UA74146C2 - Модифікований хімеричний поліпептид з покращеними фармакокінетичними властивостями - Google Patents

Abstract

Описано модифіковані химерні поліпептиди з поліпшеною фармакокінетикою. Зокрема даний винахід стосується модифікованих химерних поліпептидів рецептора FIt1, що модифіковані з метою поліпшення їх фармакокінетичного профілю. Даний винахід також стосується способів одержання та застосування модифікованих поліпептидів, що включають використання модифікованих поліпептидів для зменшення або усунення втрат плазми та/або проникливості судин у ссавця.

Description

Опис винаходу

Заявка з пріоритетом за попередньою заявкою США МобО/138133 від 8 червня 1999р. Дана заявка містить 2 посилання на різні публікації. Посилання на вказані публікації в повному обсязі включено в представлену заявку.

Представлений винахід стосується модифікованих поліпептидів з покращеною фармакокінетикою. Зокрема, даний винахід стосується поліпептидів рецепторів РМ, модифікованих з метою покращення їх фармакокінетичного профілю. Представлений винахід стосується також способів одержання та застосування модифікованих поліпептидів, які включають використання модифікованих поліпептидів для зменшення або 70 пригнічення втрати плазми та/або проникності судин у ссавців, але не обмежуються цим.

Здатність поліпептидних лігандів зв'язуватися з клітинами та таким чином викликати фенотипічну реакцію, таку, як ріст, збереження життєздатності, секреція продуктів життєдіяльності або диференціювання клітин, часто опосередкована трансмембранними рецепторами на клітинах. Позаклітинний домен таких рецепторів (тобто частина рецептору, розташована на поверхні клітини) є найбільш специфічною частиною молекули, так як він містить білок, який здатен зв'язуватися з лігандом. Зв'язування ліганду з позаклітинним доменом зазвичай викликає трансдукцію сигналу, завдяки якій біологічний сигнал передається до внутрішньоклітинних мішеней.

Трансдукція сигналу зазвичай відбувається через каталітичний внутрішньоклітинний домен. Певна сукупність елементів послідовності вказаного каталітичного внутрішньоклітинного домену визначає його доступ до потенційних субстратів кінази |Мопатітавді, еї аїЇ., 1990, Мої. Сей. Віої. 11:5068-5078; РапіІ, еї аї., 1992, сеї 69:413-413). Прикладами рецепторів, які трансдукують сигнали через каталітичні внутрішньоклітинні домени, є рецепторні тирозинкінази (КТК), зокрема родина рецепторів ТК, яка зазвичай обмежується клітинами нервової системи, родина рецепторів цитокінів, включаючи тричленний рецепторний комплекс СМТЕ Геїапі 5

Уапсороціоз, 1994, 9). Мейгобіо. 25:1454-1466), яка також обмежена клітинами нервової системи, рецептори, зв'язані з с-білком, такі як р»-адренергічний рецептор, виявлений, наприклад, на клітинах серцевого м'яза, та с 29 мультимерний рецептор Есекі з високою спорідненістю до імуноглобуліну Е (ЗЕ), який в основному знаходиться (У на тучних клітинах та базофілах (З!Ийоп 4: боці, 1993, Майиге 366:421-428).

Усі описані раніше рецептори, певно, зазнають димеризації, мультимеризації або деяким спорідненим структурним змінам, які відбуваються в результаті зв'язування ліганду (Зспіеззіподег, у)., 1988, Тгепа Віоспет.

Зеї. 13: 443-447; ШІгісп 5 Зспіезвіпдег, 1990, СеїЇ 61:203-212; ЗспІезвіпдег 5: ШІгісп, 1992, Мецгоп 9:383-391), і-й при цьому міжмолекулярні взаємодії між внутрішньоклітинними доменами, що димеризуються, призводять до чЕ активації каталітичної функції. Наприклад, у випадку фактору росту, одержаного з тромбоцитів (РОСЕ), ліганд є димером, що зв'язує молекули двох рецепторів ІНагі, еї аіІ., 1988, Зсіепсе, 240:1529-1531; Неїадіп, 1989, 3. -

Віої. Спет. 264:8905-8912), а у випадку епідермального фактору росту (ЕСЕ) ліганд є мономером (УУерег, ебаІ,, «Ж 1984 9. Віої. Спет. 259:14631-14636). У випадку рецептора ЕсеКІ ліганд ЧЕ, зв'язаний з ЕсеКІ!І є мономером і активується тільки тоді, коли антиген зв'язується з комплексом ІДЕ/Ес КІ (З!цЩоп 5 (зоцій, 1993, Майшге - 366:421-428).

