UA129672C2

UA129672C2 - Антитіло до trem-1 та його застосування

Info

Publication number: UA129672C2
Application number: UAA202006898A
Authority: UA
Inventors: Ахал Пашіне; Ахал Пашине; Майкл Л. Госселін; Майкл Л. Госселин; Аарон П. Ямнюк; Дерек А. Холмс; Годун Чень; Приянка Апурва Мадія; Приянка Апурва Мадия; Річард Юй-Чен Хуан; Ричард Юй-Чен Хуан; Стівен Майкл Карл; Стивен Майкл Карл
Original assignee: Брістоль-Майерс Сквібб Компані; Бристоль-Майерс Сквибб Компани
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2025-07-02
Also published as: TW202003570A; AU2019248547B2; TWI790370B; MA52190A; BR112020017605A2; JP2021519594A; US20190300608A1; TWI839050B; US20220002404A1; EA202092302A1; PE20201343A1; AR117566A1; AU2019248547A1; WO2019195126A1; JOP20200240A1; KR102900511B1; SG11202009625WA; KR20260006678A; AU2025242161A1; CR20200450A

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з TREM-1 і інгібує передачу сигналу TREM-1, де антитіло не зв'язується з одним або декількома FcγR і не індукує продукування мієлоїдними клітинами прозапальних цитокінів. Винахід також стосується застосування такого антитіла в терапії, наприклад при лікуванні автоімунних захворювань.

Description

Посилання на перелік послідовностей, представлений в електронному вигляді на сайті ЕЕ5-

МЕВ

Вміст представленого в електронному вигляді переліку послідовностей у вигляді текстового файлу в кодуванні АБСІІ (назва: 3338 092РСО1 Зедіівіпдїхї; розмір: 106162 байтів; і дата створення: 27 марта 2019 г.)Ї, сформованого при створенні заявки, повністю включений в даний опис як посилання.

Передумови створення винаходу

ТКЕМ-1 являє собою активуючий рецептор, який експресується на моноцитах, макрофагах і нейтрофілах. Ці клітини відіграють центральну роль при хронічних запальних захворюваннях, вивільняючи цитокіни та інші медіатори, які беруть участь в запаленні. МРНК ТКЕМ-1 і експресія білку піддаються підвищувальній регуляції у пацієнтів з ревматоїдним артритом (КА) і запальним захворюванням кишечника (ІВО), і ТКЕМ-І-позитивні клітини накопичуються в місцях запалення, що корелює з серйозністю захворювання |див. Воисйпоп та ін., Майге 410, 2001, сс. 1103-1107; 5спепкК та ін., Сіїп Іпмебі 117, 2007, сс. 3097-3106; і Киаї та ін., КпештаїйоіІоду 48, 2009, сс. 1352-1358). Пептидоглікан-розпізнавальний білок 1 (РОЇ УКР), який експресується в основному активованими нейтрофілами, являє собою ліганд для ТКЕМ-1, і після зв'язування він опосередковує передачу сигналу ТКЕМ-1.

Іп мйго участь ТКЕМ-1 запускає секрецію прозапальних цитокінів, включаючи ТМЕ, 1-8 і моноцитарний хемотаксичний білок-1. Крім того, передача сигналу ТКЕМ-1 синергетично взаємодіє з численними Толл-подібними рецепторами (ТІК), додатково підсилюючи прозапальні сигнали. У свою чергу, це викликає підвищуючу регуляцію експресії ТКЕМ-1, приводячи до порочного циклу, який посилює запалення |див. Воисйпоп та ін., У Іттипої! 164, 2000, сс. 4991-4995). Все зростаюча кількість даних свідчить про те, що ТІ К вносять внесок у виникнення та прогресування хронічних запальних захворювань, таких як КА і ІВО.

Гуманізовані МАт до ТКЕМ-1, які інгібують функцію ТКЕМ-1 як людини, так і мавп циномолгус, описані в різних документах див. М/О 2013/120553 А1 і МО 2016/009086 АТ). Однак зазначені антитіла або мають профіль в'язкості, який ускладнює процес продукування, або приводять до інших проблем, які можуть обмежувати їх терапевтичний потенціал (таких, наприклад, як цитокіновий шторм і АОСС) див. ЗПіге та ін., У. Рпагт. Зсі. 93, 2004, сс. 1390- 1402; і ММагпскКе та ін., У Іттипої. 188, 2012, сс. 4405-4411). Отже, існує необхідність в антитілах до ТКЕМ-1, які можуть специфічно зв'язуватися з ТКЕМ-1 і інгібувати його функцію, але не приводять до проблем, характерних для створених раніше антитіл до ТКЕМ-1.

Короткий виклад суті винаходу

У даному винаході представлені виділені антитіла, такі як моноклональні антитіла, перш за все людські (наприклад, моноклональні) антитіла, які специфічно зв'язуються з тригерним рецептором-1, який експресується на мієлоїдних клітинах (ТКЕМ-1), і які мають необхідні функціональні властивості. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) і константну ділянку важкого ланцюга Ідс1, де константна ділянка важкого ланцюга Їдс1 містить одну або декілька амінокислотних замін в порівнянні з константною ділянкою важкого ланцюга

І9ДО1 дикого типу (5ЕО ІО МО: 9). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло перехресно конкурує з тАБ 0318 за зв'язування з ТКЕМ-1, блокуючи його, і містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (УН), варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) і константну ділянку важкого ланцюга Ідс!1, де константна ділянка важкого ланцюга Ідс1 містить одну або декілька амінокислотних замін в порівнянні з константною ділянкою важкого ланцюга ІдсС1 дикого типу (ЗЕО ІО МО: 9).

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з тим же самим епітопом

ТКЕМ-Ї, що і тАБ 0318. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло специфічно зв'язується з епітопом ТКЕМ-1, який містить один або декілька амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з 038, 39, К40, С41, 042, 43, Т44, І 45, Е46, К4А7, Е48, А49, 550, 551, 952, К53, А54, М/55, 956, 790, НО1, 0092, НУОЗ, 594,19511 96 5ЕО ІО МО: 1. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло специфічно зв'язується з епітопом ТКЕМ-1, який містить амінокислоти з ЮЗ38 по І 45, з Е46 по 056 і/або з 90 по І 96 з БЕО ІЮО МО: 1.

У деяких варіантах здійснення винаходу константна ділянка важкого ланцюга Ідс1, представленого в даному описі антитіла, містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К, І234А, І235Е, 5237А, О35бЕ і /358М (БО- нумерація). У деяких варіантах здійснення винаходу константна ділянка важкого ланцюга Ідс1 містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К,

ІЇ234А, І235Е, 5237А, АЗ305, РЗЗ15, О0356Е і 1358М (БО-нумерація). У деяких варіантах бо здійснення винаходу константна ділянка важкого ланцюга Ідс1 містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К, С2265, С2295 і Р2385 (БО- нумерація). У деяких варіантах здійснення винаходу константна ділянка важкого ланцюга Ідс1 містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з 5131С,

К1З3ЗЕ, 5137Е, 51385, 0196К, 11997, М2030, К214К, С2265, С2295 і Р2385 (ЕО-нумерація).

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, представлене в даному описі, містить

СО, СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга і СОКІ1, СОК2 ї СОКЗ легкого ланцюга, де СОКЗ важкого ланцюга містить ОМСОСІККОРЕАМ (ЗЕО ІО МО: 26) або ОМСІККОРЕАХМ (5ЕО ІО МО: 26) за винятком однієї або двох замін. У деяких варіантах здійснення винаходу СОКЗ важкого ланцюга містить роОсІККОРГАХ (5ЕО ІО МО: 72).

СО, СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга і СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга, де СОК2 важкого ланцюга містить КІКТК55МУАТУУААВМКО (ЗЕБО ІЮО МО: 25) або КІКТК55МУАТУУААБУКО (ЗЕО ІО МО: 25) за винятком однієї або двох замін.

СО, СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга і СОКІ, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга, де СОК1 важкого ланцюга містить ТХАМН (5ЕО ІО МО: 24) або ТУАМН (5ЕО ІО МО: 24) за винятком однієї або двох замін.

СОК1, СОК2 ї СОКЗ важкого ланцюга і СОК1, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга, де СОКІ легкого ланцюга містить КАБОЗМОТЕОУЗРЇІН (5ЕО ІО МО: 27) або КАБОЗМОТЕОУЗРІ Н (5ЕО ІЮО МО: 27) за винятком однієї або двох замін. У деяких варіантах здійснення винаходу СОК2 легкого ланцюга містить КАЗМІЕ5 (5ЕО ІО МО: 28) або КАБМІ Е5 (ЗЕО ІО МО: 28) за винятком однієї або двох замін. У деяких варіантах здійснення винаходу СОКЗ легкого ланцюга містить

ООБМОЮОРУТ (5ЕО ІО МО: 29) або ОО5МОЮОРУТ (5ЕО ІО МО: 29) за винятком однієї або двох замін.

У деяких варіантах здійснення винаходу МН антитіла, представленого в даному описі, містить амінокислотну послідовність, яка принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 85 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 96 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або приблизно на 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій в ЗЕО ІЮ

МО: 14. У деяких варіантах здійснення винаходу Мі антитіла, представленого в даному описі, містить амінокислотну послідовність, яка принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 85 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 96 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або приблизно на 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій в ЗЕО ІЮ

МО: 15. У деяких варіантах здійснення винаходу МН і МІ. містять зЕО ІО МО: 14 і 5ЕО ІЮО МО: 15 відповідно.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, представлене в даному описі, містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить ЗЕО ІЮО МО: 50, ЗЕО ІО МО: 51, 5ЕО

ІО МО: 52 або 5ЕО ІЮО МО: 53. У деяких варіантах здійснення винаходу легкий ланцюг містить

ЗЕО ІЮО МО: 54.

У даному винаході запропоноване виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з ТКЕМ-1, яке містить СОКІ, СОК2, СОКЗ важкого ланцюга; СОКІ, СОК2, СОКЗ легкого ланцюга; і константну ділянку важкого ланцюга ЇдсС1, де СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга містять

ТУАМН (5ЕО ІО МО: 24), КІЕТК5ЗМУАТУУААЗМКО (5ЕО ІЮО МО: 25) і ОМОІККОРГЕАХ (5ЕО І

МО: 26) відповідно; де СОКІ, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга містять КАБОЗМОТЕОУЗРЇІ Н (ЗЕО

ІО МО: 27), КАБМІ'ЕЗ (5БО ІС МО: 28) ї ОО5МООРМУТ (5БО ІО МО: 29) відповідно; і де константна ділянка важкого ланцюга ДС! містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з І 234А, І 235Е і 6237А (ЕО-нумерація).

В даному винаході запропоноване виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з ТКЕМ-1, яке містить СОКІ, СОК2, СОКЗ важкого ланцюга; СОКІ, СОК2, СОКЗ легкого ланцюга; і константну ділянку важкого ланцюга ЇдсС1, де СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга містять

ТУАМН (5ЕО ІО МО: 24), КІЕТК5ЗМУАТУУААЗМУКО (5ЕО ІЮО МО: 25) і ОМОІККОГАХМ (5ЕО ІЮ

МО: 26) відповідно; де СОКІ, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга містять КАБОЗМОТЕОУ5РЕЇІ Н (5ЕО

ІО МО: 27), КАБМІ'ЕЗ (5БО ІС МО: 28) ї ОО5МООРМУТ (5БО ІО МО: 29) відповідно; і де константна ділянка важкого ланцюга ДС! містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з І 234А, І 235Е, 5237А, АЗ305 і РЗ315 (ЕЮ-нумерація).

В даному винаході запропоноване виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з ТКЕМ-1, яке містить СОКІ, СОК2, СОКЗ важкого ланцюга; СОКІ, СОК2, СОКЗ легкого ланцюга; і бо константну ділянку важкого ланцюга ЇдсС!, де СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга містять

ІО МО: 27), КАБМІ'ЕБ5 (5БО ІС МО: 28) ії ОО5МООРМУТ (5БО ІО МО: 29) відповідно; і де константна ділянка важкого ланцюга ДС! містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К, С2265, С2295 і Р2385 (ЕО-нумерація).

ТУАМН (5ЕО ІО МО: 24), КІЕТК5ЗМУАТУУААЗМУКО (ЗЕО ІЮО МО: 25) і ОМОІККОГАХ (5ЕО ІО

МО: 26) відповідно; де СОКІТ, СОК2 ї СОКЗ легкого ланцюга містять КАБОЗМОТЕОУ5РЕЇІ Н (5ЕО

ІО МО: 27), КАБМІЕ5 (5ЕБО ІО МО: 28), ії ООБМООРУТ (5ЕБО ІО МО: 29) відповідно; і де константна ділянка важкого ланцюга ДС! містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з 51310, К1ІЗЗ3К, 5137Е, 51385, 0196К, 11997, М2030,

К214Е, С2265, С2295 і Р2385 (ЕО-нумерація).

У деяких варіантах здійснення винаходу ТКЕМ-1 містить амінокислотну послідовність 52Е0

ІО МО: 1, БЕО ІО МО: 2, БЕО ІО МО: З або 5ЕО ІЮ МО: 7.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, представлене в даному описі, має більш низьку афінність зв'язування з ЕсукІ (СОб4), ЕсуУКІА (СО032), ЕсуУКІІВ (СО032), ЕсуУкША (СО16а),

ЕсукІВ (СО16Б) або з будь-якою їх комбінацією в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІО МО: 76, |і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 54. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло має афінність зв'язування з ЕсукіІ (СОба4), знижену принаймні в два рази, принаймні в три рази, принаймні в чотири рази, принаймні в п'ять разів, принаймні в шість разів, принаймні в сім разів, принаймні у вісім разів, принаймні в дев'ять разів або принаймні в 10 разів у порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЖЕО ІЮ МО: 54.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, представлене в даному описі, є менш імуногенним в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІО МО: 54. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло не має агоністичної дії щодо передачі сигналу ТКЕМ-1 після зв'язування з ТКЕМ-1 їі за відсутності стимулятора. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло не індукує експресію прозапального цитокіну в незрілих дендритних клітинах (0С) при інкубації клітин у присутності антитіла і за відсутності стимулятора в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЖЕО

ІО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в

ЗЕО ІО МО: 54.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, представлене в даному описі, блокує продукування прозапального цитокіну в клітині при активації клітин в присутності, як антитіла, так і стимулятора. У деяких варіантах здійснення винаходу стимулятор являє собою ліганд для

ТКЕМ-1. У деяких варіантах здійснення винаходу прозапальний цитокін вибирають з групи, яка складається з ІЇ/-6, ТМЕ-а, І--8, 11 -1р, 1-12, хітиназа-3-подібного білку 1 (СНІЗІ 1) і їх комбінацій.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване в даному винаході, зв'язується з людським ЕсКп, ЕсКп мавп циномолгус і/або мишачим ЕсКп залежно від рН. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, представлене в даному описі, має більш високу термостабільність у порівнянні з референс-антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 52ЕО ІЮО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 54, за даними вимірювань за допомогою капілярного диференціального скануючого калориметра (САР-О5С).

У деяких варіантах здійснення винаходу при нагріві до 779С стан приблизно від 10 до 20 95, приблизно від 20 до 30 95 (наприклад, 24 95) або приблизно від 30 до 40 95 антитіл є оборотним.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло має більш високу температуру плавлення (Тт) в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕБЕО ІО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 54.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, представлене в даному описі, має в'язкість менше ніж 5 сП, менше ніж 4 сП, менше ніж З сП, менше ніж 2,5 сП, менше ніж 2,4 сп, менше ніж 2,3 сП, менше ніж 2,2 СП, менше ніж 2,1 сП, менше ніж 2 сП, менше ніж 1,9 сп, бо менше ніж 1,8 сП, менше ніж 1,7 сП, менше ніж 1,6 сП, менше ніж 1,5 сП, менше ніж 1,4 сП,

менше ніж 1,3 сП, менше ніж 1,2 сП, менше ніж 1,1 сП, менше ніж 1,0 сП, менше ніж 0,9 сп, менше ніж 0,8 сП, менше ніж 0,7 сП, менше ніж 0,6 сП, менше ніж 0,5 сП, менше ніж 0,4 сп, менше ніж 0,3 сП, менше ніж 0,2 сП або менше ніж 0,1 сП при концентрації 80 мг/мл. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло має в'язкість менше ніж 10 сП (наприклад, 9 сП) при концентрації 130 мг/мл.

У деяких варіантах здійснення винаходу зв'язування антитіла з людським ТКЕМ-1 характеризується величиною Ко, яка складає менше ніж 4 нМ (наприклад, 3,4 НМ), за даними вимірювань методом Віасоге. У деяких варіантах здійснення винаходу зв'язування антитіла з

ТКЕМ-1 мавп циномолгус характеризується величиною Ко, яка складає менше ніж їнмМ (наприклад, 0,91 нМ), за даними вимірювань методом Віасоге.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є мономірним за даними аналізу методом гель-фільтрації-рідинної хроматографії високої здатності (ГФ-РХВЗ). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло характеризується мінімальним ризиком фрагментації за даними аналізу за допомогою двовимірної рідинної хроматографії-тандемної мас-спектрометрії (20-

РХ/МС) або аналізу маси інтактних білків за допомогою рідинної хроматографії-тандемної мас- спектрометрії (РХ/МС). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло має ізоелектричну точку від 8 до 9 (наприклад, 8,75).

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло має стабільність у складі композиції, що містить гістидин, цукрозу, аргінін і МасСі. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зберігає стабільність протягом принаймні 2 місяців в складі композиції, яка містить 20мММ гістидин, 150мМ цукрозу, 25мМ аргінін і 520мМ Масі. У деяких варіантах здійснення винаходу композиція має рн 6,0 і/або композицію зберігають при 4 "С, 25 "С або 40 "С.

У даному описі запропоновані також біспецифічні молекули, які містять антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, яке зчеплене з молекулою, яка має другу специфічність зв'язування.

У даному описі запропоновані нуклеїнові кислоти, що кодують антитіло, представлене в даному описі, вектори, які містять нуклеїнові кислоти, і клітини, трансформовані векторами.

У даному описі запропоновані імунокон'югати, які містять антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, які зчеплені з агентом.

У даному описі запропоновані композиції, які містять антитіла до ТКЕМ-1 або їх антигензв'язуючі фрагменти, біспецифічні молекули або імунокон'югати, представлені в даному описі, і носій. У даному описі запропоновані також набори, які містять антитіла до ТКЕМ-1 або їх антигензв'язуючі фрагменти, біспецифічні молекули або імунокон'югати, представлені в даному описі, і інструкції по їх застосуванню.

У даному описі запропонований спосіб інгібування активності ТКЕМ-1 у індивідуума, який потребує цього, що включає введення антитіла до ТКЕМ-1, біспецифічної молекули, нуклеїнової кислоти, вектора, клітини або імунокон'югата, зазначених у даному описі.

У даному описі запропонований спосіб лікування запального захворювання або автоїмунного захворювання у індивідуума, який потребує цього, що включає введення антитіла до ТКЕМ-1, біспецифічної молекули, нуклеїнової кислоти, вектора, клітини або імунокон'югата, зазначених у даному описі. У деяких варіантах здійснення винаходу запальне захворювання або автоїмунне захворювання вибирають з групи, що складається з запального захворювання кишечника (ВО), хвороби Крона (СО), неспецифічного виразкового коліту (ОС), синдрому подразненого кишечника, ревматоїдного артриту (КА), псоріазу, псоріатичного артриту, системного червоного вовчака (5ІЕ), вовчакового нефриту, васкуліту, сепсису, синдрому системної запальної відповіді (5ІК5), діабету типу І, хвороби Грейвса, розсіяного склерозу (М5), автоїмунного міокардиту, хвороби Кавасакі, захворювання коронарної артерії, хронічного обструктивного захворювання легень, інтерстиціального захворювання легень, автоіїмунного тиреоїдиту, склеродермії, системного склерозу, остеоартриту, атопічного дерматиту, вітіліго, реакції "ттрансплантат-проти хазяїна", синдрому Шегрена, автоїмунного нефриту, синдрому

Гудпасчера, хронічної запальної демієлінізуючої поліневропатії, алергії, астми, інших автоїмунних захворювань, які є результатом або гострого, або хронічного запалення, і будь-якої їх комбінації. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб включає також введення одного або декількох додаткових терапевтичних засобів. У деяких варіантах здійснення винаходу додатковий терапевтичний засіб являє собою антитіло до ІР-10 або антитіло до ТМЕ-а.

Короткий опис креслень/фігур

На кресленнях показано: на фіг. ТА їі 1Б - дані, які демонструють, що всі варіанти тАб 0318 зв'язуються з ТКЕМ-1 людини і мавп циномолгус з афінністю, подібною до афінності вихідного антитіла тАбБ 0318 бо (954). На фіг. 1А представлені дані про афінність зв'язування варіанту 318-Ідс1.3ї з ТКЕМ-1

А людини (верхній ряд) і мавп циномолгус (нижній ряд). На фіг. 1Б представлені дані про афінність зв'язування декількох різних варіантів тАБ 0318 з людським ТКЕМ-1. Різні представлені варіанти включають: (І) 318-Ідс1.17, (І) 318-І91.31, (І) 318-Ід54-Аба, (ІМ) 318-

Іде1-Аба ії (М) 318-І901.1ї (мутанти з заміною М на 0). На фіг. 1Б для цілей порівняння представлені дані про афінність зв'язування антитіла тАбБ 0318 (варіанти ІдДО4 А і В); на фіг. 2А і 2Б - дані про інтерналізацію тА 0318-І91.3ї після зв'язування з ТКЕМ-1, що експресується на СЮО14"-моноцитах, в різні моменти часу після зв'язування з ТКЕМ-1. На фіг. 2А - результати аналізу експресії рецептора ТКЕМ-1 через 0, 6 і 24 год. після зв'язування. На фіг. 25 - результати аналізу експресії рецептора ТКЕМ-1 через 0, 4 і 20 год. після зв'язування. На фіг. 2Б представлені також дані, одержані з використанням антитіла ТКЕМ26, яке не конкурує з варіантами антитіла 0318 за зв'язування з ТКЕМ-1. Антитіло ТКЕМ26 застосовували для оцінки "долі" рецептора ТКЕМ-1 після його інтерналізації (наприклад, чи піддається він деградації чи повертається назад на поверхню); на фіг. З - демонстрація того, що варіанти тАБб 0318 не мають агоністичного впливу на передачу сигналу ТКЕМ-1 за даними репортерного клітинного аналізу ВММА/ЛТКЕМ-1, в якому репортерну лінію клітин інкубували разом ("обидві") або без СНО-СО32 ("тільки ВУМ2 36").

Представлені варіанти антитіл включали: (І) 318-І901.17 С79дое1.17), (1) 318-Ід1.31 ("9до1.3, (ПІ) 318-і9054-Ара ("ЕсАба-4"), (ІМ) 318-д451-Аба ("РсАра-1"). Антитіло МАВІ1278, яке є відомим агоністом передачі сигналу ТКЕМ-1, застосовували як антитіло, що служить позитивним контролем (див. вставку, виділену рамкою). Антитіло 5С8 (контроль ізотипу) застосовували як негативний контроль; на фіг. 4 - дані про ефективність різних варіантів тАБбБ 0318 щодо блокування опосередковуваного ТКЕМ-1 продукування прозапальних цитокінів різними людськими клітинами. Варіанти антитіла тАб 0318, представлені на фіг. 4, інгібували опосередковуване

ТКЕМ-1 вивільнення прозапальних цитокінів (наприклад, ТМЕ-с, І/-6б або ІІ -8) з різних типів людських клітин: РВМС, моноцитів, нейтрофілів і цільної крові після седиментації КВС (а саме, більшість еритроцитів видаляли згідно з протоколом осадження КВС з використанням декстрану згідно з процедурою, описаною в прикладах). Для продукування прозапальних цитокінів клітини стимулювали або імобілізованим на планшеті РОКРІ і розчинним пептидогліканом, що не має Ті К2-активності ("РОКРАРСОМ-Еспазв"), або стимульованими форбол-12-міристат-13-ацетатом (РМА) нейтрофілами, які експресують РОКРІ1 ("РМА-51їійт

МештгорпіїЇ Епдодепои5 РОКР" (ендогенний РОКР стимульованих РМА нейтрофілів)).

Представлені варіанти антитіл включали: (І) 0318-Ід(4, (ІІ) 0318-Іде1.3, (1) 0318-І9051.17, (ІМ) 0318-Ідс1-Авба і (мМ) 318-Ід54-Аба. "М/О0" означає, що рівень експресії конкретного прозапального цитокіну не визначали; на фіг. 5А і 5Б - дані про ефективність тАБб 0318-Ідс1.3ї щодо блокади продукування 1І--8 в цільній крові після стимуляції РОМ із застосуванням або без застосування РОКРІ1 в присутності інгібітора МОЮБ2. На фіг. 5А представлені дані про інгібування, отримані за допомогою фармакодинамічного аналізу цільної крові згідно з методом, описаним в прикладах. На фіг. 5Б представлені дані про інгібування, отримані за допомогою внутрішньоклітинного аналізу цитокінів в цільній крові згідно з методом, описаним в прикладах; на фіг. бА-В -- рівні експресії РНК хітинази-3-подібного білку 1 ("СНІЗІ 1") (фіг. бА), І--18рД (фіг. 6Б) і 11-6 (фіг. 6В) в цільній крові, стимульованій в присутності тАБб 0318-І901.3Ї в різних концентраціях (0-1НМ). Цільну кров брали у трьох різних донорів (Ме 126, Мо 290 і Мо 322) і стимулювали розчинним РОКРІ і розчинним пептидогліканом, який не має активності щодо

ТтК2 Срозчинний РОКР ї- розчинний РОМ-Еспаз5"). На кожній з фіг. бА-6В представлені рівні експресії РНК (у-вісь) як у вигляді» інгібування (права колонка), так і у вигляді ДАСІ (різниця між рівнем референс-гена і рівнем гена в тестованому зразку) (ліва колонка). На х-осі наведені різні концентрації антитіла 0318-І91.3Г; на фіг. 7 - профіль в'язкість-концентрація двох варіантів антитіла 318-І91.17 (квадрати) і 318-І901.31 (кола). Визначення профілю в'язкості здійснювали на основі схеми розведення за допомогою динамічного віскозиметра КПпеозепзе т-УКОС з використанням З-точкової розгортки зсувного зусилля для кожної точки при постійній температурі. Суцільна лінія являє собою криву, отриману шляхом нелінійної апроксимації даних методом найкращого підбору. Пунктирною лінією позначений максимально допустимий з точки зору ефективності рівень в'язкості; на фіг. 8 - дані, які демонструють, що обидва варіанти антитіла 318-Їде1.14 ї 318-ІдС1.3 характеризувалися ризиком імуногенності від низького до помірного. Як позитивні контролі застосовували МІ 6 (імуногенне ІЇ/-21К тАБ) і КІН (гемоціанін лімфи равлика). Як негативний контроль застосовували авастин; бо на фіг. ЗА ії 9Б - дані, які демонструють, що всі варіанти тАб 0318 мають здатність зв'язуватися з ЕсКп (людини (чорний колір), мавп циномолгус (білий колір) і мишей (сірий колір)) в залежності від рН. На фіг. 9А представлені дані про зв'язування з ЕсКп у вигляді 95 Ктах (максимальна здатність зв'язуватися з ЕсКп). На фіг. 9Б представлені дані про зв'язування з

ЕсКп у вигляді сенсограмм. Представлені варіанти антитіла 0318 включають: (І) Ідс1-Аба, (ІІ)

Ідо4-Авба, (І) Іде1.11 ї (ІМ) Ід1.3Ї. Для цілей порівняння представлені також дані для антитіла тАб 0318 (ІдС4); на фіг. Т10А ії 10Б - дані, які демонструють, що всі варіанти антитіла тАБр 0318 характеризуються зниженою здатністю зв'язуватися з одним або декількома людськими Есук (а саме, СО64, варіант СОЗ2а-НІ131, варіант СОЗ2а-К131, СО32р, варіант СО1ба-М158 і варіант

СО0168-МА2). На фіг. 10А представлені дані про афінність зв'язування у вигляді 96 Ктах (максимальна здатність зв'язуватися з Есук). На фіг. 10Б представлені сенсограмми.

Представлені варіанти антитіла 0318 включають: (І) Їд1-АБба, (ІІ) Ід54-Аба, (І) 191.17 ї (М)

Іде1.3Ї. Для цілей порівняння представлені дані для антитіла тАб 0318 (1954). Як контроль застосовували антитіло 1Е4-пІдО1, щодо якого відомо, що воно зв'язується з декількома Есук; на фіг. 11А-1ТИ - дані, які демонструють, що варіанти антитіла 0318 самі по собі (тобто за відсутності стимулу) не є агоністичними, про що свідчать результати вимірювань вивільнення різних прозапальних цитокінів (наприклад, ІЇ/-6, ТМЕ-а і 11-12) при культивуванні з незрілими дендритними клітинами. На фіг. 11А, 11Б і 118 представлені кількості ІЇ-6, продукованого незрілими дендритними клітинами, виділеними з донорів 0179, 0276 і 0341 відповідно. На фіг. 11Г, 11Д ї 11ЄЕ представлені кількості ТМЕ-с, продукованого незрілими дендритними клітинами, виділеними з донорів 0179, 0276 і 0341 відповідно. На фіг. 11Ж, 113 ї 11И представлені кількості 1-12, продукованого незрілими дендритними клітинами, виділеними з донорів 0179, 0276 і 0341 відповідно. Представлені варіанти антитіла 0318 включають: (І) Їд1.17, (1) (901.3 (ПП) Тд01-Ава. У дужках вказані дози (мкг/мл) антитіл. Незрілі дендритні клітини культивували з варіантами антитіла до ТКЕМ-1 в присутності і за відсутності клітин СНО, які експресують на мембрані СОЗ2а (для стимуляції перехресного зв'язування Ес). РОКРАРОМ, тример СО40І.

СТптег"") і агоністичне антитіло до СО40 фірми Ріїгег ("СР870") застосовували як позитивні контролі. Як негативний контроль застосовували ізотипове антитіло ("СНІ -6". Пунктирною лінією показана нижня межа виявлення аналізу; на фіг. 12 - фармакокінетичні характеристики варіанту тАБ 0318-І951.3ї в організмі мавпи циномолгус після підшкірного введення одноразової дози. Кожній тварині вводили одну з наступних доз: (І) 0,1 мг/кг (п-:4) ("1"), (І) 0,5 мг/кг (п-:4) ("2"), (ПІ) 2 мг/кг (п-:3) ("3") або (ІМ) 10 мг/кг (п--4) (747). Дані представлені у вигляді середнього значення х стандартне відхилення; на фіг. 13 - схема мішень-опосередкованого розподілу лікарського засобу (ТМОБД), яка використовується для опису даних про фармакокінетику (ФК), фармакодинаміку (ФД) і окупацію рецептора (КО) у мавп циномолгус; на фіг. 14А і 14Б - загальна щільність рецепторів ТКЕМ-1 на моноцитах (фіг. 14А) і гранулоцитах (фіг. 14Б) після введення мавпам (підшкірно (5с) або внутрішньовенно (ім)) одноразової дози варіанту тАбБ 0318-І951.3ї циномолгусє. Щільність рецепторів ТКЕМ-1 представлена у вигляді відсотка від щільності рецепторів ТКЕМ-1 до введення антитіла. Кожній з тварин вводили одну з наступних доз: (а) 0,1 мг/кг (5с) (п-:4) ("А"), (6) 0.5 0,1 мг/кг (п--4) (зс)

СБ"), (в) 2 01 мг/кг (п--3) (вс) ("В"), (г) 2 0,1 мг/кг (п--3) (ім) СГ" або (є) 10 0,1 мг/кг (п-:4) (вс) ("Д".

Дані представлені у вигляді середнього значення « стандартне відхилення; на фіг. 15А ії 158 - дані про окупацію рецептора ТКЕМ-1 на моноцитах (фіг. 15А) і гранулоцитах (фіг. 15Б) після введення мавпам циномолгус одноразової дози варіанту тАр 0318-І91.3Ї. Дані про окупацію рецептора представлені у вигляді відсотка від загальної кількості експресованих на клітинах рецепторів ТКЕМ-1. Кожній тварині вводили одну з наступних доз: (а) 0,1 мг/кг (зс) (п-:4) ("А"), (6) 0,5 мг/кг (п-:4) (вс) ("Б"), (в) 2 мг/кг (п--3) (с) ("В"), (г) 2 мг/кг (п--3) (їм) СГ") або (д) 10 мг/кг (п--4) (зс) (Д"). Дані представлені у вигляді середнього значення « стандартного відхилення. Пунктирна лінія відповідає 85 95-вій окупації рецептора; на фіг. 16А і 16Б - отримані експериментально (незафарбовані кола) і передбачені на основі моделі (суцільна лінія) результати оцінки ФК (верхня ліва панель), ФД (верхня права панель),

КО (нижня ліва панель) і загального рівня експресії на поверхні рецептора ТКЕМ-1 (нижня права панель) після введення одноразової дози варіанту тАБб 0318-ІД21.3ї мавпам циномолгус, при цьому для теоретичної оцінки застосовували 2-компартментну модель ФК з ТМОО в центральному компартменті. На фіг. 16А представлені дані, отримані при підшкірному введенні кожній мавпі одноразової дози антитіла, що становить 0,1 мг/кг. На фіг. 16Б представлені дані, отримані при підшкірному введенні тваринам одноразової дози антитіла, що становить 10 мг/кг.

Детальний опис винаходу 60 Для полегшення розуміння даного опису спочатку дані визначення деяких понять. Додаткові визначення наведені в тексті детального опису.

Слід розуміти, що вживання елемента в однині має на увазі його застосування і в множині; наприклад, слід розуміти, що поняття "нуклеотидна послідовність" означає одну або декілька нуклеотидних послідовностей. Таким чином, поняття "один" (або "декілька"), "один або більша кількість" і "принаймні один" можуть використовуватись як взаємозамінні в контексті даного опису.

Крім того, слід розуміти, що в контексті даного опису "і/або" стосується конкретно кожної/кожного з двох зазначених характеристик або компонентів в поєднанні один з одним або окремо. Так, слід мати на увазі, що поняття "і/або", що використовується в такому виразі як "А іабо Б" в контексті даного опису включає "А і Б", "А або Б", "А" (окремо) і "Б" (окремо).

Аналогічно до цього, слід мати на увазі, що поняття "і/або", що використовується в такому виразі як "А, Б і/або В" включає наступні варіанти: А, Б і В; А, Б або В; А або В; А або Б; Б або В;

АЇВ;АЇБ; Б і В; А (окремо); Б (окремо) і В (окремо).

Слід розуміти, що якщо відносно будь-яких аспектів в даному описі вживається вираз "який містить", то він включає також аналогічні аспекти, описані в інший спосіб за допомогою понять "який складається з" і/або "який практично складається з".

Якщо не вказано інше, то всі технічні та наукові поняття, які використовуються в даному описі, мають значення, відоме звичайному спеціалісту в галузі, якої стосується даний винахід.

Наприклад, ІСопсізе Оісійопагу ої Віотедісіпе апа МоїІесшіаг ВіоІоду, Уио, Реі-Зпом, 2-е вид., вид- во СКС Ргезв, 2002; Те Оісіопагу ої СеїЇ апа МоїІесшіаг ВіоІоду, 3-е вид., вид-во Асадетіс Ргев5, 1999; ї Охтога Оісійопагу ОЇ Віоспетівігу Апа Моїесшціаг Віоіоду, доповнене видання, вид-во ОхТога

Опімегзйу Ргезз, 2000) представляють широко відомі собою словники, в яких спеціалист в даній галузі може знайти багато з понять, які використовуються в даному описі.

Одиниці, префікси і символи застосовують у формі, що відповідає Міжнародній системі одиниць (СІ). Чисельні діапазони включають числа, які визначають межі діапазону. Якщо не вказано інше, нуклеотидні послідовності написані зліва направо в 5-3 орієнтації.

Амінокислотні послідовності написані зліва направо в орієнтації від амінокінця до карбоксикінця.

Заголовки, наведені в даному описі, не обмежують обсяг різних об'єктів винаходу, який визначається всією заявкою в цілому. Відповідно, поняття, визначені безпосередньо нижче в тексті, більш повно визначаються всією заявкою в цілому.

Поняття "приблизно" в контексті даного опису означає "приблизно", "грубо", "близько до того" або "в сфері цього". Коли поняття "приблизно" використовують стосовно числового діапазону, то воно модифікує вказаний діапазон шляхом розширення кордонів вище і нижче вказаних чисельних значень. В цілому, поняття "приблизно" може модифікувати чисельне значення в бік збільшення і зменшення зазначеного значення на різницю, що становить, наприклад, 10 95, вгору або вниз (вище або нижче).

Поняття "критичний рецептор 1, який експресується на мієлоїдних клітинах" (відомий також як ТКЕМІ, ТКЕМІ ї СО354), стосується рецептора, який експресується на моноцитах, макрофагах і нейтрофілах. Основним лігандом для ТКЕМ-1 є пептидоглікан-розпізнаючий білок 1 (РОГУКРІЇ), який стосується сімейства пептидоглікан (РОМ)-зв'язуючих білків (РОКР). Після активації ТКЕМ-1 вступає в асоціацію з ІТАМ-вмісним сигнальним адапторним білком, ОАР12.

Передача сигналу в прямому напрямку може включати активацію фактора транскрипції МЕАТ, викликаючи підвищуючу регуляцію продукування прозапальних цитокінів. Поняття ""КЕМ-1" включає будь-які варіанти або ізоформи ТКЕМ-1, які в природних умовах експресуються клітинами. Отже, у деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, представлені в даному описі, можуть перехресно взаємодіяти з ТКЕМ-1 з видів, відмінних від людини (наприклад, з

ТКЕМ-1 мавп циномолгус).

Ідентифіковано три ізоформи ТКЕМ-1. Ізоформа 1 (реєстраційний номер МР 061113.1; 5ЕО

ІО МО: 1) складається з 234 амінокислот і являє собою канонічну послідовність. Ізоформа 2 (реєстраційний номер МР 001229518.1; 5ЕБО ІО МО: 2) складається з 225 амінокислот і відрізняється від канонічної послідовності амінокислотними залишками 201-234. Амінокислотні залишки кодують частину трансмембранного домену та цитоплазматичний домен. Ізоформа З (реєстраційний номер МР 001229519; 5ЕО ІО МО: З) складається з 150 амінокислот і є розчинною. У ній відсутні амінокислотні залишки 151-234, які кодують трансмембранний домен, цитоплазматичний домен і частину позаклітинного домену. Амінокислотні залишки 138-150 також відрізняються від описаної вище канонічної послідовності.

Нижче представлені амінокислотні послідовності трьох відомих ізоформ людського ТКЕМ-1. (А) Ізоформа 1 людського ТКЕМ-1 (реєстраційний номер МР 061113.1; 5ЕО ІЮО МО: 1; кодується нуклеотидною послідовністю, яка має реєстраційний номер ММ 018643; 5ЕО ІЮО МО: 60 4):

МеКТКОММОЇ ГММСЕМЗЕСКААТКІТЕЕКУЄЕС КЕСОТІ ОМКСОХУ ТТ ЕКЕАЗБОКАУМОПКОСЕМР

КТ АСТЕКРЗКМЗНРМОМОКНІ ЕОУНОНС ГІ ЕМеЕМУМГ ОМЕОБСІ МОСМІМОРРКЕРНМІ ЕОКІКІ М

МмТКОЕЗОТРОЗМЕМЗТОММУКІРРТТТКАЇ СРІ УТЗРЕТМТОАРРКЗТАОЮМЗТРОЗЕЇМІ ТММ ТОПАКМР

МЕМІМІССАССРІ ЗКБІ МЕМ ЕАМТІ К5ЕМР (сигнальна послідовність підкреслена); (Б) Ізоформа 2 людського ТКЕМ-1 (реєстраційний номер МР 001229518.1; 5ЕО ІО МО: 2; кодується нуклеотидною послідовністю, яка має реєстраційний номер ММ 001242589; 5ЕО ІЮ

МО: 5):

КТ АСТЕКРЗКМЗНРМОМОКНІ ЕОУНОНС ГІ ЕМеЕМУМГ ОМЕОБСІ МОСМІМОРРКЕРНМІ ЕОКІКІ М мМТкКОог5ОТРОЗМЕМЗТОММУУКІРРТТТКАГ СРІ УТ5РЕТМТОАРРКЗТАЮМЗТРОЗЕЇМСТММТОПКУ5

ЕОМРОРІ МУМТІ ЗРІ ЕРБІ САЕРКМ (сигнальна послідовність підкреслена); (В) Ізоформа З людського ТКЕМ-1 (реєстраційний номер МР 001229519; 5ЕО ІЮО МО: 3; кодується нуклеотидною послідовністю, яка має реєстраційний номер ММ 001242590; 5ЕО ІЮ

МО: 6):

МеКТКОММОЇ ГММСЕМЗЕСКААТКІТЕЕКУЄЕ КЕСОТІГ ОМКСОХУ ТІ ЕКЕАЗЗБОКАУМОПКОСЕМР

МТКОЕКСЗБТІ ЗЕБУМІ МО5 (сигнальна послідовність підкреслена).

Передбачено, що білок ТКЕМ-1 мавп циномолгус (реєстраційний номер ХР 001082517;

ЗЕО ІО МО: 7) повинен мати наступну амінокислотну послідовність:

МеКТКОМОЇ ГММСЕМЗЕСКАТТЕСТЕЕКУЕУКЕСОТІ ЕМКСОУАГЕКУАМЗАКАУМОКМЕСКМР

КІСАКТЕКРЗЕМЗНРМОМОКІ ПЕОУРОНОСГ ОМОМТМСОМЕОЗОСГМОСМІМОНРКЕЗНМЕМРІСТ М

УМмТКО556 ТРОБЗЕМЗТОММУ КТРЗТТАКАЇ СРКУТЗРЕТМТОАРРЕБТУММЗТРОЗЕІМСТММТОПАМ

РМЕМІМІМАССОБ І ЗКБІ МЕЗМІ ЕАМТІ КЗЕОР (сигнальна послідовність підкреслена).

Дана заявка стосується антитіл, які специфічно зв'язуються і блокують функцію ТКЕМ-1.

Антитіла блокують функцію ТКЕМ-1 шляхом зниження / блокади активації ТКЕМ-1 і передачі сигналу в прямому напрямку.

Антитіла до ТКЕМ-1, запропоновані в даному описі, блокують передачу сигналу ТКЕМ-1 за допомогою одного або комбінації декількох різних механізмів, блокуючи ТКЕМ-1 безпосередньо або побічно. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла перешкоджають природному ліганду для ТКЕМ-1, пептидоглікан-розпізнаючому белку 1 (РОЇМУКРІ), створювати функціональний комплекс з ТКЕМ-1. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіла блокують

ТКЕМ-1, перешкоджаючи окремим молекулам ТКЕМ-1 формувати димери або мультимери. У деяких варіантах здійснення винаходу зниження або попередження димеризації або мультимеризації ТКЕМ-1 обумовлено антитілами до ТКЕМ-1, які мають здатність зв'язуватися з частиною ТКЕМ-1, яка в іншому випадку була б на поверхні поділу в димері ТКЕМ-1, попереджаючи тим самим асоціацію окремих молекул ТКЕМ-1 одна з одною. В інших варіантах здійснення винаходу зниження або попередження димеризації або мультимеризації ТКЕЕМ-1 обумовлено антитілами до ТКЕМ-1, які перешкоджають взаємодії ТКЕМ-1 з його лігандом.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 можуть блокувати індуковану

РОЇУКРІ активацію ТКЕМ-1. РОЇ УКРІ, що представляє собою висококонсервативний білок, який містить 196 амінокислот, який складається з сигнального пептиду і пептидоглікан- зв'язуючого домену, експресується на нейтрофілах і вивільняється після їх активації. Нижче представлена амінокислотна послідовність РОЇ УКРІ (реєстраційний номер МР 005082.1; 5ЕО

ІО МО: 8):

МЗАКЗМАУМАСРЗІ Л.К СААОЕТЕОРАССЗРІМРАМЕМУКАЇ АЗЕСАОНІ 5І Р ЕУММУМ5НТАО

ЗЗСМТРАБСОООДЕММОНУНМКТІСУМСОМОУМЕСОЕОСІ МУЕОКОУММЕТОАНЗОНІ МММРМ51ІОІ

ЗЕМОМУМОКУРТРОАІКААОСІЇ ГГ АСОМАОСБАЇКЗМУМІ КОНКОМОКТІ ЗРОМОЇ УНОТОМУРНУК

Р (сигнальна послідовність підкреслена).

Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даній заявці, здійснюють знижуючу регуляцію або блокують вивільнення прозапальних цитокінів з мієлоїдних клітин (наприклад, дендритних клітин і моноцитів). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 блокують вивільнення ТМЕ-а, МІР-1-бета, МОСР-1, І -1-бета, СОМ-

С5Е, 1-6 і/або 1І/-8 з макрофагів, нейтрофілів, клітин синовіальної тканини і/або репортерної клітини, що продемонстровано в даному описі.

