UA129585C2 - ЕКСПРЕСІЙНА КОНСТРУКЦІЯ ДЛЯ ВИСОКОРІВНЕВОЇ ЕКСПРЕСІЇ УСІЧЕНОГО ПНЕВМОКОКОВОГО ПОВЕРХНЕВОГО БІЛКА А1 (PspA1) - Google Patents

ЕКСПРЕСІЙНА КОНСТРУКЦІЯ ДЛЯ ВИСОКОРІВНЕВОЇ ЕКСПРЕСІЇ УСІЧЕНОГО ПНЕВМОКОКОВОГО ПОВЕРХНЕВОГО БІЛКА А1 (PspA1) Download PDF

Info

Publication number
UA129585C2
UA129585C2 UAA202006326A UAA202006326A UA129585C2 UA 129585 C2 UA129585 C2 UA 129585C2 UA A202006326 A UAA202006326 A UA A202006326A UA A202006326 A UAA202006326 A UA A202006326A UA 129585 C2 UA129585 C2 UA 129585C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
truncated
pepa1
expression
aia
elution
Prior art date
Application number
UAA202006326A
Other languages
English (en)
Inventor
Раджан Сріраман
Раджан Срираман
Рамеш Венкат Матур
Нарендер Дев Мантена
Магіма Датла
Махима Датла
Светха Каміредді
Светха Камиредди
Original Assignee
Байолоджикал І Лімітед
Байолоджикал И Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байолоджикал І Лімітед, Байолоджикал И Лимитед filed Critical Байолоджикал І Лімітед
Publication of UA129585C2 publication Critical patent/UA129585C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/116—Polyvalent bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується експресійної конструкції для високорівневої експресії усіченого пневмококового поверхневого білка А1 (PspA1), рекомбінантної клітини-хазяїна для експресії усіченого пептиду PspA1 та способу високорівневої експресії усіченого PspA1.

Description

МОВ
А ре Й ртас Є у
Ж термінатор пов
ЇЇ х Зреї ск РВЕЗІС 4 і Капк сестрата пропновгата холін-зв'язуюча суперспіраль область область хвіст вв зо еті вва зв зза зве а
КУ. розміщення відомих , перехресно-протективних зв'язування з клітинною еатпопа поверхню (повтори
Фіг.
Галузь техніки, до якої належить винахід
Даний винахід стосується високорівневої експресії усіченого пневмококового поверхневого білка АТ (РорАЇ) в бактеріях.
Рівень техніки зігеріососси5 рпецтопіае є важливим збудником отиту середнього вуха, менінгіту, бактеріємії і пневмонії, а також основною причиною смертельних інфекцій у людей літнього віку і осіб з наявними супутніми захворюваннями. Привабливою метою вакцинації проти стрептококів є зниження кількості носіїв інфекції у вакцинованих популяціях і, як наслідок, зниження рівня захворюваності пневмококовою інфекцією.
Пневмококові полісахаридні вакцини, представлені на ринку під торговельною маркою
Рпештомах23, не ефективні у дітей молодше 2 років. Відсутність ефективності полісахаридних вакцин в даній популяції є наслідком незрілості дитячої імунної системи стосовно експресії
В-клітинних рецепторів. Кон'югація полісахаридів (Р) з білками-носіями перетворює їх з
Т-незалежного антигену на Т-залежний антиген. Як Т-залежний антиген полісахариди можуть викликати реакцію у відповідь з перемиканням ізотипу імуноглобулінів, генерацією клітин пам'яті і стимуляцією імунної відповіді.
Мембранні білки знаходяться всередині мембрани і охоплюють Її, через яку вони слугують для транспорту молекул або полегшення клітинної адгезії. Білки можуть сприяти переміщенню речовин за рахунок полегшеної дифузії (тобто пасивного транспорту) або активного транспорту.
Пневмококовий поверхневий білок А (РерА) є мембранним білком і ще одним важливим чинником вірулентності, виявленим приєднаним до клітинної стінки всіх штамів 5ігеріососси5 рпеитопіавє.
Заміна універсальних білків-носіїв, таких як правцевий анатоксин (ТТ) або СЕКМ197, пневмококовим білком, зокрема, РерАї1 або його фрагментом, крім розширення охоплення дії вакцини, також попереджує порушення імунних відповідей, викликаних надмірним використанням одних і тих самих білків-носіїв в кон'юЮгованих вакцинах. Експресійна плазміда сконструйована таким чином, щоб включати регуляторні послідовності, які функціонують як енхансерна і промоторна ділянки і призводять до ефективної транскрипції гена, який переноситься в експресійному векторі. Метою добре сконструйованого експресійного вектору є ефективна продукція білка, і це може бути досягнуто за допомогою синтезу значної кількості стабільної матричної РНК. Можливо сконструювати експресійний вектор, який забезпечує жорсткий контроль експресії, і білок продукується у великих кількостях тільки за необхідністю у прийнятних для експресії умовах. При відсутності жорсткого контролю експресії гена білок також може експресуватися конститутивно.
Согуперасіегішт дішатісцит являє собою грампозитивну ферментативну бактерію, яка широко використовується у виробництві глутамату натрію у великих кількостях. За рахунок своїх стабільних генетичних характеристик і відсутності яких-небудь ендотоксинів Согуперасієегійт дішатісит класифікується як СКА5-мікроорганізм (загалом, вважається безпечним). Відомо, що бактерія не секретує яких-небудь позаклітинних протеаз, і як наслідок вона стає привабливою платформою для продукування гетерологічних білків в середовище. Це може бути досягнуто з використанням експресійної плазмідної конструкції яка може синтезувати рекомбінантний білок у великих кількостях.
У ЕР2310502 ВІ1 розкрите застосування промотору Ріас в конструкції, де штам Ев5спегіснпіа соїї, що містить ІРТОо-індуцибельну мутацію й52 і делецію тіпСОЕ, культивували в середовищі
ІВ.
У публікації МоКапо еї.аї., 9. Васіеєгіо!Ї., 1984 дап.; 157 (1):79-83 розкрите використання гена стійкості до канаміцину в плазмідній конструкції для створення трансформованого штаму, який набуває властивості стійкості до канаміцину.
У публікації Мавзаї єї аї., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА, 1987 ди).; 84(14):4781-5 розкритий білок
КерА для ініціації реплікації плазміди КІ і взаємодії з послідовністю огік.
У публікації Мауак еї аї., Іптесії. Іттип.-1998-Мауак-3744-51 розкрита жива рекомбінантна вакцина для перорального введення на основі штаму ЗаЇтопеїЇІа, який експресує пневмококовий поверхневий білок А (РерА).
У публікації Мароге еї.аІ. Массіпе, 18 (2000) 1743-54 розкрита експресія рекомбінантного усіченого РерА у вигляді цитоплазматичного білка в ЕзсПегіспіа соїї.
У публікації Рідчегедо еїаїЇ., Аррі. МісгобріоЇ. ВіоїеснпоЇї. (2017) 101:2305-2317 розкрите отримання і очищення неміченого рекомбінантного пневмококового поверхневого білка А (РерАгРго).
У вищезгаданих документах розкриті генетичні елементи експресійного вектору або 60 експресія пневмококового поверхневого протеїну А в Ев5сПегіспніа соїї і ЗаІтопепПа.
Автори винаходу ідентифікували імуногенні фрагменти пневмококового поверхневого білка.
Потім автори винаходу приклали інтенсивні зусилля для розробки експресійних конструкцій, здатних до стабільної і конститутивної або індукованої експресії усіченого пневмококового поверхневого білка А! (РерАТ) в бактеріях на високому рівні.
Отже, даний винахід забезпечує подолання проблем попереднього рівня техніки за допомогою отримання експресійних векторів і рекомбінантних клітин-хазяїв для експресії усічених пневмококових поверхневих білків. Крім того, автори винаходу отримали вакцинні композиції, що містять усічені білки як білки-носії.
Мета винаходу
Основною метою даного винаходу є отримання експресійної конструкції для високорівневої експресії усіченого пневмококового поверхневого білка АТ (РорАТ) в бактеріях.
Іншою метою даного винаходу є отримання експресійної конструкції, здатної до стабільної і конститутивної або індукованої експресії на високому рівні усіченого пневмококового поверхневого білка АТ (РерАТ) в бактеріях.
Суть винаходу
Даний винахід стосується експресійної конструкції, здатної до високорівневої експресії усіченого пневмококового поверхневого білка АТ (РерА1) з послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮ
МО: Зі.
Даний винахід стосується експресійної конструкції, що містить ген, який кодує усічений рерАТ, з послідовністю, наведеною в 5ЕО ІО МО: 5 і 6.
Даний винахід стосується експресійної конструкції для високорівневої експресії усіченого
РзрАї1 (пневмококового поверхневого білка А!) з послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮО МО: З або 4, в бактеріях, яка містить: а) ген, що кодує усічений рерАТ, з послідовністю, наведеною в ЗЕО ІО МО: 5 або 6, р) оріджин реплікації, с) ген стійкості до антибіотиків, а) промотор і е) сайт зв'язування рибосоми.
Даний винахід також стосується способу високорівневої експресії усіченого РзерА1 (пневмококового поверхневого білка Аї) який включає культивування бактерій, трансформованих експресійною конструкцією, і, тим самим очищення експресованого білка.
Короткий опис фігур
На фіг. 1: на панелі А наведено схематичне подання рВЕЗІС. На панелі В наведено схематичне подання доменів рерА, визначених з виведеної амінокислотної послідовності ЕКхХ1 рорА1. На панелі С наведено схематичне подання рВЕ117. На панелі О показаний амплікон
ПЛР, що містить КВ», нативний сигнальний пептид, усічений рерА1, нативний термінатор і їггпВ.
На фіг. 2: покриття білкової послідовності усіченого РерАї в аналізі пептиду "відбитків пальців".
На фіг. З: аналіз інтактної маси усіченого РерАї, експресованого в Согупебасіегійт дішатісит.
На фіг. 4: усічений РерА!т, елюйований з колонки з керамічним гідроксіапатитом (СНТ-1І).
На фіг. 5: усічений РерАїт, елюйований з аніонообмінної колонки.
На фіг. 6: усічений РерА1 після діафільтрації.
На фіг. 7: хроматограма ЗЕС-НРІ С кінетики реакції кон'югації пневмококового полісахариду серотипу З (А), бА (В) і 68 (С).
На фіг. 8: титр сироваткових антитіл у імунізованих кроликів проти різних кон'югатів полісахариду бігеріососси5 рпештопіає серотипів 3, бА, 6В (2,2 мкг) з усіченим білком-носієм рорА.
На фіг. 9: титр сироваткових антитіл у імунізованих кроликів проти різних кон'югатів полісахариду 5ігеріососсих5 рпештопіає серотипів 3, бА, 6В (4,4 мкг) з усіченим білком-носієм рорА.
На фіг. 10: на панелі А наведено схематичне подання рВЕ114К. На панелі В показано підтвердження рВЕ114К рестрикційним розщепленням.
На фіг. 11: усічений РерА1, елюйований з хроматографічної колонки з СНТ І.
На фіг. 12: усічений РерА1, елюйований з хроматографічної колонки з Саріо О Ітргез5.
На фіг. 13: покриття білка РерА1 МАЇ бі.
На фіг. 14: аналіз інтактної маси усіченого РерА1, експресованого в ЕвспПегісніа соїї.
Детальний опис винаходу
Термін РерА1 стосується пневмококового поверхневого білка А! з бігеріососси5 рпештопіа. 60 Даний винахід стосується високорівневої експресії усіченого РерАї (пневмококового поверхневого білка А7) в бактеріях. Бактеріями, придатними для високорівневої експресії рзрАТ, є Согуперасієгіит дішатісит і ЕзсПегісніа соїї.
В одному варіанті здійснення даний винахід стосується високорівневої експресії усіченого
РзрАї1 (пневмококового поверхневого білка Ат) з послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮО МО: 3, в
Согуперасівєтішт дішатісит.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується високорівневої експресії усіченого РерА1 (пневмококового поверхневого протеїну АТ) з послідовністю, наведеною, в 5ХЕО
ІО МО: 4, в ЕзсПегіспіа соїї.
Даний винахід стосується експресійної конструкції, здатної до високорівневої експресії поверхневого білка з послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮО МО: 3.
Даний винахід також стосується експресійної конструкції, здатної до високорівневої експресії поверхневого білка з послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮО МО: 4.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується експресійної конструкції для високорівневої експресії усіченого РерАї (пневмококового поверхневого білка АТ) з послідовністю, наведеною в ЗЕО ІЮО МО: 3, в Согуперасіегіит дішатісит.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується експресійної конструкції для високорівневої експресії усіченого РерАї (пневмококового поверхневого білка АТ!) з послідовністю, наведеною в 5ЕО ІЮО МО: 4, в ЕзсПегісніа соїї.
Даний винахід стосується експресійної конструкції, яка використовується для високорівневої експресії усіченого РерА1, в Согуперасіеп ит дішатісит, що містить: і. оріджин реплікації огі К, іі. ген стійкості до канаміцину, ії. промотор Рас, ім. ген, який представляє інтерес, що кодує усічений рерАт (5ЕО ІО МО: 5).
Даний винахід також стосується експресійної конструкції, яка використовується для високорівневої експресії усіченого РерАї в ЕзспПегісніа сої, що містить: і. оріджин реплікації рис, іі. ген стійкості до канаміцину, ії. промотор РТ7, ім. ген, який представляє інтерес, що кодує усічений рерАт (5ЕО ІО МО: 6).
В одному варіанті здійснення експресійна конструкція для високорівневої експресії усіченого рерА!1 додатково містить сайт зв'язування рибосоми (КВ5). КВ5 включений в прямий праймер, і коротка ділянка ДНК, що містить нативні термінатори, включена в зворотний праймер, що використовуються для подальшої ампліфікації усіченого рерАї. КВ5 (сайт зв'язування рибосоми) представляє сайт гена триозофосфатізомерази в експресійній конструкції для експресії усіченого РерАї в Согуперасіегіит дішатісит.
