸鎂乾燥並濃縮。於高真空下乾燥，得到152mg的保護中間物。
然後將這些置於10ml的DCM中處理及以1ml的三氟乙酸去保護。由乙腈/水冷凍乾燥，得到158mg(71%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =0.19min。
LC-MS(方法3)：Rt =0.98min；MS(ESIpos)：m/z=224(M+H)+ .
中間物L25
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
將31.4mg(0.17mmol)的纈胺醯基-L-丙胺酸溶於3.0ml的DMF，並加入115.0mg(0.17mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-1-基}丙醯胺及33.7mg(0.0.33mmol)的三乙胺。將混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到74.1mg(58%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.61min；MS(ESIpos)：m/z=763[M+H]+ .
中間物L26
L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
將600.0mg(1.58mmol)的N2 -[(苯甲基氧基)羰基]-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸懸浮於25.0ml的水/乙醇/THF(1：1：0.5)中，加入鈀碳(10%) 並將混合物在RT於標準氫氣壓下以氫氣氫化5h。將催化劑濾出及於減壓下蒸發溶劑。將得到的化合物用於下個步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.42min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+ .
將180mg(0.73mmol)的N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶於5.0ml的DMF，並加入74.0mg(0.73mmol)的三乙胺。然後加入254.6mg(0.73mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺酸酯及74.0mg(0.73mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌3.5h。將反應溶液直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到294.1mg(76%的理論值)的N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+ .
起初將272.2mg(0.57mmol)的N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸注入20.0ml的乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中，並加入7.2mg的鈀活性碳。將混合物在RT於標準氫氣壓下以氫氣氫化5h。於Celite(R) 幫助下過濾混合物並以乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。將標題化合物(182mg，72%的理論值)用於下個反應步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+ .
中間物L27
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
起初將30mg(0.07mmol)的L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(中間物L26)和46.1mg(0.07mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七-1-基}丙醯胺注入1.5ml的DMF中並加入6.8mg(0.07mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應溶液於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到55.6mg(90%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.77min；MS(ESIpos)：m/z=920[M+H]+ .
中間物L28
3-甲醯基-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯
起初將461.7mg(1.15mmol)的1-第三丁基3-乙基-4-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1,3-二羧酸酯(此化合物係根據WO 2006/066896之文獻中的製程所製備)注入5.0ml的無水二氯甲烷中並將混合物冷卻至-78℃。然後緩慢逐滴加入326.2mg(2.29mmol)的二異丁基氫化銨溶液(1M 之THF溶液)並將混合物於-78℃攪拌2h(以薄層層析監測(石油醚/乙酸乙酯=3：1)。逐滴加入溶於60ml水之1.3g(4.59mmol)的酒石酸鉀鈉並讓反應混合物升溫至RT。將乙酸乙酯加到反應混合物中並以乙酸乙酯萃取水層三次。將組合的有機層以sat.NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到629.0mg的標題化合物為粗產物，將其立即用於下個反應步驟無進一步純化。
中間物L29
3-甲醯基-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯非對映異構物之混合物
起初將807.1mg(2.34mmol)的3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(根據WO 2006/100036之文獻中的製程所製備)注入8.0ml的二氯甲烷中，並加入236.4mg(2.34mmol)的三乙胺。於0℃，逐滴加入267.6mg(2.34mmol)的甲磺醯氯，並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。另再加入133.8mg(1.17mmol)的甲磺醯氯及118.2mg(1.17mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。以二氯甲烷稀釋混合物及將有機層在各情況下以飽和的碳酸氫鈉溶液、5%濃度硫酸氫鉀溶液及飽和的NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於Biotage Isolera上純化(矽膠，管柱50g SNAP，流速66ml/min，環己烷/ 乙酸乙酯)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到402.0mg(41%的理論值)的化合物3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺醯基)氧基]甲基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.38min；MS(ESIpos)：m/z=424[M+H]+ .
起初將400.0mg(0.94mmol)的3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺醯基)氧基]甲基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入5.0ml的DMF中，並加入98.2mg(1.51mmol)的疊氮鈉。將反應混合物於40℃攪拌10h。然後另再加入30.7mg(0.47mmol)的疊氮鈉，並將混合物於40℃另再攪拌10h。加入乙酸乙酯並將有機層重複以水清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到309.5mg(89%的理論值)的化合物3-(疊氮甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。將此化合物用於下個合成步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =1.50min；MS(ESIpos)：m/z=371[M+H]+ .
將250mg(0.68mmol)的3-(疊氮甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸溶於10.0ml的乙酸乙酯/乙醇(1：1)中，並加入25.0mg的鈀活性碳(10%)。將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化8h。將反應經由Celite(R) 過濾並以乙酸乙酯充分清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到226.2mg(82%的理論值)的化合物3-(胺基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。將化合物用於下個合成步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=345[M+H]+ .
將715.0mg(2.08mmol)的3-(胺基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯溶於15.0ml的THF中，並加入2.28ml(2.28mmol)的TBAF溶液(1M溶於THF)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物(1.54g)用於下個合成步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.41min；MS(ESIpos)：m/z=231[M+H]+ .
起初將1.54g(4.88mmol)的3-(胺基甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入1,4-二烷中，並加入541.8mg(4.88mmol)的氯化鈣(無水)和488.6mg(4.88mmol)的碳酸鈣並劇烈攪拌混合物。然後加入592.8mg(5.86mmol)的三乙胺及1.52g(5.86mmol)的1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入644.9mg(10.7mmol)的HOAc及乙酸乙酯。將有機層以水清洗二次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇=100：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到346.9mg(19%的理論值)的化合物3-(羥基甲基)-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.08min；MS(ESIpos)：m/z=375[M+H]+ .
起初將804.0mg(2.15mmol)的3-(羥基甲基)-4-[({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入20.0ml的氯仿及20.0ml的0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。然後加入59.7mg(0.22mmol)的四-正丁基氯化銨、429.9mg(3.22mmol)的N-氯琥珀醯亞胺及33.5mg(0.22mmol)的TEMPO並將反應混合物於RT劇烈攪拌至隔夜。將有機層分離出，及於減壓係移除溶劑。將殘餘物於矽膠上純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯=3：1)。由此得到517.0mg(46%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.13min；MS(ESIpos)：m/z=373[M+H]+ .
中間物L30
3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-甲醯基吡咯啶-1-羧酸第三丁酯立體異構物之混合物
起初將250.0mg(0.72mmol)的3-({[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(化合物係根據WO2006/100036之文獻中的製程所製備)注入12.5ml的二氯甲烷/DMSO(4：1)中，並加入219.6mg(2.17mmol)的三乙胺。於2℃，每次加入少許的345.5mg(2.17mmol)的三氧化硫-吡啶複合物並將混合物於2℃攪拌3h。每次加入少許另再加入345.5mg(2.17mmol)的三氧化硫-吡啶並將混合物於RT攪拌17h。將反應混合物置於二氯甲烷及水間分溶。以二氯甲烷萃取水層三次及將組合的有機層以水清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。將殘餘物用於下個合成步驟無進一步純化(泊層層析：石油醚/乙酸乙酯7：3)。
中間物L31
{[(第三丁氧基羰基)胺基]甲基}丙二酸二第三丁酯
將57.2g(488.27mmol)的胺甲酸第三丁酯、51.2ml(683.57mmol)的37%濃度甲醛水溶液及25.9g(244.13mmol)的碳酸鈉加到600ml的水中。將混合物加溫直到形成溶液及然後於RT攪拌16h。以500ml的二氯甲烷萃取 所形的懸浮液並將有機層分離出，以飽和的氯化鈉溶液清洗及以硫酸鈉乾燥。將混合物於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物於高真空下乾燥，得到結晶固體。將殘餘物置於1000ml的無水THF中處理，並於RT逐滴加入322ml(3.414mol)的乙酸酐和138ml(1.707mol)的吡啶之混合物。將反應混合物於RT攪拌16h及然後於室溫以水浴在旋轉蒸發器上濃縮。將殘餘物置於乙醚中處理並以飽和的碳酸氫鈉溶液清洗三次及以飽和的氯化鈉溶液清洗一次。將有機層以硫酸鈉乾燥並於旋轉蒸發器上濃縮及將殘餘物於高真空下乾燥2天。將殘餘物置於2000ml的無水THF中處理，並於冰冷卻下加入456ml(456.52mmol)的1M第三丁醇鉀之THF溶液。將混合物於0℃攪拌20min，及然後逐滴加入溶於200ml無水THF之100.8g(456.52mmol)的丙二酸二第三丁酯。將混合物於RT攪拌48h，及然後加入水。將反應混合物於旋轉蒸發器上濃縮及於500ml的乙酸乙酯中處理。以500ml的水及100ml的飽和的氯化鈉溶液清洗混合物並將有機層以硫酸鈉乾燥。將有機層於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物於高真空下乾燥。將殘餘物藉由過濾經由矽膠純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯，梯度=30：1→5：1)。由此得到37.07g(22%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt =2.87min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+ .
中間物L32
[3-羥基-2-(羥基甲基)丙基]胺甲酸第三丁酯
將37.0g(107.11mmol)的(乙醯氧基甲基)丙二酸二第三丁酯溶於1000ml的無水THF中，及以冰冷卻下逐滴加入535.5ml(1071.10mmol)的2M 硼氫化鋰之THF溶液。逐滴加入19.3ml(1071.10mmol)的水並將混合物於RT攪拌4.5h。將反應混合物於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。將殘餘物置於1500ml的乙酸乙酯中處理，加入100ml的水及以水冷卻下攪拌混合物(輕微放熱)30min。將有機層分離出，及以500ml的乙酸乙酯萃取水層二次。將有機層於旋轉蒸發器上濃縮並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到20.7g(94%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt =1.49min；MS(EIpos)：m/z=106[M-C5 H8 O2 ]+ .
中間物L33
[3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-(羥基甲基)丙基]胺甲酸第三丁酯
將20.00g(97.44mmol)的[3-羥基-2-(羥基甲基)丙基]胺甲酸第三丁酯溶於1000ml的無水二氯甲烷中，並於RT加入6.63g(97.44mmol)的咪唑及16.16g(107.18mmol)的第三丁基(氯)二甲基矽烷。將反應混合物於RT攪拌16h及以半濃縮氯化鈉溶液清洗。以乙酸乙酯萃取水層並將組合的有機層以硫酸鈉乾燥，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。由此得到28.50g(92%的理論值)的目標化合物。
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.02(s,6H),0.86(s,9H),1.37(s,9H),1.58-1.73(m,1H),2.91(q,2H),3.33-3.36[m,(2H，模糊的)]，3.53-3.58(m,2H),6.65-6.72(m,1H).
中間物L34
(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-甲醯基丙基)胺甲酸第三丁酯
將12.65g(39.591mmol)的[3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}-2-(羥基-甲基)丙基]胺甲酸第三丁酯溶於200ml的二氯甲烷，並於RT逐滴加入溶於150ml二氯甲烷之19.31g(45.53mmol)的戴斯-馬汀過碘烷。將混合物於室溫攪拌2h，然後加入250ml的半濃縮碳酸氫鈉溶液及250ml的10%濃度硫代硫酸鈉溶液並將混合物攪拌20min。將有機層分離出，及以乙酸乙酯萃取水層。將組合的有機層以300ml的水清洗，以硫酸鈉乾燥清洗，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。由此得到11.35g(90%的理論值)的目標化合物。
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.02(s,6H),0.84(s,9H),1.36(s,9H),1.48-1.51(m,1H),3.08-3.32[m,(1H，隱蔽的)]，3.50-3.58(m,2H),3.81-3.91(m,1H),6.71(t,1H),9.60(d,1H).
中間物L35
(3-氧丙基)胺甲酸第三丁酯
標題化合物係根據來自文獻之已知方法(例如Jean Bastide等人J.Med.Chem .2003 ,46 (16),3536-3545)所製備。
中間物L36
N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
將100mg(0.57mmol)的N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸置於4.0ml的DMF中處理，並加入0.08ml(0.57mmol)的三乙胺。然後加入199.0mg(0.57mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺酸及0.08ml(0.57mmol)的三乙胺。將混合物於RT攪拌48h。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水含有0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到75.7mg(33%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.69min；MS(ESIpos)：m/z=409[M+H]+ .
中間物L37
L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸
將75.7mg(0.19mmol)的中間物L36懸浮於25ml的水/乙醇/THF中，及加入7.5mg的鈀活性碳(10%)並將混合物在RT於標準氫氣壓下氫化4.5h。將催化劑濾出並將反應混合物於減壓移除溶劑及於高真空下乾燥。將殘餘物用於下個步驟無進一步純化。由此得到64.9mg(93%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt =0.25min；MS(ESIpos)：m/z=275[M+H]+ .
中間物L38
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸
起初將38.3mg(0.14mmol)的中間物L37注入3.0ml的DMF中，並加入96.4mg(0.14mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜十七-1-基}丙醯胺及39.0μl(0.28mmol)的三乙胺。將混合物於RT攪拌至隔夜。然後加入16.0μl(0.28mmol)的HOAc，並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到58.9mg(45%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.61min；MS(ESIpos)：m/z=849[M+H]+ .
中間物L39
2-(三甲基矽基)乙基(2-硫烷基乙基)胺甲酸酯
起初將300mg(2.64mmol)的2-胺基乙硫醇鹽酸鹽(1：1)注入3.0ml的二氯甲烷中，並加入668.0mg(6.60mmol)的三乙胺及719.1mg(2.77mmol) 的1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮。將混合物於RT攪拌2天(以薄層層析監測：二氯甲烷/甲醇=100：1.5)。加入乙酸乙酯並將反應混合物以水清洗三次。將有機層以飽和的NaCl溶液清洗二次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。將化合物用於下個合成步驟無進一步純化。
中間物L40
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
將600mg(1.58mmol)的N2 -[(苯甲基氧基)羰基]-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸於25.0ml的水/乙醇/THF(1：1：0.5)中使用鈀碳(10%)於RT標準壓力下以氫氣氫化。將化合物N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸用於下個合成步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.99min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+ .
將180.0g(0.73mmol)的N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶於5.0ml的DMF中，並加入74.0mg(0.73mmol)的三乙胺。然後加入254.6mg(0.73mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺酸酯及74.0mg(0.73mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌3.5h。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到294.1mg(76%的理論值)的化合物N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6 -(第 三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+ .
將272.2mg(0.57mmol)的N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶於20ml的乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中，並加入27.2mg的鈀活性碳及將混合物於RT在標準壓力下以氫氣氫化。將混合物經由Celite(R) 過濾並以乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)充分清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到182.0mg(72%的理論值)的化合物L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+ .
將30.0mg(0.07mmol)的L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸及46.1mg(0.07mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七-1-基}丙醯胺溶於1.5ml的DMF中，並加入6.8mg(0.07mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到55.6mg(90%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.77min；MS(ESIpos)：m/z=920[M+H]+ .
中間物L41
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
將600mg(1.58mmol)的N2 -[(苯甲基氧基)羰基]-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸於25.0ml的水/乙醇/THF(1：1：0.5)中使用鈀碳(10%)在RT以氫氣於標準壓力下氫化。將化合物N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸用於下個合成步驟無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.99min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+ .
將180.0g(0.73mmol)的N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶於5.0ml的DMF中，並加入74.0mg(0.73mmol)的三乙胺。然後加入254.6mg(0.73mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺酸酯及74.0mg(0.73mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌3.5h。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1% TFA)。然後於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到294.1mg(76%的理論值)的化合物N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+ .
將272.2mg(0.57mmol)的N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶於20.0ml的乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中，加入 27.2mg的鈀活性碳並將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化。將混合物經由Celite(R) 過濾並以乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)充份清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到182.0mg(72%的理論值)的化合物L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+ .
將30.0mg(0.07mmol)的L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸及34.3mg(0.07mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺溶於1.5ml的DMF中，並加入6.8mg(0.07mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到40.6mg(82%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.73min；MS(ESIpos)：m/z=744[M+H]+ .
中間物L42
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸
起初將50.0mg(0.18mmol)的L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L37)注入DMF中，並加入93.6mg(0.18mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧 雜十五-1-基}丙醯胺及36.9mg(0.37mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入21.9mg(0.37mmol)的HOAc並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到20.6mg(14%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.55min；MS(ESIpos)：m/z=673[M+H]+ .
中間物L43
N-[67-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-65-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧-64-氮雜六十七-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸
起初將11.3mg(0.04mmol)的L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L37)注入DMF中，並加入50.0mg(0.04mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-63-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧六十三-1-基}丙醯胺及8.3mg(0.08mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入4.9mg(0.08mmol)的HOAc並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到15.8mg(20%的理論值)的標 題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1377[M+H]+ .
中間物L44
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
將73.3mg(0.39mmol)的L-纈胺醯基-L-丙胺酸溶於7.0ml的DMF中，並加入200.0mg(0.39mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺及78.8mg(0.78mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到103.3mg(45%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.58min；MS(ESIpos)：m/z=587[M+H]+ .
中間物L45
(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氧代丁酸第三丁酯
將2.00g(7.26mmol)的N-(第三丁氧基羰基)-L-高絲胺酸第三丁酯溶於 90ml的二氯甲烷中，及然後加入1.76ml的吡啶及4.62g(10.90mmol)的1,1,1-三乙醯氧基-1 λ5 ,2-苯并碘雜唑-3(1H)-酮(戴斯-馬汀過碘烷)。將反應於RT攪拌2h及然後以200ml的二氯甲烷稀釋及以10%濃度硫代硫酸鈉溶液萃取二次及然後連續以5%濃度檸檬酸萃取二次及以飽和的碳酸氫鈉溶液萃取二次。將有機層分離出，以硫酸鈉乾燥及然後於減壓下乾燥。將100ml的乙醚及環己烷(v/v=1：1)加到殘餘物中，形成白色沉澱。將其以抽氣過濾。將濾液於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥，得到1.74g(88%的理論值)的目標化合物為淡黃色油狀物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=274[M+H]+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=1.38(s,18H),2.64-2.81(m,2H),4.31-4.36(m,1H),7.23(d,1H),9.59(s,1H).
中間物L46
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-麩胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物係藉由先將200mg(0.79mmol)的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)與263mg(0.87mmol)的(4S)-5-第三丁氧基-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧戊酸/三氟乙酸(1：1)在EDC/HOBT及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合，及然後於溫和條件下藉由於RT在10%濃度三氟乙酸之DCM溶液中攪拌將胺基去保護。以乙腈/水冷凍乾燥，得到85mg(20%的理論值)的標題化合物於二個步驟.
LC-MS(方法1)：Rt =0.37min；MS(ESIpos)：m/z=326[M+H]+ .
中間物L47
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係藉由將中間物L8與2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸酯偶合及隨後以TFA去保護所製備。
LC-MS(方法3)：Rt =1.36min；MS(ESIpos)：m/z=488(M+H)+ .
中間物L48
三氟乙酸/(1R,2S)-2-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售(1R,2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸類似中間物L2所製備。
LC-MS(方法3)：Rt =1.22min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+ .
中間物L49
三氟乙酸/第三丁基-N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
標題化合物係藉由先將市售溴乙酸酐與然後部份保護的胜肽L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸第三丁酯偶合，根據經典的胜肽化學法，在N ,N -二異丙基乙基胺之二氯甲烷溶液的存在下所製備。接著於溫和條件下藉由於RT在10%濃度三氟乙酸之DCM溶液中攪拌將胺基去保護，於二個步驟得到49%產率之標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.09min；MS(ESIpos)：m/z=593及595(M+H)+ .
中間物L50
三氟乙酸/(1S,3R)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售(1S,3R)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸及同樣市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由與HATU，在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以TFA去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.2min；
LC-MS(方法3)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+ .
中間物L51
三氟乙酸/(1R,3R)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售(1R,3R)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸及同樣市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由與HATU在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以TFA去保護所製備。
LC-MS(方法3)：Rt =0.98min；MS(ESIpos)：m/z=250(M-H)- .
中間物L52
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-溴乙醯胺(1：1)
將420mg(2.62mmol)的(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯置於50ml的二氯甲烷中處理，並加入817mg(3.15mmol)的溴乙酸酐及913μl(5.24mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應於RT攪拌1h及然後於減壓下乾燥。將殘餘物以製備式HPLC純化。
由此得到577mg的保護中間物，將其置於50ml的二氯甲烷中處理，並加入10ml的三氟乙酸。於RT攪拌1h後，將反應於減壓下濃縮並將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到705mg(65%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法3)：Rt =0.34min；MS(ESIpos)：m/z=181及183(M+H)+ .
中間物L53
三氟乙酸/(1S,3S)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售的(1S,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸及同樣市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由與HATU在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以TFA去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =0.19min；
LC-MS(方法3)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=250(M-H)- .
中間物L54
三氟乙酸/(1R,3S)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售的(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸及同樣市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由與HATU在N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以TFA去保護所製備。
LC-MS(方法3)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+ .
中間物L55
三氟乙酸/第三丁基-N6 -D-丙胺醯基-N2 -{N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸酯(1：1)
標題化合物係藉由先將中間物L6與N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸在HATU的存在下偶合，接著於溫和條件下藉由於RT在5%濃度三氟乙酸之DCM溶液中攪拌將胺基去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.35min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.67min；MS(ESIpos)：m/z=637(M+H)+ .
中間物L56
三氟乙酸/第三丁基-N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{[(1R,3S)-3-胺基團戊基]羰基}-L-離胺酸酯(1：1)
標題化合物係藉由先將中間物L6與(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸在HATU的存在下偶合，接著於溫和條件下藉由於RT在25%濃度三氟乙酸之DCM溶液中攪拌15分鐘將胺基去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.4min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.7min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+ .
中間物L57
(2S)-4-側氧-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯
起初將500.0mg(2.72mmol)的L-天門冬胺酸甲酯鹽酸鹽及706.3mg(2.72mmol)的2-(三甲基矽基)乙基2,5-二側氧吡咯啶-1-羧酸酯注入5.0ml的1,4-二烷中，並加入826.8mg(8.17mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。然後於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到583.9mg(74%的理論值)的化合物(3S)-4-甲氧基-4-側氧-3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIneg)：m/z=290(M-H)- .
起初將592.9mg的(3S)-4-甲氧基-4-側氧-3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸注入10.0ml的1,2-二甲氧基乙烷，將混合物冷卻至-15℃並加入205.8mg(2.04mmol)的4-甲基嗎福啉及277.9mg(2.04mmol)的氯甲酸異丁酯。15min後將沉澱濾出及在各情況下以10.0ml的1,2-二甲氧基乙烷清洗二次。將濾液冷卻至-10℃並於劇烈攪拌下加入溶於10ml水之115.5mg(3.05mmol)的硼氫化鈉。進行分層及將有機層在各情況下以飽和的碳酸氫鈉溶液及飽和的NaCl溶液清洗一次。將有機層以硫酸鎂乾燥，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到515.9mg(91%的理論值)的 化合物N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-高絲胺酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=278(M+H)+ .
起初將554.9mg(2.00mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-高絲胺酸甲酯注入30.0ml的二氯甲烷中，並加入1.27g(3.0mmol)的戴斯-馬汀過碘烷及474.7mg(6.00mmol)的吡啶。將混合物於RT攪拌至隔夜。4h後，將反應以二氯甲烷稀釋及將有機層在各情況下以10%濃度Na2 S2 O3 溶液、10%濃度檸檬酸溶液及飽和的碳酸氫鈉溶液清洗三次。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。由此得到565.7mg(97%的理論值)的標題化合物。
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.91(m,2H),2.70-2.79(m,1H),2.88(dd,1H),3.63(s,3H),4.04(m,2H),4.55(m,1H),7.54(d,1H),9.60(t,1H).
中間物L58
2-(三甲基矽基)乙基(3-氧丙基)胺甲酸酯
將434.4mg(5.78mmol)的3-胺基-1-丙醇及1.50g(5.78mmol)的2-(三甲基矽基)乙基2,5-二側氧吡咯啶-1-羧酸酯溶於10.0ml的二氯甲烷，加入585.3mg(5.78mmol)的三乙胺並將混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物以二氯甲烷稀釋及將有機層以水及飽和的碳酸氫鈉溶液清洗及然後以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物2-(三甲基矽基)乙基(3-羥基丙基)胺甲酸(996.4mg,79%的理論值)於高真空下乾燥及無進一步純化用於下個合成步驟。
起初將807.0mg(3.68mmol)的2-(三甲基矽基)乙基(3-羥基丙基)胺甲酸 注入15.0ml的氯仿及15.0ml的0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。然後加入102.2mg(0.37mmol)的四正丁基氯化銨、736.9mg(5.52mmol)的N-氯琥珀醯亞胺及57.5mg(0.37mmol)的TEMPO並將反應混合物於RT劇烈攪拌至隔夜。將反應混合物以二氯甲烷稀釋並將有機層以水及飽和的NaCl溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物於高真空下乾燥及無進一步純化用於下個合成步驟(890.3mg)。
中間物L59
三氟乙酸/1-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
起初將300.0mg(0.91mmol)的(2-{2-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺甲酸第三丁酯注入二氯甲烷中，加入4.2g(36.54mmol)的TFA並將混合物於RT攪拌1h(以TLC監測：二氯甲烷/甲醇10：1)。於減壓下蒸發揮發性組份並將殘餘物與二氯甲烷共蒸餾四次。將殘餘物於高真空下乾燥及無進一步純化用於下個合成步驟。
LC-MS(方法1)：Rt =0.19min；MS(ESIpos)：m/z=229(M+H)+ .
中間物L60
6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基氯
將200.0mg(0.95mmol)的6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸溶於4.0ml的二氯甲烷，並加入338.0mg(2.84mmol)的亞硫醯氯。將反應混合物於RT攪拌3h，及然後加入1滴的DMF。將混合物另再攪拌1h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物與二氯甲烷共蒸餾三次。將此粗產物用於下個 合成步驟無進一步純化。
中間物L61
三氟乙酸/2-(三甲基矽基)乙基-N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
首先，由N2 -[(苯甲基氧基)羰基]-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸根據經典的胜肽化學法，製備三肽衍生物2-三甲基矽基)乙基-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(以2-(三甲基矽基乙醇使用EDCI/DMAP酯化，氫解，與N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸在HATU的存在下偶合，及另外氫解)。標題化合物係藉由將該部份保護的胜肽衍生物與市售6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合所製備。接著於溫和條件下藉由於RT在5%濃度三氟乙酸之DCM溶液中攪拌2.5小時將胺基去保護，保留酯保護基。後續處理及以製備式HPLC純化，得到438mg的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.69min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.78min；MS(ESIpos)：m/z=610(M+H)+ .
中間物L62
三氟乙酸/2-(三甲基矽基)乙基-N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-L-離胺酸酯(1：1)
首先，2-(三甲基矽基)乙基N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸酯係由N2 -[(苯甲基氧基)羰基]-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸根據經典的胜肽化學法所製備。然後將148mg(0.43mmol)的此中間物在195mg(0.51mmol)的HATU及149μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下與200mg(0.43mmol)的中間物L16偶合。濃縮及將殘餘物以製備式HPLC純化後，將保護的中間物置於20ml的DCM中處理，並藉由添加2ml的三氟乙酸及於RT攪拌1h移除第三丁氧基羰基保護基。濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到254mg(63%的理論值於二個步驟)。
HPLC(方法11)：Rt =1.51min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.68min；MS(ESIpos)：m/z=696(M+H)+ .
中間物L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}-5-側氧-5-[2-(三甲基矽基)乙氧基]戊酸
首先，三肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙 醯基]胺基}-5-側氧-5-[2-(三甲基矽基)乙氧基]戊酸係由(2S)-5-(苯甲基氧基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧戊酸根據經典的胜肽化學法所製備。(以2-(三甲基矽基乙醇使用EDCI/DMAP酯化，以三氟乙酸移除保護基，與N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸HATU的存在下偶合，及於甲醇中在10%鈀活性碳上氫解)。標題化合物係藉由將該部份保護的胜肽衍生物與市售1-{6-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶合所製備。後續處理及以製備式HPLC純化，得到601mg的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.96min；MS(ESIpos)：m/z=611(M+H)+ .
中間物L64
(4S)-4-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-5-側氧-5-[2-(三甲基矽基)乙氧基]戊酸
標題化合物係由(2S)-5-(苯甲基氧基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-氧戊酸根據經典的胜肽化學法(以2-(三甲基矽基乙醇使用EDCI/DMAP酯化，氫解，以三氟乙酸移除保護基，於甲醇中在10%鈀活性碳上氫解裂解苯甲基酯及與1-{2-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮在N ,N -二異丙基乙基胺存在下偶合)所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=385(M+H)+ .
中間物L65
三氟乙酸/2-(三甲基矽基)乙基-3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-L-丙胺酸酯(1：1)
標題化合物係由3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸根據經典的胜肽化學法所製備(以2-(三甲基矽基乙醇使用EDCI/DMAP酯化及以三氟乙酸移除Boc保護基)。由此得到373mg(79%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.72min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+ .
中間物L66
(8S)-8-(2-羥基乙基)-2,2-二甲基-6,11-二側氧-5-氧雜-7,10-二氮-2-矽十四烷-14-酸甲酯
起初將1000mg(2.84mmol)的(3S)-3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸注入10.0ml的1,2-二甲氧基乙烷中，並加入344.4mg(3.4mmol)的4-甲基嗎福啉及504mg(3.69mmol)的氯甲酸異丁酯。於RT攪拌10min後，將反應冷卻至5℃並於劇烈攪拌下，以一次加入一點加入溶於3ml的水之161mg(4.26mmol)的硼氫化鈉。1h後，再次加入相同量的硼氫化鈉及然後將反應緩慢地升溫至RT。加入170ml的水及然後在各情況下以200ml的乙酸乙酯萃取反應。進行分層並以檸檬酸清洗有機層一次及然後以飽和的碳酸氫鈉溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到760mg(78%的理論值)的化合物[(2S)-4-羥基丁-1,2-二基]雙胺甲酸苯甲基酯第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+ .
將溶於13ml的氯化氫/二烷之760mg(2.16mmol)的此中間物於RT攪拌20min。然後將反應濃縮至5ml，並加入乙醚。將沉澱濾出及以乙腈/水1：1冷凍乾燥。
將以此方式得到的產物溶於132ml的DMF中，並加入345.5mg(2.35mmol)的4-甲氧基-4-氧代丁酸、970mg(2.55mmol)的HATU及1025μl的N ,N -二異丙基乙基胺。將混合物於RT攪拌5min。於減壓下移除溶劑並將剩餘的殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合及於減壓下蒸發乙腈。將剩餘的水層以乙酸乙酯萃取二次及然後將有機層濃縮並於高真空下乾燥。
將此方式得到的中間物置於甲醇中處理及於10%鈀活性碳上於RT於標準壓力下氫化1h。然後將催化劑濾出及於減壓下移除溶劑。
將247mg的此保護化合物置於20ml的DMF中處理，並加入352mg(1.36mmol)的1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮及592μl的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應混合物於RT攪拌1h及然後濃縮，並將殘餘物以製備式HPLC純化。然後於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到，於這5個反應步驟中，218mg的標題化合物總計21%的產率。
LC-MS(方法1)：Rt =0.74min；MS(ESIpos)：m/z=363(M+H)+ .
中間物L67
三氟乙酸/2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基-β-丙胺酸酯(1：1)
標題化合物係由50mg(0.354mmol)的市售1-(2-羥基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮藉由與134mg(0.71mmol)的N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸於10ml的二氯甲烷中，在1.5當量的EDCI及0.1當量的4-N ,N -二甲基胺基吡啶的存在下偶合及隨後以三氟乙酸去保護所製備。
Yield：56mg(48%的理論值於2階段)
LC-MS(方法3)：Rt =1.15min；MS(ESIpos)：m/z=213(M+H)+ .
中間物L68
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物L1根據經典的胜肽化學法，由市售(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸及(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.17min；MS(ESIpos)：m/z=212(M+H)+ .
中間物L69
三氟乙酸/1-[(苯甲基氧基)羰基]哌啶-4-基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸酯(1：1)
標題化合物係以經典的胜肽化學法，由市售4-羥基哌啶-1-羧酸苯甲基 酯，藉由以N2 -(第三丁氧基羰基)-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸使用EDCI/DMAP酯化，隨後以TFA移除Boc，接著與N-[(第三丁氧基)羰基]-L-纈胺酸在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合，及最後以TFA移除另外的Boc所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.62min；MS(ESIpos)：m/z=492(M+H)+ .
中間物L70
9H-茀-9-基甲基(3-氧丙基)胺甲酸酯
起初將1000.0mg(3.36mmol)的9H-茀-9-基甲基(3-羥基丙基)胺甲酸酯注入15.0ml的氯仿及15.0ml的0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。然後加入93.5mg(0.34mmol)的四正丁基氯化銨、673.6mg(5.04mmol)的N-氯琥珀醯亞胺及52.5mg(0.34mmol)的TEMPO並將反應混合物於RT劇烈攪拌至隔夜。將反應混合物以二氯甲烷稀釋及將有機層以水及飽和的NaCl溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物於高真空下乾燥及於矽膠上純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯3：1-1：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到589.4mg(58%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt =2.15min；MS(ESIpos)：m/z=296(M-H)+ .
中間物L71
[4-(氯羰基)苯基]胺甲酸第三丁酯
起初將100.0mg(0.42mmol)的4-[(第三丁氧基羰基)胺基]苯甲酸注入2.0ml的二氯甲烷中，並加入64.2mg(0.51mmol)的草醯氯。將反應混合物於RT攪拌30min(以TLC監測：二氯甲烷/甲醇)。然後另再加入192.6mg(1.53mmol)的草醯氯及1滴的DMF並將混合物於RT攪拌1h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物與二氯甲烷重覆共蒸餾。將殘餘物無進一步純化用於下個合成步驟。
中間物L72
(9S)-9-(羥基甲基)-2,2-二甲基-6,11-二側氧-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽十四烷-14-酸苯甲基酯
標題化合物係由市售[(2S)-3-羥基丙-1,2-二基]雙胺甲酸苯甲基酯第三丁酯，根據經典的胜肽化學法，藉由氫解移除Z保護基，隨後與4-(苯甲基氧基)-4-氧代丁酸在EDCI/HOBT的存在下偶合，接著以TFA移除Boc保護基及最後在三乙胺的存在下與1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮反應所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=425[M+H]+ .
中間物L73
N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
將395.5mg(1.87mmol)的6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及854.3mg(2.25mmol)的HATU加到300mg(1.87mmol)的(2-胺基乙基)胺甲酸第三丁酯之20ml的二甲基甲醯胺溶液中。將反應混合物於RT攪拌5分鐘。將混合物濃縮後，將殘餘物置於DCM中處理及以水清洗。將有機層以鹽水清洗，以硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。由此得到408mg(33%，純度53%)的標題化合物，其使用時無進一步純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.75min；MS(ESIpos)：m/z=354(M+H)+ .
將1ml的TFA加到(2-{[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙基)胺甲酸三丁酯(408mg,0.365mmol)之7ml的二氯甲烷溶液。將反應混合物於RT攪拌0.5h。將反應混合物於減壓下濃縮並將殘餘物以二氯甲烷共蒸餾二次。進一步使用此殘餘物無進一步純化。由此得到384mg(94%，純度57%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.26min；MS(ESIpos)：m/z=254(M+H)+ .
中間物F1
N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-{2-[(4S)-2,5-二側氧-1,3-唑啶-4-基]乙基}-2-羥基乙醯胺
於氬氣下，將77mg(0.14mmol)的(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸鹽酸鹽(1：1)(中間物C4)溶於THF。然後加入2mg的活性碳及27.5mg(0.14mmol)的三光氣，及然後將反應於50℃攪拌10min。在各情況下再加入二次的27.5mg的三光氣及於RT攪拌30min後，反應完全。
將活性碳經由注射器過濾器濾出及然後於減壓下移除溶劑。加入乙腈，並將混合物再一次於減壓下濃縮。由此得到72mg(95%)的標題化合物，將其用於ADC偶合無進一步純化。
HPLC(方法11)：Rt =2.28min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.2min；MS(ESIpos)：m/z=541(M+H)+ .
中間物F2
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁醯胺(1：1)
將55mg(0.089mmol)的(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸(中間物C5)置於12ml的DMF中處理，並連續加入68mg(0.268mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)、34.3mg(0.18mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、27.4mg(0.18mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及47μl(0.27mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下移除溶劑並將剩餘的殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，由1,4-二烷凍乾後，得到20mg(30%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.48min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.29min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+ .
將20mg(0.027mmol)的此中間物置於5ml的二氯甲烷中處理，加入1ml的三氟乙酸並將混合物於RT攪拌1h。然後將反應混合物於減壓下濃縮並將剩餘的殘餘物以乙腈/水1：1凍乾。由此得到19mg(95%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(ESIpos)：m/z=637(M+H)+ .
1 H NMR(500MHz,DMSO-d6 )：δ=8.28(t,1H),7.9-8.1(m,3H),7.7-7.8(m,2H),7.2-7.4(m,6H)7.0-7.1(m,3H),5.7(s,1H),5.0及5.3(2d,2H),4.08及 4.25(2d,2H),3.3-3.65(m,5H),3.1-3.25(m,2H),0.75及1.45(2m,2H),0.9(s,9H).
中間物F3
三氟乙酸/N-[(3S)-3-胺基-4-{2-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]肼基}-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
將13mg(0.021mmol)的(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸(中間物C5)置於5ml的DMF中處理，及然後加入33mg(86μmol)的O -(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N ,N ,N ',N '-四甲基六氟磷酸、15μl的N ,N -二異丙基乙基胺及22mg(64μmol)的市售6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯肼。將反應混合物於RT攪拌1h。然後將混合物於高真空下濃縮並將剩餘的殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到9.5mg(53%的理論值)的保護中間物為無色泡沫。
HPLC(方法11)：Rt =2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.33min；MS(ESIpos)：m/z=822(M+H)+ .
將9.5mg(0.011mmol)的此中間物置於3ml的二氯甲烷中處理，加入1ml的三氟乙酸並將混合物於RT攪拌2h。然後將反應混合物於減壓下濃縮 並將剩餘的殘餘物以乙腈/水1：1凍乾。由此得到7mg(70%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.75min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=722(M+H)+ .
中間物F4
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(6-{[(2R)-2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}己基)丁醯胺(1：1)
首先，將30mg(0.049mmol)的(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸(中間物C5)類似中間物F3與三氟乙酸/9H-茀-9-基甲基-(6-胺基己基)胺甲酸(1：1)在HATU的存在下偶合。然後以哌啶根據標準方法移除Fmoc保護基。然後將此胺組份，在N,N-二異丙基乙基胺的存在下，與(2R)-2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯氯(其係由游離酸使用亞硫醯氯所製備)偶合。在最後的步驟，以三氟乙酸於DCM中移除Boc保護基。由此得到1.1mg(3%於4個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.83min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.96min；MS(ESIpos)：m/z=764(M+H)+ .
中間物F5
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(丙醯基)胺基]-N-{2-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2，由16mg(0.026mmol)的中間物C5及8.5mg(0.03mmol)的中間物L12所製備。由此得到3mg(13%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.96min；MS(ESIpos)：m/z=681(M+H)+ .
中間物F6
三氟乙酸/N-[(16S)-16-胺基-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-12,15-二側氧-3,6,9-三氧雜-13,14-二氮雜十八烷-18-基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
將8mg(12.7μmol)的三氟乙酸/{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-肼基-1-氧丁-2-基}胺甲酸三丁酯(1：1)(中間物C6)置於8ml的DMF中處理，並加入6mg(19μmol)的市售3-(2-{2-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸、5.8mg(15μmol)的O -(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N ,N ,N ',N '-四甲基六氟磷酸(HATU)和7μl(38μmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將混合物於RT攪拌15min。然後於減壓下移除溶劑並將殘餘物置於乙腈/水1：1中處理及以三氟乙酸調整至pH 2。製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合，濃縮並以乙腈/水1：1冷凍乾燥，得到5mg(41%的理論值)的Boc-保護中間物。以三氟乙酸移除Boc基團，得到4mg(32%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.89min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=812(M+H)+ .
中間物F7
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2，由25mg(0.037mmol)的中間物C5及35mg(0.112mmol)的中間物L1所製備。由此得到14.4mg(29%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(ESIpos)：m/z=694(M+H)+ .