Хоча контрольоване вивільнення прозапальних цитокінів у відповідь на чужі антигени може бути сприятливим (наприклад, викликати ефективну адаптивну імунну відповідь), надлишкове вивільнення прозапальних цитокінів може мати важкі наслідки. Наприклад, одним із загальних і токсичних ускладнень, які спостерігалися при введенні іп мімо визначених антитіл проти імунних рецепторів на поверхні імунних клітин (наприклад, антитіл до людського СОЮЗ, таких як ОКТЗ), є бо синдром вивільнення цитокінів (СКЗ), який асоційований з надмірним вивільненням різних цитокінів (наприклад, ТМЕ-альфа, ІЕМ-гама і 1-2) в кровотік. СК5 може виникати в результаті одночасного зв'язування антитіл з їх когнатним антигеном (наприклад, СОЗ на Т-клітинах) (за допомогою варіабельної ділянки антитіла) і Ес-рецепторами (наприклад, Есук) і/або рецепторами комплементу (за допомогою константної ділянки антитіла) на допоміжних клітинах (наприклад, на антигенпрезентуючих клітинах). Така взаємодія призводить до активації клітин (наприклад, Т-клітин і/або допоміжних клітин) і вивільненню різних цитокінів, які викликають системну запальну відповідь, що характеризується гіпотензією, гіпотермією і ознобом. Інші симптоми СК5 включають лихоманку, озноб, нудоту, блювоту і задишку.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, крім блокади індукованого РОЇ УКРІ продукування прозапальних цитокінів приводять до зниження кількості випадків або до усунення випадків виникнення синдрому вивільнення цитокінів після введення індивідууму, який цього потребує. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 не індукують експресію прозапальних цитокінів клітинами (наприклад, дендритними клітинами), коли клітини інкубують в присутності тільки антитіла, в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІО МО: 54. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 мають знижену здатність зв'язуватися з одним або декількома

ЕсукК, що сприяє зниженню кількості виникнення випадків СОК.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, запропоновані в даному винаході, зв'язуються і з лодським ТКЕМ-1, і з ТКЕМ-1 з інших видів. Таким чином, в контексті даного опису поняття "ТКЕМ-1", включає будь-яку форму ТКЕМ-1, яка зустрічається в природних умовах і яка може мати походження з будь-якого придатного організму. Наприклад,

ТКЕМ-1, придатний для застосування відповідно до даного опису, може являти собою ТКЕМ-1 хребетного, такий як ТКЕМ-1 ссавця, такий як ТКЕМ-1 примату (такого як людина, шимпанзе, мавпа циномолгус або макак-резус); гризуна (такого як миша або пацюк), лагоморфа (такого як кролик) або парнокопитного (такого як корова, вівця, свиня або верблюд). У деяких варіантах здійснення винаходу ТКЕМ-1 має послідовність зхЕО ІЮО МО: 1 (людський ТКЕМ-1, ізоформа 1).

ТКЕМ-1 може являти собою зрілу форму ТКЕМ-1, таку як білок ТКЕМ-1, який був підданий посттрансляційному процесингу у відповідній клітині. Такий зрілий білок ТКЕМ-1 може, наприклад, бути глікозильованим. ТКЕМ-1 може являти собою повнорозмірний білок ТЕКЕМ-1

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, запропоновані в даному винаході, являють собою моноклональні антитіла в тому сенсі, що вони одержані безпосередньо або непрямим шляхом з одного клону В-лімфоциту. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 одержують, піддають скринінгу і очищають за допомогою методів, наприклад, описаних в розділі "Приклади" публікації міжнародної заявки на патент МО 2013/120553. В цілому, метод полягає в наступному: придатну мишу, таку як миша з "вимкненим" (Кпоск-оцї (КО)) ТКЕЕМ-1 або ТКЕМ-І/ТКЕМ-3, імунізують ТКЕМ-1, клітиною, що експресує ТКЕМ-1 або їх комбінацією. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіла до

ТКЕМ-1 являють собою поліклональні антитіла в тому сенсі, що вони є сумішшю моноклональних антитіл, представлених в даному описі.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, рекомбінантно експресуються в прокаріотичних або еукаріотичних клітинах. У деяких варіантах здійснення винаходу прокаріотична клітина являє собою ЕЕ. сої. У конкретних варіантах здійснення винаходу еукаріотична клітина являє собою клітину дріжджів, комахи або ссавця, таку як клітина, одержана з організму, який є приматом (таким як людина, шимпанзе, мавпа циномолгус або макак-резус); гризуном (таким як миша або пацюк), лагоморфом (таким як кролик) або парнокопитним (таким як корова, вівця, свиня або верблюд). Придатними лініями клітин ссавців є (але не обмежуючись тільки ними) клітини НЕК293, клітини СНО і клітини НЕГА.

Антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можна одержувати також за допомогою інших методів, відомих спеціалісту в даній галузі, таких як фаговий дисплей або дріжджовий дисплей. Після одержання антитіла можна піддавати скринінгу відносно зв'язування, наприклад, з повнорозмірним ТКЕМ-1 або його мутантами за допомогою методів, описаних в розділі "Приклади" публікації міжнародної заявки на патент (МО 2013/1205531.

Поняття "антитіло" в контексті даного опису стосується білку, одержаного з послідовності зародкової лінії імуноглобуліну, який має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (ТКЕМ- 1) або його частиною. Поняття включає повнорозмірні антитіла класу або підкласу (а саме, ІдДА,

ІЗЕ, Ід, І9М і/або ІдхХ) і будь-які одноланцюгові антитіла або фрагменти. Антитіло, яке специфічно зв'язується з антигеном або його частиною, може зв'язуватися тільки з зазначеним 60 антигеном або його частиною або воно може зв'язуватися з обмеженим числом гомологічних антигенів або їх частин. Повнорозмірні антитіла, як правило, містять принаймні чотири поліпептидні ланцюга: два важких (Н) ланцюга і два легких (І) ланцюга, які з'єднані один з одним дисульфідними зв'язками. Одним з підкласів імуноглобулінів, які представляють фармацевтичний інтерес, є сімейство дб. У людини клас (дб може бути поділений на 4 підкласи: Ідс1, Ідс2, ЇдоЗ і Ід054 на основі послідовностей константних ділянок їх важких ланцюгів. Легкі ланцюги можуть бути поділені на типи каппа і лямбда, на основі відмінностей в складі їх послідовностей. Молекули дО складаються з двох важких ланцюгів, зчеплених один з одним двома або більшою кількістю дисульфідних зв'язків, і двох легких ланцюгів, кожен з яких приєднаний до важкого ланцюга дисульфідним зв'язком. Важкий ланцюг може містити варіабельну ділянку важкого ланцюга (УН) і аж до трьох константних ділянок важкого ланцюга (СН): СНІ, СН? їі СНЗ. Легкий ланцюг може містити варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) константну ділянку легкого ланцюга (СІ). МН- і МІ -ділянки можуть бути додатково підрозділені на ділянки гіперваріабельності, які називаються гіперваріабельними ділянками (ділянками, які визначають комплементарність) (СОК), між якими знаходяться більш консервативні ділянки, які називаються каркасними ділянками (ЕК). МН- ії Мі-ділянки, як правило, складаються з трьох

СОК і чотирьох ЕК, які розташовуються в напрямку від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕКТ, СОМКІ1, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА. Гіперваріабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів формують зв'язуючий домен, який має здатність взаємодіяти з антигеном, в той час як константна ділянка антитіла може опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) різні клітини імунної системи (ефекторні клітини), Ес-рецептори і перший компонент (С14) класичної системи комплементу. Антитіла, запропоновані в даному винаході, можуть перебувати в виділеній формі. Поняття "виділене антитіло" стосується антитіла, яке відокремлене і/або виділене з іншого(их) компонента(ів) навколишнього середовища, в якому воно було одержано, і/або очищено з суміші компонентів, присутніх в навколишньому середовищі, в якому воно було одержано. У контексті даного винаходу можна розглядати певні антигензв'язуючі фрагменти антитіл, якщо продемонстровано, що фрагменти повнорозмірного антитіла можуть виконувати антигензв'язуючу функцію антитіла.

Поняття "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла стосується одного або декількох фрагменту(ів) антитіла, який(ї) зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном, таким як ТКЕМ-1, представленим в даному описі. Приклади антигензв'язуючих фрагментів включають

Еаб-, Рар-, Е(ар)2-, Е(ав)2-, Е(аб)5-, ЕРу- (як правило, МіІ- і МН-домени одного плеча антитіла), одноланцюговий Ру- |5сЕм; див., наприклад, Віга та ін., 5сіепсе 242, 1988, сс. 425-426; Нивіоп та ін., РМАБ 85, 1988, сс. 5879-5883), авЕм-, Ба- (як правило, МН- і СНІ1-домени) і аАбБ- (як правило,

МН-домен) фрагменти; УН-, МІ-, МиН- ії М-МАК-домени; одновалентні молекули, які містять один

МН- і один Мі -ланцюг; мініантитіла, діабоді, триабоді, тетрабоді і такі, які складаються з каппа- ланцюга антитіла |див., наприклад, І та ін., Ргоїєїп Епд 10, 1997, сс. 949-957); верблюжі Ідс;

І9ОМАК; а також один або декілька виділених СОК або функціональний паратоп, де виділені СОК або антигензв'язуючі залишки або поліпептиди можуть бути асоційовані або зчеплені один з одним з утворенням функціонального фрагмента антитіла. Різні типи фрагментів антитіл описані або їх огляд наведено, наприклад, у (Ноїїїдег ії Ниазоп, Маї Віоїтесппої 25, 2005, сс. 1126- 1136); в публікації міжнародної заявки на патент (МО 2005/040219 і в публікаціях патентів США 2005/0238646 і 2002/0161201). Зазначені фрагменти антитіл можна одержувати за допомогою загальноприйнятих методів, відомих спеціалістам в даній галузі, і фрагменти можна піддавати скринінгу відносно їх придатності таким же чином, що і інтактні антитіла.

Поняття "людське" антитіло (ПИМАБ) стосується антитіла, що має варіабельні ділянки, в яких і каркасна ділянка, і СОК-ділянки мають походження з послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Крім того, якщо антитіло містить константну ділянку, то константна ділянка також має походження з послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Антитіла до

ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються послідовностями імуноглобуліну людської зародкової лінії (наприклад, мутації, інтродуковані за допомогою випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп мйго або за допомогою соматичної мутації іп мімо). Однак в контексті даного опису мається на увазі, що поняття "людське антитіло" не включає антитіла, в яких послідовності СОК, що мають походження з зародкової лінії інших видів ссавців, таких як миші, трансплантовані в послідовності людської каркасної ділянки. Поняття "людські" антитіла і "повністю людські" антитіла використовуються як синоніми.

Поняття "гуманізоване" антитіло стосується людського/нелюдського химерного антитіла, яке містить одну або декілька послідовностей (СОК-ділянок або їх частин), що має походження з бо імуноглобуліну видів крім людини. Так, гуманізоване антитіло являє собою людський імуноглобулін (реципієнтне антитіло), в якому принаймні залишки з гіперваріабельної ділянки реципієнтного антитіла замінені на залишки з гіперваріабельної ділянки антитіла виду крім людини (донорське антитіло), такого як миші, щури, кролики або примати крім людини, які мають необхідну специфічність, афінність, склад послідовності і функціональності. У деяких випадках залишки ЕК людського імуноглобуліну замінюють на відповідні нелюдські залишки.

Прикладом такої модифікації є інтродукція однієї або декількох так званих зворотних мутацій, які як правило, представляють собою амінокислотні залишки, які мають походження з донорського антитіла. Гуманізацію антитіла можна здійснювати за допомогою методів рекомбінації, відомих спеціалісту в даній галузі (див., наприклад, Апіїбоду Епдіпеегіпд, Мешйовв5 іп МоЇІесшціаг Віоіоду, т. 248, під ред. Веппу К. С. І 0). Придатну людську реципієнтну каркасну ділянку для варіабельного домену як легкого, так і важкого ланцюга, можна ідентифікувати, наприклад, на основі гомології послідовності або структурної гомології. Альтернативно до цього можна використовувати фіксовані реціпієнтні каркасні ділянки, наприклад, на основі відомостей про структуру, біофізичних і біохімічних властивостей. Реципієнтні каркасні ділянки можуть мати походження з зародкової лінії або зі зрілої послідовності антитіла. СОК-ділянки з донорського антитіла можна переносити шляхом трансплантації СОМК. Гуманізоване антитіло з трансплантованою СОК можна піддавати подальшій оптимізації, наприклад, щодо афінності, функціональності і біофізичних властивостей шляхом ідентифікації положень, які мають вирішальне значення в каркасній ділянці, повторна інтродукція в які (зворотна мутація) амінокислотного залишку з донорського антитіла сприятливо впливає на властивості гуманізованого антитіла. Крім застосування одержаних з використанням донорського антитіла зворотних мутацій гуманізоване антитіло можна створювати шляхом інтродукції залишків з зародкової лінії в СОК або каркасні ділянки, елімінації імунногенних епітопів, сайт-спрямованого мутагенезу, дозрівання афінності і т.д.

Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не присутні в реципієнтному антитілі або в донорському антитілі. Такі модифікації здійснюють з метою додаткового поліпшення характеристик антитіла. В цілому гуманізоване антитіло має містити принаймні один, як правило, два варіабельних домена, в яких всі або практично всі СОК-ділянки відповідають ділянкам нелюдського імуноглобуліну і в яких всі або практично всі залишки ЕК являють собою залишки з послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло необов'язково може містити також принаймні частину константної ділянки імуноглобуліну (Ес), як правило, людського імуноглобуліну. Поняття "похідне гуманізованого антитіла" стосується будь-якої модифікованої форми гуманізованого антитіла, такої як кон'югат, що містить антитіло і інший агент або інше антитіло.

Поняття "рекомбінантне людське антитіло" в контексті даного опису включає всі людські антитіла, які одержані, експресовані, створені або виділені за допомогою методів рекомбінації, такі як (а) антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхомосомною за генами людського імуноглобуліну або одержана з гібридоми, (б) антитіла, виділені із клітини-хазяїна, трансформованої для експресії антитіла, наприклад, з трансфектоми, (в) антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки людських антитіл, і (г) антитіла, одержані, експресовані, створені або виділені за допомогою будь-яких інших методів, в яких застосовують сплайсинг послідовностей гена людського імуноглобуліну з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбінантні людські антитіла містять варіабельні і константні ділянки, основані на конкретних послідовностях імуноглобуліну людської зародкової лінії, але включають наступні перетворення і мутації, які виникають, наприклад, в процесі дозрівання антитіла. Як відомо в даній галузі Ідив., наприклад, І опрегоу, Маїиге Віоїесй. 23(9), 2005, сс. 1117-1125), варіабельні ділянки містять антигензв'язуючий домен, який кодується різними генами, який перетворюють з одержанням антитіла, специфічного щодо чужого антигену. На додаток до перетворення варіабельну ділянку можна додатково модифікувати за допомогою декількох одиночних амінокислотних замін (що позначаються як соматична мутація або гіпермутація) для підвищення афінності антитіла до чужого антигену. Константну ділянку можна змінювати для додаткової відповіді на антиген (тобто шляхом перемикання ізотипу).

Таким чином, молекули нуклеїнової кислоти, які кодують поліпептиди легкого ланцюга і важкого ланцюга імуноглобуліну, піддані перетворенню і соматичній мутації для відповіді на антиген, не можуть мати ідентичність послідовності з вихідними молекулами нуклеїнової кислоти, але вони повинні бути практично ідентичними або подібними (тобто, ідентичними принаймні на 80 95).

Поняття "химерне антитіло" стосується антитіла, в якому варіабельні ділянки мають походження з одного виду, а константні ділянки мають походження з іншого виду, наприклад, до антитіла, в якому варіабельні ділянки мають походження з мишачого антитіла, а константні бо ділянки мають походження з людського антитіла.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, зазначені в даному описі, являють собою антитіла у вигляді ДС. У контексті даного опису "антитіло у вигляді Ідс", наприклад, людський Ідс1, у деяких варіантах здійснення винаходу має структуру антитіла, що зустрічається в природних умовах у вигляді Ідс, тобто воно має таку ж кількість важких і легких ланцюгів і дисульфідних зв'язків, що і антитіло, яке зустрічається в природних умовах у вигляді

ІдО того ж підкласу. Наприклад, антитіло до ТКЕМ-1 у вигляді ЇДС1 складається з двох важких ланцюгів (НС) і двох легких ланцюгів (І С), де два важких ланцюга і легких ланцюга зчеплені за допомогою такої ж кількості і таким же чином розташованих дисульфідних містків, що і у антитілі, що зустрічається в природних умовах у вигляді ЇдО1 (якщо тільки антитіло не піддане мутації з метою модифікації дисульфідних містків).

У контексті даного опису поняття "ізотип" стосується класу антитіл (наприклад, антитіла у вигляді ЇдД1, Ід02, ІдЗ, Ід04, І9М, ІЧЗАТ1, ІдА2г, ІдО і ІЗ9Е), що кодується генами константної ділянки важкого ланцюга.

Поняття "алотип" стосується варіантів, які зустрічаються в природних умовах в конкретній ізотиповій групі, де варіанти розрізняються декількома амінокислотами |див., наприклад, УеПегів та ін., тАре 1, 2009, с. 1)|Ї. Антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можуть стосуватися будь-якого алотипу. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 мають алотип "Ідс1.3г", який містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з І 234А, 1235Е і 5237А (ЕО-нумерація), в порівнянні з ізотипом Їдс1 дикого типу (наприклад, 5ЕО ІО МО: 9). В інших варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 мають алотип "Ідс1 17", який містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з І 234А, І1235Е, 5237А, АЗ305 і РЗЗ15 (БО-нумерація), в порівнянні з ізотипом 9061 дикого типу (наприклад, 5ЕО ІО МО: 9). У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 мають алотип "Ідс1-Авба", який містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К, С2265, 02295 і Р2385 (БО-нумерація), в порівнянні з ізотипом ЇдО1 дикого типу (наприклад, ЗЕО ІО МО: 9). В інших варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 мають алотип "Ід04-Абвра", який містить СНІ1-домен ізотипу Їдсвсі4 дикого типу (наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 10) ії СН2- ії СНЗ-домени Ід01. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло алотипу Ід54-Ара містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з 5131, КІЗЗЕ, 5137Е, 51385, О196К, 1199Т, М2030,

К214К, С2265, 02295 і Р2385 (БО-нумерація), в порівнянні з ізотипом ЇдС1 дикого типу (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 9).

Вирази "антитіло, яке розпізнає антиген" і "антитіло, яке має специфічність щодо антигену" використовуються в даному описі як взаємозамінні з поняттям "антитіло, яке специфічно зв'язується з антигеном".

У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "виділене антитіло" стосується антитіла, яке відокремлене і/або виділене від/з іншого (их) компонента (ів) в навколишньому середовищі, в якому воно одержано, і/або очищено з суміші компонентів, присутніх в навколишньому середовищі, в якому воно одержано.

Поняття "ефекторна функція" стосується взаємодії Ес-ділянки антитіла з Ес-рецептором або лігандом, або біохімічної події, що сталася в результаті цього. Приклади "ефекторних функцій" включають зв'язування С1д, комплементзалежну цитотоксичність (СОС), зв'язування Ес- рецептора, ЕсукК-опосередковані ефекторні функції, такі як АОСС, і антитілозалежний клітинно- опосередкований фагоцитоз (АОСР), і знижувальну регуляцію рецептора клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора; ВСК). Такі ефекторні функції, як правило, вимагають об'єднання Ес-ділянки зі зв'язуючим доменом (наприклад, з варіабельним доменом антитіла). В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, містять Ес-ділянки, які не зв'язуються з одним або декількома ЕсукК і відтак не мають ефекторної функції (тобто не є ефекторами). "Ес-рецептор" або "БСК" являє собою рецептор, який зв'язується з Ес-ділянкою імуноглобуліну. ЕСЕ, які зв'язуються з антитілом у вигляді ЇдС, включають рецептори сімейства

Есук, включаючи алельні варіанти і утворені в результаті альтернативного сплайсингу форми цих рецепторів. Сімейство ЕсукК складається з трьох активуючих (ЕсуКІ, ЕсуУКП ї ЕсукіІМ у мишей; ЕсукІА, ЕсукПА і ЕсукША у людини) рецепторів і одного інгібуючого (ЕсуКІІВ) рецептора. У даній галузі відомі різні властивості людських ЕсукК. Більшість таких, які зустрічаються в природних умовах типів ефекторних клітин, характеризуються спільною експресією одного або декількох активуючих ЕсукК і інгібуючого ЕсуйКІІВ, в той час як природні клітини-кілери (МК) вибірково експресують один активуючий Ес-рецептор (ЕсукП у мишей і

ЕсукША у людини), але не інгібуючий ЕсукіІВ у мишей і у людини. Людський Ідс1 зв'язується з бо більшістю людських Ес-рецепторів і розглядається як еквівалент мишачому ЇдсСг2а щодо типів активуючих Ес-рецепторів, з якими він зв'язується.

Поняття "Ес-ділянка" (ділянка, яка являє собою фрагмент, який кристалізується) або "Ес- домен", або "Ес" стосується С-кінцевої ділянки важкого ланцюга антитіла, який опосередковує зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи зв'язування з Ес- рецепторами, що знаходяться на різних клітинах імунної системи (наприклад, на ефекторних клітинах) або з першим компонентом (С14) класичної системи комплементу. Таким чином, Ес- ділянка містить константну ділянку антитіла за винятком першого домену константної ділянки імуноглобуліну (наприклад, СНІ або СІ).

В доб Ес-ділянка містить імуноглобулінові домени СН2 і СНЗ і шарнір між СНІ1- і СН2- доменами. Хоча визначення меж Ес-ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну може варіюватися, в контексті даного опису Ес-ділянку важкого ланцюга людського ЇдС визначають як сегмент, що простягається від амінокислотного залишку 0221 в випадку ІДдС1, М222 в випадку Ід02, 1221 в випадку ІдОЗ і Р224 в випадку Ідс4, до карбоксикінця важкого ланцюга (нумерація відповідно до

ЕШ-індексу Кебота). СН2-домен Ес-ділянки людського ЇдС простягається від амінокислоти 237 до амінокислоти 340, а СНЗ-домен розташовується на С-кінцевій стороні домену СН2 в Ес- ділянці, тобто він простягається від амінокислоти 341 до амінокислоти 447 або 446 (якщо відсутній С-кінцевий залишок лізину), або 445 (якщо відсутні С-кінцеві залишки гліцину і лізину)

Ід. У контексті даного опису Ес-ділянка може являти собою таку, яка має нативну послідовність Ес, включаючи будь-які алотипові варіанти, або варіант Ес (наприклад, Ес, що не зустрічається в природних умовах). Поняття "Ес" може стосуватися також зазначеної ділянки, що розглядається окремо, або в контексті такого, який містить Ес-поліпептид білку, такого як "зв'язуючий білок, який містить Ес-ділянку", який називають також як "злитий з Ес білок" (наприклад, антитіло або імуноадгезивний агент). "Рс-ділянка, яка має нативну послідовність" або "Ес, яка має нативну послідовність" містить амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Ес-ділянки, яка зустрічається в природних умовах. Такі, що мають нативну послідовність людські Ес-ділянки включають таку, що має нативну послідовність людського ЇДО1 Ес-ділянку; таку, що має нативну послідовність людського ЇдДс2 Ес-ділянку; таку, що має нативну послідовність людського дз

Ес-ділянку; і таку, що має нативну послідовність людського Ідо4 Ес-ділянку, а також їх варіанти, що зустрічаються в природних умовах. Нативна послідовність Ес включає різні алотипи Ес |див., наприклад, УеїПегів та ін., тАбБз 1, 2009, с. 11. "Варіант послідовності Ес-ділянки" або "Бс, яка не зустрічається в природних умовах" містить модифікацію, як правило, яка служить для зміни однієї або декількох функціональних властивостей, таких як, серед іншого, час напіввиведення в сироватці, фіксація комплементу, зв'язування з Ес-рецептором, стабільність білку і/або антигензалежна клітинна цитотоксичність або її відсутність. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можуть бути модифіковані хімічно (наприклад, до антитіла можуть бути приєднані один або декілька хімічних фрагментів) або можуть бути модифіковані для зміни його глікозилювання, або для зміни одного або декількох функціональних властивостей антитіла. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 являє собою антитіло ізотипу Ід і несе модифікований Ес-домен, який містить одну або декілька і можливо всі з наступних мутацій, які призводять до зниженої афінності до певних Ес-рецепторів (І 234А, І 235Е і Б237А) і до зниженої С1д-опосередкованої фіксації комплементу (АЗ30О5 і РЗ315) відповідно (залишки пронумеровані відповідно до ЕО-індексу).

Поняття "шарнір", "шарнірний домен", "шарнірна ділянка" і "шарнірна ділянка антитіла" стосуються домену константної ділянки важкого ланцюга, яка з'єднує СНІ-домен з СН2- доменом і включає верхню, середню і нижню частину шарніра |Коих та ін., У Іттипої! 161, 1998, с. 4083|. Шарнір обумовлює різні ступені гнучкості між зв'язуючими і ефекторними ділянками антитіла і забезпечує також сайти для міжмолекулярного дисульфідного зв'язування константних ділянок двох важких ланцюгів. У контексті даного опису шарнір починається на

СіІц216 ії закінчується на СіІу237 у всіх ізотипах до |Коих та ін., У Іттипої 161, 1998, с. 40831.

Послідовності шарнірів ЇдС1, Ідс2, ІдОЗ і Ід04 дикого типу відомі в даній галузі |див., наприклад, публікацію міжнародної заявки на патент МО 2017/087678|. В одному з варіантів здійснення винаходу шарнірну ділянку СНІ антитіл до ТКЕМ-1 модифікують таким чином, щоб змінити, наприклад, збільшити або зменшити, кількість цистеїнових залишків в шарнірній ділянці. Такий підхід більш докладно описаний, наприклад, в (О.5. Мо 5677425).

Константну ділянку можна модифікувати для стабілізації антитіла, наприклад, для зниження ризику розділення двовалентного антитіла на два одновалентних МН-МІ-фрагмента.

Наприклад, в константній ділянці Ід54 залишок 5228 (залишки пронумеровані відповідно до ЕО- бо індексу) можна піддавати мутації, замінюючи його на залишок проліну (Р), для стабілізації формування дисульфідного містка на шарнірі між важкими ланцюгами |див., наприклад, Апдаї та ін., Мої Іттипої. 30, 1995, сс. 105-108). Антитіла або їх фрагменти можна оцінювати також з позицій ділянок, які визначають їх комплементарність (СОК). Поняття "ділянка, яка визначає комплементарність" або "гіперваріабельна ділянка" в контексті даного опису стосується ділянок антитіла, в яких розташовані амінокислотні залишки, які беруть участь у зв'язуванні з антигеном.

Ділянку гіперваріабельності або СОК можна ідентифікувати як ділянки, які характеризуються найбільшою варіабельністю, шляхом порівняльного аналізу амінокислот варіабельних доменів антитіла. Для ідентифікації СОК можна використовувати бази даних, такі як база даних Кебота, наприклад, СОК визначають як ділянки, які містять амінокислотні залишки 24-34 (СОМ), 50-59 (СОК2) і 89-97 (СОКЗ) варіабельного домена легкого ланцюга і 31-35 (СОК1), 50-65 (СОК2) і 95- 102 (СОКЗ) варіабельного домена важкого ланцюга (Кабраї та ін.; Зедцепсев5 ої Ргоїєїп5 ої

Іттипо|одісаї Іпіегеві, 5-е вид., вид-во О.5. Оераптепі ої Неайй апа Нитап зегуїісев5, публікація

МІН Мо 91, 1991, с. 3242). Альтернативно цьому СОК можна визначати як ділянки, які містять залишки з "гіперваріабельної петлі" (залишки 26-33 (11), 50-52 (І2) і 91-96 (І 3) в варіабельному домені легкого ланцюга і 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ3) в варіабельному домені важкого ланцюга |СпоїШіа і Гев5К, У. Мої. Віо! 196, 1987, сс. 901-917). Як правило, нумерацію амінокислотних залишків в даній галузі здійснюють за допомогою методу, описаного у Кабаї та ін. вище. Такі вирази, як "положення за Кеботом", "залишок за Кеботом" і "відповідно до

Кебота", в контексті даного опису стосуються зазначеної системи нумерації для варіабельних доменів важкого ланцюга і варіабельних доменів легкого ланцюга. При використанні системи нумерації Кебота фактична лінійна амінокислотна послідовність пептиду може містити меншу кількість амінокислот або додаткові амінокислоти, що відповідає вкороченню або наявності інсерції в каркасній ділянці (ЕК) або СОК варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може включати амінокислотні інсерції (залишки 52а, 525 і 52с відповідно до Кебота) після залишку 52 СОМ Н2 і вбудовані шляхом інсерції залишки (наприклад, залишки 82а, 825 і 82с і т.д. відповідно до Кебота) після залишку 82 ЕК важкого ланцюга. Номери залишків за Кеботом можна визначати для розглянутого антитіла шляхом порівняльного аналізу ділянок гомології послідовності антитіла зі "стандартною" пронумерованою відповідно до Кебота послідовністю.

Поняття "епітоп" або "антигенна детермінанта" стосується сайту на антигені (наприклад,

ТКЕМ-1), з яким специфічно зв'язується імуноглобулін або антитіло, що визначають, наприклад, за допомогою специфічного методу, призначеного для його ідентифікації. Епітопи можуть бути сформовані як безперервно розташованими амінокислотами (як правило, в випадку лінійного епітопу), так і не розташованими безперервно амінокислотами, які зближуються одна з одною в результаті третинного укладання (фолдінгу) білку (як правило, в випадку конформаційного епітопу). Епітопи, сформовані з безперервно розташованих амінокислот, як правило, але не завжди, зберігаються при впливі денатуруючих розчинників, в той час як епітопи, сформовані в результаті теоретичного фолдінгу, як правило, втрачаються при обробці денатуруючими розчинниками. Епітоп, як правило, включає принаймні 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислот, що знаходяться в унікальній просторовій конформації. Методи визначення того, які епітопи зв'язуються з розглянутим антитілом (тобто картування епітопів), добре відомі в даній галузі і включають, наприклад, аналізи методом імуноблотингу і імунопреципітації, в яких тестують пептиди, які перекриваються або безперервні пептиди (наприклад, з ТКЕМ-1) для оцінки реактивності щодо розглянутого антитіла (наприклад, антитіла до ТКЕМ-1). Методи визначення просторової конформації епітопів включають методи, відомі в даній галузі, і методи, представлені в даному описі, наприклад, рентгенівську кристалографію, мутаційний аналіз антигену, 2-мірний ядерний магнітний резонанс і НОХ-М5 |див., наприклад, Ерйоре Марріпд

Ргоїосо!ї5 іп Мейїйодвз іп МоїЇІесшіаг ВіоіІоду, т. 66, під ред. б. Е. Моїтів, 19961.

Поняття "зв'язується з тим же самим епітопом" може бути застосовано до двох або більшої кількості антитіл, і означає, що антитіла зв'язуються з одним і тим же сегментом амінокислотних залишків за даними розглянутого методу. Методи визначення того, чи зв'язуються антитіла з "им же самим епітопом на ТКЕМ-1", що і антитіла, представлені в даному описі, включають, наприклад, методи картування епітопів, такі як рентгенографічний аналіз кристалів комплексів антиген: антитіло, який забезпечує здатність епітопу на рівні атомів, і мас-спектрометричний аналіз обміну водень / дейтерій (НОХ-МС). За допомогою інших методів здійснюють моніторинг зв'язування антитіла з фрагментами антигену або мутантними варіантами антигену, де втрату здатності до зв'язування внаслідок модифікації амінокислотного залишку в послідовності антигену часто розглядають як показник присутності компонента епітопу. Крім того, для картування епітопів можна застосовувати також обчислювальні комбінаторні методи. Ці методи бо базуються на здатності антитіла, яке представляє інтерес, виділяти на основі афінності специфічні короткі пептиди з комбінаторних фагових дисплейних пептидних бібліотек.

Передбачається, що антитіла, які мають одні і ті ж послідовності МН і Мі. або одні і ті ж послідовності СОКТ, 2 і З, повинні зв'язуватися з одним і тим же епітопом.

Поняття "антитіла, які конкурують з іншим антитілом за зв'язування з мішенню", стосується антитіл, які інгібують (частково або повністю) зв'язування іншого антитіла з мішенню. Питання про те, чи конкурують два антитіла один з одним за зв'язування з мішенню, тобто чи інгібує і якою мірою одне антитіло зв'язування іншого антитіла з мішенню, можна вирішувати за допомогою відомих експериментів в умовах конкуренції, наприклад, за допомогою ВІАСОКЕЗ- аналізу на основі методу поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло конкурує з іншим антитілом і інгібує його зв'язування з мішенню принаймні на 50, 60, 70, 80, 90 або 100 95. Рівень інгібування або конкуренції може бути різним у залежності від того, яке антитіло являє собою "блокуюче антитіло" (тобто "холодне" антитіло, яке першим інкубують з мішенню). Аналізи в умовах конкуренції можна проводити відповідно до методів, описаних, наприклад, в (Соїа 5ргіпд Нагь Ргоїос; під ред. Нагіоу» і Оаміа І апе, 2006; адої: 10.1101/раб.ргої4277 або у главі 11 "Овіпуд Апііїбодієв" під ред. Нагіом/ і Оамід Гапе, вид-во Соїд

Зргіпд Натог І арогаїгу Ргев55, СоЇїд 5ргіпд Нагброг, МУ, О5А, 1999). Два антитіла "перехресно конкурують один з одним", якщо антитіла взаємно блокують одне одного принаймні на 50 95, тобто безвідносно до того, яке з двох антитіл першим приводять у контакт з антигеном при проведенні аналізу в умовах конкуренції.

У контексті даного опису поняття "специфічне зв'язування", "вибіркове зв'язування", «вибірково зв'язується" і "специфічно зв'язується" стосуються зв'язування антитіла з епітопом на заздалегідь визначеному антигені. Як правило, зв'язування антитіла характеризується (І) константою рівноваги реакції дисоціації (Кс), яка становить менше ніж приблизно 10-7М, наприклад, менше ніж приблизно 109М, 109М або 10-79М або навіть ще менше, при її визначенні, наприклад, із застосуванням технології поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) за допомогою пристрою ВІАСОКЕ? 2000 з використанням заздалегідь визначеного антигену, наприклад, рекомбінантного людського ТКЕМ-1, як аналіту і антитіла як ліганда, або аналізу зв'язування антитіла з позитивними за антигеном клітинами за методом

Скетчарда, і (ІІ) афінністю зв'язування із заздалегідь визначеним антигеном, що принаймні вдвічі більше його афінності зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, БСА, казеїном), відмінним від заздалегідь визначеного антигену або близькоспорідненого антигену.

Таким чином, антитіло, яке "специфічно зв'язується з лодським ТКЕМ-1", являє собою антитіло, зв'язування якого з розчинним або зв'язаним з клітиною людським ТКЕМ-1 характеризується величиною Ко, яка становить 107М або менше, наприклад, менше ніж приблизно 1029М, 109М або 1079М або навіть ще менше. Антитіло, яке "дає перехресну реакцію з ТЕЕМ-1 мавп циномолгус", стосується антитіла, зв'язування якого з ТКЕМ-1ї мавп циномолгус характеризується величиною Ко, яка становить 107М або менше, наприклад, менше ніж приблизно 109М, 109М або 1079М або навіть ще менше. У деяких варіантах здійснення винаходу такі антитіла, які не дають перехресну реакцію з ТКЕМ-1 з видів крім людини, характеризуються рівнем зв'язування з зазначеними білками, що практично не виявляється, за даними стандартного аналізу зв'язування.

У контексті даного опису поняття "специфічність зв'язування" стосується взаємодії молекули, такої як антитіло або його фрагмент, з одним єдиним антигеном або з обмеженою кількістю високогомологічних антигенів (або епітопів). | навпаки, антитіла, які мають здатність специфічно зв'язуватися з ТКЕМ-Ї, не мають здатності зв'язуватися з несхожими з ним молекулами. Антитіла, пропоновані у винаході, можуть не мати здатність зв'язуватися з МКр44, білком, спорідненим р44 природних клітин-кілерів.

Специфічність взаємодії і величину константи рівноваги реакції зв'язування можна визначати безпосередньо за допомогою добре відомих методів. Стандартні аналізи для оцінки здатності лігандів (таких як антитіла) зв'язуватися з їх мішенями відомі в даній галузі і включають, наприклад, ЕГІ5А, вестерн-блоттинг, РІА і аналіз методом проточної цитометрії.

Кінетичні характеристики зв'язування і афінність зв'язування антитіла також можна оцінювати за допомогою стандартних аналізів, відомих в даній галузі, таких як 5РЕ.

Аналізи зв'язування в умовах конкуренції для визначення того, чи конкурують або перехресно конкурують два антитіла за зв'язування, включають: аналіз конкуренції за зв'язування з мієлоїдними клітинами, які експресують ТКЕМ-1, наприклад, за допомогою методу проточної цитометрії, такого як описаний в розділі "Приклади". Інші методи включають: ЗРК (наприклад, ВІАСОКЕЗЯ), твердофазний прямий або непрямий радіоіїмуноаналіз (РІА), твердофазний прямий чи непрямий імуноферментний аналіз (ЕІА), конкурентний сендвіч-аналіз бо Їдив. еїанії та ін., Меїйо4й5 іп Еп7лутоіоду 9, 1983, с. 242); твердофазний прямий ЕЇїА з використанням взаємодії біотин-авідин див. КігкІапа та ін., У. Іттипої. 137, 1986, с. 3614); твердофазний прямий аналіз із застосуванням міченої сполуки, твердофазний прямий сендвіч- аналіз із застосуванням міченої сполуки див. Напом і ІГапе, Апіїродіеєв: А Габрогаїгу Мапцпаї, вид-во СоЇїй ргіпд Нагрог Ргез5, 1988); твердофазний прямий КІА із застосуванням міченої сполуки з використанням мітки 1-125 |див. Моге! та ін., Мої. Іттипої. 25(1), 1988, с. 7; твердофазний прямий ЕЇА з використанням взаємодії біотин-авідин (Спешпод та ін., Мігоїоду 176, 1990, с. 546); і прямий КІА з використанням міченої сполуки МоІдеппацег та ін., Зсапа. ..

Іттипої). 32, 1990, с. 77.

У контексті даного опису поняття "група" визначено по відношенню до референс-антитіла.

Якщо друге антитіло не може зв'язуватися з антигеном одночасно з референс-антитілом, то вважається, що друге антитіло входить в ту ж саму "групу", що і референс-антитіло. В цьому випадку референс-антитіло і друге антитіло зв'язуються з однією і тією ж частиною антигену і їх позначають як "конкуруючі антитіла". Якщо друге антитіло здатне зв'язуватися з антигеном одночасно з референс-антитілом, то вважається, що друге антитіло входить в іншу "групу". В цьому випадку референс-антитіло і друге антитіло не конкурують за зв'язування з однією і тією ж частиною антигену і їх позначають як "неконкуруючі антитіла".

Групування антитіл не дає прямої інформації про епітоп. Для конкуруючих антитіл, тобто антитіл, що входять в одну і ту ж "групу", епітопи можуть являти собою ідентичні епітопи, епітопи, які перекриваються, або навіть різні епітопи. Останнє має місце в тому випадку, коли референс-антитіло, зв'язане зі своїм епітопом на антигені, займає простір, який потрібен для того, щоб наступне антитіло могло вступити в контакт зі своїм епітопом на антигені ("стерична перешкода"). Неконкуруючі антитіла, як правило, мають різні епітопи.

У контексті даного опису поняття "афінність зв'язування" стосується вимірювання сили нековалентної взаємодії двох молекул, наприклад, антитіла або його фрагмента і антигену.

Поняття "афінність зв'язування" застосовують для опису одновалентних взаємодій (активності, внутрішньо властивої молекулам).

Афінність зв'язування двох молекул, наприклад, антитіла або його фрагмента і антигену, обумовлену одновалентною взаємодією, можна кількісно оцінювати шляхом визначення константи рівноваги реакції дисоціації (Кс). В свою чергу, Ко можна визначати шляхом вимірювання кінетичних характеристик процесу формування та дисоціації комплексу, наприклад, за допомогою методу ЗРК. Константи швидкості, відповідні асоціації та дисоціації одновалентного комплексу, позначають як константа швидкості реакції асоціації Ка (або Ког) і константа швидкості реакції дисоціації Ка (або Кої) відповідно. Ко зв'язана з Ка і Ка рівнянням

Ко-Ка/Ка. Відповідно до зазначеного вище визначення при порівнянні афінностей зв'язування різних антитіл з даним антигеном афінності зв'язування, асоційовані з різними молекулярними взаємодіями, можна порівнювати, наприклад, шляхом порівняння величин Ко для індивідуальних комплексів антитіло/антиген.

У контексті даного опису поняття "висока афінність" щодо антигену-мішені для антитіла у вигляді ЇДО стосується антитіла, що має величину Ко, яка становить 109М або менше, 109М або менше або 1079М або менше. Однак "висока афінність" зв'язування може відрізнятися від вказаного рівня для інших ізотипів антитіла. Наприклад, "висока афінність" зв'язування для ізотипу ІДМ стосується антитіла, що має величину Ко, яка становить 1079М або менше або 109М або менше.

Поняття "ЕСво в контексті аналізу іп мійго або іп мімо з використанням антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента стосується концентрації антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що індукує відповідь, що становить 50 95 від максимальної відповіді на терапію, тобто знаходиться посередині між максимальною відповіддю і вихідним рівнем.

У контексті даного опису поняття "що зустрічається в природних умовах", яке застосовується до об'єкта, відображає той факт, що об'єкт може бути присутнім в природі.

Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, яка присутня в організмі (включаючи віруси), яка може бути виділена з природного джерела і яка не модифікована навмисно людиною в лабораторії, являє собою послідовність, що зустрічається в природних умовах.

Поняття "поліпептид" стосується ланцюга, який містить принаймні два послідовно зчеплених амінокислотних залишка, при цьому не існує обмеження на верхню межу довжини ланцюга.

Один або декілька амінокислотних залишків у білку можуть містити модифікацію, таку як (але не обмежуючись тільки ними) глікозилювання, фосфорилювання або формування дисульфідного зв'язку. "Білок" може містити один або декілька поліпептидів.

У контексті даного опису поняття "молекула нуклеїнової кислоти" включає молекули ДНК і бо молекули РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою,

і вона може являти собою кДНК. "Консервативні амінокислотні заміни" стосуються замін амінокислотного залишку на амінокислотний залишок, який має подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, які мають подібні бічні ланцюги, визначені в даній галузі. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). У деяких варіантах здійснення винаходу заздалегідь визначений залишок замінної амінокислоти в антитілі до ТКЕМ-1 замінюють на інший амінокислотний залишок з того ж самого сімейства бічних ланцюгів. Методи ідентифікації консервативних нуклеотидних і амінокислотних замін, які не усувають зв'язування з антигеном, добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Вгитіпеї!Ї та ін., Віоспет. 32, 1993, сс. 1180-1187; Кобрауабвні та ін., Ргоївіп Епд. 12(10), 1999, сс. 879-884; і ВигкК5 та ін., Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 94, 1997, сс. 412-417).

Щодо нуклеїнових кислот поняття "істотна гомологія" означає, що в двох нуклеїнових кислотах або послідовностях, які їх визначають, при оптимальному вирівнюванні і порівнянні з урахуванням відповідних інсерцій або делецій нуклеотидів принаймні приблизно 80 905 нуклеотидів, принаймні приблизно від 90 до 95 95 або приблизно від 98 до 99,5 95 нуклеотидів є ідентичними. Альтернативно до цього істотна гомологія має місце в тому випадку, коли сегменти гибрідизуються в умовах селективної гібридизації з комплементом ланцюга.

Щодо поліпептидів поняття "істотна гомологія" означає, що в двох поліпептидах або послідовностях, які їх визначають, при оптимальному вирівнюванні і порівнянні з урахуванням відповідних інсерцій або делецій амінокислот принаймні приблизно 8095 нуклеотидів, принаймні приблизно від 90 до 95 95 або приблизно від 98 до 99,5 95 амінокислот є ідентичними.

Відсоток ідентичності двох послідовностей є функцією кількості ідентичних положень, наявних в послідовності (тобто, 95 гомології - кількість ідентичних положень/загальна кількість положень х 100), з урахуванням кількості "проломів" і довжини кожного "пролому", які потрібно інтродуціювати для здійснення оптимального вирівнювання двох послідовностей. Порівняння послідовностей та визначення відсотка ідентичності двох послідовностей можна здійснювати з використанням математичного алгоритму, як описано нижче в прикладах, що не обмежують обсяг винаходу.