У одному варіанті здійснення даного винаходу експресійна конструкція містить кодуючу область (нативну) сигнального пептиду РерАТ, усічений рерА1, промотор Р'ізс і сайт зв'язування рибосоми (КВ5) гена триозофосфатізомерази.
У переважному варіанті здійснення даний винахід стосується експресійної конструкції для високорівневої експресії усіченого РерАТ (ЗЕО ІО МО: 3) в Согупебасіегійт дішатісит, яка містить: а. ген, що кодує усічений рерАт (ЗЕО ІО МО: 5), р. оріджин реплікації огі К (ЗЕО ІО МО: 12), с. ген стійкості до канаміцину (ЗЕО ІЮО МО: 1), а. промотор Ріас (ЗЕО ІО МО: 2) і е. сайт зв'язування рибосоми гена триозофосфатізомерази.
У ще одному переважному варіанті здійснення даний винахід стосується експресійної конструкції для високорівневої експресії усіченого РерАї (5ЕО ІО МО: 4) в ЕзсПепгіспіа сої, яка містить: а) ген, що кодує усічений рерА! (5ЕО ІО МО: б), р) оріджин реплікації рос, с) ген стійкості до канаміцину (5ЕО ІО МО: 1), а) промотор РТ7 (ЗЕО ІО МО: 11) і е) сайт зв'язування рибосоми.
Пневмококовий поверхневий білок А (РерА) є мембранним білком і являє собою важливий чинник вірулентності, виявлений приєднаним до клітинної стінки всіх штамів 5ігеріососси5 рпештопіає, і є багатообіцяючим компонентом вакцини, який, як було показано, має високу імуногенність. 60 У конкретному варіанті здійснення даного винаходу усічений РерАї1 використовується як білок-носій. Білки-носії, що використовуються в кон'юЮгованих вакцинах, переважно являють собою білки, які не є токсичними і реактогенними, і які можна отримати у великій кількості і з високою чистотою. Білок-носій можна кон'югувати з капсульним полісахаридом, виділеним з патогенних бактерій, для посилення імуногенності полісахариду. Білки-носії повинні піддаватися стандартним процедурам хімічної кон'югації.
Усічений РерАї в Согупебрасіепйут дішатісит секретується у позаклітинне середовище.
Секреція у позаклітинне середовище сприяє ефективному очищенню.
Даний винахід стосується високорівневої експресії усіченого РерАї в Согупебасіейт дішатісит, де М-кінцева ділянка разом з багатою на пролін ділянкою усіченого гена рерА1 була ампліфікована з капсульного серотипу 23Е 5ігеріососсиб5 рпештопіає разом з розташованою вище ділянкою.
У одному варіанті здійснення даного винаходу експресійна конструкція містить усічений рерАТт, промотор Ріас і сайт зв'язування рибосоми (КВ5) гена триозофосфатізомерази.
У одному варіанті здійснення даного винаходу експресійна конструкція містить усічений рерАТ, промотор РТ7 і сайт зв'язування рибосоми (КВ5).
Експресійну конструкцію піддають електропорації в Согупебасієегічт дішатісит і відбирають на чашках зі середовищем І В з використанням канаміцину як селективного маркеру.
Ріас являє собою сильний гібридний промотор, що складається з ділянки -35 промотору гр і ділянки -10 промотору/оператор ІасуМ5.
Послідовності рерА отримували з СепВапк і вирівнювали з білками із бази даних. Праймери конструювали для специфічної ампліфікації кодуючої ділянки нативного сигнального пептиду,
М-кінцевої ділянки разом з багатою на пролін ділянкою генів рерА, що стосуються сімейств 1 і 2.
Необхідні ділянки рерАт! і рерА2 ампліфікували з доступних клінічних ізолятів Зігеріососсив5 рпештопіає. Аналіз МНС пептидів показав, що рерАЇ є порівняно більш імуногенним, ніж рерАг.
Амінокислотна послідовність кодованого усіченого РерА1, експресованого і продукованого в
Согуперасієг чт дішатісит, наведена в ЗЕО ІЮО МО: 3, має певну інтактну масу, що становить 35452 Да.
Амінокислотна послідовність кодованого усіченого РерА!1, експресованого і продукованого в
ЕзспПегісніа сої, наведена в 5ЕО ІО МО: 4, має певну інтактну масу, що становить 41966 Да.
Послідовність ДНК, що кодує усічений р5рАт1, експресований в СогупебасіепйЧчт дішатісит і
Езсепегісніа сої, наведена в ЗЕО ІЮО МО: 5і 5ЕО ІЮ МО 6 відповідно.
Согуперасіегічт дішатісит (раніше відома як Місгососси5 дішатісив), що використовується для експресії усіченого рерА1, являє собою СКАБ5-мікроорганізм, грампозитивні паличкоподібні бактерії. Согуперасіегіцт дішатісцит являє собою (СВАБ5-мікроорганізм. Доступна повна геномна послідовність Согупебасіегпчт дішатісит АТСС 13032, яку можна культивувати до вищої густини клітин, і яка також є генетично стабільною за рахунок відсутності системи рекомбінаційний репарації. Вона має обмежену систему рестрикції-модифікації. Вона не виявляє аутолізу і може зберігати метаболічну активність в умовах затримки росту. Вона має низьку протеазну активність, що сприяє отриманню рекомбінантного білка. Пластичність її метаболізму і сильний вторинний метаболізм, здатність використовувати широкий спектр джерел вуглецю (пентози, гексози і альтернативні джерела вуглецю), стресостійкість до джерел вуглецю роблять її багатообіцяючим хазяїном для продукції гетерологічних білків. Такі фізіологічні властивості роблять Согупебасієгішт дішатісит доступною для маніпуляцій і культивування в жорстких виробничих умовах, що робить її успішною промисловою "робочою конячкою". Повідомлялося про гетерологічну експресію таких білків, як «а-амілаза, ендоглюканаза, ендоксиланаза, СЕР, ксиланаза і т. д., в Согупербасіенит дішатісит.
У варіанті здійснення даного винаходу вихід усіченого РерА1 становить приблизно 500 мг/л, приблизно 400 мг/л, приблизно 300 мг/л, приблизно 250 мг/л, приблизно 220 мг/л, приблизно 200 мг/л, приблизно 180 мг/л, приблизно 160 мг/л, приблизно 150 мг/л, приблизно 120 мг/л, приблизно 100 мг/л.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується пневмококової кон'югованої вакцини, що містить щонайменше один полісахарид з 5ігеріососсив5 рпеитопіає серотипів, вибраних з 1, 2, 3, 4, 5, бА, 68, 6С, 60, 7Е, 8, 9М, 9М, 10А, 11А, 12Е, 14, 15А, 158, 15С, 16Р, 17Е, 18С, 19Б, 19А, 20А, 208, 22Е, 23А, 238, 23Е, 248, 24Е, 31, ЗЗЕ, 34, 358, З5Е, 38, 39 ї 45, кон'югований з усіченим рерА1 за даним винаходом або комбінацією усіченого РерА!1 та інших білків-носіїв, таких як СКМ!97, правцевий анатоксин, коклюшний анатоксин; РзаА і тому подібне.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується полівалентної пневмококової вакцинної композиції, вибраної з 10 валентної, 14 валентної, 15 валентної, 17 валентної, 18 валентної, 19 валентної, 20 валентної, 22 валентної, 23 валентної, 24 валентної або 25 60 валентної композиції, що містить полісахариди з бігеріососси5 рпештопіає серотипів, вибраних
31,2,3,4, 5, бА, 68, 6С, 60, 7Е, 8, 9М, 9М, 10А, 11А, 12Е, 14, 15А, 158, 15С, 16Е, 17Е, 18С, 19Е, 19А, 20А, 208, 22, 23А, 238, 2ЗР, 248, 24Е, 31, ЗЗЕ, 34, 358, З5Е, 38, 39 і 45, кон'юговані з усіченим рерАї за даним винаходом або комбінацією усіченого РерАї1 та інших білків-носіїв, таких як СЕМ!І97, правцевий анатоксин, коклюшний анатоксин; рзаА і тому подібне.
У переважному варіанті здійснення даний винахід стосується полівалентної кон'югованої вакцини, що містить щонайменше три полісахариди з Зігеріососси5 рпештопіає серотипів З, бА і 6В, кон'юговані з усіченим РерАї за даним винаходом.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується кон'югованої вакцини, що містить полісахариди з 5ігеріососсив рпештопіає серотипів 3, бА і 6В, кон'юговані з усіченим РерА1 за даним винаходом, і зі зігеріососси5 рпештопіає серотипів 1, 4, 5, 7Е, 9М, 14, 18С, 19А, 19БЕ, 22Е, 23Е і ЗЗЕ, кон'юговані з САМ 97.
Даний винахід стосується складів, що містять приблизно 2,2 мкг або 4,4 мкг кожні з пневмококових полісахаридів із серотипів З, бА і 6В, кожний кон'югований з усіченим РерА1 за даним винаходом, і приблизно 2,2 мкг кожні з пневмококових полісахаридів із серотипів 1, 4, 5,
Т7Е, 9М, 14, 18С, 19А, 19Е, 22Е, 23БЕ і ЗЗЕ, кожний кон'югований з СЕМ 197.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується пневмококової вакцинної композиції у вигляді разової дози 0,5 мл, де разова доза містить приблизно від 2,2 до 4,4 мкг одного або більше пневмококових полісахаридів; приблизно від 1 мкг до приблизно 50 мкг усіченого РерАї за даним винаходом, кон'югованого з кожним з одного або більше пневмококових полісахаридів; приблизно від 0,2 мг до приблизно 1 мг ад'юванту на основі фосфату алюмінію; і ексципієнт.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується пневмококової вакцинної композиції у вигляді разової дози 0,5 мл, де разова доза містить приблизно від 2,2 до 4,4 мкг одного або більше пневмококових полісахаридів; приблизно від 1 мкг до приблизно 30 мкг усіченого РерАї за даним винаходом, кон'югованого з кожним з одного або більше пневмококових полісахаридів; приблизно від 1 мкг до приблизно 30 мкг СКМ!97, кон'югованого з кожним з одного або більше пневмококових полісахаридів; приблизно від 0,2 мг до приблизно 1 мг ад'юванту на основі фосфату алюмінію; і ексципієнт.
У ще одному варіанті здійснення даний винахід також стосується вакцини для профілактики інфекційного захворювання, викликаного 5ігеріососси5 рпештопіає, введенням кон'югованої вакцини, отриманої за допомогою кон'югації усіченого РерАї за даним винаходом з пневмококовими полісахаридами.
Приклади
Наступні приклади наведені для ілюстрації винаходу і призначені тільки для ілюстративних цілей і не повинні тлумачитися як такі, що обмежують об'єм винаходу.
Приклад 1: рекомбінантна експресія усіченого РерАї в Согупебасієгішт дішатісит.
Конструювання рВЕЗ1С
Невелику плазміду рВЕЗО, яка стабільно реплікується, з широким колом хазяїв отримували з використанням синтетичної плазміди, що має послідовність рМО2 огік розміром 2,692 т.п.н.
Використовуючи дану плазмідну ДНК як матрицю, ділянку огікк розміром 1,8 т.п.н. ампліфікували з використанням праймерів рЕР-Е1 (5-4600 бос АСТ АСТ АСА ТСТ АТО аТА ААТ Ста Са
АСА САС-3)) і рЕР-НІ (5-07а4С2а бос АСТ АСТ аАА тто пат вада ст АТа 2-3).
Одночасно ампліфікували послідовність Кап розміром 1,033 т.п.н. з використанням ДНК- матриці рОС4-КІХХ і праймерів Кап-г2 (5-ААа ТО Са апА Тс СОА ТАС СТА САС ТОс асо ат-3) ї Кап-Н2 (5-АДа сто ба оо зп осва бат бас то ато ао-3). Амплікон гена КапкК і амплікон огій лігували по тупих кінцях для отримання вектору рВЕЗО. Також експресійну касету розміром 0,851 т.п.н., що містить тандем з промотору їас Іас ОМ5, сайту множинного клонування, компонента Іас/а і послідовності термінатора ТітпВ, ампліфікували з використанням праймерів Ріас-Е1 (5-40 АС АСТ АСТ СТО ААА ТОА СТ СТ САС ААТ ТАА
ТО-3) Її Ріас-В1 (5-66 АОС АСТ АСТ ТТ ААА САТ САС СО АТА САТ АТТ ТОА А-3), кожний з яких додає сайт рестрикції 5реіІ. ДНК-матриця, що використовується для ампліфікації експресійної касети, являє собою РММВ206 (АТСС 37808). Потім експресійну касету клонували в унікальний сайт 5реї!, сконструйований в плазміді РВЕЗО. Плазміду, отриману таким чином, позначали як рРВЕЗ1С (фіг. ТА; 5ЕО ІЮ МО: 14).
Конструювання рВЕ117
Усічений ген рерАї (М-кінцеву ділянку разом з багатою на пролін ділянкою, фіг. 18) ампліфікували з капсульного серотипу 23Е Зігеріососсивз рпештопіає разом з розташованою вище ділянкою. Амплікон клонували у вектор ТА (ртТ257К/Тї, отриманий від Еептепіаз) з використанням праймерів РОРАЕТ ЕР (ТАТО ДАТ АДО ДАА дДАА АТО АТТ ТТА АСА АСТ СТА бо ОСС 3) РБРАБ1 КР (5'ССА САС АСА ТСТ ААА ТТА ААА ТОТ САА АТО ТТС ТТА АСА ТОС
ТТТ ААТ ТТТ ТАТ ТТТ ОСТ Ос 3) і послідовність підтверджували. Її позначали як рТ7-рерА1.
Послідовність нативного термінатора включали в зворотний праймер РОРАБЕІ ЕР. Ділянки, які визначають кладу, картували в отриманій послідовності усіченого рерАт1, для підтвердження його приналежності до сімейства 1 білків РерА.