1 H NMR(500MHz,DMSO-d6 )：δ=8.2(m,1H),7.9-8.1(m,3H),7.7-7.8(m,2H),7.2-7.4(m,6H),7.0-7.12(m,3H),5.7(s,1H),4.95及5.3(2d,2H),4.1及4.25(2d,2H),4.0(s,2H),3.3-3.65(m,5H),3.0-3.15(m,2H),0.7及1.45(2m,2H),0.88(s,9H).
中間物F8
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F2，由10mg(0.016mmol)的中間物C5及13mg(0.018mmol)的中間物L6所製備。由此得到10mg(49%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.97min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1006(M+H)+ .
中間物F9
三氟乙酸/N-{(3S)-3-胺基-4-[1-(2-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)肼基]-4-側氧丁基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2，由1.5mg(0.002mmol)的中間物C7及0.95mg(0.004mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)所製備。由此得到1.1mg(52%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=709(M+H)+ .
中間物F10
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(3-{[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]胺基}-3-氧丙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2，由14mg(0.022mmol)的中間物C5及10mg(0.025mmol)的中間物L5所製備。由此得到4.5mg(22%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=756(M+H)+ .
中間物F11
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)環己烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2，由12mg(0.019mmol)的中間物C5及10mg(0.021mmol)的中間物L4所製備。由此得到7mg(38%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.04min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=776(M+H)+ .
中間物F12
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2，由43mg(0.071mmol)的中間物C5及30mg(0.071mmol)的中間物L2所製備。在Boc-保護的中間物階段，將形成的非對映異構物以製備式HPLC分離(Chromatorex C18-10/125x30/12ml/min)。 分離的非對映異構物之立體化學係藉由以類似方式由市售(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸所製備的個別非對映異構物比較來分派：
溶離份1：1S2R非對映異構物
產率：13mg(22%)
HPLC(方法11)：Rt =2.52min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.31min；MS(ESIpos)：m/z=848(M+H)+ .
溶離份2：1R2S非對映異構物
產率：10mg(17%)
HPLC(方法11)：Rt =2.56min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.33min；MS(ESIpos)：m/z=848(M+H)+ .
10mg(0.011mmol)的1R2S非對映異構物係以TFA去保護，然後得到8mg(75%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.04min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=748(M+H)+ .
中間物F13
三氟乙酸/(1S,2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
此合成係類似中間物F13來進行並藉由將1S2R非對映異構物去保護得到標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=748(M+H)+ .
中間物F14
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
將20mg(0.028mmol)的中間物C5及18mg(0.028mmol)的中間物L7，在HATU的存在下偶合，及隨後以TFA去保護，製備標題化合物。由此得到15mg(49%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.97min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=1012(M+H)+ .
中間物F15
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
此中間物係藉由將15mg(0.022mmol)的中間物C8及14mg(0.026mmol)的中間物L8在HATU的存在下偶合，及隨後以TFA去保護基所製備。由此得到7mg(27%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.85min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=984(M+H)+ .
中間物F16
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
首先，將20mg(0.03mmol)的中間物C3類似中間物F3與三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)(中間物L9)在HATU的存在下偶合(產率：15mg(44%的理論值)。
將26mg(0.023mmol)的此中間物N-{(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺溶於5ml的甲醇，加入1ml的2M氫氧化鋰溶液並將反應於RT攪拌90min。然後於減壓下移除溶劑，將殘餘物置於乙腈/水中處理及將混合物使用TFA調整至pH 2。然後將混合物再次濃縮，將殘餘物以製備式HPLC純化後，得到20mg(81%)的羧基化 合物。
然後將此中間物置於5ml的DMF中處理並與6mg(0.022mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在8.4mg(0.022mmol)的HATU及16μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。以製備式HPLC純化，得到17mg(76%的理論值)的保護中間物。將這些置於3ml的DCM中處理，並加入1ml的TFA。於RT攪拌45min後，將混合物濃縮並將殘餘物以乙醚消化。以抽氣過濾並於高真空下將殘餘物乾燥，得到15mg(81%)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(ESIpos)：m/z=1097(M+H)+ .
中間物F17
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F12，由6mg(0.01mmol)的中間物C5及8mg(0.01mmol)的中間物L10所製備。在Boc-保護的中間物階段，將形成的非對映異構物以製備式HPLC分離(Chromatorex C18-10/125x30/12ml/min)。分離的非對映異構物之立體化學係藉由以類似方式由市售(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸所製備的個別非對映異構物比較來分派：
溶離份1：1S2R非對映異構物
產率：1mg
HPLC(方法11)：Rt =2.73min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.37min；MS(ESIpos)：m/z=1274(M+H)+ .
溶離份2：1R2S非對映異構物
產率：0.7mg
HPLC(方法11)：Rt =2.81min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.41min；MS(ESIpos)：m/z=1274(M+H)+ .
0.7mg(0.001mmol)的1R2S非對映異構物之完全去保護係藉由溶於1ml的DCM，加入1ml的TFA及於RT攪拌1h來進行。於減壓下濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到0.68mg(94%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=1117(M+H)+ .
中間物F18
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{[(1S,2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F17，由8.9mg(0.014mmol)的中間物C5及13mg(0.014mmol)的中間物L11所製備。
HPLC(方法11)：Rt =2.2min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.01min；MS(ESIpos)：m/z=1117(M+H)+ .
中間物F19
N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-N2 -[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F2藉由將25mg(0.041mmol)的中間物C5與55mg(0.122mmol)的中間物L13偶合及隨後去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.84min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=780(M+H)+ .
中間物F20
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-{4-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]哌-1-基}丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2藉由將10mg(0.015mmol)的中間物C5與55mg(0.122mmol)的中間物L14偶合及隨後去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=735(M+H)+ .
中間物F21
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-12-側氧-3,6,9-三氧雜-13-氮雜十五烷-15-基]丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2藉由將10mg(0.015mmol)的中間物C5與7mg(0.015mmol)的中間物L15偶合及隨後去保護所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=840(M+H)+ .
中間物F22
三氟乙酸/N-[(3S)-3-胺基-4-(1-{2-[(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-2-側氧乙基}肼基)-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F9藉由將13.7mg(0.017mmol)的中間物C7與5.9mg(0.017mmol)的中間物L1偶合及隨後去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =2.3min；
LC-MS(方法1)：Rt =1.2min；MS(ESIpos)：m/z=866(M+H)+ .
中間物F23
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F2藉由將10mg(0.016mmol)的中間物C5與16.8mg(0.016mmol)的中間物L17在EDC/HOBT及N ,N -二異丙基乙基胺得存在下偶合及隨後去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(ESIpos)：m/z=1092(M+H)+ .
中間物F24
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物之製備係類似中間物F16來進行：首先，將30mg(0.046mmol)的中間物C3類似中間物F3與中間物L18，在HATU的存在下偶合(產率：25mg(47%的理論值)。
將27mg(0.024mmol)的此中間物溶於5ml的甲醇，加入1ml的2M氫 氧化鋰溶液並將混合物於RT攪拌30min，使得甲酯及乙醯基基團裂解。然後於減壓下移除溶劑，將殘餘物置於乙腈/水中處理並將混合物使用TFA調整至pH 2。然後將混合物再次濃縮，將殘餘物以製備式HPLC純化後，得到15mg(58%)的羧基化合物。
然後將此中間物置於3ml的DMF中處理及與4.4mg(0.017mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在6.5mg(0.017mmol)的HATU及12μl的N ,N -二異丙基乙基胺存在下偶合。以製備式HPLC純化，得到12mg(72%的理論值)的保護中間物。將這些置於2ml的DCM中處理，並加入1ml的TFA。於RT攪拌30min後，將混合物濃縮並以乙腈/水1：1冷凍乾燥。將殘餘物於高真空下乾燥，得到11mg(91%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.83min；MS(ESIpos)：m/z=1069(M+H)+ .
中間物F25
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-(4-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}苯基)-L-鳥胺醯胺(1：1)
此中間物藉由將9.6mg(0.014mmol)的中間物C8與10.8mg(0.015mmol)的中間物L19在6.4mg(0.017mmol)的HATU及72μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以TFA去保護所製備。由此得到5mg(31% 的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1041(M+H)+ .
中間物F26
三氟乙酸/N-{(15S,19R)-15-胺基-19-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-羥乙醯基-20,20-二甲基-14-側氧-4,7,10-三氧雜-13,18-二氮雜二十一-1-醯基}-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
此中間物藉由將16.4mg(0.02mmol)的中間物C9與11.2mg(0.02mmol)的中間物L20在8mg(0.04mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、6mg(0.04mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及11μl(0.06mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以TFA去保護所製備。由此得到10mg(37%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=1144(M+H)+ .
中間物F27
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)苯基]-L-離胺醯胺(2：1)
此中間物係於4個步驟所製備：在第一步驟，將20mg(0.028mmol)的中間物C8與16.7mg(0.031mmol)的中間物L21在11mg(0.057mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、8.7mg(0.057mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及15μl(0.085mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下於5ml的DMF中偶合。於RT攪拌4天後，將反應濃縮並以製備式HPLC純化產物。產率：18mg(54.5%的理論值)。
將18mg(0.016mmol)的此中間物溶於4ml的甲醇，加入194μl的2M氫氧化鋰溶液並將反應於RT攪拌至隔夜。然後另再加入116μl的氫氧化鋰溶液，並將反應於RT另再攪拌4h。然後於減壓下移除溶劑，將殘餘物置於水中處理及然後將反應以5%濃度檸檬酸調整至pH 5。以二氯甲烷萃取混合物二次並將有機層以硫酸鈉乾燥。然後將有機層過濾並濃縮及將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到10.5mg(58%)的羧基化合物。
然後將10.5mg(0.009mmol)的此中間物置於4ml的DMF中處理並與3mg(0.012mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在3.5mg(0.018mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽、2.8mg(0.018mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及6μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。攪拌至隔夜後，再次加入相同量的偶合劑並將反應於RT另再攪拌3天。然後將混合物濃縮及以製備式HPLC純化產物。產率：6 mg(52%的理論值).
然後將6mg(0.005mmol)的此中間物於含1ml三氟乙酸之3ml的DCM中去保護。以乙腈/水冷凍乾燥，得到6mg(83%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.84min；
LC-MS(方法4)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1068(M+H)+ .
中間物F28
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-4-({N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基}胺基)-L-苯丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
此中間物係於5個步驟所製備：在第一步驟，將40mg(0.058mmol)的中間物C8與46mg(0.058mmol)的中間物L22在44.3mg(0.117mmol)的HATU及30μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。於RT攪拌1h後，將反應濃縮並以製備式HPLC純化產物。
產率：53mg(62.5%的理論值).
在下個步驟，以0.6ml的哌啶於3ml的DMF中移除Fmoc基團。於RT攪拌1h後，將反應濃縮並以製備式HPLC純化產物。產率：42mg(82%的理論值).
就裂解甲酯，係將42mg(0.033mmol)的此中間物溶於2ml的THF及1ml的水中，加入330μl的2M氫氧化鋰溶液並將反應於RT攪拌1h。
然後將反應以TFA中和並濃縮及將殘餘物以製備式HPLC純化。於高 真空下乾燥，得到32mg(78%)的羧基化合物。
然後將32mg(0.026mmol)的此中間物於2.3ml的DMF中與14.6mg(0.047mmol)的市售1-{6-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在8μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。以超音波浴處理4-小時後，將反應濃縮並以製備式HPLC純化產物。產率：20.4mg(60%的理論值).
在最後的步驟，將20.4mg(0.016mmol)的此中間物於DCM中以三氟乙酸去保護。以乙腈/水凍乾，得到20mg(85%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法5)：Rt =2.84min；MS(ESIpos)：m/z=1197(M+H)+ .
中間物F29
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-4-({N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)-L-苯丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物的製備係類似中間物F28來進行。
HPLC(方法11)：Rt =2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=1111(M+H)+ .
中間物F30
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-{2-[(3-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H- 吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧丙基)亞磺醯基]乙基}丁醯胺(1：1)
此中間物係於4個步驟所製備：在第一步驟，將37.5mg(0.055mmol)的中間物C3與15mg(0.066mmol)的市售3-[(2-胺基乙基)硫烷基]丙酸甲酯鹽酸鹽(1：1)於DMF中，在25mg(0.066mmol)的HATU及29μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。於RT攪拌15min後，再次加入偶合劑。將反應於RT另再攪拌15min及然後濃縮及以製備式HPLC純化產物。產率：21mg(48%的理論值).LC-MS(方法1)：Rt =1.41min；MS(ESIpos)：m/z=802(M+H)+ .
就裂解甲酯，係將21mg(0.026mmol)的此中間物溶於5ml的甲醇，加入655μl的a 2M氫氧化鋰溶液並將反應於RT攪拌至隔夜。於此時間內，在硫上發生部分氧化。將反應濃縮並將殘餘物置於水中處理及然後以乙酸調整至pH3。以50ml的乙酸乙酯萃取混合物二次及然後將有機層以硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。在將殘餘物於高真空下乾燥後得到的混合物無進一步純化用於下個步驟與8.4mg(0.033mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在11.6mg(0.031mmol)的HATU及22μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。將反應於RT攪拌5min及然後濃縮。將殘餘物置於乙酸乙酯中處理及以5%濃度檸檬酸萃取溶液及然後以水萃取。然後將有機層以硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。將殘餘物於高真空下乾燥後所得到的混合物無進一步純化用於下個步驟。
然後將22mg的此粗產物溶於2ml的DCM及以0.5ml的三氟乙酸去 保護。於RT攪拌10min後，將反應濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。於高真空下乾燥，得到2.1mg的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.83min；MS(ESIpos)：m/z=784(M+H)+ .
中間物F31
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{[2-{(1R)-1-[(3-胺基丙基)(羥乙醯基)胺基]-2,2-二甲基丙基}-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基}苯基)-L-丙胺醯胺(1：1)
此中間物係由中間物C10於6個步驟使用經典的胜肽化學法所合成。
在第一步驟，將42mg(0.066mmol)的中間物C10與20.7mg(0.066mmol)的N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-丙胺酸在5ml的DMF中於100mg(0.266mmol)的HATU及46μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。將反應於RT攪拌至隔夜及以製備式HPLC純化產物。由此得到16mg(27%的理論值)的N-醯化化合物及9mg(12%的理論值)的N-,O-雙醯化化合物。
N-醯化化合物之去保護係在DMF中以哌啶來進行。雙醯化化合物係在乙醇中以哌啶及以甲基胺溶液二者來處理。在此二種情況下，形成(3-{[(1R)-1-{1-[3-(L-丙胺醯基胺基)苯甲基]-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基}-2,2-二甲基丙基](羥乙醯基)胺基}丙基)胺甲酸第三丁酯並以製備式 HPLC純化，得到13mg純度95%。
LC-MS(方法1)：Rt =0.95min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+ .
將13mg(0.019mmol)的此中間物於2ml的DMF中與9.1mg(0.021mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸酯在7μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。於RT攪拌20h後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。以1,4-二烷/水凍乾，得到10mg(54%的理論值)。
以哌啶在DMF中後續移除Fmoc保護基，得到9mg(quant.)部分保護的中間物。然後將9mg(0.01mmol)的此中間物於2ml的DMF與3.2mg(0.01mmol)的市售1-{6-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在5μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。於RT攪拌至隔夜後，將反應濃縮並以製備式HPLC純化產物。以乙腈/水及幾滴1,4-二烷凍乾，得到3mg(32%的理論值)，將其在最後步驟於2ml的DCM中以0.5ml的三氟乙酸去保護。以乙腈/水凍乾，得到3.8mg(quant.)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=849(M+H)+ .
中間物F32
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧丙基)丁醯胺(1：1)
此中間物係藉由將15mg(0.041mmol)的中間物C5與16.8mg(0.027mmol)的中間物L23在10.5mg(0.055mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、8.4mg(0.055mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及14μl(0.08mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合，及隨後以TFA去保護。由此得到3.4mg(15%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=708(M+H)+ .
中間物F33
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}丁醯胺(1：1)
合成此中間物在第一步驟開始係以50mg(0.075mmol)的中間物C3與26.2mg(0.082mmol)的9H-茀-9-基甲基(2-胺基乙基)胺甲酸酯鹽酸鹽(1：1)在28.7mg(0.15mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、22.9mg(0.15mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及39μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。於RT攪拌18h後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到45mg(65%的理論值)的此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.51min；MS(ESIpos)：m/z=921(M+H)+ .
將45mg(0.049mmol)的此中間物置於10ml的乙醇中處理，並加入176μl的40%濃度甲胺水溶液。將反應於0℃攪拌50℃，6h和9h後加入相同 量的甲胺溶液。於50℃另再攪拌14h後，另再加入700μl的甲胺溶液，及將混合物再攪拌20h後，最後濃縮。將殘餘物置於DCM中處理及以水清洗。將有機層濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物於高真空下乾燥，得到32mg(99%的理論值)的{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-氧丁-2-基}胺甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =0.95min；MS(ESIpos)：m/z=657(M+H)+ .
將8.3mg(0.013mmol)的此中間物溶於4ml的二氯甲烷，並加入3.3mg(0.013mmol)的溴乙酸酐及2μl的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌1h後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮並將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。將殘餘物置於1ml的二氯甲烷中處理丙並以0.5ml的三氟乙酸去保護。濃縮及由乙腈/水凍乾，得到1.1mg(9%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=677/679(M+H)+ .
中間物F34
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
此中間物係藉由將14mg(0.022mmol)的中間物C5與12.7mg(0.024mmol)的中間物L8在9.9mg(0.026mmol)的HATU及19μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合所製備。將反應於RT攪拌30min及以製備式HPLC純化產物及然後以乙腈/水冷凍乾燥。
將得到的中間物置於3ml的二氯甲烷中處理及以1ml的三氟乙酸去保護。於RT攪拌30min後，將反應濃縮並將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到8.2mg(36%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=913(M+H)+ .
中間物F35
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
於氬氣下及於0℃，將57.3mg(0.07mmol)的N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L38)、9.2mg(0.07mmol)的HOAt及32mg(0.08mmol)的HATU加到31.8mg(0.07mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)之4.0ml的DMF溶液中。然後加入23.5 μl(0.14mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，並將反應於RT攪拌至隔夜。加入7.7μl的HOAc並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到33.4mg(38%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.12min；MS(ESIpos)：m/z=651[M+2H]2+ .
中間物F36
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
合成標題化合物係類似中間物F35之製備來進行。
15.4mg(0.03mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。
25.0mg(0.03mmol)的N-[31-(2,5-二氧雜-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L25)。
由此得到10.7mg(27%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.13min；MS(ESIpos)：m/z=1215[M+H]+ .
中間物F37
三氟乙酸/N-(4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-3-基)-31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯胺(1： 1)
非對映異構物之混合物
類似中間物C21之合成，製備化合物3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-{[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]胺基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
分別8.0(0.01mmol)和13.0mg(0.02mmol)的3-胺基-4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(中間物C23)。
分別9.0mg(0.01mmol)和14.7mg(0.02mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七-1-基}丙醯胺。
產率(二個反應組合)：
10.5mg(42%)非對映異構物1
11.6mg(46%)非對映異構物2
標題化合物係類似合成中間物F38所製備。
10.5mg(0.01mmol)的3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-{[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H- 吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]胺基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(非對映異構物1)
60.6mg(0.54mmol)的TFA。
由此得到7.4mg(70%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.09min；MS(ESIpos)：m/z=1086[M+H]+ .
中間物F38
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-7,35-二側氧-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧雜-3-硫雜-6,34-二氮雜三十七-1-醯胺(1：1)
起初將24.8mg(0.02mmol)的[38-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-35-硫雜-4,32,38-三氮四十一烷-41-基]胺甲酸第三丁酯(中間物C21)注入1.0ml的二氯甲烷，並加入85.8mg(0.75mmol)的TFA。將混合物於RT攪拌16h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到23.0mg(95%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.96min；MS(ESIpos)：m/z=1104[M+H]+ .
中間物F39
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
標題化合物係類似合成中間物F35所製備。
56.1mg(0.10mmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L44)。
45.0mg(0.10mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40).
由此得到20.9mg(21%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.16min；MS(ESIpos)：m/z=1040[M+H]+ .
中間物F40
三氟乙酸/N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-3-基)甲基]-31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯胺(1：1)
3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-[33-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31-二側氧-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-2,30-二氮雜三十四烷-1-基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯係類似合成中間物C21所製備。
25.0mg(0.04mmol)的三氟乙酸/3-(胺基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(1：1)(中間物C24)。
27.6mg(0.04mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-1-基}丙醯胺。
產率：20.6mg(39%的理論值)
LC-MS(方法1)：Rt =1.23min；MS(ESIpos)：m/z=1200[M+H]+ .
標題化合物係類似合成中間物F37所製備。
26.1mg(0.02mmol)的3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-[33-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,31-二側氧-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-2,30-二氮雜三十四烷-1-基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
90.6mg(0.80mmol)的TFA。
由此得到22.9mg(95%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91及0.92min；MS(ESIpos)：m/z=1100[M+H]+ .
中間物F41
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-7,35-二側氧-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧雜-3-硫雜-6,34-二氮雜三十七-1-醯胺3-氧化物(1：1)
標題化合物係類似中間物F38由15.5mg(0.01mmol)的中間物C22所製備。由此得到4.0mg(27%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.90min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+ .
中間物F42
三氟乙酸/4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]吡咯啶-3-甲醯胺(1：1)
起初將40.5mg(0.06mmol)的4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-羧酸(中間物C25)和14.5mg(0.08mmol)的1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)注入1.0ml的乙腈中，並加入64.4mg(0.51mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及50.0mg(0.08mmol)的T3P及將混合物於RT攪拌16h。再次加入相同量的1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1),N ,N -二異丙基乙基胺及T3P，並將混合物於RT再攪拌4h。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到7.2mg(15%的理論值)的化合物3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.30min；MS(ESIpos)：m/z=763[M+H]+ .
起初將7.2mg(0.01mmol)的3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺甲醯基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯注入1.0ml的二氯甲烷中，並加入43.0mg(0.38mmol)的TFA。將反應混合物於RT攪 拌16h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到4.5mg(50%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=663[M+H]+ .
中間物F43
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
將22.4mg(0.03mmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L42)溶於2.0ml的DMF，並加入4.5mg(0.03mmol)的HOAt、15.8mg(0.04mmol)的HATU及15.7mg(0.03mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。加入8.6mg(0.07mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到16.7mg(45%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1125[M+H]+ .
中間物F44
三氟乙酸/N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-3-基)甲基]-19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯胺(1：1)
標題化合物係類似合成中間物F40所製備。
25.0mg(0.04mmol)的三氟乙酸/3-(胺基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-羧酸第三丁酯(1：1)(中間物C24)。
20.5mg(0.04mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五烷-1-基}丙醯胺。
由此得到21.8mg(48%的理論值)的化合物3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-[21-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,19-二側氧-6,9,12,15-四氧雜-2,18-二氮雜二十一烷-1-基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.22min；MS(ESIpos)：m/z=1025[M+H]+ .
21.0mg(0.02mmol)的3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}-4-[21-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,19-二側氧-6,9,12,15-四氧雜-2,18-二氮雜二十一烷-1-基]吡咯啶-1-羧酸第三丁酯
168.3mg(1.48mmol)的TFA。
由此得到17.3mg(90%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92及0.94min；MS(ESIpos)：m/z=924[M+H]+ .
中間物F45
三氟乙酸/N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-離胺醯胺(1：1)
此合成係類似合成中間物F46來進行。
22.9mg(0.05mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。
36.2mg(0.05mmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(中間物L41)。
由此得到19.8mg(34%)的化合物N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.20min；MS(ESIpos)：m/z=1196[M+H]+ .
17.0mg(0.01mmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺。
由此得到13.6mg(79%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1096[M+H]+ .
中間物F46
三氟乙酸/N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-離胺醯胺(1：1)
於氬氣下及於0℃，將49.0mg(0.05mmol)的N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(中間物L40)、7.3mg(0.05mmol)的HOAt及25.3mg(0.07mmol)的HATU加到25.1mg(0.05mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)之2.0ml的DMF溶液中。然後加入18.6μl(0.11mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，並將反應於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到29.2mg(37%的理論值)的化合物N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H- 吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺。
LC-MS(方法4)：Rt =1.51min；MS(ESIpos)：m/z=1372[M+H]+ .
起初將25.2mg(0.02mmol)的N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺醯胺注入3.0ml的二氯甲烷中，並加入83.7mg(0.73mmol)的TFA。將反應溶液於RT攪拌48h。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到24.5mg(96%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.95min；MS(ESIpos)：m/z=1272[M+H]+ .
中間物F47
N-[67-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-65-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧-64-氮雜六十七-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
將15.2mg(0.01mmol)的N-[67-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-65-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧-64-氮 雜六十七-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L43)溶於1.0ml的DMF，並加入1.5mg(0.01mmol)的HOAt、5.2mg(0.01mmol)的HATU及5.2mg(0.01mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)。加入2.9mg(0.02mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，及將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到6.8mg(33%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.37min；MS(ESIpos)：m/z=1831[M+H]+ .
中間物F48
三氟乙酸/N1-(3-胺基丙基)-N1-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N18-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-6,9,12,15-四氧雜-3-硫雜十八烷-1,18-二醯胺(1：1)
起初將16.1mg(0.02mmol)的[22-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1- 基)-4,21-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十五烷-25-基]胺甲酸第三丁酯(中間物C18)注入1.5ml的二氯甲烷中，並加入26μl(0.34mmol)的TFA。將混合物於RT攪拌至隔夜，及然後另再加入26μl(0.34mmol)的TFA。將混合物再次於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於水中處理及凍乾。由此得到10.8mg(66%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.98min；MS(ESIpos)：m/z=857[M+H]+ .
中間物F49
(25S)-25-胺基-22-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸/三氟乙酸(1：1)
合成化合物(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸第三丁酯係類似合成中間物C16來進行。
50.0mg(0.08mmol)的中間物C2
20.3mg(0.18mmol)的氯乙醯氯
19.0mg(0.19mmol)的三乙胺
由此得到43.1mg(77%的理論值)的化合物(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.55min；MS(ESIpos)：m/z=689[M+H]+ .
合成化合物(6S)-9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸係類似合成中間物C17來進行。
38.8mg(0.06mmol)的(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸第三丁酯。
19.1mg(0.07mmol)的1-硫烷基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸
45.9mg(0.14mmol)的碳酸銫
由此得到40.7mg(77%的理論值)的化合物(6S)-9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.45min；MS(ESIpos)：m/z=935[M+H]+ .
合成化合物(25S)-22-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸第三丁酯係類似合成中間物C18來進行。
37.4mg(0.04mmol)的(6S)-9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-6-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3,15,18,21,24-五氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜二十七烷-27-酸。
9.2mg(0.05mmol)的1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1).
由此得到23.4mg(49%的理論值)的化合物(25S)-22-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸第三丁酯
LC-MS(方法1)：Rt =1.47min；MS(ESIpos)：m/z=1057[M+H]+ .
合成標題化合物係類似合成中間物F38來進行。
20.8mg(0.02mmol)的(25S)-22-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-4,21-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-19-硫雜-3,22-二氮雜二十六烷-26-酸第三丁酯。
157.0mg(1.37mmol)的TFA。
由此得到13.0mg(65%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=901[M+H]+ .
中間物F50
三氟乙酸/1-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環丙甲醯胺(1：1)
將15mg(0.024mmol)的中間物C5溶於6.5ml的DCM，並加入19mg(0.049mmol)的中間物L24、13μl的N ,N -二異丙基乙基胺及10mg(0.037mmol)的2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽。將反應於RT攪拌3h及然後於減壓下乾燥。將殘餘物以製備式HPLC純化，得到2.4mg的保護中間物。將這些置於1ml的DCM中處理及以0.1ml的三氟乙酸去保護。以乙腈/水凍乾，得到2.6mg(11%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =2.4min。
LC-MS(方法1)：Rt =1.25min；MS(ESIpos)：m/z=819[M+H]+ .
中間物F51
3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧-14-氮雜十七烷-1-基]丙醯胺(異構物1)
起初將10.0mg(18.079μmol)的N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物1)注入100μl的PBS緩衝劑(Sigma D8537)中，並加入200μl的ACN.17.1mg(32.543μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧-14-氮雜十七烷-1-基]丙醯胺，及將混合物於RT攪拌16h。將反應溶液以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)並凍乾。
由此得到14.0mg(75%的理論值)的目標化合物。
異構物1
LC-MS(方法1)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1039[M+H]+ .
中間物F52
3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧14-氮雜十七-1-基]丙醯胺(異構物2)
起初將6.5mg(10.694μmol,LC/MS純度=91%)的N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物2)注入100μl的PBS緩衝劑(Sigma D8537)中，並加入200μl的ACN.10.1mg(19.249μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧-14-氮雜十七烷-1-基]丙醯胺，及將混合物於RT攪拌16h。將反應溶液以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)並凍乾。由此得到5.0mg(45%的理論值)的目標化合物。
異構物2
LC-MS(方法5)：Rt =2.87min；MS(ESIpos)：m/z=1039[M+H]+ .
中間物F53
N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡 咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物1)
起初將10.0mg(18.079μmol)的N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物1)注入200μl的PBS緩衝劑(Sigma D8537)中，並加入400μl的ACN。加入8.1mg(32.543μmol)的1,1'-丁-1,4-二基雙(1H-吡咯-2,5-二酮)，及將混合物於RT攪拌1h。然後加入300μl的DMF，並將混合物再攪拌1.5h。將反應溶液以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)並凍乾。由此得到4.0mg(29%的理論值)的目標化合物。
異構物1
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=765[M+H]+ .
中間物F54
N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物2)
起初將5.0mg(9.040μmol)的N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物2)注入500μl的DMF中。加入4.0mg(16.271μmol)的1,1'-丁-1,4-二基雙(1H-吡咯-2,5-二酮)，並將混合物於RT攪拌16h。將反應溶液以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1% TFA，梯度)並凍乾。由此得到1.1mg(16%的理論值)的目標化合物。
異構物2
LC-MS(方法6)：Rt =2.41min；MS(ESIpos)：m/z=765[M+H]+ .
中間物F55
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺甲醯基]苯基}-L-丙胺醯胺
將6.5mg(4.5μmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲 基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺溶於441μl的二氯甲烷，並加入44μl(573.1μmol)的三氟乙酸。將反應在RT於旋轉蒸發器上濃縮，置於水和CAN中處理並凍乾。由此得到5.6mg(94%的理論值，純度根據LC/MS=92%)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.01min；MS(ESIpos)：m/z=1100.6[M+H]+ .
中間物F56
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[(2S)-1-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧丙-2-基]丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F50所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(EIpos)：m/z=708[M+H]+ .
中間物F57
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[(2R)-1-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧丙-2-基]丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F56所製備
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(EIpos)：m/z=708[M+H]+ .
中間物F58
N-{5-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧戊醯基}-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
起初將16.2mg(0.02mmol)的三氟乙酸/L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺(1：1)(中間物C41)注入1.0ml的DMF中，並加入8.3mg(0.06mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及12.6mg(0.04mmol)的1,1'-[(1,5-二氧戊-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮。將反應混合物於RT攪拌至隔夜及直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到11.0 mg(60%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.18min；MS(ESIpos)：m/z=852[M+H]+ .
中間物F82
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
合成標題化合物係類似合成中間物F83來進行。所用的外消旋中間物係類似對應的R-異構物中間物所獲得。
LC-MS(方法2)：Rt =7.07min；MS(EIpos)：m/z=1236[M+Na]+ .
中間物F83
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
起初將30.0mg(0.06mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(實例98)及26.1mg(0.06mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基-N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-丙胺酸酯注入2.0ml的DMF中，並加入19.4mg(0.19mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，並加入11.5mg(0.19mmol)的 HOAc。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到41.9mg(79%的理論值)的化合物9H-茀-9-基甲基[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧丙-2-基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.44min；MS(ESIpos)：m/z=763[M+H]+ .
將37.2mg(0.05mmol)的9H-茀-9-基甲基[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1-氧丙-2-基]胺甲酸溶於1.5ml的DMF中，並加入124.6mg(1.46mmol)的2-胺基乙醇。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物置於乙酸乙酯及水間分溶並將有機層以水清洗二次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇10：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到14.2mg(50%的理論值)的化合物N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=541[M+H]+ .
將14.1mg(0.03mmol)的N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺及11.4(0.03mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸酯溶於1.5ml的DMF中，並加入7.9mg(0.08mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，並加入4.7mg(0.08mmol)的HOAc。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到15.9mg(71%的理論值)的化合物N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.46min；MS(ESIpos)：m/z=862(M+H)+ .
將14.9mg(0.02mmol)的N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺溶於1.5ml的DMF中，並加入44.2mg(0.52mmol)的2-胺基乙醇。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物置於乙酸乙酯及水間分溶並將有機層以水清洗二次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇10：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到5.7mg(52%的理論值)的化合物L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=640(M+H)+ .
將5.5mg(8.6μmol)的L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺及6.5mg(6.5μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七-1-基}丙醯胺溶於1.0ml的DMF，並加入0.9mg(8.6mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，並加入0.8mg(0.01mmol)的HOAc。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到7.7mg(74%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.10min；MS(ESIpos)：m/z=1214(M+H)+ .
中間物F84
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧丙基)丁醯胺(1：1)
首先，將16.5mg(0.02mmol)的中間物C54置於5ml的DMF中處理及與10.4mg(0.041mmol)的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在11.7mg(0.03mmol)的HATU及18μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應。於RT攪拌5min後，將混合物濃縮並將殘餘物置於乙腈/水1：1中處理。以三氟乙酸將pH調整至2及將反應再次濃縮。將剩餘的殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到8mg(42%的理論值)的保護中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.38min；MS(EIpos)：m/z=929[M+H]+ .
將7.6mg(0.008mmol)的此中間物置於3ml的DMF中處理，並加入92mg(0.82mmol)的1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷。將反應以超音波浴處理1h。然後加入31μl的乙酸並將反應於高真空下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到3mg(45%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(EIpos)：m/z=707[M+H]+ .
1 H NMR(500MHz,DMSO-d6 )：δ=8.15(t,1H),7.9-8.1(m,4H),7.6(m,1H),7.5(s,1H),7.15-7.35(m,6H),6.9-7.0(m,3H),6.85(s,1H),5.6(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.05及4.2(2d,2H),3.1-3.2(m,4H),2.15(m,2H),0.7及1.45(2m,2H),0.8(s,9H).
中間物F85
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1- 基)乙基]丁醯胺(1：1)
首先，將10mg(0.014mmol)的中間物C53置於3.4ml的DMF中處理並與7mg(0.027mmol)的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在7.8mg(0.02mmol)的HATU及12μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應。於RT攪拌15min後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到6.6mg(57%的理論值)的保護中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.4min；MS(EIpos)：m/z=858[M+H]+ .
將6.6mg(0.008mmol)的此中間物置於2ml的DMF中處理，並加入86mg(0.77mmol)的1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷。將反應以超音波浴處理2h。然後加入44μl的乙酸並將反應於高真空下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到3.3mg(53%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(EIpos)：m/z=636[M+H]+ .
中間物F86
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧丙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物係由8mg(0.012mmol)的中間物C51藉由與4.5mg(0.017mmol)的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在5.8mg(0.015mmol)的HATU及10μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到7mg(78%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.83min；MS(EIpos)：m/z=708[M+H]+ .
中間物F87
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(3-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-氧丙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F2由16mg(0.025mmol)的中間物C49藉由與24mg(0.076mmol)的中間物L1在EDCI/HOBT及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到3mg的標題化合物(14%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(EIpos)：m/z=694[M+H]+ .
中間物F88
化合物係類似中間物F8所製備。
LC-MS(方法5)：Rt =2.97min；MS(EIpos)：m/z=1006[M+H]+ .
中間物F89
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係由8mg(0.012mmol)的中間物C51藉由與7.4mg(0.014mmol)的中間物L8在5.8mg(0.015mmol)的HATU及10μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到10mg(78%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(EIpos)：m/z=984[M+H]+ .
中間物F90
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係由11mg(0.018mmol)的中間物C49藉由與13.7mg(0.018mmol)的中間物L17在34mg(0.089mmol)的HATU及19μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到7.5mg(35%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法8)：Rt =6.78min；MS(EIpos)：m/z=1092[M+H]+ .
中間物F91
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁醯胺(1：1)
將9.3mg(0.01mmol)的[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯 基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-1-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-1-氧丁-2-基]胺甲酸第三丁酯溶於2ml的二氯甲烷，並加入740mg(6.49mmol,0.50ml)的三氟乙酸及將混合物於RT攪拌1.5h。然後將反應混合物濃縮並將殘餘物置於乙腈和水中處理並凍乾。由此得到9.2mg(96%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(EIpos)：m/z=637[M+H]+ .
中間物F103
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{[(1R)-1-(3-苯甲基-7-氯-4-側氧-3,4-二氫喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基](4-甲基苯甲醯基)胺基}丙基)-L-丙胺醯胺
標題化合物係由10mg(0.019mmol)的N-(3-胺基丙基)-N-[(1R)-1-(3-苯甲基-7-氯-4-側氧-3,4-二氫喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基]-4-甲基苯甲醯胺藉由與11.3mg(0.019mmol)的中間物L44在8.8mg(0.023mmol)的HATU及10μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應所製備。以製備式HPLC純化。
產率：8.5mg(35%的理論值)
LC-MS(方法5)：Rt =3.82min；MS(EIpos)：m/z=1085[M+H]+ .
中間物F104
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯 -1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
將10mg(0.014mmol)的中間物C53溶於3.3ml的DMF，並加入8.5mg(0.027mmol)的中間物L1、7.8mg(0.02mmol)的HATU及12μl的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應於RT攪拌15min及然後濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化，凍乾後得到5.6mg(38%的理論值)的保護中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.32min；MS(ESIpos)：m/z=915(M+H)+ .
將5.6mg(0.006mmol)的此中間物置於2ml的DMF中處理，並加入69mg(0.61mmol)的1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷。將反應以超音波浴處理2h。然後加入35μl的乙酸並將反應於高真空下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到2.4mg(48%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(EIpos)：m/z=693[M+H]+ .
HPLC(方法11)：Rt =1.91min；
另一種選擇，標題化合物亦由中間物C58所製備。起先將15mg(0.023mmol)的中間物C58與11mg(0.036mmol)的中間物L1在13mg(0.034mmol)的HATU及10μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應。於RT攪拌60min後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到12.3mg(63%的理論值)的保護中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.3min；MS(EIpos)：m/z=837[M+H]+ .
在第二步驟，將此中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入12mg(0.088 mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌2h。然後加入26mg(0.088mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml的0.1%濃度三氟乙酸水溶液。將反應以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到8.1mg(68%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=693(M+H)+ .
中間物F105
N2 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F32係由中間物C5及中間物L46所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(EIpos)：m/z=766[M+H]+ .
中間物F106
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F104係由中間物C53及中間物L47所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.85min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=983(M+H)+ .
中間物F107
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.024mmol)的中間物C49藉由與22.3mg(0.049mmol)的中間物L48在14mg(0.037mmol)的HATU及21μl的N ,N -二異丙 基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到13mg(60%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F108
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F104由20mg(0.027mmol)的中間物C53及24mg(0.054mmol)的中間物L48所製備。由此得到3mg(14%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+ .
中間物F109
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}丁醯胺(1：1)
將17mg(0.026mmol)的中間物C57置於3ml的DMF中處理及與7mg(0.027mmol)的市售1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮在14μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應。於RT攪拌15min後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到7mg(33%的理論值)的此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.29min；MS(ESIpos)：m/z=777及779(M+H)+ .
將此中間物置於1ml的二氯甲烷中處理及以1ml的三氟乙酸去保護。濃縮及以乙腈/水凍乾後，得到6mg(88%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=677/679(M+H)+ .
中間物F110
N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F109由16mg(0.023mmol)的中間物C5及17mg(0.025mmol)的中間物L49所製備。由此得到6mg(24%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.93min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=933及935(M+H)+ .
