TWI682033B - 製造具有經修飾的糖苷化作用之重組糖蛋白之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種以基因工程建造之宿主動物細胞，其能製造具有經修飾的糖苷化作用型式的糖蛋白。此類宿主動物細胞可經建造，以表現岩藻糖苷酶、糖苷內切酶、或兩者。

Description

製造具有經修飾的糖苷化作用之重組糖蛋白之方法 【參考相關申請案】
本申請案係主張於2014年3月17日申請之美國臨時專利申請第61/954,337號之權益，其揭示內容在此完整併入本案以作為參考資料。
本發明係關於一種製造具有經修飾的糖苷化作用之重組糖蛋白之方法。
糖苷化作用(glycosylation)對於糖蛋白的結構及功能至關重要。舉例而言，糖苷化作用被認為可影響蛋白折疊(從而至其穩定性)及/或糖蛋白生物活性。治療性重組糖蛋白之需求，尤其是單株抗體，於近二十年來成長迅速。先前研究揭示，重組型糖蛋白聚糖結構之些微差異可影響糖蛋白生物活性及藥物動力學。舉例而言，阿法達貝泊汀(Darbepoetin alfa)為一重組型人類紅血球生成素(erythropoietin；EPO)之高度糖苷化類似物，其具有二個額外氮連結型糖苷化作用位點。相較於內源性與重組型EPO，額外之N-糖苷化作用可增加糖類分子量百分比，且明顯延長阿法達貝泊汀之血清中半衰期。此外，針對功效主要取決於抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity；ADCC)的治療性抗體，移除Fc部分上 的核心岩藻糖殘基之化學酵素學及遺傳學方法皆已被開發出，以增加該抗體誘導的ADCC效應之效力(potency)。
然而，現今可得之重塑(remodeling)糖苷化之方法常需要多重酵素及/或多重步驟，造成製造糖工程建造的重組蛋白的高成本。
本發明之揭示係基於以基因工程建造的宿主動物細胞之發展，其能製造糖蛋白，如具有經修飾之糖苷化之抗體，該修飾包括去岩藻糖基作用(defucosylation)及單糖苷化作用。此類宿主動物細胞係以基因工程建造以過度表現一或多種岩藻糖苷酶、糖苷內切酶、或兩者。出乎意料地，改變宿主動物細胞之細胞糖苷化機構對糖蛋白合成及宿主細胞生長不會造成不良影響。
據此，本發明之揭示係提供一種以基因工程建造之宿主動物細胞(如哺乳動物細胞)，其表現岩藻糖苷酶、糖苷內切酶、或兩者，其中宿主動物細胞製造相較於野生型對應體具有經修飾之糖苷化作用之糖蛋白。一些實例中，岩藻糖苷酶可為哺乳動物岩藻糖苷酶或細菌岩藻糖苷酶，例如，人類FUCA1、人類FUCA2、灰倉鼠(Cricetulus griseus)岩藻糖苷酶α-L-1、腦膜膿毒性金黃桿菌(Chryseobacterium meningosepticum)α1,6-岩藻糖苷酶、或細菌岩藻糖苷酶BF3242。另外或此外，糖苷內切酶可為Endo S酵素，如含有SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列的酵素。一些實例中，以基因工程建造之宿主動物細胞表現(i)人類FUCA1、人類FUCA2、灰倉鼠岩藻糖苷酶α-L-1、腦膜膿毒性金黃桿菌α1,6-岩藻糖苷酶、或細菌岩藻糖苷酶BF3242，以及(i)Endo S(如SEQ ID NO：11所示)。
本文所述之以基因工程建造之宿主動物細胞可進一步表現糖蛋白，其可為外源性。實例包括但不侷限於，抗體、Fc融合蛋白、細胞介素、激素、生長因子、或酵素。
一些實例中，以基因工程建造之宿主動物細胞為哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、大鼠骨髓瘤細胞、幼倉鼠腎臟(BHK)細胞、融合瘤細胞、納馬瓦(Namalwa)細胞、胚胎幹細胞、或受精卵。
本文亦描述製造具有經修飾的糖苷化作用型式(如去岩藻糖化或單糖基化)之糖蛋白之方法，其係使用本文所述之以基因工程建造之宿主動物細胞之任一者。本方法可包含：(i)提供宿主動物細胞，其係表現(a)糖蛋白，以及(b)岩藻糖苷酶、糖苷內切酶、或兩者；於容許製造糖蛋白及岩藻糖苷酶、糖苷內切酶、或兩者之條件下培養宿主動物細胞；(ii)收集宿主動物細胞或培養基上清液以分離糖蛋白，且可選地(iii)分離糖蛋白。本方法可進一步包含(iv)分析該糖蛋白之糖苷化作用型式。
此外，本發明揭示之特徵在於一種製備本文所述之以基因工程建造之宿主動物細胞之任一者之方法。該方法可包含：(i)將編碼岩藻糖苷酶之表現載體、編碼糖苷內切酶之表現載體、或兩者導入動物細胞，且可選地(ii)將編碼糖蛋白之表現載體導入動物細胞。
本發明之一或多種具體實施例之細節係說明如下。本發明之其他特徵或優點將因下列圖式及數個具體實施例之詳盡說明，以及所附申請專利範圍而顯見。
圖1為各種N-聚糖結構之示意圖。A：典型之糖蛋白氮連結 型聚糖。B：去岩藻糖化之N-聚糖。C：具有單-N-乙醯基葡萄糖胺還原糖(單糖基化)之N-聚糖。
圖2為製造岩藻糖苷酶之示例性表現載體示意圖。A：示例性質體圖譜，其攜帶岩藻糖苷酶基因。B：用於表現岩藻糖苷酶或糖苷內切酶S之示例性表現匣。