Для експресії усіченого рерА1 в Согупебасієгічт дішатісцт вибрали промотор Ріс (БЕО ІЮ
МО: 2) і сайт зв'язування рибосоми (КВ5) гена триозофосфатізомерази (ЗЕО ІО МО: 7), що стосується Согупебрасіегішт. Ген рерАї разом зі всією касетою, включаючи КВ5, нативний сигнальний пептид (5ЕО ІЮО МО: 8), усічений ген рерА!1, нативний термінатор (ЗЕО ІО МО: 10), ампліфікували з використанням праймерів - 5ОТІССНОЗ19 ГЕРБ (БАС СаА ТО АТО СТА
САД ОО ТОТ ОТ ТСА ССС АТО ААТ ААДО ААА АА 3) і РБРА2 2ВАР (5 ТСА ААТ СТ СТ
ААС АТО СТТ ТАА ТТТ ТТА тоб ТОС доб дос То ТО 3) і рТГ7-рерАт1 як матриці. КВ5 включали в прямий праймер 50ТІСОКО949 ЕР5. Ділянку термінатора гппВ (5ЕО ІЮО МО: 13) ампліфікували з рВЕЗ1С, наявного у заявників, і лігували з геном, що кодує усічений рерА1, з використанням ПЛР на основі сплайсингу шляхом розширення перекриття (5ОЕ). Ген гппВ ампліфікували з використанням ТЕК ЕР2 (ТАТО ТТА АбБА АСА ТТТ САС АТТ ТТА АТТ Тоо
ССА СТО ОСС ОТО СТ 3)і ТЕК КРЗ (5006 АТА тоб АТС ССА ТА СО САТ АСА 3).
РБЗБРА2 2КР Її ТЕК БР2 конструювали таким чином, щоб мало місце перекриття 17 основ.
Обидва амплікони рерАЇ і гпВ додавали в молярному співвідношенні 1:11 і використовували як матрицю для ПЛР на основі 5ОЕ з праймерами ЗОТІСОКОЗ49 ЕР5 (5СБАС СОА ТО АТО СТА
БАД АС ТОТ СТ ТСА ССС АТО ААТ ААС ААА АА 3) і ТЕК КРЗ (5500 АТА ТО АТО ССА
ТОд СО ОАТ АСА 3). Потім весь амплікон, включаючи КВ5, нативний сигнальний пептид (ЗЕО ІО МО: 8), усічений ген р5рА1, нативний термінатор (ЗЕО ІО МО: 10), термінатор ггпВ, розщеплювали рестриктазою, доданою в прямий (50ТІСОКО949 ЕРБ) і зворотний (ТЕК КРЗ) праймери і клонували в експресійний вектор рРВЕЗ1С, сконструйований для Согупебасіегіийт.
Отриманий клон позначали як експресійну конструкцію рВЕ117 (фіг. 1С; ЗЕО ІО МО: 15).
Експресійний вектор разом зі усіченим рерА1 далі по тексту стосується експресійної конструкції.
Орієнтацію вставки (фіг. 10) підтверджували аналізом ПЛР. Послідовність усіченого гена рзрА1 разом з його експресійною касетою підтверджували секвенуванням ДНК.
Експресія усіченого РерА1
Експресійну конструкцію піддавали електропорації в Согупебасіегчт дішатісит АТС 13032 і відбирали на чашках із середовищем ІВ з використанням канаміцину як селективного маркера. Збирали двадцять рекомбінантних колоній Согупебасієй Чт дішатісит і аналізували за допомогою ПЛР. Було відібрано п'ять колоній для конститутивної експресії усіченого рерА1.
Рекомбінантні колонії разом з Согупебрасієгішт дішатісит АТСС 13032 (використовували як негативний контроль) інокулювали в 10 мл бульйону Тегійс з кінцевою концентрацією канаміцину 25 мкг/мл і інкубували при 35 "С зі струшуванням при 200 об./хв. Через 16 год. проводили повторну інокуляцію в 10 мл того ж середовища, вказаного вище, так що кінцеве значення 00 становило 0,1. Культури інкубували при 35 "С зі струшуванням при 200 об./хв. протягом 18-20 год. Через 18 год. культуральні супернатанти тестували на експресію усіченого рерАї. 30 мкл супернатанту завантажували в 1295 505-РАСЕ і аналізували на експресію усіченого рерА1. Видна помітна смуга приблизно на рівні 45 кДа.
Результати аналізу вестерн-блотингом з використанням поліклонального антитіла проти рзрА, специфічного до М-кінцевого епітопу (ЗапіаСтги7), підтверджували експресію усіченого рерА1. Аналіз експресії рекомбінантного клону 5 масштабували до 500 мл, і експресія усіченого рерАї була підтверджена, щонайменше тричі. Усічений р5рА! був спочатку очищений в дослідах зі струшуваними колбами з використанням смоли СНТ типу 1 і Саріо Орге55 майже до 9995 чистоти. Пізніше, після підтвердження стабільної експресії усіченого РерАї в С. дішатісит, експресію масштабували до 1,5 л.
Очищення і валідування усіченого РерА1 800 мл культурального супернатанта, що містить усічений РерАї з 1,6 л (0,66 мг/мл), отриманого як описано вище, діалізували з порогом відсікання за молекулярною масою 10 кДа і концентрували до 260 мл (1,92 мг/мл). 70 мл даного діалізованого концентрату піддавали очищенню з використанням колонок зі смолою СНТ типу 1 і Саріо О Ітргез5. Кінцеве діставання усіченого рерАї1 становило 162 мг/л.
Аналіз МАГ ОЇ М5/М5 гелевої заслінки, що містить очищений усічений РерА1 з 505-РАСЕ, дав чітку оцінку потрапляння 233 для пневмококового поверхневого білка А. 31 95 покриття послідовності (фіг. 2) було показано для білка РерА з білком з ідентифікаційним номером МОВІ
АВУб7187.1. Аналіз інтактної молекулярної маси показав, що молекулярна маса експресованого усіченого рерАї становить 35,4 кДа. Дана маса співпадає з теоретичною 60 молекулярною масою усіченого рерАї. Пік при 17725, являє собою пік молекули, що має заряд 2, оскільки в Іп/2 пік з'являється на половині інтактної маси усіченого рерА1 (фіг. З)
Приклад 2: отримання усіченого РерА1
Согуперасіегішт дішатісшит АТСС 13032, що несе експресійну конструкцію, що містить усічений ген рерАї! (далі по тексту що стосується рерАт), відновлювали з вихідного банку в середовищі І В. Його використовуали для інокуляції ферментера (об'ємом 5 л; СТВ). У процесі отримання контролювали наступні параметри: рН, Бо, температура (АТ), джерело вуглецю, метаболіти. Стратегія подачі, основана на технології автоматизації процесів (РАТ), була прийнята для проведення короткої періодичної ферментації з підживленням для отримання усіченого РерА1. Був відсутній індукційний контроль продукту (усіченого РерАТ), оскільки це був продукт, пов'язаний із ростом. ОО виходу зібраного продукту становила приблизно 90 (ОЮвоонм) на час збирання продукту в напівсинтетичному середовищі. Клітини збирали і промивали РВ5 перед руйнуванням клітин у Френч-пресі.
Очищення усіченого РерА1 16,2 л відпрацьованого середовища з концентрацією загального білка 0,8 мг/мл було зібрано з партії ферментації об'ємом 20 л. 16,2 л відпрацьованого середовища концентрували до 2,6 л (3,6 мг/мл) з використанням касети з порогом відсікання за молекулярною масою 10 кДа 0,5 мг з подальшою діафільтрацією проти 20 мМ фосфату калію, рн-6,8, електропровідність 3,2 мС/см. Ці 2,6 л розділяли на дві партії, тобто, партію 1 об'ємом 1,4 л і партію 2 об'ємом 1,2 л, і переходили до подальшого очищення. 500 мл смоли СНТ І вміщували в колонку НібсаЇе 50/40.
Смолу промивали стерильною дистильованою водою з подальшим урівноваженням 8 об'ємами колонки (СМ) 20 мМ фосфату калію, рН-б,8 (буфер А). 1400 мл (3,6 мг/мл) концентрату відпрацьованого середовища (партія 1) завантажували на колонку і збирали проточну фракцію.
Колонку промивали 5 об'ємами колонки буферу А. РерА1 елюювали в ступінчастому градієнті з використанням 250 мМ фосфату калію рн-6,8 (буфер В). Ступінчастий градієнт включав 5 СМ на стадії 40 95 В, 5 СМ на стадії 80 95 В ії З СМ 0,5 М калій-фосфатного буферу. Швидкість потоку підтримувалася на рівні 80 мл/хв протягом всього циклу. РерА! збирали у фракції 1 на стадії 80 95 В з об'ємом фракції 1250 мл (фіг. 4)
Саріюо О Ітргез55 використовували на другій стадії хроматографії в очищенні РерА1. 250 мл смоли Саріо ОО Ітрге55 запаковували в колонку ХК 50/20. Смолу промивали стерильною дистильованою водою з подальшим урівноваженням 5 об'ємами колонки (СМ) 20 мМ фосфату калію і 100 мМ масі, рн-6,8 (буфер А). 1250 мл фракції з колонки зі смолою СНТ І розчиняли до 2300 мл 20 мМ фосфатом калію, рн-6,8, завантажували на колонку і збирали проточну фракцію.
Колонку промивали 5 об'ємами колонки буферу А. РерАї1 елюювали з використанням 12 СУ буферу В (20 мМ фосфат калію з 1 М Масі, рнН-6,2) в лінійному градієнті від О до 4095 В і на кінцевій стадії З СМ 10095 В. Кожну фракцію збирали в об'ємі 250 мл. Швидкість потоку підтримували на рівні 40 мл/хв. РерАї збирали в лінійному градієнті 4095 В з об'ємом об'єднаної фракції 1250 мл (фіг. 5).
Фракції 4,5,6,7 і 8 з колонки з Саріо О об'єднували, концентрували/піддавали діафільтрації з 20 мМ фосфатом калію рнН-б,5. Отриманий кінцевий витяг становив 100 мл рерАї з концентрацією 15,5 мг/мл (загальна кількість РерАї становила 1550 мг) з партії 1. Аналогічну процедуру виконували для партії 2, і отриманий кінцевий витяг становив 70 мл рерАї з концентрацією 16 мг/мл (загальна кількість РерАї становила 1120 мг) з партії 2. Очищений
РзрА!1 з партії 1 і партії 2 становив 2670 мг з партії об'ємом 16,2 л (вихід очищеного РорА1 становив 164 мг/л) (фіг. б).
Приклад 3: конструювання рВЕ114К
Експресійний вектор рРЕЗЕТ А (комерційний вектор від Іпиїгодеп) модифікували видаленням гена стійкості до ампіциліну з використанням рестрикційного розщеплення Огаї і лігування з розщепленим 5таї геном, що кодує канаміцин (отриманим з рОсСА4 КІХХ). Даний модифікований вектор позначали як РКЗЕТ-Кт. Усічений РерА1 експресували в ЕзспПегісніа соїї під контролем промотору РТ7 (5ЕБО ІЮО МО: 11) рАфБЕТ-Кт. Коротку ділянку ДНК, що містить нативні термінатори, включали в зворотний праймер, використаний для подальшої ампліфікації рерА1.
Потім весь усічений ген рерАї разом з його нативним термінатором ампліфікували, розщеплювали рестриктазою, доданою в прямий і зворотний праймери, і клонували у вектор рРАБЕТ-Кт. Отриманий клон позначали як рВЕ114К (фіг. 10А). Експресійний вектор разом з усіченим РерАї надалі по тексту стосується експресійної конструкції. Експресійну конструкцію рВЕ114К підтверджували рестрикційним розщепленням (фіг. 108). Послідовність гена усіченого
РерАТ разом з його експресійною касетою підтверджували секвенуванням ДНК.
Експресія усіченого РерА1 рВЕ114К трансформували в хімічно компетентні клітини Ев5сПегіспіа сої ОНба - ТІВ 60 (отримані від Іпмйгодеп) і відбирали на чашках із середовищем ІВ з канаміцином, який використовували як селективний маркер. Було зібрано і проаналізовано за допомогою ПЛР 40 рекомбінантних колоній ЕзсПегіспіа соїї. Всі 40 колоній відбирали на індуковану експресію усіченого РерАї. Рекомбінантні колонії разом з ЕвзсПегіспіа соїї (як негативний контроль) інокулювали в 10 мл бульйону Тегпійс з кінцевою концентрацією канаміцину 25 мкг/мл і інкубували при 37 "С зі струшуванням при 200 об./хв. У середині логарифмічної фази росту додавали 1 мМ ІРТО для індукції експресії РерАї в ЕзсПегіспіа соїї (рВЕ114К). Культури інкубували при 30 "С зі струшуванням при 200 об./хв. протягом 16 год. після індукції. Через 16 год. культуральні супернатанти тестували на експресію усіченого РерАї1. Клітини збирали центрифугуванням, лізували і завантажували в 1295 505-РАСЕ і аналізували на експресію усіченого РерА1. Видна помітна смуга приблизно на рівні 65 кДа. Аналіз вестерн-блотингом з використанням поліклонального антитіла проти РерА, специфічного до М-кінцевого епітопу (ЗапіаСтги2), підтвердив експресію усіченого РерАЇї1. Аналіз експресії рекомбінантного клона 29 підтвердив експресію усіченого РерАї, щонайменше, З рази. Усічений РерА1 спочатку очищали в експериментах зі струшуваними колбами з використанням колонок зі смолою СНТ типу 1 і
Сарю О Ітргезв5.
Очищення і валідація усіченого РерА1
Відбирали 40 г (волога маса) клітинного осаду з ЕзсПегіснпіа соїї (рВЕ114К) і ресуспендували в 400 мл 20 мМ калій-фосфатного буферу з рнН-6,8, що містить 1 мг/мл лізоциму і 1 мМ РМ5БЕ.
Клітинну суспензію лізували з використанням гомогенізатора високого тиску за З ходи при 1000 фунт/кв. дюйм. 400 мл клітинного лізату із загальною концентрацією білка 4 мг/мл розбавляли до 750 мл 20 мМ калій-фосфатним буфером рН-6,8 і очищали, використовуючи смолу СНТ І, і потім смолу Саріо О Ітргезз на другій стадії хроматографії. 250 мл смоли СНТ | помістили в колонку НізЗсаіе 50/20. Смолу промивали стерильною дистильованою водою з подальшим урівноваженням 5 об'ємами колонки (СУ) буферу А. 750 мл розбавленого клітинного лізату завантажували на колонку і збирали проточну фракцію. Колонку промивали 5 об'ємами колонки буферу А. РерАїЇ елюювали в ступінчастому градієнті, використовуючи 250 мМ фосфату калію, рн-6,8, електропровідність 29,5 мС/см (буфер В).