中間物F111
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.022mmol)的中間物C5藉由與16mg(0.044mmol)的中間物L50在12.5mg(0.032mmol)的HATU及19μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到13mg(67%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F112
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺 基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.024mmol)的中間物C49藉由與18mg(0.049mmol)的中間物L50在14mg(0.037mmol)的HATU及21μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到12mg(51%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F113
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.019mmol)的中間物C53藉由與14mg(0.038mmol)的中間物L50在11mg(0.029mmol)的HATU及17μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以133mg的DABCO於2ml的DMF中去保護所製備。以HPLC純化，得到4mg(24%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法5)：Rt =2.77min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+ .
中間物F114
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.022mmol)的中間物C5藉由與16mg(0.044mmol)的中間物L51在12.6mg(0.032mmol)的HATU及19μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到11mg(53%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F115
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺 基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.024mmol)的中間物C49藉由與18mg(0.047mmol)的中間物L51在13mg(0.035mmol)的HATU及21μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到12mg(51%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F116
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由11mg(0.014mmol)的中間物C51藉由與11mg(0.028mmol)的中間物L51在8mg(0.021mmol)的HATU及12μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以87mg的DABCO於2ml的DMF中去保護所製備。以HPLC純化，得到3.3mg(28%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+ .
中間物F117
三氟乙酸/N-[(3S)-3-胺基-4-{2-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]肼基}-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
標題化合物係根據經典的胜肽化學法由中間物C49所製備。首先，將C49與9H-茀-9-基甲基肼羧酸在HATU的存在下偶合。然後以哌啶於DMF中移除Fmoc保護基並將得到的肼與6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸在HATU的存在下偶合。在最後的步驟，以TFA於二氯甲烷中移除Boc保護基。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(EIpos)：m/z=722[M+H]+ .
中間物F118
三氟乙酸/N-[(3S)-3-胺基-4-{2-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]肼基}-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
在第一步驟，標題化合物係類似中間物F3由15mg(0.019mmol)的中間物C53藉由與市售6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己烷肼在HATU的存在下偶合所製備。以142mg的DABCO於DMF中移除Fmoc保護基。以HPLC純化，得到3mg(19%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.90min；MS(EIpos)：m/z=721[M+H]+ .
中間物F119
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}丁醯胺(1：1)
將29mg(0.044mmol)的中間物C58置於3.4ml的DMF中處理，並加入36mg(0.087mmol)的中間物L52、25mg(0.065mmol)的HATU及19μl 的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌60min後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到26.4mg(73%的理論值)的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=820及822(M+H)+ .
將此中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入6.5mg(0.048mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌4h。加入13.9mg(0.048mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml的0.1%濃度三氟乙酸水溶液。將反應以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到14.4mg(58%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=676及678(M+H)+ .
中間物F120
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由10mg(0.015mmol)的中間物C5藉由與11mg(0.03mmol)的中間物L53在8.4mg(0.022mmol)的HATU及13μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到7.5mg(59%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F121
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由10mg(0.016mmol)的中間物C49藉由與11.5mg(0.031mmol)的中間物L53在9mg(0.024mmol)的HATU及14μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到9mg(61%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F122
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.019mmol)的中間物C53藉由與14mg(0.038mmol)的中間物L53在11mg(0.029mmol)的HATU及17μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以202mg的DABCO於3ml的DMF中去保護所製備。以HPLC純化，得到4mg(24%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(EIpos)：m/z=747[M+H]+ .
中間物F123
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由10mg(0.015mmol)的中間物C5藉由與11mg(0.030mmol)的中間物L54在8.4mg(0.022mmol)的HATU及13μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到4mg(31%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F124
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由10mg(0.016mmol)的中間物C49藉由與11.5mg(0.031mmol)的中間物L54在9mg(0.024mmol)的HATU及14μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到9mg(66%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(EIpos)：m/z=748[M+H]+ .
中間物F125
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係由15mg(0.019mmol)的中間物C53藉由與14mg(0.038mmol)的中間物L54在11mg(0.029mmol)的HATU及17μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以127mg的DABCO在3ml的DMF中去保護所製備。以HPLC純化，得到3mg(17%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法4)：Rt =1.08min；MS(EIpos)：m/z=769[M+Na]+ .
中間物F126
N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F110由18mg(0.027mmol)的中間物C49及21mg(0.027mmol)的中間物L49所製備。由此得到8.7mg(30%的理論值於 2階段中)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.94min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=933及935(M+H)+ .
中間物F127
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-N-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
將12mg(0.015mmol)的中間物C59溶於2.4ml的DMF，並加入14.6mg(0.046mmol)的中間物L1、6mg(0.031mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、5.9mg(0.039mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及8μl的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌1h後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到11mg(70%的理論值)的此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=942(M+H)+ .
將11mg(0.011mmol)的此中間物置於2ml的DMF中處理，並加入123mg(1.1mmol)的1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷。將反應以超音波浴處理2h。然後加入63μl的乙酸並將反應於高真空下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到2mg(22%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(EIpos)：m/z=721[M+H]+ .
HPLC(方法11)：Rt =1.95min；
中間物F128
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-D-丙胺醯基)-N2 -{N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係由3mg(0.005mmol)的中間物C5藉由與2.5mg(0.003mmol)的中間物L55在2.5mg(0.007mmol)的HATU及3μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到1.4mg(32%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(EIpos)：m/z=1077[M+H]+ .
中間物F129
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸
標題化合物係類似中間物F128由10mg(0.016mmol)的中間物C49藉由與19mg(0.024mmol)的中間物L56在12mg(0.031mmol)的HATU及14μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到13.5mg(70%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(EIpos)：m/z=1117[M+H]+ .
中間物F142
R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將20.0mg(23.7μmol)的R/S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)和13.4mg(26.04mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧 基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺溶於1.0ml的DMF，並加入4.8mg(47.34μmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入3.6mg(0.06mmol)的乙酸並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到12.4mg(44%的理論值)的化合物R/S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.30min；MS(ESIpos)：m/z=1129(M+H)+ .
將10.0mg(8.85μmol)的R/S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-高半胱胺酸溶於三氟乙醇，並加入3.1mg(22.71μmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪至隔夜。加入3.9mg(0.01mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物簡單攪及然後加入水(0.1% TFA)。純化係直接以製備式RP-HPLC來進行(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以少許的水凍乾。由此得到7.6mg(78%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=983(M+H)+ .
1 H NMR(400MHz,DMSO-d6 )：δ[ppm]=0.50(m,1H),0.81(s,9H),1.49(m,1H),1.89(m,1H),2.05(m,1H),2.29-2.43(m,4H),2.45-2.55(m,2H),2.58-2.74(m,2H),3.10-3.20(m,2H),3.21-3.40(m,2H),3.42-3.54(m,16H),3.55-3.65(m,4H),4.28(m,1H),4.91(dd,1H),5.18(dd,1H),5.60(s,1H),6.95(m,1H),7.00(s,2H),7.15-7.38(m,7H),7.53(s,1H),7.68(m,1H),8.00(m,2H)。
中間物F143
三氟乙酸/6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]己醯胺(1：1)
起初將30.0mg(0.05mmol)的2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸及13.5mg(0.07mmol)的6-(乙醯基硫烷基)己酸注入含1滴水之2.0ml的甲醇中。加入23.0mg(0.17mmol)的碳酸鉀。將反應混合物於50℃攪拌4h。將乙酸乙酯加到反應混合物中。將有機層以飽和的NaCl溶液清洗及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到54.2mg(90%的理論值)的化合物11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽二十烷-20-酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.49min；MS(ESIpos)：m/z=1106(M+H)+ .
起初將54.0mg(0.07mmol)的11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽二十烷-20-酸及16.7mg(0.09mmol)的1-(2-mino乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)注入3.0ml的乙腈中，並加入75.0mg(0.58mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。加入60.0mg(0.09mmol)的T3P(50%之乙腈溶液)並將混合物於RT攪拌至隔夜。將反應以水終止反應及將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到42.8mg(68%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-側氧己基)硫烷基]乙醯基}胺基)丙基]胺甲酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.48min；MS(ESIpos)：m/z=866(M+H)+ .
將20.0mg(0.02mmol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-側氧己基)硫烷基]乙醯基}胺基)丙基]胺甲酸溶於2.0ml的三氟乙醇，並加入4.7mg(0.04mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜，及然後加入10.1mg(0.04mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸並將混合物攪拌10min。加入水(0.1% TFA)並將反應混合物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到9.2mg(48%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.98min；MS(ESIpos)：m/z=722(M+H)+ .
中間物F144
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
起初將50.0mg(0.1mmol)的[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯(中間物C15)注入2.0ml的二氯甲烷中，並加入22.7mg(0.22mmol)的三乙胺及49.3mg(0.22mmol)的6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯(中間物L60)WISV1648-1-1。
將反應混合物於RT攪拌至隔夜。每2h(三次)加入1當量的中間物L60及1.2當量的三乙胺，及然後將混合物於RT攪拌至隔夜。再重複此步驟二次。於減壓下移除溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到30.9mg(43%的理論值)的化合物[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.51min；MS(ESIpos)：m/z=706(M+H)+ .
將24.6mg(0.04mmol)的[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺 基)丙基]胺甲酸第三丁酯溶於3.0ml的二氯甲烷，加入79.5mg(0.7mmol)的TFA並將混合物於RT攪拌6h。另再加入79.5mg(0.7mmol)的TFA並將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下移除溶劑並將殘餘物與二氯甲烷共蒸餾三次。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到24.2mg(97%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.02min；MS(ESIpos)：m/z=606(M+H)+ .
中間物F145
三氟乙酸/6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]己醯胺
起初將90.0mg(0.15mmol)的3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸(中間物C16)和43.6mg(0.23mmol)的6-(乙醯基硫烷基)己酸注入含1滴水之9.0ml的甲醇，並加入73.9mg(0.54mmol)of碳酸鉀。將反應混合物於RT攪拌4h，及然後加入乙酸乙酯。將有機層以水/飽和的NaCl溶液及以飽和的NaCl溶 液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥並於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物於矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇100：2)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到98.7mg(83%的理論值)的化合物9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.44min；MS(ESIpos)：m/z=701(M+H)+ .
起初將20.0mg(0.03mmol)的9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸及6.5(0.04mmol)的1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)注入1.5ml的乙腈中，並加入23.6mg(0.04mmol)的T3P及29.5mg(0.23mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入水。將反應混合物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到16.7mg(99%的理論值)的化合物[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-側氧己基)硫烷基]乙醯基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.40min；MS(ESIpos)：m/z=823(M+H)+ .
將14.8mg(0.02mmol)的[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-6-側氧己基)硫烷基]乙醯基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯溶於1.5ml的二氯甲烷，並加入41.0mg(0.36mmol)的TFA。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。
然後，在各情況下再加入二次的41.0mg(0.36mmol)TFA並將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於 減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於1,4-二烷及水中處理並凍乾。由此得到2.9mg(19%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=723(M+H)+ .
中間物F146
R/S-[2-([(3S)-3-胺基-3-羧丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-側氧乙基]-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將25.0mg(28.12μmol)的R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基]高半胱胺酸(中間物C12)和15.9mg(30.93μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺溶於2.0ml的DMF，並加入11.4mg(112.48μmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔 夜。加入7.6mg(0.13mmol)的乙酸並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到23.9mg(59%的理論值)的化合物R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.26min；MS(ESIpos)：m/z=1173(M+H)+ .
將11.8mg(8.23μmol)的R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸溶於三氟乙醇，並加入1.7mg(12.35μmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。加入3.6mg(0.01mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物簡單攪拌及然後加入水(0.1% TFA)。純化係直接以製備式RP-HPLC來進行(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到5.8mg(62%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.20min；MS(ESIpos)：m/z=1029(M+H)+ .
中間物F147
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10-側氧-3,6-二氧雜-16-硫雜-9-氮雜十八-18-醯胺(1：1)
起初將15.0mg(0.03mmol)的9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十八烷-18-酸(中間物C13)注入1.5ml的乙腈中，並加入22.1mg(0.17mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及然後17.7mg(0.03mmol)的T3P。將混合物於RT攪拌5min，及然後加入9.5mg(0.03mmol)的三氟乙酸/1-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)(中間物L59)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜並以水終止反應。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到14.8mg(57%的理論值)的化合物[19-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,18-二側氧-3,6-二氧雜-16-硫雜-9,19-二十二烷-22-基]胺甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.40min；MS(ESIpos)：m/z=911(M+H)+ .
將14.2mg(0.02mmol)的[19-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪 唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,18-二側氧-3,6-二氧雜-16-硫雜-9,19-二氮雜二十二烷-22-基]胺甲酸第三丁酯溶於1.5ml的二氯甲烷，加入35.5mg(0.31mmol)的TFA並將混合物於RT攪拌至隔夜。另再加入71.0mg(0.62mmol)的TFA並將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於少許的水中處理並凍乾。由此得到14.0mg(97%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.01min；MS(ESIpos)：m/z=811(M+H)+ .
中間物F148
三氟乙酸/6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}亞磺醯基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]己醯胺(1：1)
標題化合物為合成中間物F145中所形成的副產物。由此得到8.1mg(53%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.25min；MS(ESIpos)：m/z=739[M+H]+ .
中間物F149
三氟乙酸/R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸(1：1)
起初將20.0mg(24.94μmol)的R/S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-側氧乙基]高半胱胺酸(中間物C14)和14.1mg(27.44μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺注入1.0ml的DMF中，並加入5.1mg(49.88μmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物攪拌至隔夜。加入3.7mg(0.06mmol)的乙酸並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到18.2mg(67%的理論值)的化合物R/S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-側氧乙基]-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.23min；MS(ESIpos)：m/z=1086(M+H)+ .
將17.6mg(0.02mmol)的R/S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-2-側氧乙基]-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸溶於1.5ml的二氯甲烷，加入37.0mg(0.32mmol)的TFA並將混合物於RT攪拌至隔夜。另再加入74.0mg(0.64mmol)的TFA並將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於少許的水中處理並凍乾。由此得到16.0mg(90%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=986(M+H)+ .
中間物F150
三氟乙酸/N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)乙基]-L-丙胺醯胺(1：1)
於氬氣下及於0℃，將10.0mg(0.02mmol)的三氟乙酸/[3-({[(2-胺基乙基)硫烷基]乙醯基}{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯(中間物C20)之1.0ml的DMF溶液以12.1mg(0.02mmol)的N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L25)、2.2mg(0.02mmol)的HOAt及7.6mg(0.02mmol)的HATU處理。及然後加入5.5μl(0.03mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，並將反應於RT攪拌至隔夜。加入1.8μl的HOAc並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到10.4mg(48%的理論值)的化合物N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十四烷-14-基)-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法4)：Rt =1.60min；MS(ESIpos)：m/z=687.5[M+2H]2+ .
起初將9.5mg(0.01mmol)的N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二側氧-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十四烷-14-基)-L-丙胺醯胺注入1.0ml的二氯甲烷中，加入15.8mg(0.14mmol)的TFA並將混合物攪拌至隔夜。另再加入31.6mg(0.28mmol)的TFA，並將混合物攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物置於少許的水中處理並凍乾。由此得到10.2mg(98%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.13min；MS(ESIpos)：m/z=637.5[M+2H]2+ .
中間物F151
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)胺 甲醯基]-2-苯基-2,3-二氫-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙胺醯胺
起初將5.0mg(0.01mmol)的(2S)-2-(3-胺基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-甲醯胺注入1.0ml的乙腈中，並加入7.7mg(0.06mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及9.8(0.02mmol)的T3P。將混合物於RT攪拌5min，及然後加入9.1mg(0.02mmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L44)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入水並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到4.3mg(35%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.02min；MS(ESIpos)：m/z=989[M+H]+ .
中間物F152
N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)胺甲醯基]-2-苯基-2,3-二氫-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙胺醯胺
起初將5.0mg(0.01mmol)的(2S)-2-(3-胺基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N-甲 氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-甲醯胺注入1.0ml的乙腈中，並加入7.7mg(0.06mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及9.8(0.02mmol)的T3P。將混合物於RT攪拌5min，及然後加入11.8mg(0.02mmol)的N-[31-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L25)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入水並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到4.7mg(34%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1165[M+H]+ .
中間物F153
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-羥基丙醯基]胺基)-N-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
此合成係類似中間物F104由中間物C60來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =1.1min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H)+ .
中間物F154
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2 -{N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F2由10mg(0.015mmol)的中間物C8及15mg(0.022mmol)的中間物L6所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.91min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1077(M+H)+ .
中間物F155
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2 -{N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係藉由將14mg(0.019mmol)的中間物C61與15mg(0.021 mmol)的中間物L61在8.7mg(0.023mmol)的HATU及17μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護，加以製備。以製備式HPLC純化，得到13mg(59%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=1076(M+H)+ .
中間物F156
N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，三肽衍生物2-三甲基矽基)乙基-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸係由N2 -[(苯甲基氧基)羰基]-N6 -(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸係根據經典的胜肽化學法(以2-(三甲基矽基乙醇使用EDCI/DMAP酯化，氫解，與N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸在HATU的存在下偶合，及另外再氫解)所製備。
將84mg(0.163mmol)的此中間物置於2.5ml的DMF中處理，並加入58mg(0.244mmol)的1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮。於RT攪拌10min後，將混合物濃縮，將殘餘物置於乙腈/水1：1中處理並將混合物以三氟乙酸調整至pH 2及以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮後，將殘餘物 置於15ml的5%濃度三氟乙酸之DCM溶液中處理並於RT攪拌2h。然後將混合物在稍微冷卻下濃縮並將殘餘物以乙腈/水1：1冷凍乾燥。於二個步驟得到53mg(50%的理論值)的此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.72min；MS(ESIpos)：m/z=537及539(M+H)+ .
就合成標題化合物，係將18mg(0.027mmol)的此中間物置於4ml的DMF中處理，並加入16mg(0.025mmol)的中間物C61和19mg的HATU及9μl的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌5min後，加入幾滴的三氟乙酸並將反應以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及以乙腈/水1：1凍乾後，將得到的中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入4.8mg(0.035mmol)的氯化鋅後，將反應於0℃攪拌50℃攪拌2.5h。及然後加入10mg(0.035mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並將反應以乙腈/水稀釋並過濾。純化係以製備式HPLC來進行。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，於二個步驟得到3.2mg(13%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.94min；
LC-MS(方法5)：Rt =2.79min；MS(ESIpos)：m/z=932及934(M+H)+ .
中間物F163
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係藉由將37mg(0.056mmol)的中間物C58及41mg(0.056 mmol)的中間物L61，在HATU的存在下偶合，及隨後如中間物F119所述以氯化鋅去保護所製備。由此得到12mg(19%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.49min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1005(M+H)+ .
中間物F164
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F155藉由將20mg(0.030mmol)的中間物C58與27mg(0.033mmol)的中間物L62在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.92min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=1091(M+H)+ .
中間物F165
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2 -{N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F155藉由將15mg(0.021mmol)的中間物C61與18mg(0.023mmol)的中間物L62在HATU的存在下偶合，隨後以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=1162(M+H)+ .
中間物F166
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6 -{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，三氟乙酸/(1R,3S)-3-胺基環戊羧酸苯甲基酯(1：1)係由市售(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸根據經典的胜肽化學法藉由將苯甲基醇使用EDCI/DMAP酯化及隨後以TFA於DCM中移除第三丁氧基羰基保護基所製備。
將51mg(0.076mmol)的此中間物置於6ml的DMF中處理並與50mg(0.076mmol)的中間物C58在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶 合。以製備式HPLC純化後，將中間物置於甲醇中處理並於10%鈀活性碳上於RT在標準氫氣壓下氫化2h。然後將催化劑濾出，於減壓下移除溶劑及以製備式HPLC純化產物。由二烷凍乾，得到21mg(34%的理論值於二個步驟)的(1R,3S)-3-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]胺基}環戊羧酸。
標題化合物係類似中間物F155藉由將10.5mg(0.013mmol)的此中間物與11.4mg(0.014mmol)的中間物L62，在HATU的存在下偶合，及隨後以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到8.6mg(48%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=1203(M+H)+ .
中間物F167
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F129由11mg(0.016mmol)的中間物C藉由與20mg(0.024mmol)的中間物L56在12mg(0.032mmol)的HATU及14μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應及隨後以三氟乙酸去保護所製備。由此得到11mg(46%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法4)：Rt =1.13min；MS(EIpos)：m/z=1117[M+H]+ .
中間物F168
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，三氟乙酸/苯甲基(1R,2S)-2-胺基環戊羧酸(1：1)係由市售(1R,2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊羧酸根據經典的胜肽化學法藉由以苯甲基醇使用EDCI/DMAP酯化及隨後以TFA於DCM中移除第三丁氧基羰基保護基所製備。
將102mg(0.305mmol)的此中間物置於12ml的DMF中處理並與100mg(0.152mmol)的中間物C58，在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。以製備式HPLC純化後，將中間物置於甲醇中處理及於10%鈀活性碳上於RT在標準氫氣壓下氫化2h。然後將催化劑濾出，於減壓下移除溶劑及以製備式HPLC純化產物。由乙腈/水1：1凍乾，得到70mg(59%的理 論值於二個步驟)的(1R,2S)-2-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]胺基}環戊羧酸。
然後標題化合物係藉由將20mg(0.013mmol)的此中間物與16.6mg(0.023mmol)的中間物L61在9.5mg(0.025mmol)的HATU及18μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到9.3mg(30%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.98min；MS(ESIpos)：m/z=1116(M+H)+ .
中間物F169
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6 -{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
合成標題化合物係類似中間物F168由中間物C58及L62來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=1202(M+H)+ .
中間物F170
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪 唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-D-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似其非對映異構物中間物F23所製備。
HPLC(方法11)：Rt =1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.83min；MS(ESIpos)：m/z=1092(M+H)+ .
中間物F171
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-D-丙胺醯基)-N2 -{N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
合成標題化合物係類似中間物F155由中間物C62及L61所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1076(M+H)+ .
中間物F172
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸/三氟 乙酸(1：1)
標題化合物係由10mg(0.013mmol)的中間物C63藉由與9mg(0.014mmol)的中間物L63在5.5mg(0.014mmol)的HATU及11μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後藉由於三氟乙酸/二氯甲烷1：1之溶液中攪拌2.5小時所製備。由此得到11mg(72%的理論值於二個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(EIpos)：m/z=1049[M+H]+ .
中間物F173
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係由15mg(0.018mmol)的中間物C64藉由與12mg(0.02mmol)的中間物L63在7.7mg(0.02mmol)的HATU及16μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去 保護所製備。以製備式HPLC純化，得到12mg(58%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(EIpos)：m/z=1048[M+H]+ .
中間物F174
N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F172由中間物C57及L63所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.9min；MS(EIpos)：m/z=1049[M+H]+ .
中間物F175
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
標題化合物係藉由將11mg(0.013mmol)的中間物C64與3.4mg(0.016mmol)的6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸在6.7mg(0.018mmol)的HATU及9μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到8mg(69%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.35min；MS(EIpos)：m/z=893[M+H]+ .
中間物F176
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-12-側氧-3,6,9-三氧雜-13-氮-十五烷-15-基]丁醯胺(1：1)
標題化合物係藉由將5mg(0.006mmol)的中間物C64與2mg(0.007mmo1)的3-(2-{2-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸(其製備係如中間物L15中所述)，在3.5mg(0.009mmol)的HATU及4μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到2mg(35%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(EIpos)：m/z=839[M+H]+ .
中間物F177
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺 基)-N-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F168使用中間物L1取代中間物L61所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(EIpos)：m/z=804[M+H]+ .
中間物F178
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}環戊甲醯胺(1：1)
標題化合物係類似中間物F177使用中間物L52取代中間物L1所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(EIpos)：m/z=787及789[M+H]+ .
中間物F179
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己基]丁醯胺(1：1)
標題化合物係藉由將15mg(0.023mmol)的中間物C58與6mg(0.025mmol)的1-(6-胺基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮在13mg(0.034mmol)的HATU及16μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到8.5mg(46%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt =2.22min；MS(EIpos)：m/z=692[M+H]+ .
中間物F180
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係藉由將9.6mg(0.012mmol)的中間物C64與5mg(0.013mmol)的中間物L64在7mg(0.018mmol)的HATU及6μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到3.1mg(28%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(EIpos)：m/z=822[M+H]+ .
中間物F192
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-L-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
將60mg(0.091mmol)的中間物C58置於8ml的DMF中處理並與45mg(0.100mmol)的中間物L65在42mg(0.11mmol)的HATU及64μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。以製備式HPLC純化後，將中間物置於10ml 的乙醇中處理及於10%鈀活性碳上於RT在標準氫氣壓下氫化45min。然後將催化劑濾出，於減壓下移除溶劑及以製備式HPLC純化產物。由乙腈/水1：1凍乾，得到24.5mg(31%的理論值於二個步驟)的2-(三甲基矽基)乙基3-胺基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-L-丙胺酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.17min；MS(EIpos)：m/z=844[M+H]+ .
然後標題化合物係藉由將10mg(0.012mmol)的此中間物與2mg(0.013mmol)的市售(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸中間物在5.4mg(0.014mmol)的HATU及8μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到3.5mg(33%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+ .
中間物F193
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
合成標題化合物係類似中間物F192由3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸/N-環己基環己胺(1：1)所製備。。
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+ .
中間物F194
N-{5-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-5-氧戊醯基}-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
標題化合物係由實例98首先藉由與N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合所製備。在下個步驟，於10%鈀活性碳上於RT在標準氫氣壓下氫化1小時移除Z保護基及然後如中間物F58所述，藉由與1,1'-[(1,5-二氧戊-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮反應，將保護的中間物轉變成標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.19min；MS(ESIpos)：m/z=851[M+H]+ .
中間物F195
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁基}-N'-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]琥珀醯胺(1：1)
標題化合物係藉由將26mg(0.035mmol)的中間物C65與18mg(0.07mmol)的市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在8ml的DMF中於40mg(0.1054mmol)的HATU及61μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到16mg(43%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=721(M+H)+ .
1 H NMR(500MHz,DMSO-d6 )：δ=7.99(t,1H),7.95(t,1H),7.6-7.75(m,4H),7.5(s,1H)7.2-7.4(m,6H),6.8-7.0(m,4H),5.63(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.26及4.0(2d,2H),3.3-3.6(m,4H),3.15-3.25(m,3H),2.85-3.0(m,2H),2.2-2.3(m,4H),0.64及1,49(2m,2H),0.81(s,9H)。
中間物F196
三氟乙酸/2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基-N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸酯(1：1)
首先，將15mg(0.023mmol)的中間物C58置於4ml的DMF中處理並與8.2mg(0.025mmol)的中間物L67在13.0mg(0.034mmol)的HATU及16μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應。於RT攪拌30min後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合及蒸發溶劑後，將殘餘物以乙腈/水1：1冷凍乾燥。由此得到4.3mg(20%的理論值)的保護中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.35min；MS(EIpos)：m/z=852[M+H]+ .
將4.3mg(4.5μmol)的中間物溶於1ml的三氟乙醇及如中間物F119所述，以3.65mg(27μmol)氯化鋅去保護。以製備式HPLC純化，得到1mg(25%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=708(M+H)+
中間物F204
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(2-{[3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
起先將25mg(0.038mmol)的中間物C58與16.5mg(75%純度)(0.038mmol)的中間物L68在17mg(0.046mmol)的HATU及20μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下反應。於RT攪拌60min後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到18.3mg(56%的理論值)的保護中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.32min；MS(EIpos)：m/z=851[M+H]+ .
在第二步驟，將此中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入12mg(0.086mmol)的氯化鋅並將反應於50℃攪拌2h。然後加入25mg(0.086mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml的0.1%濃度三氟乙酸水溶液。將反應以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到11mg(62%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H)+ .
中間物F205
三氟乙酸/1-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]哌啶-4-基N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸酯(1：1)
此合成係藉由將25mg(0.034mmol)的中間物C61與29mg(0.041mmol)的中間物L69，在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合，接著以鈀活性碳(10%)於標準壓力下氫化，然後與(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸，在HATU及N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及最後以氯化鋅移除2-(三甲基矽基)乙氧基羰基保護基。HPLC純化，得到11mg(26%的理論值於4個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=1061(M+H)+ .
中間物F206
三氟乙酸/1-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]哌啶-4-基N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-L-丙胺酸酯(1：1)
此合成係類似中間物F205來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=975(M+H)+ .
中間物F207
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2 -{N-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似中間物F155所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+ .
中間物F209
R-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將93.9mg(0.78mmol)的L-半胱胺酸懸浮於93.0mg(1.11mmol)碳酸氫鈉及0.9ml水的溶液中。加入溶於6.0ml異丙醇之70.0mg(0.11mmol)的 2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯(中間物C70)，並加入202.3mg(1.33mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯。將反應混合物於50℃攪拌90min。加入水(0.1% TFA)，並將反應以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到53.9mg(59%的理論值)的化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt =1.24min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+ .
將86.0mg(0.1mmol)的R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)和58.5mg(0.11mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺溶於4.0ml的DMF，並加入20.9mg(0.21mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入15.5mg(0.26mmol)的HOAc並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到68.6mg(59%的理論值)的化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法6)：Rt =2.88min；MS(ESIpos)：m/z=1115(M+H)+ .
將46.4mg(0.04mmol)的R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽 十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-半胱胺酸溶於2.0ml的三氟乙醇，並加入17.0mg(0.13mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。另再加入8.5mg(0.07mmol)的二氯化鋅，並將混合物於50℃攪拌至隔夜。加入36.5mg(0.13mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到19.4mg(43%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=971(M+H)+ .
中間物F210
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-D-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似合成中間物F209使用D-半胱胺酸所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=971(M+H)+ .
中間物F211
三氟乙酸/3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二 氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丙醯胺(1：1)
起初將30.0mg(0.05mmol)的2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯(中間物C70)共同與5.5mg(0.05mmol)的3-硫烷基丙酸注入含幾滴水之0.5ml的甲醇中。然後加入23.0mg(0.17mmol)的碳酸鉀，並將反應混合物於50℃攪拌4h。加入乙酸乙酯並將有機層以水清洗一次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物無進一步純化用於下個合成步驟。由此得到30.3mg(86%的理論值)的化合物11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸.
LC-MS(方法1)：Rt =1.39min；MS(ESIpos)：m/z=702(M+H)+ .
起初將30.0mg(0.04mol)的11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸及9.8mg(0.06mmol)的1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(1：1)注入2.0ml的乙腈中，並加入44.2mg(0.34mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。加入35.4mg(0.06mmol)T3P(50%之乙酸乙酯溶液)，並將反 應混合物於RT攪拌至隔夜。加入水，並以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到22.0mg(63%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-側氧丙基)硫烷基]乙醯基}胺基)丙基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.41min；MS(ESIpos)：m/z=824(M+H)+ .
將22.0mg(0.03mol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-3-側氧丙基)硫烷基]乙醯基}胺基)丙基]胺甲酸溶於1.0ml的三氟乙醇，並加入9.1mg(0.07mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌5h。加入19.5mg(0.07mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到15.0mg(71%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=680(M+H)+ .
中間物F212
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10-側氧-3,6-二氧雜-13-硫雜-9-氮十五-15-醯胺(1：1)
起初將28.8mg(0.04mmol)的11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸(中間物C69)共同與18.3mg(0.05mmol)的三氟乙酸/1-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)(中間物L59)注入1.9ml的乙腈中。然後加入42.4mg(0.33mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，並逐滴加入33.9mg(0.05mmol)的T3P(50%之乙酸乙酯溶液)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到10.7mg(26%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基[16-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,15-二側氧-3,6-二氧雜-13-硫雜-9,16-二氮十九烷-19-基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.44min；MS(ESIpos)：m/z=812(M+H)+ .
將10.7mg(0.01mol)的2-(三甲基矽基)乙基[16-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-10,15-二側氧-3,6-二氧雜-13-硫雜-9,16-二氮十九烷-19-基]胺 甲酸酯溶於0.8ml的三氟乙醇，並加入8.0mg(0.06mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌5h。加入17.1mg(0.06mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。直接以製備式RP-HPLC進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。
LC-MS(方法1)：Rt =1.03min；MS(ESIpos)：m/z=768(M+H)+ .
中間物F213
三氟乙酸/3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)-N-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丙醯胺(1：1)
起初將27.5mg(0.04mmol)的11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸(中間物C69)共同與15.9mg(0.05mmol)的三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L1)注入1.8ml的乙腈中。然後加入32.4mg(0.31mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，並逐滴加入32.4mg(0.05mmol)的T3P(50%之乙酸乙酯溶液)。將 反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到11.9mg(35%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基[13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧雜-10-硫雜-3,6,13-三氮十六烷-16-基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.39min；MS(ESIpos)：m/z=881(M+H)+ .
將11.9mg(0.01mol)的2-(三甲基矽基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧-10-硫雜-3,6,13-三氮十六烷-16-基]胺甲酸溶於1.0ml的三氟乙醇，並加入5.5mg(0.04mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。加入11.8mg(0.04mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。直接以製備式RP-HPLC進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到7.4mg(60%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt =2.75min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+ .
中間物F214
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-α-麩胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
起初將111.7mg(0.30mmol)的(2S)-5-(苯甲基氧基)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-氧戊酸注入3.0ml的DMF中，並加入46.1(0.30mmol)的HOBt、96.6mg(0.30mmol)的TBTU及38.9mg(0.30mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應混合物於RT攪拌10min。然後加入溶於116.3mg(0.9mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及3.0mlDMF之250.0mg(0.30mmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到257.0mg(80%的理論值)的化合物(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苯甲基氧基)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-氧戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.55min；MS(ESIpos)：m/z=1071(M+H)+ .
於氬氣下，起初將24.6mg(0.11mmol)的乙酸鈀(II)注入5.0ml的二氯甲烷中，並加入33.2mg(0.33mmol)的三乙胺及254.3mg(2.19mmol)的三乙基矽烷。將反應混合物於RT攪拌5min，並加入溶於5.0ml的二氯甲烷之234.1mg(0.22mmol)的(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苯甲基氧基)-2-{[(苯甲基氧基)羰基] 胺基}-5-氧戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物經由紙板過濾器過濾及以二氯甲烷清洗濾餅。無加熱於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到177.5mg(85%的理論值)的化合物L-α-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt =1.07min；MS(ESIpos)：m/z=846(M+H)+ .
起初將20.0mg(20.83μmol)L-α-麩醯胺基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)共同與11.8mg(22.91μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺注入1.5ml的DMF中，並加入6.3mg(62.49μmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入4.4mg(0.07mmol)的乙酸。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到19.1mg(74%的理論值)的化合物N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-α-麩醯胺基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.24min；MS(ESIpos)：m/z=1244(M+H)+ .
將17.5mg(14.06μmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-α-麩醯胺基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙 基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶於1.5ml的三氟乙醇，並加入11.5mg(84.37μmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌4h。加入24.7mg(0.08mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到10.8mg(63%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1100(M+H)+ .
中間物F215
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫烷基}乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
起初將14.9mg(0.02mmol)的N-乙醯基-S-[2-([3-(L-丙胺醯基胺基)丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-側氧乙基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(實例229)和7.1mg(0.02mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺酸酯注入1.0ml的DMF中，並加入5.7mg(0.06mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入4.5mg(0.08mmol)的乙酸。將反應混合物直接以 製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到13.3mg(78%的理論值)的化合物N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫烷基}乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.24min；MS(ESIpos)：m/z=919(M+H)+ .
將11.1mg(0.01mmol)的N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫烷基}乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺溶於5.0ml的乙醇，加入1.0mg的鈀活性碳(10%)並將混合物於RT及標準壓力下氫化至隔夜。將反應混合物以矽藻土過濾並以乙醇/THF/水混合物清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物凍乾。由此得到7.5mg(69%的理論值)的化合物L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫烷基}乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=785(M+H)+ .
起初將7.3mg(8.12μmol)的L-纈胺醯基-N-{3-[({[(2R)-2-乙醯胺基-2-羧乙基]硫烷基}乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}-L-丙胺醯胺/三氟乙酸(1：1)共同與4.6mg(8.93μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺注入0.5ml的DMF中，並加入2.5mg(24.36μmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入4.4mg(0.03mmol)的乙酸。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到4.9mg(50%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1183(M+H)+ .
中間物F216
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
於氬氣下，起初將30.2mg(0.06mmol)的N,N'-雙[(苯甲基氧基)羰基]-L-半胱胺酸注入2.0ml的水及2.0ml的異丙醇中，並加入56.7mg(0.20mmol)的TCEP。將反應混合物於RT攪拌30min。然後加入溶於2.0ml異丙醇之50.0mg(0.08mmol)的2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯(中間物C70)，及然後加入122.2mg(0.48mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯，並將反應混合物於50℃攪拌7h。然後另再加入122.2mg(0.48mmol)的1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯，並將反應混合物於50℃攪拌1h。將混合物以乙酸乙酯稀釋並以水及飽和的碳酸氫鈉溶液萃取有機層及以飽和的NaCl溶液清洗。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下蒸發溶劑清洗。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到43.1mg(64%的理論值)的化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.46min；MS(ESIpos)：m/z=851(M+H)+ .
起初將16.5mg(0.05mmol)的4-甲基苯磺酸/苯甲基β-丙胺酸酯(1：1)共同與14.0mg(0.11mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺注入1.5ml的乙腈中。將反應混合物於RT攪拌3min，及然後加入溶於1.5ml乙腈之30.8mg(0.04mmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-半胱胺酸、23.4mg(0.18mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及29.9mg(0.05mmol)的T3P(50%之乙酸乙酯溶液)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入水，並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。得到的化合物為S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸苯甲基酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.59min；MS(ESIpos)：m/z=1012(M+H)+ .
將43.8mg(43.3μmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸苯甲基酯溶於8.0ml的乙醇，加入4.4mg的鈀活性碳(10%)並將混合物於RT及標準壓力下氫化至隔夜。將反應混合物經由紙板過濾器過濾及以乙醇清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物如剛才所述再處理二次。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到4.9mg(50%的理論值)的化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt =1.08min；MS(ESIpos)：m/z=788(M+H)+ .
起初將14.5mg(16.1μmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)共同與9.1mg(17.7μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺注入1.0ml的DMF中，並加入4.9mg(48.2μmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入3.4mg(0.06mmol)的乙酸。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到4.9mg(50%的理論值)的化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt =1.28min；MS(ESIpos)：m/z=1186(M+H)+ .
將14.1mg(11.9μmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)溶於1.5ml的三氟乙醇，並加入9.7mg(71.3μmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌3h。另再加入9.7mg(71.3μmol)的二氯化鋅，並將反應混合物於50℃攪拌3h。另再加入9.7mg(71.3μmol)的二氯化鋅，並將反應混合物於70°攪拌4h。加入20.8mg(0.07mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應 混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物凍乾。由此得到6.2mg(44%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=1042(M+H)+ .
中間物F217
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
於氬氣下，起初將7.5mg(0.05mmol)的(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸注入1.5ml的DMF中，並加入7.5mg(0.05mmol)的HOBt、15.5mg(0.05mmol)的TBTU及6.2mg(0.05mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應混合物於RT攪拌10min。然後加入溶於1.5mlDMF之40.0mg(0.05mmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)及18.7mg(0.14mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到11.2mg(25%的理論值)的化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.37min；MS(ESIpos)：m/z=854(M+H)+ .
將10.9mg(12.8μmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸溶於2.0ml的三氟乙醇，並加入10.4mg(76.6μmol)二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物凍乾。由此得到7.5mg(65%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=710(M+H)+ .
中間物F218
N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-γ -麩胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
於氬氣下，起初將22.9mg(0.06mmol)的(4S)-5-(苯甲基氧基)-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-氧戊酸注入2.0ml的DMF中，並加入9.4mg(0.05mmol)的HOBt、19.8mg(0.06mmol)的TBTU及8.0mg(0.06mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應混合物於RT攪拌10min。加入溶於1.0mlDMF之51.2mg(0.06mmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸(中間物C71)，及然後加入23.9mg(0.19mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺，並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到11.2mg(25%的理論值)的化合物(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苯甲基氧基)-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-氧戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.52min；MS(ESIpos)：m/z=1070(M+H)+ .