圖3包含製造均質性去岩藻糖基化單糖(GlcNAc)抗體h4B12之顯示圖，其係藉由於以工程建造以表現岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶之宿主細胞而短暫表現該抗體。A：製造均質性去岩藻糖基化單糖(GlcNAc)抗體之示意圖。B：於宿主細胞製造之抗體4B12糖苷化作用顯示圖，該宿主細胞係經工程建造以表現人類FUCA1、人類FUCA2、灰倉鼠岩藻糖苷酶α-L-1、或腦膜膿毒性金黃桿菌α1,6-岩藻糖苷酶，其係藉LC/MS/MS測定。C：於CHO細胞之岩藻糖苷酶或糖苷內切酶短暫表現顯示圖，其係以西方墨點法檢測。D：於表現如所示之岩藻糖苷酶或糖苷內切酶之CHO細胞所製造之抗體h4B12顯示圖，該抗體具有均質性無岩藻糖之單糖(GlcNAc)糖型，其係藉LC/MS/MS測定。
圖4包含製造均質性去岩藻糖基化單糖(GlcNAc)抗體利妥昔單抗(rituximab)之顯示圖，其係藉於經工程建造以表現岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶之宿主細胞短暫表現抗體。A：於宿主細胞製造之利妥昔單抗抗體的糖苷化作用之顯示圖，該宿主細胞係經工程建造以表現如所示之各種岩藻糖苷酶或糖苷內切酶。B：於CHO細胞之如所示之岩藻糖苷酶(左道)或糖苷內切酶(右道)短暫表現之顯示圖，其係以西方墨點法檢測。
本文係揭示以基因工程建造之宿主動物細胞如哺乳動物細胞，其能製造糖蛋白(如外源性糖蛋白，如抗體)，該糖蛋白具有經修飾之糖苷化作用型式(如經修飾之N-糖苷化作用型式，如去岩藻糖化N-聚糖或單糖聚糖)。此類宿主動物細胞可以基因工程建造，以過度表現岩藻糖苷酶、糖苷內切酶、或兩者。可視需要地，宿主動物細胞亦經工程建造以表現外源性糖蛋白，如抗體。
圖1A係顯示野生型哺乳動物細胞所製造之糖蛋白之典型複雜N-聚糖的結構。此複雜之N-聚糖包含連接至糖苷化作用位點之N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)殘基，糖蛋白之天冬醯胺酸(Asn)殘基，且岩藻糖殘基係以α1,6-鍵合連接至該Asn殘基。該以基因工程建造之宿主動物細胞能製造糖蛋白(如內源性或外源性)，其具有經修飾之N-聚糖，如去岩藻糖化N-聚糖，其中一實例係顯示於圖1B，以及單糖N-聚糖，其中僅GlcNAc殘基連接至Asn糖苷化作用位點(圖1C)。具有經修飾的聚糖之糖蛋白意指糖蛋白攜帶至少一聚糖如N-聚糖，其係結構上異於該以基因工程建造宿主動物細胞之野生型對應體所製造的糖蛋白聚糖。去岩藻糖化聚糖意指任何不含α1,6-岩藻糖殘基或任何岩藻糖殘基之聚糖。
A.岩藻糖苷酶
岩藻糖苷酶為一種可分解岩藻糖的酵素。此酵素切割來自包含其之聚糖之岩藻糖殘基。用於製造以基因工程建造之宿主動物細胞之岩藻糖苷酶可為哺乳動物岩藻糖苷酶或細菌岩藻糖苷酶。一些具體實施例中，岩藻糖苷酶為野生型酵素，如野生型細菌酵素或野生型哺乳動物酵素，如人類酵素。多種示例性岩藻糖苷酶之胺基酸序列及編碼核苷酸序列係提 供如下(包括C-端之His-標籤)：
人類岩藻糖苷酶FUCA1：
胺基酸序列(SEQ ID NO：1)
Figure 104108376-A0202-12-0006-1
核苷酸序列(SEQ ID NO：2；密碼子經優化)
Figure 104108376-A0202-12-0006-2
人類岩藻糖苷酶FUCA2：
胺基酸序列(SEQ ID NO：3)
Figure 104108376-A0202-12-0007-3
核苷酸序列(SEQ ID NO：4)
Figure 104108376-A0202-12-0007-4
灰倉鼠(中國倉鼠)岩藻糖苷酶FUCA2
胺基酸序列(SEQ ID NO：5)
Figure 104108376-A0202-12-0008-5
核苷酸序列(SEQ ID NO：6)
Figure 104108376-A0202-12-0008-6
腦膜膿毒性金黃桿菌α1,6-岩藻糖苷酶
胺基酸序列(SEQ ID NO：7)
Figure 104108376-A0202-12-0008-7
Figure 104108376-A0202-12-0009-8
核苷酸序列(SEQ ID NO：8)
Figure 104108376-A0202-12-0009-9
細菌岩藻糖苷酶BF3242
胺基酸序列(SEQ ID NO：9)
Figure 104108376-A0202-12-0009-10
Figure 104108376-A0202-12-0010-11
核苷酸序列(SEQ ID NO：10)
Figure 104108376-A0202-12-0010-12
一些具體實施例中，岩藻糖苷酶可為一相較於上述提供之示例性序列任一者(如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：9)，具有至少85%(如90%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%)之序列等同度的酵素(如野生型酵素)。