Відсоток ідентичності двох нуклеотидних послідовностей можна визначати з використанням програми САР, що входить в пакет програм СО (доступна на сайті в мережі інтернет мжебр.дсд.сот), з використанням матриці ММ/5дарапа.СМР і маси "пролому" 40, 50, 60, 70 або 80 і маси довжини 1, 2, 3, 4, 5 або 6. Відсоток ідентичності двох нуклеотидних або амінокислотних послідовностей можна визначати також з використанням (алгоритму Е. Меуегз і МУ. МіІШег (САВІО5Б, 4, 1989, сс. 11-17)), який включений в програму АГІСМ (версія 2.0), використовуючи таблицю маси залишків, штраф за довжину "пролому" 12 і штрафу за "пролом" 4. Крім того, відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати з використанням алгоритму ІМееаієтап і МУйпесй (9. Мої. Віої. (48), 1970, сс. 444-453), який включений в програму САР, яка входить в пакет програм СО |доступна на сайті в мережі інтернет мжебр.дсд.соті, з використанням або матриці Віоззит 62, або матриці РАМ250О і маси пролому 16, 14, 12,10, 8, 6 або 4 і маси довжини 1, 2, 3, 4, 5 або 6.

Нуклеотидні і білкові послідовності, представлені в даному описі, можна застосовувати також як "запитувану послідовність" для здійснення пошуку в публічних базах даних, наприклад, для ідентифікації споріднених послідовностей. Такі пошуки можна здійснювати з використанням програм МВГАБТ і ХВІ А5Т (версія 2.0), (описаних у АйївБепиї та ін. 9. Мої. Віої. 215, 1990, сс. 403- 410). Пошуки нуклеотидних послідовностей за допомогою алгоритму ВІ А5Т можна здійснювати з використанням програми МВІ А5Т, бал - 100, довжина слова - 12 з одержанням нуклеотидних послідовностей, гомологічних молекулам нуклеїнової кислоти, представленим в даному описі.

Пошуки білкових послідовностей за допомогою алгоритму ВІАбБТ можна здійснювати з використанням програми ХВІ А5Т, бал - 50, довжина слова - З з одержанням амінокислотних послідовностей, гомологічних молекулам білків, представленим в даному описі. Для здійснення вирівнювань з використанням проломів для цілей порівняння можна застосовувати програму

Сарреа ВІ А5Т згідно з процедурою, описаною у |Аї5спиЇ та ін., Мисіевїс Асіаз Кез. 25(17), 1997, сс. 3389-3402. При застосуванні програм ВГ АЗТ і Саррей ВГА5Т можна використовувати задані за умовчанням параметри відповідних програм (наприклад, ХВІАБТ і МВГА5Т) (див. бо могпамідемжеб.псбрі.піт.пій.дом|.

Нуклеїнові кислоти можуть бути присутніми в цільних клітинах, в клітинному лізаті або в частково очищеній або практично очищеній формі. Нуклеїнова кислота є "виділеною" або розглядається як "практично чиста", якщо вона очищена від інших клітинних компонентів або інших домішок, наприклад, від інших присутніх в клітині нуклеїнових кислот (наприклад, від інших частин хромосоми) або білків, за допомогою стандартних методів, включаючи обробку лугом/ДСН, СвСіІ-бендінг (розділення в С5СІ), хроматографію на колонках, електрофорез в агарозному гелі та інші добре відомі в даній галузі методи |див. Сиггепі Ргоїосої5 іп МоїЇІесціаг

Віоіоду, під ред. ЕР. А!йзибеї та ін., вид-во Сгеепе Рибіїзпіпд апа Уміеу Іпіегзсіепсе, Мем/ Хогк, 1987).

Нуклеїнові кислоти, наприклад, КДНК, можна піддавати мутації відповідно до стандартних методів для одержання генних послідовностей. У випадку кодуючих послідовностей зазначені мутації можуть впливати на амінокислотну послідовність, якщо це потрібно. Зокрема, можна розглядати послідовності ДНК, практично гомологічні або які мають походження з нативних сегментів генів М, О, У, константних послідовностей, перемикачів та інших аналогічних послідовностей, представлених в даному описі (де поняття "що має походження" означає, що послідовність ідентична іншій послідовності або одержана з неї шляхом модифікації).

У контексті даного опису поняття "вектор" означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка здатна транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зчеплена. Одним з типів вектора є "плазміда", це поняття стосується петлі кільцевої дволанцюгової ДНК, в яку можна вбудовувати за допомогою лігування додаткові ДНК-сегменти. Іншим типом вектора є вірусний вектор, в цьому випадку додаткові ДНК-сегменти можна вбудовувати шляхом лігування в вірусний геном.

Деякі вектори здатні автономно реплікуватися в клітині-хазяїні в яку вони інтродуковані (наприклад, бактеріальні вектори, які мають бактеріальний сайт ініціації реплікації, і епісомальні вектори для клітин ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомальні вектори для клітин ссавців) можна інтегрувати в геном клітини-хазяїна шляхом інтродукції в клітину-хазяїна, де відбувається їх реплікація поряд з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори мають здатність направляти експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори в контексті даного опису означають як "рекомбінантні експресійні вектори" (або просто "експресійні вектори"). В цілому, експресійні вектори, які застосовуються в методах рекомбінантних ДНК, часто знаходяться в формі плазмід. У даному описі поняття "плазміда" і "вектор" можна застосовувати як взаємозамінні, оскільки плазміда являє собою найбільш широко застосовувану форму вектора.

Однак поняття включає також і інші форми експресійних векторів, такі як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси з дефективною реплікацією), які виконують еквівалентні функції.

У контексті даного опису поняття "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина- хазяїн") призначене для позначення клітини, яка містить нуклеїнову кислоту, не присутню в природних умовах в клітині, і вона може являти собою клітину, в яку інтродукований рекомбінантний експресійний вектор. Слід розуміти, що такі поняття стосуються не тільки конкретної розглянутої клітини, але також і потомства такої клітини. Оскільки в наступних поколіннях можуть виникати певні модифікації або внаслідок мутацій, або обумовлені впливом навколишнього середовища, то таке потомство фактично не може бути ідентичним батьківській клітині, але воно все ще підпадає під обсяг поняття "клітина-хазяїн", яке застосовується в даному описі.

У контексті даного опису поняття "зчеплений" ("зв'язаний") стосується асоціації двох або більшої кількості молекул. Зв'язок може бути ковалентним або нековалентним. Зв'язок може бути також обумовлений генетичними причинами (тобто, одержаний шляхом рекомбінантного злиття). Такі зв'язки можна створювати за допомогою широкої різноманітності прийнятих в даній галузі методів, таких як хімічна кон'югація і одержання білку шляхом рекомбінації.

У контексті даного опису поняття "введення" стосується фізичної інтродукції композиції, яка містить терапевтичний агент, в організм індивідуума за допомогою будь-яких різних методів і систем доставки, відомих спеціалістам в даній галузі. Різні шляхи введення антитіла до ТКЕМ- 1, представленого в даному описі, включають внутрішньовенний, внутрішньочеревний, внутрішньом'язовий, підшкірний, спинальний або інші парентеральні шляхи введення, наприклад, введення шляхом ін'єкції або інфузії. Поняття "парентеральне введення" в контексті даного опису означає шляхи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, як правило, шляхом ін'єкції, і включає (але не обмежуючись тільки ними) внутрішньовенну, внутрішньочеревну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, внутрішньооболонкову, внутрішньолімфатичну, всередину пошкодження, інтракапсулярну, внутрішньоочну, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, транстрахеальну, підшкірну, субкутікулярну, бо внутрішньосуглобову, субкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, епідуральну і інтрастернальну ін'єкцію і інфузію, а також електропорацію іп мімо. Альтернативно до цього антитіло, представлене в даному описі, можна вводити непарентеральним шляхом, таким як місцеве введення, епідермальний шлях введення або введення через слизову оболонку, наприклад, інтраназально, орально, вагінально, ректально, під'язиково або місцево. Введення можна здійснювати, наприклад, також одноразово, декілька разів і/або протягом одного або декількох тривалих періодів часу.

У контексті даного опису поняття "інгібує" або "блокує" (наприклад, стосовно інгібування/блокування зв'язування ліганда ТКЕМ-1 з ТКЕМ-1 на клітинах) використовують як взаємозамінні і вони включають як часткове, так і повне інгібування/олокування. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 інгібує зв'язування ліганда для ТКЕМ-1 з

ТКЕМ-Ї1 принаймні приблизно на 50 95, наприклад, приблизно на 60, 70, 80, 90, 95, 99 або 100 95 за даними оцінки згідно з поданими далі в даному описі методами. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 інгібує зв'язування ліганда для ТКЕМ-1 з ТКЕМ-1 не більше ніж на 50 95, наприклад, приблизно на 40, 30, 20, 10, 5 або 1 95 за даними оцінки згідно з поданими далі в даному описі методами.

Поняття "лікувати", "лікування" і "обробка" в контексті даного опису стосуються будь-якого типу втручання або процесу, що здійснюється в відношенні індивідуума, або введення йому діючої речовини з метою реверсування, полегшення, ослаблення, інгібування або уповільнення, або попередження прогресування, розвитку, серйозності або рецидиву симптому, ускладнення, стану або біохімічного показника, асоційованого із захворюванням, або підвищення загального виживання. Можна здійснювати лікування індивідуума, що має захворювання, або індивідуума, що не має захворювання (наприклад, для профілактики).

Поняття "ефективна доза" або "ефективне дозування" означає кількість, достатню для досягнення або принаймні часткового досягнення необхідної дії. "Терапевтично ефективна кількість" або "терапевтично ефективна доза" лікарського засобу або терапевтичного агента являє собою кількість лікарського засобу, яка при його застосуванні окремо або в комбінації з іншим терапевтичним агентом підсилює регрес захворювання, що проявляється в зниженні серйозності симптомів захворювання, збільшенні частоти і тривалості безсимптомних періодів захворювання або запобігання погіршення або непрацездатності внаслідок ураження захворюванням. Терапевтично ефективна кількість або доза лікарського засобу включає "профілактично ефективну кількість" або "профілактично ефективну дозу", яка являє собою будь-яку кількість лікарського засобу, яка, при введенні окремо або в комбінації з іншим терапевтичним агентом індивідууму, який має ризик розвитку захворювання або страждає на рецидив захворювання, інгібує розвиток або рецидив захворювання. Здатність терапевтичного агента посилювати регрес захворювання або інгібувати розвиток або рецидив захворювання, можна оцінювати за допомогою різних методів, відомих практикуючому спеціалісту, наприклад, в процесі клінічних випробувань на людях, за допомогою систем з використанням тваринних моделей, які дозволяють прогнозувати ефективність щодо людини, або шляхом аналізу активності агента в аналізах іп міїго.

Поняття "пацієнт" включає людину та інших ссавців, яких піддають профілактичному або терапевтичному лікуванню.

У контексті даного опису поняття "індивідуум" включає будь-яку людину або тварину крім людини. Наприклад, способи і композиції, представлені в даному описі, можна застосовувати для лікування індивідуума, який має рак. Поняття "тварина крім людини" включає всіх хребетних, наприклад, ссавців і не ссавців, таких як примати крім людини, вівці, собаки, корови, кури, амфібії, рептилії і т.д.

У контексті даного опису поняття "мікрограм"' і "мікромоль" використовуються як взаємозамінні з поняттями "мкг" і "МКМ" відповідно.

У наведених нижче підрозділах різні аспекти винаходу, представлені в даному описі, описані більш детально.

І. Антитіла до ТКЕМ-1

У даному описі представлені антитіла, наприклад, повністю людські антитіла, які мають конкретні функціональні характеристики або властивості. Наприклад, антитіла, представлені в даному описі, специфічно зв'язуються з людським ТКЕМ-1 і більш конкретно з певним доменом (наприклад, функціональним доменом) в позаклітинному домені людського ТКЕМ-1. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла специфічно зв'язуються з сайтом на ТКЕМ-1, з яким зв'язується ліганд для ТКЕМ-1 (наприклад, РОЇ УКР). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла являють собою антагоністичні антитіла, тобто вони інгібують або пригнічують активність ТКЕМ-1 (тобто не мають агоністичної активності при зв'язуванні) на клітинах, бо наприклад, моноцитах, макрофагах і нейтрофілах. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 дають перехресну реакцію з ТКЕМ-1 з одного або декількох приматів крім людини, таких як ТКЕМ-1 мавп циномолгус. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 блокують продукування прозапальних цитокінів (наприклад, ІІ -6, ТМЕ-а, 1-8, І -1р,

І--12 ї їх комбінацій) клітинами (наприклад, макрофагами, дендритними клітинами, нейтрофілами) після активації. В інших варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 містять Ес-ділянки, що не зв'язуються з одним або декількома Есук. У наступних варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 не індукують вивільнення прозапальних цитокінів мієлоїдними клітинами (наприклад, дендритними клітинами) і тим самим зменшують цитокіновий шторм або попереджують його наступ після введення антитіла до ТКЕМ-1 індивідууму, який цього потребує.

У деяких варіантах здійснення винаходу конкретні антитіла до ТКЕМ-1, зазначені в даному описі, являють собою антитіла, наприклад, моноклональні, рекомбінантні і/або людські антитіла, які перехресно конкурують з тАБ 0318 за зв'язування з люодським ТКЕМ-1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 перехресно конкурують також з тАр 0318 за зв'язування з ТКЕМ-1 мавп циномолгус. Іншими словами, антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, в конкретних варіантах здійснення винаходу входять в ту ж саму "групу", що і тАБ 0318.

Антитіло тАБб 0318 має варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), яка містить 5ЕО ІЮ МО: 14, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), яка містить 5ЕО ІЮО МО: 15 (див. публікацію міжнародної заявки на (патент 2016/009086). тА 0318 має також СОКІ, СОК2 ії СОКЗ важкого ланцюга, які відповідають амінокислотам 31-35, 50-68 ії 101-110 5ЕО ІЮО МО: 14 відповідно.

СОК1, СОК2 ії СОКЗ легкого ланцюга антитіла тА 0318 відповідають амінокислотам 24-38, 54- 60 ї 93-101 БЕО ІЮО МО: 15.

Отже, у деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, містить МН і МІ, які мають 5ЕО ІЮ МО: 14 ії 5ЕО ІО МО: 15 відповідно. В іншому варіанті здійснення винаходу МН антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОКІ, яка складається з амінокислот 31-35 (ТМАМН) ЗЕО ІО МО: 14, в якій одна з амінокислот може бути замінена на іншу амінокислоту. У конкретних варіантах здійснення винаходу УН антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОК2, яка складається з амінокислот 50-68 (КІКТК55МУАТУУААБМКО) ЗЕО ІЮ

МО: 14, в якій одна, дві або три амінокислоти можуть бути замінені на іншу амінокислоту. У деяких варіантах здійснення винаходу МН антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОКЗ, яка складається з амінокислот 101-410 (ОМСІККОРАХМ) 5ЕО ІЮО МО: 14, в якій одна, дві або три амінокислоти можуть бути замінені на іншу амінокислоту.

У деяких варіантах здійснення винаходу МІ антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність

СОКТ, яка складається з амінокислот 24-38 (ОО5МООРУТ) 5ЕО ІО МО: 15, в якій одна, дві або три амінокислоти можуть бути замінені на іншу амінокислоту. В інших варіантах здійснення винаходу Мі антитіло до ТКЕМ-1 містить послідовність СОК2, яка складається з амінокислот 54-60 (КАБЗМІ Е5) ЗЕО ІО МО: 15, в якій одна або дві амінокислоти можуть бути замінені на іншу амінокислоту. У деяких варіантах здійснення винаходу Мі антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОКЗ, яка складається з амінокислот 93-101 (ФО5МООРУТ) ЗЕО ІЮО МО: 15, в якій одна або дві амінокислоти можуть бути замінені на іншу амінокислоту.

Залишки метіоніну в СОК антитіл можуть окиснюватися, що приводить до можливого хімічного розщеплення та подальшого зниження ефективності антитіла. Отже, в антитілах до

ТКЕМ-Ї1, представлених в даному описі, один або декілька залишків метіоніну в СОК важкого іабо легкого ланцюга можуть бути замінені амінокислотними залишками, що не зазнають окиснювального розщеплення. У деяких варіантах здійснення винаходу залишки метіоніну в

СОКІ ї СОКЗ важкого ланцюга замінюють на амінокислотні залишки, що не зазнають окиснювального розщеплення (наприклад, на глютамін або лейцин). Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу МН антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОКЗ, яка складається з амінокислот 101-110 (ПОСІККОРАМ) 5ЕО ІО МО: 81 або амінокислот 101-110 (ОГОІККОГАХ) 5ЕО ІО МО: 82. В інших варіантах здійснення винаходу МН антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОК'І, яка складається з амінокислот 31-35 (ТМАОН) 5ЕО ІО МО: 83 або амінокислот 31-35 (ТУАГ-Н) 5ЕО ІО МО: 84. Так само у деяких варіантах здійснення винаходу з антитіла до ТКЕМ-1, перш за все з СОК, можуть бути видалені сайти дезамінування.

У деяких варіантах здійснення винаходу МН і Мі. антитіла до ТКЕМ-1 містять послідовності

МН ії Мі. антитіла до ТКЕМ-1, описані в публікації міжнародної заявки на патент (МО 2017/152102 АЗІ, повний вміст якої включений в даний опис як посилання. У деяких варіантах здійснення винаходу МІ. антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОКІ1, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО І МО: 9-27, представлених в МО 2017/1521021, послідовність СОК2, бо вибрану з групи, яка складається з 5БЕО ІЮО МО: 28-40, представлених в І2017/1521021, і/або послідовність СОКЗ, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 41-119, представлених в

ІММО 2017/152102). В одному з варіантів здійснення винаходу УН антитіла до ТКЕМ-1 містить послідовність СОКІ, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 120-143, представлених в

МО 2017/1521021, послідовність СОК2, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 144-172, представлених в (МО 2017/1521021, іл або послідовність СОКЗ, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІО МО: 173-247, представлених в ММО 2017/1521021.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, містять послідовності СОК і/або варіабельних ділянок, ідентичні принаймні на 80 95 (наприклад, ідентичні принаймні на 85 95, принаймні на 95 95, принаймні на 95 95, або принаймні на 99 95) послідовностей СОК і/або варіабельних ділянок антитіла тАб 0318.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (УН) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), які містять 5ЕО ІЮО МО: 14 і

ЗЕО ІО МО: 15 відповідно. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 містять важкий ланцюг (НС) і легкий ланцюг (ІС), де НС містить зЗЕО ІЮ МО: 50, 5ЕО ІЮО МО: 51, 5ЕО І

МО: 52 або 5ЕО ІЮО МО: 53. У деяких варіантах здійснення винаходу І С містить зЕО ІЮО МО: 54.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (УН), вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ

МО: 396-475, представлених в МО 2017/1521021, і/або варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 316-395, представлених в (МО 2017/1521021.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг і легкий ланцюг містять амінокислотні послідовності, представлені в таблиці 7. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло до ТКЕМ-1 містить важкий ланцюгі легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ

МО: 50, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІО МО: 54. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 51, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 54. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 52, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІО МО: 54. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІО МО: 53, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 54.

Важкі і легкі ланцюги, які містять амінокислотну послідовність, яка принаймні на 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 або 80 95 ідентична будь-якому з важких і легких ланцюгів, представлених в даному описі, наприклад, в ЗЕО ІЮО МО: 50-54, можна застосовувати для створення антитіл до

ТКЕМ-Ї1, що мають необхідні характеристики, наприклад, такі, які представлені нижче в даному описі.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, ідентичну принаймні на 80 95, принаймні на 85 95, принаймні на 90 95, принаймні на 95 95, принаймні на 96 95, принаймні на 97 95, принаймні на 9895, принаймні на 99 або 100 95 амінокислотній послідовності, представленій в 5ХЕО ІО МО: 50, 51, 52 або 53, і де легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, ідентичну принаймні на 80 принаймні на 85 95, принаймні на 9095, принаймні на 9595, принаймні на 96 95, принаймні на 97 95, принаймні на 98 95, принаймні на 99 або 100 95 амінокислотній послідовності, представленій в ХЕО ІЮ МО: 54.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ'І містить константну ділянку важкого ланцюга, де константна ділянка важкого ланцюга містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К, 1234А, 1235Е, 5237А, ЮЗ356Е,

ЇЗ358М і будь-якої їх комбінації (ЕО-нумерація). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить константну ділянку важкого ланцюга, де константна ділянка важкого ланцюга містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К,

Ї234А, І235Е, 5237А, АЗ3305, РЗ3315, ЮЗ56Е, І 358М і будь-якої їх комбінації (ЕО-нумерація). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить константну ділянку важкого ланцюга, де константна ділянка важкого ланцюга містить одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К, С2265, С2295, Р2385 і будь-якої їх комбінації (ЕО-нумерація). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить константну ділянку важкого ланцюга, де константна ділянка важкого ланцюга містить одну або бо декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з 5131С, К1ІЗЗ3К, С137Е,

1385, 0О196К, 11997, М2030, К214К, 02265, 02295, Р2385 і будь-якої їх комбінації (ЕО- нумерація).

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність зв'язуватися з варіантами людського ТКЕМ-1 (наприклад, ізоформами 2 і 3 ТКЕМ-1, ЗЕО ІЮО МО: 2 і ЗЕО ІЮ

МО: З відповідно) за даними оцінки, наприклад, методом поверхневого плазмонного резонансу.

В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність зв'язуватися з ТКЕМ- 1 мавп циномолгус (5ЕО ІЮ МО: 7) за даними оцінки, наприклад, методом поверхневого плазмонного резонансу.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, зв'язуються з людським ТКЕМ-1 з високою афінністю, наприклад, що характеризується величиною Ко, яка становить за даними оцінки за допомогою Віасоге"Мм (наприклад, згідно з методом, описаним в розділі "Приклади") 107М або менше, 109М або менше, 109М (ІНМ) або менше, 10-9М або менше, 10-7М або менше, 10-2М або менше, від 10-2М до 10-М, від 10-7М до 10-М, від 1079М до 10-7М або від 109М до 10-7М. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, зв'язуються з ТКЕМ-1 мавп циномолгус (супо), наприклад, з величиною Ко, яка становить за даними оцінки за допомогою Віасоге"м (наприклад, згідно з методом, описаним в розділі "Приклади") 1077М або менше, 109М або менше, 109М або менше, 1079М або менше, 107"М або менше, 10-2М або менше, від "М до 10- 7М, від 10-7М до 10-М, від 1079М до 10-7М або від 109М до 10-М.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла, представлені в даному описі, зв'язуються з тим же самим одним або тими ж самими декількома епітопами на ТКЕМ-1, що і антитіло тАБ 0318. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність специфічно зв'язуватися з (І) принаймні одним амінокислотним залишком, вибраним з групи, яка складається з А21, Т22, К23, 124, Т25, Е26б і будь-якої їх комбінації, і (ІЇ) принаймні одним амінокислотним залишком, вибраним з групи, яка складається з А49, 550, 551, 052, К53, А5Б4,

МУ55, 956, 157, 158, 59, 060, 561, Еб62, М63, Рб4, Кб5, 166, 167, Аб8, С69, 170, Е71, 272, Р7З, 574, К75, М76, 577, Н78, Р79У, М80, 081, М82, 583, К84, 185 і будь-якої їх комбінації, і (1) принаймні одним амінокислотним залишком, вибраним з групи, яка складається з С113, М114, 1115, м116, 0117, Р118, Р119 і будь-якої їх комбінації, людського ТКЕМ-1 (наприклад, ізоформи 1, ЗЕО ІО МО: 1) |див. МО 2016/0090861.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність специфічно зв'язуватися з амінокислотами з ЮЗ8 по Е48 із БЕО ІО МО: 1 (людський ТКЕМ-1) за даними аналізу, наприклад, методом НХ-МС або дифракції в рентгенівських променях. У деяких варіантах здійснення винаходу епітоп для антитіла до ТКЕМ-1 містить один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім або всі з амінокислотних залишків 038, 39, К40, СА1, 042, у43, Т44 і 1 45 із 5ЕО ІО МО: 1 (людський ТКЕМ-1) і один, два або всі з амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з Е46б, К47 і Е48 із БЕО ІЮО МО: 1 (людський ТКЕМ-1), за даними аналізу за допомогою, наприклад, НХ-МС або дифракції в рентгенівських променях. У конкретних варіантах здійснення винаходу епітоп для антитіла до ТКЕМ-1 містить один, два, три або всі з амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з 042, Е46, 092 НОЗ із БЕО ІО МО: 1 (людський ТКЕМ-1), за даними аналізу з використанням варіантів ТКЕМ-1 і методу поверхневого плазмонного резонансу.

В одному з варіантів здійснення винаходу епітоп для антитіла до ТКЕМ-1, представленого в даному описі, містить принаймні амінокислотні залишки Е4б і/або 092 із 5ЕБЕО ІЮО МО: 1 (людський ТКЕМ-1) за даними аналізу з використанням варіантів ТКЕМ-1 і методу поверхневого плазмонного резонансу. В іншому варіанті здійснення винаходу епітоп для антитіла до ТКЕМ-1 містить один, два або всі з амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з І 31, 186 ії М101 із БЕБЕО ІЮО МО: 1 (людський ТКЕМ-1). У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність специфічно зв'язуватися з поліпептидом, який містить амінокислотні залишки з Е19 по 126 з ТКЕМ-1 мавп циномолгус (ЗЕО ІО МО: 7), за даними аналізу, наприклад, методом НХ-МС або дифракції в рентгенівських променях.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність специфічно зв'язуватися з людським ТКЕМ-1, де епітоп для антитіла містить один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або всі з амінокислотних залишків, вибраних з групи, яка складається з

М39, К40, С41, 042, У43, 145, Е4А6, К47, Г48 і А49 із БЕО ІЮО МО: 1.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність специфічно зв'язуватися з людським ТКЕМ-1, де епітоп для антитіла містить 042 із ФЕО ІО МО: 1. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має здатність специфічно зв'язуватися з бо людським ТКЕМ-1, де епітоп для антитіла містить Е4б із БЕО ІО МО: 1. У деяких варіантах здійснення винаходу епітоп для антитіла може містити У39, С41, 042, у43,145 із БЕО ІО МО: 1.

У наступних варіантах здійснення винаходу епітоп для антитіла може містити Е46, К47 і А49 із

ЗЕО ІЮО МО: 1. У конкретному варіанті здійснення винаходу епітоп для антитіла до ТКЕМ-1 може додатково містити Е48 із БЕО ІО МО: 1.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має профіль в'язкості, подібний до профілю в'язкості антитіла тАБб 0318. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до

ТКЕМ-1, представлене в даному описі, має в'язкість менш ніж 5 сП, менше ніж 4 сР, менше ніж

З СП, менше ніж 2,5 сП, менше ніж 2,4 сП, менше ніж 2,3 сП, менше ніж 2,2 сП, менше ніж 2,1

СП, менше ніж 2 сП, менше ніж 1,9 сП, менше ніж 1,8 сП, менше ніж 1,7 сП, менше ніж 1,6 сп, менше ніж 1,5 сП, менше ніж 1,4 сП, менше ніж 1,3 сП, менше ніж 1,2 сП, менше ніж 1,1 сп, менше ніж 1,0 сП, менше ніж 0,9 сП, менше ніж 0,8 сП, менше ніж 0,7 сП, менше ніж 0,6 сП, менше ніж 0,5 сП, менше ніж 0,4 сП, менше ніж 0,3 сП, менше ніж 0,2 сП або менше ніж 01 сП при концентрації 80 мг/мл. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має в'язкість менше ніж 10 сП (наприклад, 9 сП) при концентрації 130 мг/мл.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, містить мутації, в результаті яких один або декілька негативно заряджених залишків в ділянках

СОКІ1 ї СОКЗ легкого ланцюга антитіла замінені на незаряджені залишки. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить заміну одного або декількох з амінокислотних залишків 01, 030, 033, 074, 098, Е?27 і Е97 із 5ЕО ІЮО МО: 15 на амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гліцину, аланіну, серину, аспарагіну, глутаміну, треоніну, цистеїну і тирозину. Ці мутації передбачені у даному описі як "які ховають заряд" мутації.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, містить мутації в ділянці взаємодії Гар-Рар, що має 5ЕО ІЮО МО: 14, для зниження димеризації

Еар-Раб. Раніше для антитіла тАб 0318 було встановлено, що, оскільки антитіла містять дві

Раб, то, мультимеризація може впливати на в'язкість. Такі мутації позначають як мутації "Рар-

Еар-взаємодії". У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 містить мутацію, яка замінює будь-який один із залишків 32, К52, 555, 556, М57, АБУ, М102, 1104 і

К106 із БЕО ІО МО: 14 або Е32, 033, 34, 53, 254 і 098 із БЕО ІЮО МО 15 на амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гліцину, аланіну, серину, аспарагіну, глутаміну, треоніну, цистеїну, лізину, аргініну, триптофану, гістидину і тирозину.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, містить мутацію в положенні 32 з зЕО ІЮО МО: 15, в результаті якої фенілаланін замінений на амінокислоту, вибрану з наступних амінокислотних залишків: гліцин, серин, треонін, цистеїн, аланін, валін, лейцин, ізолейцин і метіонін. Застосування такої мутації базується на виявленні того факту, що заміна Аа в положенні 90 із «ЕО ІО МО: 1 підвищує афінність 5ЕО ІО МО: З до

ТКЕМ-1. Було встановлено, що У90 взаємодіє з таким, що являє собою фенілаланін, залишком

ЗЕО ІО МО: 15. Мутацію 5ЕО ІО МО: 15, здійснювану для посилення взаємодії Гар-ТКЕМ-1, означають як мутація "б-ар-ТКЕМ-1-взаємодії". У даному описі представлені антитіла до ТКЕМ- 1, варіабельні ділянки яких зчеплені (наприклад, ковалентно зв'язані або злиті) з Ес, наприклад,

Ес Ідс1, Ідс2, ІДОЗ або Ідея, які можуть мати будь-який алотип або ізоалотип, наприклад, для

Іде1: б1т, б1т'і(а), 1т2(х), 51т3(О, б1т17(7); для ІДб2: 52т, б2т23(п); для ІдД03: оЗт, бЗт21(91), Зт28(95), оЗт11(60), бЗт5(61), бЗт13(63), 53т14(64), б3т10(65), сЗт15(5), б3т16(О), бЗтб(с3), сЗт24(с5), оЗт26б(и), ОЗт27(м); і для К: Кт, Кт!, Кт2, Кт3З |(див., наприклад, Здейпев та ін., тАбе 1, 2009, с. 1)Ї. У деяких варіантах здійснення винаходу варіабельні ділянки антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі, зчеплені з Ес, що не має ефекторної функції або практично не має ефекторної функції, наприклад, ДС1. У деяких варіантах здійснення винаходу варіабельні ділянки антитіл до ТКЕМ-1 зчеплені з Ес, який характеризується зниженою здатністю до зв'язування або не має здатності до зв'язування з одним або декількома Есук.

В одному з варіантів здійснення винаходу МН-домен антитіла до ТКЕМ-1, представленого в даному описі, може бути злитий з константним доменом людського ЇдО (тобто Ес), наприклад, 961, Ідс2, ІдсСЗ3 або 9054, який може зустрічатися в природних умовах або бути модифікованим, як, наприклад, додатково зазначено в даному описі. Наприклад, МН-домен може містити амінокислотну послідовність будь-якого МН-домену, представленого в даному описі, злиту з константним доменом людського ІдсС, наприклад, ЇДС1, що має амінокислотну послідовність константного домену людського Їдс1 дикого типу:

А5ТКОРЗМЕРІ АРЗ5КЗТЗОСТААГ ОСІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗОАСТЗОМНТЕРАМІ 05561 51.

З5УМТМРЗБЗЗІ СТО ТУСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇ ЇЇ СОРБЗМБІЇ ЕРРКРКОТ

І/МІБЕТРЕМТСУМУМОМЗНЕОРЕМКЕММ УМОСМЕМНМАКТКРЕЕЄО УМО ТУ ЕМ БМУІ ТМ НОВУМІ МО бо КЕУКСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРКЕРОМУТІ РРОКОЕТКМОМ5І ТС МКОЕУРЗОІАМЕУМЕЗМ

СОРЕММУКТТРРМІОБОСЗЕБІ КТ ЮОКЗКУМОООММЕЗСЗУМНЕАСНМНУТОКБІ 5І РОК (ЗЕО ІЮ МО: 9) або послідовність алотипового варіанту 5ЕО ІО МО: 9, ії має наступну амінокислотну послідовність:

З5УМТМРБЗБЗЗІ СТО ТУСМУМНКРУЬМТКМОКАеМЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЇ І ООРБМБІ ЕРРКРКОТ

Г.МІБЕТРЕМТСУММОМЗНЕОРЕМКЕММ УМОСМЕМНМАКТКРЕЕЕєОУМЗ ТЕМ ЗУСТУ НОВБВУМІ МО

КЕУКСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРКЕРОМУТІ РРЗАКЕЕМТКМОМ5І ТСІ МКОЕУРЗВПІАМЕМЕЗМ

СОРЕММУКТТРРМІОБОСЗЕБІ КТ ЮОКЗКУМОООММЕЗСЗУМНЕАСНМНУТОКБІ 5І РОК (ЗЕО ІО МО: 77; специфічні для алотипу амінокислотні залишки виділені жирним шрифтом і підкреслені).

В одному з варіантів здійснення винаходу МН-домен антитіла до ТКЕМ-1, представленого в даному описі, може містити амінокислотну послідовність будь-якого МН-домену, представленого в даному описі, злиту з константною ділянкою, що не має ефекторної функції, наприклад, з наступними амінокислотними послідовностями такого, що не має ефекторної функції, константного домену людського Ідс1:

З5УМТУРБЗББІ СТО ТУСМУМНКРЗМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕАЕСАРЗМУРБІ ЕРРКРКО

ТЕМІЗЕТРЕМТСУУМОМЗНЕОРЕМКЕМУУМОСМЕМНМАКТКРЕЕЄОЮУ МО ТЕ ММБМІ ТМ НОВУ М

СКЕУКСКМУЗМКАЇ РУЗБІЕКТІЗКАКООРКЕРОМУТІ РРІЕКЕЕМТКМОМ5І ТС МКОЕУРЗОІАМЕМЕ5

МООРЕММУКТТРРМІ О5ООЗЕБІ КОТЮК КУМОООММЕЗСЗУМНЕАСНМНУТОКЗБІ 5І РОК (ЗЕБЕО ІЮ МО: 78; "ДСс1 1, що містить заміни Г234А, І235Е, 0237А, АЗ305 і РЗ315 (БО- нумерація, зазначені заміни підкреслені) або

ТЕМІЗЕТРЕМТСУУМОМЗНЕОРЕМКЕМУУМОСМЕМНМАКТКРЕЕЄОЮУ МО ТЕМ БМ НОВУ М

СКЕУКСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРКЕРОМУТІ РРІЕАКЕЕМТКМОМ5І ТС МКОЕУРЗБОІАМЕМЕЗ

МООРЕММУКТТРРМІ О5ООЗЕБІ КОТЮК КУМОООММЕЗСЗУМНЕАСНМНУТОКЗБІ 5І РОК (ЗЕО ІО МО: 79; "Ідс1.3г, що містить заміни І234А, І235Е і 5237А (ЕО-нумерація, зазначені заміни підкреслені).

Наприклад, алотиповий варіант ЇдДС1 містить КеО7К, 0239Е і/або 1241М (підкреслені і виділені жирним шрифтом, див. вище), і їх нумерація відповідає нумерації 560 10 МО: 77-79. У повнорозмірній ділянці важкого ланцюга і відповідно до ЕО-нумерації зазначені амінокислотні заміни мають наступні номери К214К, ЮОЗ356Е І 358М. У деяких варіантах здійснення винаходу константна ділянка антитіла до ТКЕМ-1 додатково містить одну або декілька мутацій або замін амінокислот 1117, А118, 5120, А213 їі Р214 (вище підкреслені), якщо вони пронумеровані як у 5ЕО ІЮ МО: 77-79, або 1234, А235, 5237, АЗ30О і РЗЗ31 відповідно до ЕО-нумерації. У таких випадках здійснення винаходу константна ділянка антитіла до ТКЕМ-1 містить одну або декілька мутацій або замін амінокислот І 117А, А118Е, 5120А, А2135 і Р2145 в 5ЕО ІЮ МО: 77- 79 або з номерами І234А, І235Е, б237А, АЗЗ305 і РЗ315 відповідно до ЕО-нумерації.

Константна ділянка антитіла до ТКЕМ-1 може містити також одну або декілька мутацій або замін 117А, АТ18Е і 5120А в 5ЕО ІО МО: 9 або 1І234А, 1235Е і 5237А відповідно до ЕО- нумерації.

У деяких варіантах здійснення винаходу МН-домен антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі, містить амінокислотну послідовність будь-якого МН-домену, представленого в даному описі, злитого з константним доменом |дс1, що містить наступні амінокислотні послідовності:

З5МУМТУРБЗББІ СТО ТУСМУМНКРЗМТКМОКАКМЕРКЗСОКТНТЗРРЗРАРЕЇ ЇЇ СО5ЗМУБІ ЕРРКРКОТ

КЕУКСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРКЕРОМУТІ РРОКОЕЇТКМОМ5І ТС МКОЕУРБОІАМЕМЕЗМ

СОРЕММУКТТРРМІОБОСЗЕБІ КТ ЮОКЗКУМОООММЕЗСЗУМНЕАСНМНУТОКБІ 5І РОК (ЗЕО ІЮО МО: 11; "Ідо1-Ава", яка містить заміни К214К, С2265, С2295 і Р2385 (ЕО-нумерація), які підкреслені); або

А5ТКОРЗМЕРІ АРС5БА5ЗТЗЕЗТААЇ СІ МКОМЕРЕРУТУБУУМЗОАЇТ5ОМНТЕРАМІ О5501 51. 5ЗММТУРБЗББІ СТКТУТСММОНКРУЬМТКМОКеМЕРКЗСОКТНТЗРРУЗРАРЕЇ ЇЇ ОО55МБІ ЕРРКРКО

СКЕУКСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРКЕРОМУТІ РРЗКОЕЇ ТКМОМ5І ТСІ МКОЕУРЗОІАМЕУМЕЗ

МООРЕММУКТТРРМІО5ООЗЕРІ КОТЮК КУМОООММЕЗСЗУМНЕАСНМНУТОКЗІ 5І РОК бо (ЗЕО І МО: 12; "Ідб4-Абра", яка містить заміни 5131С, КІЗЗ3К, 5137Е, 51385, О196К, 11997Т,

м2030, К214К, С2265, С2295 і Р2385 (БО-нумерація), які підкреслені).

МІ -домен, представлений у даному описі, може бути злитий з константним доменом людського легкого каппа- або лямбда-ланцюга. Наприклад, МІ -домен антитіла до ТКЕМ-1 може містити амінокислотну послідовність будь-якого Мі -домену, представленого в даному описі, злиту з наступною амінокислотною послідовністю легкого каппа-ланцюга людського Ідс1:

ЕТМААРЗМЕЇІЕРРЗОЕОЇ К5ОТАБУМСГ І ММЕУРЕЕАКМОМКМОМАГОБОМЗОЕВМТЕООЗКОЗ

ТУ5І 55ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКМУАСЕМТНОСЇІ 55РУТК5ЕМАКСЕС (5ЕО ІО МО: 13)

У конкретних варіантах здійснення винаходу константна ділянка важкого ланцюга містить на

С-кінці лізин або іншу амінокислоту, наприклад, вона містить такі амінокислоти: І 5РОК (5ЕО І

МО: 48) в важкому ланцюзі. У конкретних варіантах здійснення винаходу в константній ділянці важкого ланцюга на С-кінці відсутні одна або декілька амінокислот, і вона має, наприклад, С- кінцеву послідовність І ЗРО (ЗЕО ІЮО МО: 49) або І 5Р.

В одному з варіантів здійснення винаходу варіабельна ділянка антитіла до ТКЕМ-1 зчеплена з Ес, що не має ефекторної функції або практично не має ефекторної функції. У конкретних варіантах здійснення винаходу варіабельна ділянка антитіла до ТКЕМ-1 зчеплена з

Ес, яка вибрана з групи, яка складається з ЇдС1.17, Ідс1.31, Ідо1-Аба і І(дс4-Аба, представлених в даному описі.

Як правило, варіабельні ділянки, представлені в даному описі, можуть бути зчеплені з Ес, що містить одну або декілька модифікацій, здійснених, як правило, для зміни однієї або декількох функціональних властивостей антитіла, таких як зв'язування Ес-рецептора, вивільнення прозапальних цитокінів, час напіввиведення в сироватці, фіксація комплементу іл або антитілозалежна клітинна цитотоксичність. Крім того, антитіло, представлене в даному описі, може бути хімічно модифіковано (наприклад, до антитіла можуть бути приєднані один або декілька хімічних фрагментів) або модифіковано для зміни його глікозилювання, для зміни одного або декількох функціональних властивостей антитіла. Кожен з таких варіантів здійснення винаходу більш докладно описаний нижче. Нумерація залишків в Ес-ділянці відповідає ЕО-індексу Кебота.

Ес-ділянка включає домени, які походять з константної ділянки імуноглобуліну (наприклад,

ІЧО1, Ідс2, ІДОЗ, Ідс4 і інших класів, таких як ІдА, до, І9Е і ІОМ), включаючи фрагмент, аналог, варіант, мутант або похідну константної ділянки. Константна ділянка імуноглобуліну являє собою такий поліпептид, що зустрічається в природних умовах або одержаний синтетичним шляхом, гомологічний С-кінцевій ділянці імуноглобуліну, і вона може включати СНІ1-домен, шарнір, СН2-домен, СНЗ-домен або СН4-домен окремо або в комбінації.

Молекули Ід взаємодіють з декількома класами клітинних рецепторів. Наприклад, молекули

Ід взаємодіють з трьома класами Есу-рецепторів (ЕсукК), специфічних щодо антитіла Ідс- класу, а саме, ЕсукКіІ, ЕсукІІ ії ЕсукП. Опубліковані дані про те, що послідовності, які мають важливе значення для зв'язування Ідс з ЕсукК-рецепторами, локалізовані в СН2- і СНЗ-доменах.

Здатність зазначеного антитіла до зв'язування з Ес-рецептором (ЕсК) впливає на час напіввиведення антитіла в сироватці.

В одному з варіантів здійснення винаходу Ес-ділянка антитіл до ТКЕМ-1 являє собою варіант Ес-ділянки, наприклад, має послідовність Ес, яка модифікована (наприклад, шляхом амінокислотної заміни, делеції і/або інсерції) в порівнянні з батьківською послідовністю Ес (наприклад, немодифікованого поліпептиду Ес, який потім модифікують для створення варіанту) для забезпечення необхідних структурних характеристик і/або біологічної активності.

Наприклад, можна здійснювати модифікації в Ес-ділянці для створення варіанту Ес, який має (а) підвищену або знижену антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (АОСС), (б) підвищену або знижену комплемент-опосередковану цитотоксичність (СОС), (в) підвищену або знижену афінність до С14 і/або (г) підвищену або знижену афінність до Ес- рецептора в порівнянні батьківської Ес. Такі варіанти Ес-ділянки, як правило, повинні містити принаймні одну амінокислотну модифікацію в Ес-ділянці. Вважається, що особливо кращою є комбінація амінокислотних модифікацій. Наприклад, варіант Ес-ділянки може включати дві, три, чотири, п'ять і т.д. замін, наприклад, у вказаних у даному описі специфічних положеннях в Ес- ділянці.

Варіант Ес-ділянки може мати також зміну послідовності, в результаті чого амінокислоти, які беруть участь у формуванні дисульфідного зв'язку, видаляють або замінюють на інші амінокислоти. Таке видалення може дозволяти уникати взаємодії з іншими білками, які містять цистеїн, присутніми в клітині-хазяїні, яка застосовується для одержання антитіла до ТКЕМ-1, представленого в даному описі. Навіть в тому випадку, коли залишки цистеїну видалені, одноланцюгові Ес-домени все ще можуть формувати димерний Ес-домен, в якому вони присутні бо разом, за допомогою нековалентної взаємодії. В інших варіантах здійснення винаходу Ес-

ділянку можна модифікувати для її більшої сумісності з вибраною клітиною-хазяїном.