於氬氣下，起初將3.9mg(0.02mmol)的乙酸鈀(II)注入1.0ml的二氯甲烷中，並加入5.3mg(0.05mmol)的三乙胺及254.3mg(2.19mmol)的三乙基矽烷。將反應混合物於RT攪拌5min，並加入溶於1.0ml二氯甲烷之18.6mg(0.02mmol)的(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苯甲基氧基)-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-氧戊醯基]胺基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七-17-酸。無加熱於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物置於乙腈中處理，經由注射器過濾器過濾並以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到11.0mg(66%的理論值)的化合物L-γ -麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt =1.14min；MS(ESIpos)：m/z=846(M+H)+ .
起初將15.0mg(15.6μmol)的L-γ-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)共同與8.8mg(17.2μmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺注入1.0ml的DMF中，並加入4.7mg(46.9μmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入3.3mg(0.06mmol)的乙酸。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到14.2mg(70%的理論值)的化合物N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-γ-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法4)Rt =1.24min；MS(ESIpos)：m/z=1244(M+H)+ .
將13.8mg(11.1μmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-γ-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1- 苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶於2.0ml的三氟乙醇，並加入9.1mg(66.5μmol)二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌4h。加入19.4mg(0.07mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到6.9mg(50%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=1100(M+H)+ .
中間物F235
三氟乙酸/N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺甲醯基]苯基}-L-丙胺醯胺(1：1)
將120.0mg(0.22mmol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(參見 合成中間物C11)和52.1mg(0.28mmol)的4-硝基苯甲醯氯溶於8.0ml的二氯甲烷，並加入28.4mg(0.28mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。由此得到97.7mg(64%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.54min；MS(ESIpos)：m/z=705(M+H)+ .
將97.0mg(0.14mmol)的2-(三甲基矽基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯溶於5.0ml的乙醇，加入9.7mg的鈀活性碳(10%)並將混合物於標準壓力下氫化5h。將反應混合物經由紙板過濾器過濾及以乙醇清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物無進一步純化用於下個合成步驟。由此得到87.4mg(88%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.47min；MS(ESIpos)：m/z=675(M+H)+ .
起初將59.3mg(0.09mmol)的2-(三甲基矽基)乙基{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺甲酸酯及25.5mg(0.11mmol)的N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺酸共同與68.1mg(0.53mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺注入5.0ml的乙腈中。緩慢地加入72.7mg(0.11mmol)的T3P(50%之乙酸乙酯溶液)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到52.2mg(68%的理論值)的化合物[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基 丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]胺基}-1-氧丙-2-基]胺甲酸苯甲基酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.48min；MS(ESIpos)：m/z=880(M+H)+ .
將23.9mg(0.03mmol)的苯甲基[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]胺基}-1-氧丙-2-基]胺甲酸溶於3.0ml的乙酸乙酯，加入2.4mg的鈀活性碳(10%)並將混合物於標準壓力下氫化2h。將反應混合物經由濾紙過濾並以乙酸乙酯清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物無進一步純化用於下個合成步驟。由此得到20.1mg(90%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基[3-([4-(L-丙胺醯基胺基)苯甲醯基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.13min；MS(ESIpos)：m/z=746(M+H)+ .
起初將20.0mg(0.03mmol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-([4-(L-丙胺醯基胺基)苯甲醯基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯共同與14.9mg(0.04mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺酸酯注入2.0ml的DMF中，並加入5.4mg(0.05mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到化合物N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.49min；MS(ESIpos)：m/z=979(M+H)+ .
將17.0mg(17.4μmol)的N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙 基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺溶於2.5ml的乙酸乙酯，加入1.7mg的鈀活性碳(10%)並將混合物於標準壓力下氫化至隔夜。將反應混合物經由濾紙過濾及以乙酸乙酯清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到15.3mg(60%的理論值)的化合物L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.15min；MS(ESIpos)：m/z=845(M+H)+ .
起初將15.3mg(0.01mmol)的L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺共同與7.9mg(0.02mmol)的3-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜十五-1-基}丙醯胺注入2.4ml的DMF中，並加入1.9mg(0.02mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後加入1.4mg(0.02mmol)的乙酸。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到11.7mg(70%的理論值)的化合物N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺。
將11.7mg(0.01mmol)的N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-γ-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基矽基)乙氧 基]羰基}胺基)丙基]胺甲醯基)苯基]-L-丙胺醯胺溶於2.0ml的三氟乙醇中，並加入3.9mg(0.03mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。加入8.3mg(0.03mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到5.4mg(47%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1100(M+H)+ .
中間物F236
(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-4-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丁酸/三氟乙酸(1：1)
合成標題化合物係類似中間物F192由(2R)-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸/N-環己基環己胺(1：1)來進行。
LC-MS(方法4)：Rt =1.1min；MS(ESIpos)：m/z=751(M+H)+ .
中間物F238
三氟乙酸/N-{(2S)-1-胺基-3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙-2-基}-N'-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫 -1H-吡咯-1-基)乙基]琥珀醯胺(1：1)
將18mg(0.025mmol)的中間物C72置於6ml的DMF中處理並與7.5mg(0.03mmol)的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)在11.3mg(0.03mmol)的HATU及22μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。於RT攪拌1h後，將反應濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮並將殘餘物以乙腈/水1：1冷凍乾燥。由此得到15mg(67%的理論值)的中間物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.71min；MS(EIpos)：m/z=873[M+Na]+ .
然後標題化合物係由此中間物，如中間物F119中所述，藉由以氯化鋅於4ml的三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到8.5mg(63%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+Na)+ .
中間物F241
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(2-{[N-(溴乙醯基)甘胺醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物係由中間物C66藉由與市售的1-(2-溴乙醯氧基)吡咯啶-2,5-二酮偶合及隨後以氯化鋅去保護類似地製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(EIpos)：m/z=733及735[M+H]+ .
中間物F242
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-(3-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丙基)丁醯胺(1：1)
合成標題化合物係類似中間物F104來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H)+ .
中間物F243
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[2-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡 咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙基]丁醯胺(1：1)
合成標題化合物係類似中間物F242來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+ .
中間物F244
N-{2-[(S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-L-半胱胺醯基)胺基]乙基}-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
起初將100mg(約0.101mmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基矽基)丙醯基]-L-半胱胺酸(中間物C 73) 注入88ml的二甲基甲醯胺中，並加入107mg(約0.15mmol)的N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(中間物L73)、46mg(0.12mmol)的HATU及88μl(0.50mmol)的。將反應混合物於RT攪拌15分鐘。將水/二氯甲烷加到混合物中，及然後以水和鹽水清洗有機層，以硫酸鎂乾燥，於旋轉蒸發器上濃縮及於高真空下乾燥。進一步使用此殘餘物無進一步純化。由此得到92mg(59%，純度72%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.59min；MS(ESIpos)：m/z=1096(M+H)+ .
於氬氣下，將40mg(0.30mmol)的氯化鋅加到91mg(約0.06mmol)的2-(三甲基矽基)乙基[(9R)-4-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,15-三氧-9-{[3-(三甲基矽基)丙醯基]胺基}-7-硫雜-4,11,14-三氮二十-1-基]胺甲酸酯之1.45ml的三氟乙醇溶液中。將反應混合物於50℃攪拌2h。然後加入30mg(0.22mmol)的氯化鋅，並將混合物於RT另再攪拌1h。加入52mg(0.18mmol)的EDTA，及於RT攪拌10分鐘後，以水/乙腈稀釋混合物並以製備式HPLC純化(移動相：ACN/水+0.1%TFA，梯度)。由此得到17mg(31%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.80min；MS(ESIpos)：m/z=808(M+H)+ .
中間物F245
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁基}-N'-(2-{[(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)琥珀醯亞胺(1：1)
標題化合物係藉由將10mg(0.0135mmol)的中間物C65與8mg(0.027mmol)的中間物L1在8ml的DMF中於15mg(0.04mmol)的HATU及9μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合及隨後如中間物F119中所述，以氯化鋅於三氟乙醇中去保護所製備。以製備式HPLC純化，得到8.8mg(58%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=778(M+H)+ .
中間物F247
三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-溴-4-氧代丁酸甲酯(1：1)
將14mg(0.018mmol)的中間物C66溶於14ml的DCM，及以一次加入少許加入10.1mg(0.037mmol)的2-溴-1-乙基吡錠三氟硼酸鹽(BEP)，總計250μl的吡啶。將pH保持在5及6。然後以乙酸將pH調整至4，將反應濃 縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合，凍乾及乾燥，得到4mg(21%的理論值)保護中間物，然後將其在胺基功能基上以氯化鋅去保護。HPLC純化及凍乾，得到3mg(72%的理論值)的標題化合物為無色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=805及807(M+H)+ .
中間物F248
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-{2-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁醯胺(1：1)
標題化合物係藉由將10mg(0.015mmol)的中間物C58與5mg(0.017mmol)的中間物L12，在HATU的存在下偶合，及隨後以氯化鋅去保護所製備。由此得到6.5mg(52%的理論值於二個步驟)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=680(M+H)+ .
中間物F254
三氟乙酸/(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-溴-4-氧代丁酸甲酯(1：1)
標題化合物係類似中間物247藉由將15mg(0.02mmol)的中間物C66與21mg(0.099mmol)的(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸[其合成係描述於(J.Org.Chem.200,65,517-522)]偶合，由(2S)-2-胺基-4-甲氧基-4-氧代丁酸鹽酸鹽(1：1)所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=805及807(M+H)+ .
B：製備抗體/活性化合物接合物(ADC)
B-1.產生抗-TWEAKR抗體之通用方法
抗-TWEAKR抗體，例如，係藉由篩選用於重組的人類TWEAKR SEQ ID NO：138及鼠科TWEAKR SEQ ID NO：137之噬菌體表現庫來產生。將此方式所得的抗體重定格式成人類的IgG1格式並用於本處所述的操作實例。此外，與TWEAKR結合的抗體已為熟習本項技術者所知，參見，例如WO2009/020933(A2)或WO2009140177(A2)。
SEQ ID NO：138(多肽)：
SEQ ID NO：137(多肽)：
B-2.於哺乳細胞中表現抗-TWEAKR抗體之通用方法
抗體，例如TPP-2090，係以過渡的哺乳動物細胞培養來產生，如Tom等人所描述，Methods Express之第12章：Expression Systems由Micheal R.Dyson及Yves Durocher所編輯，Scion Publishing Ltd,2007(參見AK-實例1)。
B-3.由細胞上清液純化抗體之通用方法
抗體，例如TPP-2090，係由細胞培養上清液所獲得。藉由離心細胞來澄清細胞上清液。然後藉由親和層析於MabSelect Sure(GE Healthcare)層析管柱上純化細胞上清液。就此項，係以DPBS pH 7.4(Sigma/Aldrich)平衡管柱，施予細胞上清液並以約10個管柱體積的DPBS pH 7.4+500mM氯化鈉沖洗管柱。以50mM乙酸鈉pH 3.5+500mM氯化鈉溶離抗體及然後進一步以凝膠過濾層析於Superdex 200管柱(GE Healthcare)上以DPBS pH 7.4純化。
市售抗體西妥昔單抗(cetuximab)係由市售產品藉由標準層析法純化(蛋 白A，製備式SEC)。
市售抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)(商品名稱賀癌平(Herceptin))係由市售產品藉由標準層析法純化(蛋白A，製備式SEC)。
來自市售產品(商品名稱CIMAher)，抗體尼妥珠單抗(nimotuzumab)係由市售產品藉由標準層析法純化(蛋白A，製備式SEC)。
來自市售產品(商品名稱Vectibix)，抗體帕尼單抗(panitumumab)係由市售產品藉由標準層析法純化(蛋白A，製備式SEC)。
B-4用於偶合半胱胺酸側鏈之通用方法
偶合反應係使用下列抗體：
西妥昔單抗(抗EGFR AK)
抗-TWEAKR AK 1(TPP-2090)
曲妥珠單抗(抗-Her2 AK)
尼妥珠單抗(抗-EGFR AK)
帕尼單抗(抗-EGFR AK)
將溶於PBS緩衝劑之2至5當量間的叁(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)，以介於1mg/ml及20mg/ml之濃度範圍，較佳地約10mg/ml至15mg/ml範圍，加到適當的抗體之PBS緩衝劑溶液中並將混合物於RT攪拌1h。就此目的，所用的個別抗體之溶液以操作實例中所述的濃度來應用，或其亦可視需要以PBS緩衝劑稀釋至一半的所述起始濃度，以便於進到較佳的濃度範圍。隨後，依照希望的載量，可加入2至12當量，較佳地約5-10當量的偶合用馬來醯亞胺前驅化合物或鹵化物前驅化合物之DMSO溶液，本處，DMSO的量不應超過總量的10%。就馬來醯亞胺前驅物的情況，係將反應於RT攪拌60-240min而就鹵化物前驅物的情況係於RT攪拌8至24h間，及然後施用於PBS-平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑溶離。一般而言，除非另有指出，否則係使用5mg的所述抗體溶於PBS緩衝劑進行還原及隨後結合。於PD10管柱上純化，因此，在各 情況下得到個別ADC之3.5ml PBS緩衝劑溶液。然後將樣本以超離心濃縮及視需要以PBS緩衝劑再稀釋。若需要，較佳的移除低分子量組份係以PBS緩衝劑再稀釋後，重覆以超過濾濃縮。就生物檢測，若需要，最終的ADC樣本濃度視需要係以再稀釋調整至0.5-15mg/ml的範圍。測定個別的ADC溶液之蛋白濃度(操作實例中所述)。再者，抗體載量(藥物/mAb比率)係使用下文B-7所述的方法來測定。
除非另有指出，否則實例中所示的免疫接合物係藉由此方法來製備。依照連接子，實例中所示的ADC亦可或多或少以水解的開鏈琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
特言之，KSP-I-ADC經由連接子基礎結構 與抗體的硫醇基相連，亦可視需要以針對性的方式，根據流程26經由以開鏈琥珀醯胺相連接的ADC，在偶合後藉由於pH 8再緩衝約20h來製備。
#1係代表連接抗體的硫橋，及#2為經修飾的KSP抑制劑之連接點。
此等ADC，其中連接子係經由水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體，亦可視需要以針對性的方式，藉由下列之示例製程來製備： 於氬氣下，將0.344mg TCEP之100μl的PBS緩衝劑溶液加到60mg的所述抗體之5ml的PBS緩衝劑溶液(c~12mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於600μlDMSO之0.003mmol的馬來醯亞胺前驅化合物。於RT另再攪拌1.5h-2h後，將反應以事先已調整至pH之81075μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施予經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液以PBS緩衝劑pH 8稀釋至14ml的總體積。將此溶液於RT在氬氣下攪拌至隔夜。若需要， 然後將此溶液再緩衝至pH 7.2。以超離心濃縮ADC溶液，以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋及然後適需要再次濃縮至約10mg/ml的濃度。
在操作實例中連接抗體之其他潛在水解敏感性噻烷基琥珀醯亞胺橋含有下列連接子基礎結構，其中#1係代表連接抗體的硫醚鍵連而#2為與修飾的KSP抑制劑之連接點：
這些連接子基礎結構係代表連接抗體之連接單元並具有(除了連接子組成之外)對在腫瘤細胞中形成的代謝物之結構和性質的顯著效應。
在所示的結構式中，AK1A 、AK1B 、AK1E 、AK1I 、AK1H 、AK1K 具有下列意義：
AK1A =西妥昔單抗(部份還原)-S§1
AK1B =抗-TWEAKR AK-1(部份還原)-S§1
AK1E =曲妥珠單抗(部份還原)-S§1
AK1I =尼妥珠單抗(部份還原)-S§1
AK1H =帕尼單抗(部份還原)-S§1 其中§1 係代表連接琥珀醯亞胺基團或連接異構性水解的開鏈琥珀醯胺之鍵連或從其所形成的伸烷基，及S係代表部份還原抗體之半胱胺酸殘基的硫原子。
B-5.用於偶合離胺酸側鏈之通用方法
偶合反應係使用下列抗體：
西妥昔單抗(抗EGFR AK)
抗-TWEAKR AK 1(TPP-2090)
曲妥珠單抗(抗-Her2 AK)
尼妥珠單抗(抗-EGFR AK)
帕尼單抗(抗-EGFR AK)
將2至8當量所欲偶合的前驅化合物之DMSO中溶液，以介於1mg/ml及20mg/ml之濃度範圍，較佳地約10mg/ml，依照希望的載量加到所指抗體之PBS緩衝劑溶液中。於RT攪拌30min至6h後，再次加相同量之前驅化合物之DMSO溶液。本處，DMSO的量不應超過總量的10%。於RT另再攪拌30min至6h後，將反應施用於經PBS平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑溶離。一般而言，除非另有指出，否則係使用5mg的所述抗體溶於PBS緩衝劑進行反應及隨後偶合。於PD10管柱上純化，因此，在各情況下得到個別ADC之3.5ml PBS緩衝劑溶液。然後將樣本以超離心濃縮及視需要以PBS緩衝劑再稀釋。若需要，較佳的移除低分子量組份，係以PBS緩衝劑再稀釋後，重覆以超過濾濃縮。就生物檢測，若需要，最終的ADC樣本濃度視需要係以再稀釋調整至0.5-15mg/ml的範圍。
測定個別的ADC溶液之蛋白濃度(操作實例中所述)。再者，抗體載量(藥物/mAb比率)係使用下文B-7所述的方法來測定。
在所示的結構式中，AK2A 、AK2B 、AK2G 、AK2E 、AK2I 、AKH 具有下列 意義：
AK2A =西妥昔單抗(抗-EGFR AK)-NH§2
AK2B =抗-TWEAKR AK-1(部份還原)-NH§2
AK2E =曲妥珠單抗-NH§2
AK2I =尼妥珠單抗(部份還原)-NH§2
AK2H =帕尼單抗(部份還原)-NH§2 其中§2 係代表連接羰基基團之鍵連及NH係代表抗體之離胺酸的側鏈胺基基團。
B-6a.製備封閉的琥珀醯亞胺-半胱胺酸接合物之通用方法：
在示例的實施例中，係將上述的10μmol馬來醯亞胺前驅化合物置於3-5ml的DMF中處理，並加入2.1mg(20μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌2h至24h，然後於減壓下乾燥及然後以製備式HPLC純化。
B-6aa.製備開鏈的琥珀醯胺-半胱胺酸接合物之通用方法：
在示例的實施例中，係將上述的68μmol馬來醯亞胺前驅化合物置於15ml的DMF中處理，並加入36mg(136μmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌~20h，然後於減壓下乾燥及然後以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合及於減壓下蒸發溶劑，及然後將殘餘物溶於15ml的THF/水1：1。加入131μl的2M氫氧化鋰水溶液，並將反應於RT攪拌1h。然後以1M鹽酸中和反應，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到~50%理論值之區域異構性保護中間物為無色泡沫。
在最後的步驟，將0.023mmol的這些區域異構性水解產物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入12.5mg(0.092mmol)的氯化鋅，並將將反應於50℃攪拌4h。然後加入27mg(0.092mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並於減 壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮並將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到水解打開的硫烷基琥珀醯亞胺為區域異構物混合物。
B-6b.製備離胺酸接合物之通用方法：
在示例的實施例中，係將上述的10μmol上述活化酯前驅化合物置於3-5ml的DMF中處理，並在30μmol的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下加入α-胺基-保護的L-離胺酸。將反應混合物於RT攪拌2h至24h，然後於減壓下乾燥及然後以製備式HPLC純化。然後以已知的方法移除保護基。
進一步純化及本發明接合物之定性
反應後，在某些情況下將反應混合物濃縮，例如以超過濾，及然後脫鹽並以層析純化，例如使用Sephadex® G-25管柱。例如，以磷酸-緩衝食鹽水(PBS)進行溶離。然後將溶液殺菌過濾並冷凍。另一種選擇，可將接合物凍乾
B-7.測定抗體、帶毒體(toxophor)載量及開鏈半胱胺酸接合物之比例
就蛋白鑑別，除了分子量測定之外，係在去糖基化及/或變性後進行胰蛋白酶消化，其在變性、還原及衍生後，經由發現的胰蛋白酶胜肽確認蛋白的身份。
操作實例中所述的接合物之得到的PBS緩衝劑溶液之帶毒體載量係如下測定：
測定離胺酸-連接的ADC之帶毒體載量係藉由質譜測量個別接合物種類的分子量來進行。本處，首先將抗體接合物以PNGaseF去糖基化，並將樣本酸化，及HPLC分離/脫鹽後，以質譜使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)分析。加入在TIC(總離子層析圖)訊號上的所有光譜並以MaxEnt反摺積為基礎，計算不同接合物種類之分子量。然後將不同種類的訊號積分後計算DAR(=藥物/抗體比率)。
半胱胺酸-連接的接合物之帶毒體載量係藉由還原及變性的ADC之逆 相層析來測定。將胍鹽酸鹽(GuHCl)(28.6mg)及DL-二硫蘇糖醇溶液(DTT)(500mM,3μl)加到ADC溶液(1mg/ml,50μl)中。將混合物於55℃培養1小時並以HPLC分析。
HPLC分析係在Agilent 1260 HPLC系統上於220nm偵測來進行。以1ml/min之流速以下列梯度使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合物逆相管柱(型號PL1912-3802)(2.1 x150mm,8μm粒徑，1000Å)：0min,25%B；3min,25%B；28min,50%B。移動相A含有0.05%三氟乙酸(TFA)之水溶液，移動相B為0.05%三氟乙酸之乙腈溶液。
所偵測的波峰係藉由與非接合抗體的輕鏈(L0)和重鏈(H0)比較之滯留時間來分派。在結合的樣本中所獨有偵測到的波峰係歸屬於含一個帶毒體之輕鏈(L1)及含一、二或三個帶毒體(H1、H2、H3)之重鏈。
含帶毒體之抗體的平均載量係由積分所測定的波鋒面積來計算，為所有的波峰之帶毒體數目加權積分結果之總合的二倍除以所有波峰個別加權積分結果之總合。在個別的情況下，其可能，由於某些波峰的共溶離，不能精確的測定帶毒體載量。
就其中輕鏈和重鏈不能充分地以HPLC分離之情況，測定半胱胺酸-連接的結合物之帶毒體載量係藉由質譜測定個別接合物種類在輕鏈和重鏈之分子量來進行。
將胍鹽酸鹽(GuHCl)(28.6mg)及DL-二硫蘇糖醇溶液(DTT)(500mM,3μl)加到ADC溶液(1mg/ml,50μl)中。將混合物於55℃培養1小時及使用ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik)於線上脫鹽後以質譜分析。
就DAR測定，加入在TIC(總離子層析圖)訊號上的所有光譜並以MaxEnt反摺積為基礎，計算不同接合物種類在輕鏈和重鏈之分子量。含帶毒體之抗體的平均載量係由特定分子量面積之積分所計算，為所有波峰之帶毒體數目加權積分結果之總合的二倍除以所有波峰個別加權積分結果之總合。
就測量打開的半胱胺酸之比例，係測定所有個別接合的輕鏈和重鏈之封閉與打開的半胱胺酸接合物(分子量△18道爾頓)之分子量面積比率。由所有變體之平均得到打開的半胱胺酸接合物之比例。
B-8.檢測ADC之抗原結合
與標靶分子結合之結合子能力係在偶合發生後檢測。熟習本項技術者熟悉可用於此目的之各種方法；例如，接合物之親和力可使用ELISA技術或表面電漿共振分析(BIAcoreTM 測量)來檢測。接合物濃度可由熟習本項技術者使用習用的方法來測量，例如就抗體接合物係以蛋白測定(亦參見Doronina等人；Nature Biotechnol.2003；21：778-784及Polson等人，Blood 2007；1102：616-623)。
操作實例ADC
實例1A
本處，將70mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物F1偶合並將反應，在Sephadex純化後，以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：10.8mg/ml
Drug/mAb比率：2.6
附帶
在實例1A中，下式之化合物 其中n=2.6並得到一特定抗體(西妥昔單抗)。然而，本發明不僅提供確切地具有此藥物/mAb比率之此抗體的該特定接合物，亦提供具有此式之其他結合子接合物，其為一其中西妥昔單抗係經不同的抗體或其衍生物(例如半胱胺酸)置換之接合物且n=2.6係被任何在n=1至20範圍內的值所置換，較佳地n=1-10。
此項同樣適用於下列實例。
實例2A
本處，將80mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物F2偶合，及將反應，在Sephadex純化後，以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：11.0mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例2B
本處，將50mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F2偶合，並將反應，在Sephadex純化後，以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：11.7mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例2E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.4mg/ml)用於與中間物F2偶合，並將反應，在Sephadex純化後，以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.77mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例3A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物F3偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.87mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例3B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物F3偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.13mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例4A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物F4偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.11mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例4B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物F4偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.69mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例5A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物F5偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.16mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例5B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物F5偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.5mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例6A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物F6偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.24mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例6B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物F6偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.88mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例7A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F7偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.46mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例7B
本處，將40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於 與中間物F7偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：11.27mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例8A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.7mg/ml)用於與中間物F8偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例8B
本處，40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F8偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：11.54mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例8E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.4mg/ml)用於與中間物F8偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.97mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例8H
本處，將5.0mg的帕尼單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F8偶合。以TCEP還原的時間增加至4h及用於ADC偶合的攪拌時間增加至20h。然後在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。
蛋白濃度：1.79mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例9A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.6mg/ml)用於與中間物F9偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.05mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例9B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F9偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例10A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F10偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.04mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例10B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F10偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例11A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F11偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.97mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例11B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F11偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例12A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F12偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例12B
本處，將40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F12偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS 再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：9.9mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例13A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F13偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.87mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例13B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F13偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例14A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.2mg/ml)用於與中間物F14偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.32mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例14B
本處，5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F14偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.23mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例14E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.4mg/ml)用於與中間物F14偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.21mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例15A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.2mg/ml)用於與中間物F15偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.39mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例15B
本處，將32mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F15偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：11.82mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例15E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.4mg/ml)用於與中間物F15偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。 某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.57mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例16A
本處，5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.2mg/ml)用於與中間物F16偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.15mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例16B
本處，將30mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F16偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：9.54mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例16E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.4mg/ml)用於與中間物F16偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。 某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.26mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例17A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.6mg/ml)用於與中間物F17偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.02mg/ml
藥物/mAb比率：nd
實例17B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F17偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.64mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例18A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.6mg/ml)用於與中間物F18偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例18B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F18偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.74mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例19A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F19偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例19B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物F19偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.9mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例20A
本處，5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F20偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例20B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F20偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.03mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例21A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F21偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.76mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例21B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F21偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例22A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.56mg/ml)用於與中間物F22偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例22B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與 中間物F22偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.77mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例22E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.4mg/ml)用於與中間物F22偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.89mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例23A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.56mg/ml)用於與中間物F23偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.32mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例23B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F23偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例24A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.56mg/ml)用於與中間物F24偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例24B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F24偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例25A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.56mg/ml)用於與中間物F25偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.17mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例25B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F25偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.78mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例26A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.56mg/ml)用於與中間物F26偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：nd
實例26B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F26偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.02mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例27A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F27偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例27B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與 中間物F27偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例28A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.59mg/ml)用於與中間物F28偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.13mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例28B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F28偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例29A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.59mg/ml)用於與中間物F29偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.49mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例29B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F29偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.82mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例30A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.59mg/ml)用於與中間物F30偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.04mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例30B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F30偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.85mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例31A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物F31偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.21mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例31B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.54mg/ml)用於與中間物F31偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.59mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例32A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.59mg/ml)用於與中間物F32偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例32B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10.1mg/ml)用於與中間物F32偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.78mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例33A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=8.95mg/ml)用於與中間物F33偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.78mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例33B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F33偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.46mg/ml
藥物/mAb比率：3.9
實例34A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=8.95mg/ml)用於與中間物F34偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.21mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例34B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F34偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.4mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例35A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F35偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：14.30mg/ml
藥物/mAb比率：1.4
實例35B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=16.54mg/ml)用於與中間物F35偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.93mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例35E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F35偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.61mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例36A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F36偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：13.86mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例36B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=16.54mg/ml)用於與中間物F36偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.08mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例36E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F36偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例37A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.08mg/ml)用於與中間物F37偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.52mg/ml
藥物/mAb比率：1.5
實例37B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=16.54mg/ml)用於與中間物F37偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例37E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F37偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.23mg/ml
藥物/mAb比率：1.5
實例38A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.08mg/ml)用於與中間物F38偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.45mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例38B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F38偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.54mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例38E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F38偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.90mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例39A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F39偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例39B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F39偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.40mg/ml
藥物/mAb比率：1.4
實例39E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F39偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.04mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例40A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F40偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.0mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例40B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F40偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.81mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例40E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F40偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例41A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.08mg/ml)用於與中間物F41偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.53mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例41B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F41偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.73mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例41E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F39偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.09mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例42A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F42偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.05mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例42B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F42偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.64mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例42E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F42偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.80mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例43A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F43偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.90mg/ml
藥物/mAb比率：1.3
實例43B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F43偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.85mg/ml
藥物/mAb比率：1.3
實例43E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F43偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.97mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例44A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F44偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例44B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F44偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.65mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例44E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F44偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例45A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F45偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例45B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F45偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.27mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例45E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F45偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例46A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F46偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.0mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例46B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F46偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：11.21mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例46E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F46偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例47A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F47偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.51mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例47B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F47偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.89mg/ml
藥物/mAb比率：1.7
實例47E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F47偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.97mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例48A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F48偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.10mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例48B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=10.10mg/ml)用於與中間物F48偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.73mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例48E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.39mg/ml)用於與中間物F48偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例49A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F49偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.09mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例49B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F49偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例49E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F49偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.96mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例50A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.02mg/ml)用於與中間物F50偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.89mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例50B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F50偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.82mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例51A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七-1-基]丙醯胺(異構物1)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.16mg/ml
實例51B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七-1-基]丙醯胺(異構物1)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.74mg/ml
藥物/mAb比率：1.7
實例51E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.2mg/ml)用於與中間物3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七-1-基]丙醯胺(異構物1)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.67mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例52A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七-1-基]丙醯胺(異構物2)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.41mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例52B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七-1-基]丙醯胺(異構物2)偶合，並在Sephadex純化後，將反應 以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.34mg/ml
藥物/mAb比率：1.6
實例52E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.2mg/ml)用於與中間物3-{3-[(3-胺基-2-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二側氧吡咯啶-1-基}-N-[17-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15-側氧-4,7,10-三氧雜-14-氮雜十七-1-基]丙醯胺(異構物2)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.16mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例53A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡 咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物1)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.09mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例53B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物1)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例53E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.2mg/ml)用於與中間物N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物1)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.15mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例54A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物2)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.17mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例54B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=16.5mg/ml)用於與中間物N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物2)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例54E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.2mg/ml)用於與中間物N-{3-胺基-2-[({1-[4-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(異構物2)偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.90mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例55A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.1mg/ml)用於與中間物N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺甲醯基]苯基}-L-丙胺醯胺偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.47mg/ml
藥物/mAb比率：nd
實例55B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.2mg/ml)用於與中間物N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺甲醯基]苯基}-L-丙胺醯胺偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.26mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例56A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.33mg/ml)用於與中間物F56偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.74mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例56B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F56偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例57A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.33mg/ml)用於與中間物F57偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.04mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例57B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F57偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例58A
本處，將20mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.32mg/ml)用於與中間物F58偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.33mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例58B
本處，將20.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F58偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.54mg/ml
藥物/mAb比率：4.6
實例58E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F58偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.15mg/ml
實例59
N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸三氟乙酸(1：1)
將8mg(15μmol)的中間物F1置於1.7ml的DCM中處理，並加入7.3mg(30μmol)的N2-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸及13μl的N ,N -二異丙基乙基胺。將反應混合物於RT攪拌15min，然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。然後於1ml的DCM中處理中間物及使用1ml的TFA去保護。將反應濃縮並將殘餘物以乙腈/水1：1冷凍乾燥。
LC-MS(方法1)：Rt =0.8min；MS(ESIpos)：m/z=643(M+H)+ .
實例60
S-{1-[6-(2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)-6-側氧己基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸
將4mg(5μmol)的中間物F3置於1ml的DCM中處理，並加入1.2mg(10μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌20h，然後於減壓下濃縮及 然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=843(M+H)+ .
實例61
S-{1-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸
將7mg(9μmol)的中間物F2置於1.75ml的DMF中處理，並加入2.3mg(19μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌20h，然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=758(M+H)+ .
實例62
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(丙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙氧基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸
將2.9mg(3.6μmol)的中間物F5置於1ml的DMF中處理，並加入0.9mg(7.3μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌3天，及然後加入相同量的半胱胺酸。於RT另再攪拌24h後，將混合物於減壓下濃縮及以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=802(M+H)+ .
實例63
N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫氫基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸三氟乙酸(1：1)
將3mg(3μmol)的中間物F5置於2ml的DMF中處理，並加入1mg(8μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌10min，加入500μl的水並將混合物使用TFA調整至pH 2及然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC 純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=1127(M+H)+ .
實例64
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸三氟乙酸(1：1)
將5.6mg(7μmol)的中間物F7置於1ml的DMF中處理，並加入1.7mg(14μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌20h及然後於減壓下濃縮，及以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=815(M+H)+ .
實例65
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-(4-{[(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)乙醯基]胺基}苯基)-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
將3mg(3μmol)的中間物F25置於2ml的DMF及200μl的水中處理，並加入1mg(8μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌4h，加入500μl的水並使用TFA將混合物調整至pH 2及然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.76min；MS(ESIpos)：m/z=1162(M+H)+ .
實例66
S-(1-{4-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]苯基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸
將3.5mg(3.8μmol)的中間物F10置於1ml的DMF中處理，並加入1.4mg(11μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌23h，及然後加入相同量的半胱胺酸。於RT另再攪拌24h後，將混合物於減壓下濃縮及以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=877(M+H)+ .
實例67
S-{1-[2-({[(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(lR)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸
將3.3mg(4μmol)的中間物F12置於1ml的DMF中處理，並加入1.4mg(11μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌3h。然後加入500μl的水，將混合物於減壓下濃縮及以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=869(M+H)+ .
實例68
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-[4-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)苯基]-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
將3mg(3μmol)的中間物F15置於2ml的DMF中處理，並加入1mg(8μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌4h。然後將500μl的水加到反應中，並使用TFA將混合物調整至pH 2。然後將混合物於減壓下濃縮，並以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.76min；MS(ESIpos)：m/z=1105(M+H)+ .
實例69
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-(2-{[2-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)苯基]-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
將3mg(2μmol)的中間物F16置於2ml的DMF中處理，並加入0.8mg(7μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌4h。然後將500μl的水加到反應中，並使用TFA將混合物調整至pH 2。然後將混合物於減壓下濃縮，並以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=1218(M+H)+ .
實例70
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-[4-(2-{[2-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)苯基]-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
將3mg(3μmol)的中間物F24置於2ml的DMF及200μl的水中處理，並加入0.9mg(8μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌4h。然後將500μl的水加到反應中，並使用TFA將混合物調整至pH 2。然後將混合物於減壓下濃縮，並以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.77min；MS(ESIpos)：m/z=1190(M+H)+ .
實例71
(15S,19R)-15-胺基-19-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-羥乙醯基-20,20-二甲基-14-側氧-4,7,10-三氧雜-13,18-二氮雜二十一-1-酸/三氟乙酸(1：1)
在第一步驟，將70mg(0.114mmol)的中間物C5與32mg(0.114mmol)的3-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸第三丁酯於15ml的DMF中在44mg(0.228mmol)的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。35mg(0.228mmol)的1-羥基-1H -苯并三唑水合物及60μl的N ,N -二異丙基乙基胺的存在下偶合。
將反應於RT攪拌至隔夜及以製備式HPLC純化產物。由此得到33mg(33%的理論值)的保護中間物。將其以1.1ml的三氟乙酸於11ml的二氯甲烷中攪拌1h，後處理後，得到26mg(98%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=718(M+H)+ .
實例72
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基 -L-鳥胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係由中間物C3使用經典的胜肽化學法所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=842(M+H)+ .
實例73
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似實例72由中間物C3使用經典的胜肽化學法所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=814(M+H)+ .
實例74
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-4-胺基-L-苯丙胺酸/三氟乙酸(1：2)
標題化合物係由中間物C8及三氟乙酸/4-胺基-L-苯基丙胺酸甲酯(1：1)所合成，三氟乙酸/4-胺基-L-苯基丙胺酸甲酯係使用經典的胜肽化學法由市售N-(第三丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙胺酸所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=748(M+H)+ .
實例75
三氟乙酸/N-{(1R)-1-[1-(3-胺基苯甲基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-胺基丙基)-2-羥基乙醯胺(1：1)
標題化合物係由中間物C10藉由以三氟乙酸去保護所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=486(M+H)+ .
實例76
(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係由中間物C5藉由以三氟乙酸去保護所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=515(M+H)+ .
實例77
三氟乙酸/N-[(3S)-3-胺基-4-肼基-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)
標題化合物係由中間物C6藉由以三氟乙酸去保護所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=529(M+H)+ .
實例78
三氟乙酸/N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二胺基丁基]-2-羥基乙醯胺(1：1)
在第一步驟，將中間物C1與苯甲基第三丁基-[(2S)-4-氧丁-1,2-二基]雙 胺甲酸酯類似中間物C2反應。所用的醛係由市售(3S)-3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸藉由還原及隨後類似中間物C2氧化所製備。
在第二步驟，N-醯化係類似中間物C3來進行，最後接著於冰乙酸中先以33%濃度氫溴酸及然後以氫氧化鋰完全去保護。
LC-MS(方法1)：Rt =0.78min；MS(ESIpos)：m/z=500(M+H)+ .
實例79
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸
標題化合物係由中間物C8藉由以三氟乙酸去保護所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=586(M+H)+ .
實例80
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯胺(2：1)
標題化合物係由中間物C5使用經典的胜肽化學法所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.72min；MS(ESIpos)：m/z=557(M+H)+ .
實例81
(1-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸/三氟乙酸(1：2)
標題化合物係由中間物C7藉由以三氟乙酸去保護所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=587(M+H)+ .
實例82A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F82偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.59mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例82B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=10.10mg/ml)用於與中間物F82偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.59mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例82E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=11.50mg/ml)用於與中間物F82偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.15mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例83A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F83偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.77mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例83B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F83偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.29mg/ml
藥物/mAb比率：1.3
實例83E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F83偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例83H
本處，將5.0mg的帕尼單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F83偶合。經以TCEP還原之時間增加至4h並將ADC偶合的攪拌時間增加至20h。然後在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.57mg/ml
藥物/mAb比率：0.9
實例84A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.02mg/ml)用於與中間物F84偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。 某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例84B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F84偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.77mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例85A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.02mg/ml)用於與中間物F85偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.13mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例85B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F85偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再 稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.63mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例86A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.59mg/ml)用於與中間物F86偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.96mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例86B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F86偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.55mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例87A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=8.95mg/ml)用於與中間物F87偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.08mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例87B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F87偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例88A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.02mg/ml)用於與中間物F88偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.03mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例88B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F88偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.9mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例89A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.02mg/ml)用於與中間物F89偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.2mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例89B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F89偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.03mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例90A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=13.33mg/ml)用於與中間物F90偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.19mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例90B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F90偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.97mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例91A
本處，將80mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F91偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：12.75mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例91B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F91偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：5.71mg/ml
藥物/mAb比率：4.0
實例92
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸三氟乙酸(1：1)
將3mg(4μmol)的中間物F86置於3ml的DCM/水10：1中處理，並加入1.3mg(11μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌10min，然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.77min；MS(EIpos)：m/z=829[M+H]+ .
實例93
N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物1)
化合物係根據中間物C32(異構物1)所得來。
實例94
中間物C33(異構物2)N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)(異構物2)
化合物係根據中間物C33(異構物2)所得來。
實例95
三氟乙酸/4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺(2：1)
標題化合物係由{3-[(4-胺基苯甲醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]丙基}胺甲酸第三丁酯藉由以三氟乙酸去保護所製得。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(EIpos)：m/z=532[M+H]+ .