Ступінчастий градієнт включав 5 СМ на стадії 50 95 буферу В, 5 СМ на стадії 80 95 буферу В, іколонку промивали 3 СМ 0,5 М фосфатно-калієвого буферу рН-6,8, електропровідність 48 мС/см (буфер С). Швидкість потоку підтримували на рівні 40 мл/хв протягом всього циклу.
Фракції піка білка РерАї1 збирали вручну, пул елюйованих фракцій 5, б і 7 на стадії 80 95 В з кінцевим об'ємом 350 мл (фіг. 11).
Саріо О Ітрге55 використовували на другій стадії хроматографії в очищенні РерА1. 60 мл смоли Саріо О Ітрге55 запаковували в колонку ХК 26/20. Смолу промивали стерильною дистильованою водою з подальшим урівноваженням 5 об'ємами колонки (СМ) 20 мМ фосфату калію і 100 мм Масі, рн-6,8, електропровідність 13,6 мС/см (буфер А). 350 мл фракції з колонки з СНТ І розбавляли до 700 мл 1 мМ фосфатом калію, рН-6б,86, завантажували на колонку і збирали проточну фракцію. Колонку промивали 5 об'ємами колонки буферу А. РерАї1 елюювали з використанням лінійного градієнта з 10 об'ємів колонки буферу В (20 мМ фосфат калія с 1 М
Масі, рн-6,2, електропровідність 89 мС/см) в лінійному градієнті від 0 до 40 95 В, які були зібрані вручну, фракції 4-8, 10 ї 11 складали 60 мл, і фракції 9 і 12 складали 100 мл (фіг. 12). На заключній стадії з 3 СМ 10095 В, збирали 180 мл у вигляді фракції 13. Швидкість потоку підтримували на рівні 10 мл/хв. Білок РерА1 збирали у фракції 9 в лінійному градієнті 40 95 В, яка становила 100 мл.
Збирали фракцію 9 з колонки з Саріо О, концентрували/піддавали діафільтрації з 20 мМ фосфатом калію, рнН-6,8. Отриманий кінцевий витяг становив 100 мл Ре5рАї1 з концентрацією
Б мг/мл білка (загальний білок РерАї7 дорівнював 500 мг) з 400 мл клітинного лізату з концентрацією 4 мг/мл. 95 витяг становив 31,25.
Аналіз МАГ ОЇ М5/М5 гелевої заслінки, що містить очищений усічений РерА! з 505-РАСЕ, дав чітку оцінку потрапляння 223 для поверхневого пневмококового білка А. 39 95 покриття послідовності (фіг. 13) було показано для білка РерА з білком з ідентифікаційним номером МОВІ
МР 050210652.1.
Аналіз інтактної молекулярної маси показав, що молекулярна маса експресованого усіченого РерА1 становить 41,96 кДа. Аналіз інтактної маси усіченого РерА1, експресованого в
Евспегіспіа соїї, показав 41966 Да (41,9 кДа), що співпадає з теоретичною молекулярною масою усіченого РерАт. Пік при 20982,7 Да є піком молекули, що має заряд 2, оскільки в Іп/727 пік з'являється на половині інтактної маси усіченого рерА1 (фіг. 14).
Приклад 4: кон'югація окремого пневмококового полісахариду з білком-носієм з утворенням кон'югатів полісахарид-усічений РерА!1 60 Активація серотипу З і кон'югація зі усіченим рерА1
Серотип З (6,0 мл Ре, концентрація 10 мг/мл) і СОАР (100 мг/мл в ацетонітрилі (мас./об.) в приблизному співвідношенні за розміром 1:11 змішували в скляному флаконі і перемішували протягом 1 хв. рН пневмококового полісахариду серотипу З доводили до 9,25 з використанням 0,2 М триетиламіну і перемішували протягом З хв. при кімнатній температурі (КТ). Усічений
РзрАї (4,0 мл з концентрацією 15,0 мг/мл) додавали до активованого серотипу З в співвідношенні 1:1 (усічений РерАї1:серотип 3). рН реакційної суміші доводили до 9,05 з використанням 0,2 М триетиламіну, і реакцію продовжували при змішуванні протягом 5 год. при кімнатній температурі, і, нарешті, реакцію гасили додаванням надмірної концентрації гліцину.
Реакційну суміш піддавали діафільтрації, використовуючи мембрану з порогом відсікання за молекулярною масою 100 кДа, і очищали за допомогою ексклюзійної хроматографії, де суцільна лінія відповідає полісахаридам, і пунктирна лінія - усіченому рерАї, і 5-годинна реакція представлена пунктирною лінією на хроматограмі А (фіг.7). Фракції аналізували антроновим методом 5ЕС-МАГІ 5, фракції, що містять кон'югати, об'єднували і стерилізували фільтруванням з використанням 0,2 мкм фільтрів. Далі даний матеріал називається моновалентним кон'югатом (кон'югат серотип З3-усічений РерА1).
Активація серотипу 6бА і кон'югація зі усіченим РерА1
Серотип бА (6,0 мл РБ5, концентрація 10 мг/мл) і СОАР (100 мг/мл в ацетонітрилі (мас./об.) в приблизному співвідношенні за розміром 1:11 змішували в скляному флаконі і перемішували протягом 1 хв. рН пневмококового полісахариду серотипу бА доводили до 9,25 з використанням 0,2 М триетиламіну і змішували протягом З хв. при кімнатній температурі (КТ). Усічений Ре5рА1 (4,0 мл з концентрацією 15,0 мг/мл) додавали до активованого серотипу бА в співвідношенні 1:1 (усічений РерАТ: серотип 6бА). рН реакційної суміші доводили приблизно до 9,05 з використанням 0,2 М триєтиламіну, і реакцію продовжували при змішуванні протягом 5 год. при кімнатній температурі, і, нарешті, реакцію гасили додаванням надмірної концентрації гліцину.
Реакційну суміш піддавали діафільтрації, використовуючи мембрану з порогом відсікання за молекулярною масою 100 кДа, і очищали за допомогою ексклюзійної хроматографії, де суцільна лінія відповідає полісахаридам, і пунктирна лінія відповідає усіченому РерАїт, ії 5-годинна реакція представлена пунктирною лінією на хроматограмі В (фіг. 7). Фракції аналізували антроновим методом 5ЕС-МАГІ 5, і фракції, що містять кон'югати, об'єднували і стерилізували фільтруванням з використанням фільтрів 0,2 мкм. Далі даний матеріал називається моновалентним кон'югатом (кон'югат серотип бА-усічений РерАТ).
Активація серотипу 68В і кон'югація зі усіченим РерА1
Серотип 6В (6,0 мл Р5, концентрація 10 мг/мл) і ССАР (100 мг/мл в ацетонітрилі (мас./об.) в приблизному співвідношенні за розміром 1:11 змішували в скляному флаконі і перемішували протягом 1 хв. рН пневмококового полісахариду серотипу 6В доводили до 9,25 з використанням 0,2 М триетиламіну і змішували протягом З хв при кімнатній температурі (КТ). Усічений РерА1 (4,0 мл з концентрацією 15,0 мг/мл) додавали до активованого серотипу 6В в співвідношенні 1:1 (усічений Р5рА1: серотип 68). рН реакційної суміші доводили до 9,05 з використанням 0,2 М триетиламіну, і реакцію продовжували при перемішуванні протягом 5 год. при кімнатній температурі, і, нарешті, реакцію гасили додаванням надмірної концентрації гліцину.
Реакційну суміш піддавали діафільтрації з використанням мембрани з порогом відсікання за молекулярною масою 100 кДа і очищали за допомогою ексклюзійної хроматографії, де суцільна лінія відповідає полісахаридам, і пунктирна лінія відповідає усіченому РерАїт, ії 5-годинна реакція представлена пунктирною лінією на хроматограмі С (фіг.7). Фракції аналізували антроновим методом 5ЕС-МАГІ 5, і фракції, що містять кон'югати, об'єднували і стерилізували фільтруванням з використанням 0,2 мкм фільтрів. Далі даний матеріал називається моновалентним кон'югатом (кон'югат серотип 6В-усічений Р5рАТ1).
Приклад 5: дослідження імуногенності кон'югованої вакцини
Готували два склади, що містять 2,2 мкг або 4,4 мкг серотипів 3, бА і 6В, кожний кон'югований з усіченим РерАї, що містять 2,2 мкг серотипів 1, 4, 5, 7/Е, 9М, 14, 18С, 19А, 19БЕ, 22, 23Е і ЗЗЕ, кожний кон'югований з СКМ197. Ці кон'югати були адсорбовані на А|І-гідрогелі.
Кроликів з масою тіла 1,5-2 кг розділяли на групи по 7 тварин в кожній і імунізували вищезгаданими складами кон'югатів. Зразки сироватки крові аналізували до і після імунізації.
Сироватку, отриману від імунізованих кроликів, аналізували на наявність полісахарид- специфічних антитіл в непрямому ЕГІ5А.
Титр сироваткових антитіл у імунізованих кроликів визначали з використанням непрямого 60 ЕСІБА. Планшети для мікротитрування, покриті специфічними полісахаридами, піддавали взаємодії з сироватковими антитілами. Сироватку кроликів до імунізації, після 1 і 2 дози використовували для аналізу, де на осі У представлений титр антитіл, отриманий з використанням зворотного значення максимального розчинення, яке дало ЕГІЗА ОЮ450 вище порогового значення. Титр сироваткових антитіл у кроликів до імунізації був нижчим межі виявлення. Пусті стовпці вказують титр після введення першої дози вакцини, і чорні суцільні стовпці вказують титр антитіл після введення другої дози вакцини (фіг. 8 і 9). Спостерігали дозозалежне збільшення титрів як серотипу, кон'гованого з усіченим рерАЇ, так і для серотипу кон'югованого з СЕМ197. Титри антитіл на полісахарид, кон'югований з СКМ197, не інгібувались присутністю кон'югатів з усіченим РерА!1 і навпаки. Це вказує на те, що усічений РерАї можна використовувати як альтернативний білок-носій для полісахарид-білкової кон'югованої вакцини.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ВІОТОСІСАТІ, Е ПІМІТЕР «1205» ЕКСПРЕСІЯ ПНЕВМОКОКОВОГО ПОВЕРХНЕВОГО БІЛКА А (РврА) «1305 рвБраАї «1605 15 «1705 РабепсІпПп уеквіоп 3.5 «2105 1 «2115» 795 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2205» «223» Ген стійкості до канаміцину «4005 1 аєчаєєдаас аачаєддаєє дсасодсаддеє ЄсЕссоЯддссЯя сЕсдЧоадсода даддадссасес бо часраєчдасеЕ доддсасааса дасааєсддс ЄдсеЕСЕєЧдасд ссоассЯасаєс ссоадсеєдесса 120 чдсодсаддддс дсссудеЕсЕ ЕЕЕЕЧдЕСаад ассдасседЕ ссудеЕдсссе дааєдаастд 180 садчасчдадд садсдсуддсе аєсдєддсвд дссасдасуд дсдЕєєссеЕвд содсадседчед 240 сЕСЧСасудеєєд єсасеєдаадс додааддадчас єддсеЕдстає єдоддсдааде дссодддадсад Зоо чаєсеЕссьЯеЕ саєсеєсассе гєдсЕССсСтвдсс дадааадтає ссаєсаєддс єдаєдсааєд збо сддасоуддсеЕдс абасусссда сСссудстасс Єдсссаєссду ассассаадс дааасаєсдс 420 аєсдадсдад сасдєасеєсу ддаєддадсс дадЕСЕсЯдЕєсС даєсачаєда сседдасоваа 480 чадсаєсадд додсЕсдсдсс адссдаассд Єссоаассаддс ссааддсодсоа саєдсссдас 5:40 часчадчаєс єсдЕСЯдєЄєЧдас ссаєддасдчає дссгдсеЕсоЯас сддаасаєсає двасодаааає бо чдоссСЯсСЕЄЕЄ седдаєєсає счасеєдеєдоас соадсЕдадЕЯ Єдоасодасся ссассаддас бо асадсдЕєдд срасссуєда СаєсдсеЕдаа дадсєсдоасуд дсдааєдддас Сдассдсесс 720