Наприклад, можна видаляти РА-послідовність, присутню поблизу М-кінця типової нативної Ес- ділянки, яка може розпізнаватися травним ферментом в Е. соїї, таким як пролінспецифічна імунопептидаза. В інших варіантах здійснення винаходу можна видаляти один або декілька сайтів глікозилювання в Ес-домені. Залишки, які, як правило, глікозилюються (наприклад, аспарагін), можуть забезпечувати цитолітичну відповідь. Такі залишки можна видаляти або заміщати на неглікозильовані залишки (наприклад, аланін). В інших варіантах здійснення винаходу в Ес-ділянці можна видаляти сайти, які беруть участь у взаємодії з комплементом, такі як сайт зв'язування С1д. Наприклад, можна видаляти шляхом делеції або замінювати послідовність ЕКК людського ІдсС1. У конкретних варіантах здійснення винаходу можна видаляти сайти, які впливають на зв'язування з Ес-рецепторами, краще сайти, відмінні від сайтів зв'язування з рецептором реутилізації. В інших варіантах здійснення винаходу можна модифікувати Ес-ділянку з метою видалення АЮОСС-сайта. АОСС-сайти відомі в даній галузі; див., наприклад, багтау та ін., МоїЇес. Іттипої. 29 (5), 1992, сс. 633-639 щодо АЮОСсС-сайтів в

Ід01. Конкретні приклади варіантів Ес-доменів (описані, наприклад, в УМО 97/34631 і УМО 96/32478І.

В одному з варіантів здійснення винаходу модифікують шарнірну ділянку Ес таким чином, щоб змінювати, наприклад, збільшувати або зменшувати, кількість залишків цистеїну в шарнірній ділянці. Цей підхід описаний детально в (О.5. Мо 5677425 на ім'я Водтег та ін.

Кількість залишків цистеїну в шарнірній ділянці Ес змінюють, наприклад, для полегшення складання легкого і важкого ланцюгів або для підвищення або зниження стабільності антитіла.

В одному з варіантів здійснення винаходу шарнірну ділянку Ес антитіла піддають мутації для зменшення біологічного часу напіввиведення антитіла. Більш конкретно, інтродукують одну або декілька амінокислотних мутацій в поверхню поділу СН2-СНЗ-домену шарнірного Ес-фрагмента таким чином, щоб у антитіла знизилася здатність до зв'язування білку А 5їарпуІососсуї (5рА) в порівнянні зі здатністю до зв'язування 5рА антитіла, яке має нативний шарнірний фрагмент Ес.

Цей підхід описаний більш детально в (0.5. Мо 6165745 на ім'я Умага та ін.

У таких випадках здійснення винаходу Ес-ділянку змінюють шляхом заміни принаймні одного амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок для зміни ефекторної (их) функції(й) антитіла. Наприклад, можна замінювати одну або декілька амінокислот, вибраних з амінокислотних залишків 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 330 і/або 331, на інший амінокислотний залишок таким чином, щоб антитіло мало змінену афінність до ефекторного ліганду, але зберігало антигензв'язуючу здатність батьківського антитіла. Ефекторний ліганд, афінність до якого змінюють, може являти собою, наприклад, Ес-рецептор або С1-компонент системи комплементу. Цей підхід описаний більш детально в (патентах О.5. Мо 5624821 і ШО.5. Мо 5648260, обидва на ім'я М/піег та ін.

В іншому прикладі можна замінювати одну або декілька амінокислот з числа амінокислотних залишків в положеннях 329, 331 і 322 на інший амінокислотний залишок таким чином, щоб змінювати здатність антитіла до зв'язування Сід і/або знизити комплементзалежну цитотоксичність (СОС) або єлімінувати її. Цей підхід описаний більш детально в (Ш.5. Мо 6194551 на ім'я Ідизодіє та ін.

В іншому прикладі можна замінювати один або декілька амінокислотних залишків в амінокислотних положеннях 231 і 239, щоб тим самим змінювати здатність антитіла до фіксації комплементу. Цей підхід описаний більш детально в публікації |РСТ УМО 94/29351 на ім'я

Воатег та ін.)

Ще в одному прикладі можна модифікувати Ес-ділянку для зменшення антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АДОСС) і/або для зменшення афінності до Есу- рецептора шляхом модифікації однієї або декількох амінокислот в наступних положеннях: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 або 439. Приклади замін включають 236А, 2390, 239Е, 2680, 267Е, 268Е, 268БН, 324Т, 3320 і 332Е. Приклади варіантів включають 2390/332Е, 236А/332Е, 236А/2390/332Е, 268БЕ/324Т, 267Е/268Е, 267Е/3241 і 267Е/268Б/324Т. Інші модифікації для посилення взаємодій з

ЕсукК і комплементом включають (але не обмежуючись тільки ними) заміни 298А, 33З3А, 334А, 326А, 2471, 3390, 3390, 280ОН, 2905, 2980, 298У, 2431, 292Р, 3001, 3961, 3051 і 3961. Огляд цих та інших модифікацій представлений у |5ігОопі, Ситепі Оріпіоп іп Віотесппоіоду 20, 2009, сс. 685- 6911. бо Іншими модифікаціями Ес, які можна здійснювати в Ес, є модифікації, призначені для зниження або елімінації здатності до зв'язування з Есук і/або білками системи комплементу, в результаті чого відбувається зниження або елімінація Ес-опосередковуваних ефекторних функцій, таких як АОСС, АОСР ї СОС. Приклади модифікацій включають (але не обмежуючись тільки ними) заміни, інсерції і делеції в положеннях 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, 328, 330 і/або 331 (наприклад, 330 ї 331) (нумерація відповідає ЕО-індексу). Приклади замін включають (але не обмежуючись тільки ними) 234А, 235Е, 236К, 237А, 267, 269К, 3251, 328Е, 3305 і 3315 (наприклад, 3305 і 3315) (нумерація відповідає ЕМ-індексу). Варіант Ес може містити 236К/328К. Інші модифікації, призначені для зменшення взаємодій з ЕсукК і комплементом, включають заміни 297А, 234А, 235А, 237А, З18А, 228Р, 236Е, 2680, 3091, 3305, 331 5, 2205, 2265, 2295, 2385, 233Р і 234М, а також усунення глікозилювання в положенні 297 за допомогою мутацій або ферментативним шляхом, або за допомогою продукування в організмах, таких як бактерії, в яких не відбувається глікозилювання білків. Огляд цих та інших модифікацій представлений у |5ігОПі, Ситепі Оріпіоп іп Віоїесппоіоду 20, 2009, сс. 685-691.

Не обов'язково Ес-ділянка може містити амінокислотний залишок, що не зустрічається в природних умовах в додаткових і/або альтернативних положеннях, відомих спеціалісту в даній галузі |див., наприклад, О.5. МоМо 5624821; 6277375; 6737056; 6194551; 7317091; 8101720; публікації міжнародних заявок на патент УМО 00/42072; УМО 01/58957; МО 02/06919; УМО 04/016750; УМО 04/029207; УМО 04/035752; УМО 04/074455; МО 04/099249; МО 04/063351; МО 05/070963; УМО 05/040217, УМО 05/092925 і УМО 06/0201 14).

Афінності та здатність до зв'язування Ес-ділянки з її лігандом можна визначати за допомогою різних методів аналізу іп міїго (біохімічних і імунологічних аналізів), відомих в даній галузі, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) рівноважні методи (наприклад, твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5А) або радіоіїмунний аналіз (КІА)), або кінетичні (наприклад, ВІАСОКЕ-аналіз) та інші методи, такі як непрямий аналіз зв'язування, аналіз конкурентного інгібування, резонансний перенос енергії флуоресценції (ЕКЕТ), гель- електрофорез і хроматографія (наприклад, гель-фільтрація). У цих та інших методах можна використовувати мітку на одному або декількох компонентах, що підлягають дослідженню і/або застосовувати різні методи виявлення, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) хромогенні, флуоресцентні, люмінесцентні або ізотопні мітки. Детальний опис питань, які стосуються афінності зв'язування і кінетики, представлено в (Бипдатепіаї іттипоїіоду, 4-е вид., під ред. Раці МУ. Е., вид-во Гірріпсой-Камеп, РпйШааеїрпіа, 1999), де основна увага сфокусована на взаємодіях антитіло-імуноген.

У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, містять Ес, яка має знижену здатність або не має здатності до зв'язування з Есук. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має знижену афінність зв'язування з

ЕсукІ (СО64), ЕсукПА (СО32), ЕсукіІВ (2032), ЕсукКША (СО16ба), ЕсукПІВ (СО165) або будь-яку їх комбінацію в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 54. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 має афінність зв'язування з ЕсуКІ!І (СОб4), знижену принаймні в два рази, принаймні в три рази, принаймні в чотири рази, принаймні в п'ять разів, принаймні в шість разів, принаймні в сім разів, принаймні в вісім разів, принаймні в дев'ять разів або принаймні в 10 разів у порівнянні з антитілом, що містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮО МО: 54.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 містять варіант Ес ІдДС1, який містить: (а) одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з І 234А,

Ї235Е, 0237А і будь-якої їх комбінації (ЕО-нумерація); (б) одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з І 234А, 1235Е, 5237А, АЗ305, РЗ3315 і будь-якої їх комбінації (ЕО-нумерація); (в) одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з К214К, С2265, С2295, Р2385 і будь-якої їх комбінації (ЕО-нумерація); або (г) одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з 5131С, КІЗЗК, С137Е, 1385, 0196К, 11997, М2030, К214К, С2265, 02295, Р2385 і будь-якої їх комбінації (ЕО- нумерація).

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, має (а) ізотип Їдс1 і містить одну або декілька амінокислотних замін амінокислотного залишку в

Ес-ділянці, вибраних з групи, яка складається з: М297А, М2970, 0270А, 0265А, І 234А, І 235А,

С2265, 02295, Р2385, Е23З3Р, 1234М, Р2З8А, АЗ27О, АЗ2706, РЗ29А, КЗ22А, 1 234Е, І1235Е,

РЗ315, Т3940, АЗЗОЇ, М252У, 52541, Т256Е,, 1328Е, Р2380, 5267Е, І 328Е, Е2330, 602370, бо Н2г680, Р2716, АЗЗОК і будь-якої їх комбінації, де нумерація залишків відповідає ЕО-нумерації або нумерації Кебота, або має амінокислотну делецію в Ес-ділянці в положенні, що відповідає гліцину 236; (б) ізотип Ідс2 і містить одну або декілька амінокислотних замін амінокислотного залишку в Ес-ділянці, вибраних з групи, яка складається з: Р2385, М234А, 5237А, Н2б8А,

Н2г2680, Н2б8Е, М3091, М297А, М2970, АЗ305, РЗЗ315, С2325, 02335, М252У, 52541, Т256Е і будь-якої їх комбінації, де нумерація залишків відповідає ЕО-нумерації або нумерації Кебота; або (в) ізотип Ідс4 і містить одну або декілька амінокислотних замін амінокислотного залишку в

Ес-ділянці, вибраних з групи, яка складається з: Е23ЗР, Е234У, І 234А/Е234А, 1235А, 0237А,

ЕЗ1Т8А, 5228Р, І1236Е, 5241Р, І1248Е, Т3940, М252У, 5254Т, Т256Е, М297А, М2970 і будь-якої їх комбінації, де нумерація залишків відповідає ЕО-нумерації або нумерації Кебота. У деяких варіантах здійснення винаходу (а) Ес-ділянка додатково містить також одну або декілька амінокислотних замін амінокислотного залишку, вибраних з групи, яка складається з АЗЗОЇ,

ІЇ234Е; І235Е, РЗ315, і будь-якої їх комбінації, де нумерація залишків відповідає ЕО-нумерації або нумерації Кебота; (б) с-ділянка містить також одну або декілька додаткових амінокислотних замін амінокислотного залишку, вибраних з групи, яка складається з М252У, 5254Т, Т256Е, і будь-якої їх комбінації, де нумерація залишків відповідає ЕО-нумерації або нумерації Кебота; або (в) Ес-ділянка додатково містить амінокислотну заміну 5228Р, де нумерація відповідає ЕО-нумерації або нумерації Кебота див. УМО 2017/1521021.

У конкретних варіантах здійснення винаходу вибирають Ес, що характеризується зниженою здатністю до фіксації комплементу. Прикладом Ес, наприклад, Ес ІДдДО1, зі зниженою здатністю до фіксації комплементу є Ес, яка має такі дві амінокислотні заміни: АЗ3305 і РЗЗ3З15.

У конкретних варіантах здійснення винаходу вибирають Ес, яка практично не має ефекторної функції, тобто характеризується зниженою здатністю до зв'язування з ЕсукК і зниженою здатністю до фіксації комплементу. Прикладом Ес, наприклад, Ес Ідс1, яка не має ефекторної функції, є Ес, яка містить наступні п'ять мутацій: І 234А, 1235Е, 5237А, АЗЗО5 і

РЗ3315.

ІЇ. Фізичні властивості антитіл

Антитіла до ТКЕМ-1, наприклад, представлені в даному описі, мають деякі або всі фізичні характеристики специфічних антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі, такі як характеристики, описані в розділі "Приклади".

Сайти глікозилювання, перш за все присутні в варіабельних ділянках, можуть обумовлювати підвищену імуногенність антитіла або зміну значення рК антитіла внаслідок зміни зв'язування з антигеном |ІМаї:зпаї та ін., Аппи Кем Віоспет 41, 1972, сс. 673-702; Саїа і Моїтізоп, У. Іттипої 172, 2004, сс. 5489-5494; ММаїїсК та ін., У Ехр Меа 168, 1988, сс. 1099-1109; Зріго, СІусобіоІоду 12, 2002, сс. 4А3К-56К; Рагекп та ін., Майге 316, 1985, сс. 452-457; Мітига та ін., Мої Іттипої 37, 2000, сс. 697-706). Відомо, що глікозилювання відбувається в мотивах, які містять послідовність

М-Х-5/Т. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, не мають взагалі або мають знижений рівень глікозилювання варіабельної ділянки. Це може бути досягнуто шляхом відбору антитіл, які не містять мотив глікозилювання в варіабельній ділянці, або шляхом мутації залишків в ділянці глікозилювання. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1, представлене в даному описі, є менш імуногенним в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮО МО: 54.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 не містять сайтів ізомеризації аспарагіну. Дезамінування аспарагіну може мати місце на послідовностях М-с або 0-0, і воно приводить до утворення залишку ізоаспарагінової кислоти, який призводить до вигину поліпептидного ланцюга та зменшення його стабільності (ефект ізоаспарагінової кислоти).

Кожне антитіло має характеризуватися унікальною ізоелектричною точкою (рі), яка, як правило, знаходиться в діапазоні значень рН від Є до 9,5. рі для антитіла Ідс1-підкласу, як правило, знаходиться в діапазоні значень рн 7-9,5, а рі для антитіла Ідб4-підкласу, як правило, знаходиться в діапазоні значень 6-8. Передбачається, що антитіла з рі, що знаходиться за межами нормального діапазону, можуть характеризуватися певним ступенем розгортки білку і нестабільністю в умовах іп мімо. Так, антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можуть мати значення рі, яке знаходиться в нормальному діапазоні (наприклад, 8-9). Це може бути досягнуто або шляхом відбору антитіл зі значенням рі, що знаходяться в нормальному діапазоні, або за допомогою мутації заряджених залишків, які знаходяться на поверхні.

Кожне антитіло має мати характерну температуру плавлення, при цьому чим вище температура плавлення, тим більше загальна стабільність іп мімо (Кгізппатипну К. і Маппіпо М.

С., Сицт Ріагт Віоїесппої З, 2002, сс. 361-371). Як правило, Тмі (температура початку розгортки) бо може бути вище 60 "С, вище 65 "С або вище 70 "С. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, мають більш високу температуру плавлення в порівнянні з антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕБЕО ІО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮО МО: 54. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, мають більш високу термостабільність у порівнянні з референс-антитілом, яке містить важкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 76, і легкий ланцюг, який складається з амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІО МО: 54, за даними вимірювань, наприклад, за допомогою капілярного диференціального скануючого калориметра (САР-О5С). Температуру плавлення антитіла можна вимірювати методом диференціальної скануючої калориметрії |(СНеп та ін., Рпагт Кез 20, 2003, сс. 1952-1960; Спіпапао та ін., Іттипої

Ген 68, 1999, сс. 47-52) або кругового дихроїзму (Мигтау та ін., У. Спготайодг 5сі 40, 2002, сс. 343-349). У деяких варіантах здійснення винаходу стан приблизно від 10 до 20 95, приблизно від 20 до 30 95 (наприклад, 24 95) або приблизно від 30 до 40 95 антитіла є оборотним при нагріванні до 7796.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі не піддаються швидкій деградації. Деградацію антитіла можна оцінювати за допомогою капілярного електрофорезу (СЕ) і МАСОІ-МС |АІехапаег А.). ії Нидпез О.Е., Апа!Ї Спет 567, 1995, сс. 3626-3632.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, характеризуються мінімальною здатністю до агрегації яка може приводити до запуску небажаної імунної відповіді і/або до виникнення змінених або несприятливих фармакокінетичних властивостей. Як правило, антитіла є прийнятними при рівні агрегації 25 95 або менше, 20 95 або менше, 15 95 або менше, 10 95 або менше або 5 95 або менше. Агрегацію можна оцінювати за допомогою декількох методів, включаючи гель-фільтрацію на колонках (ЗЕС), рідинну хроматографію високої здатності (РХВЗ) і динамічне розсіювання світла (01 5). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, є мономерами за даними аналізу методом гель-фільтрації-рідинної хроматографії високої здатності (ГФ-РХВЗ). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 характеризуються мінімальним ризиком фрагментації за даними оцінки методом двовимірної рідинної хроматографії-тандемної мас-спектрометрії (20-РХ/МС) або інтактного мас- спектрометричного аналізу методом рідинної хроматографії-тандемної мас-спектрометрії (РХ/МО).

ІП. Нуклеїнові кислоти, вектори і клітини

Іншим об'єктом винаходу є молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі. Нуклеїнові кислоти можуть бути присутніми в цільних клітинах, в клітинному лізаті або в частково очищеній або практично чистій формі. Нуклеїнова кислота вважається "виділеною" або "розглядається як практично чиста", якщо вона очищена від інших клітинних компонентів або інших домішок, наприклад, інших присутніх в клітині нуклеїнових кислот (наприклад, іншої хромосомній ДНК, наприклад, хромосомній ДНК, зчепленій в природних умовах з виділеною ДНК) або білків, за допомогою стандартних методів, включаючи обробку лугом/ДСН, СзСіІ-бендінг, хроматографію на колонках, обробку рестриктазами, електрофорез в агарозному гелі та інші добре відомі в даній галузі методи Ідив. Сигтепі

РгоїосоЇї5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, під ред. Е. А!йзибеї та ін., вид-во Сгеепе Рибіїзпіпуд апа Уміеу

Іпіегзсіепсе, Мем/ МогКк, 1987). Нуклеїнова кислота, зазначена в даному описі, може являти собою, наприклад, ДНК або РНК, їі може містити або може не містити інтрони послідовності. У деяких варіантах здійснення винаходу нуклеїнова кислота являє собою молекулу кКДНК.

Нуклеїнові кислоти, представлені в даному описі, можна одержувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Для антитіл, які експресуються гібридомами (наприклад, гібридомами, одержаними з використанням трансгенних мишей, які несуть гени людських імуноглобулінів, що більш детально описано нижче), кКДНК, які кодують легкий і важкий ланцюги антитіла, що продукується гібридомою, можна одержувати за допомогою стандартної ПЛР-ампліфікації або методів клонування кДНК. Для антитіл, одержаних з бібліотеки генів імуноглобулінів (наприклад, за допомогою методів фагового дисплея), нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, можна виділяти з бібліотеки.

У деяких варіантах здійснення винаходу нуклеїнові кислоти, представлені в даному описі, кодують послідовності МН і МІ. антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі. Приклади послідовностей ДНК, які кодують послідовності УН і МІ, представлені в зЕО ІЮО МО: 58-61 і 5ЕО

ІО МО: 62-65 відповідно. бо Спосіб одержання антитіла до ТКЕМ-1, представленого в даному описі, може включати здійснення експресії важких ланцюгів і легких ланцюгів в лінії клітин, які містять нуклеотидні послідовності, які кодують важкі і легкі ланцюги з сигнальним пептидом, наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 58-61 ії 5ЕО ІО МО: 62-65 відповідно. Клітини-хазяїни, які містять такі нуклеотидні послідовності, підпадають під обсяг даного винаходу.

Після одержання ДНК-фрагментів, які кодують сегменти УН і МІ, зазначені ДНК-фрагменти можна піддавати додатковим маніпуляціям з допомогою стандартних методів рекомбінантних

ДНК, наприклад, для перетворення генів варіабельної ділянки на гени повнорозмірного антитіла, на гени Рар-фрагмента або на ген 5сЕу. При здійсненні цих маніпуляцій кодуючий МІ. або МН ДНК-фрагмент функціонально зв'язують з іншим ДНК-фрагментом, що кодує інший білок, такий як константна ділянка антитіла або гнучкий лінкер. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "функціонально зв'язаний" означає, що два ДНК-фрагмента з'єднані таким чином, щоб амінокислотні послідовності, які кодуються двома ДНК-фрагментами, залишалися в рамці зчитування.

Виділену ДНК, кодуючу МН-ділянку, можна перетворювати на ген повнорозмірного важкого ланцюга за допомогою функціонального зв'язку кодуючої МН ДНК з іншою молекулою ДНК, що кодує константні ділянки важкого ланцюга (шарнір, СНІ, СН2 і/або СНЗ). Послідовності людських генів константної ділянки важкого ланцюга відомі в даній галузі (див., наприклад,

Каваї Е.А. та ін., Зедпепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїодісаї Іп(егеві, 5-е вид., вид-во Ш.5. Оерапйтепі ої Неакй апа Нитап зЗегмісез, публікація МІН Мо 91-3242, 19911 і ДНК-фрагменти, що включають ці ділянки, можна одержувати за допомогою стандартної ПЛР-ампліфікації. Константна ділянка важкого ланцюга може являти собою константну ділянку ІдО1, Ідс2, Ід3, Ідс4, ІдА, ІЗЕ, ІМ або ІдО, наприклад, константну ділянку Ідс2 і/або ІдДс4. У випадку гена важкого ланцюга Еабр- фрагмента кодуючу ДНК МН можна функціонально зв'язувати з іншою молекулою ДНК, що кодує тільки константну ділянку СНІ важкого ланцюга.

Виділену ДНК, кодуючу Мі -ділянку можна перетворювати на ген повнорозмірногоо легкого ланцюга (а також на ген легкого ланцюга Раб) за допомогою функціонального зв'язку кодуючої

ДНК МІ з іншою молекулою ДНК, що кодує константну ділянку легкого ланцюга, Сі.

Послідовності людських генів константної ділянки легкого ланцюга відомі в даній галузі Ідив., наприклад, КаБбаї Е.А. та ін., хХедоепсез ої Ргоївіпз ої Іттипо|одісаї Іпіегеві, 5-е вид., вид-во 0.5.

ВОераптепі ої Неайкй апа Нитап 5егуісез, публікація МІН Мо 91-3242, 1991) і ДНК-фрагменти, які включають ці ділянки, можна одержувати за допомогою стандартної ПЛР -ампліфікації.

Константна ділянка легкого ланцюга може являти собою константну ділянку каппа- або лямбда- ланцюга.

Іншим об'єктом даного винаходу є клітини (наприклад, клітини-хазяїни), які експресують (наприклад, рекомбінантно) антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, і відповідні полінуклеотиди і експресійні вектори. У даному описі представлені також вектори, які містять полінуклеотиди, які містять нуклеотидні послідовності, які кодують антитіла до ТКЕМ-1 або їх фрагмент. У деяких варіантах здійснення винаходу вектори можна застосовувати для здійснення рекомбінантної експресії антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі, в клітинах-хазяїнах, наприклад, в клітинах ссавців. У деяких варіантах здійснення винаходу вектори можна застосовувати для генної терапії.

Придатні відповідно до даного опису вектори включають експресійні вектори, вірусні вектори і плазмідні вектори. У деяких варіантах здійснення винаходу вектор являє собою вірусний вектор.

У контексті даного опису поняття "експресійний вектор" стосується будь-якої конструкції нуклеїнової кислоти, яка містить елементи, необхідні для транскрипції і трансляції вбудованої кодуючої послідовності, або в випадку вектора для вірусної РНК елементи, необхідні для реплікації і трансляції після інтродукції в відповідну клітину-хазяїна. Експресійні вектори можуть включати плазміди, фагміди, віруси і їх похідні.

Експресійні вектори, представлені в даному описі, можуть включати полінуклеотиди, які кодують антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, представлене/представлений у даному описі. У деяких варіантах здійснення винаходу кодуючі послідовності антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента функціонально зв'язані з послідовністю, яка контролює експресію. У контексті даного опису вважається, що дві нуклеотидні послідовності функціонально зв'язані якщо вони ковалентно зв'язані таким чином, щоб для кожного компонента нуклеотидної послідовності забезпечувалося збереження його функціональності.

Вважається, що кодуюча послідовність і контролююча генну експресію послідовність функціонально зв'язані якщо вони ковалентно зв'язані таким чином, щоб експресія або транскрипція, і/або трансляція кодуючої послідовності перебувала під впливом або бо контролювалася послідовністю, яка контролює генну експресію. Вважається, що дві ДНК-

Зо послідовності функціонально зв'язані, якщо індукція промотора в 5'-ділянці експресованої послідовності гена приводить до транскрипції кодуючої послідовності і якщо природа зв'язку між двома ДНК-послідовностями не приводить до (1) інтродукції мутації зсуву рамки зчитування, (2) не погіршує здатність промоторної ділянки контролювати транскрипцію кодуючої послідовності або (3) не погіршує здатність відповідного РНК-транскрипту транслюватися в білок. Так, експресована послідовність гена може бути функціонально зв'язана з кодуючою нуклеотидною послідовністю, якщо експресована послідовність гена здатна здійснювати транскрипцію зазначеної кодуючої нуклеотидної послідовності, в результаті чого одержаний транскрипт транслюється в потрібне антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.

Вірусні вектори включають (але не обмежуючись тільки ними) нуклеотидні послідовності з наступних вірусів: ретровірус, такий як вірус мишачого лейкозу Молоні, вірус мишачої саркоми

Харві, вірус мишачої пухлини молочної залози і вірус саркоми Рауса; лентивірус; аденовірус; аденоасоційований вірус; віруси типу 5М40; поліомавіруси; віруси Епштейна-Барра; віруси папіломи; вірус герпесу; вірус коров'ячої віспи; поліовірус; і РНК-вірус, такий як ретровірус. Є прийнятним застосування інших векторів, добре відомих в даній галузі. Конкретні вірусні вектори засновані на нецитопатичних еукаріотичних вірусах, в яких не мають вирішального значення гени, замінені на ген, який представляє інтерес. Нецитопатичні віруси включають ретровіруси, життєвий цикл яких включає зворотну транскрипцію геномної вірусної РНК в ДНК з наступною провірусною інтеграцією в ДНК клітини-хазяїна. Ретровіруси дозволені для досліджень в терапії з використанням людських генів. Найбільш придатними є ретровіруси з дефіцитом реплікації (тобто вони здатні управляти синтезом необхідних білків, але не здатні продукувати інфекційну частинку). Такі генетично змінені ретровірусні експресійні вектори широко застосовують для здійснення високоефективної трансдукції генів іп мімо. Стандартні протоколи одержання ретровірусів з дефіцитом реплікації (включаючи стадії вбудовування екзогенного генетичного матеріалу в плазміду, трансфекції плазмідою лінії пакувальних клітин, одержання рекомбінантних ретровірусів лінією пакувальних клітин, збір вірусних частинок з тканинного культурального середовища і інфікування клітин-мішеней вірусними частинками) представлені у ІКгіедіег М., Сепе Тгапеїег апа Ехргеззіоп, А І арогаїогу Мапиаї, вид-во М.Н.

Егеетап Со., Мем МогК, 1990 і Мигу Е. 9., Мешйоаз іп МоЇІесшаг Віоіоду, т. 7, вид-во Нитапа

Ргезв, Іпс., СІЙОп, М.., 19911.

У деяких варіантах здійснення винаходу вірус являє собою аденоасоційований вірус, вірус, який містить дволанцюгову ДНК. Аденоасоційований вірус можна конструювати таким чином, щоб він був вірусом з дефіцитом реплікації і був здатний інфікувати широкий спектр типів клітин і видів. Він має додаткові переваги, такі як термостабільність і стабільність в ліпідному розчиннику; високі частоти трансдукції в клітинах різних ліній, включаючи гематопоетичні клітини; і відсутність інгібування суперінфекції, що дозволяє здійснювати декілька серій трансдукції. Опубліковані дані про те, що аденоасоційований вірус може інтегруватися в ДНК людської клітини сайтспецифічним чином, що мінімізує можливість інсерційного мутагенезу і варіабельність характеристик експресії вбудованого гена при інфікуванні ретровірусом. Крім того, інфекції аденоасоційованого вірусу дикого типу в культурі тканини простежувалися протягом більш ніж 100 пересівань за відсутності селективного тиску, це свідчить про те, що інтеграція аденоасоційованого вірусу в геном є порівняно стабільною подією.

Аденоасоційований вірус може функціонувати також поза хромосомою.

ЇМ. Імунокон'югати

У даному описі представлені також імунокон'югати, які містять будь-які антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі. У деяких варіантах здійснення винаходу імунокон'югат містить антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, зчеплений з агентом. У деяких варіантах здійснення винаходу імунокон'югат містить біспецифічну молекулу, представлену в даному описі, зчеплену з агентом (наприклад, таким як терапевтичний агент або діагностичний агент).

Для діагностичних цілей придатними агентами є виявлені мітки, які включають радіоізотопи для візуалізації всього організму і радіоїзотопи, ферменти, флуоресцентні мітки та інші придатні для антитіла мітки, які використовуються для аналізу зразків. Мітками, які виявляються, які можна зв'язувати з будь-яким антитілом до ТКЕМ-1, представленим в даному описі, можуть служити будь-які мітки з числа різних типів, які застосовуються в даний час в сфері діагностики іп міго, включаючи такі, що складаються з частинок мітки, в тому числі металеві золі, такі як колоїдне золото, ізотопи, такі як І125 або Тс, застосовувані, наприклад, з пептидним хелатуючим агентом типу М292, Мз5 або Ми, хромофори, включаючи флуоресцентні маркери, люмінесцентні маркери, фосфоресцентні маркери і т.п., а також ферментні мітки, які перетворюють розглянутий субстрат на маркер, який виявляється, і полінуклеотидні мітки, які бо виявляють після ампліфікації, здійснюваної, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Придатні ферментні мітки включають пероксидазу з хріну, лужну фосфатазу і т.п.

Наприклад, мітка може являти собою фермент лужну фосфатазу, яку виявляють шляхом оцінки присутності або генерування хемілюмінесценції після перетворення 1,2-діоксетанових субстратів, таких як адамантілметоксифосфорилоксифенілдіоксетан (АМРРО), динатрій-3-(4- (метоксиспіроїї, 2-діоксетан-3,2'-(5'-хлор)трицикло/3.3.1.1 3,7їдекан)-4-іл)уфенілфосфат (С5РВБ), а також СОР і СОР-5іаі? або інших люмінесцентних субстратів, добре відомих в даній галузі, наприклад, хелатів придатних лантанідів, таких як тербій (ІІІ) ї європій (ІІ). Засоби виявлення визначаються вибраною міткою. Виявлення мітки або продуктів її реакції можна здійснювати неозброєним оком в тому випадку, коли мітка складається з частинок і накопичується у відповідних кількостях, або з використанням інструментів, таких як спектрофотометр, люмінометр, флуориметр і т.п., у всіх випадках відповідно до стандартної практики.

У деяких варіантах здійснення винаходу методами кон'югації одержують зв'язки, які є практично (або майже) неімуногенними, наприклад, пептидні (тобто амідні), сульфідні, (стерично утруднені), дисульфідні, гідразонові зв'язки та зв'язки на основі простого ефіру. Ці зв'язки є практично неімуногенними і характеризуються прийнятною стабільністю в сироватці

Ідив., наприклад, бепіег Р.О., Си. Оріп. Спет. Віої. 13, 2009, сс. 235-244; МО 2009/059278; УМО 95/178861,.

Залежно від біохімічної природи фрагмента і антитіла можна застосовувати різні стратегії кон'югації. У тому випадку, якщо фрагмент являє собою такий, що зустрічається в природних умовах або рекомбінантний фрагмент, що складається з 50-500 амінокислот, в підручниках з хімії синтезу білкових кон'югатів описані стандартні процедури, які легко може здійснювати спеціаліст в даній галузі (див., наприклад, НасКепрегдег С.Р.К. і 5спулаггег О., Апдем/. Спет. пі.

Еа. Епої. 47, 2008, сс. 10030-10074Ї. У деяких варіантах здійснення винаходу застосовують взаємодію малеїнімідного фрагмента з залишком цистеїну, присутнім в антитілі або його фрагменті. Така взаємодія являє собою найбільш придатну реакцію хімічного сполучення в випадку застосування, наприклад, Рар- або Рар'-ррагмента антитіла. Альтернативно до цього у деяких варіантах здійснення винаходу здійснюють сполучення з С-кінцевою ділянкою антитіла або фрагмента. С-кінцеву модифікацію білка, наприклад, Рар-фрагмента, можна здійснювати відповідно до методу, (описаного у Зиприї М. і Міп У., Огд. Віотої. Спет. 7, 2009, сс. 3361-3371.

В цілому, сайт-специфічна взаємодія і ковалентне сполучення базується на трансформації амінокислоти, яка зустрічається в природних умовах, на амінокислоту, реактивність якої ортогональна реактивності інших присутніх функціональних груп. Наприклад, конкретний цистеїн в контексті рідкісної послідовності можна ферментативно перетворювати на альдегід

Їдив. ЕРгезе М. А. і Оіегк5 Т., СпетВіоСпет. 10, 2009, сс. 425-427). Необхідну амінокислотну модифікацію можна створювати також шляхом використання специфічної ферментативної реактивності певних ферментів щодо амінокислоти, що зустрічається в природних умовах, в контексті розглянутої послідовності (див., наприклад, Такі М. та ін., Ргої. Епд. Оеє5. Зеї. 17, 2004, сс. 119-126; Сашіег А. та ін. Спет. ВіоїЇ. 15, 2008, сс. 128-136; а каталізоване протеазою утворення С-М-зв'язків описано у Вогадиза Р., Нідпіїднів іп Віоогдапіс Спетівігу, 2004, сс. 389- 403|. Сайт-специфічну взаємодію і ковалентне сполучення можна здійснювати також за допомогою селективної взаємодії кінцевих амінокислот з відповідними модифікуючими реагентами.

Для здійснення сайтспецифічного ковалентного сполучення можна використовувати реактивність М-кінцевого цистеїну щодо бензонітрилів (див. Кеп Н. та ін., Апдем/. Спет. Іпі. Ед.

Епої. 48, 2009, сс. 9658-9662.

Нативне хімічне лігування може базуватися також на використанні С-кінцевих залишків цистеїну (Гауїог Е. Модеї!; Ітрегіайй В., МисіІеїіс Асід5 апа Моїесшіаг ВіоІоду, 22 (Ргоївіп

Епдіпеегіпо), 2009, сс. 65-961,.

В Ш.5. (Мо 6437095| ВІ описаний метод кон'югації, який базується на швидкій взаємодії цистеїну, присутнього в сегменті негативно заряджених амінокислот, з цистеїном, що знаходиться в сегменті позитивно заряджених амінокислот.

Фрагмент може являти собою також синтетичний пептид або пептидний міметик. У тому випадку, коли поліпептид синтезують хімічним шляхом, в процесі такого синтезу можна вбудовувати амінокислоти з ортогональною хімічною реактивністю |див., наприклад, де Сгааї

А.). та ін., Віосопіпд. Спет. 20, 2009, сс. 1281-1295). Оскільки в розпорядженні є велика різноманітність ортогональних функціональних груп і їх можна інтродуціювати в синтетичний пептид, то кон'югація такого пептиду з лінкером є стандартною хімічною процедурою.

Для одержання поліпептиду, який несе одну мітку, кон'югат з стехіометрією 1:11 можна відокремлювати від інших побічних продуктів кон'югації за допомогою хроматографії. Цю 60 процедуру можна полегшувати шляхом застосування міченого барвником партнера по спаровуванню і лінкера, який несе заряд. Шляхом застосування такого роду міченого партнера і такого, який несе великий негативний заряд партнера по спаровуванню, легко можна відокремлювати монокон'юговані поліпептиди від немічених поліпептидів і поліпептидів, які несуть більше одного лінкера, оскільки для розділення можна використовувати різницю в заряді і молекулярній масі. Для очищення комплексу від незв'язаних компонентів можна застосовувати флуоресцентний барвник, такий як мічений одновалентний зв'язуючий агент.

У деяких варіантах здійснення винаходу фрагмент, приєднаний до антитіла до ТКЕМ-1, вибирають з групи, яка складається зі зв'язуючого фрагмента, застосовуваного для мічення фрагмента і біологічно активного фрагмента.

Антитіла до ТКЕМ-1Ї, представлені в даному описі, можна кон'югувати також з терапевтичним агентом для одержання імунокон'югату, такого як кон'югат антитіло-лікарський засіб (АОС). Придатні терапевтичні агенти включають антиметаболіти, алкілуючі агенти, агенти, які зв'язуються з малою борозенкою ДНК, ДНК-інтеркалятор, кросслінкери для ДНК, інгібітори гістондеацилази, інгібітори ядерного експорту, інгібітори протеасоми, інгібітори топоіїзомерази або ІЇ, інгібітори білків теплового шоку, інгібітори тирозинкіназ, антибіотики і антимітотичні агенти. Для одержання АОС антитіло і терапевтичний агент краще кон'югують за допомогою розщеплюваного лінкера, такого як пептидильний, дисульфідний або гідразоновий лінкер. У деяких варіантах здійснення винаходу лінкер являє собою пептидильний лінкер, такий як Маї!-

СІї, АІа-Маї, Ма!І-АІа-Маї, Гуз-Гувз, Рго-МаІ-сіІу-МаІ-Ма! (ЗЕО ІЮО МО: 80), АІа-Азп-Маї, Ма!І-Гец-Г ув,

АІа-АІа-Азп, СИ-Сії, МаІ-Г ув, Гуз, Сі, Зег або сСіш. АОС можна одержувати згідно з методом,

Їописаним в Ш.5. МоМо 7087600; 6989452 і 7129261; публікаціях РСТ УМО 02/096910; УМО 07/038658; УМО 07/051081; УМО 07/059404; УМО 08/083312 і УМО 08/103693; публікаціях патентів 0.5. МоМо 20060024317; 20060004081 і 200602472951,.

Антитіла до ТКЕМ-1, наприклад, представлені в даному описі, можна застосовувати також для виявлення ТКЕМ-1, такого як людський ТКЕМ-1, наприклад, людський ТКЕМ-1, в тканинах або зразках тканини. Антитіла можна застосовувати, наприклад, в аналізі ЕЇІ5А або аналізі методом проточної цитометрії. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 приводять у контакт з клітинами, наприклад, клітинами в тканині, протягом періоду часу, достатнього для здійснення специфічного зв'язування, і потім додають реагент, наприклад, антитіло, яке виявляє антитіло до ТКЕМ-1. Приклади аналізів представлені в розділі "Приклади". Антитіло до ТКЕМ-1 може являти собою повністю людське антитіло або воно може являти собою химерне антитіло, таке як антитіло, яке має людські варіабельні ділянки і мишачі константні ділянки або їх фрагменти. Приклади методів виявлення ТКЕМ-1, наприклад, людського ТКЕМ-1, в зразку (зразку клітини або тканини) включають (І) приведення зразка в контакт з антитілом до ТКЕМ-1 протягом періоду часу, достатнього для здійснення специфічного зв'язування антитіла до ТКЕМ-1 з ТКЕМ-1 в зразку, і (І) приведення зразка в контакт з реагентом для виявлення, наприклад, з антитілом, яке специфічно зв'язується з антитілом до ТКЕМ-1, наприклад, з Ес-ділянкою антитіла до ТКЕМ-1, для виявлення ТКЕМ-1, зв'язаного з антитілом до ТКЕМ-1. Після інкубації з антитілом і/або реагентом для виявлення можна застосовувати стадії промивки. Антитіла до ТКЕМ-1, які застосовуються в цих методах, не потребують зчеплення з міткою або агентами для виявлення, оскільки агент для виявлення можна застосовувати окремо.

Інші варіанти застосування антитіл до ТКЕМ-1, наприклад, в монотерапії або в комбінованій терапії, представлені нижче, наприклад, в розділі, присвяченому комбінованій обробці.

М. Біспецифічні молекули

Антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можна застосовувати для створення біспецифічних молекул. Антитіло до ТКЕМ-1 або його антигензв'язуючі фрагменти можна дериватизувати або зв'язувати з іншою функціональною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, іншим антитілом або лігандом для рецептора), для створення біспецифічної молекули, яка зв'язується принаймні з двома різними сайтами зв'язування або молекулами-мішенями. Наприклад, антитіло до ТКЕМ-1 можна зв'язувати з антитілом або 5сгЕм, яке/який специфічно зв'язується з будь-яким білком, який можна використовувати як потенційні мішені для комбінованих обробок, таких як білки, представлені в даному описі (наприклад, антитіла до ІР-10 або ТМЕ-4). Фактично антитіло, представлене в даному описі, можна дериватизувати або зв'язувати більш ніж з однією іншою функціональною молекулою для створення мультиспецифічних молекул, які зв'язуються більш ніж з двома різними сайтами зв'язування і/або молекулами-мішенями; мається на увазі, що такі мультиспецифічні молекули також підпадають під поняття "біспецифічна молекула", що використовується в даному описі.

Для створення біспецифічної молекули, зазначеної в даному описі, антитіло, представлене в бо даному описі, можна функціонально зв'язувати (наприклад, за допомогою хімічного сполучення,

генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим чином) з однією або декількома іншими зв'язуючими молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пептид або зв'язуючий міметик, з одержанням біспецифічної молекули.

Таким чином, в даному описі запропоновані біспецифічні молекули, які містять принаймні одну першу зв'язуючу специфічність для ТКЕМ-1 і другу зв'язуючу специфічність для другого епітопу-мішені. У деяких варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі, в яких біспецифічна молекула є мультиспецифічною, молекула може додатково мати третю зв'язуючу специфічність.

У деяких варіантах здійснення винаходу біспецифічні молекули, представлені в даному описі, перебувають у ролі зв'язуючої специфічності принаймні одне антитіло або фрагмент антитіла, включаючи, наприклад, Раб, Раб", Е(ар)2, Ем або одноланцюговий Ем (зсЕм). Антитіло може являти собою також димер легкого ланцюга або важкого ланцюга, або будь-який мінімальний фрагмент, такий як Ем або одноланцюгова конструкція, (описана в 0.5. 4946778 на ім'я І адпег та ін.

Хоча кращими є моноклональні антитіла, в біспецифічних молекулах, представлених в даному описі, можна застосовувати і інші антитіла, такі як мишачі, химерні і гуманізовані моноклональні антитіла.

Біспецифічні молекули, представлені в даному описі, можна одержувати шляхом кон'югації зв'язуючих специфічностей, які входять до його складу, за допомогою методів, відомих в даній галузі. Наприклад, кожну зв'язуючу специфічність біспецифічної молекули можна створювати окремо і потім кон'югувати одна з одною. Коли зв'язуючі специфічності являють собою білки або пептиди, то для ковалентної кон'югації можна застосовувати різноманітні зв'язуючі або перехресно зшиваючі агенти. Приклади перехресно зшиваючих агентів включають білок А, карбодіїмідів, М-сукцинімідил-5-ацетилтіоацетат (ЗАТА), 5,5'-дитіобіс(2-нітробензойну кислоту) (ОТМВ), о-фенілендималеїмід (ОРОМ), М-сукцинімідил-3-(2-піридилтіо)упропіонат (5РОР) і сульфосукцинімідил-4-(М-малеїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-5ХМСОСС) |див., наприклад, Кагроузку та ін., У. Ехр. Меа. 160, 1984, с. 1686; ім М.А. та ін., Ргос. Маї!. Асад. 5сбі.

БА 82, 1985, с. 8648). Інші методи включають методи, (описані у Рашіиз, Вейгіпу Іп5. Міф. Мо. 78, 1985, сс. 118-132; Вгеппап та ін., Зсіепсе 229, 1985, сс. 81-83 і у СіІеппіє та ін., У. Іттипо). 139, 1987, сс. 2367-2375). Прикладами кон'югуючих агентів є 5АТА і сульфо-5МСОС, обидві сполуки випускаються фірмою Ріегсе Спетісаї! Со. |Рокфорд, шт. Іллінойсі|.

Коли зв'язуючі специфічності являють собою антитіла, їх можна кон'югувати за допомогою сульфгідрильного зв'язування С-кінцевих шарнірних ділянок двох важких ланцюгів. У деяких варіантах здійснення винаходу шарнірну ділянку модифікують таким чином, щоб вона до кон'югації містила непарну кількість (краще один) сульфігідрильних залишків.