實例96
N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺
起初將101mg(0.16mmol)的2-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-側氧乙酸乙酯注入2ml的無水乙醇，並加入244mg(3.14mmol,225μl)的40%濃度甲胺水溶液。將混合物於50℃攪拌1h，及然後另再加入244mg(3.14mmol,225μl)的40%濃度甲胺水溶液及總計3.5h後將混合物直接以製備式HPLC純化。(移動相：ACN/水+1.0% NEt3 ，梯度)。由此得到52mg(70%的理論值)的目標化合物。
LC-MS(方法3)：Rt =2.56min；MS(EIpos)：m/z=471[M+H]+ .
實例97
S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將3mg(4μmol)的中間物F33置於2ml的DMF及200μl的水中處理，並加入1.4mg(12μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌1h。然後 將反應於減壓下濃縮，並以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=718(M+H)+ .
實例98
N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺
起初將150.0mg(0.42mmol)的(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中間物C52)注入2.0ml的二氯甲烷中，並加入29.2mg(0.49mmol)的HOAc及125.6mg(0.59mmol)的三乙氧基硼氫化鈉並將混合物於RT攪拌5min。加入98.9mg(0.49mmol)的3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。然後以乙酸乙酯稀釋反應混合物並將有機層以飽和的碳酸鈉溶液清洗二次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物使用矽膠純化(移動相：二氯甲烷/甲醇100：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到188.6mg(74%)的化合物2-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮。
LC-MS(方法1)：Rt =1.00min；MS(ESIpos)：m/z=541[M+H]+ .
起初將171.2mg(0.32mmol)的2-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮注入5.0ml的二氯甲烷中，並加入73.6mg(0.73mmol)的三乙胺。於0℃，加 入94.9mg(0.70mmol)的乙醯氧基乙醯氯，並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。以乙酸乙酯稀釋反應混合物及將有機層以飽和的碳酸氫鈉溶液清洗二次及以sat.NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物使用Biotage Isolera純化(矽膠，管柱10g SNAP，流速12ml/min，乙酸乙酯/環己烷1：3)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到159.0mg(77%)的化合物乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.35min；MS(ESIpos)：m/z=642[M+H]+ .
起初將147.2mg(0.23mmol)的乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-氧代乙酯注入4.0ml的乙醇中，並加入356.2mg(4.59mmol)的甲胺(40%之水溶液)。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物與甲苯共蒸餾三次。將殘餘物使用矽膠純化(移動相：二氯甲烷/甲醇10：1)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到67.4mg(63%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=470[M+H]+ .
實例99
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-甲基丁醯胺(1：1)
首先，將中間物C52以(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-氧代丁酸苯甲基酯類似C2還原性氧化，然後將二級胺基基團以2-氯-2-氧乙酸乙酯，如中間物C27所述，進行醯化。
將190mg(0.244mmol)的此中間物置於7.5ml的乙醇中處理，並加入0.35ml的40%濃度甲胺水溶液。將反應於50℃攪拌3h，並再次加入相同量的甲胺。於50℃另再攪拌5h後，將反應濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到78mg(48%的理論值)的此標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.32min；MS(EIpos)：m/z=661[M+H]+ .
將78mg(0.118mmol)的此中間物溶於8ml的乙醇及，加入15mg的10%鈀活性碳後，在RT於標準氫氣壓下氫化3min。然後將催化劑濾出，於減壓下移除溶劑及以製備式HPLC純化產物。以乙腈/水凍乾後，得到33mg(44%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.88min；MS(ESIpos)：m/z=527(M+H)+ .
1 H NMR(500MHz,DMSO-d6 )：δ=8.1(m,1H),8.0(m,3H),7.9(m,1H),7.65(m,1H),7.5(s,1H),7.15-7.35(m,5H)7.0(m,1H),6.85(m,1H),5.6(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.02及4.22(2d,2H),3.2-3.5(m,6H),0.7及1.46(2m,2H),0.8(s,9H)。
實例100
三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)
起初將100.0mg(0.21mol)的N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(中間物C40)漢109.8mg(0.28mmol)的N5-胺甲醯基-N2-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-鳥胺酸注入5.0ml的乙腈中，並加入137.3mg(1.06mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及175.8mg(0.28mmol)的T3P。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物置於飽和的氯化銨溶液及乙酸乙酯間分溶。將有機層以水清洗二次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。以硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到118.9mg(66%)的化合物N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-N2-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-鳥胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.31min；MS(ESIpos)：m/z=850[M+H]+ .
起初將97.3mg(0.11mmol)的N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-N2-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-鳥胺醯胺注入4.0ml的DMF中，並加入194.9mg(2.29mmol)的哌啶。將反應混合物於RT攪拌2h及然後以HOAc中和。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到101.4mg的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.87min；MS(ESIpos)：m/z=628[M+H]+ .
實例101
三氟乙酸/L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)
起初將96.2mg(0.13mmol)的三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)(實例100)和40.8mg(0.13mmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基-N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸酯注入2.0ml的DMF中，並加入39.4mg(0.39mmol)的4-甲基嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。另再加入59.1mg(0.59mmol)的4-甲基嗎福啉，並將混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物置於乙酸乙酯及飽和的氯化銨溶液間分溶。將有機層以飽和的NaCl溶液清洗一次及以硫酸鎂乾燥。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到74.1mg(69%)的化合物N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt =1.27min；MS(ESIpos)：m/z=827[M+H]+ .
將68.1mg(0.08mmol)的N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺溶於4.0ml的二氯甲烷，並加入187.8mg(1.65mmol)的TFA。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，另再加入187.8mg(1.65mmol)的TFA並將反應混合物於RT再次攪拌至隔夜。 於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到67.2mg(97%)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.97min；MS(ESIpos)：m/z=727[M+H]+ .
實例102
N-(3-胺基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥乙醯胺
此合成係類似合成實例98使用對應的S-異構物中間物來進行。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=470[M+H]+ .
實例103A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.33mg/ml)用於與中間物F103偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.9mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例103B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F103偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例103E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F103偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.05mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例104A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.33mg/ml)用於與中間物F104偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例104B
本處，35mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F104偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：10.93mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例104E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F104偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.11mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例104I
本處，將5.0mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=13.1mg/ml)用於與中間物F104偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.89mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例104H
本處，將5.0mg的帕尼單抗之PBS溶液(c=12mg/ml)用於與中間物F104.以還原的時間TCEP增加至4h及用於ADC偶合的攪拌時間增加至20h。然後在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.79mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例105A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.9mg/ml)用於與中間物F105偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例105B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.23mg/ml)用於與中間物F105偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.01mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例106A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.33mg/ml)用於與中間物F106偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例106B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F106偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.76mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例106E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F106偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.5mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例107A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.3mg/ml)用於與中間物F107偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.16mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例107B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F107偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.9mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例107E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F107偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.48mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例108A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.3mg/ml)用於與中間物F108偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例108B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F108偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.22mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例109A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F109.TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.1mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例109B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F109.TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.63mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例110A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.33mg/ml)用於與中間物F110.TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例110B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F110偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.64mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例110E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F110.TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS 再稀釋。
蛋白濃度：2.23mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例111A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F111偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.4mg/ml
藥物/mAb比率：3
實例111B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F111偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.71mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例112A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F122偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.2mg/ml
藥物/mAb比率：3
實例112B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F112偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.39mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例113A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F113偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例113B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F113偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例114A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F114偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.07mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例114B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F114偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.9mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例115A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F115偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.18mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例115B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F115偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.0mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例116A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F116偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.03mg/ml
藥物/mAb比率：4.4
實例116B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F116偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.96mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例117A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F117偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.02mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例117B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.4mg/ml)用於與中間物F117偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.77mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例118A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物 F118偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.38mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例118B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F118偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.14mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例118E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F118偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.27mg/ml
藥物/mAb比率：3
實例119A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.8mg/ml)用於與中間物F119偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮 及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.14mg/ml
藥物/mAb比率：3.9
實例119B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F119偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：0.91mg/ml
藥物/mAb比率：4.1
實例119E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F119偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.69mg/ml
藥物/mAb比率：4.4
實例120A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F120偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例120B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F120偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.71mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例121A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F121偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.1mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例121B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F121偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.88mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例122A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F122偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.78mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例122B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F122偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.64mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例123A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F123偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例123B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F123偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例124A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F124偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例124B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F124偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例125A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F125偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.14mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例125B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F125偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例126A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F126偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.89mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例126B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F126偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.62mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例126E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=8.23mg/ml)用於與中間物F126偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮 及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例127A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F127偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.54mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例127B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F127偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.62mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例127E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F127偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再 稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.07mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例128A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F128偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例128B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F128偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例129A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.84mg/ml)用於與中間物F129偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.28mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例129B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F129偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.06mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例129E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F129偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.0mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例130
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
4.2mg(5μmol)的中間物F32置於2ml的DCM/水10：1中處理，並加 入1.8mg(15μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌2h，然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.8min；MS(EIpos)：m/z=829[M+H]+ .
實例131
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將5mg(6μmol)的中間物F87置於1ml的DMF中處理，並加入7.5mg(62μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌20h，然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(EIpos)：m/z=815[M+H]+ .
實例132
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-[4-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)苯基]-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯胺/三氟乙酸(1：1)
將5mg(5μmol)的中間物F89置於2ml的DMF/水10：1中處理，並加入1.7mg(14μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌1h及然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙腈/水中處理，並使用TFA將混合物調整至pH 2及然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到3mg的標題化合物為白色泡沫。
LC-MS(方法4)：Rt =0.93min；MS(EIpos)：m/z=1105[M+H]+ .
實例133
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將1.6mg(2μmol)的中間物F84置於1.5ml的DMF/水10：1中處理，並加入0.74mg(6μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌10min及 然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙腈/水中處理，並使用TFA將混合物調整至pH 2及然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到1.9mg(89%的理論值)的標題化合物為白色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt =0.8min；MS(EIpos)：m/z=828[M+H]+ .
實例134
N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6 -{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
將3.8mg(3μmol)的中間物F90置於1.5ml的DMF/水10：1中處理，並加入1.2mg(9μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌15min及然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙腈/水1：1中處理，再次濃縮及然後以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到2.3mg(56%的理論值)的標題化合物為白色泡沫。
LC-MS(方法4)：Rt =1.0min；MS(EIpos)：m/z=1213[M+H]+ .
實例135
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將1.8mg(2μmol)的中間物F104置於1ml的DMF中處理，並加入2.7mg(22μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌20h，然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。剩餘的0.6mg(26%的理論值)標題化合物為無色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt =0.80min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+ .
實例136
S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將3.3mg(4μmol)的中間物F109置於2ml的DMF/水10：1中處理，並加入1.5mg(13μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌30min及然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙腈/水1：1中處理，再次濃縮及然後以 製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到1.9mg(55%的理論值)的標題化合物為白色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt =0.75min；MS(EIpos)：m/z=718[M+H]+ .
實例137
S-{1-[6-(2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)-6-側氧己基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將3.2mg(4μmol)的中間物F117置於2ml的DMF/水10：1中處理，並加入1.6mg(13μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌30min及然後於減壓下濃縮。將殘餘物置於乙腈/水1：1中處理，再次濃縮及然後以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到2mg(47%的理論值)的標題化合物為白色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt =0.76min；MS(EIpos)：m/z=843[M+H]+ .
實例138
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
起初將6.0mg(0,01mmol)的R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物F146)注入2.2ml的DMF/水(10：1)中，加入2.0mg(0.02mmol)的L-半胱胺酸並將混合物於RT攪拌10min。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到5.5mg(76%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1106(M+H)+ .
實例139
S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：2)
此合成係類似合成化合物實例138來進行。
6.0mg(0.01mmol)的三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]丁醯胺(1：1)。
2.6mg(0.02mmol)的L-半胱胺酸。
由此得到3.4mg(43%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=757(M+H)+ .
實例140
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸/三氟乙酸(1：2)
此合成係類似合成化合物實例138來進行。
6.0mg(0.01mmol)的三氟乙酸/R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]高半胱胺酸(1：1)(中間物F149)
2.0mg(0.02mmol)的L-半胱胺酸。
由此得到6.1mg(84%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1107(M+H)+ .
實例141
S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)己醯基]胺基}乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：2)
此合成係類似合成化合物實例138來進行。
10.07mg(0.01mmol)的三氟乙酸/6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]己醯胺(1：1)(中間物F143)。
9.3mg(0.08mmol)的L-半胱胺酸。
由此得到9.2mg(67%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt =1.05min；MS(ESIpos)：m/z=843(M+H)+ .
實例142A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F142偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.08mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例142B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=34.42mg/ml)用於與中間物F142偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例142E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F142偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例142I
本處，將5.0mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=13.8mg/ml)用於與中間物F142偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例142H
本處，將5.0mg的帕尼單抗之PBS溶液(c=2.1mg/ml)用於與中間物F142偶合。TCEP的還原時間為1h及ADC偶合的攪拌時間為1.5h。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.7mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例143A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F143偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例143B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=34.42mg/ml)用於與中間物F143偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.05mg/ml
藥物/mAb比率：1.6
實例143E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F143偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例144B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F144偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。
蛋白濃度：1.53mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例145A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F145偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.00mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例145B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F145偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.54mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例145E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F145偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例146A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F146偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.02mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例146B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=34.42mg/ml)用於與中間物F146偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.87mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例146E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F146偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例147A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F147偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.04mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例147B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F147偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.31mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例147E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F147偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例148A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F148偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.11mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例148B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F148偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例148E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F148偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.62mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例149A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=5.90mg/ml)用於與中間物F149偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.09mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例149B
本處，40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=34.42mg/ml)用於與中間物F149偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：9.61mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例149E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F149偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例150A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.33mg/ml)用於與中間物F150偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例150B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F150偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.81mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例150E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F150偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例151A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.90mg/ml)用於與中間物F151偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例151B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F151偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.78mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例151E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=16.90mg/ml)用於與中間物F151偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.74mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例152A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.90mg/ml)用於與中間物F152偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.80mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例152B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=12.87mg/ml)用於與中間物F152偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.77mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例152E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=16.90mg/ml)用於與中間物F152偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.69mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例153A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.32mg/ml)用於與中間物F153偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例153B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F153偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.71mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例154A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=26.8mg/ml)用於與中間物F154偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.34mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例154B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F154偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例155A
本處，將50mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=8.51mg/ml)用於與中間物F155偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：14.85mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例155B
本處，40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F155偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：11.25mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例156A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.3mg/ml)用於與中間物F156偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例156B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F156偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.79mg/ml
藥物/mAb比率：3.9
實例156E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F156偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：4.2
實例157
S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將2mg(2μmol)的中間物F125置於2ml的DMF/水10：1中處理，並加入0.8mg(6μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌20h，然後於減壓下濃縮及然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(EIpos)：m/z=868[M+H]+ .
實例158
S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將6mg(8μmol)的中間物F119置於3ml的DMF中處理，並加入1.8mg(15μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌6h及然後於RT下放置3天。然後將反應於減壓下濃縮，並以製備式HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+ .
實例159
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-D-丙胺醯基)-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，以2,5-二側氧吡咯啶-1-基-N-[(苯甲基氧基)羰基]-D-丙胺酸酯及N2-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸甲酯開始，使用經典的胜肽化學法製備N6-D-丙胺醯基-N2-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸甲酯。
就合成標題化合物，係將8.4mg(0.022mmol)的此中間物置於4ml的DMF中處理，並加入10mg(0.015mmol)的中間物C5和11mg的HATU及 13μl的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌5h後，將反應以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮後及於高真空下乾燥，將得到的中間物溶於4ml的甲醇，加入83μl的2M氫氧化鋰溶液並將混合物於RT攪拌至隔夜。另再加入167μl的氫氧化鋰溶液，及將混合物另再攪拌4h。然後以水稀釋混合物並以5%濃度檸檬酸調整至pH=5。濃縮後，將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到3.5mg(26%的理論值)Boc-保護的中間物。藉由以1ml的三氟乙酸於2ml的DCM中去保護，由此得到3mg(95%的理論值)的標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.76min； LC-MS(方法1)：Rt =0.75min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+ .
實例160
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2 -{N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫氫基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
將4mg(3μmol)的中間物F155置於2.5ml的DMF/水10：1中處理，並加入1.2mg(10μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌30min，然後於減壓下濃縮，以乙腈/水1：1處理及然後以製備式HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(EIpos)：m/z=1197[M+H]+ .
實例161
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，使用經典的胜肽化學法製備三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-N2 -[(苯甲基氧基)羰基]-L-麩醯胺酸苯甲基酯(1：1)。在HATU的存在下，然後將此中間物與中間物C58偶合。隨後，首先以氫解裂解苯甲基氧基羰基保護基及苯甲基酯，及然後使用氯化鋅移除2-(三甲基矽基)乙氧基羰基保護基。
LC-MS(方法6)：Rt =1.91min；MS(EIpos)：m/z=685[M+H]+ .
實例162
N6 -(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
起初，使用胜肽化學中已知的經典保護基操作，製備三氟乙酸/2-(三甲基矽基)乙基-N2-[(苯甲基氧基)羰基]-L-離胺酸酯(1：1)。在HATU的存在下，然後將此中間物與中間物C61偶合。隨後，先使用氯化鋅裂解2-(三甲基矽 基)乙氧基羰基保護基及2-(三甲基矽基)乙基酯。最後，藉由以氫解裂解苯甲基氧羰基保護基及以製備式HPLC純化，得到標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt =1.65min；
LC-MS(方法1)：Rt =0.76min；MS(EIpos)：m/z=713[M+H]+ .
實例163A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F163偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.02mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例163B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F163偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.76mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例163H
本處，將5.0mg的帕尼單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F163偶合。TCEP的還原時間為30min及用於ADC偶合的攪拌時間為2h。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.61mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例164A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.9mg/ml)用於與中間物F164偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.15mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例164B
本處，30mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F164偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：14.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例164E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F164偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.11mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例165A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.9mg/ml)用於與中間物F165偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例165B
本處，40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F165偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：12.02mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例165E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F165偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例166A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.3mg/ml)用於與中間物F166偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.0mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例166B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F166偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.76mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例166E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F166偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.01mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例167A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.9mg/ml)用於與中間物F167偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.05mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例167B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F167偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.76mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例167E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F167偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.9mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例168A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F168偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例168B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F168偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.33mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例168E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F168偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.89mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例168H
本處，將5.0mg的帕尼單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F168偶合。TCEP的還原時間為4h及ADC偶合的攪拌時間為20h。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.76mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例169A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.9mg/ml)用於與中間物F169偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例169B
本處，將40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F169偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：11.2mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例169E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F169偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例170A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.9mg/ml)用於與中間物F170偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例170B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F170偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.72mg/ml
藥物/mAb比率：3.07
實例170E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F170偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例171A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F171偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例171B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=12.9mg/ml)用於與中間物F171偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.58mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例172A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F172偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.96mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例172B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F172偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.85mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例172E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F172偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例173A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F173偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.1mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例173B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F173偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：12.26mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例173E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F173偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.33mg/ml
藥物/mAb比率：3.9
實例174A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F174偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.18mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例174B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F174偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例174E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F174偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.03mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例175A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=16.9mg/ml)用於與中間物F175偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例175B
本處，將40mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F175偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。
蛋白濃度：9.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例175E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F175偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.97mg/ml
藥物/mAb比率：4.2
實例176A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.3mg/ml)用於與中間物F176偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例176B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F176偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例176E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F176偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.85mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例177A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.3mg/ml)用於與中間物F177偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.96mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例177B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F177偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.2mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例177E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F177偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例178A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.3mg/ml)用於與中間物F178偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例178B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F178偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.45mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例178E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F178偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例179A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F179偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.04mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例179B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F179偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.65mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例179E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F179偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.89mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例180A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=8.51mg/ml)用於與中間物F180偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.72mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例180B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F180偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.82mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例180E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F180偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.01mg/ml
藥物/mAb比率：4.7
實例181
N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺
起初將1.01g(2.84mmol)的(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺注入20ml的1,2-二氯乙烷中，並加入0.84g(3.98mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及2.56g(42.65mmol)的乙酸，及將混合物於RT攪拌5min。然後加入0.54g(3.13mmol)的(3-氧丙基)胺甲酸第三丁酯之5ml的1,2-二氯乙烷溶液，並將反應混合物攪拌至隔夜。然後將混合物蒸發至乾，將殘餘物置於乙酸乙酯中處理並過濾及將含產物的濾液蒸發至乾。
將51.26mg的殘餘物溶於0.8ml的1,2-二氯甲烷並加到7.85mg(0.1mmol)的乙醯氯中於深的96-孔多滴定盤上然後加入25.8mg(0.2mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺及將混合物RT震盪至隔夜。然後使用離心乾燥器完全移除溶劑，加入0.4ml的1,2-二氯乙烷及0.4ml的三氟乙酸並將混合物震盪至隔夜。然後使用離心乾燥器完全移除溶劑，並將0.8ml的DMF加到殘餘物中，然後將混合物過濾及由濾液以製備式LC-MS(方法9)分離目標化合物。將含產物的溶離份於減壓下使用離心乾燥器濃縮。將各產物溶離份的殘餘物溶於0.6ml的DMSO。將這些組合及最後以離心乾燥器移除溶劑。由此得到12.2mg(27%的理論值；純度100%)的標題化合物。
LC-MS(方法10)：Rt =0.95min；MS(ESIpos)：m/z=455[M+H]+
表XA中所示的示例化合物係類似實例181所製備：
實例186
N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙醯胺
起初將1.0g(2.82mmol)的(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺注入20ml的1,2-二氯乙烷中，並加入1.4g(3.95mmol)的三乙氧基硼氫化鈉及2.54g(42.32mmol)的乙酸，及將混合物於RT攪拌5min。然後加入0.54g(3.10mmol)的(3-氧丙基)胺甲酸第三丁酯之5ml的1,2-二氯乙烷溶液，並將反應混合物攪拌至隔夜。然後將混合物蒸發至乾，將殘餘物置於中處理乙酸乙酯並過濾及將含產物的溶離份蒸發至乾。
將51.16mg的殘餘物溶於0.8ml的1,2-二氯甲烷及加到14.65mg(0.1mmol)的3,3,3-三氟丙醯基於深的96-孔多滴定盤上然後加入25.8mg(0.2mmol)的N ,N -二異丙基乙基胺並將混合物於RT震盪至隔夜。然後使用離心乾燥器完全移除溶劑，加入0.4ml的1,2-二氯乙烷及0.4ml的三氟乙酸並將混合物震盪至隔夜。然後使用離心乾燥器完全移除溶劑，並將0.8ml的DMF加到殘餘物中。然後將混合物過濾及由濾液以製備式LC-MS(方法9)分離目標化合物。將含產物的溶離份使用離心乾燥器於減壓下濃縮。將各溶離份的殘餘物溶於0.6ml的DMSO。將這些組合及最後以離心乾燥器移除溶劑。由此得到1.0mg(2%的理論值；純度82%)的標題化合物。
LC-MS(方法10)：Rt =1.01minMS(ESIpos)：m/z=522[M+H]+
表XA1中所示的示例化合物係類似實例186所製備：
實例192A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.3mg/ml)用於與中間物F192偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1,968mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例192B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F192偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例192E
本處，將5mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F192偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.04mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例193A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.1mg/ml)用於與中間物F193偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.98mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例193B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F193偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.03mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例193E
本處，將5mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F193偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.61mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例194A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.1mg/ml)用於與中間物F194偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.67mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例194B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F194偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：0.99mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例194E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F194偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.39mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例195A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.1mg/ml)用於與中間物F195偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.79mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例195B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F195偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.53mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例195E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F195偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例196A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.1mg/ml)用於與中間物F196偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.85mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例196B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F196偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.73mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例196E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F196偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例197
(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸鹽酸鹽(1：1)
將150mg(0.2mmol)的中間物C53溶於15ml的DMF及2.29g(20.39mmol)的DABCO。將反應以超音波浴處理30min。藉由添加1.17ml的乙酸，然後將反應調整至pH 3-4，並將混合物於減壓下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化及將適當的溶離份於RT減壓下濃縮。將殘餘物置於乙腈/水1：1中處理，加入5ml的4N鹽酸及然後將混合物凍乾。由此得到81 mg(68%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt =2.69min；MS(EIpos)：m/z=514[M+H]+ .
實例198
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯胺(1：1)
將15mg(0.018mmol)的中間物C64溶於4ml的2,2,2-三氟乙醇。加入15ml(0.110mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌2h。然後加入32mg(0.110mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並將反應於減壓下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到9.5mg(77%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.68min；MS(ESIpos)：m/z=556(M+H)+ .
實例199
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)及4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)
LC-MS(方法1)：Rt =0.80min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+ .
首先，將L-半胱胺酸以1-({[2-(三甲基矽基)乙6氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮於DMF中在N,N-二異丙基乙基胺的存在下轉變成N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將406mg(1.53mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶於10ml的DMF，加入157.5mg(1.606mmol)的馬來酸酐並將反應於RT攪拌1小時。將7.5mg(0.01mmol)的中間物C66加到130μl的此溶液，並將反應於RT攪拌5min。然後將混合物於減壓下濃縮，並將殘餘物以製備式HPLC純化。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到10mg(89%)的保護中間物；以HPLC或以LC-MS不能分離此區域異構物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.38min；MS(EIpos)：m/z=1120[M+H]+ .
在最後的步驟，將10mg的此中間物溶於2ml的2,2,2-三氟乙醇。加入12ml(0.088mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌30min。然後加入26mg(0.088mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到8.3mg(99%的理論值)的標題化合物為87：13比率之區域異構物混合物。
LC-MS(方法5)：Rt =2.3min及2.43min；MS(ESIpos)：m/z=832(M+H)+ .
1 H NMR主要異構物：(500MHz,DMSO-d6 )：δ=8.7(m,1H),8.5(m,2H),8.1(m,1H),7.6(m,1H),7.5(s,1H)7.4-7.15(m,6H),6.9-7.0(m,1H),6.85(s,1H),5.61(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.26及4.06(2d,2H),3.5-3.8(m,5H),3.0-3.4(m, 5H),2.75-3.0(m,3H),2.58及2.57(dd,1H),0.77及1,5(2m,2H),0.81(s,9H)。
另一種選擇，區域異構性標題化合物係如下所製備：
就此，先將L-半胱胺酸以1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮於DMF中在N,N-二異丙基乙基胺的存在下轉變成N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將55mg(0.068mmol)的中間物F104及36mg(0.136mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶於15ml的DMF中，並將混合物於RT攪拌20h。然後將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合並於減壓下蒸發溶劑，及然後將殘餘物溶於15ml的THF/水1：1。加入131μl的2M氫氧化鋰水溶液並將反應於RT攪拌1h。然後以1M鹽酸中和反應，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到37mg(50%的理論值)的區域異構性保護的中間物為無色泡沫。
LC-MS(方法5)：Rt =3.33min及3.36min；MS(ESIpos)：m/z=976(M+H)+ .
在最後的步驟，將25mg的此中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入2.5ml(0.092mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌4h。然後加入27mg(0.092mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到18.5mg(85%的理論值)的標題化合物為21：79比率之區域異構物混合物。
LC-MS(方法5)：Rt =2.37min及3.44min；MS(ESIpos)：m/z=832(M+H)+ .
此標題化合物之個別區域異構物的目標性製備係如下進行：
實例199-2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)
首先，將L-半胱胺酸甲酯以1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡 咯啶-2,5-二酮於DMF中在N,N-二異丙基乙基胺的存在下轉變成N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯。
將53mg(0.251mmol)的市售3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸及70mg(0.251mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯溶於5ml的DMF中，並加入碳酸氫鈉水溶液同時監測pH。於RT攪拌15min後，以乙酸將混合物調整至pH=4.3並將反應濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合及於減壓下蒸發溶劑，得到72mg(70%的理論值)的4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=410(M+H)+ .
將此中間物，在HATU的存在下，與中間物C66偶合及然後如上所述先以氫氧化鋰之甲醇溶液及然後以氯化鋅完全去保護。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到2mg的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.78min；MS(ESIpos)：m/z=832(M+H)+ .
異構物1可以類似方式來製備。
實例200
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
將10mg(0.014mmol)的中間物C61溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入 11ml(0.082mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌30min。然後加入24mg(0.082mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到4.2mg(40%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.79min；MS(ESIpos)：m/z=585(M+H)+ .
實例201
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-絲胺酸/三氟乙酸(1：1)
將20mg(0.03mmol)的中間物C58及8.5mg(0.037mmol)的L-絲胺酸苯甲基酯鹽酸鹽(1：1)置於5ml的DMF中處理，並加入17mg(0.046mmol)的HATU及21μl的N ,N -二異丙基乙基胺。於RT攪拌10分鐘後，將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到12.5mg(49%的理論值)的中間物。LC-MS(方法1)：Rt =1.42min；MS(ESIpos)：m/z=835(M+H)+ .
將12.5mg(0.015mmol)的此中間物溶於10ml的乙醇，加入鈀碳(10%)及將混合物於RT以氫氣於標準壓力下氫化30min。將催化劑濾出及於減壓下蒸發溶劑，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到7.5mg(67%的理論值)的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.28min；MS(ESIpos)：m/z=745(M+H)+ .
將7.5mg(0.01mmol)的此中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入8ml(0.06mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌4.5h。然後加入17.7mg(0.06 mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到4.2mg(58%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.75min；MS(ESIpos)：m/z=601(M+H)+ .
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
實例202
標題化合物係類似實例201由中間物C58及L-丙胺酸苯甲基酯鹽酸鹽(1：1)所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=585(M+H)+ .
實例203
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}甘胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係類似實例201由中間物C58及甘胺酸苯甲基酯鹽酸鹽(1： 1)所製備。
LC-MS(方法1)：Rt =0.82min；MS(ESIpos)：m/z=571(M+H)+ .
實例204A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.1mg/ml)用於與中間物F204偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.88mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例204B
本處，將50mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F204偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：12.66mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例204E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F204偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.65mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例205A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.1mg/ml)用於與中間物F205偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例205B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F205偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.96mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例205E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F205偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例206A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.1mg/ml)用於與中間物F206偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.73mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例206B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F206偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.21mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例206E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F206偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例207A
本處，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F207偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.79mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例207B
本處，50mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F207偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮，以PBS再稀釋並再次濃縮。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。就此ADC製備物，在此合成後立刻測定有19%比例的開環琥珀醯胺形式。
蛋白濃度：12.99mg/ml
藥物/mAb比率：4.3
實例207E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.5mg/ml)用於與中間物F207偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.39mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例207I
本處，將5.0mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=13.1mg/ml)用於與中間物F207偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例207H
本處，將5.0mg的帕尼單抗之PBS溶液(c=13.6mg/ml)用於與中間物F207.TCEP的還原時間為4h及用於ADC偶合的攪拌時間為20h。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.0mg/ml
藥物/mAb比率：1.9
實例208A
於氬氣下，將0.344mg的TCEP之100μl的PBS緩衝劑溶液加到60mg的西妥昔單抗之5494μl的PBS溶液中(c=10.92mg/ml)。將反應於RT攪拌 30min，及然後加入溶於600μl的DMSO之2.582mg(0.003mmol)的中間物F104。120min於RT另再攪拌後，將反應以1306μl的PBS緩衝劑稀釋，其事先已調整至pH 8。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。以PBS緩衝劑pH 8稀釋溶離液至總體積14ml。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：13.36mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
就此ADC製備物，經測定有94%比例的開環琥珀醯胺形式。
實例208B
於氬氣下，將60mg的抗-TWEAKR AK-1之3225μl的PBS溶液(c=18.6mg/ml)以775μl的PBS緩衝劑稀釋及然後加入0.344mg的TCEP之100μl的PBS緩衝劑溶液。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於600μl的DMSO之2.582mg(0.003mmol)的中間物F104。於RT另再攪拌120min後，將反應以事先已調整至pH 8之300μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。以PBS緩衝劑pH 8稀釋溶離液至總體積14ml。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：14.95mg/ml
藥物/mAb比率：3.2
實例208I
於氬氣下，將0.344mg的TCEP之100μl的PBS緩衝劑溶液加到60mg 的尼妥珠單抗之4587μl的PBS(c=13.1mg/ml)溶液中。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於600μl的DMSO之2.582mg(0.003mmol)的中間物F104。於RT另再攪拌120min後，將反應以事先已調整至pH 8的2213μl之PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。以PBS緩衝劑pH 8稀釋溶離液至總體積14ml。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：14.79mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
就此ADC製備物，經測定有91%比例的開環琥珀醯胺形式。
實例208K
於氬氣下，將0.23mg的TCEP之67μl的PBS緩衝劑溶液加到40mg的抗-TWEAKR AK-2之2759μl的PBS溶液(c=14.5mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於400μlDMSO之1.72mg(0.002mmol)的中間物F104。於RT另再攪拌120min後，將反應以事先已調整至pH 8之1774μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。以PBS緩衝劑pH 8稀釋溶離液至總體積14ml。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：11.66mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例209A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.32mg/ml)用於與中間物F209偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.75mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例209B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.60mg/ml)用於與中間物F209偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.30mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例209E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F209偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.03mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例209H
本處，將5.0mg的帕尼單抗抗體之PBS溶液(c=70.5mg/ml)用於與中間物F209偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：1.5
實例209I
本處，將5.0mg的尼妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.1mg/ml)用於與中間物F209偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.81mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例210A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.32mg/ml)用於與中間物F210偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例210B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.60mg/ml) 用於與中間物F210偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.41mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例210E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F210偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.79mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例211A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=12.33mg/ml)用於與中間物F211偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.82mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例211B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=34.42mg/ml)用於與中間物F211偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並 再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.52mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例211E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F211偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例212A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=11.3mg/ml)用於與中間物F212偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例212B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml) 用於與中間物F212偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：0.85mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例212E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F212偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.55mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例213A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=21.32mg/ml)用於與中間物F213偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例213B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F213偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並 再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.4mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例213E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F213偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例214A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.21mg/ml)用於與中間物F214偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.00mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例214B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F214偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.01mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例214E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F214偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例215A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.21mg/ml)用於與中間物F215偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.99mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例215B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F215偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.64mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例215E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F215偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例215H
本處，將5.0mg的帕尼單抗抗體之PBS溶液(c=70.5mg/ml)用於與中間物F215偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯膠連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：1.4
實例215I
本處，將5.0mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=13.1mg/ml)用於與中間物F215偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例216A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.21mg/ml)用於與中間物F216偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.97mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例216B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F216偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.94mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例216E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F216偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.90mg/ml
藥物/mAb比率：1.7
實例217A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.21mg/ml)用於與中間物F217偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.05mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例217B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F217偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.44mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例217E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F217偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.85mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例218A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=15.21mg/ml)用於與中間物F218偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.05mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例218B
本處，將5.0mg的抗-TWEAKR AK-1抗體之PBS溶液(c=18.6mg/ml)用於與中間物F218偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.95mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例218E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F218偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例218H
本處，將5.0mg的帕尼單抗抗體之PBS溶液(c=20mg/ml)用於與中間物F218.以還原的時間TCEP增加至4h及用於ADC偶合的攪拌時間增加至20h。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.33mg/ml
藥物/mAb比率：0.8
實例218I
本處，將5.0mg的尼妥珠單抗抗體之PBS溶液(c=13.8mg/ml)用於與中間物F218偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮並再稀釋。某些ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.48mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例219
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲醯胺(1：1)
起初將70.0mg(0.09mmol)的9H-茀-9-基甲基-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(中間物C67)注入3.0ml的二氯甲烷，並加入31.3mg(0.31mmol)的三乙胺及31.8mg(0.21mmol)的4-甲基苯甲醯氯。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到33.4mg(48%的理論值)的化合物9H-茀-9-基甲基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-甲基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯。
LC-MS(方法2)：Rt =11.91min；MS(ESIpos)：m/z=774(M+Na)+ .
將33.0mg(0.04mmol)的9H-茀-9-基甲基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-甲基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯於1.0ml的DMF中與20.0mg(0.23mmol)的嗎福啉攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高 真空下乾燥。由此得到9.6mg(34%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =1.01min；MS(ESIpos)：m/z=530(M+H)+ .
實例220
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲醯胺(1：1)
起初將50.0mg(0.07mmol)的9H-茀-9-基甲基-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(中間物C67)注入2.0ml的二氯甲烷中，並加入22.3mg(0.22mmol)的三乙胺及27.5mg(0.15mmol)的4-(甲基硫烷基)苯甲醯氯。將反應混合物於40℃攪拌4h，另再加入10.2mg(0.10mmol)的三乙胺及27.5mg(0.15mmol)的4-(甲基硫烷基)苯甲醯氯並將混合物於RT攪拌至隔夜。然後另再加入14.9mg(0.15mmol)的三乙胺及27.5mg(0.15mmol)的4-(甲基硫烷基)苯甲醯氯，並將混合物於40℃攪拌2h。將混合物以乙酸乙酯稀釋並將有機層以水清洗三次及以飽和的NaCl溶液清洗一次。將有機層以硫酸鎂乾燥及於減壓下濃縮。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到39.8mg(76%的理論值)的化合物9H-茀-9-基甲基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[4-(甲基硫烷基)苯甲醯基] 胺基)丙基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.59min；MS(ESIpos)：m/z=785(M+H)+ .
將18.0mg(0.02mmol)的9H-茀-9-基甲基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[4-(甲基硫烷基)苯甲醯基]胺基)丙基]胺甲酸酯於1.0ml的DMF中與10.0mg(0.12mmol)的嗎福啉攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到6.2mg(40%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.99min；MS(ESIpos)：m/z=562(M+H)+ .
實例221
三氟乙酸/(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺(1：1)
起初將40.0mg(0.06mmol)的9H-茀-9-基甲基-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(中間物C67)注入2.0ml的二氯甲烷中，並加入9.6mg(0.10mmol)的三乙胺及14.3mg(0.10mmol)的(2S)-1-氯-1-氧丙-2-基乙酸酯。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到39.7mg(84%的理論值)的化合物 (2S)-1-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙基)胺基]-1-氧丙-2-基乙酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.51min；MS(ESIpos)：m/z=748(M+H)+ .
將37.0mg(0.05mmol)的(2S)-1-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙基)胺基]-1-氧丙-2-基乙酸酯於1.0ml的DMF中與0.1ml的嗎福啉及3滴的水於50℃攪拌10h。另再加入0.1ml的嗎福啉及0.1ml的水，並將混合物於50℃攪拌10h。加入20.5mg(0.15mmol)的碳酸鉀及於RT攪拌72h後，加入0.1ml的1N NaOH溶液並將混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到20.5mg(69%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.89min；MS(ESIpos)：m/z=484(M+H)+ .
實例222
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙醯胺(1：1)
起初將70.0mg(0.11mmol)的2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸(中間物C 70)注入3.0ml的DMF中。加入15.5mg(0.22mmol)的甲硫醇鈉，並將反應混合物於50℃攪拌2h。將反應混合物直接以製備式 RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到60.0mg(84%的理論值)的化合物2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(甲基硫烷基)乙醯基]胺基)丙基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.50min；MS(ESIpos)：m/z=644(M+H)+ .
將40.0mg(0.06mol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(甲基硫烷基)乙醯基]胺基)丙基]胺甲酸溶於2.0ml的三氟乙醇，並加入21.2mg(0.16mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。加入45.4mg(0.01mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1% TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到34.6mg(91%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=500(M+H)+ .
實例223
三氟乙酸/(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺(1：1)
將40.0mg(0.08mmol)的[3-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡 唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯溶於2.0ml的二氯甲烷，並加入19.7mg(0.20mmol)的三乙胺及29.4mg(0.20mmol)的(2S)-1-氯-1-氧丙-2-基乙酸酯。將反應混合物攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到21.2mg(43%的理論值)的化合物2S)-1-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-1-氧丙-2-基乙酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.46min；MS(ESIpos)：m/z=627(M+H)+ .
將21.2mg(0.03mmol)的(2S)-1-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(第三丁氧基羰基)胺基]丙基}胺基)-1-氧丙-2-基乙酸酯溶於1.0ml的二氯甲烷，加入77.1mg(0.68mmol)的三氟乙酸並將混合物於RT攪拌2h。另再加入77.1mg(0.68mmol)的三氟乙酸二次，且每次將混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物重複與二氯甲烷共蒸餾及然後於高真空下乾燥。將殘餘物，包括三氟乙酸/(2S)-1-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-1-氧丙-2-基乙酸酯(1：1)物質，無進一步純化進一步反應。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=527(M+H)+ .