СсСЕСЧЯЕДСЕЕ асодадвраєсдс содсеЕсСссдає єсодсадсдса ЄсодссЕссса сСсдссессее 780 часчадеЕєсе єсвєда 795 60
«2105 2 «2115 30 «2125 ДНК «213» штучна послідовність «2205 «223» Гібридний промотор «4005 2
СЕдасааста аєсаєсддсеєс сдбаєааєдь 30 «2105 З «2115» 310 «2125 БІЛОК «213» вЕгсереЕососсцв рпешпопіаєе «4005 з сі Авр А1їа Рго Уаї Аїа Авп о сіп Бек пув Аїа бій пув Авр Туг Авр 1 5 10 15
А1ї1а Аї1а ув Агуд АБр Аї1а бій АБп Азїа пув їув Аза їей бій АБр Аза 20 25 30 гув Агуд Аїа сбіп Ппув Ппув Тук Ппув Авр АвБр біп Ппув ч11е ТПг біц с1ц
Зо пув Аїа бі біц сбіц пув пув Аїа Бек біп біц сбіп сбіп пув Аїа Авп бо 35
Те Авр Тук біп сіп Ппув Гец Агуд Ппув Туг тч11е АБп о біц Гпув Авр 5Бег 65 70 75 80 40 ув пув Агуд Бек Меє Гей біп пув бі Меє сій біш Ат1а бій Ага Гуз 85 90 935
Авр пув бій пув біп Аї1а бій Рпе Гуз пув І1е Агуд бій Ггув Уаі1і Ше 45 100 105 110
Рго Бек Аї1а бій бій тей ТПпг бій ТПпг Агу Агуд ув Аза бій бій Аїта 115 120 125 50 сій Аїа Ппув біц Рго сіц Гецшц ТПг о пув пув Уаї пув біц Аза сбіц с1ц 130 135 140 55 пув Уаі1 ТПпгЕ сбіц Аїа Ппув сіп пув Гец АвБр Аїа сбіц Агуд Аза пув с1ц 145 150 155 160 бо ма1 А1їа еп сіп Аїа гув ч11е Аза сій Гей бі АвБп бій Уаї Нів Агд 165 170 175
Те біц ТПпг пув Гецп Ппув сіц І1е Авр біц Бег Ар Бек біц Ар Тукг 180 185 190 уаї пув біц б1у Гец Агуд Аїа Рго Гей сіп бек сій Гей Авр Аза Гуз 195 200 205 сіп Аїа Ппув Гей Бек Ппув Ге сбіц сбіц Гец бБег Авр Ппув І1е АБр б1ц 210 215 220 еп Авр Аї1а біц І1ї1е Аїа пув геш біц пув Авр Уаї б1п Авр Рпе ув 225 230 235 240
Авп о Бек Авр с1у бій Туг Бек Аза Іїейш Туг тей бій Аїа Аїа сій Гув 245 250 255
Авр гей Аїа Аїа пув пув Аї1а бій тей бій пув ТПпг бій Аза АБр Іецй 260 265 270 пув пув Аїа Уаі АвБр сбіц Рго сбіц Ппув Рго Аїа Рго Аїа Рго біц ТПг 275 280 285
Зо
Рго Аїа Рго бій Аза Рго Аї1а бій біп Рго Гув Рго Аза Рго Аза РгОо 290 295 300 сіп Рго А1а Рго Аїа Рго 305 310 «2105 14 «2115» 369 «2125 БІЛОК «213» вЕгсереЕососсцв рпешпопіаєе «4005 4 сій Авр Аїа Рго Уаі Аїа Ап сіп Бек пув Аїа біц Гпув Авр Тукг Авр 1 5 10 15
Аза Аза пув Агуд АвБр Аза сій Авп Атїа пув пув Аїа теп бій АБр Аї1а 20 25 30 гув Агуд Аїа сбіп Ппув Ппув Тук Ппув Авр АвБр біп Ппув ч11е ТПг біц с1ц 35 40 45 пув Аїа бі біц сбіц пув пув Аїа Бек біп біц сбіп сбіп пув Аїа Авп 50 55 бо 60
Те Авр Тук біп сіп Ппув Гец Агуд Ппув Туг тч11е АБп о біц Гпув Авр 5Бег 65 70 75 80 пув пув Агд Бек Меє Гей сіп пув сіц Месє біц б1п Аза бій Ага Гув 85 90 935
Авр пув бій пув біп Аї1а бій Рпе Гуз пув І1е Агуд бій Ггув Уаі1і Ше 100 105 110
Рго Бек Аї1а бій бій тей ТПпг бій ТПпг Агу Агуд ув Аза бій бій Аїта 115 120 125 сій Аїа Ппув біц Рго сіц Гецшц ТПг о пув пув Уаї пув біц Аза сбіц с1ц 130 135 140 пув Уаі1 ТПпгЕ сбіц Аїа Ппув сіп пув Гец АвБр Аїа сбіц Агуд Аза пув с1ц 145 150 155 160 ма1 А1їа еп сіп Аїа гув ч11е Аза сій Гей бі АвБп бій Уаї Нів Агд 165 170 175
Те біц ТПпг пув Гецп Ппув сіц І1е Авр біц Бег Ар Бек біц Ар Тукг
Зо 180 185 190 уаї пув біц б1у Гец Агуд Аїа Рго Гей сіп бек сій Гей Авр Аза Гуз 195 200 205 сіп Аїа Ппув Гей Бек Ппув Ге сбіц сбіц Гец бБег Авр Ппув І1е АБр б1ц 210 215 220
Те АБр Аїа сіц І1їе Аїа Ппув Гец біц Гпув Авр Уаї біцш Авр Рпе Гуг 225 230 235 240
АБп оБек Авр б1і1у біц Тук Бек Аїа тей Тук Гей сій Аїа Аїа с1иц Гуз 245 250 255
Авр гей Аїа Аїа пув пув Аї1а бій тей бій пув ТПпг бій Аза АБр Іецй 260 265 270 пув пув Аїа Уаі АвБр сбіц Рго сбіц Ппув Рго Аїа Рго Аїа Рго біц ТПг 275 280 285
Рго Аїа Рго бій Аза Рго Аї1а бій біп Рго Гув Рго Аза Рго Аза РгОо 290 295 300 60 сіп Рго Аїа Рго Аїа Рго Ппув Рго біц Ппув Рго Аїа біц біп Рго Гувг
305 310 315 320
Рго бій пуб ТПг Авр АБр біп бі1іп А1а бій бій АвБр Туг Аза Агуд Агд 325 З3о 335 зек бі біц сбіц Туг АБп АгудФ Гец ТПг біп біп біп Рго Рго Ппув Аї1а 340 345 З50 сі пув Рго Аїа Рго Аїа Рго Ппув Рго біц біп Рго Аїа Рго Аїа Рго 355 З6о 365
Туз «2105 15 «2115 933 «2125 ДНК «213» вЕгсереЕососсцв рпешпопіаєе «4005 15 чаачасудсеєс сеЕдсадсваа ссадеЕссааа дсєдадааач ассаєдаєдс адсддаададда бо чаєдсеЕдада аєдсдааааа адсеєсададд дасдсаааасєс деЕдсдсадаа аааасаєсаад 120 чаєчассада ачасаассда ддадааадсуд даачаадааа ааааадссєс Ссаададсаа 180 сааааадсаа аєсєддасса єсаасаааад Єсєдчаддааає асаєсаасдда аааадасессс 240 ааааааадає сбаєдсесєса дааачаааєд дчадчаадссд ададчаааада Сааддааааа Зоо саадсадаає Єсаадаачає бададаааадч дчедчаєєсста дсодсддаада деЕсаасадад збо асєадасдаа аадсадаада додсєдаадса ааадаассад адсєсассаа аааадсаааа 420 чаачдссдадуд ааааадссас Сдаадссааа саааааєсдуда аєдседаасу Сдссааадаа 480 чЧЕЄДСЕСЕЕЄСсС аадссаааає содсєдадесд дааааєдаадч Єссасадасоі адааасаааа 5:40 сЕСааачача ЄЄєЧаєдааєс єдасеєсадаа чаєсаєдеЕса аадаадчдеєсс ссдасдсесссє бо сСЕєСсСааєстд ааєєддаєдс єаадсаадсе ааассаєсаа аасєсдаача чессдадесдває бо аачаєєчаєд адесадасодс єдаааєєдса ааасєєсєдааа аачаєдсада ачассссааа 720 аасеєсадасу ЧчЕДдаасасєс Сдсастаєсає ссєдаадсвд садааааача СЕгадседсь 780 аааааадсєд ааєсадаааа аасєдаадсе дассєсаада аадсадссєда сдадссадаа 840 ааассадсес садссссада аассссадсс ссадаадсас садсєдааса ассаааасса 900 дсдссдудсЕсС сеЕсаассадс Сссбдсасса аа 333 «2105 6 60 «2115 1110 «2125 ДНК
«213» вЕгсереЕососсцв рпешпопіаєе «4005 б чаачасудсеєс сеЕдсадсваа ссадеЕссааа дсєдадааач ассаєдаєдс адсддаададда бо чаєдсеЕдада аєдсдааааа адсеєсададд дасдсаааасєс деЕдсдсадаа аааасаєсаад 120 чаєчаєсада ачаєаасєда ддадааадсу даачаадчааа ааааадсєсс ссаададсаа 180 сааавадсаа аєссддасста Ссаасааагад ЄсСдаддааасє асассаасда аааадасессс 240 ааааааадає сбаєдсесєса дааачаааєд дчадчаадссд ададчаааада Сааддааааа Зоо саадсадаає Єсаадаачає бададаааадч дчедчаєєсста дсодсддаада деЕсаасадад збо асєадасдаа аадсадаада додсєдаадса ааадаассад адсєсассаа аааадсаааа 420 чаадсєдадуд ааааадессас єЄдаадссааа саааааєсдч асдссдааса Сдссааадаа 480 дЕсдсССсСЕЕєсС аадссаааає сдссдадчссд даааасСдаад ЕЄЄсасбадасе адааасаааа 5:40 сЕСааачача ЄЄєЧаєдааєс єдасеєсадаа чаєсаєдеЕса аадаадчдеєсс ссдасдсесссє бо сСЕєСсСааєстд ааєєддаєдс єаадсаадсе ааассаєсаа аасєсдаача чессдадесдває бо аачаєєчаєд адесадасодс єдаааєєдса ааасєєсєдааа аачаєдсада ачассссааа 720 аасєсадасуд деЕдаасаєєс єдсаєсаєає сеЕсдаадссдд садааааача сссадсесдсс 780 аааааадсєд аассадаааа аассдаадсе дассєсаада аадсадссда Сдадссадаа 840 ааассадсес садссссада аассссадсс ссадаадсас садсєдааса ассаааасса 900 дсдссддсЕс сеЕсаассадс Есссдсасса ааассадада адссадсєда асаассаааа 960 ссадаааааа сачаєдаєса асаадсєдаа дчаачассаєд сесдсадаєс адаадаадаа 1020
Баєаассудсе єдасеєсааса дсаассодсса ааадсадааа аассадсессс соадсассаааа 1080 ссададсаас садсеЕсссдс ассааааєаа 1110 «2105 17 «2115 20 «2125 ДНК «213» Согуперассегіцют дчішбатісшит «4005 17 бадаааддеєд ЕдДдеЕсЕсассс 20 «2105 8 «2115 93 «2125 ДНК «213» Б5Егергеососсив рпешшпопіаєе «4005 8 аєчааєсаада ааааааєчає єссаасааде сеадссадса ЄсодссассеЕє адддассдає бо бо ЕЕЕДЕЕдсЯЄ сЕсССудсстас єдЕєдеаада дса з3
«2105 13 «2115 31 «2125 БІЛОК «213» вЕгсереЕососсцв рпешпопіаєе «4005 19
Мес Ап опув Ппув Ппув Мес Іїе Гей ТПг бек Гей Аїа бек Уаї Аї1а І1е 1 З 10 15 теп б1у Аїа сіу Рпе Уаії Аїа Бек Бек Рго ТПг Уаї Уаї Агуд Аї1а 20 25 Зо «2105 10 «2115 38 «2125 ДНК «213» БЕгрерсбососсив рпешшпопіає «4005 10 аааєсааадс аєдессаадаа саєссдасає сссааєсь 38 «2105 11 «2115 19 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність
Зо «2205 «2235» Промотор РТ7 «4005 11
Єаасасдасе сассаєад 19 «2105 12 «2115» 1854 «2125 ДНК «213» Согуперассегіцют ЗірпЕБПегіає «4005 12 чааєєсодадеєд аддеЕсаєдоас ддвададеЕєдс дададеєссада адаасачада аадссаєсдсс бо
Ебєдаадсаєа єаадсеєдссс ЄдссссеЕСВа ЯсдЕсесссеЕссС аадедчадаєє ссаєсссєаась 120 дссЕаасддс аддоддаассу басаєєсдсеЕє асоадсаєдад ассссеєсааа сасссоадаєа 180