В альтернативному варіанті обидві специфічності зв'язування можна кодувати в одному і тому ж векторі і здійснювати їх експресію і збірку в одній і тій же клітині-хазяїні. Цей метод найбільш придатний в тому випадку, коли біспецифічна молекула являє собою злитий білок типу МАтТхМАт, МАтхРарб, МАт х (зсЕм)», Рабх (аб) або ліганд хРаб. Біспецифічне антитіло може містити антитіло, що містить 5сЕм на С-кінці кожного важкого ланцюга. Біспецифічна молекула, представлена в даному описі, може являти собою одноланцюгову молекулу, яка містить одноланцюгове антитіло і зв'язуючу детермінанту або одноланцюгову біспецифічну молекулу, яка містить дві зв'язуючі детермінанти. Біспецифічні молекули можуть містити принаймні дві одноланцюгові молекули. Методи одержання біспецифічних молекул описані, наприклад, в (0.5.

Мо 5260203; 0.5. Мо 5455030; Ш.5. Мо 4881175; 0.5. Мо 5132405; Ш.5. Мо 5091513; 0.5. Мо 5476786; 0.5. Мо 5013653; 0.5. Мо 5258498 і 0.5. Мо 54828581.

Зв'язування біспецифічних молекул з їх специфічними мішенями можна підтверджувати за допомогою відомих в даній галузі методів, таких як твердофазний імуноферментний аналіз (ЕНІЗА), радіоїмунний аналіз (КІА), ЕАСзЗ-аналіз, біоаналіз (наприклад, аналіз інгібування росту) або аналіз методом вестерн-блоттинга. Кожен з цих аналізів дозволяє виявляти присутність комплексів білок-антитіло, що представляють особливий інтерес, шляхом застосування міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного щодо комплексу, що представляє інтерес.

МІ. Набори

У даному описі запропоновані набори, які містять одне або декілька антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі, або їх антигензв'язуючі фрагменти, біспецифічні молекули або їх імунокон'югати. У деяких варіантах здійснення винаходу, запропонована/запропонований фармацевтична упаковка або набір, яка містить/який містить один або декілька контейнерів, заповнених одним або декількома інгредієнтами фармацевтичних композицій, представлених в бо даному описі, такими як одне або декілька антитіл, представлених в даному описі, або їх антигензв'язуючі фрагменти, необов'язково інструкції по застосуванню. У деяких варіантах здійснення винаходу набори містять фармацевтичну композицію, представлену в даному описі, і будь-який профілактичний або терапевтичний засіб, наприклад, представлений в даному описі.

МІ. Композиції та препаративні форми

У даному описі запропоновані також композиції (наприклад, фармацевтичні композиції) і препаративні форми, які містять одне або декілька антитіл до ТКЕМ-1 (включаючи полінуклеотиди, вектори і клітини, які кодують і/або експресують антитіла до ТКЕМ-Ї1), представлені в даному описі. Наприклад, в одному з варіантів здійснення винаходу запропонована фармацевтична композиція, яка містить одне або декілька антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі, включених в препаративну форму разом з фармацевтично прийнятним носієм.

У контексті даного опису поняття "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-який і всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові агенти, агенти для додання ізотонічності і уповільнення абсорбції і т.п., які є фізіологічно сумісними. У деяких варіантах здійснення винаходу носій придатний для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинального або епідермального введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). Залежно від шляху введення на активну сполуку, тобто антитіло, імунокон'югат або біспецифічну молекулу, може бути нанесено покриття з матеріалу, що захищає сполуку від дії кислот або інших умов навколишнього середовища, які інактивують сполуку.

Отже, однією з цілей даного винаходу є створення фармацевтичної препаративної форми, яка підвищує стабільність антитіла до ТКЕМ-1 і тим самим забезпечує його тривале зберігання.

У деяких варіантах здійснення винаходу фармацевтична препаративна форма, представлена в даному описі, містить: (а) антитіло до ТКЕМ-1; (б) забуферюючий агент; (В) стабілізатор; (Г) сіль; (Д) наповнювач і/або (є) поверхнево-активну речовину. У деяких варіантах здійснення винаходу фармацевтична препаративна форма зберігає стабільність протягом принаймні 1 місяця, принаймні 2 місяців, принаймні З місяців, принаймні б місяців, принаймні 1 року, принаймні 2 років, принаймні З років, принаймні 5 років або більше. У деяких варіантах здійснення винаходу препаративна форма зберігає стабільність при зберіганні при 4 "С, 2570 або 40 "С.

Забуферюючий агент

Забуферюючі агенти, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, можуть являти собою слабку кислоту або основу, яка використовується для підтримки рівня кислотності (рН) розчину, близького до вибраного значення, після додавання іншої кислоти або основи.

Придатні забуферюючі агенти можуть підвищувати до максимуму стабільність фармацевтичних препаративних форм за допомогою підтримки контрольного значення рН препаративної форми.

Придатні забуферюючі агенти дозволяють також забезпечувати фізіологічну сумісність або оптимізувати розчинність. Реологічні характеристики, в'язкість і інші властивості також можуть залежати від значення рН препаративної форми. Звичайні забуферюючі агенти включають (але не обмежуючись тільки ними) гістидин, цитрат, сукцинат, ацетат і фосфат. У деяких варіантах здійснення винаходу забуферюючий агент містить гістидин (наприклад, І -гістидин) з агентами, які забезпечують ізотонічність і може регулювати значення рН за допомогою кислоти або основи, відомої в даній галузі. У конкретних варіантах здійснення винаходу забуферюючий агент являє собою І-гістидин. У конкретних варіантах здійснення винаходу значення рн композиції підтримують на рівні від приблизно 2 до приблизно 10 або від приблизно 4 до приблизно 8.

Стабілізатор

Стабілізатори додають до фармацевтичного продукту для стабілізації зазначеного продукту.

Такі агенти можуть забезпечувати стабілізацію білків численними різними шляхами. Звичайні стабілізатори включають (але не обмежуючись тільки ними) амінокислоти, такі як гліцин, аланін, лізин, аргінін або треонін, вуглеводи, такі як глюкоза, цукроза, трегалоза, рафіноза або мальтоза, поліоли, такі як гліцерин, маніт, сорбіт, циклодекстрини або декстрани будь-якого типу, які мають одну молекулярну масу, або ПЕГ. В одному з об'єктів винаходу стабілізатор вибирають для підвищення до максимуму стабільності поліпептиду РІХ в ліофілізованих препаратах. У конкретних варіантах здійснення винаходу стабілізатор являє собою цукрозу і/або аргінін.

Наповнювач

Наповнювачі можна додавати до фармацевтичного продукту для збільшення об'єму і маси бо продукту, полегшуючи тим самим здійснення точного дозування і маніпуляцій з ним. Звичайні наповнювачі включають (але не обмежуючись тільки ними) лактозу, цукрозу, глюкозу, маніт, сорбіт, карбонат кальцію або стеарат магнію.

Поверхнево-активна речовина

Поверхнево-активні речовини являють собою амфіпатичні субстанції, які мають ліофільні і ліофобні групи. Поверхнево-активна речовина може бути аніонною, катіонною, цвіттеріонною або неіонною. Приклади неіїонних поверхнево-активних речовин включають (але не обмежуючись тільки ними) алкілетоксилат, нонілфенолетоксилат, амінетоксилат, поліетиленоксид, поліпропіленоксид, жирні спирти, такі як цетиловий спирт або олеїловий спирт, кокамід МЕА, кокамід ОЕА, полісорбати або додецилдиметиламіноксид. У деяких варіантах здійснення винаходу поверхнево-активна речовина являє собою полісорбат 20 або полісорбат 80.

У деяких варіантах здійснення винаходу фармацевтична препаративна форма, представлена в даному описі, містить: (а) антитіло до ТКЕМ-1 в концентрації приблизно від 0,25 мг/мл до 250 мг/мл (наприклад, від 10 до 200 мг/мл); (б) гістидин в концентрації приблизно 20мМ; (в) цукрозу в концентрації приблизно 150мМ; (г) аргінін в концентрації приблизно 25мМ; і (д) Масі в концентрації приблизно 50ММ.

Препаративна форма може додатково містити одну або декілька забуферюючих систем, консервант, агент, який регулює тонічність, хелатуючий агент, стабілізатор і поверхнево-активну речовину, а також різні їх комбінації. Застосування консервантів, агентів, які забезпечують ізотонічність, хелатуючих агентів, стабілізаторів і/або поверхнево-активних речовин у фармацевтичних препаративних формах добре відомо спеціалісту в даній галузі (див.

Кетіпдіоп: Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпагтасу, 19-е вид., 19951.

У деяких варіантах здійснення винаходу фармацевтична препаративна форма являє собою водну препаративну форму. Така препаративна форма, як правило, являє собою розчин або суспензію, але може включати також колоїди, дисперсії, емульсії і багатофазні продукти.

Поняття "водна препаративна форма" означає препаративну форму, яка містить принаймні 50 мас. 95 води. Аналогічно цьому поняття "водний розчин" означає розчин, який містить принаймні 50 мас. 95 води, а поняття "водна суспензія" означає суспензію, яка містить принаймні 50 мас. 95 води.

У деяких варіантах здійснення винаходу фармацевтична препаративна форма являє собою висушену заморожуванням препаративну форму, до якої лікуючий лікар або пацієнт додає розчинники і/або розріджувачі перед застосуванням.

Фармацевтичні композиції, представлені в даному описі, можна вводити в рамках комбінованої терапії, тобто, в комбінації з іншими агентами. Наприклад, комбінована терапія може включати застосування антитіла до ТКЕМ-1, представленого в даному описі, в комбінації принаймні з одним іншим терапевтичним агентом. Приклади терапевтичних агентів, які можна застосовувати в комбінованій терапії, можуть включати інші сполуки, лікарські засоби і/або агенти, які застосовуються для лікування захворювання або порушення (наприклад, запального порушення). Такі сполуки, лікарські засоби і/або агенти можуть включати, наприклад, протизапальні лікарські засоби або антитіла, які блокують або знижують продукування прозапальних цитокінів. У деяких варіантах здійснення винаходу терапевтичні агенти можуть включати антитіло до ІР-10, антитіло до ТМЕ-а (наприклад, адалімумаб (НОМІЕАЗЄ), голімумаб (БІМРОМІЄ), інфліксимаб (КЕМІСАОЕЄ), цертолізумаба пегол (СІМААЄ)), інтерферон бета-1а (наприклад, АМОМЕХ?У, РЕВІЕ-У), інтерферон бета-15 (наприклад, ВЕТАБЕКОМУ, ЕХТАМІАЗЄ), глатирамера ацетат (наприклад, СОРАХОМЕ?, СІАТОРА?), мітоксантрон (наприклад,

МОМАМТВОМЕ?), нестероїдні протизапальні лікарські засоби (НСПВЗ), анальгетики, кортикостероїди та їх комбінації.

Фармацевтичні сполуки, представлені в даному описі, можуть включати одну або декілька фармацевтично прийнятних солей. Поняття "фармацевтично прийнятна сіль" стосується солі, яка зберігає необхідну біологічну активність батьківської сполуки і не чинить ніяких небажаних токсикологічних дій (див., наприклад, Вегде 5.М. та ін., У. Рпапт. осі. 66, 1977, сс. 1-19).

Приклади таких солей включають кислотно-адитивні солі і солі приєднання основ. Кислотно- адитивні солі включають солі, утворені з нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна, азотна, фосфорна, сірчана, бромистоводнева, йодистоводнева, фосфориста кислота і т.п., а також з нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, фенілзамещені алканові кислоти, гідроксіалканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні і бо ароматичні сульфонові кислоти і т.п. Солі приєднання основ включають солі, утворені з лужноземельних металів, таких як натрій, калій, магній, кальцій і т.п., а також з нетоксичних органічних амінів, таких як М,М'-дибензилетилендіамін, М-метилглюкамін, хлорпрокаїн, холін, діетаноламін, етилендіамін, прокаїн і т.п.

Фармацевтична композиція, представлена в даному описі, може включати також фармацевтично прийнятний антиоксидант. Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію і т.п.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксіанізол (ВНА), бутильований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і т.п.; і (3) метал- хелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т.п.

Приклади придатних водних і неводних носіїв, які можна застосовувати в фармацевтичних композиціях, представлених в даному описі, включають воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т.п.) і придатні їх суміші, рослинні масла, такі як оливкове масло, і придатні для ін'єкції органічні складні ефіри, такі як етилолеат. Необхідну текучість можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування придатних матеріалів для покриттів, таких як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у випадку дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин.

Такі композиції можуть містити також ад'юванти, такі як консерванти, змочуючі речовини, емульгатори і диспергатори. Попередження присутності мікроорганізмів можна забезпечувати за допомогою процедур стерилізації (див. вище) і шляхом включення різних антибактеріальних і протигрибкових агентів, такх як, наприклад, парабен, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота і т.п. Може виявитися доцільним включати в композиції агенти для додання ізотонічності, таких як цукри, хлорид натрію і т.п. Крім того, можна забезпечувати пролонговану абсорбцію фармацевтичної форми, що ін'єктгується шляхом застосування агентів, які уповільнюють абсорбцію, таких як моностеарат алюмінію і желатин.

Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для приготування призначених для негайного введення стерильних розчинів або дисперсій, які ін'єктуються. Застосування таких середовищ і агентів для фармацевтично активних субстанцій відомо в даній галузі. Передбачається їх застосування в фармацевтичних композиціях за винятком випадків, коли будь-яке/будь-який або середовище або агент є несумісним з діючою речовиною. Фармацевтична композиція може містити консервант або консервант може бути відсутнім. У композицію можуть бути включені додаткові діючі речовини.

Терапевтичні композиції, як правило, повинні бути стерильними і стабільними в умовах продукування і зберігання. Композиція може бути приготована в формі розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, придатної для включення лікарського засобу у високій концентрації. Носій може являти собою розчинник або дисперсійне середовище, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь тощо) і їх придатні суміші. Необхідну текучість можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування матеріалів придатних для покриттів, таких як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у випадку дисперсій і шляхом застосування поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках композиції можуть включати агенти для додання ізотонічності, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт або хлорид натрію. Пролонговану абсорбцію композицій, які ін'єкгуються, можна забезпечувати шляхом включення в композицію агента, який уповільнює абсорбцію, наприклад, моностеаратів і желатину.

Стерильні розчини для ін'єкцій можна готувати шляхом включення діючої речовини в необхідній кількості у відповідний розчинник при необхідності разом з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, і наступної стерилізації за допомогою мікрофільтрації. Як правило, дисперсії готують шляхом включення діючої речовини в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і необхідні інші інгредієнти з числа перерахованих у даному описі. У випадку стерильних порошків, призначених для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій, прикладами методів приготування є вакуумна сушка та сушка виморожуванням (ліофілізація), які дозволяють одержувати порошок діючої речовини плюс будь-якого додаткового необхідного інгредієнта з попередньо простерилізованого фільтрацією розчину, який їх містить.

Кількість діючої речовини, яку можна поєднувати з матеріалом носія для одержання лікарської форми з одноразовою дозою, має варіюватися з огляду на індивідуума, який підлягає лікуванню, і конкретного шляху введення. Кількість діючої речовини, яку можна поєднувати з бо матеріалом носія для одержання лікарської форми з одноразовою дозою, як правило, має являти собою кількість композиції, яка має терапевтичну дію. Як правило, ця кількість, за винятком випадку, коли вона становить 100 95, може варіюватися в межах від приблизно 0,01 95 до приблизно 99 95 діючої речовини, від приблизно 0,1 95 до приблизно 70 95 або від приблизно 195 до приблизно 3095 діючої речовини, що входить в комбінацію з фармацевтично прийнятним носієм.

Режими дозування регулюють для забезпечення оптимальної необхідної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити одноразову болюсну дозу, можна вводити декілька розділених доз протягом певного проміжку часу або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, як в випадку гострої необхідності, обумовленої терапевтичною ситуацією. Найкраще готувати парентеральні композиції у вигляді стандартної лікарської форми для простоти введення і забезпечення однаковості доз. У контексті даного опису поняття "стандартна лікарська форма" стосується фізично дискретних одиниць, придатних як одиничні дози для індивідуумів, які підлягають лікуванню; де кожна одиниця містить діючу речовину в заздалегідь визначеній кількості, яка розрахована для досягнення необхідної терапевтичної дії, в асоціації з необхідним фармацевтичним носієм. Специфікація стандартних лікарських форм, представлених в даному описі, диктується і прямо пов'язана з (а) унікальними характеристиками діючої речовини і конкретною терапевтичною дією, яку потрібно досягти, і (б) обмеженнями, які існують в галузі рецептур з використанням діючої речовини для лікування чутливих індивідуумів.

Для введення антитіла до ТКЕМ-1, наприклад, представленого в даному описі, застосовують дози, які знаходяться в межах від приблизно 0,0001 до 100 мг/кг і більше, як правило, від 0,01 до 5 або 10 мг/кг маси тіла хазяїна. Наприклад, дози можуть становити 0,3 мг/кг маси тіла, 1 мг/кг маси тіла, З мг/кг маси тіла, 5 мг/кг маси тіла або 10 мг/кг маси тіла, або можуть знаходитися в межах 1-10 мг/кг. Приклади режимів обробки включають введення один раз на тиждень, один раз кожні два тижні, один раз кожні три тижні, один раз кожні чотири тижні, один раз на місяць, один раз кожні З місяці або один раз кожні 3-6 місяців. Приклади режимів дозування антитіла до ТКЕМ-1, представленого в даному описі, включають внутрішньовенне введення в дозі 1 мг/кг маси тіла або З мг/кг маси тіла, де антитіло вводять з використанням однієї з наступних схем дозування: (І) кожні чотири тижні, здійснюючи шість введень дози, потім кожні три місяці; (ІІ) кожні три тижні; (ІІІ) одноразово в дозі З мг/кг маси тіла, потім в дозі 1 мг/кг маси тіла кожні три тижні.

У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 вводять в постійній дозі (режим постійного дозування). В інших варіантах здійснення винаходу антитіло до ТКЕМ-1 вводять у фіксованій дозі з іншим антитілом. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло до

ТКЕМ-1 вводять в дозі, яка розрахована на основі маси тіла.

У деяких методах вводять одночасно два або декілька моноклональних антитіл з різними зв'язуючими специфічностями, в цьому випадку доза кожного введеного антитіла знаходиться в зазначених діапазонах. Антитіло, як правило, вводять декілька разів. Інтервали між введеннями окремих доз можуть становити, наприклад, один тиждень, один місяць, три місяці або один рік.

Інтервали можуть бути також нерівномірними і їх можна визначати в залежності від виміряних рівнів антитіла до антигену-мішені в крові пацієнта. У деяких методах дозу регулюють до досягнення концентрації антитіла в плазмі, що становить приблизно 1-1000 мкг/мл, а в деяких методах приблизно 25-300 мкг/мл.

Антитіло можна вводити в складі препаративної форми з пролонгованим вивільненням, в цьому випадку потрібно менш часте введення. Доза і частота введення варіюються в залежності від часу напіввиведення антитіла в організмі пацієнта. В цілому, найбільш тривалим часом напіввиведення характеризуються людські антитіла, за ними йдуть гуманізовані антитіла, химерні антитіла і нелюдські антитіла. Доза і частота введення можуть варіюватися в залежності від того, чи є лікування профілактичним чи терапевтичним. У випадку профілактичних застосувань вводять відносно низьку дозу з відносно рідкісними інтервалами протягом тривалого періоду часу. Деякі пацієнти продовжують одержувати лікування протягом всього життя. У випадку терапевтичних застосувань іноді потрібне введення відносно високої дози з відносно короткими інтервалами до зниження або припинення прогресування захворювання і до тих пір, поки у пацієнта не відбудеться часткове або повне поліпшення симптомів захворювання. Після цього пацієнта можна переводити на профілактичний режим.

Фактичні рівні доз діючих речовин у фармацевтичних композиціях, представлених в даному описі, можна варіювати таким чином, щоб одержувати кількість діючої речовини, ефективну для досягнення необхідної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта при застосуванні зазначеної композиції та шляху введення, але не токсичну для пацієнта. Вибраний рівень доз бо повинен залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи активність конкретних застосовуваних композицій, представлених в даному описі, або їх складного ефіру, солі або аміду, шляху введення, часу введення, швидкості екскреції конкретної застосовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або продуктів, які застосовуються в комбінації з конкретними застосовуваними композиціями, віку, статі, маси тіла, стану, загального стану здоров'я і попередньої історії хвороби пацієнта, який підлягає лікуванню, і подібних факторів, добре відомих в галузі медицини.

Композицію, представлену в даному описі, можна вводити за допомогою одного або декількох шляхів введення з використанням одного або декількох з різноманітних методів, відомих в даній галузі. Як повинно бути очевидно спеціалісту в даній галузі, шлях і/або форма введення повинні варіюватися в залежності від необхідних результатів. Шляхи введення антитіл до ТКЕМ-1, представлених в даному описі, можуть включати внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньошкірний, внутрішньочеревний, підшкірний, спинальний або інші парентеральні шляхи введення, наприклад ін'єкцію або інфузію. Поняття "парентеральне введення" в контексті даного опису означає шляхи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, як правило, введення шляхом ін'єкції, і включає (але не обмежуючись тільки ними) внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, внутрішньооболонкову, інтракапсулярну, внутрішньоочну, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньочеревну, транстрахеальну, підшкірну, субкутікулярну, внутрішньосуглобову, субкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, епідуральну та інтрастернальну ін'єкцію і інфузію.

Альтернативно до цього антитіло, представлене в даному описі, можна вводити непарентеральним шляхом, таким як місцевий, епідермальний шлях введення або введення через слизову оболонку, наприклад, інтраназально, орально, вагінально, ректально, під'язиково або місцево.

Діючі речовини можна включати в препаративну форму з носіями, які захищають сполуку від швидкого вивільнення, таку як препаративна форма з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні пластирі та мікрокапсульовані системи доставки.

Можна застосовувати біорозкладні біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, складні поліортоефіри і полімолочна кислота.

Багато методів одержання таких препаративних форм запатентовані або добре відомі спеціалістам в даній галузі (див., наприклад, Зивіаіїпей апіа СопігоПей КеїЇеазе Огид Оеїїмегу

Зузіетв, під ред. У.К. Коріпзоп, вид-во Магсеї! ОеккКег, Іпс., Мем/ УогК, 19781.

Терапевтичні композиції можна вводити за допомогою медичних пристроїв, відомих в даній галузі. Наприклад, в конкретному варіанті здійснення винаходу терапевтичну композицію, представлену в даному описі, можна вводити за допомогою пристрою для здійснення безголкової гіподермальної ін'єкції, такого як пристрої, (описані 0.5. МоМо 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 або 4596556|. Приклади добре відомих імплантатів і модулів для застосування з використанням антитіл до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, включають приклади, наведені в (0.5. Мо 4487603|, в якому описаний імплантований мікроїнфузійний насос для вивільнення лікарського препарату з контрольованою швидкістю;

ІЮ.5. Мо 4486194), в якому описаний терапевтичний пристрій для введення медикаментів через шкіру; (Ш.5. Мо 4447233), в якому описаний лікарський інфузійний насос для доставки медикаменту шляхом інфузії з точною швидкістю; (0.5. Мо 4447224|, в якому описаний імплантований інфузійний апарат з варійованим потоком для безперервної доставки лікарського засобу; (0.5. Мо 4439196), в якому описана осмотична система доставки лікарського засобу, що має багатокамерні компартменти; і (0.5. Мо 4475196), в якому описана осмотична система доставки лікарського засобу. Вміст зазначених патентів включено в даний опис як посилання. Спеціалістам в даній галузі відомо багато інших таких імплантатів, систем доставки і модулів.

У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можна випускати в формі, яка забезпечує необхідний розподіл іп мімо. Наприклад, гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) перешкоджає проходженню багатьох високогідрофільних сполук. Для того, щоб забезпечити проходження терапевтичних сполук, представлених в даному описі, через ГЕБ (якщо це необхідно, наприклад, в випадку раків головного мозку), їх можна включати, наприклад, в ліпосоми. Методи одержання ліпосом описані, наприклад, в (О.5.

МоМо 4522811; 5374548 і 53993311). Ліпосоми можуть містити один або декілька фрагментів, які вибірково транспортуються в специфічні клітини або органи, підсилюючи тим самим таргетну доставку лікарського засобу |див. наприклад, М.М. Капааде, 4. Сііп. Рнаптасої. 29, 1989, с. 6851.

Приклади таргетуючих фрагментів включають фолат або біотин І(див., наприклад, 0.5. 5416016 бо на ім'я Г ому та ін.Ї; маннозиди |(телгаула та ін., Віоспет. Віорпуз. Ке5. Соттип. 153, 1988, с.

1038); антитіла (Р.О. Віоетап та ін., РЕВ5 Гей. 357, 1995, с. 140; М. Оулаї5 та ін., Апійтісгоб.

Адепіз СпетоїПпег. 39, 1995, с. 180); рецептор сурфактантного білка А |Вгізсоє та ін., Ат. ..

РПузіо!. 1233, 1995, с. 134); рі20 |ЗсНгеїег та ін., 9. ВіоЇ. Снет. 269, 1994, с. 90901; див. також |К.

Кеіпапеп, М.Г/.. І ашККапеп, РЕВ5 ГІ ей. 346, 1994, с. 123; 9.9. КіШоп, 1.9. РіаІег, Іттипотеїййовд3з 4, 1994, с. 273.

МІ. Застосування і способи

Антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, і препаративні форми, які містять такі антитіла (наприклад, фармацевтична композиція, препаративні форми, полінуклеотиди, вектори і клітини) можна застосовувати для лікування запального захворювання (наприклад, шляхом інгібування активності ТКЕМ-1).

Таким чином, один з об'єктів винаходу стосується способів лікування запального захворювання у індивідуума, який потребує цього, що включає введення індивідууму в терапевтично ефективній дозі антитіла до ТКЕМ-1. Приклади запальних захворювань, які можна лікувати за допомогою представлених в даному описі антитіл до ТКЕМ-1, включають (але не обмежуючись тільки ними) запальне захворювання кишечника (ІВО), хворобу Крона (СО), неспецифічний виразковий коліт (ШС), синдром подразненого кишечника, ревматоїдний артрит (КА), псоріаз, псоріатичний артрит, системний червоний вовчак (5ІЕ), вовчаковий нефрит, діабет типу І, хворобу Грейвса, розсіяний склероз (М5), автоїмунний міокардит, хворобу Кавасакі, захворювання коронарної артерії, хронічне обструктивне захворювання легень, інтерстиці(альне захворювання легенів, автоїмунний тиреоїдит, склеродермію, системний склероз, остеоартрит, атопічний дерматит, вітіліго, реакцію "трансплантат-проти хазяїна", синдром Шегрена, автоїммунний нефрит, синдром Гудпасчера, хронічну запальну демієлінізуючу поліневропатію, алергію, астму та інші автоїмунні захворювання, які є результатом гострого або хронічного запалення.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 можна застосовувати для лікування індивідуумів із запальним захворюванням кишечника. Запальне захворювання кишечника (ІВО) являє собою захворювання, яке може вражати будь-яку частину шлунково- кишкового тракту від рота до ануса, викликаючи широке розмаїття симптомів. ІВО викликає перш за все абдомінальний біль, діарею (яка може бути кривавою), блювоту або втрату маси, але може викликати також ускладнення поза шлунково-кишковим трактом, такі як висип на шкірі, артрит, запалення ока, втома і втрата концентрації. Пацієнтів з ІВО можна поділити на два основні класи: пацієнти з неспецифічним виразковим колітом (С) і пацієнти з хворобою Крона (СО). СО, як правило, зачіпає клубову кишку і ободову кишку, вона може вражати будь-яку ділянку кишечника, але ураження часто є вогнищевим (уражені захворюванням ділянки у вигляді вогнищ поширюються по кишечнику). ОС завжди зачіпає пряму кишку (тобто відноситься до товстої (ободової) кишки) і ураження є більш безперервним. При СО запалення є трансмуральним, приводячи до абсцесів, фістул і стриктур, в той час як при ОС, запалення, як правило, обмежується слизовою оболонкою. Для хвороби Крона не існує фармацевтичного або хірургічного одужання, в той час як деяких пацієнтів з ОС можна виліковувати шляхом хірургічного видалення ободової кишки. Можливості лікування обмежені контролюванням симптомів, підтриманням ремісії і попередженням рецидиву. Ефективність лікування запального захворювання кишечника в клінічних умовах можна оцінювати за зниженням бала СО, що розраховується за бальною шкалою індексу активності хвороби Крона (СОАЇ) на основі лабораторних тестів і анкет (опитувальника) якості життя. У випадку тваринних моделей ефективність оцінюють в основному по збільшенню маси, а також за індексом активності хвороби (ВАЇї), що розраховується на основі комбінації даних щодо консистенції випорожнень, маси тіла і присутності крові в калі.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 представлені в даному описі, можна застосовувати для лікування індивідуумів з ревматоїдним артритом. Ревматоїдний артрит (КА) являє собою системне захворювання, яке вражає якщо не весь організм, то майже весь, і є однією з таких форм артриту, які найбільш часто зустрічаються. Він характеризується запаленням суглоба, що викликає біль, ригідність, жар, почервоніння і набрякання. Таке запалення викликається запальними клітинами, які проникають в суглоби, і зазначені запальні клітини вивільняють ферменти, які можуть розщеплювати кістку і хрящ. В результаті цього зазначене запалення може приводити серед інших фізіологічних впливів до серйозного пошкодження кістки і хряща і до руйнування суглоба і серйозного болю. Вражений суглоб може втрачати свою форму і правильне розташування, що призводить до болю і втрати рухливості. У даній галузі відомо декілька тваринних моделей ревматоїдного артриту. Наприклад, у випадку моделі колаген-індукованого артриту (СІА), у мишей розвивається запальний артрит, що бо нагадує людський ревматоїдний артрит. Оскільки СІА характеризується імунологічними і патологічними особливостями, схожими з КА, це робить його придатною моделлю для скринінгу потенційних протизапальних сполук для людини. Ефективність при використанні цієї моделі оцінюють за зменшенням набрякання суглобів. Ефективність при КА в клінічних умовах оцінюють за здатністю знижувати симптоми у пацієнтів, яку оцінюють за комбінацією набрякання суглобів, швидкістю осадження еритроцитів, рівнями С-реактивного білку і рівнями в плазмі таких факторів, як антитіла до цитрулінованного білку.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, можна застосовувати для лікування індивідуумів з псоріазом. Псоріаз являє собою опосередковане Т-клітинами запальне порушення шкіри, яке може викликати значний дискомфорт. Він являє собою захворювання, яке в даний час не піддається лікуванню і яке вражає людей різного віку. Хоча індивідууми зі слабким псоріазом часто можуть контролювати своє захворювання за допомогою агентів для місцевої обробки, більше одного мільйона людей в усьому світі потребують обробки ультрафіолетовим світлом або системної імунносупрессорної терапії. На жаль, незручності і ризики, зв'язані з ультрафіолетовим опроміненням, і токсичність що притаманна багатьом терапіям, обмежують їх тривале застосування. Крім того, у пацієнтів, як правило, спостерігається рецидив псоріазу та в деяких випадках він виникає незабаром після припинення імуносупресорної терапії. Розроблена в останні роки модель псоріазу базується на перенесенні СО4"-Т-клітин, вона імітує багато аспектів людського псоріазу і тому її можна застосовувати для ідентифікації сполук, придатних для лікування псоріазу |(Оамепрогі та ін., Іпіегпаї. Іттипорпаптасої 2, 2002, сс. 653-672.

Ефективність при застосуванні цієї моделі оцінюють з використанням бальної системи за зменшенням шкірної патології. Аналогічно до цього, ефективність для пацієнтів оцінюють за зменшенням шкірної патології.

В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла до ТКЕМ-1 можна застосовувати для лікування індивідуумів з псоріатичним артритом. Псоріатичний артрит (РА) є типом запального артриту, який виникає в субпопуляції пацієнтів з псоріазом. У цих пацієнтів шкірна патологія/симптоми супроводжуються набряками суглобів, схожими з набряками, які спостерігалися при ревматоїдному артриті. Він відрізняється наявністю неоднорідних опуклих почервонілих ділянок шкірного запалення, що характеризуються лущенням. Псоріаз часто вражає згини ліктів і колін, шкіру голови, пупок і ділянки навколо геніталій і ануса. Приблизно у 10 95 пацієнтів з псоріазом розвивається також асоційоване запалення суглобів.

З точки зору даного опису профілактичне, паліативне, симптоматичне і/або радикальне лікування можуть розглядатися як окремі об'єкти винаходу. Антитіло, запропоноване у винаході, можна вводити парентерально, наприклад, внутрішньовенно, наприклад, внутрішньом'язово, наприклад, підшкірно. В альтернативному варіанті антитіло, запропоноване у винаході, можна вводити непарентеральним шляхом, наприклад, перорально або місцево. Антитіло, запропоноване у винаході, можна вводити в профілактичних цілях. Антитіло, запропоноване у винаході, можна вводити в терапевтичних цілях (на вимогу).

Представлені нижче приклади дані з метою ілюстрації винаходу, але не для обмеження його обсягу. Вміст всіх процитованих в даній заявці документів, спеціально включений до неї як посилання.

Приклади

Приклад 1: Аналіз кінетичних характеристик взаємодії варіантів антитіла 318 з ТКЕМ-1 людини і мавп циномолгус, за допомогою методу поверхневого плазмонного резонансу

Визначали кінетичні характеристики зв'язування варіантів тАБб 0318 з людським ТКЕМ-І-Ес (пТКЕМ-1) і ТКЕМ-І-Рс мавп циномолгус (СТКЕМ-1). Вивчення зв'язування здійснювали на аналізаторі РгоїеОп (фірма ВіоКад), за допомогою якого вимірювали молекулярні взаємодії в реальному часі на основі поверхневого плазмонного резонансу. Експерименти проводили при 2570 і зразки зберігали при 15 "С в компартменті для зразків. Сигнал (КИ, одиниці відповіді), вимірюваний за допомогою РгоїеОп, знаходиться в прямій кореляції з масою на поверхнях індивідуальних сенсорних чіпів в шести паралельних проточних комірках. Моноклональне антитіло до людської Ес або поліклональних антитіл до мишачої Ес з наборів для захоплення людської або мишачої Ес фірми Віасоге імобілізували в горизонтальному напрямку на проточних комірках сенсорного чіпу СІМ згідно з інструкціями виробника. Кінцевий рівень імобілізації захоплюючого антитіла відповідав приблизно 2600-6000 КО в кожному експерименті. Захоплення очищених моноклональних мишачих або рекомбінантно експресованих антитіл до ПИТКЕМ-1 здійснювали шляхом розведення антитіл до концентрації 5- 1ОнМ в рухомому буфері (10мМ Нерез, 0,15М Масі, 5мМ ЕДТК, 0,05 95 сурфактанту Р20, рн 7,4), після чого ін'єктували в вертикальному напрямку зі швидкістю 30 мкл/хв протягом 60 с, в бо результаті чого створювали проміжні референс-плями по сусідству з усіма проточними комірками, в яких було імобілізовано тільки антитіло до Ес. Це, як правило, приводило до кінцевих рівнів захоплення тестованих антитіл, які відповідають приблизно 100-300 КИ і величинам Кітах аналіту 30-90 КИ. Зв'язування білків АИТКЕМ-1 або сТКЕМ-1 здійснювали шляхом ін'єкції аналіту (антиген) в усі проточні комірки в горизонтальному напрямку для забезпечення можливості порівняльного аналізу зв'язування різних захоплених антитіл з ТКЕМ- 1 щодо зв'язування з проміжною референс-плямою. Білки АЯТКЕМ-1 або сТКЕМ-1 серійно розводили в співвідношенні 1: З в рухомому буфері, охоплюючи діапазон концентрацій 1,2- 100ОнНМ, ін'єктували зі швидкістю 100 мкл/хв протягом 250 с і давали можливість дисоціювати протягом 600 с. Поверхню СІ М регенерували після кожного циклу ін'єкції аналіту за допомогою двох ін'єкцій протягом 18 с 10мМ гліцину, рН 1,7 ії 50мМ Маон зі швидкістю 100 мкл/хв. За допомогою цієї стадії регенерації видаляли антитіло до ТКЕМ-1 і будь-який зв'язаний білок

ТКЕМ-1 з поверхні з імобілізованим захоплюючим антитілом і забезпечували можливість подальшого зв'язування наступної пари зразків, призначених для аналізу взаємодії. Процедура регенерації не приводила до видалення безпосередньо імобілізованого захоплюючого антитіла до Ес з поверхні чіпа.

Афінності зв'язування антитіл з антигеном кількісно оцінювали шляхом визначення константи рівноваги реакції дисоціації (Ко), яку визначали шляхом вимірювання кінетичних характеристик формування комплексу і його дисоціації. Константи швидкості, відповідні асоціації та дисоціації одновалентного комплексу, такі як Ка (швидкість асоціації) і Ка (швидкість дисоціації), одержували шляхом підгонки даних до моделі зв'язування Ленгмюра за типом 1: 1 з використанням для оцінки програмного забезпечення РгоїеОп, призначеного для аналізу даних.

Коефіцієнт Ко зв'язаний з Ка і Ка рівнянням Ко-Ка/Ка.

Перед здійсненням аналізу даних криві зв'язування обробляли з використанням подвійного контролю (віднімання сигналів від референс-поверхні, а також рівнів, одержаних при ін'єкції чистого буфера на захоплені антитіла до ТКЕМ-1). Це дозволяло вносити корекцію на інструментальний шум, зсув і дрейф масиву в процесі ін'єкцій зразка.

Як продемонстровано на фіг. ТА і 1Б, встановлено, що всі варіанти тАБ 0318 (а саме, 318-

Іде1.17, 318-Ід1.3ї, 318-І954-Абра і 318-І9051-Аба) мали афінність до людської ТКЕМ-1І-Ес, подібної до афінності тА 0318-І954. Варіант 0318-Ідс1.3ї зв'язувався також з ТКЕМ-1 мавп циномолгус, хоча і з дещо нижчою афінністю в порівнянні з афінністю до людського ТКЕМ-1 (див. фіг. ТА)

Приклад 2: Аналіз інтерналізації тАб 0318-І901.3ї після зв'язування з рецептором ТКЕМ-1

Варіант антитіла тАБ 0318-І951.3Ї тестували щодо його інтерналізації в первинних людських моноцитах за допомогою як лазерної скануючої конфокальної мікроскопії (дані не представлені), так і візуалізуючого проточного цитометричного аналізу з використанням системи Атпів ІтадебігеатФб). Як продемонстровано на фіг. 2А, в момент часу 0 год. ТКЕМ-1 експресувався в основному на поверхні моноцитів. Однак через 24 годин після зв'язування антитіла значний відсоток (-36 95) рецептора ТКЕМ-1 (за результатами фарбування за допомогою 0318-Ід1.3Ї) був інтерналізований, це дозволяє припустити, що після зв'язування антитіла тАБ 0318-І9ДС1.3ї весь комплекс антитіло-рецептор інтерналізований в клітину.

Потім для визначення "долі" рецептора ТКЕМ-1 після його інтерналізації застосовували антитіло ТКЕМ2б |каталожний номер 314902, фірма ВіоіІєдепа; див. О.5. Мо 20150274825, параграф| для порівняння. Антитіло ТКЕМ2б не конкурує з варіантами антитіла 0318, представленими в даному описі. Як продемонстровано на фіг. 2Б, в момент часу 20 год. спостерігалося значне зниження експресії ТКЕМ26" (51 95) в порівнянні з моментом часу 0 год.

Було виявлено також значне зменшення (4-кратне) рівня МРЇ (середній індекс флуоресценції)

ТКЕМ26: в момент часу 20 год. (після обробки тАБб 0318-І91.3Ї), це дозволяє припустити, що

ТКЕМ-1 розщеплювався після інтерналізації. Зазначене зменшення експресії рецептора ТКЕМ- 1 після впливу антитіла було оборотним, проте, це мало місце після видалення антитіла (дані не представлені).

Приклад 3: Аналіз ефективності блокування активації ТКЕМ-1 варіантами тАб 0318 за допомогою репортерного аналізу з використанням клітин ВИМА/ЛТКЕМ-1

Здатність варіантів антитіла тАб 0318 до ТКЕМ-1 інгібувати передачу сигналу людського

ТКЕМ-1 визначали шляхом аналізу з використанням лінії клітин ВУУ2.36/иТКЕМ-10АР12:МЕАТ- ас. (в даному описі позначена також як "репортерна клітина ВУУ/ЛТКЕМ-1"), описаного, наприклад, в (Ш.5. Мо 9550830 В21| і публікації міжнародної заявки на патент (МО 2016/009086

А1|. В цілому метод полягав у наступному: приблизно 40000 пПТКЕМ-1/В8УУ27.36 клітин/лунку висівали на чорний 9б-лунковий планшет з прозорим пласким дном в присутності 75 нг/мл

РОГУРКРІ (5ЕО ІО МО: 8) з 2,5 мкг/мл РОМ-ЕСпайї |(каталожний номер ІГгІ-кКірдп, фірма Іпмімодеп, бо Сан-Дієго, шт. Каліфорнія, США) для забезпечення позитивного сигналу з інтенсивністю, що становить половину від максимальної або в альтернативному варіанті в присутності субмаксимального рівня (1 мкг/мл) адсорбованого на пластику моноклонального антитіла до

ТКЕМ-1 Ікаталожний номер МАВІ1278, фірма КО Зузіетв5, Міннеаполіс, шт. Міннесота, США для забезпечення позитивного сигналу.

При проведенні аналізу варіанти тАБб 0318 (тобто 0318-Ід01.37; 0318-Ід01.17; 0318-Ідс1-Аба і 0318-Іід4-Аба) титрували, починаючи з концентрації 10 мкг/мл, використовуючи 5 серійних 2- кратних розведень. Аналізований зразок інкубували протягом ночі при 37 "С, потім виявляли з використанням Веїа біо |каталожний номер Е4740, фірма Рготеда, Медісон, шт. Вісконсін,

США) згідно з протоколом для Веїа Сіо і реєстрували люмінесценцію. За результатами будували графік залежності інтенсивності люмінесценції Вега Сіо (в відносних одиницях) від концентрації антитіла. На кожному планшеті для аналізу тестували використовуваний як негативний контроль, що не має нейтралізуючої здатності тідс1 (каталожний номер МАВОО2, фірма КУ УО Зузіет5, Міннеаполіс, шт. Міннесота, США) і використовуване як позитивний контроль, що має нейтралізуючу здатність поліклональне козяче антитіло до ПРОЇ УКР1

Ісаталожний номер АБЕ2590, фірма К 50 Зузіет5, Міннеаполіс, шт. Міннесота, СШАЇ. Як позитивний контроль використовували також антитіло МАВ1278 (каталожний номер МАВ1278, фірма КУО Зузіетв5; див. 05 Мо 20150274825, параграфі, відомий агоніст передачі сигналу

ТКЕМ-1 (див. прямокутну вставку).

Як продемонстровано на фіг. 3, всі варіанти тАБб 0318 були сильними інгібіторами передачі сигналу людського ТКЕМ-1, що було описано раніше для антитіла тАб 0318 Ід04 в публікації міжнародної заявки на патент (МУО 2016/009086 АТ1..

Приклад 4: Аналіз іп мійго ефективності варіантів антитіла тАбБ 0318 щодо інгібування опосередковуваного ТКЕМ-1 продукування прозапальних цитокінів різними первинними людськими клітинами

Для додаткової оцінки антагоністичних властивостей варіантів антитіла тАб 0318 кКТКЕМ-1 аналізували їх ефективність щодо блокування вивільнення різних прозапальних цитокінів (наприклад, ТМЕ-а, І/-6 або І/-8) активованими людськими первинними клітинами. Первинні моноцити, нейтрофіли і мононуклеарні клітини периферійної крові (РВМС) виділяли з людської цільної крові і стимулювали імобілізованим на планшеті РОКРІ1 і розчинним пептидогліканом (РОМ-ЕСпазв; форма пептидоглікану, яка не має ТІ К2-активності).

Як продемонстровано на фіг. 4, всі варіанти тАБб 0318 (тобто Ідс1.3ї, Ідсе1.17, Ідс1-Аба і

Ід54-Ара) виявилися ефективними щодо інгібування (величини ІС5о знаходились в діапазоні -10-20пМ) опосередковуваного ТКЕМ-1 вивільнення ТМЕ-с із РВМС і моноцитів. Ефективність зазначених варіантів тАБб 0318 була схожою з ефективністю антитіла тАБб 0318-Ід04. Антитіло тА 0318-ІД01.37ї мало ефективність також і щодо інгібування продукування І1ІІ/-6 (величина

ІСво-32пМ). У випадку нейтрофілів варіант тАбБ 0318-І901.3Ї мав більш високі в порівнянні з антитілом тАБ 0318-54 характеристики щодо блокування опосередковуваного ТКЕМ-1 продукування 1-8 нейтрофілами (див. фіг. 4).