將26.5mg(0.04mmol)的三氟乙酸/(2S)-1-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-1-氧丙-2-基乙酸酯(1：1)溶於THF/甲醇/水(1.0ml/1.0ml/0.05ml)，並加入17.2mg的碳酸鉀。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1% TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到17.3mg(70%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=485(M+H)+ .
實例224
三氟乙酸/4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-氧代丁酸甲酯(1：1)
將60.0mg(0.11mmol)的2-(三甲基矽基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(參見合成中間物C11)溶於1.0ml的二氯甲烷，並加入19.6mg(0.25mmol)的吡啶及35.8mg(0.24mmol)的4-氯-4-氧代丁酸甲酯。將反應混合物40℃攪拌至隔夜。另再加入19.6mg(0.25mmol)的吡啶及35.8mg(0.24mmol)的4-氯-4-氧代丁酸甲酯並將混合物於40℃攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到16.1mg(22%的理論值)的化合物11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十五烷-15-酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.52min；MS(ESIpos)：m/z=670(M+H)+ .
將16.1mg(0.02mmol)的11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十 五烷-15-酸甲酯溶於1.0ml的三氟乙醇中，並加入16.4mg(0.12mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌5h。加入35.1mg(0.12mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1%TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到11.1mg(72%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=526(M+H)+ .
實例225
4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)
起初將9.7mg(0.02mmol)的三氟乙酸/4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-氧代丁酸甲酯(1：1)(實例224)注入THF/甲醇/水(1.0ml/0.2ml/0.04ml)中，並加入1.3mg(0.03mmol)的氫氧化鋰單水合物。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。另再加入1.3mg(0.03mmol)的氫氧化鋰單水合物，並將混合物於RT攪拌至隔夜。加入3.6mg(0.06mmol)的HOAc並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到5.4 mg(57%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.90min；MS(ESIpos)：m/z=512(M+H)+ .
實例226
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基]-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-3,19-二氮雜二十二烷-1-酸/三氟乙酸(1：2)
起初將10.3mg(mmol)的R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物F209)注入DMF/水(2.0ml/0.2ml)中，並加入L-半胱胺酸及將混合物於RT攪拌10min。加入水並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到10.3mg(82%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.84min；MS(ESIpos)：m/z=1092(M+H)+ .
實例227
三氟乙酸/4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺(2：1)
起初將50.0mg(0.10mol)的[3-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯(中間物C68)注入二氯甲烷中，並加入54.9mg(0.22mmol)的[4-(氯羰基)苯基]胺甲酸第三丁酯(中間物L71)和22.7mg(0.22mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及另再加入54.9mg(0.22mmol)的[4-(氯羰基)苯基]胺甲酸第三丁酯(中間物L71)和22.7mg(0.22mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到26.2mg(37%的理論值)的化合物。
[3-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(第三丁氧基羰基)胺基]苯甲醯基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯
LC-MS(方法1)：Rt =5.34min；MS(ESIpos)：m/z=732(M+H)+ .
將26.2mg(0.04mmol)的[3-({(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(第三丁氧基羰基)胺基]苯甲醯基}胺基)丙基]胺甲酸第三丁酯溶於2.0ml的二氯甲烷，並加入204.1mg(1.79mmol)的TFA。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到3.4mg(13%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.92min；MS(ESIpos)：m/z=532(M+H)+ .
實例228
N-乙醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將50.0mg(0.08mol)的2-(三甲基矽基)乙基-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯(中間物C70)懸浮於0.30ml的水及66.43mg的碳酸氫鈉。將144.47(0.95mmol)的1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一-7-烯及51.62mg(0.32mmol)的N-乙醯基-L-半胱胺酸之3.0ml的異丙醇溶液加到懸浮液中。將反應混合物於50℃攪拌2.5h。加入水(0.1%TFA)並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到55.2mg(92%的理論值)的化合物N-乙醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.41min；MS(ESIpos)：m/z=759(M+H)+ .
將53.1mg(69.96μmol)的N-乙醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶於5.0ml的三氟乙醇，並加入57.2mg(419.76μmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌4h。加入122.67mg(0.42mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min 及然後加入水(0.1%TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。由此得到32.5mg(64%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.90min；MS(ESIpos)：m/z=615(M+H)+ .
實例229
N-乙醯基-S-[2-([3-(L-丙胺醯基胺基)丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-側氧乙基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將30.3mg(41.58μmol)的N-乙醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(實例228)溶於1.5ml的DMF中，並加入8.4mg(83.15μmol)的4-甲基嗎福啉及14.65mg(45.73μmol)的2,5-二側氧吡咯啶-1-基-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺酸酯。將反應混合物於RT攪拌至隔夜，及然後另再加入8.4mg(83.15μmol)的4-甲基嗎福啉。再次將反應混合物於RT攪拌至隔夜。加入10.0mg(0.17mmol)的乙酸並將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到31.2mg(92%的理論值)的化合物N-乙醯基-S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧乙基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt =1.22min；MS(ESIpos)：m/z=820(M+H)+ .
將28.6mg(0.04mmol)的N-乙醯基-S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧乙基]-L-半胱胺酸溶於5.0ml的乙醇，並加入2.9mg的鈀活性碳(10%)。將反應混合物於標準壓下及RT氫化至隔夜。將混合物經由矽藻土過濾並以乙醇混合物清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物凍乾。由此得到17.4mg(62%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=686(M+H)+ .
實例230
三氟乙酸/(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氫呋喃-2-甲醯胺(1：1)
將100.0mg(0.16mmol)的9H-茀-9-基甲基-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(中間物C67)溶於含71.9mg(0.71mmol)三乙胺之5.0ml的二氯甲烷並逐滴加到新鮮製備的(2S)-四氫呋喃-2-羰基氯溶液中(製備：起初將54.7mg(0.39mmol)的(2S)-四氫呋喃-2-羧酸注入0.7ml的甲苯中，加入0.04ml的亞硫醯氯並將混合物於90℃攪拌1h。冷卻後，將此粗反應溶液進一步反應)。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到44.3mg(38%的理論 值)的化合物9H-茀-9-基甲基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-四氫呋喃-2-基羰基]胺基)丙基]胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.52min；MS(ESIpos)：m/z=776(M+HCOOH-H)- .
將26.0mg(0.04mmol)的9H-茀-9-基甲基[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-四氫呋喃-2-基羰基]胺基)丙基]胺甲酸酯溶於2.6ml的DMF中，並加入0.26ml的嗎福啉。將反應混合物於RT攪拌3h。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。由此得到11.7mg(53%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=510(M+H)+ .
實例231
3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)丙酸/三氟乙酸(1：1)
將53.9mg(0.08mmol)的11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮-2-矽十七烷-17-酸(中間物C69)溶於4.0ml的三氟乙醇中，並加入31.4mg(0.23mmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌至隔夜。加入67.3mg(0.23mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1%TFA)。以製備式RP-HPLC直接進行純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。由此得到34.2mg(66%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.91min；MS(ESIpos)：m/z=558(M+H)+ .
實例232
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸/三氟乙酸(1：2)
將40.0mg(47.3μmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧-5-氧雜-7,11-二氮-2-矽十三烷-13-基)高半胱胺酸(中間物C11)溶於3.0ml的三氟乙醇，並加入38.7mg(0.28μmol)的二氯化鋅。將反應混合物於50℃攪拌6h。加入83mg(0.28mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，將反應混合物攪拌10min及然後加入水(0.1%TFA)。直接進行純化以製備式RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。由此得到32.4mg(84%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.81min；MS(ESIpos)：m/z=587(M+H)+ .
實例233
三氟乙酸/4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺(2：1)
將73.0mg(0.12mmol)的9H-茀-9-基甲基-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺甲酸酯(中間物C67)和27.8mg(0.15mmol)的4-硝基苯甲醯氯溶於2.0ml的二氯甲烷，並加入15.2mg(0.15mmol)的三乙胺。將反應混合物於RT攪拌至隔夜。再次加入相同量的4-硝基苯甲醯氯及三乙胺，並將反應混合物於RT攪拌至隔夜。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。由此得到39.3mg(44%的理論值)的化合物9H-茀-9-基甲基{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt =1.54min；MS(ESIpos)：m/z=783(M+H)+ .
將39.3mg(0.05mmol)的茀-9-基甲基-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲醯基)胺基]丙基}胺甲酸溶於2.0ml的乙醇，加入3.9mg的氫氧化鈀活性碳(20%)並將混合物於標準壓力下氫化至隔夜。將反應混合物經由濾紙過濾及以乙醇清洗濾餅。於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到32.9mg(86%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.93min；MS(ESIpos)：m/z=531(M+H)+ .
實例234A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於50μl的DMSO之0.2mg(0.00027mmol)的中間物F85。於RT另再攪拌90min後，將反應以事先已調整至pH 8之1900μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.68mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例234B
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的抗-TWEAKR AK-1之269μl的PBS溶液(c=18.6mg/ml)。將反應於RT攪拌30min及然後加入溶於50μlDMSO之0.2mg(0.00027mmol)的中間物F85。於RT另再攪拌90min後，將反應以事先已調整至pH 8之2130μl 的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.57mg/ml
藥物/mAb比率：3.7
實例234I
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的尼妥珠單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min及然後加入溶於50μl的DMSO之0.2mg(0.00027mmol)的中間物F85。於RT另再攪拌90min後，將反應以事先已調整至pH 8之1900μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.93mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例234H
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的帕尼單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌4h，及然後加入溶於50μl的DMSO之0.2mg(0.00027mmol)的中間物F85。於RT另再攪拌120min後，將反應以事先已調整至pH 8之1900μl的PBS緩 衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：2.12mg/ml
藥物/mAb比率：1.4
實例235A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之329μl的PBS溶液中(c=15.2mg/ml)，及然後將混合物以事先已調整至pH 8之2021μl的PBS緩衝劑稀釋。將反應於RT攪拌1h，及然後加入溶於50μl的DMSO之0.28mg的中間物F235。於RT另再攪拌90min後，然後將反應施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.5mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例235B
類似實例235A，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之269μl的PBS溶液(c=18.6mg/ml)以PBS緩衝劑pH 8稀釋至濃度2mg/ml並與中間物F235偶合。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：0.56mg/ml
藥物/mAb比率：1.0
實例235E
類似實例235A，將5mg的曲妥珠單抗之370μl的PBS溶液(c=14.5mg/ml)以PBS緩衝劑pH 8稀釋至濃度2mg/ml並與中間物F235偶合。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.67mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例235I
類似實例235A，將5mg的尼妥珠單抗之382μl的PBS溶液(c=13.08mg/ml)以PBS緩衝劑pH 8稀釋至濃度2mg/ml並與中間物F235偶合。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.81mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例235H
類似實例235A，將5mg的帕尼單抗之74μl的PBS溶液(c=67.4mg/ml)以PBS緩衝劑pH 8稀釋至濃度2mg/ml並與中間物F235偶合。某些以此 方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.14mg/ml
藥物/mAb比率：0.9
實例236A
類似實例234A，將5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與中間物F236偶合。於這些條件下，某些ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.85mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例236B
類似實例234A，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與中間物F236偶合。於這些條件下，某些ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.67mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例236E
類似實例234A，將5mg的曲妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與中間物F236偶合。於這些條件下，某些ADC亦可能以開環形式 存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.67mg/ml
藥物/mAb比率：3.9
實例237A
於氬氣下，將0.344mg的TCEP之100μl的PBS緩衝劑溶液加到60mg西妥昔單抗之4000μl的PBS溶液中(c=15mg/ml)。將反應於RT攪拌1h，及然後加入溶於600μl的DMSO之3.04mg(0.003mmol)的中間物F104。於RT另再攪拌90min後，將反應以事先已調整至pH 8之PBS緩衝劑稀釋至15ml。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。於這些條件下，某些ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：13.78mg/ml
藥物/mAb比率：4.8
實例237B
於氬氣下，將0.287mg的TCEP之500μl的PBS緩衝劑溶液加到50mg的抗-TWEAKR AK-1之2688μl的PBS溶液中(c=18.6mg/ml)，及然後將混合物以事先已調整至pH 8之8812μl的PBS緩衝劑稀釋。將反應於RT攪 拌1h，及然後加入溶於500μlDMSO之2,894mg(0.003mmol)的中間物F104。於RT另再攪拌90min後，然後將反應施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將此溶液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。於這些條件下，某些ADC亦可能以開環形式存在。就此批件，開環形式之比例係在合成後直接測定，為23%。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：11.1mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例237I
類似實例237A，將60mg的尼妥珠單抗之4587μl的PBS溶液(c=13.08mg/ml)與中間物F209偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：15.88mg/ml
藥物/mAb比率：4.0
實例238A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min， 及然後加入溶於50μl的DMSO之0.22mg(0.00027mmol)的中間物F238。於RT另再攪拌90min後，將反應以事先已調整至pH 8之1900μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.89mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例238B
類似實例238A，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與中間物F238偶合。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.66mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
於這些偶合條件下，26%的ADC係以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
實例238E
類似實例238A，將5mg的曲妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與中間物F238偶合。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例239A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之458μl的PBS溶液中(c=10.92mg/ml)。將反應以事先已調整至pH 8之1892μl的PBS緩衝劑稀釋並於RT攪拌1h。然後加入溶於100μlDMSO之0.19mg(0.00027mmol)的中間物F217。於RT另再攪拌90min後，將反應施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.86mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例239B
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的抗-TWEAKR AK-1之269μl的PBS溶液中(c=18.6mg/ml)。將反應以事先已調整至pH 8之2081μl的PBS緩衝劑稀釋並於RT攪拌1h。然後加入溶於100μlDMSO之0.19mg(0.00027mmol)的中間物F217。於RT另再攪拌90min後，將反應施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特 性係如下：
蛋白濃度：1.28mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例239I
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的尼妥珠單抗之382μl的PBS溶液中(c=13.1mg/ml)。將反應以事先已調整至pH 8之1968μl的PBS緩衝劑稀釋並於RT攪拌1h。然後加入溶於100μlDMSO之0.19mg(0.00027mmol)的中間物F217。於RT另再攪拌90min後，將反應施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.32mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
就此ADC製備物，開環琥珀醯胺形式經測定為89%之比例。
實例239H
於氬氣下，將0.048mg的TCEP之83μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的帕尼單抗之74μl的PBS溶液中(c=67.5mg/ml)。將反應以事先已調整至pH 8之2243μl的PBS緩衝劑稀釋並於RT攪拌4h。然後加入溶於100μlDMSO之0.19mg(0.00027mmol)的中間物F217。將反應於RT攪拌至隔夜。然後將溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.33mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例240A
於氬氣下，將0.29mg的TCEP之500μl的PBS緩衝劑溶液加到50mg的西妥昔單抗之4579μl的PBS溶液中(c=10.92mg/ml)。將反應以事先已調整至pH 8之7421μl的PBS緩衝劑稀釋並於RT攪拌1h。然後加入溶於500μlDMSO之1.4mg(0.0027mmol)的中間物F213。於RT另再攪拌90min後，將反應施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：15.63mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例240B
類似實例239A，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與中間物F213偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：0.9mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例240E
類似實例239A，將5mg的曲妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10 mg/ml)與中間物F213偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.4mg/ml
藥物/mAb比率：2.1
實例241A
於氬氣下，將0.172mg的TCEP之300μl的PBS緩衝劑溶液加到30mg的西妥昔單抗之3ml的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於330μlDMSO之1.36mg(1.6μmol)的中間物F241。於RT攪拌20h後，將反應以1.37ml的PBS緩衝劑稀釋及經由PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)使用PBS緩衝劑溶離。然後將溶離液以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：9.98mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例241B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F241偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心 濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.39mg/ml
藥物/mAb比率：3.9
實例241E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F241偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.83mg/ml
藥物/mAb比率：4.7
實例241I
本處，將5mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F241偶合。TCEP還原後，與抗體之偶合係以攪拌至隔夜來進行，接著進一步以Sephadex純化作後處理。在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.6mg/ml
藥物/mAb比率：4.0
實例242A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於50μlDMSO之0.22mg(0.00027mmol)的中間物F242。於RT另再攪拌90min後，將反應以事先已調整至pH 8之1900μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
實例242B
如實例242A中所述，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.22mg的中間物F242偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.54mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例242E
如實例242A中所述，將5mg的曲妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.22mg的中間物F242偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.76mg/ml
藥物/mAb比率：3.6
實例243A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於50μl的DMSO之0.23mg(0.00027mmol)的中間物F243。於RT另再攪拌90min後，將反應以事先已調整至pH 8之1900μl的PBS緩衝劑稀釋。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例243B
如實例243A中所述，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.23mg的中間物F243偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.63mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例243E
如實例243A中所述，將5mg的曲妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.23mg的中間物F243偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例243I
如實例243A中所述，將5mg的尼妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.23mg的中間物F243偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.87mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例244A
本處，將5.0mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=23.10mg/ml)用於與中間 物F244偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：2.12mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例244B
本處，將5.0mg的抗-TWEAK AK-1之PBS溶液(c=18.60mg/ml)用於與中間物F244偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.65mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例244E
本處，將5.0mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=13.50mg/ml)用於與中間物F244偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例244I
本處，將5.0mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=13.08mg/ml)用於與中間物F244偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。
蛋白濃度：1.91mg/ml
藥物/mAb比率：2.9
實例245A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於50μlDMSO之0.24mg(0.00027mmol)的中間物F245。於RT另再攪拌90min後，將反應以稀釋1900μl的PBS緩衝劑其事先已調整至pH 8。
然後將此溶液施用於經PBS緩衝劑pH 8平衡過的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)並以PBS緩衝劑pH 8溶離。將溶離液於RT氬氣下攪拌至隔夜及然後以超離心濃縮及以PBS緩衝劑(pH 7.2)再稀釋。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.69mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例245B
如實例245A中所述，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.24mg的中間物F245偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.51mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例245E
如實例245A中所述，將5mg的曲妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.24mg的中間物F245偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：3.5
實例245I
如實例245A中所述，將5mg的尼妥珠單抗之500μl的PBS溶液(c=10mg/ml)與0.24mg的中間物F245偶合。於這些條件下，某些的ADC亦可能以開環形式存在。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.65mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例246
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸及4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)
首先，將L-半胱胺酸以1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮於DMF中在N,N-二異丙基乙基胺的存在下轉變成N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將11mg(0.013mmol)的中間物F193及8mg(0.016mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶於3ml的DMF中，並將混合物於RT攪拌20h。然後將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合及於減壓下蒸發溶劑，及然後將殘餘物溶於2ml的THF/水1：1。加入19μl的2M氫氧化鋰水溶液並將反應於RT攪拌1h。然後另再加入19μl的2M氫氧化鋰水溶液並將反應於RT攪拌至隔夜。然後將混合物以1M鹽酸中和，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到4.1mg(38%的理論值)的區域異構性保護的中間物為無色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt =1.03min(broad)；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+ .
在最後的步驟，將4.1mg(0.004mmol)的此中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入3ml(0.022mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌1h。然後加入6mg(0.022mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml的0.1%濃度三氟乙酸，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到5mg(quant.)的標題化合物為20：80比率之區域異構物混合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.78min(broad)；MS(ESIpos)：m/z=876(M+H)+ .
LC-MS(方法5)：Rt =2.36min及2.39min；MS(ESIpos)：m/z=876(M+H)+ .
實例247A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min，及然後加入溶於50μlDMSO之0.264mg(0.27μmol)的中間物F247。於RT攪拌20h後，將反應以1.9ml的PBS緩衝劑稀釋及經由PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)使用PBS緩衝劑溶離。然後將溶離液以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.66mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例247B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F247偶合並如實例247A中所述進行後處理。
蛋白濃度：1.49mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例247E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物 F247偶合並如實例247A中所述進行後處理。
蛋白濃度：1.67mg/ml
藥物/mAb比率：2.3
實例247I
本處，將5mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F247偶合並如實例247A中所述進行後處理。
蛋白濃度：1.62mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例248A
本處，類似實例5A，將5mg的西妥昔單抗之PBS溶液(c=10.92mg/ml)用於與中間物F248偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：2.06mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例248B
本處，類似實例5B,5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=18.6 mg/ml)用於與中間物F248偶合，並在Sephadex純化後，將反應以超離心濃縮及以PBS再稀釋。某些以此方式所製備的ADC亦可能以水解開鏈的琥珀醯胺連接抗體之形式存在。
蛋白濃度：1.84mg/ml
藥物/mAb比率：4.1
實例249
S-{1-[6-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)己基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將11mg(14μmol)的中間物F179置於2.2ml的DMF中處理，並加入3.3mg(27μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌3h及然後於減壓下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到7.3mg(58%的理論值)的標題化合物為無色泡沫。
LC-MS(方法4)：Rt =1.04min；MS(EIpos)：m/z=813[M+H]+ .
實例250
4-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)及4-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)
將10mg(0.013mmol)的中間物F85及5.3mg(0.02mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶於3ml的DMF，並將混合物於RT攪拌3天。然後將混合物濃縮並將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合及於減壓下蒸發溶劑，及然後將殘餘物溶於2ml的THF/水1：1。加入9μl的2M氫氧化鋰水溶液並將反應於RT攪拌1h。然後以1M鹽酸將反應調整至~3之pH，於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物以製備式HPLC純化。由此得到3mg(24%的理論值於二個步驟)的區域異構性保護的中間物為無色泡沫。
LC-MS(方法5)：Rt =3.39min及3.43min；MS(ESIpos)：m/z=919(M+H)+ .
在最後的步驟，將3mg(0.0033mmol)的此中間物溶於3ml的2,2,2-三氟乙醇。加入2.2ml(0.016mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌3.5h。然後加入4.8mg(0.016mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到1mg(33%的理論值)的標題化合物為43：34比率之區域異構物混合物。此異構物混合物係包括23%的另一種異構物(RT=2.51)。
LC-MS(方法5)：Rt =2.57min及2.62min；MS(ESIpos)：m/z=775(M+H)+ .
實例251
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙氧基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將3mg(4μmol)的中間物F248置於2ml的DMF中處理，並加入0.9mg(8μmol)的L-半胱胺酸。將反應混合物於RT攪拌18h及然後於減壓下濃縮。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮，將殘餘物以乙腈/水凍乾後，得到1.1mg(32%的理論值)的標題化合物為白色固體。
LC-MS(方法1)：Rt =0.78min；MS(EIpos)：m/z=801[M+H]+ .
實例252
(3R,7S)-7-胺基-17-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-羥乙醯基-2,2-二甲基-8,16-二側氧-12-氧雜-4,9,15-三氮雜十九烷-19-酸/三氟乙酸(1：1)及(3R,7S)-7-胺基-18-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-羥乙醯基-2,2-二甲基-8,16-二側氧-12-氧雜-4,9,15-三氮雜十九烷-19-酸/三氟乙酸(1：1)
將8mg(0.010mmol)的中間物F248之保護中間物及5.1mg(0.02mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶於3ml的DMF中，並將混合物於RT攪拌18h及然後以超音波浴處理2h。然後將混合物濃縮並將 殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份組合及於減壓下蒸發溶劑，及然後將殘餘物溶於2ml的THF/水1：1。加入15μl的2M氫氧化鋰水溶液並將反應於RT攪拌15min。然後以1M鹽酸將反應調整至~3之pH，以20ml的氯化鈉溶液稀釋及以20ml的乙酸乙酯萃取。將有機層以硫酸鎂乾燥並濃縮，並將殘餘物以乙腈/水冷凍乾燥。由此得到8.4mg(78%的理論值於二個步驟)的區域異構性保護的中間物為無色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt =1.44min及3.43min；MS(ESIpos)：m/z=1107(M+H)+ .
在最後的步驟，將8mg(0.007mmol)的此中間物溶於5ml的2,2,2-三氟乙醇。加入9.8ml(0.072mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌1.5h。然後加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，及於減壓下蒸發溶劑。將殘餘物以製備式HPLC純化。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到4mg(59%的理論值)的標題化合物為31：67比率之區域異構物混合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.79min及0.81min；MS(ESIpos)：m/z=819(M+H)+ .
實例253
4-({2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}胺基)-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)及4-({2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}胺基)-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1：1)
此異構性標題化合物係類似實例250由中間物F84及N-{[2-(三甲基矽 基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸所製備。
實例254A
於氬氣下，將0.029mg的TCEP之50μl的PBS緩衝劑溶液加到5mg的西妥昔單抗之500μl的PBS溶液中(c=10mg/ml)。將反應於RT攪拌30min及然後加入溶於50μlDMSO之0.264mg(0.27μmol)的中間物F254。於RT攪拌20h後，將反應以1.9ml的PBS緩衝劑稀釋及經由PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)使用PBS緩衝劑溶離。然後將溶離液以超離心濃縮，以PBS緩衝劑再稀釋(pH 7.2)及再次再濃縮。得到的ADC批件特性係如下：
蛋白濃度：1.74mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例254B
本處，將5mg的抗-TWEAKR AK-1之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F254偶合並如實例254A中所述進行後處理。
蛋白濃度：1.8mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例254E
本處，將5mg的曲妥珠單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F254偶合並如實例254A中所述進行後處理。
蛋白濃度：1.74mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
實例254I
本處，將5mg的尼妥珠單抗之PBS溶液(c=10mg/ml)用於與中間物F254偶合並如實例254A中所述進行後處理。
蛋白濃度：1.73mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例255
(2R,28R)-28-胺基-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)甲基]-25-(羧甲基)-4,20,24-三側氧-7,10,13,16-四氧雜-26-硫雜-3,19,23-三氮雜二十九烷-1,29-二酸/三氟乙酸(1：2)及(1R,28R,34R)-1-胺基-33-(3-胺基丙基)-34-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35,35-二甲基-6,10,26,32-四側氧-14,17,20,23-四氧雜-3,30-二硫雜-7,11,27,33-四氮雜三十六烷-1,4,28-三羧酸/三氟乙酸(1：2)
將20mg(0.018mmol)的R-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-N-[19-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物F209)和9.78mg(0.036mmol)的N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶於2ml的DMF中，並將混合物於RT攪拌18h。將反應混合物於減壓下濃縮。將殘餘物(47.7mg)溶於3ml的THF/水1：1。加入0.08ml的2M氫氧化鋰水溶液並將反應於RT攪拌1小時。然後使用9.26mg(0.15mmol)的乙酸將反應調整至~7之pH。將反應混合物直接以製備式RP-HPLC純化(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1%TFA)。於減壓下蒸發溶劑並將殘餘物於高真空下乾燥。由此得到15.3mg(29%於二個步驟)的區域異構性保護的中間物。
LC-MS(方法6)：Rt =12.26min及12.30min；MS(ESIpos)：m/z=1254(M+H)+ .
在最後的步驟，將15.3mg(0.01mmol)的此中間物溶於2ml的2,2,2-三氟乙醇。加入6.1ml(0.05mmol)的氯化鋅，並將反應於50℃攪拌2h。然後加入13.1mg(0.05mmol)的乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，並以製備式HPLC純化產物。將適當的溶離份濃縮及將殘餘物以乙腈/水凍乾，得到11.9mg(79.5%)的標題化合物為區域異構物混合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1110(M+H)+ .
實例256
(3R)-6-{(11S,15R)-11-胺基-15-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-羥乙醯基-16,16-二甲基-2,5,10-三側氧-3,6,9,14-四氮雜十七-1-基}-5-氧噻嗎福啉-3-羧酸/三氟乙酸(1：1)
將4mg(0.004mmol)的實例135之化合物溶於4ml的THF/水，並加入48μl的2-莫耳濃度氫氧化鋰水溶液。將反應於RT攪拌1h及然後濃縮並以製備式HPLC純化。組合，濃縮及將適當的溶離份由乙腈/水凍乾，得到2.4mg(60%的理論值)的標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt =0.86min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+ .
C：生物效力之評估
本發明化合物的生物活性可用下述之分析來顯示：
m.C-1a測定抗TWEAKR之ADC的細胞毒性效應
抗-TWEAKR-ADC的細胞毒性效應分析係以各種細胞株來進行：
NCI-H292：人類黏液表皮樣肺癌細胞，ATCC-CRL-1848，標準培養基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215,stab.麩醯胺酸)+10%FCS(Biochrom；#S0415),TWEAKR-陽性，EGFR-陽性。
BxPC3：人類胰臟癌細胞，ATCC-CRL-1687，準培養基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215,stab.麩醯胺酸)+ 10%FCS(Biochrom；#S0415),TWEAKR-陽性。
KPL4：人類乳癌細胞，標準培養基：RPMI 1640+GlutaMAX I+10%FBS,細胞銀行，Bayer Pharma AG(身分檢及於19.7.2012在DSMZ確認)，柏林，ERBB2-陽性。
如美國菌種保存中心(American Tissue Type Collection)(ATCC)就個別細胞株所示，以標準方法培養細胞。
MTT分析
此試驗係藉由以Accutase之PBS溶液(Biochrom AG #L2143)分離細胞，形成小團，再懸浮於培養基中，計數並種入白底的96-孔培養盤(Costar #3610)(依照所用的細胞，100μl/每孔中1000-2000細胞)並於37℃及5%二氧化碳的培養箱中培養。48h後，將抗體藥物接合物以10μl的培養基之10-5 M至10-13 M濃度加到細胞中(三重複)並於37℃及5%二氧化碳的培養箱中培養。72h後，使用MTT分析(ATCC,Manassas,Virginia,USA，型號30-1010K)偵測增生作用。在選擇性培養結束時，將MTT試劑與細胞培養4h，接著藉由加入清潔劑解離細胞至隔夜。於570nm偵測所形成的染劑。未以試驗物質處理但以同樣處理的細胞之增生係定義為100%計數。
CTG分析
將細胞根據標準方法使用列於下述C-1之生長培養基來培養。此試驗係藉由以胰蛋白酶(0.05%)和EDTA(0.02%)之PBS溶液(Biochrom AG #L2143)分離細胞，形成小團，再懸浮於培養基中，計數並種入白底的96-孔培養盤(Costar #3610)(75μl/孔，每孔細胞數如下：NCI-H292：2500個細胞/孔，BxPC3 2500個細胞/孔))並於37℃及5%二氧化碳的培養箱中培養。24h後，將抗體藥物接合物以25μl的培養基(濃縮四倍)加到細胞中，得到細胞上3 x 10-7 M至3 x 10-11 M之最終抗體藥物接合物濃度(三重複)。然後將細胞於37℃及5%二氧化碳的培養箱中培養。在一平行的盤上，使用Cell Titer Glow(CTG)發光細胞活力分析(Promega #G7573及#G7571)測定活性化合物處理開始時之細胞活性(第0天)。就此，每批細胞係加入100μl的基質，然後以鋁箔包覆培養盤，於盤式震盪器中以180rpm震盪2分鐘，在實驗台上放置8分鐘及然後使用照度計(Victor X2,Perkin Elmer)測量。此基質係偵測活細胞產生螢光訊號之ATP含量，其強度係與細胞的存活力成正比。以抗體藥物接合物培養72h，然後亦使用上述Cell Titer Glow發光細胞活力分析測定這些細胞的存活力。從所測量的數據，使用DRC(劑量反應曲線)分析試算表及4-參數擬合與第0天相比較，計算生長抑制之IC50 。此DRC分 析試算表為一由Bayer Pharma AG及Bayer Business Services on the IDBS E-WorkBook Suite platform(IDBS：ID Business Solutions Ltd.,Guildford,UK)所開發的生物書試算表。
表1a、1b及1c係列出來自此分析使用抗-TWEAKR抗體之代表性操作實例的IC50 值：
所提出的活性數據係關於本發明實驗部份所述的操作實例，具有所示的藥物/mAb比率。此等數值對不同的藥物/mAb比率可能有偏差。IC50值為數個獨立的實驗或個別值之平均。TWEAKR抗體藥物接合物之作用對於包括各別連接子及帶毒體之各別的同型對照組係具選擇性。
下表2係列出來自MTT分析含西妥昔單抗抗體之代表性操作實例的IC50值：
所提出的活性數據係關於本發明實驗部份所述的操作實例，具有所示的藥物/mAb比率。此等數值對不同的藥物/mAb比率可能有偏差。IC50值為數個獨立的實驗或個別值之平均。西妥昔單抗抗體藥物接合物之作用對於包括各別連接子及帶毒體之各別的同型對照組係具選擇性。
下表3係列出來自MTT分析含曲妥珠單抗抗體之代表性操作實例的IC50值：
所提出的活性數據係關於本發明實驗部份所述的操作實例，具有所示的藥物/mAb比率。此等數值對不同的藥物/mAb比率可能有偏差。IC50值為數個獨立的實驗或個別值之平均。曲妥珠單抗抗體藥物接合物之作用對於包括各別連接子及帶毒體之各別的同型對照組係具選擇性。
C-1b測定所選實例之紡錘體驅動蛋白KSP/Eg5的抑制作用
將來自tebu-bio/Cytoskeleton Inc,No.027EG01-XL)的人類紡錘體驅動蛋白KSP/Eg5之動力區用10nM之濃度以50μg/ml taxol-(來自Sigma No.T7191-5MG)經安定化的微管(牛或豬，來自tebu-bio/Cytoskeleton Inc)於RT在15mM PIPES,pH 6.8(5mM MgCl2 及10mM DTT，來自Sigma)中培養5min。將此新鮮製備的混合物分成等份置入384-孔MTP中。然後加入欲檢測的抑制劑濃度1.0 x 10-6 M至1.0 x 10-13 M及ATP(最終濃度500μM，來自Sigma)。於RT培養2h。使用孔雀石綠(來自Biomol)藉由偵測所形成無機磷酸鹽來偵測ATP酶活性。加入試劑後，將分析於RT培養50分鐘，之後於620nm波長偵測吸收度。使用Monastrol及伊斯平斯(Ispinesib)(來自Adooq A10486)作為正性對照。劑量-活性曲線之個別的數據為8-倍的測定值。IC50值為三個獨立實驗之平均。100%對照組為未經抑制劑處理之樣本。
下表4係匯整來自所述分析之代表操作實例的IC50值：以一示例的方式，其確認了在帶毒體之標靶和所述的ADC方法上的高效力。
所提出的活性數據係關於本發明實驗部份所述的操作實例。
C-2內化分析
內化為能經由抗體藥物接合物(ADC)在表現抗原的癌細胞中專一及有效提供細胞毒性酬載(cytotoxic payload)之關鍵過程。此過程係經由螢光標定的專一性TWEAKR抗體及同型對照抗體(M014)來監測。首先，將螢光染劑與抗體的離胺酸接合。接合係使用2-倍莫耳超量的CypHer 5E單NHS酯(Batch 357392,GE Healthcare)於pH 8.3來進行。偶合後，於4℃將反應混合物透析(sSlide-A-Lyser Dialysis Cassettes MWCD 10kD，來自Pierce)至隔夜，用以移除過量的染劑並調整pH，及然後濃縮蛋白溶液(VIVASPIN 500,來自Sartorius stedim biotec)。以分光光度分析測定抗體的染劑載量(NanoDrop)及隨後計算(D：P=A染劑 ε蛋白 ：(A280 -0.16A染劑 )ε染劑 )。本處所檢測的TWEAKR抗體及同型對照組之染劑載量具有相當的序類。在細胞結合分析中，確認了接合不會造成抗體親和力的改變。