ЧдЕсассдсЕсС ЕЕСЕЕвсадсе ссоосдасаєсд сстадсаасс дЕддсодсдад адасссстас 240 сСЕСЕДДссссЕ аєєєсадссс асаєдоадаас ЄдЕСсСссЕдЕСсС Єддааасасеі даєссадсссас Зоо саєєсєддсва абасудддасе Ссудсбадаєсу ЄссеЕЄДдадсес ЕЕСЕЕССсССас ддарєдсдессе збо
ЕссаадсеЕєс дассЕссудєд сЕєдсддсасба СЄСЕддсссЕсСу ДоОдЕСЕДЕЕ Сссадсоаєсд 420
ЄЧдсСЧдсЕСЕЕ ЕДЕССЯЯСсССсСЕС єдсдЕєсссає садсддссаад ЯсСЕСссссоасе соассдссоде 480 бо ЧдасЕЄсСассо доаосдсоаєссад адссдсеЕдса ддЕсЕсдсЕС Еєдаєсдад сдасаєбасссе 5:40 чдсдсасдсдс сЕєЄДдссаєда ЕЄЕЄєдоадсоадЕСсС дсоасаєдаді доасассеєсає сдссоасоадсс бо
Едсассдсса ЄдодЧЕЧЕЧеЕЯЧ счасаєєдса доасаєдсеЕса саддсоаєсдча Єчассдссдс бо
ЧдЕСЕЯДсСсСадуд сУссдуЧссСЕЕ дсЕддсодсаа дсдЧдЕддсса ЧдЧЕСЕтаадсу саєдесстааваа 720 часСЕЧЕСЕСсСУЯ ЕСУОСУЧЄЧСсСвд соЯодЕсЄсСсеЕсд дасааєссад адсасасодса сассаяаєссдає 780 аадсєссоддда єсаваседдчеЕ сдадассасс ддсдаєєєєсс дсдЕСТтТасдє ссеЕдддсдад 840 7 ЄдсЕЄєЧдаає чсЕсЧЧддЧсСЕЄ сЕєЄСасодсоа дЯдссЕЄдасс дсаєсєдаєаа дЕссоадсоадсс 900 ачадсєдаає ЄдсЕЧдасоає4д доадЕдЧадЧаЄЕ даасеєдадєся ЄдЕссєдсса бассссесас 960 седсЕсСТаєс аадссессаа ддсдсаєсас ссодЕСдЯдЕдс Едсстасасс аасддаєаадс 1020 чабаддддсєс ЕєДсСсСЕдсдЕ адаасудддсєє дсддссааад соддсдоадааа адедсдадеіс 1080 асддеЕссааа адсссассса дсасасудсудє ддЕєдссдса адаадсссса сСседсдсада 1140 7 Ессассудеєса соддссадсудє адасадддсс аасаадссає аєдаассддщд сЕЕсдссєе 1200 адеЕЕдддеЕєа абасссассс аддссддссс дасуссаєда деааєссадед адсдсассас 1260
ЧдЕсдсддасуд басддЧдсєєста адеЕссдсудда десассдссо дсуддеасста сЕєддЕсаас 1320 дЕстасдасс аддасддсудд сдбтасеЕдсс додасддасдадс аєддсдбасе сдсассдесс 1380 бааадсаєса дЕСсСссдаадс дасасасасуд сддсдадеєс деЕдссдссад сдеЕсдсдаєсд 1440 7 асадудссеЕс єсааадесес деЕдсдасеєда ассудєддаді асассодсддас стадаєдаєс 1500 чдсдЕаааагдд Есдсуддессас Сддсадаєдс єдоддаасдЕеЕсд ЕсСсадеЕссас сасддеісддсд 1550 сЕсдасдсоуд ЧчеадчЕдсьє садсдеЕдсдс асєсєдсдса ЕдчадеЕССдта аасссаєдас 1620 сдЕчдчасєєсс сссаддєдеЕд Сдсєдуддєда бЄаадсдааад ЕсассододдеЕє дссдсссдаде 1680
ЧФасСЕСССЕЄС ДЯЕСЕЕеСаєє ДдЕСЕСЕСсСссе дасеЕссааає дасассудеЕд Стаєсстасса 1740 7 дссаєдасас дсдаааааста СудссСсЕсас ссдсуддеЕстас деаєсддссад асасаєсддса 1800 адстасасує аассудсдЕсєс садссдсаса дддсєдЕсСвд сдсадасста ссає 1854 «2105 13 «2115» 627 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2205» «223» термінатор ггпПВв «4005 13 сддсасеЕддс суссУєсста саасдЕсуєд ассдддаага сссгддсдЕЕ асссаасеса бо аєсдссЕєдс адсасаєссс ссЕсЕсодсса дсєдоассаає адсдаададд сссодсассда 120
ЕсдсссЕЄєсс саасадеЕсєдс дсадссєдаа Єдоасдчаєдоас ЄЯдЕсєссоддсоа дчаєсдададаа 180 7 чавєєєєсадс сеєдаєасада єсаааєсада асодсадаадс дассеєдаєаа аасадаасес 240 чЧдссЕддсоддс адрадсдсуда єддеЕсссасс єдассссаєдд ссдаасесад аадсдааасд Зоо ссдбадсодсс даєддеадед єдоаддадЕєсЕсс ссаєдсдада дсадоадаасоі дссаддсаєс збо ? ааасаааасу аааддсеєсад єсдааадчасе дддассеЕєєесу вврасстЕдйеЕ пююдчеевчесодл 420
ЕдчаасдсеєсеЕ сседадсадуд асаааєссодс соадддадсоада Єссдаасуаєс дсдаадсаас 480 чдасссддадда чдЕддсодддса ддасдсссдс сабааассдс саддсаєсєсаа аєгсаадсада 5:40 аддссаєсссс дасудасуддс сЕЕССЕусуєЄ ЄсСстгасааас ЕСЕСЕрУЧЄє аєтсесваа бо асасасссаа асаєсдсаєсс дсесаєд 627 «2105 14 «211» 3784 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2205» «223» рвВЕЗ1С «4005 14 асрадеЕсєЧда ааєдчадседеЕ єдасааєстаа єсаєсудсеєс драєааєдед єддааєтчед бо адсддаєаас аареєссасас аддааастад дсассссаддд сЕЕрасасьє гаєрдсесссд 120 дсЕСЧОСаєдс єдсдЕддаає СдЕдадсуда Єаасаасрсєс асасаддааа садссаєдас 180 саєчаєсасу ааєєсссоодуа даєссдєсда ссєдсадсса адсеєсддсас Єддссаєссає 240
БЕєасаасуає сдєдасеєдодад аааасссвєдуд сдєсасссаа сеЕсааєсодсс ссодсадсаса Зоо 7 ЄсссссЕвЕсС дссадседдс баасадсдаа даддсссдса ссдарсдссс ЕЕсСссаасад збо
Еєдсодсадсс єдааєдодсда єдасЕдЧЕЄЕЄ доасодаєдадч адаачасєєєс садссеєдаєа 420 садаєсааасє садаасдсад аадсддЕссд асСаааасадча аєссдсссдуа соддсадеадс 480 чЧсоддЕдЧдЕсСс сассеєдассс саєдссдаас єсадаадесда аасодссоаєбад соассдачаєсоаде 5:40 адеЕдеЕдддадЕ сеЕСсСссаєдс дадчадсаддад аассдссадд саєсаааєаа аасдаааддс бо о ЕсадеЕсдааа часеЕддудссе ЕєЄСсСУЄєЕЕває сЕдеЕЕЧєєвд єСОЧдЕДдаасуд СЕСЕССтЕДЧдад бо
Баддасааає ссоудссоудддад соуодаєєєдаа сдЕєдсдаад саасддсссу даддадедасд 720 чдадасаддасдс ссдссасааа сЕдссаддса Єсааассаад садааддсса Ссссдасоддда 780
ЕДдЯСсСсССЕЕЕС дсуусЕЄССас ааасссЕвст дсстасєєєс свраааєасає Ссааваатєаєде 840 аєссдсеЕсає дЕссаааасе адессдададє сссоадоадаєЄє доадсаєсасеЕ сЄоддссоадесса 900 7 бЕєсСдаассс сададесссу сесадаадаа сеЕсдЕсаада аддсдасада аддсдаєдсд 960 сЕдсдааєсу ддадсоддсда бассдєааадч сасчададаадч соддесадссс асссодссосс 1020 бо аадсЕсЕєса дсаастассас доадсадссаа сдстасдеЕсс Едчасадсддде ссдссасасс 1080 садссддсса садссдаєда асссадаааа дсддссавфес Ессассаєда сСарссддасаа 1140 чдсаддсаєсуд ссасдддсеса сдасдадасєс сссдссдЕсуд дадсаєдсдсд ссеЕєЄдадсся 1200 чдасчаасадс ЕсддсеЕддсу сдадссссстд асдсєсессу ЕсСсадаєсає сеЕдчаєсддаса 1260 адасссуддсес ссассссдад Сасудсдсесу сссдасдсда ЕДЕСЕсСудсСЕЕ даєддЕсдаа 1320
Еддодсаддба дссуддаєсаа дсудсбаєдсад ссдссдсаєс дсассадсса Сдаєддаєас 1380 7 вЕсСсеЕсдудса ддададсаададі дадасдасад дадаєсстдс сссдудсасьє сдсссаасад 1440 садссадеЕсс сЕЄсссЯасЕЄ садедасаас деЕсдадсаса дссдсоаасаад даасдсссдае 1500 сдЕддссадс сасдаєадсс дсодссдсссс дессєдсадо єсаєсєсаддад сассддасад 1550
ЧЕСЯДдДЕСЕЄд асааааадаа ссодддсдссс сеЕдсодсєдас адссоодааса соадсоддсаєс 1620 ачдадсадссу аєєсдЕСсдЕЕ деЕдсссадсс асадссудаає адссесссса сссаадсддс 1680 7 сддадаасссї дсдсдсааєс сарссєтєдеєсс аассасдсда аасцчаєсстс ассдеьссс 1740
Есдаєсадає сеЕсдаєсссс Сдсдссаєса дасссссдудс ддасаадааад ссаєссадсе 1800 басЕєсдсад додссЕсСссаа ссЕсСассада дддсдсссса дссддсаатє ссоадесесдсе 1860 гЄдсЕДдсссає аааассдссс адессадсса ссдссаєссс ддадассессе адесадаєссд 1920 ааєєсддЕЧа дассаєддсу дадддЕєдсу аддессадда даасададда адссаєсдссе 1980 7 Едаадсатає аадсеЕдсссе дссссесаад ДЧФЕЕЕССЕЄСа адсдадддєее саєссаассод 2040 ссгаасуддса доаддаассує агассдссса сддсасдада ссссеЕсааас дЕССсСддаєсад 2100
ЕсассдсЕсс ЕССсСтадсес сдсдасаєдс ссадсаассуд гддсодсдада дасесстасс 2160
ЕсеЕдссссва ЕЕсСсадссса сдЕдддаасі дсссссдЕсСс ддааасастд ассдсєссасс 2220 асстддстаа гасудддасеЕє сдрадаєсує ссеЕЕЧдадсесс Ессе Сасу деЕдсдеЕсесе 2280 7 ЕсаадсеЕєссу ассЕеЕудсдс СсСеЕдсдсавбає ссдссссоуд дадссЕдеЕсЕеЕє ссадсде де 2340
ДФсСЯдДсСЕЕЕС дЕССдсСсСЕсСЕ дсудссссаєс десддссаадда сеЕссссусес дседстоЯ9Чед 2400
ЧФсСЕЕсасстд ЧдчЕдсЧдєсСада дссусеЕЧдчсад дссЕСЯСЕССЄ єддаєєддодс дасасбасссд 2460 сдсасдсдсес Еєдссаєсдуає СЕддсдаєсд сдсаєдддед дсассесдеЕе дЕСЯдДсЯдссЕ 2520 дсассдссЯає дадЕдЕдсдс дасуаєєдсад дсдеЕдсеЕсає аддсдєсдає чаєсдседсд 2580 7 ЕсеЕдеЕсаддс дЕсСддссСЕвд сеЕддсдсаад сддеЕддссад ЕСсССсСсаадсдс агдесстааад 2640 дсСЕДЕСЕСсСУЯєЄ содсудєдссдс ддгсссесду асааєссада дсасасдсас ассдєсдаєса 2700 адЕЕссддудс сасасеєддес дадассассу дсчдаєсєссу сдєстасддєс сЕдддсдваде 2760 дсСЕЕєдааєд сЕсСдДУдЧСсСЕЕСсС СсСЕСсСасуддсдудд ДЕСЕЄДассу сдссдаєсаад СЕсдсддесса 2820 чадсєдааєс дссдодсаєда дагдоаддЧаєсу аасеЕддеЕсудє дЕССтЕдссає агсссттасс 2880 7 гдсСЕЄсСаєса адссессаад дсдсаєсасс суддЕєдЕдсс дссставбасса асдасаадсд 2940 чсаддддсЕс єдсстдсдсра даасдудаєсдд сддсєааадс дасдоддаааа деЕдсдддеЕса Зоо бддЕСсСаааа дсссасссад сасасудсудєд дЕсдссдсаа даадсессає сеЕдсдсадає зо6о ? Есассдєвтас ддассадсудбра дасадддеса асСсаадссаєба гдааседддс СЕЕдссоаєса 3120 дЕсдоддеЕсаа гбасссассса дудссддсесссуд асдсбаєдад баассадсда дсдсассасд 180
Есдсоддасує асддчєссаа дЕССдсооддуд Єсассдесвд судбассстас сгЕддаєсаас 3240
Ессасдасса ддасуддсддс деассдсеєсдд дсддєдадса гддсудбасес дсассдеуссе Зоо ааадсаєсад Есссдаадсуд абасасасдс ддсдадеЕєсд гдссдЕсадс дЕєдсдеЕсда 3360 7 гаддссЕЕс гааадесссу СдеЕдаседаа ссдгддадса сассдсддес Садаєдаєсд 3420 сдсаааадді сдсдудеЕсасе ддсадаєдсе доддЧдєдЕсЯдс ссадессасс асуддісдсдес заво
Есдасдсудуда гадудЕЧЕстєЕ адеЕдсдсдса ЄсСсЕдсдсає дчадесьдсаа асесаєдасе 3540 чЕдаєсєсьс ссаддеЕдсдЕ дсеЕдддеЕдає аадсдааадс сассуддаеєєд ссдсссоадеід збо
ДФСЕЕСЕСЕЕСУЯ ЕЕСЕЕСсСаєтуд СсЕССсссод асессаааєд асассодеЕдЕеЕ Саєссассад збо 7 ссаєдасасуд сдааааасає дссЕсеЕврасс єдсуддесасу гасддсесада сагасддсаа 3720 дстасасувєа ассдсдсєсес адссдсасад ддсЕдсстдс дсадаєссас сагадаєсса 378О сгад 3784 «2105 15 «211» 5501 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2205» «223» рвЕ117 «4005 15 асрадеЕсєЧда ааєдчадседеЕ єдасааєстаа єсаєсудсеєс драєааєдед єддааєтчед бо адсддаєаас аареєссасас аддааастад дсассссаддд сЕЕрасасьє гаєрдсесссд 120 о дсЕСЯОваєдЕ ЕЧ9ЕЧЕЧддЧчаає ЄдЕЧадсоода баасаасссс асасаддааа садссаєдас 180 саєчаєсасу ааєєсссоодуа даєсстадаа аддєдеЕдеЕсс сасссаєдаа сСаадаааааа 240 асчаєсєвсаа саадеЕссадс садсдЕСсудсе ассеЕсадада сЕддеЕЕссЧє сосуєсессо Зоо ссрасеЕдеЕєд єаададсада адчасдсеєссеЕ дсадссаасс адсссааадс сдадааадас збо