Для додаткової демонстрації антагоністичних властивостей варіантів антитіла тАбБ 0318 до

ТКЕМ-1 застосовували також аналіз спільної культури моноцитів-нейтрофілів. Асоційований з нейтрофілами РОКРІ при спільному культивуванні з моноцитами може зв'язуватися з рецепторами ТКЕМ-1, приводячи до продукування моноцитами ТМЕ-а. Як продемонстровано на фіг. 4, всі варіанти антитіла тАб 0318 ефективно блокували зазначену ендогенну активацію (величини ІСсо знаходились в діапазоні 19-44пМ). Схожі результати були отримані для цільної крові з осадженими КВС (див. фіг. 4).

Приклад 5: Аналіз іп міго ефективності тАб 0318-І91.37 щодо блокування продукування ЇЇ - 8 в стимульованій цільній крові

Однією з головних проблем при розробці аналізу фармакодинаміки в цільній крові (ФД) для оцінки антагоністичних властивостей варіантів антитіла до ТКЕМ-1 є високий вихідний рівень, обумовлений РОМ-стимуляцією. Для полегшення вирішення цієї проблеми цільну кров стимулювали заздалегідь сформованим комплексом РОКР1-РОМ в присутності інгібітора МО02 (для того, щоб блокувати вихідні цитокіни, продуковані в результаті РОМ-стимуляції МОЮ).

Рівні І-8 вимірювали за допомогою стандартного фармакодинамічного аналізу зв'язування ліганда (НТРЕЄ) (фіг. БА) або аналізу внутрішньоклітинного фарбування цитокінів (ІС5) (фіг. 5Б).

Як продемонстровано на фіг. 5А і 5Б, антитіло 0318-І951.3ї ефективно блокувало опосередковане ТКЕМ-1 продукування 1І/-8, що характеризувалося відсотком інгібування, що становило 60-9095 (див. фіг. 5А). Виміряні величини ІСхо (середнє значення 12п1М при використанні НТКЕ і 19,бпМ при використанні ІС5) виявилися схожими з величинами, отриманими із застосуванням інших функціональних аналізів (див., наприклад, приклад 4). бо Приклад 6: Аналіз іп міго ефективності тАБб 0318-ІД21.3Її щодо блокування експресії мРНК різних медіаторів запалення в стимульованій цільній крові

Для додаткової демонстрації антагоністичних властивостей тАбБ 0318-І951.37 вимірювали рівні експресії деяких медіаторів запалення (тобто хітиназа-3-подібного білку 1 ("СНІЗІ 17), 1р і

І-6) за допомогою ПЛР в реальному часі (КПЛР). В цілому метод полягав у наступному: зібрану в пробірки з ЕОТА людську цільну кров трьох здорових добровольців (донори Мо 126, 290 і 322) стимулювали заздалегідь включеними в комплекс ПРОКРІ (50 мкг/мл) і РОМ-ЕСпавзз (10 мкг/мл) (фірма Іпуиімодеп, каталожний номер гі-Ккезрдп) протягом ночі в присутності тАб 0318-І951.3ї в різних концентраціях (0-ї1НМ). Після стимуляції плазму видаляли і заморожували для вимірювання рівнів цитокінів. Із зразків виділяли мРНК з використанням набору МадМах-96

Віоса ІзоїЇайоп (фірма Тпептогїізпег, каталожний номер АМ1837) згідно з протоколом виробника.

Потім виділену мРНК перетворювали на кДНК з використанням майстер-суміші Зирегзспрі МІГ О (фірма Тпегто РізПпег, 11755250). Після цього здійснювали ДРУК із застосуванням таких зондів:

НРЕТІ (Нз99999909 т1) (фірма Тнпегто Різпег, 4351370), СНІЗІ 1 (Нез01072228 ті) |фірма

ТВпепто Різпег, 43311821, 18 (Не00174097 т1) |фірма ТНегто Різпег, 43311821) і 116 (Н5З00985639 т!) |фірма Тпепто Різпег, 43311821) і універсальної майстер-суміші ТадМап Еаві (2х) |фірма ТПегто Різпег, 43660721. Рівні генної експресії стандартизували щодо рівня зонда

НРЕКТІ і отримували величини ЛАСТ. Потім за результатами будували графік і визначали величини ІСво.

Як продемонстровано на фіг. бА-68, і відповідно до результатів, представлених в наведених вище прикладах, тАб 0318-ІДС1.3ї мало здатність інгібувати опосередковану ТКЕМ-1 експресію різних медіаторів запалення в людській цільній крові. Встановлено, що інгібування залежало від дози. Величини ІСсо наведені нижче в таблиці 1.

В сукупності, представлені вище результати демонструють, що варіанти антитіла тАбБ 0318, представлені в даному описі, мають антагоністичну дію і можуть ефективно блокувати опосередковане ТКЕМ-1 продукування прозапальних цитокінів різними людськими клітинами.

Таблиця 1 як | | сни 0 ОД ип клітин . Стимул медіатор ІСво (ПМ) розчинний РОВР з цільна кров розчинний РОМ-

Еспав5

Приклад 7: В'язкість варіантів тАб 0318

У зразку замінювали буфер і здійснювали діаліз з використанням вибраного складу (20ММ гістидин, 150мМ цукроза, 25мМ аргінін, 50мММ хлорид натрію, рН 6,0), після чого концентрували з використанням центрифужних фільтрів фірми Атісоп ОКга з відсічкою за молекулярною масою.

Агрегаційний стан зразків оцінювали за допомогою гель-фільтрації для контролю можливих змін мономірності, якщо вони мали місце, після концентрування. Залежність в'язкості від концентрації визначали за допомогою віскозиметра для розчину КПеобЗепзе т-МкКос, здійснюючи для кожної аналізованої концентрації вимірювання зростаючих зсувних зусиль за З точками. Концентрацію визначали на основі вимірювання абсорбції при 280 нм за допомогою приладу папоОгор із застосуванням серійних розведень і екстраполяції.

Як продемонстровано на фіг. 7, обидва варіанти 318-Ід(1.17 і 318-І9С1.3ї мали схожий профіль в'язкості. При концентрації приблизно 130 мг/мл варіант 0318-ІдС1.3ї мав величину в'язкості приблизно 9 сП. Такий профіль в'язкості близький до профілю, визначеного раніше для тА 0318-Ід4 І|див. публікацію міжнародної заявки на патент М/О 2016/0090861.

Приклад 8: Імуногенний потенціал варіантів тАБ 0318

Як продемонстровано на фіг. 8 і в таблиці 2 (нижче), варіанти 318-Ідс1.17 і 318-Ід1.3ї характеризувалися ризиком імуногенності для хворих людей від низького до середнього. Тільки приблизно 22-30 95 донорів давали імуногенні відповіді (які оцінювали за проліферацією іп міго сра Т-клітин) на зазначені антитіла. Імуногенність варіантів 0318-Ід51-Аба і 0318-І954-Аба становила 10 9; і 42.5 95 відповідно (див. таблицю 2 (нижче)). На відміну від цього, варіант тАб 0318-Ід054 виявився набагато більш імуногенним (5595) для хворих людей. КІН (гемоціанін лімфи равлика) і МІ Є (МАт до ІІ -21К), які застосовували як позитивні контролі, мали високу імуногенність для хворих людей (100 95 і 40 95 відповідно).

Таблиця 2 . Варіант конц. |Клітина- Фо Конц. в . .

Аналіз | Когорта 0318 (мг/мл) хазяїн ЕШ/мг мономе аналізі /|95 імуногенності ра (мкг/мл)

Приклад 9: Аналіз зв'язування варіантів тАБ 0318 з ЕсКп методом поверхневого плазмонного резонансу (5РЕК)

Для визначення того, чи мають різні варіанти тАБб 0318 здатність зв'язуватися з ЕсКап, здійснювали імобілізацію рецепторів ЕсКп (мишей, людини і мавп циномолгус) на біосенсорному чипі СМ5 ВіАсоге |фірма СЕ Неаййсаге Віозсіепсе, Уппсала, Швеція| за допомогою амінного сполучення до досягнення рівня, який відповідає 400 одиницям відповіді (КО). Аналіз проводили при кімнатній температурі з використанням ЗФР, 0,05 95 Ту"'ееп-20"7, рн 6,0 (фірма СЕ Неайсаге Віозсіепсе) як рухомого буферу і буферу для розведення. Різні варіанти тА 0318 (200Нм) ін'єктували зі швидкістю потоку 50 мкл/хв при кімнатній температурі і рН 6,0. Час асоціації становив 180 с, фаза дисоціації (також при рН 6,0) займала 360 с.

Регенерацію поверхні чіпу до повернення до вихідного рівня здійснювали шляхом короткочасної ін'єкції 50ММ Трис, рН 8,0 ії 150мМ Масі. Аналіз 5РК-даних проводили шляхом порівняння висоти сигналу біологічної відповіді через 180 с після ін'єкції і через 300 с після ін'єкції.

Відповідні параметри представляли собою максимальний рівень в КО (КИ тах) (через 180 с після ін'єкції) і пізній рівень стабільності (через 300 с після завершення ін'єкції).

Як продемонстровано на фіг. 9А і 9Б, всі варіанти антитіла тАБб 0318 (І9051-Аба тод, Ідс4-

Ара тод, 901.17 ї Ід01.3) мали здатність зв'язуватися з ЕсКп людини, мишей і мавп циномолгус в залежності від рН. Це мало місце також і для антитіла тАБб 0318 (Ід).

Приклад 10: Аналіз зв'язування варіантів тАб 0318 з одним або декількома Есук

Як зазначено вище, введення іп мімо антитіл до певних рецепторів на поверхні імунних клітин може індукувати вивільнення цитокінів, що може призводити до індукції загального і токсичного клінічного ускладнення, відомого як синдром вивільнення цитокінів (СК5). Через побоювання, що участь ЕсукК в результаті перехресного зшивання може приводити до можливого прояву агоністичної активності ТКЕМ-1, антитіло тАБб 0318-Ід54 перетворювали на один з варіантів форматів, представлених в даному описі (тобто ІЇдс1.17, Іде1.37, Ідс1-Аба або

Ідо4-Аба). Потім оцінювали здатність варіантів антитіла 0318 до зв'язування з різними Есук.

Як продемонстровано на фіг 10А ії 10Б, варіанти 318-ІдС1.17 і 318-І91.3ї характеризувалися мінімальним зв'язуванням з усіма Есук (тобто Есук!І (СО64), ЕсукКПА (варіанти СОЗ2а-НІ131 ї СО32а-К131), ЕсукІ!В (СО325), ЕсукКПША (варіант СО1ба-М158) і ЕсумІВ (варіант СО16Б-КМАЗ2)). Варіанти 318-Ід01-Аба і 318-І954-Абра не зв'язувалися з ЕсукІА, ЕсуКІЇІВ,

ЕсСУКІША і БсуКкПІВ, але зв'язувалися з ЕсукІ. На відміну від цього, тАБ 0318 (Ід04) характеризувався значним рівнем зв'язування з усіма Есук.

Приклад 11: Аналіз індукції прозапальних цитокінів варіантами тАбБ 0318

Для подальшого визначення того, чи приводить обробка іп мімо варіантами тАБ 0318 до ризику виникнення синдрому вивільнення цитокінів, збирали цільну кров у 8 донорів і виділяли моноцити. Потім моноцитам давали диференціюватися в незрілі дендритні клітини, висіваючи моноцити (4х105 клітин/лунку) і культивуючи їх в середовищі для диференціювання, яке містить

І/-4 ї еМ-С5Е (100 нг/мл). Приблизно через 2-3 дні після посіву приблизно половину середовища для диференціювання замінювали свіжим середовищем. У день 7 клітини збирали і оцінювали ефективність диференціювання шляхом аналізу експресії СО14 на клітинах за допомогою проточного цитометра. Потім незрілі дендритні клітини висівали на плоскодонний планшет (0,8х105 клітин/лунку) і у відповідні лунки додавали варіанти тА 0318 (які містять або не містять СНО-СОЗ2а). Незрілі дендритні клітини, стимульовані РОКРАРОМ, використовували як позитивний контроль. Потім клітини інкубували протягом ночі при 37 "С. На наступний день збирали супернатанти з лунок і оцінювали кількість продукованого ТМЕ-а, І/-б і 11-12 за допомогою ЕГІ5А.

Результати, отримані для репрезентативних донорів, представлені на фіг. 11А-11И.

Додавання різних варіантів тАб 0318 (0318-І901.1ї, 0318-І901.31 ії 0318-Іі951.1 Аба) приводило до мінімального продукування ІІ -6 (фіг. 11А, 1165 і 118), ТМЕ-са (фіг. 11Г, 11 Ді 11ЄЕ) ї 11-12 (фіг. 11Ж, 113 ї 11К) незрілими дендритними клітинами. Ці результати, поряд з отриманими в прикладі 9, свідчать про те, що антитіла до ТКЕМ-1, представлені в даному описі, характеризуються низьким ризиком індукції синдрому вивільнення цитокінів при введенні пацієнтам іп мімо.

Приклад 12: Додаткові характеристики варіантів тАБ 0318

Біофізичні характеристики варіанту 0318-ІДС1.3ї наведені нижче в таблиці 3.

Таблиця З

Біофізичні характеристики антитіла до ТКЕМ-1 0318-І951.3

РХ-МС Підтверджена інтактна маса . Пептидне Послідовність підтверджена за допомогою дентичність . й картування методом|пептидної карти з використанням іу5-С (вихід

РХ-МС/МС 95,4 У; ступінь глікозилювання 99,7 95) мономер 96,3 95, НМУМ 3,6 95 ст о -

ЗЕС-МАІ 5 МИ пік - 95 95 мономера і є гомогенним (145

РХ-МС СОР (23,3 95), С1Е (51,3 95), 52 (17,3 95), З62Е (2,1 У), 5202 (1,0 95) капіляр не не Основний пік рі-8,75 (5595); кислотні варіанти -

Чистота/гомогенність р 29,5 95 і основні варіанти - 15,5 95 фокусування (СІЕЕ)

В відновлюючих умовах: 2 основні смуги «50 кДа і 25 кДа

ДСН-ПААГ в невідновлюючих умовах: основна смуга -150 кДа з мінорними фрагментами -98 кДа, 75 кДа, 50 кДа, 25 кДа (артефакти, обумовлені умовами ДеНн- розгонки) пиТКЕМТІ: 2. . Ко-0,91нМ; Коп-1,4 Е06 (1/Мс); Кон-1,3 Е-3 (1/с)

Афінність ЗРЕ (Віасоге) СупоТРЕМІ:

Ко-3,4нМ; Коп-4,0 Е 05 (1/Мс); Кок-1,4 Е-3 (1/с)

Термостабільність /О5С Тт1-66,2 С; Тп2-78,4 С; Тт3-83,27С р Оборотність при 77 "С становить 24 95

Продемонстрована знижена здатність до

Взаємодія . зв'язування з усіма Есук

Есук/ЕсКап ЗРА (Віасоге) Очікуване рН-залежне зв'язування ЕсКп можна порівняти зі зв'язуванням МАт ІдС1 дикого типу

Для клінічних розробок біофізичні характеристики варіанту тАБ 0318-І9с1.37 є кращими.

Ідентичність антитіла була підтверджена за допомогою мас-спектрометричного аналізу (аналіз інтактної маси і пептидне картування). За даними аналізу методом гель-фільтрації » 96 95 антитіла знаходилося в формі мономера. Була підтверджена наявність одного сайту М- глікозилювання на М301 важкого ланцюга, профіль гліканів відповідав профілю гліканів експресованих СНО моноклональних антитіл (СОЕ, С1Е і С2Е). Термостабільність (Тт1-66,2 270;

Тт2-78,4 С; Ти3-83,2 С) і оборотність при нагріванні (24 95 при 77 С) тАБ 0318-ІД051.3 знаходилися в діапазоні, характерному для типового людського моноклонального антитіла

ІдО1.3.

Характеристики стабільності варіанту тАБб 0318-І9С1.3ї наведені в таблиці 4 (нижче).

Таблиця 4

Стабільність антитіла до ТКЕМ-1 0318-ІЇ91.3

Заморожування/відтаювання УФ, ЗЕС, 0І5|Не виявлено ризику для стабільності при

С год. при -80 С, 4 год. при ІСІЕЕ заморожуванні/відтаюванні . . »150 мг/мл в буфері для композиції (20мММ 25ММ аргінін, рН 6,0)

Оріїт2

Вибір значення рН, що) (температури Оптимальна конформаційна стабільність при забезпечує конформаційну і плавлення ії рн 6-8 колоїдну стабільність початку агрегації Оптимальна колоїдна стабільність при рН 5-6

Тт і Тадд)

Оріїт2

Вибір буфера і ексципієнтів (температури і Стабілізатори: цукроза, сорбіт, аргінін (висока 4 концентрація), гліцерин початку агрегації

Тт і Тадо)

ЗЕС, сіЕКЕ, НІС,

Прискорений тест на РХ-МС/МС 12 тижнів при 40 "С: збільшення вмісту НМУМ стабільність 150 мг/мл 12) (пептидне на 1,2 Уб/місяць збільшення вмісту ГМУМ на тижнів при 4 "С, 25 70 і 40" Сі картування), 2,4 У/місяць в буфері для композиції РХ/МС (інтактна|!12 тижнів при 40 "С: збільшення Кп і Ра 12 (20ММ гістидин, 150мМ)| маса), 20-РХ/МСЇ| тижнів при 40 "С: збільшення вмісту кислотних цукроза, 50ММ хлорид! (фрагменти), варіантів на 11 95/місяць 12 тижнів при 40 "с: натрію, 25мМ аргінін, рН 6,0) | Віасоге, біоаналіз, дезамінування М5МК на З 9б/місяць

УФ-Мі5, БІ 5

В ДЕ оці , . профілю В'язкість розчину досягає 9 сП при «130 мг/мл, цінка в'язкості . є концентрація- передбачена в'язкість 12 сП при 150 мг/мл в'язкість

Не було виявлено зв'язаних з фізичною стабільністю проблем при проведенні експерименту на стрес при заморожуванні-відтаюванні (3 цикли) при концентрації 150 мг/мл в буфері описаного складу (20мМ гістидин, 150мМ цукроза, 50ММ хлорид натрію, 25мМ аргінін, рН 6,0).

Тести на прискорену деградацію даної композиції в концентрації 150 мг/мл проводили при 4, 25 і 40 С (протягом періоду часу аж до З місяців). Хімічні модифікації СОК залишалися на низькому рівні при всіх температурних умовах і не впливали на активність за даними аналізу методом ЗРК. Дезамінування М5МК було нижче очікуваного рівня в порівнянні з іншими моноклональними антитілами з каркасом Ідс1.3ї (збільшення на 3 95/ місяць в умовах зберігання при 40 С), зміни залежали від часу і температури. Всі інші хімічні модифікації (окиснення, дезамінування, ізомеризація) також залишалися на низькому рівні при спостереженні в процесі проведення тестів на стабільність. Слід зазначити, що в умовах зберігання при 40 "С виявлено утворення як НМУУ-варіантів, так і Г/ММу-варіантів (зі швидкістю 1,2 95 / місяць і 2,4 Фо/місяць відповідно). Виявлені зміни залежали від часу і температури, так кількість НМУМ зростала на 0,25 Уб/місяць, а кількість ПМУУ залишалася незмінною в умовах зберігання при 4 "С протягом періоду дослідження. Низьке утворення ГМУМ в умовах зберігання при 40 "С класифікували на основі вимірювань методом 20-РХ/МС і точних вимірювань маси з високою роздільною здатністю як результат накопичення видів з втраченим 1 Раб, а також ЕБар- плечем, ймовірно в консервативній послідовності у верхній шарнірній ділянці.

Приклад 13: Вивчення ФК/ТК/ФД варіанту тАБб 0318-І9ДО1.3ї на мавпах циномолгус

Проводили вивчення фармакокінетичних (ФК), токсикокінетичних (ТК) і фармакодинамічних (ФД) характеристик антитіла до ТКЕМ-1 0318-І901.3Ї при його однодозовому введенні мавпам циномолгус. Деяким тваринам (п-3) вводили внутрішньовенно антитіло 0318-І901.3 в дозі 2 мг/кг. Іншим тваринам вводили підшкірно антитіло 0318-І9Д1.37 в одній з наступних доз: (І) 0 мг/кг (тобто контроль) (п--4), (ІІ) 0,1 мг/кг (п-:4), (ІІ) 0,5 мг/кг (п-:4), (ІМ) 2 мг/кг (п-3) або (М) 10 мг/кг (п-4). Після введення антитіла аналізували в заздалегідь визначені моменти часу фармакокінетичні характеристики, наявність антитіл до лікарського засобу (АБА), окупацію рецептора ТКЕМ-1 (КО) та фармакодинамічні відповіді ех мімо.

Фармакокінетичні характеристики (ФК)

Для оцінки фармакокінетичних характеристик визначали концентрацію антитіла 0318-І951.3ї в сироватці тварин за допомогою аналізу зв'язування ліганда з використанням біотинілювання рекомбінантного білка ТКЕМ-1 як захоплюючого реагента і такого, що надходить у продаж поліклонального козячого антитіла до ТКЕМ-1 як реагенту для виявлення.

Як продемонстровано на фіг. 12, встановлено, що фармакокінетичні характеристики антитіла 0318-Ідс1.37 були нелінійними в діапазоні концентрацій від 0,1 до 10 мг/кг, головним чином внаслідок мішень-опосередкованого кліренсу (тобто інтерналізації і деградації антитіла після зв'язування з рецептором ТКЕМ-1; див. приклад 2).

Одержані за допомогою некомпартментного аналізу ФК-параметри представлені в таблицях 5 (внутрішньовенне введення) і б (підшкірне введення). В цілому результати полягали в наступному: 100-кратне збільшення дози приводило до 830-кратного збільшення експозицій в сироватці (АОС) (див. таблицю б). Кліренс в організмі мавп після введення ІМ дози 2 мг/кг становив 0,1-0,02 мл/ч/кг і був схожим з кліренсом інших МАт у вигляді ЇдО1 (див. таблицю 4).

Величина Ме5 при 36-55 мл/кг була схожа з об'ємом плазми, що свідчило про обмежений екстраваскулярний розподіл. Час напіввиведення антитіла 0318-І901.37 зростав з 2 днів при введенні дози 0,1 мг/кг до 10 днів при введенні доз 2 і 10 мг/кг (підшкірне введення одноразової дози) (див. таблицю 6). Біодоступність антитіла 0318-Ідс1.31 після підшкірного введення (2 мг/кг) була високою і становила 84 95.

Таблиця 5

ФК-параметри ітАБ 0318-І901.3 після ІМ-введення одноразової дози мавпам циномолгус

ФК-параметри ітАбБ 0318-І901.3 після ІМ-введення мавпам циномолгус

Таблиця 5

ФК-параметри тА 0318-І901.37 після 5С-введення одноразової дози мавпам циномолгус

Би

ЗС-введення . - 3/4 (2/4) 4/4, (2/4) 3/3 (2/3) 3/4 (1/4) проаналізовані " кількість мавп, у яких виявлені персистентні АВА, серед усіх проаналізованих.

Антитіла до лікарського засобу (АБА)

У той час як АБА були виявлені в сироватці більшості мавп (у 16 з 18) після введення одноразової дози (незалежно від шляху введення), у більшості АЮОА-позитивних тварин не було виявлено негативного впливу на експозицію антитіла 0318-Ід1.37 і окупацію рецептора ТКЕМ-1

(КО) (див. таблиці 4 і 5). Прискорене зниження кінцевої експозиції антитіла 0318-Ідс1.31, яке супроводжувалося формуванням АБА, було виявлено тільки у двох мавп (у одній в групі, обробленій дозою 0,1 мг/кг, в день 7 і у однієї в групі, обробленій дозою 0,5 мг/кг, в день 21).

Внаслідок того, що АБА вплинули на експозицію у цих двох мавп на кінцевій фазі, відповідні дані були виключені з ФК-аналізу.

Окупація рецептора ТКЕМ-1 (КО) і загальні рівні рецептора ТКЕМ-1

Потім оцінювали окупацію рецепторів ТКЕМ-1, які експресуються на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові. Як продемонстровано на фіг. 15А і 156, для всіх протестованих доз відсотки окупованих рецепторів ТКЕМ-1 (тобто зв'язаних з антитілом до

ТКЕМ-1) на моноцитах і гранулоцитах були схожими. Крім того, виявилося, що тривалість окупації рецептора залежала від введеної тваринам дози антитіла 0318-І901.3Ї. У випадку дози 0,5 мг/кг рівень КО, який становив 285 95, спостерігався протягом періоду часу аж до 2 тижнів після введення антитіла. На відміну від цього, в випадку доз 2 і 10 мг/кг рівень окупованих рецепторів ТКЕМ-1, який становив 2 8595, зберігався протягом принаймні 1 місяця після введення.

Після введення доз антитіла 0318-І91.31 загальні рівні рецептора ТКЕМ-1 знижувалися як на моноцитах, так і на гранулоцитах (див. Фіг. 14А і 14Б). Як описано раніше, таке зменшення обумовлено головним чином підвищенням оборотності рецептора після зв'язування з антитілом.

Зниження експресії рецептора ТКЕМ-1 на поверхні було оборотним і тривалість втрати рецептора на поверхні корелювала з тривалістю окупації рецептора принаймні при вивчених рівнях доз.

Встановлено, що рівні розчинного ТКЕМ-1 (ЗТКЕМ-1) підвищувалися в 10-50 разів після введення одноразової дози варіанту тАБб 0318 тАБ-Ідс1.37 у всіх протестованих оброблених дозою групах (дані не представлені). Залишилося нез'ясованим, чи пов'язане підвищення рівнів 5ТКЕМ-1 з введенням антитіла до ТКЕМ-1 або із загальними умовами тримання тварин в процесі дослідження. У будь-якому випадку, оскільки концентрації лікарського засобу набагато перевищували (21000 раз) рівні ЗТКЕМ-1, не можна припустити, що розчинна мішень впливала на зв'язування варіанту тАБб 0318 тАБ-ІдС1.3ї з ТКЕМ-1 на клітинній поверхні.

Приклад 14: Вивчення ФК/ТК/ФД варіанту тАб 0318-І901.3 в організмі мавп циномолгус на основі 2-компартментної моделі ФК з ТМОО в центральному компартменті

Дані про ФК, КО, загальні рівні рецептора і ФД в організмі мавп аналізували з використанням 2-компартментної моделі ФК з таким, що насичує мішень-опосередкованим розподілом лікарського засобу (ТМОЮ) в центральному компартменті для їх акомодації до спостережуваних в експерименті нелінійних ФК (див. приклад 12 і фіг. 13). Для опису ФД- відповіді застосовували модель інгібування прямої дії. Ця модель дозволяла ефективно описувати залежність від часу ФК/КО/ФД, що спостерігається у мавп. Спостережувані в дослідженні (незафарбовані кола) і передбачені на основі моделі кінцеві точки (суцільна лінія) представлені на фіг. 16А (0,1 мг/кг, підшкірне дозування) і 16Б (10 мг/кг, підшкірне дозування). У таблиці 7 представлені встановлені ФК/ФД-параметри. Коли дані про експозицію в сироватці варіанту тАБб 0318-Ідс1.3гі КО ТКЕМ-1 об'єднували для всіх мавп, було виявлено залежне від концентрації підвищення КО (див. фіг. 16А і 16Б). На основі моделі Етах, яку застосовували для опису залежності концентрація-КО, встановлена величина ЕС5о КО іп мімо становила 1,6-0,2нМ.

Таблиця 7

Оцінки параметрів моделі ФК/ФД, яка застосовується для опису

ФК/ГК/ФД-даних у мавп і оцінки прогнозованих параметрів у людини

Оцінка на основі | Прогнозована

ФК-параметри Опис цино-моделі (оцінка параметрів (СМоб) для людини компартменті центрального компартмента

Ка) 7111111111111111111002203 | 004 щ (Об) 0 |Біодоступністьпри ХС-введенніїд/- | 8005) | 80 г

Таблиця 7

Оцінка на основі | Прогнозована

ФК-параметри Опис цино-моделі (оцінка параметрів (СМоб) для людини

Кдед(п-ї) Константа швидкостіобороту | 009(20) | 009 комплексу мішень-МАт компартменті

Концентрація, необхідна для інгібування

ІСБО (НМ) опосередкованої РОМАРОКР стимуляції 1,9 (92) 01 ех-мімо ТКЕМ-1 на 50 90

Вихідна опосередковувана РОМАРОКР . значення) введенням дози)

Таблиця 8

ЕМО! МЕБООСОІ МОРОСБІ КІ ХСААБСЕТЕЗ ТУАМНУУМКОАБОКОЇ ЕМУМО

КІКТК5ЗМУАТУУААЗУКОКЕТІЗКООЗКМТАМІ ОММ5І КТЕОТАУУУСТКО

МОІККОРАМУУСОСТІ МІМЗ55АЗТКОРБМЕРІ АРЗЗКОТЗООСТААГ ОСІ КО 318-і901.3Ї ХЕРЕРМТУЗУМЗОАГСТЗОМНТЕРАМІО55ОЇ У51 55УМТМРБЗЗБІСТО ТИС важкий ланцюг МУМНКРУМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕАЕСАРБМРНІ ЕРРКРКОТІ.

МІЗКТРЕУТСМУМОМ5ЗНЕОРЕУКЕМУ УМОСМЕМНМАКТКРКЕЕОУМТУК

МУБМІ ТМ НОБУМ МО КЕУКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРКЕРОМУТІ РР

ЗКЕЕМТКМОМУ5І ТС МКОЕУРЗВІАМЕЖМЕЗМОСОРЕММУКТТРРМІ О5ОСЗЕ

ЕсУЗКСТУОКЗКУМООЄММЕЗСЗММНЕАСНМНУ ТОКЗІ 5І. РОК

МОІККОРАМУСОСТІ МТІМЗ5АЗТКОРБМЕРІ АРЗБЗКЗТЗООСТААГ ОСІ КО 318-901. ХЕРЕРМТУЗУМЗОАГСТЗОМНТЕРАМІО55ОЇ У51 55УМТМРБЗЗБІСТО ТИС 51 важкий ланцюг МУМНКРУМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕАЕСАРБМРНІ ЕРРКРКОТІ.

МУБМІ ТМ НОБУМ МО КЕУКСКМУЗМКАЇ РЗБІЕКТІЗКАКООРКЕРОМУТІ РР

ЗКЕЕМТКМОМУ5БІ ТС МКОЕУРЗВІАМЕЖМЕЗМСОСОРЕММУКТТРРМІ ОЗОСЗЕ

МОІККОРАМУСОСТІ МТІМЗ5АЗТКОРБМЕРІ АРЗЗКОТЗООСТААГ ОСІ КО 318-Ідс1-Аба ХЕРЕРМТУЗУМЗОАГСТЗОМНТЕРАМІО55О1 51.55 МРБЗЗБІСТО ТИС 52 важкий ланцюг МУМНКРУМТКМОКАМЕРКЗСОКТНТЗРРЗРАРЕЇТЇ О55МБІ ЕРРКРКОТІ.

ЗКОЕСТКМОМУБІ ТС МКОСЕУРЗВІАМЕЖМЕЗМООРЕММУКТТРРМІ О5ОСЗЕ

ЕсУЗКСТУОКЗКУМОООММЕЗСЗММНЕАСНМНУ ТОКЗІ 5І. РОК

КІКТК5ЗМУАТУУААЗУКОКЕТІЗКООЗКМТАМІ ОММ5І КТЕОТАУУУСТКО 318-і964-Ава МОІККОРАМУСОСТІ МТІМЗ5АЗТКОРБМЕРІ АРСЗБКЗТ5Е5ТААЇ ОСІ МКО 53 важкий ланцюг ХЖЕРЕРМТМБУУМ5ОАГТЗОМНТЕРАМІ О550І 51 55ММТМРБЗЗБІСТКТУТ

СММОНКРЗУМТКМОКАКМЕРКЗСОКТНТ5ОРРЗРАРЕЇ І ОО55УБІ ЕРРКРКОТ

ГЕМІЗКТРЕМТСМУММОМЗНЕОРЕМКЕМУУМОСМЕМНМАКТКРКЕЄєОУМЗТУ

ЕММБМІ- ТМ НОБУМ-МОКЕХКСКМУМЗМКАГРАРІЕКТІЗКАКОСОРКЕРОМУ ТІ Р

Таблиця 8 т

РЗКОЕСТКМОМУБІ ТС МКОСЕУРЗВІАМЕЖЕЗМООРЕММУКТТРРМІ О5065

ЕРСМЗКСТМОК5КУМООСММЕЗСЗММНЕАСНМНУТОКБІ БІ РОК 3184913 ВІМ-ТО5РОБІАМ5І СЕКАТІМСКАЗОЗМОТЕРОУЗЕСНУУООКРООРРКИІГІ

ІС т | с1- УКАБМГЕБОМРОКЕЗОЗОЗОТОРТ ТІВ ОАДЕОМАМУУСООБМООРУТЕО 54 два І СА два ОСТКГЕІККТМААРБМЕЇЕРРБЗОБЕОЇ К5ОТАБМУМУСІ СММЕУРКЕАКМОМКМО легкий пан юг МАГОБОМЗОЕБМТЕООБКОБЗТУБІ 55 ТІ ЗКАОУЕКНКМУАСЕМТНОСІ 5

ЦюГ | 5РУТКБЕМВСЕС

Дана заявка РСТ претендує на пріоритет попередньої заявки на (патент США 62/6516051|, зареєстрованої 2 квітня 2018 р., повний вміст якої включений в даний опис як посилання.

Перелік послідовностей «110» БРІСТОЛ-МАЙЕРС СКВІББ КОМПАНІ «120». АНТИТІЛА ДО ТРЕМ-1 ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «130» 3338.0920000/ЕІ Е/С-К/ЮКС «1405 5 62/651,605 «141» 2018-04-02 «160» 84 «170» Раїепіп мегвіоп 3.5 «210» 1 «211» 234 «212» РЕТ «213» пото заріеп5 «400» 1

Меї Агод Гуз Тиг Агд Гей Тгр Су Геи Гей Тгр Меї І еи Ре Маї Зег 1 5 10 15

СІМ Гей Аго Аа Аа Тпг Гуз Геи Тиг Сім СІ Гуз Туг Сім Гей Гув 20 25 30

Сіи Су СІп ТНг Гей Азр Маї Гуз Суз Авр Туг Тиг І еи Сім Гуз Рпе 35

Аа Зег 5ег Сп І уз Аа Тгр Сіп Пе Пе Агу Азр Су Сім Меї Рго 60

Гуз ТигІ ей АІа Суз Тпг Сім Агд Рго Зег І уз Авп зег Ні Рго Маї 40 65 70 75 80

СіІп Ма! СІу Аго Пе Пе Геи Сім Ар Туг Ні Авр Ніз ОМ ГГ еи Гей 85 90 95 45 Агу Маї Агд Меї Ммаї Авп ГГ еи СІп Маї Сім Азр 5ег СУ Геи Туг СіІп 100 105 110

Суз Ма Пе Туг СіІп Рго Рго Гуз Сім Рго Ніз Меї Геи Ре Авр Ага 115 120 125

Пе Аг Гей Маї Маї Тиг Гуз Су Ре 5ег Су ТНг Рго Су Зег Азп 130 135 140

Сім Авп Зег Тпг СІп Азп Маї Туг Гуз Пе Рго Рго Тиг Тиг Тиг Гуз 145 150 155 160

Аа Геи Суз Рго Геи Туг Тиг Зег Рго Агуд ТНиг Ма! ТНг СіІп Аа Рго 165 170 175

Рго Гуз Зег ТНиг Аа Азр Маї Зег ТНиг Рго Азр Зег Сім Пе Авп Ї ей 180 185 190

ТНиг Азп Маї Тпг Азр Іе Пе Агод Маї Рго Маї Рпе Азп Пе Ма! Пе 195 200 205

Г ей І еи Аа Су Су Ре ГГ еи Зег І уз Зег І еи Ма! Рпе 5ег Ма! Гей 210 215 220

Ріє Аа Маї ТНг Геи Агуд 5ег РПе Маї Рго 225 230 «2105» 2 «211» 225 «212» РЕТ «213» пото заріеп5 «4005» 2

Меї Агод Гуз Тиг Аг Гей Тгр Су Геи Геи Тгтр Меї І еи Ре Маї Зег 1 5 10 15

Сіи СУ СІп ТПг Геи Азр Маї Гуз Суз Азр Туг ТигІ еи Сім Гуз Рпе 35 40 45

Аа Зег 5ег Сп І уз Аа Тгр Сіп Пе Пе Агу Азр Су Сім Меї Рго 50 55 60

Гуз ТигІ ей АІа Суз Тпг Сім Агд Рго Зег І уз Авп зЗег Ні Рго Маї 65 70 75 80

СіІп Ма! СІу Аго Пе Пе Геи Сім Ар Туг Ні Авр Ніз ОМ ГГ еи Гей 85 90 95

Агу Маї Агд Меї Ммаї Авп ГГ еи СІп Маї Сім Азр 5ег СУ Геи Туг СіІп 100 105 110

Сім Авп Зег Тпг СІп Азп Маї Туг Гуз Пе Рго Рго Тиг Тиг Тиг Гуз 145 150 155 160 бо Аа Г еи Суз Рго ГГ еи Туг ТАиг Зег Рго Агуд ТНиг Маї ТНг СіІп Аа Рго

165 170 175

ТНиг Азп Маї Тпг Азр Пе Пе Агоу Туг Зег Ре СіІп Маї Рго Су Рго 195 200 205

Ї еи Маї Тгр Тиг Геи Зег Рго Гей Ре Рго 5ег І еи Суз Аа Сім Агд 210 215 220

Меї 225 «210» З «211» 150 «2125 РКТ «213» пото заріепь5 «400» З

Аа Зег 5ег Сп І уз Аа Тгр Сіп Пе Пе Агу Азр Су Сім Меї Рго 50 55 бо

Пе Агу Гей Маї Маї Тиг Гуз Су Ріе Агд Суз 5ег ТНг Геи 5ег Рпе 130 135 140 зег Тр Геи Маї Азр Зег 145 150 «210» 4 «211» 3333 «212» ОМА «213». Ното заріеп5о «400» 4 ддсаасі ссдаадссіс Таддісано юдоссно їадсідіссс дддадсссіс (210) бо адсадсаді ддадсюддід сасаддаадд ададдаада ссаддсісід ддддсідсід 120 тюодаїйосісі Ндїсісада асіссдадсі дсаасіааа! І(аасідадда ааадіаюаа 180 сюааададд ддсадасссї ддадюдааа ідідасіаса сдсіададаа д«Шдоссадс 0240 ? адссадааад сіддсадаї ааїаадддас ддададаїдс ссаадасссі ддсаїдсаса 300 дададдссії сааадаайс ссаїссадіс саадідддда додаїсаїасіадаадасіас 360 сащдаїйсад дщасідсо сдіссдаад дісаассіс аадіддаада йсіддасіюд 420

Таїсадіюдю даїсіасса дссісссаад дадссісаса ІдсіднНсда ісдсаїссдс 480

Ндоащоїда ссааддоаш Ксадддасс ссіддсісса аїдадаацс асссадааї 540 7 дідіагаада Кссіссіас сассасіаад дссцдідсс сасісіайас ссадссссада 600 асідідассс аадсіссасс саадісаасі дссдаїдісї ссасіссіда сісідаааїйс 660 аассНасаа ашідасада іаїсаїсадд диссоддіді саасацої сайсіссд 720 дсддаододаї ІЇссдадіаа дадссіддіс Нсісідісс ющШосідї сасдсідадд 780 їсашогас ссіаддссса сдаасссасд адаайціссі сідасцсса дссасаїсса 840 т Ісддсади дідссааддд аддадддадо аддіаааадд садддадна аїаасадаа 900

Наааїсідї ааіїсассддс їашсіааа дісадсодісі сассНссід сссасідссс 960

Ісонссісї ааг(ааїсно дддддсакн щідссісад аааадаадц асадссссаа 1020 асадснодод Ісснсанс сассадссас дддоно9да саїдааайас адасадсіса 1080 адсішса ссоїаансії снущдадодд сідщасад садааддсас ассідайасі 1140 о Ісіссідсіс аафідссс ддассаїас ааїшоддсс Ідассіддас ададсіссса 1200 сіасадаадс аїссідсісуд ссссадсід ддасцссіс Шсіадсаї садасаснд 1260 доашсаїдс Чашдіддд ксшссаа сасісссада ааадддаідн дааданоїд 1320 даассіддад аааіаадаса Ісдіддідад ааадідсаїс сісісадад аааададна 1380 аасдаднаї сіснсідд ддааагасід дсаддссдад адддаїсса їаддададса 1440 е асаасадасс ащдісадаса іссідідідс ашайсдсі ддаїссідаа ааїадсссся 1500

Шааддсада аащіащід асіадаасда ддссасаїда аіаадссасі дсссасіддс 1560 аддадідааа асідаадсдс іІссЧассід ааддасссса ааассаїайа дааіадаайа 1620 ассаддадії ссдссідщі сіааафссі сійссіді аїсасасаад ддісадддаї 1680 дадодадіаа аадсісіссс ссідддаддс ссіддадос ідіссссаюд ідсндссіа 1740 7 днссссасі сідсссіссі ссіснсїсі садісідсіс сіддаасасс їдссісаді 1800

Іссафсісі сіссадідсс сіссссддід аадсаддіад діднсадудс сассасадад 1860 бо асааїсісід Ідддадано ісцдсааїс Ісссасадаї ЧСсааїсадд аншонаї 1920

Нссіасій дадсшааа дддаааодо ссісаддої дддадааадда ддідддієс 1980

Нссадссса ашадюдаї дсссадддса даїацаїсс Ісадіссса ададсааїса 2040 ? їасішсса сасагассої дідісіса ЧНададіаааї дїаншас ааїдадсасс 2100 аснсідідд аааааднсс сідсасддду аддіссадсі Іссадасідс Іссаїсдсаї 2160 ааддаснсс ссанссссі ааафдсідсі сіцісадаас сідсссадді ааддіаад 2220 асссіадада дадащсі даассдсааї Шдадссса Чадааздоіо іддідддс 0 2280 ашашса іссідадсі сіддчідадаа Іісщтдсада сдсасіадаї ссадаадсід 2340 7 Нааїсндд дсащжшак Нссіассіа ааадаассаа дсадсісада ддсадідасі 2400 діасаддаюд садщщтаї аагаа(сю адсндсідо їсддаассс сасасщад 2460 сааїсссадс айднссід Шадааді дасааадід ассадддсаа дддддіачца 2520

Ісацааава сасісіадда даддсадаас асададддс аадщшис ададаієщ 2580 аддссассдс аїсадаксі ссіддадсаї ааадсааад сщШаїдаді ссадддсссс 2640 т садассіа сідацгасіа діагасадсі сссісНаді ддаїсісаад сцдшсса 2700 аааадісай асасіссцЦа ссааадссса Щасасайс агасадайцс аїссадасаї 2760 аасссасідс аддіссаді дсадсної дідсНаасі їабагадаї саадіунаї 2820

Наадіссаа са(ацааас ддасідааа іацагатдс асіаааісдд аадасааадю 2880 дссдідсідд агасісіссс афдсасії асаддссасд ссаїдсісса Іссіссссаї 2940 о ссідссюддо аассідасса адіддсіаа ассадсаддс іІсссіддсід ссадсНсід 3000 дсдданНодад ссааїдддаа дсащдададд ададссдадд дчіддддадас адісадаїса 3060 дадщеі ссісадддсі сссісссдд саддададідо саддадчіддсідсайсссс 3120

Ісідааддсі ссісаадсс Ісісадсааа садсісссаї сіссаадісс адссассідї 3180

Іссаїссісі ссісідтадд сссадсадід ддааїдассс ассасіаноду ссадссісад 3240 е саїасідаад сассссНас ддайсссі ааайсіа сасадщша Чааагдсіс 3300 сісаацасс саднааааа аааааааааа ага 3333 «2105 5 «211» 2102 «212» ОМА «213» пото заріеп5 «4005» 5 андіддідс снкоїадсід Ісссдддадс ссісадсадс адйддадсі ддаідсасадд (210) ааддададд аадассаддс ісідддоддсі дсідідда сісщоїсі садаасіссд 120 бо адсдсаасі ааайаасід аддаааадіа даасідааа даддддсада сссіддаїдї 180 дааашдюас іасасдсіад адаадщодс садсадссад ааадсцддс адайаайїйаад 240 ддасддадад аїдсссаада сссіддсад сасадададд ссісааада айсссаїсс 300 ? адіссагадід дддаддаїса їасіадаада сіассаїщдаї садддШасідсдсдісєссд 360 ааддісаас сісаадідд аадайсідд асідіагсад (дідідаїсіассадссісс 420 сааддадссі сасафдсіді (сдаїсдсаї ссдсцдаїд дідассаадд чншсадуд 480 дассссіддс Іссааідада ансіассса даадіоіаї аадайссіс сіассассас 540