二胺基酸序列之「等同度百分比」係以Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68,1990之演算法測定，其如於Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77,1993描述修正。此一演算法係併入NBLAST與XBLAST程式(版本2.0)，如Altschul,et al.J.Mol.Biol.215：403-10,1990所示。BLAST蛋白質搜尋可以XBLAST程式進行，其中評分(score)為50、字長(wordlength)為3，以取得同源於本發明蛋白質分子之胺基酸序列。若二序列間存在間隙(gap)，可使用Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402,1997所述之Gapped BLAST。採用BLAST與Gapped BLAST程式時，可使用個別程式(如XBLAST與NBLAST)之原始參數。
可用於構築以基因工程建造之宿主動物細胞之哺乳動物岩藻糖苷酶包括但不侷限於，該些GenBank登錄號揭示者：NP_114409.2、XP_003811598.1、AAH03060.1、EHH53333.1、XP_001127152.1、XP_010360962.1、XP_006084558.1、XP_004263802.1、XP_007171384.1、XP_006075254.1、XP_010982011.1、NP_001004218.1、及XP_010964137.1。
可用於構築以基因工程建造之宿主動物細胞之細菌岩藻糖苷酶包括但不侷限於，該些GenBank登錄號揭示者：WP_008769537.1、WP_032568292.1、EYA08300.1、WP_005780841.1、EXY26528.1、WP_044654435.1、WP_029425671.1、WP_022470316.1、CDA84816.1、WP_004307183.1、及WP_008025871.1。
B.糖苷內切酶
糖苷內切酶為破壞聚糖之二糖單體間糖苷鍵之酵素，從而自糖蛋白或糖脂質釋出寡糖。本發明揭示所使用之糖苷內切酶(如野生型酵素) 包括糖苷內切酶D、糖苷內切酶F、糖苷內切酶F1、糖苷內切酶F2、糖苷內切酶H、及糖苷內切酶S。各亞屬之示例性糖苷內切酶酵素係列於下表：
Figure 104108376-A0202-12-0012-13
其他適用之糖苷內切酶酵素包括該等與上述所列酵素具有至少85%(如90%、95%、98%、或99%)序列等同度者。與上述所列之糖苷 內切酶任一者具有高度序列同源性(如至少85%序列等同度)的酵素係被預期擁有相同生物活性。此類酵素(如野生型)可自基因數據庫如GenBank以上述所列酵素之一者進行查詢而得。
於部分具體實施例中，本文所述之糖苷內切酶為Endo S酵素。EndoS為一種糖苷內切酶，其專一性切割連接至原始IgG分子Fc結構域Asn糖苷化作用位點之第一個GlcNAc殘基的N-聚糖，而獲致單糖基化IgG分子，即一具有單一GlcNAc連接至Asn糖苷化作用位點的IgG分子。胺基酸序列及編碼核苷酸序列係提供如下：
Endo S胺基酸序列(SEQ ID NO：11)
Figure 104108376-A0202-12-0013-14
Endo S核苷酸序列(SEQ ID NO：12)
Figure 104108376-A0202-12-0013-15
Figure 104108376-A0202-12-0014-16
一些具體實施例中，本文所述之Endo S酵素可為相較於SEQ ID NO：11具有至少85%(如90%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%)之序列等同度的酵素(如野生型酵素)。具體實例包括但不侷限於，該等GenBank登錄號揭示者：EQB24254.1、WP_037584019.1、WP_012679043.1、及ADC53484.1。
C.以基因工程建造之宿主動物細胞
本文所述之宿主動物細胞係以基因工程建造，以過度表現一或多種具有特異聚糖修飾活性(如糖苷酶或乙二醇-轉移酶)的酵素。以基因工程建造之宿主動物細胞為攜帶外源性(非原始)基因材料之動物細胞，該基因材料如外源性編碼一或多種岩藻糖苷酶與糖苷內切酶之基因。過度表現酵素之宿主細胞意指以基因工程建造之宿主細胞，其酵素表現量相較於該宿主細胞之野生型對應體之酵素表現量為高(如20%、50%、80%、100%、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、104倍、或105倍)，該宿主細胞之野生型對應體為未含有如同以基因工程建造之宿主細胞之基因修飾之相同類型之細胞。一些具體實施例中，編碼本文所述外源性酵素之基因可導入適用之母動物細胞，以製造本文所述之以基因工程建造之宿主動物細胞。外源性酵素係指不存在於用以製造以基因工程建造之宿主動物細胞的母細胞之酵素。
本文所述之以基因工程建造之宿主動物細胞，相較於野生型對應體，能製造具有經修飾之糖苷化的糖蛋白，其可藉常規之重組技術製備。一些情況下，可將強的啟動子插入內源性岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶基因上游，以增進其表現。其他情況下，可將編碼一或多種岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶之外源性基因材料導入母宿主細胞，以製造本文所述之以基 因工程建造之宿主動物細胞。