Баєчаєдсад сдаачачача єЄдсеєдадчаає дсдаааааад сессададда соаасаааасає 420 7 чдсдсадаааа аасаєсаадда єдаєсадаач асєаасєдад адааадсодда адаадааааа 480 ааадсЕєсеЕс аададсааса аааадсааає сєддассаєс аасаааадес даддааасає 5:40 бо ассаасдааа аадасессаа ааааачассеї асдсеєссада аадааасдчда дчаадсеєдад бо ачаааачаєса аддаааааса адсадааєсєсє аадчаачаєса дадаааадає часссстсадс бо дсддаададі Саасададас садасдаааа дсадаачдадуд ссдаадсааа адаассадад 720 сЕбассаааа аадсаааача адссдаддаа ааадеєсасєд аадссаааса ааггаєсєодає 780
ЧдсЕЧдаасудєд себааадааде єдсЕсСЕєсЄсаа дссааааєся сєдадеЕсода аааєдаадес 840 саєадасвсад ааасаааасє сааачачаєє дчаєчааєссдд асссадаача ссасдссааа 900 7 чааддеЕсеЕсс дЕДдсЕсСсСЕсСЕ єсааєсєдаа Єсодаєдсса адсаадссаа ассаєссаааа 960 сЕсдаачдаді єдадедасаа чаєсдаєдад ЄсСадасудсеєд ааассдсааа асесдааааа 1020 чаєдсадаад аєсссааааа сеЕсадасудЕ даасасєсьд сассаєаєсяє сСдаадседса 1080 чааавадаєс гадссдссаа аааагадсєдаа ЄсСадаааааа седаадссда ссесаадааа 1140 чсадеЕєдаєд адссадаааа ассадсеєсса дссссадааа сессадсссс адаадсасса 1200 7 дсЕдаасаас саааассадс дссудсеЕссЕ саассадсес седсассата ааааєсааад 1260 саєдеЕсаада асасєєдаса СЕЕсааєрсєсс ддсассддсес дЕСЯЄЕсСсСас аасаєсдавєда 1320 сгдддааагс сссддсусєта сссаасеЕсаа Єсдссссдса дсасаєсссс сЕЕсСсдссад 1380 сеЕддссааса дсдаададдс ссдсассдає сдсссссссс аасадесдсд садсседаає 1440 часчасдусс дЯдчЕсСсСедодсудуа аєдададаауд ассессадсс єдасасадає Сааассадаа 1500 7 сдсадаадсуд дЕСсдасааа асадааєссдд ссеЕддсуддса деадсдсддаЕ ддеЕсссассе 1550 чассссаєдс сдаасесада адгсдааасдс сдсадсдссуд аєддтадесдеЕ ддддеісьссс 1620 саєдсдачад гаддчдаассд ссаддсаєсса аасаааасуда ааддсеєсаде сдааачассд 1680 дассЕСЕсСУєЄ ссасссде дЕЕсдЕСУддДЕ даасудсссьсС сеЕдадсадда сааасссдсс 1740 чачадсододає єєЄдаасудєєд сдаадсаасу дсссоаодададд Єдоадсоддасад дасдсссодсс 1800 7 асааассдсс аддсаєсааа Ссаадсадаа ддссасссвд асдддаєддсс СЕЕСССсЧЄЄ 1860
Есгсасааасс сЕсстуєста сЕссСсвааа сасаєссааа гасдтаєссу сеЕсасддадає 1920 ссдЕСсСдассо дсадссаадс СЕддсассдуд ссдЕєсСдЄЕЕс асаасаєсає дассддадааа 1980 асссеЕддсдс гасссаасеє аарсдссеєсуд садсасаєсс сссЕЕсдсс адсєддсеаа 2040
Бадсдаадад дсссдсассу арсудсссееєс ссаасадеєд сдсадсседа аєддасдаєдд 2100 7 сЕдЕЄСсдодс дадаєдадада адасстєєсад ссєдасасад аєсаааєсад аасдсадаад 2160 сддЕСсдаєа ааасадааєє Сдсссддсдуча садсадсудсуд деЕддЕсСссас сеЕдассссає 2220 дссдаасеса даадедааас дссусадсдс сдаєддабадсе чЧчеЕддддссеЕсС сссасдсддад 2280 адсадддаас Едссаддсає сааасаааас даааддссса дЕсдааадас Судддссессс 2340
ЧЕсЕсСасстд ЕКЕЧ9ЕЕвудєЄсСУЯ деЕдаасудссс сссеЕДдДадсад дасаааєсссдя ссодддадсдд 2400 7 аєєєдаасудє єдсдаадсаа сддсссоддад ддЕддсодддс аддасдсссуд ссагбааастд 2460 ссаддсаєса аассаадсад ааддссаєсс Єдасуддасєдудда ссЕсеЕссдсд СЕсСсасааа 2520
СЕСЕЄСЕЧЄ гассєєсста аарасаєсса аасаєдсаєс содсссасдеЕє Саааастаде 2580 ? ссдаддеЕссс дадоаддЕсдоЯд сдЕсдсеЕсду єсддесаєеьс сдаассссад адрсссддсєсс 2640 ачаачаасес дЕСсаадаадуд счаєсадаадд счаєдсодссд сдааєсєсооддада дсоадсдасас 2700 сдЕааадсас даддаадсудд Ссадсссасе сдссдссаад сЕСЕЕСсСадса агассасдадд 2760 бадссаасоудс гасдеЕсссда Садсддоссуд ссасасссад ссддссасад Ссдаєдааєс 2820 садаааадсуд дссаєсєсссс ассаєсдасає ссддсаадса ддадсаєсдсса Сдодадссасда 2880 7 сдадчасссес дссдЕсдддс абдсдсдссе Єдадсссддс даасадсссу дсеЕддсдсда 2940 дсссссдаєд сеЕСсСсЕсудєсс адаєсаєссд ассдасаада сссддсеєссса Ссссдадесас Зоо
ЧдЕдсЕСЯдсСЕС дасдсдчасдЕ СЕСУОСЕєДдДЕ ддЕСсСдааєдда дсаддєадсесс дчдаєссаадсд зо6о баєсдсадссуд ссдсаєсдса Ссадссаєда Єддасасьсєс сеЕсддсадда дсааддедад 3120 асдасаддад аєсстдсссс ддсасеЕссдс ссаасадсад ссадеЕссстє сссдудсеєсад 180 7 Едасаасуєс дадсасадсеє дсдсааддаа сдсссуЕсдЕ ддссадссас дагсадсс9дсд 3240 сеЕдссссуєс седсадессса сСссадддсас сддасаддес ддссЕЄдаса аааадаассд Зоо чддсодссссвд содссдасадс соддаасасду сддсаєсєсада дсадссдаье дЕССЯЕєЧУГЇЄ 3360 сссадесаєа дссдаасадс сеЕСЕСсСсассс аадсоддссод адаасссдса Єдсааєсссає 3420 сЕсдеЕсСсаас сасдсдааас даєссесаєс ссдЕсССссСЕвуд аєсадасстє даєссссвдс заво 7 дссаєсадає ссссуддсдудс аадааадсса Єссадесстас ЕєсСдсаддде СЕсСссаасся 3540 бассададдд сдссссадсе ддсааєсссу ДдЕссСудсЕвдс гдсссасааа ассдсссаде збо стадссаєсуд ссаєсссдуду ассссстадеЕ адаєссдаасє ЕСддЕЧЄадчє сСаєддсоадад збо чЧаЕЕдсдадд ЕссСаддадаа сададдааді сасдсссєда адсасгасаад сеЕдссстдсс 3720 ссеЕсааддеЕс ЕЄСсСЕЕсСаадеі даддасеЕєсає ссаассдссо аасддсаддд даассдтаєса 378О о ЕсдсеЕсасодд гасдадассс сеЕгааасудсс суддасадеса ссудсеЕсесссе Стадсессдес 3840 часаєдсста дсаассусдуд сдсдададас Єсстассесс дсссстасеє садсссасдаеі 900 чадаасеЕдЕС сссдЕССдда аасасеЕчдчаєс деєсассаєєс єддстаасас доаоадчасеЕєсЧе 3960 ачаєсуєссс ЕдадссеЕсеЕ ссеЕсСасусд судссеЕсеса адсеЕесдасс СЕУЧЯЄЧСеЕС 4020 сдсавсастєвудд сссссуддеЕ сЕДдеЕсСеЕсса у дсуєсдуЄєдсу дсССсЕЕЕсСддЕС судсесісвдсд 4080 7 Есссассуєд дссаадддасеЕє Сссусесуасе дседдсдуасс Есассвддед сдеЕсададсес 4140 дсЕдсаддес ЕсдсЕСсСссддуд асєсддадасдас асСсасссдсдс асдсуссетд ссасддеЕєсд 4200 бо чдсаддЕСЯдсоЯс аєддЧчеЕддса СсЕСЯЕЕЧ СС дсдодсседса ссдссоасдоад ЄдЕдсдсдас 4260
ЧдЕсдеаддсуд Едсссасадда сдеєсдаєдає сЄдсеЕдсдеЕсс деЕсаддсууєєе ддсессєсєтодссд 4320 дсдсаадсдд Еддссадесе Саадсдсаєд Єссаааддсс дЯдЧЕСССЯЄсдс дЕДЯДССдсоадЕ 4380
ЕссЕєЄддаса аєссададса сасдсасасс дссчасаадс ЕССсСддддаєсає аседдеЕсдад 4440 ассассддсуд аєєссссдсудє стасдеєсссуд ддсдадеЕдесс Есдаардчсеє доддссссесс 4500 асддсдуддЕс ЕєДассдсує Сдаєсаадесс дсддссадад сеєдааєсдсе доасадсддадве 45560 чадЧдЕєсдаас годдссЯасдЕС сеЕдссараєс ссеЕрасстдс ЕЄсСаєсаадеі сЕССааддсд 4620 саєсасссдд ЕЄДСЕдссдсс Сагассаасу асСсаадсуддса доаддсЕссдс сеЕдсдсадаа 4680 сдаЧчЕсдсодд сеааадсдЧчЕ додчаааадсд сдддєЕсаєдуа єСсСсСаааадсе сасссадсас 4740 асдсдсдЧЕс дссдсаадаа дсеЕссаєссд сдсадаєєса ссудссасудє садсдбсадас 4800 адддеЕсааса адссагбаєда асеЕдддсЕсс дссуєсадеьс доадессаасас ссасссаддес 4860
Еддсссдасуд сбаєдадсаа Ссадсдадсуд сассасдусуд соддасдбасу ддЕссаадесс 4920
ЕдсддддеЕса ссдсседсудд Сасссасеєсуд дссаасудсєссі асдассадда сддсддсдаєба 4980 сеЕдсСЕсЯдЧєд ЧдЕДдадсаєсоддуд сдбасеЕсдса ссдЕСсСстааа дсассадссе сдаадсдаса 5040 сасасдсуддс дадеЕссдсдс сдеЕсадсуєє дсудеєЕсдатрад дєссЕєЕеЕссваа адесссЯявде з100 часеЕдаассуд гддадсасає сдсддсссад асдаєсдсдс ааааддесдс ддеЕсаседдас з160
Зо ачаєдседдад дЕДЕЕдЕссса деЕссассасуд десдсдсесуа асодсдаддсад дЯяЕдДЕСсеЕваде з220
ЧдЕдсдсавреєс гдсдсаєдад СсеЕдсааасі саєдассуєд арсссессса ддЕдесдеЕдся 5з280 чадЕЧчасаад сдааадссає содддсеєЧчсесу сссоудесдУсс ЕЕСЕЕСУУЄЕЄ сеЕСЯСЕЧУЄСЯ з340
Есссссдасоі сеаааєдаса ссудсдеЕсає ссассадсса гдасасдсда ааагасаєдсс 5400 гссвассвдс даєссасудсає ддссадасає асддсаадссі абасудєаасс дсдєсесадс 5160
Едсасадддс ЕдЕссЕдсдса даєєссассає адаєссаста 9д з5о01

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Експресійна конструкція для високорівневої експресії усіченого РерАїт, як наведено в 5ЕО ІЮ МО: 3, в Согуперасіепит дішатісит, яка містить: а) ген, що кодує усічений РерАї, як наведено в 5ЕО ІЮО МО: 5; р) оріджин реплікації огі К, як наведено в ЗЕО ІЮ МО: 12; БО с) ген стійкості до канаміцину, як наведено в ЗЕО ІЮО МО: 1; а) промотор Ріс, як наведено в ЗЕО ІО МО: 2; і е) сайт зв'язування рибосоми.
    2. Експресійна конструкція для високорівневої експресії усіченого РерА1, як наведено в 5ЕО ІЮ МО: 4, в ЕвсНепсніа сої, яка містить: а) ген, що кодує усічений РерАї, як наведено в 5ЕО ІО МО: 6; р) оріджин реплікації рос; с) ген стійкості до канаміцину, як наведено в ЗЕО ІЮО МО: 1; а) промотор Рт7, як наведено в 5ЕО ІО МО: 11; і е) сайт зв'язування рибосоми. 60 3. Рекомбінантна клітина-хазяїн, яка містить експресійну конструкцію за будь-яким з пп. 1-2, де рекомбінантна клітина-хазяїн вибрана з Согупебасіепит дішатісит і ЕвсНегісніа сої).
    4. Спосіб високорівневої експресії усіченого 5ігеріососсив рпештопіае РерА!, який включає культивування бактерії, трансформованої експресійною конструкцією за будь-яким з пп. 1-2, Її тим самим забезпечення очищення експресованого білка, де бактерія вибрана з Согупебрасіепит дішатісит і ЕвсНепсніа сої.
    5. Спосіб за п. 4, де вихід усіченого РерАї1 становить приблизно 500, приблизно 400, приблизно 300, приблизно 250, приблизно 220, приблизно 200, приблизно 180, приблизно 160, приблизно 150, приблизно 120, приблизно 100 мг/л. Мо А Бреї Й щи т З ее. ідола те? ' У термінатор пив І У Вре і зтві лк. і. а-трали пролін-багзтв о 00/холін-ав язуюча суперспіраль область область хвіст заз зтв вуз вва з зявЕ жа ; : : 2
    КУ. розміщення відомих і вгатовів поверхнею (повтори)
    Фіг. 1 квей Бтві з Зреї та ще а Бе Ватні ж «
    х., М, вве ; С ху ; ЩО сх разі? 5 ЗБа1вр 5 ОВ ох у . Я о ОХ Нативний Я, сх о лермінатор ча І І ло. йти п ХняВ ватні Зреї о тпн. М с.