將經標定的抗體用於內化分析。在開始處理前，將細胞(2 x 104 /孔)以100μl種入96-孔MTP(豐厚、黑色、底部透明No 4308776，來自Applied Biosystems)。於37℃/5%CO2 培養18h後，置換培養基並加入不同濃度的標定抗-TWEAKR抗體(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)。以相同的處理方法施用於經標定的對照組(負性對照)。所選擇的培養時間為0、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h及24h。螢光測量係使用InCellanalyser 1000(來自GE Healthcare)來進行。接著經由測量參數顆粒數細胞及總顆粒強度/細胞，評估動力學。
在與TWEAKR結合後，檢測TWEAKR抗體之內化能力。就此目的，選擇含不同TWEAKR表現程度的細胞。以TWEAKR抗體觀察到標靶-媒介的專一內化，而同型對照組並無顯現內化作用。
C-3測定細胞通透性之活體外試驗
物質的細胞通透性可藉由活體外試驗以通量分析使用Caco-2細胞來評估[M.D.Troutman和D.R.Thakker,Pharm.Res. 20(8) ,1210-1224(2003)]。就此目的，將細胞置於24-孔過濾盤上培養15-16天。就通透作用之測定，係將個別的操作實例於HEPES緩衝液中以頂端(A)或基部(B)施用於細胞，並培養2小時。0小時及2小時後，將樣本從順槽和反槽取出。將樣本以HPLC(Agilent 1200,Böblingen,Germany)使用逆相管柱分離。HPLC系統係經由Turbo離子噴霧界面與Triple Quadropol質譜儀API 4000(Applied Biosystems Applera,Darmstadt,Germany)結合。通透性係以Papp 值為基準來評估，該值係使用Schwab等人所發表的公式來計算[D.Schwab等人，J.Med.Chem. 46,1716-1725(2003)]。當Papp (B-A)與Papp (A-B)之比率(外排比率)為>2或<0.5時，則該物質被歸類為主動轉運。
對於胞內釋放帶毒體非常重要的為從B到A之通透性[Papp (B-A)]及Papp (B-A)與Papp (A-B)之比率(外排比率)：此通透性越低，物質經由Caco-2細胞之單層的主動和被動運輸越慢。若另外，通量比率未顯示任何主動運輸，則物質可能在胞內釋放後，留在細胞中越久。因此亦有更多的時間可與生化標靶(在本案例中為：紡錘體驅動蛋白，KSP/Eg5)相互作用。
下表4係說明此分析之代表性操作實例的通透性數據：
C-4測定P-糖蛋白(P-gp)之基質性質的活體外試驗
許多腫瘤細胞對藥物表現轉運子蛋白，且此項通常伴隨對細胞抑制劑 產生抗藥性。非此等轉運蛋白基質之物質，例如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP，粒如，可能因此具有增進的活性性質。
P-gp(ABCB1)物質之基質性質係藉由通量分析使用過度表現P-gp之LLC-PK1細胞(L-MDR1細胞)來測定[A.H.Schinkel等人，J.Clin.Invest. 96,1698-1705(1995)]。就此目的，係將LLC-PK1細胞或LMDR1細胞於96-孔過濾盤上培養3-4天。就滲透性之測量，係將個別的試驗物質單獨或在抑制劑(例如伊維菌素(Ivermectin)或維拉帕米(Verapamil))之存在下於HEPES緩衝液中以頂端(A)或基部(B)施用於細胞並培養2小時。在0小時及2小時後，將樣本從順槽和反槽取出。將樣本以HPLC使用逆相管柱分離。HPLC系統係經由渦輪增壓離子噴霧界面與三段四極質譜儀API 3000(Applied Biosystems Applera,Darmstadt,Germany)結合。通透性係以Papp 值為基準加以評估，該值係使用Schwab等人所發表的公式來計算[D.Schwab等人，J.Med.Chem. 46,1716-1725(2003)]。當Papp (B-A)與Papp (A-B)之流出比率為>2時，則該物質被歸類為P=gp物質。
作為評估P-gp物質性質之另外的標準，L-MDR1及LLC-PK1細胞中流出比率或在有或無抑制劑的存在下之流出比率可能可相較。若這些值差異在二倍以上，則該所指的物質為一P-gp物質。
C-5藥物動力學
C5a：鑑定活體外內化後ADC代謝物
方法說明：
進行免疫接合物之內化研究用以分析胞內所形成的代謝物。就此，將人類肺癌細胞NCI H292(3x105 /孔)種入6-孔盤中並培養至隔夜(37℃,5%CO2 )以10μg/ml欲檢測的ADC處理細胞。內化係在37℃及5%CO2 下進行。在各時間點(0、4、24、48、72h)，取細胞樣本作進一步的分析。首先，收取上清液(約5ml)及，在離心後(2min,RT,1000rpm Heraeus Variofuge 3.0R)，儲存於-80℃。以PBS清洗細胞並以PBS清洗細胞及液分離，並測 定細胞數。再次清洗，將一定義數量的細胞(2 x 105 )以100μl的解離緩衝劑.處理細胞(哺乳動物細胞解離套組(Sigma MCL1)並以連續震盪(Thermomixer,15min,4℃,650rpm)於蛋白LoBind試管中(eppendorf型號0030 108.116)培養。培養後，將解離液離心(10min,4℃,12000g,eppendorf 5415R)並收取上清液。將得到的上清液儲存於-80℃。然後將所有的樣本如下分析。
培養上清液或細胞解離液中化合物的測量係在以甲醇或乙腈沉澱但蛋白後，藉由高壓液相層析(HPLC)結合三段四極質譜儀(MS)來進行。
就50μl的培養上清液/細胞解離液之後處理，加入150μl的沉澱劑(一般為乙腈)並將混合物震盪10秒。沉澱劑含有適合濃度(一般在20-100ng/ml範圍內)之內標(ISTD)。以16000g離心3分鐘後，將上清液轉置於自動取樣器小瓶中，添加500μl適合移動相的緩衝劑並再次震盪。
然後使用HPLC-結合三段四極質譜儀API6500來自AB SCIEX Deutschland GmbH公司，測量二個陣列的樣本。
就校準，係將0.5-2000μg/l之濃度加到血漿樣本。偵測極限(LOQ)為約2μg/l。線性範圍係由2延伸至1000μg/l。
就腫瘤樣本之校準。係將0.5-200μg/l之濃度加到未處理的腫瘤之上清液。偵測極限(LOQ)為4μg/l。線性範圍係由4延伸至1000μg/l。
就檢測有效性之質性對照組係含有5及50μg/l。
將NCI-H292，在各情況下，以10μg/ml的實例104b、119b、155b、165b及173b之ADC培養。72h後，以PBS清洗細胞、解離及深低溫冷凍(-80℃)。使用上述方法，將係胞解離液和細胞培養上清液作後處理，及萃取後，鑑別下列代謝物並定量：
將NCI-H292，在各情況下，以10μg/ml的實例179a、226a、85b及208b之ADC培養。72h後，以PBS清洗細胞、解離及深低溫冷凍(-80℃)。使用上述方法，將細胞解離液和細胞培養上清液作後處理，及萃取後，鑑別下列代謝物並定量：
C5b：鑑別活體內ADC代謝物
以i.v.投予3-30mg/kg不同的ADC後，可測量ADC的血漿和腫瘤濃度及任何產生的代謝物，及計算藥物動力學參數例如清除率，曲線下面積(AUC)和半衰期(t1/2 )。
任何代謝物產生之定量分析
測量血漿和腫瘤中的化合物係在以甲醇或乙腈沉澱蛋白後，以高壓液 相層析(HPLC)結合三段四極質譜儀(MS)來進行。
就50μl血漿的後處理，係加入250μl的沉澱劑(一般為乙腈)並將混合物震盪10秒。沉澱劑含有適合濃度(一般在20-100ng/ml範圍內)之內標(ISTD)。以16000g離心3分鐘後，將上清液轉置於自動取樣器小瓶中，添加500μl適合移動相的緩衝劑並再次震盪。
在腫瘤後處理期間，後者係以3倍萃取緩衝劑的量處理。萃取緩衝劑含有50ml的組織蛋白萃取試劑(Pierce,Rockford,IL)，2團的完全-蛋白酶-抑制劑-混合物(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)和最終濃度1mM之苯甲基磺醯氟(Sigma,St.Louis,MO)。以Tissuelyser II(Qiagen)將樣本以最大划動數均質二次歷時20分鐘。將50μl的均質液加到自動取樣器小瓶中，添加150μl包括ISTD的甲醇。以16000g離心3分鐘後，將10μl的上清液添加180μl適合移動相的緩衝劑並再次震盪。則此腫瘤樣本便已完成可供測量。
然後將二個陣列的樣本使用來自AB SCIEX Deutschland GmbH公司之HPLC-結合三段四極質譜儀API6500測量。
就校準，係將0.5-2000μg/l之濃度加到血漿樣本。偵測極限(LOQ)為約2μg/l。線性範圍係由2延伸至1000μg/l。
就腫瘤樣本之校準。係將0.5-2000μg/l之濃度加到未處理的腫瘤之上清液。偵測極限(LOQ)為5μg/l。線性範圍係由5延伸至200μg/l。
檢測有效性之質性對照組係含有5及50μg/l，在血漿中另外為500μg/l。
在來自NCI-H292之異種移植模型的對照組中投予10mg/kg的實例119b及104b ADC後，24h後將小鼠安樂死，移出血液及分離腫瘤。使用上述方法，將血漿和腫瘤樣本作後處理，及萃取後，鑑別下列代謝物並定量：
所用的抗體之定量分析
使用配體結合分析(ELISA)測定ADC的抗體部份，為血漿樣本和腫瘤解離液中之總IgG濃度。本處，係使用三明治ELISA格式。此ELISA經定性且對於血漿和腫瘤樣本中的測定為有效的。將ELISA盤塗覆上抗-人類山羊IgG Fc抗體。與樣本培養後，清洗測定盤並以猿猴抗-人類IgG(H+L)抗體及辣根過氧化酶(HRP)之偵測劑接合物進行培養。另一個清洗步驟後，將HRP基質加到OPD並經由490nm之吸收度監測顏色的發展。將具有已知IgG濃度的標準樣本使用4-參數方程式擬合。在定量下限(LLOQ)和上限(ULOQ)內，以內插法測定未知的濃度。
C-6活體內之活性試驗
本發明接合體之活性係，例如，使用異種移植模型來試驗。熟習本項技術者已熟悉先前技術中用於試驗本發明化合物活性之方法(參見，例如WO 2005/081711；Polson等人，Cancer Res.2009 Mar 15；69(6)：2358-64)。就此，係將表現結合子標靶分子之腫瘤細胞株植入囓齒類(例如小鼠)中。然後將本發明接合體、同型對照抗體或等張鹽溶液投予此等植入的動物中。給藥可進行一次或一次以上。在接種數日後，藉由將接合物治療的動物與對照組作比較，測定腫瘤大小。經接合物治療的動物顯現較小的腫瘤。
C-6a.生長抑制/小鼠中實驗腫瘤之消退
將表現抗體藥物接合物之抗原的人類腫瘤細胞以皮下接種至免疫抑制 小鼠，例如NMRi裸小鼠或SCID小鼠的側腹。從細胞培養中分離1百萬-1千萬個細胞，離心並再懸浮於培養基或培養基/基質膠(Matrigel)中。將細胞懸浮液注射至小鼠的皮膚下。
於數天內，使腫瘤生長。在腫瘤建立後，腫瘤大小約40mm2 時建議治療。就檢驗對較大腫瘤之效用，治療係在腫瘤大小50-100mm2 時才開始治療。
ADC接合體之治療係經由靜脈路徑進入小鼠尾靜脈來進行。ADC係以5ml/kg之量來給藥。
治療方法係依抗體的藥物動力學而定。治療係每隔三天或每隔六天進行三次，作為標準。就快速評估，可應用單一治療方法。然而，治療亦可持續進行，或於以後的某時間點接著第二輪的三個治療天數。
每個治療組使用8隻動物作為標準。除了投予活性物質之組別外，以一組作為對照組，依照相同的方法僅以緩衝劑治療。
在實驗期間，使用游標尺定期地測量二維(長/寬)腫瘤面積。腫瘤的面積係以長x寬來計算。治療組的平均腫瘤面積與對照組腫瘤面積之比率係以T/C面積表示。
當治療結束後，所有的實驗組同時停止，可將腫瘤移出並稱重。治療組(T)與對照組(C)之腫瘤平均重量的比率係以T/C表示。治療組的平均腫瘤重量與對照組腫瘤重量之比率係以T/C重量表示。
C-6b.抗-EGFR抗體藥物接合物於NCI-H292腫瘤模型中對重覆治療的效用
將1百萬個NCI-H292細胞以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在第7天腫瘤大小為35mm2 時，開始3或10mg/kg劑量之靜脈內治療(第7、11、15天)。治療後，監測腫瘤生長至第105天。
相較於媒劑及同型對照組，以實例01a及02a之抗體藥物接合物治療造成腫瘤生長顯著的抑制。起初與劑量無關，有最大的腫瘤消退。表6係顯示經由第35天腫瘤面積所測定的T/C面積值。以對照接合物(抗不相關抗 原之同型抗體)治療產生明顯較弱的腫瘤生長抑制作用。以未接合的抗體治療同樣造成生長抑制；然而，此情況係低於抗體藥物接合物之情況。
C-6c.抗-EGFR抗體藥物接合物於NCI-H292腫瘤模型中對單一治療之效用
將1百萬個NCI-H292細胞以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在第9天腫瘤大小為~37mm2 時，以3mg/kg的ADC或2.5mg/kg帶毒體A(N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺)或帶毒體B(N-[(3R)-3-胺基-4-氟丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺)劑量治療動物一次。治療後，監測腫瘤生長至第25天。
相較於對照組，以實例35A及02A之抗體藥物接合物治療造成腫瘤生長顯著的抑制。在以3mg/kg治療期間，有最大的腫瘤消退。表7係顯示在第25天所測定的腫瘤重量及腫瘤面積之T/C值。本處，抗體藥物接合物35A顯現優於西妥昔單抗及優於帶毒體A或帶毒體B之效用。
C-6d.抗-EGFR並抗-TWEAKR抗體藥物接合物於NCI-H292腫瘤模型中對單一治療之效用
將1百萬個NCI-H292細胞以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在第7天腫瘤大小為37mm2 時，以3或10mg/kg劑量之抗體藥物接合物進行一次靜脈內治療(第7、11、15天)。治療後，監測腫瘤生長至第24天。
相較於對照組，以實例02B之抗-TWEAKR抗體藥物接合物單一治療造成顯著及持久的腫瘤生長抑制。表8係顯示於第24天所測定的腫瘤重量及腫瘤面積之T/C值。
C-6e.抗-TWEAKR抗體藥物接合物在BxPC3腫瘤模型中對重覆治療之效用
將2百萬個BxPC3細胞以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在第10天腫瘤大小為45mm2 時，開始10mg/kg劑量之靜脈內治療(第10、14、18天)。治療後，監測腫瘤生長至第42天。表9係顯示於第42天所測定的腫瘤重量及腫瘤面積之T/C值。以個別對照接合物(抗不相關抗原之同型抗體)治療產生明顯較弱的腫瘤生長抑制作用。以未接合的抗體治療同樣，在某些情況下造成較弱的腫瘤生長抑制。
C-6f.抗-TWEAKR抗體藥物接合物於NCI-H292腫瘤模型中對單一治療之效用(2個獨立的實驗)
在二個實驗中，將1百萬個NCI-H292細胞以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在第10天(實驗1)或第8天(實驗2)腫瘤大小為45mm2 時，以3mg/kg劑量之抗體藥物接合物進行一次靜脈內治療。治療後，監測腫瘤生長至第18天(實驗1)或第24天(實驗2)。
相較於對照組和未接合的抗-TWEAKR抗體，在實驗1中以抗 -TWEAKR抗體藥物接合物02B、07B及08B治療造成腫瘤生長顯著的抑制。表10(實驗1)係顯示於第18天所測定的腫瘤重量及腫瘤面積之T/C值。相較於對照組和個別的同型對照組(未顯示)，在實驗2中以抗-TWEAKR抗體藥物接合物155B、173B、165B及085B之單一治療同樣造成腫瘤生長顯著的抑制。表11(實驗2)係顯示於第24天所測定的腫瘤面積之T/C值。
C-6g.抗-TWEAKR抗體藥物接合物在A375腫瘤模型中對重覆治療之效用
將5百萬個A375(人類黑色素瘤)細胞以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在第10天腫瘤大小為41mm2 時，開始10mg/kg劑量之靜脈內治療(第10、14、18天)。治療後，監測腫瘤生長至第22天。
相較於對照組，以實例38B及104B之抗體藥物接合物治療造成腫瘤生長顯著的抑制。表10係顯示在第22天所測定的腫瘤重量及腫瘤面積之T/C值。以個別對照接合物(抗不相關抗原之同型抗體)治療產生明顯較弱的腫瘤 生長抑制作用。以未接合的抗體治療同樣，在某些情況下造成較弱的腫瘤生長抑制
C-6h.抗-TWEAKR抗體藥物接合物於LoVo腫瘤模型中對重覆治療之效用
將5百萬個LoVo(人類大腸癌)細胞以皮下接種至雌性NMRI-裸小鼠(Janvier)的側腹。在第7天腫瘤大小為43mm2 時，開始10mg/kg劑量之靜脈內治療(第7、11、15天)。治療後，監測腫瘤生長至第45天。
相較於對照組，以實例07B、87B及104B之抗體藥物接合物治療造成腫瘤生長顯著的抑制。表11係顯示在第45天所測定的腫瘤面積之T/C值。以07B5之對照接合物(抗不相關抗原之同型抗體)治療產生明顯較弱的腫瘤生長抑制作用。
D.醫藥組合物之操作實例
本發明化合物可如下轉變成醫藥調配物：
i.v.溶液：
將本發明化合物以低於飽和溶解度之濃度溶於生理上可接受的溶劑中(例如等張的食鹽水溶液、D-PBS或帶有甘油和氯化鈉溶於檸檬酸緩衝液中添加山梨醇酯80之調配物)。將溶液進行無菌過濾並分散於無菌和無病原之注射容器中。
i.v.溶液：
本發明化合物可轉變為所述的給藥形式。其可以本身已知的方法，藉由「混合」或「溶解」於惰性、無毒的醫藥上適合的賦形劑(例如緩衝劑物質、安定劑、增溶劑、防腐劑)中來進行。例如可存有下列物質：胺基酸(甘胺酸、組胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、離胺酸、白胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸及其他)、糖及相關化合物(葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、山梨醇)、甘油、鈉鹽、鉀、銨鹽和鈣鹽(例如氯化鈉、氯化鉀或磷酸氫二鈉及許多其他)、乙酸鹽/乙酸緩衝系統、磷酸緩衝系統、檸檬酸和檸檬酸鹽緩衝系統、胺丁三醇(trometamol)(TRIS和TRIS鹽)、聚山梨醇酯(例如Polysorbate 80和Polysorbate 20)、泊洛沙姆(Poloxamer)(例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆171)、聚乙二醇(Macrogol)(PEG，例如3350)、Triton X-100、EDTA鹽、麩胱甘肽、白蛋白(例如人類)、尿素、苯甲醇、酚、氯甲酚、間甲酚、苯札氯銨(benzalkonium chloride)及許多其他。
用於後續轉變為i.v.、s.c.或i.m.溶液之凍乾物：
另一種選擇，本發明化合物可轉變為穩定的凍乾物(可在上述賦形劑之幫助下)，及在給藥前，以適合的溶劑(例如注射等級的水、等張食鹽水溶液)重建並給藥。
抗-TWEAKR抗體之操作實例
除非在本文有詳細說明，否則所有的實例係使用熟習本項技術者已知的標準方法來進行。下列實例之分子生物的例行方法可如標準實驗教科書，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：a Laboratory Manual,2.Edition；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989所述來進行。
AK實例1：使用抗體庫之抗體製備物
將一完整的人類噬菌體表現庫(Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，藉由蛋白淘選用於分離本發明之TWEAKR-專一性人類單株抗體(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005；23(3)：1105-16)，其中人類及鼠科TWEAKR之二聚化Fc-融合胞外區係經固定化作為標靶。
使用約2-倍莫耳過量的生物素-LC-NHS(Pierce；型號21347)根據製造商的說明將抗原生物素化並使用Zeba脫鹽管柱(Pierce；型號89889)脫鹽。將清洗過的磁珠(DynaBeads)以200nM生物素化抗原於4℃培養至隔夜並於4℃以阻斷緩衝劑(PBS含3%BSA,0.05%Tween-20)阻斷1h。將阻斷的Fab噬菌體庫加到阻斷的TWEAKR微珠中(DynaBeads Streptavidin-M280-Invitrogen 112-06D)並於室溫培養30min。嚴密的沖洗後(3 x阻斷緩衝劑及9 x PBS(150mM NaCl；8mM Na2HPO4；1.5mM KH2PO4；調整至pH=7.4-7.6)含0.05%Tween-20)，將Fab噬菌體專一結合生物素化TWEAKR微珠(DynaBeads鏈黴親合素-M280-Invitrogen 112-06D)懸浮於PBS溶液中，並直接用於轉染大腸桿菌(Escherichia coli )株TG1，供增幅。在第二輪選擇時，使用二種鼠科TWEAKR(200nM)進行交叉反應結合子之選擇，及在第三輪選擇中，降低人類TWEAKR濃度(100nM)以便增加高親和力結合子之選擇壓力。
鑑別出11種不同的Fab噬菌體並將對應的抗體選殖至哺乳動物IgG表現載體中，其係提供不存在可溶性Fab中遺失的CH2-CH3區。如Tom等人，Methods Express之第12章：Expression Systems edited by Micheal R.Dyson及Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007中所述，將產生的IgG 過渡性表現在哺乳動物細胞中。簡言之，將CMV啟動子-為基礎的表現質體轉染至HEK293-6E細胞及並於馮巴赫瓶(Fernbach bottle)或Wave袋中培養。培養係在F17培養基(Invitrogen)中於37℃進行5至6天。轉染24h後，加入1%Ultra-Low IgG FCS(Invitrogen)和0.5mM丙戊酸(Sigma)作為添補劑。以蛋白-A層析純化抗體及藉由其與可溶性單體TWEAKR之結合親和力，如AK-實例2中所述，使用ELISA及BIAcore分析進一步定性。
就測定抗-TWEAKR抗體之細胞結合特性，係以流式細胞儀檢測許多的細胞株(HT29、HS68、HS578)。將細胞懸浮於抗體(5μg/ml)之FACS緩衝劑的稀釋液並於冰上培養1h。然後加入第二抗體(PE山羊-抗-人類IgG,Dianova #109-115-098)。於冰上培養1h後，以流式細胞儀使用FACS陣列(BD Biosciences)分析細胞。
進行NF-κ B受體基因分析，用以評估全部所鑑別的11種抗體(人類IgG1)之促效活性。將HEK293以NF-κ B受體建構(BioCat，型號LR-0051-PA)使用293fectin根據製造商的說明過渡性轉染。於37C、5%CO2將轉染的細胞種入白色塗覆聚離胺酸384-孔盤(BD)中的F17培養液(無血清；Invitrogen)。翌日，以各種濃度的純化抗體刺激6h，及然後使用標準方法進行一螢光酶分析。
經由螢光標定的抗-TWEAKR抗體(CypHer 5E單NHS酯；GE Healthcare)監測內化作用。在處理前，將HT29細胞(2 x 104 /孔)種入96-孔MTP盤(厚的，黑色，透明底，型號4308776,Applied Biosystems)之100μl的培養基中。於37℃/5%CO2 培養18h後，置換培養基並加入不同濃度經標定的抗-TWEAKR抗體(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)。選擇的培養時間為0、 0.25、0.5、1、1,5、2、3、6及24h。螢光測量係以InCell-分析儀1000(GE Healthcare)來進行。
選擇具有最高活體外活性之抗體(TPP-883)供進一步活性和親和力成熟。
TPP-883
SEQ ID NO.71
SEQ ID NO.72TPP-883之輕鏈(SEQ ID NO.71)和重鏈(SEQ ID NO.72)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
成熟係以一輪首先突變收集，接著重組最大增加親和力和活性之該等胺基酸修飾來進行。就收集突變NNK(N=AGCT,K=G或T)，係於下列個別的胺基酸位置藉由定點突變，使用合成的寡核苷酸，包括NNK密碼子多 樣化(連續的胺基酸命名法)進行隨機化：在CDR-L1為S35、S36、Y37及N39；在CDR-L2中為A51、S53、S54、Q56及S57；在CDR-L3中為S92、Y93、S94、S95、G97及I98；在CDR-H1中為P31、Y32、P33、M34及M35；在CDR-H2中為Y50、S52、P53、S54、G56、K57及H59；在CDR-H3中為G99、G100、D101、G102、Y103、F104、D105及Y106。將所有個別的NNK飽和致突變庫之DNA選殖至哺乳動物IgG表現載體用於活性成熟，或選殖至噬菌體質體用於親和力成熟。親合力成熟係藉由噬菌體淘選來進行。將清洗過的磁珠(DynaBeads)以10nM、1nM、100pM或10pM生物素化抗原於4℃培養至隔夜並於4℃以阻斷緩衝劑(PBS含3%BSA,0.05%Tween-20)阻斷1h。將阻斷的Fab噬菌體庫，以相較於理論資料庫複雜性10000-倍、1000-倍或100-倍過量，加入阻斷的TWEAKR-DynaBeads中並於室溫培養30min。其表示總計有12項策略跟隨(4種抗原濃度x 3 Fab噬菌體效價)。嚴密清洗後(3 x阻斷緩衝劑及9 x PBS含0.05%Tween-20)，將專一與生物素化TWEAKR DynaBeads(DynaBeads鏈黴親和素-M280-Invitrogen 112-06D)結合的Fab噬菌體再懸浮於PBS中，並直接用於轉染大腸桿菌(Escherichia coli )菌株TG1，供增幅。在第二輪選擇中，降低人類TWEAKR-Fc濃度(1nM、100pM、10pM及1pM)，並於所有12個策略(4.4 x 1011 )使用相同的Fab噬菌體效價。就可溶性Fab之表現，係將噬菌體質體載體以MluI消化，移除Fab顯現在噬菌體上所需的基因-III膜錨序列，並將載體再-綁紮。將各12種選擇池庫的96種變體表現成可溶性Fab並以ELISA格式檢驗。就此，將2.5nM生物素化TWEAKR-Fc以抗原塗覆，及使用抗-c-Myc抗體(Abcam ab62928)驗證可溶性Fab之結合。驗證了對TWEAKR-Fc(Seq ID No 138)具有增進結合之7種單一取代變體(連續的胺基酸命名法)：CDR-L1之S36G，CDR-L2之A51Q及S57K，CDR-L3之S94T及G97F，CDR-H1之M35I及CDR-H3之G102T。就活性成熟，係將HEK293細胞以NF-κ B受體(BioCat，型號LR-0051-PA)轉染。將轉染的細胞種入白 色塗覆聚離胺酸384-孔盤(BD)中的F17培養液(無血清；Invitrogen)，並將NNK-多樣化位置抗體(人類IgG1)庫之個別變體過渡性表現在哺乳動物細胞中。翌日，以表現的個別NNK抗體刺激NF-κ B受體細胞6h，及然後使用標準方法進行一螢光酶分析。偵測出1個具有增進的促效活性之單一取代變體：CDR-H3之G102T。此變體亦可藉由親和力成熟來獲得，在該處，其亦顯示最高增進的親和力。親和力和活性篩選之突變收集後，將全部7個有利的個別取代(資料庫複雜性：128個變體)重組成一重組的資料庫。就此，合成寡核苷酸用以在各所選擇的位置導入選擇的突變或對應的野生型胺基酸。使用連續幾輪的重疊延伸PCR建立資料庫。最終的PCR產物綁紮在細菌可溶性Fab表現載體中，及如上述，以可溶性Fab就平衡ELISA篩選，隨機選擇528個變體(取~4-倍過量的樣本)。最後，相較於最佳單一取代變體G102T，以增加的親和力為基準，選擇7種變體。將這些變體之對應的DNA選殖至IgG表現載體並以上述的NF-κ B受體細胞分析檢驗功能活性。最後，將得到的序列與人類生殖系序列相比較，並重編對親和力及效力無任何顯著效應之偏差。具有下列序列之抗體係藉由抗體庫篩選及藉由親和力及/或活性成熟所得來：
TPP-2090
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2： TPP-2090之輕鏈(SEQ ID NO.1)和重鏈(SEQ ID NO.2)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-2149
SEQ ID NO.11
SEQ ID NO.12TPP-2149之輕鏈(SEQ ID NO.11)和重鏈(SEQ ID NO.12)的胺基酸序列；重 鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-2093
SEQ ID NO.21
SEQ ID NO.22TPP-2093之輕鏈(SEQ ID NO.21)和重鏈(SEQ ID NO.22)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-2148
SEQ ID NO.31
SEQ ID NO.32TPP-2148之輕鏈(SEQ ID NO.31)和重鏈(SEQ ID NO.32)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-2084
SEQ ID NO.41
SEQ ID NO.42 TPP-2084之輕鏈(SEQ ID NO.41)和重鏈(SEQ ID NO.42)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-2077
SEQ ID NO.51
SEQ ID NO.52TPP-2077之輕鏈(SEQ ID NO.51)和重鏈(SEQ ID NO.52)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-1538
SEQ ID NO.61
SEQ ID NO.62TPP-1538之輕鏈(SEQ ID NO.61)和重鏈(SEQ ID NO.62)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-1854
SEQ ID NO.81
SEQ ID NO.82TPP-1854之輕鏈(SEQ ID NO.81)和重鏈(SEQ ID NO.82)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-1853
SEQ ID NO.91
SEQ ID NO.92 TPP-1853之輕鏈(SEQ ID NO.91)和重鏈(SEQ ID NO.92)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-1857
SEQ ID NO.101
SEQ ID NO.102TPP-1857之輕鏈(SEQ ID NO.101)和重鏈(SEQ ID NO.102)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
TPP-1858
SEQ ID NO.111
SEQ ID NO.112TPP-1858之輕鏈(SEQ ID NO.111)和重鏈(SEQ ID NO.112)的胺基酸序列；重鏈和輕鏈二者之CDR以加底線表示。
實例2：抗體之生化特性
以Biacore分析測定結合親和力：
抗-TWEAKR抗體的結合親和力係使用表面電漿共振分析於Biacore T100儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)上檢測。使用間接捕捉試劑抗-人類IgG(Fc)將抗體固定在CM5感應晶片上。如製造商說明，使用「人類抗體捕捉套組」之試劑(BR-1008-39,GE Healthcare Biacore,Inc.)。將10μg/ml濃度的抗-TWEAKR抗體以10μl/min注射10秒。
表AK-3： 用於親和力測量之重組的抗原(TWEAKR)列表
將各種濃度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、 3.12nM、1.56nM)的純化重組人類TWEAKR蛋白(TPP-2305,SEQ ID NO：168)之HEPES-EP緩衝劑溶液(GE Healthcare Biacore,Inc.)以60μl/min的流速注射在固定的抗-TWEAKR抗體歷時3分鐘，解離時間為5分鐘。線上參照柵元校正後產生感應圖，接著減去緩衝劑樣本。以結合(kon )和解離(koff )常數之比例為基準計算解離常數(KD )(藉由擬合感應圖使用1：1一級結合模型(first order binding model)所得來)。
測定出本發明抗體係以中度親和力(KD 10-200nM)與TWEAKR結合，然而某些比較性的抗體(例如PDL-192(TPP-1104)、136.1(TPP-2194)、 18.3.3(TPP-2193)、P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)、P2D3(TPP-2196)、ITEM-1,ITEM-4)顯示高親和力結合(0.7-3.7nM)。由專利文獻WO2009/020933及WO2009/140177得到抗體PDL-192、136.1、18.3.3、P4A8、P3G5和P2D3之可變區的序列，並加入編碼人類IgG1及鼠科IgG2恆定區的序列，產生全長的IgGs PDL-192(TPP-1104)、136.1(TPP-2194)、18.3.3(TPP-2193)、P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)、P2D3(TPP-2196)。本研究中所測量的親和力範圍與公開的數據充份吻合：就PDL-192、18.3.3及136.1，已公開的KD值為5.5,0.2及0.7nM(WO2009/020933)；就P4A8為2.6nM(WO2009/140177)。就比較而言：天然配體TWEAK係以0.8-2.4nM之KD 值與TWEAKR結合(Immunity.2001 Nov；15(5)：837-46；Biochem J.2006 Jul 15；397(2)：297-304；Arterioscler Thromb Vasc Biol.2003 Apr 1；23(4)：594-600)。
因此，可提出本發明之抗體(TPP-883、TPP-1538、TPP-2077、TPP-2084、TPP-2148、TPP-2093、TPP-2149及TPP-2090)係以中度親和力(KD 10-200nM)與TWEAKR結合。
使用TWEAKR膜外區域之N-及C-末端截斷變體定出TPP-2090結合表位的特性：
不同物種之TWEAKR富含半胱胺酸-區(胺基酸34-68)的比對(圖1-比對)顯示，在所有分析的6個物種中為非常保守。PDL-192結合係依賴R56(WO2009/020933：圖2B)而因此不會與大鼠、豬和小鼠的TWEAKR結合。TPP-2090結合係依賴保守的胺基酸D47，而因此與所有顯示的物種結合。
在第一個定性上文所提及的抗體之結合表位之方法中，產生一TWEAKR膜外區域之N-及C-端截斷的突變體並檢測其與各種抗-TWEAKR抗體之結合能力。刪除胺基酸28至33的N-端及胺基酸69至80刪除的C-端，使得在Cys36-Cys49、Cys52-Cys67及Cys55-Cys64之間帶有雙硫橋之 富含半胱胺酸-區仍為完整的(比較圖2)。二個結構，表現完整的外膜外區域28-80，包括N-及C-端及截斷的膜外區域34-68，並分別純化為Fc融合蛋白TPP-2202及TPP-2203。
就分析結合性，係塗覆上1μg/ml的對應二聚性TWEAKR Fc結構，及使用0.3μg/ml及0.08μg/ml的生物素化IgG作為可溶性結合夥伴。使用鏈黴親和素-HRP及Amplex Red基質進行偵測。使用約2-倍莫耳過量的生物素-LC-NHS(Pierce；型號21347)根據製造商的說明書將IgG生物素化並使用Zeba脫鹽管柱(Pierce；型號89889)脫鹽。在所有可溶性配體所使用的濃度，本發明之抗體顯示與二種結構飽和的結合，然而抗體P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)和Item-4僅與全長的膜外區域顯現飽和的結合，但與N-及C-端截斷的結合結合差(圖3 &圖4)。此項顯示出本發明抗體之結合表位係位於介在胺基酸34-68之富含半胱胺酸-區。就分析TWEAKR膜外區域的N-端或C-端是否為P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)結合所需，係產生一具有C-端刪除胺基酸69至80之單體膜外區域。P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)與C-端截斷的TWEAKR膜外區域之結合同樣很差，然而本發明抗體則顯示飽和的結合(圖5)。
因此，TPP-2090、TPP-2084、PDL-192(TPP-1104)和136.1(TPP-2194)在富含半胱胺酸-區之結合表位及P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)之結合表位係位於至少富含半胱胺酸-區的外面
TWEAKR-Fc突變蛋白對抗體親和力之效應
就更詳細地檢測本發明抗體之結合特性，係研究建議與已知的促效性抗體活性有關的特定TWEAKR突變蛋白(WO2009/140177)。就此，表現具有下列個別胺基酸取代之全長膜外區域(胺基酸28-80)並純化為Fc融合蛋白：T33Q；S40R；W42A；M50A；R56P；H60K；L65Q。
就得到劑量反應數據，係將不同的TWEAKR-Fc突變蛋白以低濃度(62ng/ml)塗覆在384-孔Maxisorb ELISA盤，及使用連續2-倍稀釋的生物素IgG，以100nM濃度開始，作為可溶性結合夥伴。使用鏈黴親和素-HRP及Amplex Red基質進行偵測。檢測的IgG為本發明之TPP-2090及TPP-2084，WO2009/020933之PDL-192、136.1和18.3.3，WO2009/140177之P4A8及P3G5，以及Nakayama等人[Biochem Biophys Res Com 306：819-825]之ITEM-1及ITEM-4。
使用約2-倍莫耳過量的生物素-LC-NHS(Pierce；型號21347)根據製造商的說明書將IgG生物素化並使用Zeba脫鹽管柱(Pierce；型號89889)脫鹽。擬合劑量-反應並測量IC50。就結果之說明，係製成一表格；“-“標示IC50 超過50nM，“+”標示IC50在1至150pM之範圍內。
如已公開的，ITEM-4顯示對H60K突變蛋白[WO2009/140177：圖23F]及PDL-192對R56P突變蛋白[WO2009/020933：圖22B]結合性差。與公開的資料相反，ITEM-1顯示對R56P，及所有的抗體對W42A[WO2009/140177：圖23E、圖23F]結合性差。這些差異可藉由所選的方法來解釋。
與ITEM-1、ITEM-4、PDL-192、136.1及18.3.3相反，本發明抗體之結合與所有的取代無關，但W42A除外。
富含半胱胺酸-區之丙胺酸掃描：
進行富含半胱胺酸-區(胺基酸34-68)之丙胺酸掃描，用以找出本發明抗體之結合位置。圖6顯示，TWEAKR全長膜外區域之N-及C-端截斷的變體並未惡化本發明抗體之結合。因此，結合表外係位於富含半胱胺酸-區。將下列取代導入TWEAKR(34-68)Fc結構中：S37A、R38A、S40A、S41A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A及L65A。
將這些TWEAKR(34-68)Fc突變蛋白表現在HEK293細胞。就得到劑量-反應數據，係將IgG以1μg/ml之濃度塗覆在384-孔Maxisorp ELISA盤，及使用包括TWEAK突變蛋白之連續2-倍稀釋的上清液作為可溶性結合夥伴。使用抗-HIS-HRP及Amplex Red進行偵測。受檢測的IgG為本發明之TPP-2090，WO2009/020933之PDL-192及WO2009/140177之P4A8。
就評估TWEAKR突變蛋白對於結合各種IgG之相關性，係製備一特定突變蛋白濃度的相關圖。例如，圖6顯示TWEAKR表現培養液之8-倍稀釋上清液之相關相作圖，其中PDL-192(TPP-1104)在X軸上及TPP-2090在Y軸上。圖中顯示，取代D47A，TPP-2090的結合變差，及取代R56A則PDL-192(TPP-1104)之結合變差。無任何結構顯示與P4A8(TPP-1324)結合，其與上面所得到的結果相符(圖6)。因此，P4A8表位係位於至少部份富含半胱胺酸-區的外面。就特定TWEAKR胺基酸對抗體相互作用之所鑑別的依賴性係與這些抗體所測的促效活性相關。天然的配體TWEAK顯示有效的活化TWEAKR且結合係依TWEAKR之富含半胱胺酸-區中的白胺酸46而定(Pellegrini等人，FEBS 280：1818-1829)。P4A8展現非常低的促效活性且至少部份與TWEAKR富含半胱胺酸-區外面的區域相互作用。PDL-192展現中度的促效活性且係依R56與富含半胱胺酸-區結合，但與TWEAK配體位置相反。TPP-2090及TWEAK結合分別係依賴D47及L46，且其因此係與類似的結合位置相結合(圖7)。
可結論出，本發明之抗體(例如TPP-2090)係以依賴D47之方式與TWEAKR結合。
所鑑別的特定TWEAKR胺基酸對抗體相互作用之依賴性係與這些抗體所測定的促效活性相關。天然的配體TWEAK顯示有效的活化TWEAKR且結合係依TWEAKR之富含半胱胺酸-區中的白胺酸46而定(Pellegrini等人，FEBS 280：1818-1829)。P4A8展現非常低的促效活性且至少部份與 TWEAKR富含半胱胺酸-區外面的區域相互作用。PDL-192展現中度的促效活性且係依賴R56與富含半胱胺酸-區結合，但與TWEAK配體位置相反。本發明抗體(實例TPP-2090)係以依賴D47之方式與TWEAKR結合，而TWEAK係以依賴L46之方式結合，及與類似，但不同的結合位置結合(圖7)。因此，展現強力的促效活性之本發明抗體係與一新穎的表位(D47-依賴)結合，就非常高促效活性有關的抗體。有趣地請注意，Michaelson等人(參見第369頁左欄，Michaelson JS等人，MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75)就該事實給予一解釋，所有受檢測的促效性抗體本身具有比天然配體TWEAK更弱的促效活性。其結論出，效力降低可能為抗體與TWEAKR之二聚性結合相互作用的功能，其中TWEAK可能進入三聚性相互作用。因此一令人驚訝的結果為，儘管與TWEAKR的二聚性相互作用，其仍具有一甚高的促效活性。此驚人的活性係與本發明抗體之專一性結合相關聯，亦即與TWEAKR的D47專一結合。
另外的實施例
1.帶有一或多個活性化合物分子之結合子或其衍生物的接合物，該活性化合物分子為一經由連接子L連接結合子之紡錘體驅動蛋白抑制劑。
2.根據第1項之接合物，其中該結合子或其衍生物為一結合子胜肽或蛋白或結合子胜肽或蛋白之衍生物。
3.根據第2項之接合物，其中各活性化合物分子係經由連接子與結合子胜肽或蛋白或其衍生物之不同的胺基酸相連接。
4.根據一或多項前述項目之接合物，其中該接合物之每個結合子具有平均1.2至20個活性化合物分子。
5.根據第2至4項中一或多項之接合物，其中該結合子胜肽或蛋白係代表一抗體或結合子胜肽或蛋白之衍生物或。
6.根據一或多項前述項目之接合物，其中該結合子係與癌症標靶分子結合。
7.根據第6項之接合物，其中該結合子係與胞外標靶分子結合。
8.根據第7項之接合物，其中該結合子，在與胞外標靶分子結合後，被內化並經表現標靶分子之細胞於胞內(較佳地溶酶體)處理。
9.根據一或多項2至8項之接合物，其中該結合子胜肽或蛋白為人類、人源化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段。
10.根據第9項之接合物，其中該結合子胜肽或蛋白為一抗-HER2抗體、抗-EGFR抗體、抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段。
11.根據第10項之接合物，其中該抗-TWEAKR抗體係專一與TWEAKR(SEQ ID NO：169)位置47的胺基酸(D47)結合，較佳地抗-TWEAKR抗體TPP-2090。
12.根據前述項目中一或多項之接合物，其中該紡錘體驅動蛋白抑制劑係具有下列基礎結構： 其中#a係代表連接分子其餘部分之鍵；R1a 係代表H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立 地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要係經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 及R4a 相互獨立地係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 及R4a 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、NH2 、COOH、SO3 H、SH或OH，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；其中該紡錘體驅動蛋白抑制劑係藉由在R1a 、R2a 、R4a 或在R2a 及R4a 所形成的吡咯啶之氫原子取代與連接子相連，及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
13.根據前述項目中一或多項之接合物，其中該紡錘體驅動蛋白抑制劑係以通式(I)表示： 其中R1a 係代表H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或 -(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2a 及R4a 相互獨立地係代表H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2a 及R4a 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表H、SO3 H、NH2 、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；R3a 係代表一視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基或雜環烷基基團，較佳地C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基-或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(其各自可具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH (其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R8a 係代表C1-10 -烷基；HZ係代表單-或雙環雜環，其可經一或多個由下列組成之群中選出的取代基取代：鹵素、C1-10 -烷基基團、C6-10 -芳基基團及C6-10 -芳烷基基團其可視需要經鹵素取代；其中該紡錘體驅動蛋白抑制劑係藉由在R1a 、R2a 、R4a 、R8a 或在R2a 及R4a 所形成的吡咯啶之氫原子取代與連接子相連，及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
14.根據前述項目中一或多項之接合物，其中該活性化合物分子連接子係以通式(II)表示： 其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C；或X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表CH，X2 係代表C而X3 係代表N；或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C；或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表CR1 係代表H、-L-#1或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或 -CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 及R4 相互獨立地係代表-L-#1、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 及R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-#1或視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基或雜環烷基基團，較佳地-L-#1或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基、C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10- 烷基-O-C6-10 -芳基-或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(其各自可具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相 互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-#1、H、F、NH2 、NO2 、鹵素、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、OY3 、-SY3 、鹵素、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中取代基R1 、R2 、R3 、R4 及R5 之一係代表-L-#1，L係代表連接子而#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵，R6 及R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基或鹵素，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
15.根據第14項之接合物，其中R1 係代表-L-#1、H、-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-CO-NY1 Y2 、NHY3 、OY3 、-SY3 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 及R4 相互獨立地係代表-L-#1、-CO-CHY4 -NHY5 或H或R2 及R4 共 同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -，其中R10 係代表H、-L-#1、NH2 、COOH、SH、OH或SO3 H，其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO，R3 係代表-(CH2 )OH或-L-#1，及R5 係代表-L-#1或H，其中取代基R1 、R2 、R3 、R4 及R5 之一係代表-L-#1。
16.根據第14或15項之接合物，其中R6 及R7 相互獨立地係代表H、C1-3 -烷基或鹵素。
17.根據第14至16項中一或多項之接合物，其中R8 係代表C1-4 -烷基(較佳地第三丁基)。
18.根據第14至17項中一或多項之接合物，其中R9 係代表H。
19.根14至18項中一或多項之接合物，其中R6 及R7 係代表F。
20.根據前述項目中一或多項之接合物，其中該連接子-L-具有下列(i)至(iv)基礎結構之一：(i)-(CO)m -SG1-L1-L2-(ii)-(CO)m -L1-SG-L1-L2-(iii)-(CO)m -L1-L2-(iv)-(CO)m -L1-SG-L2其中m為0或1，SG及SG1為活體內可裂解基團，L1相互獨立地係代表活體內不可裂解之有機基團，及L2係代表連接結合子之偶合基團。
21.根據第20項之接合物，其中該活體內可裂解的基團SG為一2-8寡肽基團，較佳地二肽或二硫化物、腙、縮醛或縮醛胺而SG1為一2-8寡肽基 團，較佳地二肽基團。
22.根據第2至21項中一或多項之接合物，其中該連接子係與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基相連接，並具有下列化學式：§-(CO)m-L1-L2-§§ 其中m為0或1；§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，及-L2-係代表 其中#1 係代表結合子之硫原子的連接點，#2 係代表L1 基團的連接點，L1係代表-(NR10 )n-(G1)o-G2-，其中R10 係代表H、NH2 或C1 -C3 -烷基；G1係代表-NHCO-或；N為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有 1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2 -(較 佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，或代表下列基團之一： 其中Rx係代表H、C1 -C3 -烷基或苯基。
23.根據第22項之接合物，其中該烴基鏈係插入其中一個下列基團： 其中X係代表H或C1-10 -烷基基團，其視需要可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、NH2 、-NH-CNNH2 、碸、亞碸或磺酸取代。
24.根據第22項之接合物，其中該連接子具有下列化學式： 其中#3係代表連接活性化合物分子之鍵，#4係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，R11 係代表H或NH2 ；B係代表-[(CH2 )x -(X4 )y ]w -(CH2 )z -，w=0至20；x=0至5；x=0至5；y=0或1；z=0至5；及 X4 係代表-O-、-CONH-或-NHCO-。
25.根據第24項之接合物，其中R1 或R4 係代表-L-#1。
26.根據第21至25項中一或多項之接合物，其中該接合物具有下列化學式之一： 其中X1 、X2 及X3 具有如同第14項中之相同意義，AK1 係代表結合子胜肽或蛋白，其係經由結合子之硫原子相連接；n係代表1至20之數字；及L1係代表視需要具有1至70個碳原子之支鏈烴基基團，其係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、 O及S，或-SO-或-SO2 -(較佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，及SG1為2-8寡肽，較佳地二肽；L4為一單鍵或-(CO)y -G4-基團，其中y係代表0或1，及G4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、 -SO2 NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2 -(較佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
27.根據一或多項1至21項之接合物，其中該連接子-L-係與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基相連接並具有下列化學式： 其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，m為0、1、2或3；n為0、1或2；p為0至20；及L3係代表 其中o為0或1；及G3係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH- 及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-、-SO-或-SO2 -(較佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、碸、亞碸或磺酸取代。
28.根據第27項之接合物，其中該連接子-L-係與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基相連接並具有下列化學式： 其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，m為1；p為0；n為0；及L3係代表 其中o為0或1；及G3係代表-(CH2 CH2 O)s (CH2 )t (CONH)u (CH2 CH2 O)v (CH2 )w -，其中s、t、v及w各自相互獨立地為0至20而u為0或1。
29.根據第27或28項之接合物，其中R2 或R3 係代表-L-#1。
30.根據第29項之接合物，其中該接合物具有下列化學式之一： 其中 X1 、X2 及X3 具有如同第14項中之相同意義，AK1 係代表結合子胜肽或蛋白，其係經由結合子之硫原子相連接；n係代表1至20之數字；及L2及L3係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2 -(較佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
31.根據第1至21項中一或多項之接合物，其中該連接子-L-係與離胺酸側鏈相連接並具有下列化學式：-§-(SG)x -L4-CO-§§ 其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，x係代表0或1，SG係代表可裂解基團，較佳地2-8寡肽，特佳地二肽，及L4係代表一單鍵或-(CO)y -G4-基團，其中y係代表0或1，及G4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子： N、O及S，或-SO-(較佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
32.根據第31項之結合子胜肽或蛋白的接合物，其中該接合物具有下列化學式之一： 其中X1 、X2 及X3 具有如同第14項中之相同意義，AK2 係代表結合子胜肽或蛋白，其係經由結合子之硫原子相連接；n係代表1至20之數字；及L4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之視需要直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2 、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2 NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH- 及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2 -(較佳地)，其中該側鏈，若存在，可經-NHCONH2 、-COOH、-OH、-NH2 、NH-CNNH2 、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，及SG1係代表可裂解基團，較佳地2-8寡肽，較佳地二肽。
33.根據第10至32項中一或多項之接合物，其中該抗-TWEAKR抗體為一促效性抗體。
34.根據第10至33項中一或多項之接合物，其係包括：一可變重鏈，其包括：a.一重鏈之CDR1，其係由包括式PYPMX(SEQ ID NO：171)之胺基酸序列所編碼，其中X為I或M；b.一重鏈之CDR2，其係由包括式YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO：172)之胺基酸序列所編碼，其中X為S或K；及c.一重鏈之CDR3，其係由包括式GGDTYFDYFDY(SEQ ID NO：173)之胺基酸序列所編碼；及一可變輕鏈，其包括：d.一輕鏈之CDR1，其係由包括式RASQSISXYLN(SEQ ID NO：174)之胺基酸序列所編碼，其中X為G或S；e.一輕鏈之CDR2，其係由包括式XASSLQS(SEQ ID NO：175)之胺基酸序列所編碼，其中X為Q、A或N；及f.一輕鏈之CDR3，其係由包括式QQSYXXPXIT(SEQ ID NO：176)之胺基酸序列所編碼，其中在位置5的X為T或S，在位置6的X為T或S及在位置8的X為G或F。
35.根據第10至34項中一或多項之接合物，其包括：a.一如SEQ ID NO：10所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO： 9所示之輕鏈的可變序列，或b.一如SEQ ID NO：20所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：19所示之輕鏈的可變序列，或c.一如SEQ ID NO：30所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：29所示之輕鏈的可變序列，或d.一如SEQ ID NO：40所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：39所示之輕鏈的可變序列，或e.一如SEQ ID NO：50所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：49所示之輕鏈的可變序列，或f.一如SEQ ID NO：60所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：59所示之輕鏈的可變序列，或g.一如SEQ ID NO：70所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：69所示之輕鏈的可變序列，或h.一如SEQ ID NO：80所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：79所示之輕鏈的可變序列，或i.一如SEQ ID NO：90所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：89所示之輕鏈的可變序列，或j.一如SEQ ID NO：100所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：99所示之輕鏈的可變序列，或k.一如SEQ ID NO：110所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：109所示之輕鏈的可變序列，或l.一如SEQ ID NO：120所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：119所示之輕鏈的可變序列。
36.根據第10至35項中一或多項之接合物，其中該抗體為一IgG抗體。
37.根據第10至36項中一或多項之接合物，其包括：a.一如SEQ ID NO：2所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：1 所示之輕鏈的序列，或b.一如SEQ ID NO：12所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：11所示之輕鏈的序列，或c.一如SEQ ID NO：22所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：21所示之輕鏈的序列，或d.一如SEQ ID NO：32所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：31所示之輕鏈的序列，或e.一如SEQ ID NO：42所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：41所示之輕鏈的序列，或f.一如SEQ ID NO：52所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：51所示之輕鏈的序列，或g.一如SEQ ID NO：62所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：61所示之輕鏈的序列，或h.一如SEQ ID NO：72所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：71所示之輕鏈的序列，或i.一如SEQ ID NO：82所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：81所示之輕鏈的序列，或j.一如SEQ ID NO：92所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：91所示之輕鏈的序列，或k.一如SEQ ID NO：102所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：101所示之輕鏈的序列，或l.一如SEQ ID NO：112所示之重鏈的序列，以及一如SEQ ID NO：111所示之輕鏈的序列。