利用本領域習知之方法，可將編碼本文所述之岩藻糖苷酶或糖苷內切酶之基因插入適用之表現載體(如病毒載體或非病毒載體)。Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Mannual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press。舉例而言，基因與載體可相接觸，其係於適當條件下，以限制酶酵素於各分子上創造互補端，可彼此配對，且以連接酶相接。或者，可將合成的核酸連接子連接至基因末端。此等合成之連接子含有相對應於載體上特定限制酶位點的核酸序列。一些具體實施例中，岩藻糖苷酶或糖苷內切酶基因係包含於一表現匣，其包含一或多種下列元件：科扎克序列(Kozak sequence)及訊息胜肽序列，其係位於酵素之氮端，以及蛋白質標籤(如FLAG、His-標籤，包括幾丁質結合蛋白(chitin binding protein；CBP)、麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein；MBP)、及麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST))。蛋白標籤可位於酵素之氮端或碳端。
此外，表現載體可含有，例如，下列之部分或全部：選擇性標記基因，如新黴素(neomycin)基因，以於哺乳動物細胞篩選穩定或暫時轉染體；源自人類CMV立即早期基因之強化子/啟動子序列，以高程度轉錄；源自SV40之轉錄終止與RNA加工訊息基因，以為mRNA之穩定性；SV40多瘤複製起始序列及ColE1，用於適度之游離型複製；通用之多重選殖位點；以及T7與SP6 RNA啟動子，以體外轉錄正義與反義RNA(sense and antisense RNA)。用於製造含轉基因之載體的適用載體及方法係本領域習知且可得。Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Mannual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
若需以二或多種酵素構築本文所述之宿主動物細胞，例如，二或多種岩藻糖苷酶、二或多種糖苷內切酶、或岩藻糖苷酶與糖苷內切酶之組合，則編碼該二或多種酵素之基因可插入個別表現載體或插入經設計以製造多種蛋白的共用表現載體。
用於製造岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶之表現載體可導入適用之母宿主細胞，其包括但不限於，鼠骨髓瘤細胞(如NSO細胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚胎腎細胞(如HEK293)、及人類視網膜母細胞瘤細胞(如PER.C6)。適用宿主細胞株之選擇，其係屬於本領域具通常知識者之知識範圍，將取決於高產率需求及製造具有所欲性質產物需求間之平衡。一些情況下，表現載體可經設計，如此，其可藉本領域習知之方法，以同源或非同源重組併入細胞基因體中。用於轉移表現載體至母宿主細胞之方法包括但不侷限於，病毒介導之基因轉移、微脂體介導之轉移、轉形、轉染、及轉導，如病毒介導之基因轉移，如使用基於DNA病毒之載體，該病毒如腺病毒、腺相關病毒、及皰疹病毒，以及反轉錄病毒系載體。基因轉移模式之實例包括，如裸DNA、CaPO4沈澱、DEAE葡聚糖、電穿孔、原生質體融合、脂轉染、細胞顯微注射、及病毒載體、佐劑輔助型DNA、基因槍、導管。於一實例中，其係使用病毒載體。欲增進非病毒載體至細胞之輸送，核酸或蛋白可共軛結合至抗體或其結合片段，其係結合細胞表面抗原。也包含標靶性抗體或其片段之微脂體可用於本文所述之方法。
本文所述之「病毒載體」意指以重組方式製造之病毒或病毒顆粒，其包含欲輸送至宿主細胞之多核苷酸，不論體內、離體、或體外。 病毒載體之實例包括反轉錄病毒載體，如慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、及其類似物。於藉反轉錄病毒載體介導之基因轉移方面，載體構築體意指包含反轉錄病毒基因體或其部分之多核苷酸，以及一治療性基因。
以基因工程建造之動物宿主細胞可包含使用供所導入的基因之持續性或可誘發性表現所創建之表現匣。此表現匣可包括調節元件，如啟動子、起始密碼子、終止密碼子、及多腺核苷酸化(polyadenylation)訊息。該等元件可為可操作連接至編碼感興趣之表面蛋白的基因，如此，該基因可於宿主細胞操作(如表現)。
許多啟動子可用於表現岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶(以及本文所述之任何外源性糖蛋白)。可用於表現該蛋白質之啟動子為本領域習知，包括但不侷限於，細胞巨大病毒(cytomegalovirus；CMV)立即早期啟動子、病毒LTR如勞氏肉瘤病毒LTR(Rous sarcoma virus LTR)、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴病毒40(simian virus 40；SV40)早期啟動子、大腸桿菌lac UV5啟動子、及單純泡疹tk病毒啟動子。