    Фіг. 1 (продовження) Покриті послідовності білка: 3155 Підкроеслені пептиди, які співпадають І АПЕРТУУРАК ПАРУХЧОСКА ЕКОТСАКНО ДЕМІККЬКО АКВЛОККУКО БА ООКІТЕЕКАК ЕЕККАСОКОЮ КАББОТОЄКЬ ВКЖІКЕКЮК КЕЕМБОКЕМЕ 1 ШАБНКОКЕКО АБККІКЕКУ ши еьоЕх КАБАН БРЕОУККУКЕ «чі ТУХКОМОТЬ УКВ КОАК СББЦЕКЬОК ТОББОККТАК СЕКОТУЄОУКИ КІ БОСЕТОТЬ БАБАК КАКЬЕКТЕАО СККАУКЕРЕК БЕРАРЕТРАР ЗІ КБРАБОРКЕА РАРОРАРАРК РЕКРАКОРКЕ ЕКТООООАЖЕ ПТАВАОЕКЕХ Зі МЕОТООПРИХ АЕКРАРАРКР БОРАРЕТ
    Фіг. 2 їх М БЕ ВЕ МР ВО ОСІВ ХТО ВЕЖ З. у ую. В ЗВ аа й ж, е кевх У скечкєтнняя І «Хто
    25 . ї ще : ех : і : а они промо попи ові ско Е ват 00000 да ІБ хо зщюе ода ззаоя те
    Фіг. З м ' 2 з 85 2 7 и. кДа Пон нн ти, виник пл с - - ши о ще ОА ит - Доріжка г. завантаження в шНН : лука З: паю реа паші 0 пав о Доріжка У: промивання пс В ВАрня й. діяичодаиця АЛ, Й пом НН Доріжка 4: влюювання 40 Я НН о и ; ш: суда з су 00000001 пора влоювання во ВН ШДПЛИИМИЙИИЙ ПТ КК В ОН В сах кож са т» г; 11111 Прржа Є зпюювання во ро ПО шко З в ВО Пряйкка 7: вловання Й 5 М бкчватим капі а 00000001 доріжка б елюювання 05 М фосіфатом калію ПО КМ В о НМ ТО дів ОБ В ш с ж г в ШИ з її ви ЗМОВ З А Кн фіг. 4 дея ка Мі 2 3 9 5 5 7 5 а пав НН ШЕ 00000011 дома завантаження би яв 00 доржка Є проточна фракція БО що 0 Доріжка 3: промивання ПІ - В Д й ; ;
    з. х в Доріжка 4. елюювання Фракція 4 11111171 дома елюювання фращив по 00000000 Доржеб елюювання фракціяє ЛКК ех о о Коня : 5 сни 00111101 Лор Поелюювання фракція 7 11111117 доржеав'епюювання фракція 8 п де ши Доріжка 8. елюювання пупу фракцій 4 В та 7 ат я по о ШИ ЕКОН ЕН ощд ПЕС о А В е паж 3 ВЕ В Шо с
    Фіг. 5 МЕ кКДа КН НК КЕ о її МЕН я а Ву п 250 шу гой ССС. нн с . п жен 1000000 Доріжа 25 мкг РерА! ПНО А п й | І Пожнн КО Доріжка 2 БМК РерАї ша я дн , ї Шолх 00101111 Доріжка 7,5 мкг РерА!ї МОБ А ДК Еко 5 . 00000000 Доріжа й ЮмкгРерд! ет пий шко ее в фіг. 6
    ЇА) /-Кон'югат серотиі З-Рер А ше Кон'югат і РерАї рої .тя, і ,
    ! 2. зх Я - Ме У 4 ! : ИМЯ Беуревщя х Полісакарий ! і Ї хе й М ееджиююєктні : ї Жідх і - що ; ; Що ! Я я, і і І з дкот дк жук ж ко КК Кт в о лу Вий ! 33 ха 3 за х5 15 17 за ж за ! Чао утримування (хв) ЇВ конюгат серотил 5А-РЗВ А т конюки і ЕЕ кох ра : ве под р Всю й й З Нолібахврид х . і Зоо 4 7 ех. і 5 о і Я І ! , і зо Я ; ї . і Ж : у "Ух х : і З хх 33 34 5 її ХХ 38 ІЗ Ку : р пепнетнотакотоеокелотоеоосоеоесоокосноно В ДІВИ ВВА (ХВ м уонолтотостосотеотосототесототесосоеокононгд
    СУ. Ком'юєат серотип БВ-Рер А во Кок га т ню Полісвхавид І ! ях ч рі од, щі у з х бе реа; дит ТРЕрА, ш ї : я к 5 За 5 я чех, ; х Ж ! й і х Ж з од, зоркжннчнінгоететеетестеннюєн Ку ю ЖЖ дж в її АХ 33 ха 5 її Ка ї- Зх хай Час утримування (хв)
    Фіг. 7 імунна відповідь на полісахариди, кон юговані з Рерді СКМ 1280щю ; мншю що 51 513 514 515 ЗТБА 51655 7 5Т9У 514 5Т18С5Т1ЗАБТІЗЕ ТОБ аТоЗЕ ЗЕ ж До імунізації по Зразки крові, відібрані ж Зразки крові, підібрані тд час дослідження В кінці ДосСлІДЖЕННЯ
    Фіг. 8
    Імунна відповідь на попісахариди, кон 'ютовані ЗРерАї САМ 125000 З2000 допо Ш | | І | | І ті 5т3 5т4 575 5Т6А 5ТБВ 7Р О5Т9У 5714 5Т1ЯС5Т19А5Т19Р 51222 5Т23Е 5ТАЗЕ ж До імунізації п Зразки крові, відібрані ш Зразки крові, відібрані під час доспідження В КІНЦІ ДОСЛІДЖЕННЯ
    Фіг. З весен КУ З вв: хай їй та . Ех ж век лак ЩО . чне; і. М во зе ВзлиВ ! ин ; Тер х но я ої А Маркер п, молекулярної еВ как мажітям о Лесі Воті ДЦ: сш и, 33 бін В
    Фіг. 10
    М Р 2 3 4 ДЩД5ДщД6Й.7 58 Бр ка ЕК НК КК пед Пн в МеВ В МІНИ Е: ОВ А ОК КК їЕ Же 1. х а Ви с . Доріжка 1: завантаження СВІ ідо с с Доріжка З. промивання пИЛШЛИМ НИ ТЕ ХО МУ МУХА ПІ: : де св - . о. . с Доріжка 4: елюювання Ж В о 00000000 ечнов пІКННІМИ . ЕЕ с о фосфатом калію МЛИИТИНМ М КАХ ОО КН ин не ПЕНЯ а МО нн СсСщьх вени ен А о
    Фіг. М 1 232 3 4587 8 9 10 М 12 13 се Да ТЛ ННІ пл 0000 Порожа т: завантвження пе орюал ОО на Доббка Ж промивання ПІ нев її с Попенкя : рожнвне і ННЯ Я: влюювання Я 11111111 пнавежевня НИ ІТ я пек о Не Доріжка 8: елюювання 8 мк 0 Вомяка З влююданно З СТР У? 0 пон нн в в Ов МИРЖКа М влюювання У 011 ДОР НХ епюювання 10 ші пен нн МОрІЖКа Бо алюювання 1! пе 10001010 Да і олюювання шо Дора ЗУ: елюювання 13 М Є п в нн ВК ВОВ ж ММ В В НВК НК ЕК КА АЮ фіг. 12 Покриті послідовності білка: 3995 Підкреслені пептиди, які співпадають 1 МНКККМІБТО БАЗУАТЬСАЄ ЕУАББЗРІУУК АЕРАРУАНОВ КАЖКОХОВАК БІ ВОВЕМАККАЄ ЕОАЖВАСККТ КОБОКІТЕЕК АККЕККАВОК ООКАНЬОХОВ 191 КОНВКУЇМЕКО Б5КККОМІОКЕ МЕЕЛЕККОКЕ КОАЕКЕККІВЕ ЕУТРОАБЕЬТ 151 ЕТВЯКАБКАК АКЕРЕБТЕКУ КЕАБЕКУТЕА ХОКЬОАЕВАК БУАБОАКІАЕ 21 БЕМЕУНАБИТ КІКЕЇСЕБОО ВБОХУКЕОВВА РІОБЕБОАКО АКЬОКЬЕКІ о 251 ОКІВЕБОАВІ АКЬЕКБУКОК КМБООБУБАЇ УББААЕКОБА АККАКБЕКТЕ З01 АОБАКАУОКе БЕКРАРАРЕТР АРЕАВАКОРЕ РАРАРОБАВА РКРЕКРАКОР 351 КРЕКТОРОСА ЕБОХАККЗЕЕ ЕУМВЬТОООК РКАЕКРАРАР КРЕОРАБАРК
    Фіг. 13
UAA202006326A 2018-03-01 2019-03-01 ЕКСПРЕСІЙНА КОНСТРУКЦІЯ ДЛЯ ВИСОКОРІВНЕВОЇ ЕКСПРЕСІЇ УСІЧЕНОГО ПНЕВМОКОКОВОГО ПОВЕРХНЕВОГО БІЛКА А1 (PspA1) UA129585C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN201841007814 2018-03-01
PCT/IB2019/051655 WO2019167008A1 (en) 2018-03-01 2019-03-01 Expression of pneumococcal surface protein a (pspa)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA129585C2 true UA129585C2 (uk) 2025-06-11

Family

ID=66440079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA202006326A UA129585C2 (uk) 2018-03-01 2019-03-01 ЕКСПРЕСІЙНА КОНСТРУКЦІЯ ДЛЯ ВИСОКОРІВНЕВОЇ ЕКСПРЕСІЇ УСІЧЕНОГО ПНЕВМОКОКОВОГО ПОВЕРХНЕВОГО БІЛКА А1 (PspA1)

Country Status (20)

Country Link
US (2) US11725029B2 (uk)
EP (1) EP3758746A1 (uk)
JP (2) JP7334176B2 (uk)
KR (1) KR102774793B1 (uk)
CN (1) CN112118865B (uk)
AU (1) AU2019226487B2 (uk)
BR (1) BR112020017431A2 (uk)
CA (1) CA3091583A1 (uk)
CL (1) CL2020002246A1 (uk)
CU (1) CU24709B1 (uk)
EA (1) EA202092065A1 (uk)
IL (1) IL277023B2 (uk)
MX (1) MX2020009049A (uk)
MY (1) MY204760A (uk)
PH (1) PH12020551357A1 (uk)
SA (1) SA520420041B1 (uk)
SG (1) SG11202008124XA (uk)
UA (1) UA129585C2 (uk)
WO (1) WO2019167008A1 (uk)
ZA (1) ZA202005414B (uk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
IL326005A (en) 2021-09-09 2026-03-01 Affinivax Inc Multivalent pneumococcal vaccines
WO2025193903A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Affinivax, Inc. Pneumococcal polysaccharide compositions and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5476929A (en) * 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
JP4712716B2 (ja) 2004-09-09 2011-06-29 財団法人地球環境産業技術研究機構 プロモーター機能を有するｄｎａ断片
EP3020811A1 (en) 2008-06-25 2016-05-18 Vaxiion Therapeutics, LLC Regulated genetic suicide mechanism compositions and methods
WO2010141312A2 (en) * 2009-06-01 2010-12-09 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
CN107674118A (zh) * 2016-08-02 2018-02-09 中国食品药品检定研究院 重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3以及包含其的多糖结合疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
PH12020551357A1 (en) 2021-08-23
US11725029B2 (en) 2023-08-15
IL277023A (en) 2020-10-29
WO2019167008A1 (en) 2019-09-06
KR102774793B1 (ko) 2025-02-27
SG11202008124XA (en) 2020-09-29
IL277023B1 (en) 2025-07-01
EA202092065A1 (ru) 2020-11-19
JP7334176B2 (ja) 2023-08-28
SA520420041B1 (ar) 2024-03-14
AU2019226487A1 (en) 2020-09-10
AU2019226487B2 (en) 2025-08-07
CL2020002246A1 (es) 2021-01-15
CU24709B1 (es) 2024-06-11
EP3758746A1 (en) 2021-01-06
MX2020009049A (es) 2020-10-12
CN112118865A (zh) 2020-12-22
JP7645946B2 (ja) 2025-03-14
US20210009641A1 (en) 2021-01-14
KR20200129121A (ko) 2020-11-17
CN112118865B (zh) 2025-03-28
CA3091583A1 (en) 2019-09-06
CU20200064A7 (es) 2021-04-07
US20230322871A1 (en) 2023-10-12
BR112020017431A2 (pt) 2021-01-19
MY204760A (en) 2024-09-11
ZA202005414B (en) 2022-02-23
JP2023154063A (ja) 2023-10-18
JP2021516050A (ja) 2021-07-01
IL277023B2 (en) 2025-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100316004B1 (ko) Crm단백질및디프테리아독소의생산을위한방법및플라스미드
Gaillard et al. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci
EP1066375B1 (en) $i(LACTOBACILLI) HARBORING AGGREGATION AND MUCIN BINDING GENES AS VACCINE DELIVERY VEHICLES
JPH08503602A (ja) 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現
JPH07502646A (ja) リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するｄｎａを含む細菌発現ベクター
JP7645946B2 (ja) 肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）の発現
EP3231868B1 (en) O-antigen carbohydrate chain extended salmonella paratyphi a and use thereof
Rezaei et al. Production of Brucella melitensis Omp16 protein fused to the human interleukin 2 in Lactococcus lactis MG1363 toward developing a Lactococcus-based vaccine against brucellosis
KR19990007306A (ko) 클로스트리디움 페르프링겐스 백신
US5872001A (en) Lanthionine antibiotic compositions and methods
Dubail et al. Listeriolysin O as a reporter to identify constitutive and in vivo-inducible promoters in the pathogen Listeria monocytogenes
HUT64596A (en) Recombinant vaccine against swine pleuropneumonie
Foynes et al. Vaccination against type F botulinum toxin using attenuated Salmonella enterica var Typhimurium strains expressing the BoNT/F HC fragment
US6783764B1 (en) Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine
JPH06501607A (ja) ミコバクテリアへの部位特異的組み込みの可能なｄｎａ
EP1292686A1 (en) Gene expression cassette and its use
US6255097B1 (en) Two-phase system for the production and presentation of foreign antigens in hybrid live vaccines
EA045199B1 (ru) ЭКСПРЕССИЯ ПНЕВМОКОККОВОГО ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА А (PspA)
OA20033A (en) Expression of Pneumococcal Surface Protein A (PSPA).
CN121699954A (zh) 一种表达环二腺苷酸的乳酸乳球菌重组菌及其应用
US6521596B1 (en) Lanthionine antibiotic compositions and method
HK1101704B (en) Plasmid maintenance
HK1101704A1 (en) Plasmid maintenance
AU2002357406A1 (en) Defective entities and uses therefor