Іааддссцну дсссасісії аїассадссс садаасідід асссаадсіс сасссаадіє 600 7 аасдссодаї дісіссасіс сідасісіда ааїсаассії асааащіда садаїаїйсаї 660 саддіагаді Сссаддісс сідддссссі ддашддаса сідадсссц (дДШсссад 720

Ісщдсії дададдаю?! дзааадщадд даааддддад даїддддсаддадаадасни 780 дадісасай адісідддіа дааащісса ддддаадагазд даадчіддаіда юдадаасад 840 ддададдсісії садссаддсі діссцсісс ссадінсасс НСШОШ ссНЦдсаасс 900 т Щадіацаа адададддаа аддсаїсії ссссааднс садіддадсі саїссаассс 960 саддддссід аїдддсадід ддааадсасії сідадідадд ддсссіддаї сіадізнод 1020 ссідасіаас Іаащідас Шоддащдад ісаддаассс ісісіддсн адснсш 1080 дасаайсад іаддсащдої адааасссаа адсіддаада сайцдіссас сіааіаасіс 1140

Ісадсаддад сюдадсда досіааафс адандуан Шоссча дшшщаа 1200 о агаасацоії дсащідсс саацагада (аааіадааї садаанй дсадададоа 1260

Ісссісісад їайшааї аададшща ддадащсі ааїдідіадд сааасчаад 1320 аассасіаас бадсааф сасассісні їасаднай ааанодаї Наїацада 1380 адккщаї сайааагас Іаацнаїса ддаддаааї асішссас аїсассасіа 1440 дісіааса( ісСфсї сагансісї Ісіадісф айсаш агасааш 1500 е Іаагаддса діаадісіаа Пагасащді щас ЯссНосід ааацансі 1560

Ндафдсідс їассіааай (сагааацаї аашсааю адідсасанк Шсіаїсаа 1620

Ндоддааасдс сагаасцас аїаассано дссіднсії адасанодаї аїадіднда 1680

Іаасісдад агааасайас (сндсадаї аїашнцсі Їстцнааагаанаасісд 1740 ааажссаї дадаїааці ааасасідаї аїсанної агасааацад саїсіассаа 1800 7 одїснсса ааадацйдда аасаащос адідідаїсс абаадсаца ааїааадсад 1860 ісаддса ддсКасада сасддаща дісіщааа Ісацаааа дідідадна 1920 бо ааїсасакнс сідсіаааас ааадктаас ддідссідс ісіаашсі сіаєдадчіуї 1980 адасіссасс іссадаФдодо їадіддсаді дссцшсс ссабаюн дшоддодаа 2040 сааадідсіс айаааснс дддааїйаа а(сааасдаа Ідаїсааааа аааааааааа.ї /-:-2100 і аа 2102 «210» 6 «211» 3140 «2125» ОМА «213» пото заріеп5 «400» 6 ддсаасі ссдаадссіс Таддісано ддідссно їадсідіссс дддадсссіс бо 7 адсадсадії ддадсюдду сасаддаадд аїдаддаада ссаддсісід ддадосідсід 120 тюодаїйосісі Ндїсісада асіссдадсі дсаасіааа! І(аасідадда ааадіаюаа 180 сюдааададд ддсадасссї ддадюдааа (дідасіаса сдсіададаа дшОудссадс 240 адссадааад сіддсадаї ааїаадддас ддададаїдс ссаадасссі ддсаїдсаса 300 дададдссії сааадаайс ссаїссадіс саадідддда додаїсаїасіадаадасіас 360 т сащдаїйсад дшасідсад сдіссдаад дісаассис аадіддаада нсіддасід 420

Нодоащоїщда ссаадддойії ссддіднса асаноісаї ісіссіддсі ддіддайсс 0540

Щадіаадад ссіддісне ісідіссіді Нрсідісас дсідададіса Шодіасссї 600 аддсссасда асссасдада аїдіссісід асіссадсс асаїссаїсі ддсаднооїд 660 о ссагдддадд адддаддадад їааааддсад ддаднааїа асаїдааца ааїсідіаай 720 сассддсєіаї Ксіааадіс адсдісісас сессідссс асідсссісу Цссістааїй 780 ааїснддої дддсащої дссісадааа адааднаса дссссаааса дсНудісс 840

Нсанссас садссасну ддднддсаї даааіїасада садсісаа сцйсассд 900 їаансісі дідддодсід щасаїдсад ааддсасасс ІШаїасйнсії ссідсісаді 960 е Шосссідоу ассайасааї Шддссіда ссіддасада дсісссасіа садаадсаїс 1020 сідсісдссс садсіддда сцссісф сіадсаїсад асаснддої КсаїдсНа 1080 одонс Шссаасас іІсссадаааа ддоаїюнНодаа чандіддаа ссіддадааа 1140

Іаадасаїсуд ддідадааа дідсаїссії сісададааа ададнааас дадіаїсц 1200 снсдддда аагасддса ддссдадайд ддаїссагад дададсааса асадассаїд 1260 7 Ісадасаїсс ідідсан гасдсідда іссідааааї адссссдіда аддсадаааї 1320

Чдіащцдіюдасії адаасдаддс сасаюдаагїйа адссасідсс сасіддсадд адідаааасїі 1380 бо даадсодсісс Нассідаад дассссаааа ссаїас(адаа іадааіаасс аддадіссуд 1440 ссідідісіа аагдссісії бссідіагс асасааддодї садддаоді ддадіаааад 1500 сісісссссї дддаддснс ддадосідї ссссащідс Ндссіади ссссасісід 1560 ? сессіссіссі сцсісісад Ісідсіссід даасассідс сісадшсс аїдсісісіс 1620 садідсссіс сссдддаад саддіаддю Нсаддссас сасададаса аїсісідідд 1680 дчадацноісі (дсааїсісс сасадащшс ааїсаддай копашс ссіасшодад 1740 сШаааддд ааадддссі саддащдаод чаааддаад дддісснс садсссаай 1800 їадідафдсс садддсадаї анаїссіса дісссаада дсааїсаїасіШссасас 1860 7 агассдіді ісісаюна додгааашіа ННасааї дадсассасіісідіддааа 1920 ааднсссід сасддддадо Іссадснсс адасідсісс аїсдсагаад даснсссса 1980

Нссссіааа (дсідсісід їсадаассюд сссаддіааї ддїаадасс сіадададаї 2040 дашсідаа ссдсаації дадсссаца дааддідідї ддіддосанк ашсаїсс 2100 щаїдсісід ддадааїсі бдсадасодс асіадаїсса даадсіднНа аїсбддідс 2160 т ашаннс сіассіаааа даассаадса дсісададдс адідасіюд(а саддадсад 2220 тющагїааї ааїдсщдадс Кдсіддісї ддаассссас асшадсааїсссадсай 2280

Унссід адааднода сааадідасс адддсагаддд ддіанаїса Цааайасас 2340

Ісї(аддадад дсадаасаса дадддсааї чншсада даісЩадд ссассдсаїс 2400 адансіссії ддадсагааа дсааадси (аїдадісса дддссссідс адассіасід 2460 о Тагасіадіа іасадсіссс Ісбадідда ісісаадсі дшссаааа адісайаса 2520 сіссЦасса аадсссаїда сасайсаїйа садайсаїс садасай(аас ссасідсаюд 2580 діссадідса (сного сЧаасцаї іа(адаєсаа діднащша адіссаасаї 2640 аЧааасдід асідааайа (агардсасі аааісддаад асааафддсс дідсіддайа 2700 сісісссай (дсасцЦаса ддссасдсса Ідсіссаїсс Іссссаїссі дссідддаас 2760 е сюдассаа іддсіааасс адсаддсісс сіддсідсса дсцсіддсі доундадсса 2820 адоддаадса дададдада дссдадддаід дддадасасді садаїсадду Шесідіссї 2880 садддсіссс Ісссддсад чдадодсад дадіддсідс айссссісї даадудсіссії 2940

Ісаадссісї садсааасад сісссаїсіс саадіссадс сассіднос аїссісіссї 3000 сідїаддссс адсадіддда аїдасссасс асіацдсса дссісадсасасідаадсас 3060 7 сссНасідд айсссіааа Цсіаїдсас адщаца ааїдсіссіс аайасссад 3120

Каааааааа аааааааааа 3140 60 0о«2105» 7

«211» 233 «212» РЕТ «213» Масаса їазсісшагі5 «4005» 7

Меї Агод Гуз Тиг Аго Гей Тгр Су Геи Геи Тгр Меї І еи Ре Маї Зег 1 5 10 15

Сім Геи Аг Аа Тпг Тиг Сім Їеи ТНг Сім Сі Гуз Туг См Туг Гуз 20 25 30

Сіи Су СІп Тпг Гей Си Ма! Гуз Суз Азр Туг Аа Гей Си Гуз Туг 35 40 45

Аа Авп Зег Ага Гуз Аа Тгр СіІп Гуз Меї Сіи Су Гуз Меї Рго ГГ ув 50 55 60

Пе Гей Аа Гуз Тниг Си Агу Рго Зег Сім Авп 5ег Ні Рго Маї СіІп 65 70 75 80

Уа! Су Аго Пе Тпг ем Сім Авр Туг Рго Ар Ніз Су І ей Гей Сіп 85 90 95

Уа! СіІп Меї Тпг Авп ГГ еи Сп Маї Сім Авр Зег Су Геи Туг СІп Суб 100 105 110

Уа Пе Туг СІп Ні Рго Гуз Сім 5ег Ніз Ма! Геи Ре Авп Рго Пе 115 120 125

Суз І еи Маї Ма! Тиг Гуз Су Зег Зег СІу Тиг Рго Су Зег Зег Си 130 135 140

Авп Зег Тиг СІп Авп Маї Туг Агд ТНиг Рго 5ег Тиг ТНг Аа Гуз Аа 145 150 155 160

Ї еи Су Рго Агоу Туг Тиг Зег Рго Ага ТНг Маї ТНг Сп Айа Рго Рго 165 170 175

Сім Зег Тпг Маї Ма! Ма! Зег ТНиг Рго Су бег Си Пе Авп Гей ТНг 180 185 190

Азп Маї ТНиг Азр Іе Пе Агу Маї Рго Маї Ріе Азп Пе Маї Пе Пе 195 200 205

Уа! АІа Су Су Ре Г еи 5ег Гуз 5ег І ей Маї Ре 5ег Ма! І еи Рпе 210 215 220

Аа Ма! Тиг Геи Агд 5ег Рпе Су Рго 225 230 «210» 8 «211» 196 «212» РЕТ «213» пото заріеп5 «4005» 8

Меї Зег Агу Агу Зег Меї І еи І еи Аа Тгр Аа Геи Рго Зегі ей Ї еи 60 1 5 10 15

Аг ГІ ем Су Аа Аа СіІп Сім ТАг Сім Авр Рго Аа Суз Суз 5ег Рго 20 25 30

Пе Маї Рго Агу Азп Сім Тгр Гуз АПа І еи Аа 5ег Сім Суз Аа Сіп 35 40 45

Ніз Гени зегіІ ем Рго І еи Ага Туг Маї Ма! Ма! Зег Ніз ТНг АІа СІу 50 55 60

Зег Зег Суз Азп Тпг Рго Аа Зег Суз Сп СіІп СіІп Аа Агд Азп Маї 65 70 75 80

СіІп Ні Туг Ніз Меї Гуз ТНг І еи Су Тгр Суз Авр Маї Су Туг Азп 85 90 95

Ріє Геи Пе Су Сім Азр Су І еи Маї Туг СІм Су Агуд Су Тгр Азп 100 105 110

Рпе Тнг Су Аїа Ні Зег Су Ніз І еи Тгр Азп Рго Меї Зег Пе Су 115 120 125

Пе бег Рпе Меї Су Азп Туг Меї Азр Аго Маї Рго Тпг Рго Сіп Аа 130 135 140

Пе Агу Аа Аа СіІп Су Г ем І еи Аа Суз Су Маї АІа Сіп Су Аїа 145 150 155 160

Ї ем Агу Зег Азп Туг Ма! І еи Гуз Су Ніз Агуд Ар Маї СіІп Аго Тиг 165 170 175

Ї еи бег Рго Су Авзп Сп І еи Туг Ніз І еи Пе Сіп Авзп Тгр Рго Ніб 180 185 190

Туг Агд Зег Рго 195 «210» 9 «211» 330 «212» РЕТ «213» пото заріеп5 «4005» 9

Аа Зег Тпг І уз Су Рго 5ег Ма! Ре Рго Геи Айа Рго 5ег Зег І уз 1 5 10 15

Зег Тиг Зег СІу СУ ТНг Аа Аа ГІ еи Су Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30

Ре Рго Си Рго Маї ТНг Маї Зег Тгр Азп 5ег Су Аа І еи ТНг 5ег 35 40 45

Су Маї Ніз Тиг Ре Рго Аїа Маї Гей Сп Зег Зег СУ І еи Туг 5ег 50 55 60

Ї еи 5ег Зег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег Зег Зег І еи Су ТНг СіІп ТАг 65 70 75 80 бо ТугПе Суз Азп Маї Авп Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТПг Гуз Маї Азр Гуз бо

85 90 95

Гуз Ма! Сіши Рго Гуз Зег Сув Авр Гуз ТНиг Ні Тиг Суз Рго Рго Суз 100 105 110

Рго Аа Рго Сип Гей Геи Су Су Рго Зег Ма! Рпе Геи РНе Рго Рго 115 120 125

Гуз Рго Гуз Азр Тпг ей Мей Ше Зег Агуд ТНг Рго Сім Маї Тиг Суз 130 135 140

Уа! маї Ма! Азвр Маї Зег Ніз Сім Авр Рго Си Ма! Гуз Рпе Авзп Ттр 145 150 155 160

Туг Ма! Азр Су Маї СіІш Маї Ніз Азп Аа Гуз Тпг Гуз Рго Агу Сім 165 170 175

Сім Сп Туг Азп 5ег ТНг Туг Агу Маї Ммаї Зег Ма! І еи Тнг Ма! Гей 180 185 190

Ні СіІп Азр Тгр Гей Азп Оу Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп 195 200 205

Гуз Аа ГІ еи Рго Аїа Рго Пе Си Гуз Тниг Пе Зег Гуз Аа І ув Су 210 215 220

Сп Рго Агд Сім Рго СіІп Маї Туг ТНг І ем Рго Рго Зег Агу Авр Сім 225 230 235 240

Їеи Тиг Гуз Азп Сп Маї Зег І еи Тиг Суз І еи Ма! Гуз СіІу Рпе Туг 245 250 255

Рго бег Азр Пе Аїа Маї СіІи Тгр Сім Зег Азп Су СІп Рго Сім Авп 260 265 270

Авзп Туг Гуз Тпг ТАг Рго Рго Маї Гей Азр Зег Азр Су Зег Рпе Рпе 275 280 285

Ї ем Туг Зег І уз І еи ТНг Маї Азр Гуз 5ег Агу Тгр СІп СіІп Су Ап 290 295 300

Уа! Рне Зег Суз 5ег Ма! Меї Ні Сім Аа Геи Ні Авп Ні Туг ТАг 305 310 315 320

СіІп Гуз бегіІ ей Зег І еи Зег Рго Су Гуз 325 330 «210» 10 «211» 327 «212» РЕТ «213» пото заріеп5 «400» 10

Аа Зег ТНг І уз Су Рго 5ег Ма! Рпе Рго Геи Аїа Рго Суз 5ег Агд 1 5 10 15

Зег Тиг Зег Сім Зег ТНг Аа Аа Гей Су Суз ГІ еи Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30 60

Ї еи 5ег Зег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег Зег Зег І еи СІу ТНг Гуз Тпг 65 70 75 80

Туг Тиг Суз Авзп Маї Авр Нів Гуз Рго 5ег Азп ТПг Гуз Маї Ар Гуз 85 90 95

Аг Маї Си 5ег Гуз Туг Су Рго Рго Суз Рго 5ег Суз Рго Аа Рго 100 105 110

Сім Ре Г еи Су Су Рго Зег Ма! Рпе ГГ еи Ре Рго Рго Гуз Рго ГГ ув 115 120 125

Азр Тпг Геи Ме! Пе 5ег Агу Тиг Рго Сім Ма! Тиг Суз Маї Маї Маї 130 135 140

Азр Маї Зег СіІп Сім Азр Рго Си Маї СІп Рпе Авзп Тгр Туг Ма! А5р 145 150 155 160

Су Ма! Сім Маї Ні Азп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Сім Сім СІп Рпе 165 170 175

Азп 5ег Тиг Туг Агу Маї Ма! Зег Ма! І еи Тиг Ма! Геий Ні СіІп Азр 180 185 190

Тгр Геи Азп Су Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Маї бег Авп Гуз Оу Ї ей 195 200 205

Рго бег Зег Пе Си Гуз ТНг Пе Зег Гуз Аа Гуз Су Сп Рго Ага 210 215 220

Сім Рго СІп Ма! Туг Тиг Геи Рго Рго 5ег СіІп СІ Сім Меї ТНг Гуз 225 230 235 240

Авзп Сіп Маї 5ег І еи Тпг Суз І еи Ма! Гуз Су Рпе Туг Рго Зег Азр 245 250 255

Пе Аа Маї Сім Ттр Сім Зег Азп Су СІп Рго Сім Авп Авп Туг Гуз 260 265 270

Тег Тиг Рго Рго Маї Гей Азр 5ег Авр Су Зег Ре Ре Геи Туг Зег 275 280 285

Агу І еи Тиг Маї Азр Гуз Зег Агоу Тгр СіІп Сім Су Азп Маї РПпе 5ег 290 295 300

Суз 5ег Ма! Меї Ніз Сім Аа ГГ ем Ні Азп Ні Туг ТАг СіІп Гуз бег 305 310 315 320

Ї еи 5егі еи Зег І еи Су ГГ ув 325 «210» 11 «211» 330 60 «212» РЕТ

«213» Апіїсіа!І Зедоепсе «223» Ід01-Аба Неаму Спаіп Сопеїапі Кедіоп «400» 11

Аа Зег Тпг І уз Су Рго 5ег Маї Рпе Рго ГГ еи Аїа Рго Зег 5ег Гуз 1 5 10 15

Ре Рго Си Рго Маї ТНг Маї Зег Тгр Азп 5ег Су Аа Геи ТНг 5ег 35 40 45

Ї еи 5ег Зег Маї Маї Тнг Маї Рго 5ег Зег Зег І еи Су Тиг СіІп ТАг 65 70 75 80

ТугПе Суз Азп Маї Авп Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТПг Гуз Маї Азр Гуз 85 90 95

Аг Маї СіІши Рго Гуз 5ег Сув Авр Гуз Тпг Ніз ТНг Зег Рго Рго 5ег 100 105 110

Рго Аа Рго Сп Гей Геи Су Су бег Зег Ма! Рпе Геи Ре Рго Рго 115 120 125

Уа! маї Ма! Азвр Маї Зег Ніз Сім Авр Рго Си Ма! Гуз Рпе Авп Тгр 145 150 155 160

Сім Сп Туг Азп 5ег ТНг Туг Агу Маї Маї Зег Ма! І еи ТНг Ма! І еи 180 185 190

Гуз Аа ГІ еи Рго Аїа Рго Пе Си Гуз Тпг Пе Зег І уз Аа Гуз Су 210 215 220

Їеи Тиг Гуз Азп Сп Маї Зег І еи Тиг Суз І еи Ма! Гуз Су Ре Туг 245 250 255

Авзп Туг Гуз Тпг ТАг Рго Рго Маї Гей Азр 5ег Авр Су Зег Рпе Рпе 60 275 280 285

Уа! Рне Зег Суз 5ег Ма! Меї Ні Си Аїйа І еи Ніз Азп Ні Туг ТАг 305 310 315 320

СіІп Гуз бегіІ ей Зег І еи Зег Рго Су Гуз 325 330 «210» 12 «211» 330 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» Ід0б4-Абра Неаму Спаіп Сопеїапі Кедіоп «4005 12

Аа Зег Тпг Гуз Су Рго 5ег Ма! Рпе Рго Геи Аїа Рго Суз 5ег Агд 1 5 10 15

Зег Тиг Зег Сім Зег ТНг Аа Аа Гей Су Суз ГІ еи Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30

Ї еи 5ег Зег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег Зег Зег І еи Су Тиг Гуз Тпг 65 70 75 80

Ні СіІп Азр Тгр Гей Азп Оу Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп 195 200 205 бо Гуз Аа ГІ еи Рго Аїа Рго Пе Си Гуз Тпг Пе Зег І уз Аа Гуз Су

210 215 220

Авзп Туг Гуз Тпг ТАг Рго Рго Маї Гей Азр 5ег Авр Су Зег Рпе Рпе 275 280 285

СіІп Гуз бегіІ ей Зег І еи Зег Рго Су Гуз 325 330 «210» 13 «211» 107 «212» РЕТ «213» пото заріеп5 «4005 13

Агу ТНг Маї Аа Аїа Рго 5ег Маї Ре Пе РНе Рго Рго 5ег Авр Сн 1 5 10 15

Сіп Геи Гуз бег Су ТНг Аа 5ег Маї Ма! Сув Геи Гей Азп Азп Рпе 20 25 30

Туг Рго Агу Сім Аїа Гуз Маї СіІп Тгр Гуз Маї Азр Авп Аа ГГ еи Сп 35 40 45

Зег Су Азп 5ег СІп Сім Зег Ма! Тиг Сім Сп Ар 5ег І уз Азр 5ег 50 55 60

ТНиг Туг ЗегІ еи Зег Зег ТПг І еи ТНг Гей 5ег Гуз Аа Ар Туг Сни 65 70 75 80

Гуз Ніз Гуз Маї Туг АІа Суз Сім Маї Тпг Ні СіІп Су І еи бег Зег 85 90 95

Рго Маї Тиг Гуз Зег Рпе Азп Аг Су Сім Сув 100 105 «210» 14 «211» 121 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» тАБ 0318 УН 60 «400» 14

Сім мМаї СіІп І еи Ма! Сіи Зег СіІу СІу Су Геи Маї СіІп Рго Су Су 1 5 10 15 зегі еи Гуз І еи Зег Суз Аа Аа 5ег Су Рпе Тпг Ре Зег Тпг Туг 20 25 30

Аа Меї Ніз Тгр Маї Агд СіІп Аа Зег Су Гуз СУ І еи Сім Тгр Маї 35 40 45

Су Агу Ме Аго Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа ТНг Туг Туг Аа Аїа 50 55 60

Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе 5ег Агу Азр Азр Зег І уз Авзп ТАг 15.щД 865 70 75 80

Аа Туг Геи СіІп Меї Авп зЗег І еи Гуз Тиг Сім Азр ТНг Аа Маї Туг 85 90 95

Туг Суз Тиг Агу Азр Меї Су Пе Агу Агу СіІп Ре Аїа Туг Тгр СУ 100 105 110

СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег 115 120 «210» 15 «211» 218 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» тАБ 0318 М «4005 15

Азр Іе Ма! І еи ТНг Сп 5ег Рго Ар 5ег І еи Аа Маї 5ег І ей Су 1 5 10 15

Сім Аго Аа Тпг Пе Азп Суз Аго Аа Зег СіІп Зег Ма! Азр Тиг Рпе 20 25 30

Азр Туг Зег Ре Гей Ні Тгр Туг СіІп Сп Гуз Рго Су Сп Рго Рго 35 40 45

Гуз Геи Г еи Пе Туг Аг Аа 5ег Авп І еи Сім Зег Су Маї Рго Азр 60

Агу РПе 5ег Су Зег СІу Зег Су ТПг Азр Ре Тиг Гей Тнг Пе Зег 65 70 75 80 50 зегі еи Сп Аа Сім Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз СіІп СіІп Зег Азп 85 90 95

СіІп Авр Рго Туг Тпг Рпе Су СІп СіІу Тпг Гуз І ем Сім Пе Гуз Агд 55 100 105 110

ТНиг Маї Айа Айа Рго Зег Маї Рпе Пе Ре Рго Рго 5ег Авр Си Сп 115 120 125 бо Ї еи Гуз Зег Су Тиг Аа Зег Маї Маї Суз І ей Ї еи Азп Азп РПе Туг бб

130 135 140

Рго Агд Сім Аїа Гуз Маї СіІп Тгр Гуз Маї Авр Авп Аа Геи Сп Зег 145 150 155 160

Су Азп 5ег СіІп Си Зег Ма! Тпг Си Сп Авр Зег Гуз Азр 5ег ТАг 165 170 175

ТугзЗегі еи Зег Зег ТПг І ей ТАг Гей Зег Гуз АІа Азр Туг Сім Гуз 180 185 190

Ніз Гуз Маї Туг АІа Суз СіІшм Маї ТНг Ніз СіІп Су Геи Зег 5ег Рго 195 200 205

Уа! Тиг Гуз Зег Рпе Азп Аго Су Сім Сувз 210 215 «210» 16 «211» 121 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-І9613 УНН «400» 16

Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе 5ег Агу Азр Азр Зег І уз Авзп ТАг 65 70 75 80

СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег 115 120 «210» 17 «2115 111 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІДБ1.3 МІ. 60 «400» 17

Азр Іе Ма! І еи ТНг Сп 5ег Рго Ар 5ег І еи Аа Маї Зег І еи Су 1 5 10 15

Азр Туг Зег Ре Гей Ні Тгр Туг СІп Сп Гуз Рго Су СІп Рго Рго 35 40 45

Гуз І еи Геи Пе Туг Аг Аа 5ег Авп І еи Сім Зег Су Маї Рго Азр 50 55 60

Агу РПе 5ег Су Зег СІу Зег Су ТПг Азр Рпе ТНг Геи ТНг Пе Зег 15.щД 865 70 75 80 зегі еи Сп Аа Сім Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз СіІп СіІп Зег Азп 85 90 95

СіІп Авр Рго Туг Тпг Рпе Су СіІп Су Тиг Гуз Гей Сім Пе Гув 100 105 110 «210» 18 «211» 121 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІД01 ЛЕН «400» 18

Сім мМаї СіІп І еи Ма! Сіи Зег СіІу СІу Су Геи Маї СіІп Рго Су Су 1 5 10 15 зегі еи Гуз І еи Зег Суз Аа Аа бег Су Рпе Тпг Рпе 5ег ТАг Туг 20 25 30

Су Аго Ме Аго ТНг Гуз Зег Зег Азп Туг Аа ТНиг Туг Туг Аа Аа 50 55 60

СіІп Су ТНг І ем Ма! Тиг Маї Зег Зег 115 120 «210» 19 «2115 111 «212» РЕТ бо «213» Апіїсіа!І Зедоепсе

«223» 0318-ІДС1Л1МІ. «400» 19

Гуз Геи Г еи Пе Туг Аг Аа 5ег Авп І еи Сім Зег Су Маї Рго Азр 50 55 60

Агу РПе 5ег Су Зег СІу Зег Су ТПг Азр Рпе ТНг Геи ТНг Пе Зег 65 70 75 80 зегі еи Сп Аа Сім Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз СіІп СіІп Зег Азп 85 90 95

СіІп Авр Рго Туг Тпг Рпе Су СіІп Су Тиг Гуз Гей Сім Пе Гув 100 105 110 «210» 20 «211» 121 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІД01-Аба УН «400» 20

Су Агу Ме Аго Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа ТНг Туг Туг Аа Аїа 60 50 Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе 5ег Агу Азр Азр Зег І уз Авзп ТАг 65 70 75 80

Аа Туг Геи СіІп Меї Авп зЗег І еи Гуз Тиг Сім Азр ТНг Аа Маї Туг 85 90 95 55

СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег 60 115 120

«210» 21 «2115 111 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід01-Аба МІ. «400» 21

Азр Іе Ма! І еи ТНг Сп бег Рго Ар зЗег І еи Аа Маї 5Зег І еи Су 1 5 10 15

Сім Аго Аа Тпг Пе Азп Суз Аго Аа Зег СіІп Зег Ма! Азр Тиг Рпе

Азр Туг Зег Ре Гей Ніз Тгр Туг СІп Сп Гуз Рго Су Сп Рго Рго 20

Агу РПе 5ег Су Зег Су Зег СІуУ ТПг Азр Ріе Тиг Геи ТНг Пе Зег 25 55 70 75 80 зегі еи Сп Аа Сім Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз СіІп СіІп Зег Азп 85 90 95 30 СіІп Авр Рго Туг Тпг Ре Су СіІп Су Тиг Гуз І ей Сім Пе Гув 100 105 110 «210» 22 «211» 121 35 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-(д64-Аба УН 40 «4005 22

Сім мМаї СіІп І еи Ма! Сіи Зег СіІу СІу СУ Геи Маї СіІп Рго СіІу СІу 1 5 10 15 45 зегі еи Гуз І еи Зег Суз Аа Аа 5ег Су Рпе Тпг Ре Зег Тпг Туг 20 25 30

Аа Меї Ніз Тгр Маї Агд СіІп Аа Зег Су Гуз СУ І еи Сім Тгр Маї 50 35 40 45

Су Агу Ме Аго Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа ТНг Туг Туг Аа Аїа 50 55 60 55 Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе Зег Агу Авр Азр Зег І уз Азп ТНг 65 70 75 80

Аа Туг Геи СіІп Меї Авп зЗег І еи Гуз Тиг Сім Азр ТНг Аа Маї Туг 85 90 95 60 то

Туг Суз Тиг Агу Азр Меї Су Пе Агу Ага СіІп Ре Аїа Туг Тгтр СІу 100 105 110

СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег 115 120 «210» 23 «2115 111 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід054-Аба МІ «400» 23

СіІп Авр Рго Туг Тпг Рпе Су СіІп Су Тиг Гуз Гей Сім Пе Гув 100 105 110 «210» 24 «2115 5 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід61.3г МН СОК1 «400» 24

ТНг Туг Аа Меї Ні 1 5 «210» 25 «211» 19 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід61.3 МН СОК2 «400» 25 60

Ага Ме Агоу Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа Тиг Туг Туг Аа Аа 5ег 1 5 10 15

Уа! Гуз СІу «210» 26 «211» 10 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід61.3г МН СОКЗ «400» 26

Азр Меї С1Уу Пе Аг Агу СІп Ре Аа Туг 1 5 10 «210» 27 «211» 15 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІД61.31 МІ СОКІ1 «400» 27

Ага Аа 5ег СіІп бег Ма! Азр Тпг Ре Ар Туг 5ег Ріє Геи Нів 1 5 10 15 «210» 28 «2115 7 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІдД61.31 М СОК2 «400» 28

Ага Аа 5ег Авп ГГ еи Си Зег 1 5 «210» 29 «211» 9 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІдД61.31 МІ СОКЗ «400» 29

СіІп Сп бег Азп Сп Авр Рго Туг ТНг 1 5 «210» 30 60 «2115 5

«212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід61 1 МН СОКІ1 «4005 30

ТНг Туг Аа Меї Ні 1 5 «2105 31 «211» 19 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ід01 1 МН СОК2 «4005 31

Уа! Гуз СІу «2105 32 «211» 10 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-д01 1 МН СО «4005 32

Азр Меї С1Уу Пе Аг Агу СІп Ре Аа Туг 1 5 10 «210» 33 «211» 15 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-11 МІ СО «4005 33

Ага Аа 5ег Сп бег МаїЇ Азр Тпг Ре Азр Туг Зег Ре ГГ еим Ніб 1 5 10 15 «210» 34 «2115 7 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» 60 «223» 0318-11 МІ сСОоК2

«400» 34

Ага Аа 5ег Авп ГГ еи Си Зег 1 5 «210» 35 «211» 9 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-11 МІ СОКЗ «4005 35

СіІп Сп бег Азп Сп Азр Рго Туг ТНг 1 5 «210» 36 «2115 5 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-(Д01-Аба МН СОК1 «4005 36

ТНг Туг Аа Меї Ні 1 5 «210» 37 «211» 19 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-(Дд01-Аба УН СОК2 «400» 37

Ага Ме Агоу Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа Тиг Туг Туг АІа Аа 5ег 1 5 10 15

Уа! Гуз СІу «210» 38 «211» 10 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-(Дд01-Аба УН СОКЗ «400» 38

Азр Меї С1Уу Пе Аг Агу СІп Ре Аа Туг 60 1 5 10 т4

«210» 39 «211» 15 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід61-Аба МІ СОК1 «400» 39

Ага Аа 5ег СіІп бег Ма! Азр Тпг Ре Ар Туг 5ег Ріє Геи Нів 1 5 10 15 «210» 40 «2115 7 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІдД61-Аба МІ СОК2 «400» 40

Ага Аа 5ег Авп ГГ еи Си Зег 1 5 «210» 41 «211» 9 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІдД61-Аба МІ СОКЗ «400» 41

СіІп Сп бег Азп Сп Азр Рго Туг ТНг 1 5 «210» 42 «2115 5 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-(д04-Аба МН СОК1 «400» 42

ТНг Туг Аа Меї Ні 1 5 «210» 43 «211» 19 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» 60 «223» 0318-і(д04-Аба УН СОК2

«400» 43

Уа! Гуз СІу «210» 44 «211» 10 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ід04-Аба УН СОКЗ «400» 44

Азр Меї С1Уу Пе Аг Агу СІп Ре Аа Туг 1 5 10 «210» 45 «211» 15 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-д064-Аба МІ СОК!1 «400» 45

Ага Аа 5ег СіІп бег Ма! Азр Тпг Ре Ар Туг 5ег Ріє Геи Нів 1 5 10 15 «210» 46 «2115 7 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ід64-Аба МІ СОК2 «400» 46

Ага Аа 5ег Авп ГГ еи Си Зег 1 5 «210» 47 «211» 9 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ід064-Аба МІ СОКЗ «400» 47

СіІп Сп бег Азп Сп Азр Рго Туг ТНг 60 1 5

«210» 48 «2115 5 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» І РОК (С-іегтіпа! епа ої Неаму сНаїп) «400» 48

Ї еи 5ег Рго Су Гуз 1 5 «210» 49 «211» 4 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» І 5РО (С-егтіпаї епа ої пПеаму спаїйп) «400» 49

Ї еи бег Рго Су 1 «210» 50 «211» 451 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІД61.3 НС «4005 50

СіІп Су ТНг І еи Маї ТНг Маї Зег Зег Аа 5ег ТНг Гуз Су Рго 5ег 60 115 120 125

Уа! Ріе Рго ГІ еи Айа Рго Зег 5ег Гуз бег Тиг Зег СІу Су ТНг Аа 130 135 140

Аа Геи Су Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг Рпе Рго Сім Рго Маї ТНг Маї 145 150 155 160 зег Тгр Азп 5ег Су Аа Гей ТНиг Зег Су Маї Ні5 Тниг Ре Рго Аїа 165 170 175

Уа! Геи СіІп Зег Зег Су І еи Туг Зег І еи 5Зег Зег Маї Ма! Тиг Ма! 180 185 190

Рго бег Зег 5ег І ей СІу Тпг СІп ТАиг Туг Пе Суз Азп Маї Авп Ні 195 200 205

Гуз Рго Зег Азп ТПг Гуз Маї Азр Гуз Аг Маї Сім Рго Гуз бег Сув 210 215 220

Ар Гуз Тиг Ніз Тиг Сув Рго Рго Суз Рго Аїа Рго Сім Аа Сім Су 225 230 235 240

Аа Рго 5ег Ма! Ріє Геи РНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр Тпг І ем Меї 245 250 255

Пе бЗег Агд Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Азр Маї Зег Ні 260 265 270

Сім Авр Рго Сім Ма! Гуз Рпе Азп Тгр Туг Ма! Азр Су Маї Сім Маї 275 280 285

Ні Авп Аа Гуз ТПг Гуз Рго Агд Сім Сім Сп Туг Азп Зег Тпг Туг 290 295 300

Аг Маї Маї 5ег Ма! Геи ТНиг Ма! Гей Ні СіІп Азр Тгр І еи Азп Су 305 310 315 320

Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп І уз Аїа І еи Рго Аа Рго Пе 325 330 335

Сім Гуз Тпг Пе 5ег Гуз Аа І уз СІу СІп Рго Агу Си Рго СіІп Маї 340 345 350

Туг Тиг Геи Рго Рго Зег Агд Сім Сім Меї Тпг Гуз Азп СіІп Маї Зег 355 360 365

Ї ем Тиг Суз І еи Ма! Гуз СіІу Рпе Туг Рго 5ег Ар Пе Аїа Маї Си 370 375 380

Тгр СіІи Зег Азп Су Сп Рго Сім Азп Азп Туг Гуз Тпг ТАг Рго Рго 385 390 395 400

Уа! Геи Ар Зег Азр Су 5ег Рпе Ре ГГ еи Туг 5ег І уз І еи ТНг Маї 405 410 415

Авр Гуз 5ег Агу Тгр СіІп СІп Су Азп Маї Рпе 5ег Су Зег Ма! Меї 420 425 430

Ніз Сім Айа Г еи Ні Азп Ні Туг Тпг Сп Гуз Зегі еи 5ег І еи Зег 60 435 440 445

Рго Су Гуз «2105 51 «211» 450 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІДС1ЛЕ НС «4005 51

Сім мМаї СіІп І еи Ма! Сіи Зег СіІу СІу Су Геи Маї СіІп Рго Су Су 1 5 10 15 зегі еи Гуз І еи Зег Суз Аа Аа 5ег Су Рпе Тпг Рпе 5ег Тпг Туг 20

Аа Меї Ніз Тгр Маї Агд СіІп Аа Зег Су Гуз СУ І еи Сім Тгр Маї

Су Аго Пе Агоу ТАг Гуз Зег Зег Азп Туг Аа ТНг Туг Туг Аа Аа 25 50 55 60

Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе 5ег Агу Азр Азр Зег І уз Авзп ТАг 65 70 75 80 30 Аа Туг Геи СіІп Меї Авп зЗег І еи Гуз Тиг Сім Азр ТНг Аа Маї Туг 85 90 95

Туг Суз Тиг Агу Азр Меї Су Пе Агу Агу СіІп Ре Аїа Туг Тгр СУ 100 105 110 35

СіІп Су ТНг І еи Маї ТНг Маї Зег Зег Аа 5ег ТНг Гуз Су Рго 5ег 115 120 125

Уа! Ріе Рго ГІ еи Айа Рго Зег 5ег Гуз бег Тиг Зег СІу Су ТНг Аа 40 130 135 140

Аа Геи Су Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг Рпе Рго Сім Рго Маї ТНг Маї 145 150 155 160 45 зег Тгр Азп 5ег Су Аа Гей ТНиг Зег Су Маї Ні5 Тниг Ре Рго Аїа 165 170 175

Ар Гуз Тиг Ніз Тиг Сув Рго Рго Суз Рго Аїа Рго Сім АІа Сім Су 225 230 235 240 бо Аа Рго 5ег Ма! Ріє Геи РНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр Тпг І ем Меї

245 250 255

Пе бЗег Агд Тиг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Азр Маї 5ег Ні 260 265 270

Ні Авп Аа Гуз Тпг Гуз Рго Агд Сім Сім Сп Туг Азп 5ег ТНг Туг 290 295 300

Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп І уз Айа Г еи Рго 5ег Зег Пе 325 330 335

Туг Тиг Геи Рго Рго Зег Агд Сім Сім Меї Тиг Гуз Азп Сп Маї Зег 355 360 365

Тгр СіІи Зег Азп Су Сп Рго Сім Авп Азп Туг Гуз ТАг Тиг Рго Рго 385 390 395 400

Авр Гуз 5ег Агу Тгр СіІп СіІп СіІу Азп Маї Рпе Зег Суз 5ег Ма! Меї 420 425 430

Ніз Сім Айа Г еи Ні Азп Ні Туг Тпг Сп Гуз Зегі еи 5ег І еи Зег 435 440 445

Рго СІу 450 «2105 52 «211» 451 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІД61-Аба НС «4005 52

Аа Меї Ніз Тгр Маї Агд СіІп Аа Зег Су Гуз СУ І еи Сім Тгр Маї 35 40 45 60 во

Су Аго Ме Аго Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа ТНг Туг Туг Аа Аа 50 55 60

СіІп Су ТНг І еи Маї ТНг Маї Зег Зег Аа 5ег ТНг Гуз Су Рго Зег 115 120 125

Аа Геи Су Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг Рпе Рго Сім Рго Маї Тиг Маї 145 150 155 160 зег Тгр Азп 5ег Су Аа Гей ТНиг Зег Су Маї Ні5 Тниг Ре Рго Аїа 165 170 175

Уа! Геи СіІп Зег Зег Су І еи Туг Зег І еи 5ег Зег Маї Ма! Тиг Маї 180 185 190

Гуз Рго Зег Азп ТПг Гуз Ма! Азр Гуз Агу Маї Сім Рго ГГ ув Зег Суз 210 215 220

Ар Гуз Тиг Ніз Тпг Зег Рго Рго Зег Рго Аа Рго СіІи Геи Гей Су

Д225 230 235 240

Су Зег Зег Ма! Ріє Геи Рне Рго Рго Гуз Рго І уз Авр ТНг І еи Меї 245 250 255

Сім Авр Рго Сім Ма! Гу Рпе Азп Тгр Туг Ма! Азр Су Маї Сім Маї 275 280 285

Агу Маї Маї Зег Ма! І еи Тиг Ма! Геий Ні СіІп Авр Тгр І еи Азп Су 305 310 315 320

Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп І уз Айа ГГ еи Рго Аа Рго Пе 325 330 335

Сім Гуз Тпг Пе 5ег Гуз Аа Гуз СІу СіІп Рго Агу Си Рго СіІп Маї 340 345 350

Туг Тиг Геи Рго Рго Зег Агу Азр Си ГГ еи Тпг Гуз Азп Сп Маї Зег 355 360 365 60

Рго Су Гуз 450 «2105» 53 «211» 451 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-д064-Аба НС «4005 53

Уа! Рне Рго ГІ еи Аа Рго Суз 5ег Агуд зЗег Тиг бег Сім Зег ТПг Аа 130 135 140

Аа Геи Су Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг Рпе Рго Сім Рго Маї ТНг Маї 145 150 155 160 зег Тгр Азп 5ег Су Аа Гей ТНиг Зег Су Маї Ні5 Тниг Ре Рго Аїа 60 165 170 175

Рго бег Зег 5ег І ей СіІу Тпг Гуз Тиг Туг Тиг Суз Авп Маї Авр Ні 195 200 205

Ар Гуз Тиг Ніз Тпг Зег Рго Рго Зег Рго Аа Рго СіІи Геи Гей Су 225 230 235 240

Су Зег Зег Ма! Ріє Геи Рне Рго Рго Гуз Рго І уз Авр ТНиг І еи Меї 245 250 255

Аг Ммаї Маї 5ег Ма! Геи ТНиг Ма! Геий Ні СіІп Азр Тгр І еи Авп Су 305 310 315 320

Сім Гуз ТАг Пе 5ег Гуз Аа Гуз Су СІп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї 340 345 350

Туг Тиг Геи Рго Рго Зег Агу Азр Си ГГ еи Тпг Гуз Азп Сп Маї Зег 355 360 365

Ї ем Тиг Суз І еи Ма! Гуз СіІу Рпе Туг Рго 5ег Азр Пе Аа Ма! Сіи 370 375 380

Уа! Геи Ар Зег Азр Су 5ег Рпе Ре ГГ еи Туг Зег І уз І еи Тиг Маї 405 410 415

Ніз Сім Айа Г еи Ні Азп Ні Туг Тиг Сп Гуз 5егі еи Зегі еи 5ег 435 440 445

Рго Су Гуз 450 «210» 54 «211» 218 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе 60

«223» 0318-І951.3ГІ С «4005 54

Азр Туг Зег Ре Гей Ніз Тгр Туг СІп Сп Гуз Рго Су Сп Рго Рго 35 40 45

Агу РПе 5ег Су Зег Су Зег СІуУ ТПг Азр Ріе Тиг Геи ТНг Пе Зег 65 70 75 80 зегі еи Сп Аа Сім Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз СіІп СіІп Зег Азп 85 90 95

СіІп Авр Рго Туг Тпг Рпе Су СІп Су ТНг Гуз І ей Сім Пе Гуз Агд 100 105 110

ТНиг Маї Айа Айа Рго Зег Маї Рпе Пе Ре Рго Рго 5ег Авр Си Сп 115 120 125

Ї еи Гуз Зег Су Тиг Аа Зег Маї Маї Суз І еи І ей Азп Азп РІПе Туг 130 135 140

Су Азп 5ег СіІп Си Зег Ма! Тиг Си СІп Авр Зег І уз Авр Зег ТИг 165 170 175

Ні Гуз Маї Туг АІа Суз СіІшм Маї ТНг Ніз СіІп Су Геи Зег 5ег Рго 195 200 205

Уа! Тиг Гуз Зег Рпе Азп Аго Су Сім Сувз 210 215 «2105» 55 «211» 218 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-І951.171 С «4005 55