亦可使用可調節性啟動子。此類可調節性啟動子包括該等使用四環黴素(tetR)抑制子者[Gossen,M.,and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992)；Yao,F.et al.,Human Gene Therapy,9：1939-1950(1998)；Shockelt,P.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92：6522-6526(1995)]。其他系統包括FK506二聚體、使用雌二醇之VP16或p65、RU486、二酚米樂甾酮(diphenol murislerone)、或雷帕黴素(rapamycin)。誘發性系統可得自Invitrogen、Clontech、及Ariad。
一些誘發性啟動子之功效可隨時間增加。於此類情況，藉串聯方式插入多重抑制子，如以內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site；IRES)將TetR連接至TetR，吾人可增進此類系統之功效。或者，於篩選所欲之功能前，吾人可等待至少3天。雖然可能發生某些靜默現象(silencing)，可藉使用適當細胞數目而最小化該現象，該細胞數目較佳為至少1x104、更佳為至少1x105、又更佳為至少1x106、甚至更佳為1x107。吾人可藉習知之方法增進所欲蛋白之表現，以增進此系統之功效。舉例而言，使用土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element；WPRE)。參見Loeb,V.E.,et al.,Human Gene Therapy 10：2295-2305(1999)；Zufferey,R.,et al.,J.of Virol.73：2886-2892(1999)；Donello,J.E.,et al.,J.of Virol.72：5085-5092(1998)。
用於實施本文所述方法之多腺核苷酸化訊息之實例包括但不侷限於，人類第一型膠原蛋白多腺核苷酸化訊息、人類第二型膠原蛋白多腺核苷酸化訊息、及SV40多腺核苷酸化訊息。
可操作地連接至調節元件的外源性基因材料，包括岩藻糖苷酶基因及/或糖苷內切酶基因(以及本文所述之糖蛋白基因)，可維持存在於細胞以作為可作用之細胞質分子、可作用之游離型分子，或其可融入細胞之染色體DNA。外源性基因材料可導入細胞，其以質體形式維持為獨立之基因材料。或者，可融入染色體之線型DNA，可被導入細胞。當導入DNA至細胞時，可加入促進DNA融入染色體之試劑。適用於促進融入之DNA序列亦可包括於DNA分子中。或者，可將RNA導入細胞。
可使用選擇性之標記監控本文所述宿主動物細胞對所欲轉 基因之攝取。此等標記基因可受控於任何啟動子或誘發性啟動子。此等係本領域習知者，且包括能改變細胞對一刺激，如營養物、抗生素等之敏感性的基因。基因包括該等neo、puro、tk、多重抗藥性(multiple drug resistance；MDR)等基因。其他基因表現可易於進行篩選的蛋白質，如綠色螢光蛋白(green fluorescent protein；GFP)、藍色螢光蛋白(blue fluorescent protein；BFP)、螢光酵素、及LacZ。
D.製造具有經修飾的糖苷化之糖蛋白
以基因工程建造之宿主動物細胞可用於製造具有經修飾的糖苷化作用型式之糖蛋白(如內源性或外源性)。一些具體實施例中，用於製造上述以基因工程建造之宿主動物細胞的母宿主細胞係已攜帶編碼外源性糖蛋白之基因。其他具體實施例中，編碼感興趣之糖蛋白之基因或多個基因可被導入以基因工程建造之宿主動物細胞，該細胞係藉本領域習知或本文所述之方法表現一或多種岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶。
能同時製造感興趣之糖蛋白與一或多種岩藻糖苷酶及/或糖苷內切酶之以基因工程建造之宿主動物細胞可於適當條件下培養，以容許此等蛋白之表現。可收集該等細胞及/或其培養基，且可藉常規技術自細胞及/或培養基分離及純化感興趣之糖蛋白。可據此以常規技術如LC/MS/MS測定所製造糖蛋白之糖苷化型式，以確認糖苷化之修飾。
一些實例中，感興趣之糖蛋白為抗體。示例性抗體包括但不侷限於，阿昔單抗(糖蛋白IIb/IIIa；心血管疾病)、阿達木單抗(TNF-α，各種自體免疫失調，如類風溼性關節炎)、阿崙單抗(CD52；慢性淋巴細胞性白血病)、巴利昔單抗(IL-2Rα受體(CD25)；移植排斥)、貝伐單抗(血管內皮生 長因子A；各種癌症，如直腸癌、非小細胞肺癌、神經膠質母細胞瘤、腎癌；濕性年齡相關性黃斑退化)、卡妥索單抗、西妥昔單抗(EGF受體，各種癌症，如大腸直腸癌、頭頸癌)、賽妥珠單抗(如聚乙二醇結合賽妥珠單抗)(TNFα；克隆氏症、類風溼性關節炎)、達利珠單抗(IL-2Rα受體(CD25)；移植排斥)、依庫珠單抗(補體蛋白C5；陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria))、依法利珠單抗(CD11a；牛皮癬)、吉妥單抗(CD33；急性骨髓性白血病(如伴隨卡奇黴素(calicheamicin))、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(CD20；非霍奇金淋巴瘤(如伴隨釔-90或銦-111))、英夫利昔單抗(TNF-α；各種自體免疫疾病，如類風溼性關節炎)、莫羅單抗-CD3(T細胞CD3受體；移植排斥)、那他珠單抗(α-4(α4)整合素；多發性硬化症、克隆氏症)、奧馬珠單抗(IgE；過敏相關氣喘)、帕利珠單抗(RSV F蛋白表位；呼吸道融合病毒感染)、帕尼單抗(EGF受體；癌症，如大腸直腸癌)、來尼珠單抗(血管內皮生長因子A；濕性年齡相關性黃斑退化)、利妥昔單抗(CD20；非霍奇金淋巴瘤)、托西莫單抗(CD20；非霍奇金淋巴瘤)、曲妥珠單抗(ErbB2；乳癌)。