38.根據前述項目中一或多項之紡錘接合物，其中該接合物具有每個結合子胜肽或蛋白1至10個，較佳地2至8個活性化合物分子。
39.用於製備根據第26或30項之接合物的方法，其中下列化學式之一的化 合物，較佳地以其三氟乙酸鹽之形式，係與結合子胜肽或蛋白的半胱胺酸殘基相連接，而該結合子胜肽或蛋白係視需要事先經部份還原，其中該化合物較佳地係以相對於結合子胜肽或蛋白2-至12-倍莫耳過量來運用： 其中R係代表-H或-COOH，其中K係代表直鏈或支鏈視需要經C1 -C6 -烷氧基或-OH-C1 -C6 -烷基取代，其其中X1 、X2 、X3 、SG1、L1、L2、L3及L4具有如同第26或30項中之相同意義。
40.用於製備根據第32項之接合物的方法，其中下列化學式之一的化合物，較佳地以其三氟乙酸鹽之形式，係與結合子胜肽或蛋白的離胺酸殘基相 連接，其中該化合物較佳地係以相對於結合子胜肽或蛋白2-至12-倍莫耳過量來運用： 其中X1 、X2 、X3 、SG1及L4具有如同第32項中之相同意義。
41.下列化學式之一的化合物： 其中R係代表-H或-COOH，其中K係代表直鏈或支鏈視需要經C1 -C6 -烷氧基或-OH-C1 -C6 -烷基取代，及其中X1 、X2 、X3 、SG1、L1、L2、L3及L4具有如同第26、30或32項中之相同意義。
42.通式(III)之化合物： 其中X1 係代表N，X2 係代表N而X3 係代表C，或X1 係代表CH，X2 係代表C而X2 係代表N或X1 係代表NH，X2 係代表C而X3 係代表C，或X1 係代表CH，X2 係代表N而X3 係代表C；R1 係代表-L-BINDER、H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH；其中W係代表H或OH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 及R4 相互獨立地係代表-L-BINDER、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z，或R2 及R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H 或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-BINDER或視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團，較佳地-L-#1，或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-BINDER、H、F、NH2 、NO2 、鹵素、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中L係代表連接子及BINDER係代表結合子或其衍生物，其中結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連接，R6 及R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基或鹵素，R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或視需要經取代氧呾；及R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ； 及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
43.通式(IV)之化合物： 其中X1 係代表N，X2 係代表C而X3 係代表N；R1 係代表-L-BINDER、H或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、-NHY3 、-OY3 、-SY3 、鹵素、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 、-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘或-CH(CH2 W)Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、NH2 、SO3 H、COOH、-NH-CO-CH2 -CH2 -CH(NH2 )COOH或-(CO-NH-CHY4 )1-3 COOH；其中W係代表H或OH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代；R2 及R4 相互獨立地係代表-L-BINDER、H、-CO-CHY4 -NHY5 或-(CH2 )0-3 Z或R2 及R4 共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2 -CHR10 -或-CHR10 -CH2 -，其中R10 係代表L-#1、H、NH2 、SO3 H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中Y4 相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代，及Y5 係代表H或-CO-CHY6 -NH2 ，其中Y6 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基；A係代表CO、SO、SO2 、SO2 NH或CNNH；R3 係代表-L-BINDER或視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基或雜環烷基基團，較佳地-L-#1或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基、C6-10 -芳烷基、C5-10 -雜烷基、C1-10 -烷基-O-C6-10 -芳基-或C5-10 -雜環烷基基團，其可經1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基基團(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基基團、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基基團、1-3個-O-CO-烷基基團、1-3個-O-CO-NH-烷基基團、1-3個-NH-CO-烷基基團、1-3個-NH-CO-NH-烷基基團、1-3個-S(O)n -烷基基團、1-3個-SO2 -NH-烷基基團、1-3個-NH-烷基基團、1-3個-N(烷基)2 基團、1-3個-NH2 基團或1-3個-(CH2 )0-3 Z基團取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘及Y3 係代表H、-(CH2 )0-3 -CH(NHCOCH3 )Z‘、-(CH2 )0-3 -CH(NH2 )Z‘或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH，(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)；R5 係代表-L-BINDER、H、F、NH2 、NO2 、鹵素、SH或-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘，及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH；其中L係代表連接子及BINDER係代表結合子或其衍生物，其中結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連接，R6 及R7 相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C2-10 -烯基、(視需要氟化)C2-10 -炔基、羥基或鹵素， R8 係代表(視需要氟化)C1-10 -烷基、(視需要氟化)C4-10 -環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9 係代表H、F、CH3 、CF3 、CH2 F或CHF2 ；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類；其限制條件為R1 、R2 及R4 不能同時係代表H。
44.根據第43項之化合物，其中Z係代表Cl或Br。
45.根據第43項之化合物，其中R1 係代表-(CH2 )0-3 Z，其中Z係代表-CO-NY1 Y2 ，其中Y2 係代表-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z‘及Y1 係代表H、NH2 或-(CH2 CH2 O)0-3 -(CH2 )0-3 Z’。
46.根據第43-44項中一或多項之化合物，其中Y1 係代表H，Y2 係代表-(CH2 CH2 O)3 -CH2 CH2 Z‘及Z‘係代表-COOH。
47.根據第43-44項中一或多項之化合物，其中Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘及Z‘係代表-(CONHCHY4 )2 COOH。
48.根據第47項之化合物，其中Y4 係代表直鏈或支鏈C1-6 -烷基，其視需要經-NHCONH2 取代。
49.根據第48項之化合物，其中至少一個Y4 代表基係由異 -丙基及-CH3 組成之群中選出。
50.根據第43及45項中一或多項之化合物，其中Y1 係代表H，Y2 係代表-CH2 CH2 Z‘，Z‘係代表-CONHCHY4 COOH及Y4 係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2 取代。
51.根據第50項之化合物，其中Y4 係代表胺基苯甲基。
52.根據第43項之化合物，其中R2 係代表-(CH2 )0-3 Z及Z係代表-SY3 。
53.根據第43項之化合物，其中R4 係代表-CO-CHY4 -NHY5 及Y5 係代表H。
54.根據第43項之化合物，其中R4 係代表-CO-CHY4 -NHY5 及Y5 係代表-CO-CHY6 -NH2 。
55.根據第53及54項中一或多項之化合物，其中Y4 係代表直鏈或支鏈C1-6 - 烷基，其視需要經-NHCONH2 取代。
56.根據第43至55項中一或多項之化合物，其中該化合物具有下列化學式之一：(15S,19R)-15-胺基-19-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-羥乙醯基-20,20-二甲基-14-側氧-4,7,10-三氧雜-13,18-二氮雜二十一烷-1-酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5 -胺甲醯基-L-鳥胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-4-胺基-L-苯丙胺酸；N-{(1R)-1-[1-(3-胺基苯甲基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-胺基丙基)-2-羥基乙醯胺(1：1)；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸；N-[(3S)-3-胺基-4-肼基-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)；N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二胺基丁基]-2-羥基乙醯胺(1：1)；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸；(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯胺(2：1)；(1-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸；N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)；4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺(2：1)；N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)；L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)；L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)。
57.一種醫藥組成物，係包括根據第1至38項中一或多項之接合物，或根據第42-56項之化合物與一惰性無毒醫藥上適合的佐劑組合。
58.根據第1至38項中一或多項之接合物，或根據第42-56項之化合物，係用於治療及/或預防疾病的方法中。
59.根據第1至38項中一或多項之接合物，或根據第42-56項之化合物，係用於治療過度增生及/或血管新生病症的方法中。
60.根據第1至38項中一或多項之接合物，或根據第42-56項之化合物，其中R3a 或R3 係代表-L-BINDER或經取代之烷基、芳基或雜芳基基團，較佳地-L-#1或C1-10 -烷基、C6-10 -芳基或C6-10 -芳烷基基團或C5-10 -雜烷基，其可經-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n -烷基、SO2 -NH-烷基、NH-烷基、 N(烷基)2 、NH2 或-(CH2 )0-3 Z取代，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3 、-SY3 、-NHY3 、-CO-NY1 Y2 或-CO-OY3 ，其中Y1 及Y2 相互獨立地係代表H、NH2 或-(CH2 )0-3 Z‘及Y3 係代表H或-(CH2 )0-3 Z‘，其中Z‘係代表H、SO3 H、NH2 或COOH，(其中「烷基」較佳地係代表C1-10 -烷基)。
61.使用一有效量之至少一種根據第1至38項中一或多項之接合物或根據第42-56項之化合物供治療及/或預防人類及動物過度增生及/或血管新生病症的方法。
<110> Bayer Pharma AG
<120> 具有KSP-抑制劑的結合子-接合物(ACD)
<130> 173 506
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<213> 智人
<400> 216
<210> 217
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人
<400> 217
<210> 218
<211> 1255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 218
<210> 219
<211> 297
<212> PRT
<213> 智人
<400> 219
<210> 220
<211> 595
<212> PRT
<213> 智人
<400> 220
<210> 221
<211> 847
<212> PRT
<213> 智人
<400> 221
<210> 222
<211> 364
<212> PRT
<213> 智人
<400> 222
<210> 223
<211> 572
<212> PRT
<213> 智人
<400> 223
<210> 224
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 224
<210> 225
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
<210> 226
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
<210> 227
<211> 557
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
<210> 228
<211> 273
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
<210> 229
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
<210> 230
<211> 1048
<212> PRT
<213> 智人
<400> 230
<210> 231
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人
<400> 231
<210> 232
<211> 750
<212> PRT
<213> 智人
<400> 232
<210> 233
<211> 976
<212> PRT
<213> 智人
<400> 233
<210> 234
<211> 668
<212> PRT
<213> 智人
<400> 234
<210> 235
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組成
<400> 235
<210> 236
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組成
<400> 236
<210> 237
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組成
<400> 237
<210> 238
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組成
<400> 238
<210> 239
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組成
<400> 239
<210> 240
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體組成
<400> 240

Claims (40)

  1. 一種具有一或多個活性化合物分子之結合子或其衍生物的接合物，其中該結合子或其衍生物為人類、人源化或嵌合單株抗體，其衍生物包含一半胱胺酸殘基或離胺酸殘基，該活性化合物分子為一經由連接子L與結合子相連接之紡錘體驅動蛋白抑制劑，其中該紡錘體驅動蛋白抑制劑係具有下式(IIa)：
    Figure TWI650136B_C0001
    其中X1係代表N，X2係代表N而X3係代表C；或X1係代表CH或CF，X2係代表C而X3係代表N；或X1係代表NH，X2係代表C而X3係代表C；或X1係代表CH，X2係代表N而X3係代表C；R1係代表H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、NH2、SO2H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代；R2係代表-L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2及R4共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10係代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH，或OH；其中Z係代表-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代，及Y5係代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基；R4係代表-L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代，及Y5係代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基；或R2及R4共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10係代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；A係代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；R3係代表-L-#1、-MOD或視需要經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團；R5係代表-L-#1、H、NH2、NO2、鹵素、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、-OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；R6及R7相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C2-10-烯基、(視需要氟化)C2-10-炔基、羥基、NO2、NH2、COOH或鹵素，R8係代表(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C2-10-烯基、(視需要氟化)C2-10-炔基、(視需要氟化)C4-10-環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2係代表4-至7-員雜環，其具有至高二個選自N、O和S組成之群的雜原子，其中各基團可經-OH、CO2H或NH2或-L-#1取代；其中有1個或無任何R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10取代基係代表或(就R8的情況)含有-L-#1，L係代表連接子及#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵，R9係代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；其中-MOD係代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中R10係代表H或C1-C3-烷基；G1係代表-NHCO-、-CONH-或
    Figure TWI650136B_C0002
    (其中，若G1係代表-NHCO-或
    Figure TWI650136B_C0003
    ，則R10不代表NH2)；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一直鏈及/或支鏈烴基基團，其具有1至10個碳原子且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry係代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx係代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
  2. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該活性化合物分子連接子係以通式(II)表示：
    Figure TWI650136B_C0004
    其中X1係代表N，X2係代表N而X3係代表C；或X1係代表CH，X2係代表C而X3係代表N；或X1係代表NH，X2係代表C而X3係代表C；或X1係代表CH，X2係代表N而X3係代表C；R1係代表H、-L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W係代表H或OH，其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代；R2及R4相互獨立地係代表-L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2及R4共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10係代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代，及Y5係代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基；A係代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；R3係代表-L-#1或視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基或雜環烷基基團，R5係代表-L-#1、H、F、NH2、NO2、鹵素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中取代基R1、R2、R3、R4及R5之一係代表-L-#1，L係代表連接子及#1係代表連接結合子或其衍生物之鍵，R6及R7相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C2-10-烯基、(視需要氟化)C2-10-炔基、羥基或鹵素，R8係代表(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C4-10-環烷基或視需要經取代之氧呾(oxetane)；及R9係代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
  3. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該接合物具有每個結合子平均1.2至20個活性化合物分子。
  4. 如申請專利範圍第4項之接合物，其中其中該結合子或其衍生物為一抗體或結合子胜肽或蛋白之衍生物
    Figure TWI650136B_C0005
    或
    Figure TWI650136B_C0006
    。
  5. 如申請專利範圍第4項之接合物，其中該結合子或其衍生物為一抗-HER2抗體、抗-EGFR抗體、抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段。
  6. 如申請專利範圍第5項之接合物，其中該抗-TWEAKR抗體係專一與TWEAKR(SEQ ID NO：169)的位置47胺基酸D(D47)結合。
  7. 如申請專利範圍第5項之接合物，其中該結合子為一抗-EGFR抗體及R3係代表-L-#1。
  8. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該連接子-L-具有下列(i)至(iv)基礎結構之一：(i)-(CO)m-SG1-L1-L2- (ii)-(CO)m-L1-SG-L1-L2- (iii)-(CO)m-L1-L2- (iv)-(CO)m-L1-SG-L2其中m為0或1，SG及SG1為活體內可裂解基團，L1相互獨立地係代表活體內不可裂解之有機基團，及L2係代表連接結合子之偶合基團。
  9. 如申請專利範圍第8項之接合物，其中該活體內可裂解的基團SG為一2-8寡肽基團、腙、縮醛或縮醛胺，而SG1為一2-8寡肽基團。
  10. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該連接子係與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基相連接，並具有下列化學式：§-(CO)m-L1-L2-§§其中m為0或1；§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，及-L2-係代表
    Figure TWI650136B_C0007
    其中#1係代表與結合子之硫原子的連接點，#2係代表L1基團的連接點，L1係代表-(NR10)n-(G1)o-G2-，其中R10係代表H、NH2或C1-C3-烷基；G1係代表-NHCO-或
    Figure TWI650136B_C0008
    ；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-，其中該側鏈，若存在時，可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，或代表下列基團之一：
    Figure TWI650136B_C0009
    其中Rx係代表H、C1-C3-烷基或苯基。
  11. 如申請專利範圍第10項之接合物，其中L2係以下列化學式之一或二者來表示：
    Figure TWI650136B_C0010
    其中#1係代表與結合子之硫原子的連接點，#2係代表與L1基團的連接點，R22係代表COOH及80%以上(以連接子與結合子相連接之總鍵數為基準)連接結合子之硫原子的鍵係以這二種結構之一存在。
  12. 如申請專利範圍第10項之接合物，其中該連接子具有下列化學式：
    Figure TWI650136B_C0011
    其中#3係代表連接活性化合物分子之鍵，#4係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，R11係代表H或NH2；B係代表-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，w=0至20；x=0至5；x=0至5；y=0或1；z=0至5；及X4係代表-O-、-CONH-或-NHCO-
    Figure TWI650136B_C0012
    。
  13. 如申請專利範圍第10項之接合物，其中該接合物具有下列化學式之一：
    Figure TWI650136B_C0013
    Figure TWI650136B_C0014
    Figure TWI650136B_C0015
    Figure TWI650136B_C0016
    其中X1、X2及X3具有如申請專利範圍第10項中之相同意義，AK1係代表結合子胜肽或蛋白，其係經由結合子之硫原子相連接；n係代表1至20之數字；及L1係代表視需要具有1至70個碳原子之支鏈烴基基團，其係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S，或-SO-或-SO2-，及SG1為一2-8寡肽；L4為一單鍵或-(CO)y-G4-基團，其中y係代表0或1，及G4係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S，或-SO-或-SO2-。
  14. 一種具有一或多個活性化合物分子之結合子或其衍生物的接合物，其中該接合物具有下列化學式之一或二者：
    Figure TWI650136B_C0017
    其中AK1A係代表結合子胜肽或蛋白，其係經由結合子之硫原子相連接；n係代表1至20之數字；及L1係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-。
  15. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該連接子-L-係與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基相連接並具有下列化學式：
    Figure TWI650136B_C0018
    其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，m為0、1、2或3；n為0、1或2；p為0至20；及L3係代表
    Figure TWI650136B_C0019
    其中o為0或1；及G3係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次直鏈或支鏈：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-SO-或-SO2-。
  16. 如申請專利範圍第15項之接合物，其中該連接子-L-係與半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基相連接並具有下列化學式：
    Figure TWI650136B_C0020
    其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，m為1；p為0；n為0；及L3係代表
    Figure TWI650136B_C0021
    其中o為0或1；及G3係代表-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)u(CH2CH2O)v(CH2)w-，其中s、t、v及w各自相互獨立地為0至20而u為0或1。
  17. 如申請專利範圍第15項之接合物，其中R2或R3係代表-L-#1。
  18. 如申請專利範圍第17項之接合物，其中該接合物係具有下列化學式之一：
    Figure TWI650136B_C0022
    Figure TWI650136B_C0023
    Figure TWI650136B_C0024
    其中X1、X2及X3具有如申請專利範圍第17項中之相同意義，AK1係代表結合子胜肽或蛋白，其係經由結合子之硫原子相連接；n係代表1至20之數字；及L2和L3係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-。
  19. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中該連接子-L-係與離胺酸側鏈相連接並具有下列化學式：-§-(SG)x-L4-CO-§§其中§係代表連接活性化合物分子之鍵及§§係代表連接結合子胜肽或蛋白之鍵，x係代表0或1，SG係代表可裂解基團，及L4係代表一單鍵或-(CO)y-G4-基團，其中y係代表0或1，及G4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S，或-SO-。
  20. 如申請專利範圍第19項之接合物，其中該接合物具有下列化學式之一：
    Figure TWI650136B_C0025
    其中X1、X2及X3具有如申請專利範圍第19項中之相同意義，AK2係代表結合子胜肽或蛋白，其係經由結合子之硫原子相連接；n係代表1至20之數字；及L4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之視需要直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-，及SG1係代表可裂解基團，。
  21. 如申請專利範圍第5項之接合物，其中該抗-TWEAKR抗體為一促效性抗體。
  22. 如申請專利範圍第5項之接合物，其係包括：一可變重鏈，其包含：a.一重鏈之CDR1，其係由包含式PYPMX(SEQ ID NO：171)之胺基酸序列所編碼，其中X為I或M；b.一重鏈之CDR2，其係由包含式YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO：172)之胺基酸序列所編碼，其中X為S或K；及c.一重鏈之CDR3，其係由包含式GGDTYFDYFDY(SEQ ID NO：173)之胺基酸序列所編碼；及一可變輕鏈，其包含：d.一輕鏈之CDR1，其係由包含式RASQSISXYLN(SEQ ID NO：174)之胺基酸序列所編碼，其中X為G或S；e.一輕鏈之CDR2，其係由包含式XASSLQS(SEQ ID NO：175)之胺基酸序列所編碼，其中X為Q、A或N；及f.一輕鏈之CDR3，其係由包含式QQSYXXPXIT(SEQ ID NO：176)之胺基酸序列所編碼，其中在位置5之X為T或S，在位置6之X為T或S及在位置8之X為G或F。
  23. 如申請專利範圍第5項之接合物，其包含：a.一如SEQ ID NO：10所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：9所示之輕鏈的可變序列，或b.一如SEQ ID NO：20所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：19所示之輕鏈的可變序列，或c.一如SEQ ID NO：30所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：29所示之輕鏈的可變序列，或d.一如SEQ ID NO：40所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：39所示之輕鏈的可變序列，或e.一如SEQ ID NO：50所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：49所示之輕鏈的可變序列，或f.一如SEQ ID NO：60所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：59所示之輕鏈的可變序列，或g.一如SEQ ID NO：70所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：69所示之輕鏈的可變序列，或h.一如SEQ ID NO：80所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：79所示之輕鏈的可變序列，或i.一如SEQ ID NO：90所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：89所示之輕鏈的可變序列，或j.一如SEQ ID NO：100所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：99所示之輕鏈的可變序列，或k.一如SEQ ID NO：110所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：109所示之輕鏈的可變序列，或l.一如SEQ ID NO：120所示之重鏈的可變序列，以及一如SEQ ID NO：119所示之輕鏈的可變序列。
  24. 如申請專利範圍第5項之接合物，其中該抗體為一IgG抗體。
  25. 如申請專利範圍第5項之接合物，其包含：a.一如SEQ ID NO：2所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列，或b.一如SEQ ID NO：12所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：11所示之輕鏈序列，或c.一如SEQ ID NO：22所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：21所示之輕鏈序列，或d.一如SEQ ID NO：32所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：31所示之輕鏈序列，或e.一如SEQ ID NO：42所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：41所示之輕鏈序列，或f.一如SEQ ID NO：52所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：51所示之輕鏈序列，或g.一如SEQ ID NO：62所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：61所示之輕鏈序列，或h.一如SEQ ID NO：72所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：71所示之輕鏈序列，或i.一如SEQ ID NO：82所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：81所示之輕鏈序列，或j.一如SEQ ID NO：92所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：91所示之輕鏈序列，或k.一如SEQ ID NO：102所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：101所示之輕鏈序列，或l.一如SEQ ID NO：112所示之重鏈序列，以及一如SEQ ID NO：111所示之輕鏈序列。
  26. 一種用於製備如申請專利範圍第13項之接合物的方法，其中下列化學式之一的化合物係與結合子胜肽或蛋白的半胱胺酸殘基相連接，而該結合子胜肽或蛋白係視需要事先經部份還原：
    Figure TWI650136B_C0026
    Figure TWI650136B_C0027
    Figure TWI650136B_C0028
    Figure TWI650136B_C0029
    Figure TWI650136B_C0030
    其中R係代表-H或-COOH，其中K係代表直鏈或支鏈，其視需要經C1-C6-烷氧基或-OH-C1-C6-烷基取代，及其中X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3及L4具有如申請專利範圍第13項中之相同意義。
  27. 一種用於製備如申請專利範圍第26項之接合物的方法，其中下列化學式之一的化合物係與結合子胜肽或蛋白的離胺酸殘基相連接：
    Figure TWI650136B_C0031
    其中X1係代表N，X2係代表N而X3係代表C；或X1係代表CH或CF，X2係代表C而X3係代表N；或X1係代表NH，X2係代表C而X3係代表C；或X1係代表CH，X2係代表N而X3係代表C；SG1係代表可裂解基團；及L4係代表一單鍵或-(CO)y-G4-基團，其中y係代表0或1，及G4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S，或-SO-。
  28. 一種下式之化合物：
    Figure TWI650136B_C0032
    Figure TWI650136B_C0033
    Figure TWI650136B_C0034
    Figure TWI650136B_C0035
    Figure TWI650136B_C0036
    其中R係代表-H或-COOH，其中K係代表直鏈或支鏈視需要經C1-C6-烷氧基或-OH C1-C6-烷基取代，及其中X1係代表N，X2係代表N而X3係代表C；或X1係代表CH或CF，X2係代表C而X3係代表N；或X1係代表NH，X2係代表C而X3係代表C；或X1係代表CH，X2係代表N而X3係代表C；L1係代表-(NR10)n-(G1)o-G2-，其中R10係代表H、NH2或C1-C3-烷基；G1係代表-NHCO-或
    Figure TWI650136B_C0037
    ；n為0或1；o為0或1；及G2係代表一來自伸芳基及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-，其中該側鏈，若存在時，可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，或代表下列基團之一：
    Figure TWI650136B_C0038
    其中Rx係代表H、C1-C3-烷基或苯基；L2係以下列化學式之一或二者來表示：
    Figure TWI650136B_C0039
    其中#1係代表與結合子之硫原子的連接點，#2係代表與L1基團的連接點，R22係代表COOH及80%以上(以連接子與結合子相連接之總鍵數為基準)連接結合子之硫原子的鍵係以這二種結構之一存在；L3係代表
    Figure TWI650136B_C0040
    其中o為0或1；及G3係代表一來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次直鏈或支鏈：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-SO-或-SO2-；及L4係代表一單鍵或-(CO)y-G4-基團，其中y係代表0或1，及G4係代表來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團，具有1至100個碳原子之直鏈或支鏈烴基鏈，且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至高4個由下列組成之群中選出的雜原子：N、O及S，或-SO-或-SO2-。
  29. 一種通式(III)之化合物：
    Figure TWI650136B_C0041
    其中X1係代表N，X2係代表N而X3係代表C，或X1係代表CH，X2係代表C而X3係代表N或X1係代表NH，X2係代表C而X3係代表C，或X1係代表CH，X2係代表N而X3係代表C；R1係代表-L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W係代表H或OH；其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代；R2及R4相互獨立地係代表-L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2及R4共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10係代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代，及Y5係代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基；A係代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；R3係代表-L-BINDER或視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基基團；R5係代表-L-BINDER、H、F、NH2、NO2、鹵素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中L係代表一連接子及BINDER係代表結合子或其衍生物，其中該結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連接，R6及R7相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C2-10-烯基、(視需要氟化)C2-10-炔基、羥基或鹵素，R8係代表(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C4-10-環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9係代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
  30. 一種通式(IV)之化合物：
    Figure TWI650136B_C0042
    其中X1係代表CH，X2係代表C而X3係代表N；R1係代表-L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W係代表H或OH；其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代；R2及R4相互獨立地係代表-L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2及R4共同(形成一吡咯啶環)係代表-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10係代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4相互獨立地係代表直鏈或支鏈C1-6烷基，其視需要經-NHCONH2取代，或係代表芳基或苯甲基，其視需要經-NH2取代，及Y5係代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6係代表直鏈或支鏈C1-6-烷基；A係代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；R3係代表-L-BINDER或視需要經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基或雜環烷基基團，R5係代表-L-BINDER、H、F、NH2、NO2、鹵素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z係代表-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2相互獨立地係代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，及Y3係代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘係代表H、SO3H、NH2或COOH；其中L係代表一連接子及BINDER係代表結合子或其衍生物，其中該結合子可視需要與多數個活性化合物分子相連接，R6及R7相互獨立地係代表H、氰基、(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C2-10-烯基、(視需要氟化)C2-10-炔基、羥基或鹵素，R8係代表(視需要氟化)C1-10-烷基、(視需要氟化)C4-10-環烷基或視需要經取代之氧呾；及R9係代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；及其鹽類、溶劑化物和溶劑化物之鹽類。
  31. 如申請專利範圍第30項之化合物，其中化合物具有下列化學式之一：N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]-N-甲基丁醯胺(1：1)；N-(3-胺基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；(15S,19R)-15-胺基-19-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-羥乙醯基-20,20-二甲基-14-側氧-4,7,10-三氧雜-13,18-二氮雜二十一-1-酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-4-胺基-L-苯丙胺酸；N-{(1R)-1-[1-(3-胺基苯甲基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-胺基丙基)-2-羥基乙醯胺(1：1)；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸；N-[(3S)-3-胺基-4-肼基-4-側氧丁基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1：1)；N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二胺基丁基]-2-羥基乙醯胺(1：1)；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸；(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯胺(2：1)；(1-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)乙酸；N-[3-胺基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺鹽酸鹽(1：1)；4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺(2：1)；N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)；L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)；L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丙基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)；N-(3-胺基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-[4-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)苯基]-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺；S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N-[4-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)苯基]-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺；S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-N6-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-離胺酸；S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-L-半胱胺酸；S-{1-[6-(2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}肼基)-6-側氧己基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸；S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)-17-側氧-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九-1-醯基]-R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸；S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)己醯基]胺基}乙基)-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}胺基)乙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)-L-半胱胺酸；N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-D-丙胺醯基)-L-離胺酸；N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸；N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸；N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-L-離胺酸；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲氧基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2,4-二氟苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙醯胺；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁酸；(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯胺；4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-絲胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}-L-丙胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}甘胺酸；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲醯胺；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙醯胺；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺；4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-氧代丁酸甲酯；4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-氧代丁酸；(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二側氧吡咯啶-1-基]-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二側氧-7,10,13,16-四氧雜-3,19-二氮雜二十二-1-酸；4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺；N-乙醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}-L-半胱胺酸；N-乙醯基-S-[2-([3-(L-丙胺醯基胺基)丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-側氧乙基]-L-半胱胺酸；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氫呋喃-2-甲醯胺；3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}硫烷基)丙酸；S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧乙基}高半胱胺酸；4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺；4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
  32. 一種醫藥組成物，係包含如申請專利範圍第1項之接合物，與一惰性無毒醫藥上適合的佐劑組合。
  33. 如申請專利範圍第1項之接合物，其中R3a或R3係代表-L-BINDER或經取代烷基、芳基或雜芳基基團。
  34. 如申請專利範圍第30或31項之化合物，其中R3a或R3係代表-L-BINDER或經取代烷基、芳基或雜芳基基團。
  35. 一種如申請專利範圍第1至25項中任一項之接合物或如申請專利範圍第30或31項之化合物之用途，其用於製造治療及/或預防人類及動物中過度增生及/或血管新生病症的藥物。
  36. 一種如下列化學式之一的抗體藥物接合物(ADC)，其中n為1至20之數字及AK1A及AK2A係代表一抗體：
    Figure TWI650136B_C0043
    Figure TWI650136B_C0044
    Figure TWI650136B_C0045
    Figure TWI650136B_C0046
    Figure TWI650136B_C0047
    Figure TWI650136B_C0048
    Figure TWI650136B_C0049
    Figure TWI650136B_C0050
    Figure TWI650136B_C0051
    Figure TWI650136B_C0052
    Figure TWI650136B_C0053
    Figure TWI650136B_C0054
    Figure TWI650136B_C0055
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    Figure TWI650136B_C0057
    Figure TWI650136B_C0058
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    Figure TWI650136B_C0092
    其中該ADC，若經由
    Figure TWI650136B_C0093
    基團與抗體相連接，則亦可至少部分以水解開鏈的琥珀醯胺之形式取代此基團存在。
  37. 一種下列通式之結合子-活性化合物：
    Figure TWI650136B_C0094
    其中BINDER係代表結合子或其衍生物，L係代表連接子，WS係代表活性化合物，m係代表1至2之數字，n係代表1至50之數字，其中L具有下式A所示之結構：
    Figure TWI650136B_C0095
    其中#1係代表與結合子之硫原子的連接點，#2係代表與活性化合物之連接點及R22係代表COOH、COOR、COR(其中R在各情況下係代表C1-3-烷基)、CONH2、Br；L5為選自-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-之基團，其中m、n、o、p及q相互獨立地具有下列之值：m=0-10；n=0或1；o=0-10；p=0或1；及q=0-10，其中m+n+o=1-15；X係代表一5-或6-員芳香或非芳香雜環或同素環(homocycle)，RS係代表酸基團，
    Figure TWI650136B_C0096
    L6為一選自-CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、及
    Figure TWI650136B_C0097
    之基團，其中r為1、2或3，L7為一單鍵或選自直鏈或支鏈烴基鏈之基團，其具有1至100個碳原子，係來自伸芳基基團及/或直鏈及/或支鏈及/或環狀伸烷基基團且其可插入一或多個下列基團一或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry係代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其各自可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx係代表H、C1-C3-烷基或苯基)及/或3-至10-員芳香或非芳香雜環，其具有至少4個由下列組成之群中選出之雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-，其中包括任何側鏈之烴基鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
  38. 如申請專利範圍第36項之接合物，其中該抗體為一人類、人源化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段。
  39. 如申請專利範圍第38項之接合物，其中該抗體為一抗-HER2抗體，及抗-EGFR抗體、抗-TWEAKR抗體或其抗原結合片段。
  40. 如申請專利範圍第39項之接合物，其中該抗-TWEAKR抗體係專一與TWEAKR(SEQ ID NO：169)位置47的胺基酸D(D47)結合。
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