Азр Іе Ма! І еи ТНг Сп 5ег Рго Ар 5ег І еи Аа Маї Зег І еи Су 1 5 10 15 60

Сім Аго Аа Тпиг Пе Азп Суз Аго Аа Зег СіІп Зег Ма! Азр Тиг Рпе 20 25 30

Гуз Геи ГГ еи Пе Туг Аг Аа 5ег Авп І еи Сім Зег Су Маї Рго Азр 50 55 60

Агу РПе 5ег Су Зег СІу Зег Су ТПг Азр Рпе ТНг Геи ТНг Пе Зег 65 70 75 80 зегі еи Сп Аа Сім Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз Сп СіІп бег Авп 85 90 95

СіІп Авр Рго Туг Тпг Рпе Су СіІп Су ТНг Гуз Гей Сім Пе Гуз Ага 100 105 110

ТНиг Маї Айа Айа Рго Зег Маї Рпе Пе Ре Рго Рго 5ег Авр Сім Сп 115 120 125

Ї еи Гуз Зег Су Тиг Аа Зег Маї Маї Суз І еи І ей Азп Азп Ре Туг 130 135 140

Рго Агд Сім Аїа Гуз Маї СіІп Тгр Гуз Маї Азр Авзп Аа І еи СіІп Зег 145 150 155 160

ТугЗегі еи Зег Зег ТПгІ ей ТНг І еим 5ег Гуз АІа Азр Туг Сім Гуз 180 185 190

Уа! Тиг Гуз Зег Рпе Азп Агоу Су Сім Сувз 210 215 «2105» 56 «211» 218 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід01-Аба1 С «4005 56

Гуз Геи Г еи Пе Туг Аг Аа 5ег Авп І еи Сім Зег Су Маї Рго Азр 60 50 55 60

Уа! Тиг Гуз Зег Рпе Азп Аго Су Сім Сувз 210 215 «210» 57 «211» 218 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ід064-Ара1 С «4005 57

Агу РПе 5ег Су Зег СІу Зег Су ТПг Азр Рпе ТНг Геи ТНг Пе Зег 55. 65 70 75 80 зегі еи Сп Аа Сім Азр Маї Аїа Маї Туг Туг Суз СіІп СіІп Зег Азп 85 90 95 бо СіІп Авр Рго Туг Тпг Рпе Су СіІп Су ТНг Гуз Гей Сім Пе Гуз Ага

100 105 110

Уа! Тиг Гуз Зег Рпе Азп Аго Су Сім Сувз 210 215 «210» 58 «211» 1407 «212» ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-9013 НС «400» 58 ададдосії ддаїсней ісідсісідс сіддссдддс дсдссцддс сдаадідсад 6о0 сісдіддаді ссддсддадо асіддіссаа ссіддсддсі сссідаадсі діссідсдсі 120 дссіссддсі Ісасснсіс сассіасдсс аїдсасіюддао Ісаддсаддс сіссддааад 180 доссіддааї дддісддссд дайаддасс аадіссадса асіасдсіас сіасіасдсс о / 240 дссадсдіса адддссддії сасааїсісс сдддасдасі ссаадаасас сдссіаїсіс 300 сададааса дссідаадас ададдасасс дссдідіасі айдсасссдуд ддагацддудс 360 аксддаддс адісдссіа ддддссад ддсасссідд Ідасадісад сіссдссадс 420 асааагаддас сіадсдідії сссссіддсс ссіадсадса адіссасаад сддсддсасс 480 дсідсссіду дсідісіддї дааадасіас Шсссдадс ссдідасаді дадсіддаас 540

Ісіддсдссс ЩЗасаїссдд адідсасасс йсссідссо ідсіссадіс садсддссід 600 їІасадссюда дсадсдісді дассдісссі адсадсадсс дддаассса дассіасаїс 660

Івсаасдіда ассасаадсс сіссаасасс ааддіддаса ададддідда дсссаадієс 720 дасаада сссайассід сссссссіді ссідсіссід аадсідаддуд суссссНсс 0780 діснесіді (сссіссіаа дсссааддас асссідаїда іІсіссаддас ссссдаддід 840 60 ассідшідд дш«ащдоацці дісссасдад дассссдадод дааднсаа Нодіасоїіє 900 дасддсдщда аддідсасаа сдссаадасс ааассссддо аддадсадіааасадсасс 960

Тассдддідо щіссдідсі сассдідсід сассаддасі ддсідаасдуд сааддадіас 1020 аадідіаадд іІсадсаайдаа ддсссідссі дсссссаїсуд адаадассай іадсааддсі 1080 аадддссадс ссадддаасс ссаддідіаї асссіссссс сіадссддда ддадаїдасс 1140 т аадаассадд іІсадссідас сідссіддід аааддайсі асссіадсда саїсдсідїд 1200 дадідддада дсааддаса дсссдадаас аасіасаааа ссассссісс сдіссіддас 1260

Іссдаддса дсисщсї діасіссаад сісассдісд асаададссо діддсадсад 1320 доасаадюої Чадсідсіс сдудайдсас даддсісідс асаассасіа асссаааад 1380

Ісссідіссс Ісадссссдуд саадща 1407 7 «210» 59 «211» 1404 «212» ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-ІіДС1 ЛЕ НС «4005» 59 ададддсії ддаїснсй ісідсісідс сіддссдддс дсдссцдодс сдаадідсад (210) сіддіддааа дсддсддадо асіддідсад ссаддсддса дссідаадсі дісйдсудсс 120 дссадсддсі (сассісад сассіасдсс аїдсасіддд іІссдссаддс садсддсаад 180 о доассіддааї дддісддасд даїссддасс аададсадса асіасдссас сіасіасдсс 0240 дссіссдіда адддссддії сассаїсадс сдддасдаса дсаадаасас сдссіассід 300 сададааса дссідаааас сдаддасасс дссдідіасі асідсасссуд ддасаддус 360 аїссддсддс адшодссіа сіддддссад ддсасссідд іІсасадідіс садсдсдісд 420 ассаадддсс саїсддіс!ї сссссіддса сссіссісса ададсассісідддддсаса 480 е дсддсссіду дсідссідді сааддасіас Чссссдаас сддідасодді дісдіддаас 540

Ісаддсдссс Ідассадсдд сдідсасасс Цсссдорсід Іссіасадіс сісаддасіс 600

Іасісссіса дсадсдідої дассдідссс Іссадсадсі (ддудсассса дассіасаїс 660

Твсаасдіда аїсасаадсс садсаасасс ааддіддаса адададнда дсссаааїсі 720

І дасаааа сісасасад сссассдідс ссадсассід аадссдаадд ддссссдіса 780 7 діснесісі Іссссссааа асссааддас асссісаїда ісісссддас сссідаддіс 840 асадсода ддіддасдї дадссасдаа дасссідадо іІсаадіїсаа сіддіасод 900 бо дасддсдда аддідсаїгаа дссаадаса аадссдс9дду аддадсадіа саасадсасд 960

Тассдідідд садсодїссії сассдіссід сассаддасі ддсідаа(од сааддадіас 1020 аадідсаадод ісіссаасаа адсссіссса адсадсаїсуд адаааассаї сіссааадсс 1080 ? ааадддсадс сссдадаасс асаддюїас асссідсссс саїсссддда ддадаїдасс 1140 аадаассадд іІсадссідас сідссіддіс аааддснсі аїсссадсда саїсдссдід 1200 дадідддада дсааідддса дссддадаас аасіасаада ссасдссісс сдідсіддас 1260

Іссдасддсі ссцсцссі сіаїадсаад сісассдідд асаададсад діддсадсад 1320 дддаасцоїсі Ісісаїдсіс сдідадвсаї даддсісідс асаассасіа сасдсадаад 1380 7 адссісіссс Іщдіссссддаоа да 1404 «210» 60 «211» 1407 «2125 ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід01-Ара НС «400» 60 ащдаддосії ддаїснсй Ісідсісідс сіддссдддс дсдссцНддс сдаддіссад (210) сюдіддада дсддаддадо асісдідсад ссіддаддаї сссюдаадсі діссідсдсі 120 о дссіссддсі Чассцсіс сассіасдсс аїдсандду даддсаддос сіссддсаад 180 доассіддааї дддаюдодсад даїсаддаса аададсісса асіасдссас сіасіасдсс / 240 дссадсдіда ааддасдойії сассаїсісс сдддасдай ссааааасас сдссіассіс 300 садаюдааїйа дссідаадас сдаддасасс дссдідіасі асідсассад ддагацдрдус 360 аїссддсддс адшодссіа сіддддссад ддсасссідд дасадідіс садсдсіадс 420 т ассаааддсс ссіссдідн сссссіддсі сссіссадса адіссасаїс сддсддаасс 480 дссдсісюод дащісідої дааддасіас Яссссдадс ссдідасаді дадсіддаас 540

Ісіддсосіс Ідассіссдуд сдідсасасс Шессідсід дсідсадіс сіссддссіс 600

Тасадссіді ссіссдісої дасадідссс Іссіссадсс ддоудсассса дассіасаїс 660

Тсаасдіда ассасаадсс Цссаасасс ааддіддаїа адсдддісда асссаададс 720 їй Тсдасаада сссасассад ссссссцсс ссідсісссду адсіссіддуд аддсадсісс 780

Чдщсщді Кссссссаа дссіааддас асссіда(а ісадсаддас ссссдаадід 840 асадсодідо ддісдасої дісссасдад дассссдадд іІсааднсаа сіддіасоїд 900 даддадоад аддіссаїаа Ідссаадасс аадссссдду аддадсадіа саайссасс 960 во Тассдддідд щіссдідсі дасадіссід саїсаддасі ддсісаасдуд сааддадіасє 1020 ааадсаадод щіссаасаа додсісідссс дсссссаїсуд адаадасааї садсааддсі 1080 аадддссадс сіадддадсс ссаддюіас асссідсссс сиссаддда сдадсісасс 1140 аадаассадд щдісссдас адссісдд аадддсни асссіадсда саїсдсідід 1200 дадододдаді ссаасддаса дсссдадаас аасіасаада саасассссс іщдідсіддас 1260

Іссдасддсі ссцстссі діасадсаад сісассдідд асаааїсссд діддсадсад 1320 т ддааасдіді Ісадсідсіс сдудаюдсаї даддсссідс асаассацЦа сасссадааа 1380

Ісссідіссс дісссссду саадіда 1407 «210» 61 «211» 1407 «212» ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід004-Ара НС «400» 61 ащдаддосії ддаїснсй Ісідсісідс сіддссдддс дсдссцддс сдаддісєсад (210) т сіддісдада дчсддсддадд асіддіссад ссіддаддаї сссдааодсі сіссідідсс 120 дсіадсддаї ЧМасснсад сассіасдсі аддсанддд даддсаддс Кссддсаад 180 ддасддаді дддаідддасд дайсддасс аададсісса айасдссас сіацасдсс 0240 дснссдада адддссододії сассаїсісс адддасдасі ссаадаасас сдсНассід 300 садаюдаасі сссісаадас сдаддасасс дссдідїай асідсасссуд ддасаюдоус 360 о аїссддаддс адксдсна бддддасад ддсасссідд дассдідад сіссдссісс 420 ассаадддсс снссдідії сссісіддсс сссідіадса ддіссассад сдадіссаса 480 дсідсісідд дсідісідої даадданаї Чссссдадс ссдідасаді діссіддааї 540 адсддсдссс щдассіссду сдідсаїасс Цсссідссо іІссідсааад садсдудссід 600

Тасадссідї ссіссдідді дасадісссі Іссіссадсс ддддаассаа дассіасасс 660 е саащіюда ассасаадсс іадсаасасс ааддіддаса ададддісда дсссаадієс 720

Тсодагаада сасасассіс сссіссНсс ссідсіссід адсідсісдуд сддаадсадс 780 діднесіді (сссіссіаа дссіааддас асссідаїа ісадссоддас сссідаддюд 840 ассідідієсд ддаіддасої дісссасдаа дассссдадо Ідааайсаа сіддіаса4д 900 дасддсдісд аддідсасаа сдсіаадаса ааасссаддуд аддадсадіа саайссасс 960 7 Тассдддісд щіссдідсї дассдідсід сассаддасі ддсідаасудуд сааададіас 1020 аадідіаадд іІсадсаадаа ддсссідссї дсссссацду адаадассаї Кссааддсс 1080 бо аадддссадс ссадддаасс ісаддіюдіас асссідссіс ссісссддда сдадсідасс 1140 аадаассадд іІсадссідас сідссісдід аадддснсії асссіадсда саїсдссдід 1200 дадідддасді ссаасддсса дссідадаас аацйасаада ссассссссс Ідіссіддас 1260

Іссдасддаї ссцснссї діасіссаад сідасадідд аг(аадісссод діддсадсад 1320 ддааайщіоі ісіссідсіс сдісаїдсас даадсссідс аїаассасіа сасасадаад 1380 адссідіссс дадсссідд саадща 1407 «210» 62 «211» 708 «212» ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-І901.37Г1 С «400» 62 ащдаддосії ддаїснесй Ісідсісідс сіддссдддс дсодссцдадс содаїасад (210) сідасссада дссссдагад ссіддсідюд адссіддодсу адададссас саїсаасідс 120 адддссіссс ададсдісда сасснсдас Іасадснсс Іссасіддіа ссадсадаад 180 ссіддссадс сссссаадсі дсідаїсіас адддссадса ассіддадад сддадідссс 240 даїадонса дсддсадсдо сіссддаасс дасЩассс Ісассаїсад сісссюдсад 300 дссдадда (ддссадісіа сіасідссад сададсаасс аддассссіа сассшщддс 360 садддсасса адсддадаї саададдасс діддссдссс ссіссдіднН саїсцЦсссії 420 сссадсдасд адсадсідаа дадсддаасс дссадсодідд дідссідсі даасааснс 480

Іассссаддуд аддссаадодї дсадддаад дісдасаасд сссідсадад сддсааїадс 540 саддададсд Ідассдааса ддасадсаад дасіссассі асісссідад садсасссід 600 асссідадса аддссдасіа сдадаадсас ааддідіасод ссідідадді дасссассад 660 ддасідадса дссссдідас ааададсії аасаддддсд аддсда 708 «210» 63 «211» 708 «212» ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-І901.171 С «400» 63 ащдаддосії ддаїснесй Ісідсісідс сіддссдддс дсодссцдадс содаїасад (210) сідасссада дссссдайїад ссіддсідід адссідддсуд адададссас саїсаасідс 120 адддссіссс ададсдісда сасснсдас їасадснсс Іссасіддіа ссадсадаад 180 бо ссіддссадс сссссаадсі дсідаїсіас адддссадса ассіддадад сддадідссс 240 даїадонса дсддсадсдо сіссддаасс дасЩассс Ісассаїсад сісссюдсад 300 дссдадда (ддссадісіа сіасідссад сададсаасс аддассссіа сассщддс 360 садддсасса адсддадаї саададдасс діддссдссс ссіссдіднН саїсцЦсссії 420 сссадсдасд адсадсідаа дадсддаасс дссадсодідд дідссідсі даасааснс 480 їІассссадду аддссаадої дсадддаад дісдасаасд сссідсадад сддсааіадс 540 саддададсд Ідассдааса ддасадсаад дасіссассі асісссідад садсасссід 600 асссідадса аддссдасіа сдадаадсас ааддідіасод ссідідадді дасссассад 660 ддасідадса дссссдідас ааададсії аасаддддсд аддсда 708 «210» 64 «211» 708 «212» ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318-Ід01-Ара1 С

«400» 64 ащдаддосії ддаїснесй Ісідсісідс сіддссдддс дсодссцдадс содаїасад (210) сідасссада дссссдайїад ссіддсідід адссідддсуд адададссас саїсаасідс 120 адддссіссс ададсдісда сасснсдас Іасадснсс Іссасіддіа ссадсадаад 180 ссіддссадс сссссаадсі дсідаїсіас адддссадса ассіддадад сддадідссс 240 дагаддиса дсддсадсдд сіссддаасс дасЩассс Ісассаїсад сісссідсад 300 дссдадда (ддссадісіа сіасідссад сададсаасс аддассссіа сассшудс 360 садддсасса адсддадаї саададдасс діддссдссс ссіссдіднН саїсцЦсссії 420 сссадсдасд адсадсідаа дадсддаасс дссадсодідд дідссідсі даасааснс 480 їІассссадду аддссаадої дсадддаад дісдасаасд сссідсадад сддсаайадс 540 саддададсд Ідассдааса ддасадсаад дасіссассі асісссідад садсасссід 600 асссідадса аддссдасіа сдадаадсас ааддідіасод ссідідадді дасссассад 660 ддасідадса дссссдідас ааададсії аасаддддсд аддсда 708

«210» 65 «211» 708 «212» ОМА «213» Апіїсіа!І Зедоепсе

«220» «223» 0318-Ід04-Ара!1 С «400» 65 бо ададдодсії ддаїснсй ісідсісідс сіддссдддс дсдссцНдас сдаїасадід (210)

сідасссада дссссдайїад ссіддсідід адссідддсуд адададссас саїсаасідс 120 адддссіссс ададсдісда сасснсдас їІасадснсс Іссасіддіа ссадсадаад 180 ссіддссадс сссссаадсі дсідаїсіас адддссадса ассіддадад сддадідссс 240 даїадонса дсддсадсдо сіссддаасс дасЩассс Ісассаїсад сісссюдсад 300 дссдадда (ддссадісіа сіасідссад сададсаасс аддассссіа сассщдддс 360 садддсасса адсддадаї саададдасс діддссдссс ссіссдіднН саїсцЦсссії 420 сссадсдасд адсадсідаа дадсддаасс дссадсодідд дідссідсі даасааснс 480 їІассссадду аддссаадодї дсадддаад дісдасаасд сссідсадад сддсаайадс 540 саддададсд Ідассдааса ддасадсаад дасіссассі асісссідад садсасссід 600 асссідадса аддссдасіа сдадаадсас ааддідіасод ссідідадді дасссассад 660 ддасідадса дссссдідас ааададсії аасаддддсд аддсда 708 «210» 66 «2115 5 «2125 РКТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ - МН СОК1 «400» 66

ТНг Туг Аа Меї Ні 1 5 «210» 67 «211» 19 «2125 РКТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ- МН СОК2 «400» 67

Ага Ме Агоу ТПг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа ТНг Туг Туг АІа Азр 5ег 1 5 10 15

Уа! Гуз Азр «210» 68 «211» 10 «2125 РКТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ - МН СОКЗ 60

«400» 68

Азр Меї Су СіІп Агоу Агоу СіІп Ре Аа Туг 1 5 10 «210» 69 «211» 15 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ - МІ СОК1 «400» 69

Ага Аа 5ег Сім бег Ма! Азр Тпг Ре Ар Туг 5ег Ріє Геи Нів 1 5 10 15 «210» 70 «2115 7 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ -МІ СОК2 «400» 70

Ага Аа 5ег Авп ГГ еи Си Зег 1 5 «2105 71 «211» 9 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ -МІ СОКЗ «4005 71

СіІп Сп бег Азп Си Азр Рго Туг ТНг 1 5 «2105 72 «211» 10 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АВ - МН СОКЗ (тшап) «4005 72

Авр СіІп Су Пе Агу Аг Сп Ре Аа Туг 1 5 10 «210» 73 «211» 10 60 «212» РЕТ

«213» Апіїсіа!І Зедоепсе «223» 0318 АВ - МН СОКЗ (тшап) «4005 73

Авр І еи Су Пе Агу Агу СіІп Ре Аа Туг 1 5 10 «210» 74 «2115 5 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ - МН СОКІ (тшап) «400» 74

ТНг Туг Ава СіІп Нів 1 5 «2105 75 «2115 5 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ - МН СОКІ (тшап) «4005 75

ТНг Туг Ага Г еи Ні 1 5 «210» 76 «211» 451 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 0318 АБ - НС (ІдД04) «4005» 76

Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе 5ег Агу Азр Азр Зег І уз Авзп ТАг 60 65 70 75 80

Гуз Рго зег Азп ТПг Гуз Маї Азр Гуз Агу Маї Сім 5ег Гуз Туг СУ 210 215 220

Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Си Рпе І еи Су Су Рго Зег 225 230 235 240

Уа! Рнпе Геи Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр Тпг І ем Мей Пе Зег Ага 245 250 255

Тиг Рго СіІш Маї Тиг Суз Маї Маї Ма! Азвр Маї Зег СіІп Си Ар Рго 260 265 270

Сім Маї СІп Ріе Авзп Тгр Туг Ма! Азр Су Ма! Сіши Маї Ні Авп Аа 275 280 285

Гуз ТАиг Гуз Рго Агд Сім Сім СІп Рпе Азп 5ег ТНиг Туг Агу Маї Маї 290 295 300 зег Ма! Геи ТНг Ма! І ем Ні СіІп Азр Тгр Гей Азп Су Гуз Сім Туг 305 310 315 320

Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп І уз Су Геи Рго 5ег Зег Пе Сім Гуз ТНг 325 330 335

Пе Зег Гуз Аа Гуз Су СІп Рго Агд Си Рго СіІп Маї Туг Тиг Геи 340 345 350

Рго Рго Зег СІп Сім Сім Меї Тпг Гуз Азп Сп Маї Зег Геи Тиг Сув 355 360 365

Ї ем Ма! Гуз Су Ріе Туг Рго Зег Азр Пе Аїа Маї! Сім Тгр Сім 5ег 370 375 380

Авп Су СіІп Рго Сіи Азп Азп Туг Гуз ТНг ТНг Рго Рго Маї Гей Азр 60 385 390 395 400 зЗег Авр Су бег Рпе Ре Геи Туг Зег Агд Геи ТНиг Ма! Авр Гуз 5ег 405 410 415

Агу Тгтр СІп СіІш Су Азп Маї Рпе Зег Суз 5ег Ма! Меї Ніз Сім Аа 420 425 430

Ї еи Ні Авп Азр Іе Маї ем ТНг Сп Зег Рго Авр зег І еи Аа Маї 435 440 445 зегіІ еи Су 450 «210» 77 «211» 330 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» УМ Ід01 Сопеїапі Кедіоп (АїПоїуріс Магіапі) «4005 77

Зег Тиг Зег Су СУ ТНг Аа Аа І еи Су Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30

Ре Рго Си Рго Маї ТНг Маї Зег Тгр Азп 5ег Су Аа І еи ТНг 5ег

Су Ма! Ні5 Тиг Ре Рго Аїа Маї Гей Сп Зег Зег СУ І еи Туг 5ег 60 35

Ї еи 5ег Зег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег Зег Зег І еи Су ТНг СіІп ТАг 65 70 75 80

ТугПе Суз Азп Маї Авп Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТПг Гуз Маї Азр Гуз 40 85 90 95

Аг Маї СіІши Рго Гуз 5Зег Сув Авр Гуз Тпг Ніз Тиг Суз Рго Рго Сувз 100 105 110 45 Рго Аа Рго Сип Гей Геи Су Су Рго Зег Ма! Рпе Геи РНе Рго Рго 115 120 125

Гуз Рго Гуз Азр Тпг ей Мей Ше Зег Агуд ТНг Рго Сім Маї Тиг Суз 130 135 140 50

Туг Ма! Азр Су Маї СіІш Маї Ніз Азп Аа Гуз Тпг Гуз Рго Агу Сім 55 165 170 175

Сім Сп Туг Азп 5ег ТНг Туг Агу Маї Маї Зег Ма! І еи ТНг Ма! І еи 180 185 190 бо Ні СіІп Азр Тгр Гей Азп Оу Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Азп

195 200 205

Сп Рго Агу Си Рго СіІп Маї Туг ТАг Гей Рго Рго бег Агу Сім Си 225 230 235 240

Меї Тпг Гуз Азп Сп Маї 5ег І еи ТНиг Суз Геи Ма! Гуз Су Рпе Туг 245 250 255

СіІп Гуз бегіІ ей Зег І еи Зег Рго Су Гуз 325 330 «210» 78 «211» 330 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 1дД01 11 НС Сопвіапі Кедіоп «4005 78

Су Ма! Ні5 Тиг Ре Рго Аїа Маї Гей Сп Зег бег СУ І еи Туг 5ег 60

Ї еи 5ег Зег Маї Ма! Тнг Маї Рго 5ег Зег Зег І еи Су ТНг СіІп ТАг 50 65 70 75 80

ТугПе Суз Азп Маї Авп Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТПг Гуз Маї Азр Гуз 85 90 95 55 Аг Маї СіІши Рго Гуз 5Зег Сув Авр Гуз Тпг Ніз Тиг Суз Рго Рго Сувз 100 105 110

Рго Аа Рго Си Аа Сім Су Аа Рго 5ег Ма! РНе Геи Ре Рго Рго 115 120 125 60

Гуз Аа І еи Рго 5ег Зег Пе Сім Г ув ТАг Пе Зег І уз Аа Гуз Су 210 215 220

Сп Рго Агу Си Рго СіІп Маї Туг ТАг Гей Рго Рго бег Агу Сім Си

ЙД225 230 235 240

СіІп Гуз бегіІ ей Зег І еи Зег Рго Су Гуз 325 330 «210» 79 «211» 330 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 101.37 НС Сопвіапі Кедіоп «400» 79

Зег Тиг Зег СІу СУ ТНг Аа Аа І еи Су Суз І еи Ма! Гуз Азр Туг 20 25 30

Су Маї Ні5 Тиг Ре Рго Аїа Маї Гей Сп Зег бег СУ І еи Туг 5ег 60 50 55 60

ТугПе Суз Авзп Маї Авп Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТПг Гуз Маї Азр Гуз 85 90 95

Аг Маї СіІши Рго Гуз 5Зег Сув Авр Гуз Тпг Ніз Тиг Суз Рго Рго Сувз 100 105 110

Рго Аа Рго Си Аа Сім Су Аа Рго 5ег Ма! РНе Геи Ре Рго Рго 115 120 125

СіІп Гуз бегіІ ей Зег І еи Зег Рго Су Гуз 325 330 «210» 80 «2115 5 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» І іпКег 60

«400» 80

Рго Маї Су Маї Маї 1 5 «210» 81 «211» 121 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 318 АБ - Мшапі «400» 81

Сім мМаї СіІп І еи Ма! Сіи бег Су Су Су Гей Маї СІп Рго Су Су 1 5 10 15 зегі еи Гуз І еи Зег Суз Аа Аа 5ег Су Рпе Тпг Ре Зег Тпг Туг 20 25 30

Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе Зег Агу Ар Азр Зег І уз Авзп ТАг 65 70 75 80

Туг Сувз Тиг Агу Авр СіІп Су Пе Агу Агу СіІп Рпе АПа Туг Тгр СУ 100 105 110

СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег 115 120 «210» 82 «211» 121 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 319 АБ - Мшапі «400» 82

Су Агу Ме Аго Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа ТНг Туг Туг Аа Аїа 60 50 55 60

Туг Суз Тиг Агу Авр Геи Су Пе Агу Агду СіІп Ре Аа Туг Тгр СУ 100 105 110

СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег 115 120 «210» 83 «211» 121 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 320 АБ - Мшапі «400» 83

Аа СіІп Ні Тгр Маї Агу СіІп Аїа 5ег Су Гуз Су Геи Сім Тгр Маї

Су Агу Ме Аго Тпг Гуз Зег Зег Азп Туг АІа ТНг Туг Туг Аа Аа 60 35

Аа Туг Геи СіІп Меї Авп зЗег І еи Гуз Тиг Сім Азр ТНг Аа Маї Туг 40 85 90 95

Туг Суз Тиг Агу Азр Меї Су Пе Агу Агу СіІп Ре Аїа Туг Тгр СУ 100 105 110 45 СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег 115 120 «210» 84 «211» 121 50 «212» РЕТ «213» Апіїсіа!І Зедоепсе «220» «223» 321 АБ - Мшапі 55 «400» 84

Сім мМаї СіІп І еи Ма! Сіи Зег СіІу СІу Су Геи Маї СіІп Рго Су Су 1 5 10 15 60 зегі еи Гуз І еи Зег Суз Аа Аа 5ег Су Рпе Тпг Ре Зег Тпг Туг 20 25 30

Аа Гей Ніз Тгр Маї Агд СіІп Аа Зег Су Гуз СУ І еи Сім Тгр Маї 35 40 45

Зег Ма! Гуз Су Агуд Ре Тпг Пе 5ег Агу Азр Азр Зег Гуз Азп ТНг 65 70 75 80

Туг Суз Тиг Агд Азр Меї Су Пе Агу Агду СіІп Ре Аїа Туг Тгтр СІу 100 105 110

СіІп Су ТНг І еи Ма! Тиг Маї Зег Зег

Claims

115 120 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з тригерним рецептором-1, який експресується на мієлоїдних клітинах (ТКЕМ-1), яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить ЗЕО ІЮ МО: 50, ЗЕО ІО МО: 51 або 5ЕО ІЮО МО: 50, що не має С-кінцевого лізину та має 5ЕО ІЮО МО: 49 (І 5РС) на С-кінці, і де легкий ланцюг містить 5ХЕО ІО МО: 54.

2. Антитіло за п. 1, де важкий ланцюг містить 5ЕО ІО МО: 50, що не має С-кінцевого лізину та має 5ЕО ІО МО: 49 (І 5РС) на С-кінці, і де легкий ланцюг містить 5ЕО ІО МО: 54.

3. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з тригерним рецептором-1, який експресується на мієлоїдних клітинах (ТКЕМ-1), яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить ЗЕО ІО МО: 50, що не має С-кінцевого лізину та має ЗЕО ІЮ МО: 49 (І 5РС) на С-кінці, і де легкий ланцюг містить 5ХЕО ІЮО МО: 54.

4. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з тригерним рецептором-1, який експресується на мієлоїдних клітинах (ТКЕМ-1), яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить 5ЕО ІО МО: 50 і легкий ланцюг містить 5ЕО ІЮ МО: 54.

5. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з тригерним рецептором-1, який експресується на мієлоїдних клітинах (ТКЕМ-1), яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить 5ЕО ІО МО: 51 і легкий ланцюг містить 5ЕО ІЮ МО: 54.

6. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з тригерним рецептором-1, який експресується на мієлоїдних клітинах (ТКЕМ-1), яке містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить 5ЕО ІО МО: 52 і легкий ланцюг містить 5ЕО ІЮ МО: 54.

7. Біспецифічна молекула, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-6, зчеплене з молекулою, яка має другу зв'язуючу специфічність.

8. Нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло за будь-яким з пп. 1-6.

9. Вектор, який містить нуклеїнову кислоту за п. 8.

10. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 9.

11. Імунокон'югат, який містить антитіло за будь-яким з пп. 1-6, зчеплене з агентом.

12. Фармацевтична композиція для інгібування активності ТКЕМ-1 при лікуванні запального захворювання або автоїмунного захворювання, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-6, біспецифічну молекулу за п. 7, нуклеїнову кислоту за п. 8, вектор за п. 9, клітину-хазяїна за п. 10 або імунокон'югат за п. 11 і носій.

13. Спосіб інгібування активності ТКЕМ-1 у індивідуума, який потребує цього, який включає введення індивідууму антитіла за будь-яким з пп. 1-6, біспецифічної молекули за п. 7 або імунокон'югата за п. 11.

14. Спосіб за п. 13, який додатково включає введення одного або декількох додаткових терапевтичних засобів.

15. Спосіб лікування запального захворювання або автоїмунного захворювання, пов'язаного з експресією ТКЕМ-1, у індивідуума, який потребує цього, який включає введення індивідууму бо антитіла за будь-яким з пп. 1-6, біспецифічної молекули за п. 7 або імунокон'югата за п. 11.

16. Спосіб за п. 15, де запальне захворювання або автоїмунне захворювання вибирають з групи, що складається з запального захворювання кишечнику (ВО), хвороби Крона (СО), неспецифічного виразкового коліту (С), синдрому подразненого кишечнику, ревматоїдного артриту (КА), псоріазу, псоріатичного артриту, системного червоного вовчака (51 Е), вовчакового нефриту, васкуліту, сепсису, синдрому системної запальної відповіді (5ІК5), діабету типу І, хвороби Грейвса, розсіяного склерозу (М5), автоїмунного міокардиту, хвороби Кавасакі, захворювання коронарної артерії, хронічного обструктивного захворювання легень, інтерстиціального захворювання легень, автоїмунного тиреоїдиту, склеродермії, системного склерозу, остеоартриту, атопічного дерматиту, вітиліго, реакції "трансплантат-проти хазяїна", синдрому Шегрена, автоїмунного нефриту, синдрому Гудпасчера, хронічної запальної демієлінізуючої поліневропатії, алергії астми, інших автоїмунних захворювань, які є результатом або гострого, або хронічного запалення, і будь-якої їх комбінації.

17. Спосіб за п. 16, де запальне захворювання або автоїмунне захворювання являє собою хворобу Крона.

18. Спосіб за п. 16, де запальне захворювання або автоїмунне захворювання являє собою неспецифічний виразковий коліт.

19. Спосіб інгібування активності ТКЕМ-1 при лікуванні хвороби Крона у індивідуума, який потребує цього, який включає введення індивідууму виділеного антитіла, де вказане виділене антитіло містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить 52ЕО ІЮ МО: 50, що не має С-кінцевого лізину та має 5ЕО ІЮ МО: 49 (І 5РО) на С-кінці, і де легкий ланцюг містить ЗБОЮ МО: 54.

20. Спосіб інгібування активності ТКЕМ-1 при лікуванні неспецифічного виразкового коліту у індивідуума, який потребує цього, який включає введення індивідууму виділеного антитіла, де вказане виділене антитіло містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить 5ЕО ІО МО: 50, що не має С-кінцевого лізину та має ЗЕО ІЮ МО: 49 (І5РС) на С-кінці, і де легкий ланцюг містить ХЕО ІЮ МО: 54.

21. Спосіб інгібування активності ТКЕМ-1 при лікуванні хвороби Крона у індивідуума, який потребує цього, який включає введення індивідууму виділеного антитіла, де вказане виділене антитіло містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить ЗЕО ІО МО: 50 і легкий ланцюг містить 5ЕО ІО МО: 54.

22. Спосіб інгібування активності ТКЕМ-1 при лікуванні неспецифічного виразкового коліту у індивідуума, який потребує цього, який включає введення індивідууму виділеного антитіла, де вказане виділене антитіло містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить 5ЕО ІЮ МО: 50 і легкий ланцюг містить 5ЕО ІЮО МО: 54. со Варіяну 1 Аваліт ов оММЕК ОЇ. Боб лмсь ен ВТМ ОЕМ нн В КМ ДЕН ЯК а

Фіг. 16 якаїккі й ; Сех ВЕ меле же фербупання . снворют плин . . занавйляжеуна ай ЗЕ ВЯЕЕЕя вк ТЕС САЖІ Нести »

Фіг. 2А час звАВНЯХ са сіна Меакйня ОВЕН оорну фзраування І ПЕ ТС (А Ева (ТЕ) КНенесіні) режекійьнирні 0 зкакоззклеванях КК кни ниинннннинииннии ні М МОН ВИ шо шк ПИ

Фіг. 265 сЕеУДАляВНЯЛЕ КеНТЕКНОЕте ВЕсістиченє Ваз і да ТЕ м т тк " мАВІзтЯ У ДЕ : ще Я з щ- Це. зок " 1 щ ІЗ я ІН Й Є з «ані ; , в ш | в ; ! 5 ЕЕ УДЕ И З н я. кенацетпгореюії век апЕглютіля й т х ш 1 ЩЕ ТЕ жави 5 5 Б ЛИ я В Я КІ а Я и ОТО тела пев тя и дтп ю петлею те ета я ТАТИ в ШЕ; її ТЕ щ : - щі ї : : і й ВЕ г- Ж Е Ж г:

7. пнтрнннянй -ш ; Е і Я : Що | І и 7 - - тт з ї Е Б Е а Перадсне ростяпгевиння штавичень вв працніку: нваває» клітини вововеттрвви Смс

Фіг. З

Фіг. 4 АД АЛЛІКА пооі доти чні мо ря кі со хай і, д нання ся у - с - йу КС я ї і. уеУКЕтьткя К сл Мікс. тест З й ї (Донори ТіеитоМ РОМОМ ко 05500 КНИМ СВК МІВ 01601005 ин ння 2319 еВ - МЕ ння 10025 вжи ши ши Он ПГУ ние ПИЙ, 5 Із Е з ЗБЕ. ІЗ З г | чі 000 (36. 5 0ШМБ 1 : : : : Ст. відхилюзаря, | а і їде

Фіг. ЗА б ОТ нг повитмених ей клітин Бе 7 Ся (ПМ) (оереяя, основи хлітня КО Сп вла по) ТР | нат | фовчнюю | Гб | чин тлі АТ вів 11111495

0.05 0475 ваз 11360 пу 19,2 ве 905 | Б в.о : под | вом

Фіг. 56

І Її 1 8 щі ї ЗК я 1 ЕТ шир мя, Я во и м обл я 00 00 зей З а ОВА Я М. Же ОО кониентрація Си конізентраккія (ЕС е т- 100 Й Яр а т : й т 290 і, й ЕВ В Ва. ИЙ в ро - дохо 0109 МОЮ в ОО 1 0 ню юю вхивкевєрнтих СОЇ й ковоБетеанвія КАК 150 дя я. в 7 ово. во Е п пану Ж о ОК 043 1 Як 10 ЕОСНАКНХХ - ШИЯ ШЕ то До ох ою комакентратави СОМ) Го вовпураєгрошкія сп, с

Фіг. БА Донор ле во дів 16 5 | що сіяв

2 . ї ви ПІ здаалланннинттттнтн т ж 0: пет ОЗ 01110500 іяхЖНОЮЮ а ЩО й як ОО МОЮ жонкентуатія С т кекс реакція СІЙ ще кеназентуатвія Сл Е Ва ян польню їв «у зво Яю| 07, дю : -- Е Б м Сай Мт: ж с т пи -о ДЯ т тт, Ши бло то 10000 тббтомю со ВОК ОЖЄ Ж МЮ ЮМОЮю зожклеевсгуавкня Ех вОонІжеетрація сл е ща. я оо я як ЗО. 5 Ж о . 322 5 х с я ; я Ж Шк 3 10100000 ла Меюв ро ЮК М Ото 103 зКНЖхю комнентуантя (тях - жеагадезтереія сив К

Фіг. 66

Донор ло -

щі. В о» ЖЕ во є» я-г ЗО. з " ще де 126 З вал кл і ак ж БЮ тр ОО доти 1 кою - 5 ям то яю і я протя й - ЦІ І о Шо Боові 811 8 0 «ОМ бог ше ОКО ор кю кенаненстраня (Мі; кеннаятуннекя КУ 150 - ВО В ; У в вд т Сай тож ; 290 з | обя б о

5 . В кт З : Ж о Оз о Вл 000 ЯНЮВ ТЕ хкннютуюттттттт р тонн зааажарнянная ря чо вялногіечн втаккі СКУ ЕЕ по ва Я 00 КК КІ НКЮ - Е ваонпентрація сем НО - 2 ва. ву йо 7 ї пд 1055 юю з22 5 Я он шен, ЖОВКОЄКОНОЗАЯ ГОМ чн . вочю п - як ЩО щі Б ОО 100 Об по ЕК Ге веншезприкія СЕМ

Фіг. 6 ж І: її Е- ; - ! І Ж й Є мости З Е ж ! ей Яд о БО 100 ї50 200 концентрація (мгомлу

Фіг. 7

Іжуногенний потеншал антитіла до ТКЕМ 1. (40 донорів РЕМС) ФО ФО----нтттННННТНТтНЮЧНЮЯТ Е р ЗЕ КЕ З пі фо ве ПОН нн ; 4 Во їх. - Р високий потенціал і девой : ; МАКИ, піхвах шоб воно : Е а Мк ФО нн т дев ДДТ в . Е Гееляевю Ген пет середній потенціял птн ЕН КК деле КВ нянні , ; 20 Бош кое що ще ож Б низький нотенціал а а-ля 20 Менні іч 0... авастин кін мів о зівчюєіл З1В-де З

Фіг. 8 воніпах звязків ТКЕМ-Ї, які зв'язуються з імобілізованим рев Ду дня Кос орооеотЕетЕ стер еетеееЕеет сетер ф-т тт ЕЕ пдв ко Ж М ня дич В, ток котом Диннмнаннннннчниннннни ДО чляняяалляалнннкюй КО фест -тнт і МЕ М Я они -Ж ще хх аж птн шт З от з» -Щ А к -- ша й : Е СО іх 15 ІВ З ! 1 | - зе - ЩЕ НО . пня не Кт ча се р пе щі. Бе І. 105 А ре І. ЩО ж р ще пе пеня |В Ада ння вс Аа здав ів44 ша в псеКа Стобойа сопел

Фіг. ЗА і , мначий Бека Ку люлський БеКп Ки диню Бека Ки шко яв. зт ву ШОК Б' А во В Ж нще Я мо в їж СВ, Я А МО вм А 1 в. : В й ж МО ху В інн Ко Ф дж М ххх нтия пе. ей з 1 УМ з етеннрутттетрттьння «АЙ 5. рн орожрнтрюттфрюдюя 20 Фежлрнярию тт кетретятрннтюяя й оне ай Ж по ою Вб? о 00 зо 500 о чає е час с час є А ко Бо вим а Іді-ва Що ввів Дощ

Фіг. 936

Теепт і ТО, одини о долетіти АНА АТ тент З ще ОСС спиш 2020111 оддддднннннннтннттінттзтнтенттни М снеснсоснтітіізтоттссотттетсяоя Е І ве 000000 ! Я зов Ж. СС... пиши дова сн ооо 2 20 СЛЮБІАЬНЕИ

Е -. | | венссЗааняя Ж Воло: й пеш ни нн ПТ его, важ Я ет пт хе с: ор сетикнякеехо рівні вВ лав пня пт нен РОБ кожні мкА ож МО М 00300 юс оо ббвнсх ЛК. ОМ Днийй св. З. лених іде-ква івнза-днка тесля вра івизнЕоЗх

Фіг. 10А зірвана ся 40 до. шия а рин ід о ! Ідо1-Ава в ІК іща4-Ава: ' Била ня р «3 о; ях я подзльнія З Гі ів; ! | : в ! ще іх ї «ві . ст Гео І і ВЕ. І : ї ї до на ї : і г Я в) ооо Бо Ї рбзнуолфлтндюом Ї дзюдо! рува ї г трутні ЗБ ТЕ рення ІД вик вк Петі Е БВ ще і е зе г 7 Р : шк х 7 М нанні стік тс бої т-е- т Зо що я т 9 : пор ла (нкочнта :

Я 1. в ї : ТО 7 Я КО роз І і і о : Б ; ті Ї прче Деві Пен ! ден Годі Вч; Ї : 5 : в. ГО встннт М. і і Ії і т : і; Рі фунт з рЛЯявНІЗ С ЦД до і ї що я зі | В ї- ! ! яти о уче Ж Бенюні ред Я вв і ТЯ нка стій ОЇ В вк ї хояков гуунннмАХ ВО ше сш До киш

Фіг. 106

075 16 ЕЦЗА водо до0ю «о гос: Д- й - - зок Е хм | ; 109 ч | | | ї Пе вав вавииВих ож Ж о Фрош. ЄМ С вопі ос) дб біс Це од» рія КУ ОМ пу Бех а а шЕ В ж Б що ЩІ ОВ в ож тт с з ово хвви ЕВ х за бот СА жк те ос же СК ро шко в с свововнаеОовЗІа й т т Ж Од Сно-Ссозеа СНО-Созра СНО-СОзра

Фіг. 11А 0276 8 ЕЧБА ЗлоФо: 2о00о ; оо 8 в Б З ! : 100 жі х М ооо ШЕ ні ско ле шт. фу шко мес се Ол ле сх А о ля НЯОБІ5НУк 55533555 33555355 вин 5 В ш шо ц 5 Г пово ни ее а овІОсаВВоЗзВаИВевВВОВ гу мощі їі ре ж І Бк о з З о Ше я ях ЩО ОО М ЩО ЩУ ТБ ЕдвБІЕсВИсягиВоВВО в 5 свт оеваеив ї що ВІ я Як я в ж ож І ГК - СНО-Созга СНО-созак СНечСозов

Фіг. 116 рз41 6 ПВА Ко: 15 ооо БОЮ Я зо Е 2 мо й в шо. злив І "Шк яп іо рт гелій каЗоеЕв8Ів 3 зве БОБ ве ж РФОБЕОНЕВНЯШЕВИВИНОВНВО БТ а пдв ЕнЕЕЗВВІВВсСВІ ВЕ с 5 лев ВВ ВІ Юа ся ; дк їв іс С Же ва а ча су в су в'зветьее в Я с с яння. фр рення СНО-сОзоа Ссно-созоа СНОНСЮЗоа

Фіг. 116 р179 ТМЧЕа ЕЦЗА оч ВОпОчІ о Я - що 0 - ЩО Жде во Пефеуя У те ь т ; ; гайда яв зе" а овивІНнНВаВЕвИАВе Жов а Ж щомошщо же Хе ож що Ж ще Ще ож ще 8 0 ек т БЕВБВОсоВрооБ5ВОВО ее шва веоевО ет в снО-сохв сносодея 0 СНО-СОа

Фіг. 11Г