一些實例中，感興趣之糖蛋白為細胞介素。實例包括但不侷限於，干擾素(如IFN-α、INF-β、或INF-γ)、介白素(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12)、及群落刺激因子(如G-CSF、GM-CSF、M-CSF)。IFN可為如干擾素α 2a或干擾素α 2b。參見如Mott HR and Campbell ID.「Four-helix bundle growth factors and their receptors：protein-protein interactions.」Curr Opin Struct Biol.1995 Feb；5(1)：114-21；Chaiken IM,Williams WV.「Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines：towards de novo mimetics design.」Trends Biotechnol.1996 Oct；14(10)：369-75；Klaus W,et al.,「The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution」.J.Mol Biol.,274(4)：661-75,1997，對於某些此類細胞介素之進一步討論。
感興趣之蛋白亦可為細胞介素蛋白，其具有類似於前述細胞介素之一或多者之結構。舉例而言，細胞介素可為IL-6類細胞介素如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor；LIF)或抑瘤素M(oncostatin M)。一些具體實施例中，細胞介素係自然結合至一包含GP130訊息轉導子單元的受體。其他感興趣之四螺旋束蛋白(four-helix bundle protein)包括生長激素(growth hormone；GH)、泌乳素(prolactin；PRL)、及胎盤生乳素(placental lactogen)。一些具體實施例中，標靶蛋白為紅血球生成刺激劑，如EPO，其亦為四螺旋束細胞介素。一些具體實施例中，紅血球生成刺激介質為EPO變體，如阿法達貝泊汀，亦稱作新型紅血球生成刺激蛋白(novel erythropoiesis stimulating protein；NESP)，其係以基因工程建造以含有五條氮連結型糖鏈(比重組型HuEPO多二個)。一些具體實施例中，蛋白包含五個螺旋。舉例而言，蛋白可為干擾素β，如干擾素β-1a或干擾素β-1b，其(如所理解)常歸類為四螺旋束細胞介素。一些具體實施例中，標靶蛋白為IL-9、IL-10、IL-11、IL-13、或IL-15。參見如Hunter,CA,Nature Reviews Immunology 5,521-531,2005，對特定細胞介素之探討。亦參見Paul,WE(ed.),Fundamental Immunology,Lippincott Williams & Wilkins；6th ed.,2008。
此外，感興趣之蛋白可為用於治療人體之疾病或失調，經美 國食品藥物管理局(或對等法規機構如歐洲藥品評價局)核准之蛋白。此類蛋白可為或可不為經臨床試驗檢測及/或經市場上認可之聚乙二醇化(PEGylated)版本。
此外，感興趣之蛋白可為神經滋養因子(neurotrophic factor)，即促進神經譜系細胞(該詞如本文所使用包括神經祖源細胞、神經元、及神經膠細胞，如星狀膠質細胞、寡樹突細胞、微膠質細胞)存活、發育、及/或功能之因子。舉例而言，一些具體實施例中，標靶蛋白為促進軸突生長之因子。一些具體實施例中，蛋白為纖毛神經滋養因子(ciliary neurotrophic factor；CNTF，一種四螺旋束蛋白)或其類似物如Axokine，其為人類纖毛神經滋養因子之修飾版本，其具有碳端15個胺基酸截切及二個胺基酸取代，其體外與體內試驗之功效為CNTF之3至5倍，且具有改進之穩定性。
或者，感興趣之蛋白可為酵素，如代謝或其他生理過程之重要酵素。如本領域習知，酵素或其他蛋白質之缺失可造成各種疾病。此類疾病包括與糖類代謝、胺基酸代謝、有機酸代謝、卟啉(porphyrin)代謝、嘌呤或嘧啶代謝、溶酶體儲存失調、血液凝集等缺陷相關聯之疾病。實例包括法布瑞症(Fabry disease)、高歇氏症(Gaucher disease)、龐貝氏症(Pompe disease)、腺核苷去胺酶缺失、天冬醯胺酸酶缺失、卟啉病(porphyria)、血友病及遺傳性血管性水腫。一些具體實施例中，蛋白為凝血或凝集因子(如第VII、VIIa、VIII、或IX因子)。其他具體實施例中，蛋白為一酵素，其於糖類代謝、胺基酸代謝、有機酸代謝、卟啉代謝、嘌呤或嘧啶代謝、及/或溶酶體儲存扮演一角色，其中外源性投予該酵素可至少部分緩解疾病。
此外，感興趣之蛋白可為激素，如胰島素、生長激素、黃體生成素、卵泡刺激素及促甲狀腺激素。感興趣之蛋白亦可為生長因子，包括但不侷限於，腎上腺髓素(adrenomedullin；AM)、血管生成素(angiopoietin；Ang)、自分泌運動因子(autocrine motility factor)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins；BMPs)、腦源性神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor；BDNF)、表皮生長因子(EGF)、紅血球生成素(EPO)、纖維母細胞生長因子(FGF)、神經膠細胞系源性神經滋養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor；GDNF)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor；G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor；GM-CSF)、生長分化因子-9(growth differentiation factor-9；GDF9)、癒合因子、肝細胞生長因子(HGF)、肝癌源性生長因子(hepatoma-derived growth factor；HDGF)、類胰島素生長因子(IGF)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor；KGF)、促移行因子(migration-stimulating factor；MSF)、肌肉生長抑制素(myostatin)(GDF-8)、神經生長因子(NGF)與其他神經滋養素、血小板源性生長因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、轉形生長因子α(TGF-α)、轉形生長因子β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)及胎盤生長因子(PGF)。
據信無需進一步詳盡說明，本領域之具通常知識者可根據前面陳述，最大程度利用本發明。因此，下列具體實施例應理解為僅具有說明性，而非以任何方式侷限本發明。為本文之目的或標的引用之所有出版品皆於此併入本案以作為參考資料。
實施例
方法
i.構築表現載體以製造岩藻糖苷酶或糖苷內切酶
為構築岩藻糖苷酶或糖苷內切酶之表現載體，以常規技術分離岩藻糖苷酶或糖苷內切酶之基因，並基於倉鼠細胞之密碼子使用，進行密碼子優化。合成之基因係由GeneArt Corp.製備，並選殖至pcDNA3.1 B(-)Myc-His載體(Invitrogen，US)，其限制酶位點為Bgl II/EcoR I(圖2A)。α-岩藻糖苷酶之基因表現匣，由5’端至3’端，包含科扎克序列、Igk前導序列、岩藻糖苷酶編碼序列、及His-標籤編碼序列。圖2B。糖苷內切酶之基因表現匣，由5’端至3’端，包含科扎克序列、Igk前導序列、糖苷內切酶編碼序列、及Flag標籤編碼序列。圖2B。
ii.製備去岩藻糖化抗體
抗體產生細胞株以0.3~3.0×106存活細胞/mL之濃度維持於完全培養基，以8mM L-麩醯胺酸與抗結塊劑1：100稀釋補充之CD FortiCHOTM培養基(Life Technologies，USA)。將細胞維持在含8%CO2培養箱中之振盪台，其設定為130-150rpm。
欲製造去岩藻糖化抗體，根據製造商之步驟，利用FreeStyleMAX試劑(Life Technologies，USA)，以轉染編碼前述α-岩藻糖苷酶之表現載體至前述抗體產生細胞。將轉染細胞培養於含有4g/L葡萄糖之培養基，且每隔一天置換培養基。當細胞存活率降至低於70%時，收取細胞。收集經澄清(clarified)之培養基上清液，並以蛋白A層析法純化。
iii.分析抗體之糖苷化作用
根據本文所述方法製備之重組型抗體係經還原、烷化、及於37℃之25mM碳酸氫銨緩衝液(pH~8)存在下以胰蛋白酶隔夜分解。將PNGase F溶液(3μL，Roche)加至200μL之經分解樣本，且將混合物於37℃下另外培養16小時。使用Sep-Pak® C18匣(Waters)自胜肽分離釋出之聚糖。以乙腈清洗Sep-Pak C18，之後以水清洗。將PNGaseF分解之樣本填入該匣，並以1%乙醇沖提釋出之聚糖，同時胜肽仍結合於Sep-Pak C18。釋出之蛋白質寡糖係首先以多孔性石墨碳管柱(PhyNexus)純化，之後經全甲基化(permethylated)。所有質譜實驗係以Orbitrap Fusion Tribrid質譜儀進行，其係經由直接輸注至奈米電灑源(nano-electrospray source)內。
結果
1.製造具有單糖(GlcNAc)糖型之抗體h4B12、利妥昔單抗、及奧馬珠單抗
藉由岩藻糖苷酶切割反應，可由前述之二糖變體製造單糖之糖變體。由許多可得酵素之搜尋及藉LC/MS/MS之乙二醇-胜肽分析顯示，經由優化之切割反應條件，使用α-1,6-岩藻糖苷酶可達到有效之去岩藻糖化作用，且較高之切割效率係與較低之NF/N比例有關。或者，可以依序結合二反應酵素以取得單糖之糖變體，該二酵素包括糖苷內切酶(Endo S)與α-1,6-岩藻糖苷酶。所得之單-GlcNAc糖變體係顯示於圖3A。
結果顯示，Endo-S移除90%以上之本文所述以基因工程建造之CHO細胞製造之h4B12、利妥昔單抗、及奧馬珠單抗的重鏈氮連結型聚 糖。對於表現各岩藻糖苷酶之CHO細胞製造之h4B12抗體，五種不同類型之岩藻糖苷酶FUCA1、FUCA2、灰倉鼠岩藻糖苷酶α-L-1、腦膜膿毒性金黃桿菌α1,6-岩藻糖苷酶、及BF3242之去岩藻糖基作用能力分別為5.8%、9.1%、17.7%、11.5、及68%。圖3B。酵素表現係以西方墨點法檢測，如圖3C所示。
2-去氧-2-氟L-岩藻糖為一種經氟化之岩藻糖類似物。其可於宿主細胞內代謝，以產生基於受質之岩藻糖基轉移酶抑制劑。當培養短暫表現岩藻糖苷酶BF3242與Endo-S之抗體產生CHO細胞時，連接至CHO細胞製造之抗體的N-聚糖中，99.89%為單糖基化(GlcNAc-Ig-Fc)。圖3D。
CHO-35D6細胞，其產生利妥昔單抗，係以表現載體穩定轉染，以製造BF3242及Endo-S。細胞係於100~400μg/ml之G418存在下培養。因此，所產生之抗體含有17-19%之GlcNAc-Ig-Fc。圖4A。
酵素表現係以西方墨點法檢測，如圖5B所示。
類似之結果亦出現在以CHO細胞製造之奧馬珠單抗，該細胞係以基因工程建造以同時表現岩藻糖苷酶及Endo S。
此種效率於製備同質性聚糖型抗體之轉糖基化步驟中至為關鍵。
其他具體實施例
本說明書所揭示之所有特徵可以任何組合結合。本說明書揭示之各特徵可基於相同、對等、或類似目的，以另一特徵所替代。因此，除非另有明確指明，所揭示之各特徵係僅一通用系列之對等或類似特徵之實例。
由上述之陳述，本領域具通常知識者可易於確定本發明之必要特徵，且在不背離其精神及範疇之下，可進行本發明之各種變更及改良，以使其適應各種用途及條件。因此，其他具體實施例亦落於本發明申請專利範圍內。
<110> 泉盛生物科技股份有限公司
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<130> FB0003TW
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Claims (18)

  1. 一種以基因工程建造之宿主動物細胞，其係表現岩藻糖苷酶及糖苷內切酶，其中該岩藻糖苷酶係選自由人類FUCA1、人類FUCA2、灰倉鼠(Cricetulus griseus)岩藻糖苷酶α-L-1、腦膜膿毒性金黃桿菌(Chryseobacterium meningosepticum)α1,6-岩藻糖苷酶、及細菌岩藻糖苷酶BF3242所組成之群組，該糖苷內切酶為Endo S酵素，以及該以基因工程建造之宿主動物細胞製造具有經修飾的糖苷化作用之糖蛋白。
  2. 如請求項1之以基因工程建造之宿主動物細胞，其更表現糖蛋白。
  3. 如請求項2之以基因工程建造之宿主動物細胞，其中該糖蛋白係外源性。
  4. 如請求項3之以基因工程建造之宿主動物細胞，其中該糖蛋白為抗體、Fc融合蛋白、細胞介素、激素、生長因子或酵素。
  5. 如請求項4之以基因工程建造之宿主動物細胞，其中該糖蛋白為抗體。
  6. 如請求項1之以基因工程建造之宿主動物細胞，其中該動物細胞為哺乳動物細胞。
  7. 如請求項6之以基因工程建造之宿主動物細胞，其中該哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、大鼠骨髓瘤細胞、倉鼠嬰腎(BHK)細胞、融合瘤細胞、或納馬瓦細胞(Namalwa cell)。
  8. 如請求項1之以基因工程建造之宿主動物細胞，其係表現(i)細菌岩藻糖苷酶BF3242，以及(ii)Endo S。
  9. 一種製造去岩藻糖化糖蛋白之方法，包含： 提供如請求項1至8中任一項所述之以基因工程建造之宿主動物細胞；培養該宿主動物細胞，其係於容許製造該糖蛋白及該岩藻糖苷酶與糖苷內切酶之條件下進行；以及收集該宿主動物細胞或該培養基上清液以分離該糖蛋白。
  10. 如請求項9之方法，其中該糖蛋白係外源性。
  11. 如請求項9之方法，其中該糖蛋白為抗體、Fc融合蛋白、細胞介素、激素、生長因子、或酵素。
  12. 如請求項11之方法，其中該糖蛋白為抗體。
  13. 如請求項9之方法，其中該以基因工程建造之宿主動物細胞為哺乳動物細胞。
  14. 如請求項13之方法，其中該哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、大鼠骨髓瘤細胞、幼倉鼠腎臟(BHK)細胞、融合瘤細胞、或納馬瓦細胞。
  15. 如請求項9之方法，其進一步包含分離該糖蛋白。
  16. 如請求項15之方法，其進一步包含分析該糖蛋白之糖苷化作用型式。
  17. 一種製備如請求項1至8中任一項所述之以基因工程建造之宿主動物細胞之方法，其包含將編碼該岩藻糖苷酶之表現載體及編碼該糖苷內切酶之表現載體導入該動物細胞。
  18. 如請求項17之方法，其進一步包含將編碼糖蛋白之表現載體導入該動物細胞。
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