Розподіл конкретного рецептора в тканинах вищих організмів часто дозволяє виявити біологічну функцію рецептора. В деяких факторах росту та диференціювання, таких як фактор росту фібробластів (ЕСЕ), сильно « 20 експресовані КТК, що вказує на їхню певну роль в рості та збереженні тканин. Члени родини КТК (Сіазз 85 -в

Уапсороціоз, 1993, Тгепаз іп Сеї/ ВіоЇ. 3:262-268), як правило, обмежені клітинами нервової системи, що с включає фактор росту нервової тканини (МОРЕ), нейротрофічний фактор (ВОМЕ), який виділяють з головного :з» мозку, нейтрофін-3 (МТ-3) та нейтрофін-4/5 (МТ-4/5), які зв'язують рецептори родини ТІК КТК, стимулюють диференціювання різних груп нейронів в головному мозку та периферичній системі (| іпазау, К.М., 1993 іп 15 Мешгорпіс Расіогв, 5.Е. І оцдпіїп 8 .Н. Раїоп, еав., рр. 257-284, Зап Оіедо, СА, Асадетіс Ргезв)|. Рецептор Есекі -І зустрічається в обмеженій кількості типів клітин, таких як тучні клітини та базофіли. Тучні клітини продукуються лінією поліпотентних кровотворних стовбурових клітин кісткового мозку, але дозрівають в тканині те після міграції з кровотоку (див. дапемау 8: Тгамегв, 1996, іп ІттипоїІоду, 279 Едйіоп, М. Бобегівоп 5 Е. І амтепсе, - едвз., рр. 1:3-1:4, Сцтепі Віоіоду Ца., Гопаоп, ОК, Рибіївпегі|.

Багато дослідження вказують на те, що позаклітинний домен рецептора має здатність зв'язувати специфічні те ліганди. Крім того, клітинне середовище, в котрому експресовано рецептор, може впливати на біологічну

Ф реакцію, яка виникає при зв'язуванні ліганду з рецептором. Наприклад, дія на нервову клітину, що експресує рецептор ТІК, нейтрофіном, який зв'язується з даним рецептором, зумовлює виживання й диференціювання нейронів. Коли той же рецептор експресовано фібробластом, під дією нейтрофіну проходить проліферація дв фібробластів (Сіазз еї а!., 1991, Сеї! 66:405-413).

Ідентифіковано клас димерних мітогенів, що виділяють з клітин, з вибірковістю по відношенню до (Ф, ендотеліальних клітин судин, який названо фактором росту ендотеліальних клітин судин (МЕСЕ). МЕСЕ було ка виділено з кондиційованого поживного середовища клітин гліоми щурів (Сопп еї аї., (1990), Ргос. Маї). Асад.

Зеї. О.5.А., 87. рр. 2628-2632; кондиційованого поживного середовища зірчастих клітин гіпофізарних фолікулів бо великої рогатої худоби (Ретайа апа Неплеї, (1989), Віоспет. Віорпуз. Кев. Сот., 161, рр. 851-858;

Соградогоміс: еї аіІ., (1989), Ргос. Май. Асай. Зеї. ШО.5.А., 86, рр. 7311-7315| кондиційованого поживного середовища клітин ШОЗ7 людини |СоппоїПУ, О.Т. еї аї., (1989), Зсіепсе, 246, рр. 1309-1312). МЕСЕ є димером із молекулярною масою приблизно 46бкДа, при цьому кожна субодиниця має молекулярну масу приблизно 2ЗкДа.

МЕСЕ має деяку структурну подібність до одержаного з тромбоцитів фактору росту (РОСРЕ), який є мітогеном для бБ Клітин сполучної тканини і не є мітогеном для ендотеліальних клітин великих судин.

Встановлено, що зв'язаний з мембраною рецептор тирозинкінази, відомий як РІЇ, є рецептором МЕСЕ

ІОемгієв, С. еї аї., (19920, Зсіепсе, 255, рр. 989-991). Рецептор РІЇ зв'язує МЕСЕ, який індукує мітогенез.

Відомо, що інша форма рецептора МЕСЕ, яку називають КОК, також зв'язує МЕСЕ, та індукує мітогенез. Крім того, відома неповна послідовність КДНК та майже повна білкова послідовність КОК |Тептап В.Ї. еї аї., (1991)

Опсодепе 6, рр. 1677-1683; Тептап В.1. еї а!., (1992) Віоспет. Віорпувз. Кев. Сотт. 187. рр.1579-1586).

Постійний ангіогенез може бути причиною виникнення чи загострення деяких захворювань, таких як псоріаз, ревматоїдний артрит, гемангіома, ангіофіброма, діабетична ретинопатія та неваскулярна глаукома. Інгібітор активності МЕСЕ має бути корисним для лікування таких захворювань й інших типів МЕСРЕ-індукованого патологічного ангіогенезу, а також захворювань, пов'язаних з проникністю судин, таких як васкуляризація 7/0 пухлини. Даний винахід відноситься до інгібітору МЕСЕ на основі рецептора РН МЕСБЕ.

Втрата плазми, яка є основним показником запального процесу, виникає в окремій сукупності мікросудин.

Зокрема, втрата плазми в більшості випадків відбувається в венулах. На відміну від артеріол та капілярів, втрата плазми з венул виникає під дією численних медіаторів запалення, включаючи гістамін, брадикінін та серотонін. Однією відмінною особливістю запалення є втрата плазми, яка відбувається через міжклітинні 7/5 проміжки, що утворюються в ендотелії венул. Експериментальні моделі запального процесу показують, що міжклітинні проміжки між ендотеліальними клітинами посткапілярних та збираючих венул (ВаїшкК, Р. еї а!., Ат.

У. Раїйої. 1998, 152:1463-76). Встановлено, що певні лектини можна використовувати для виявлення центрів втрати плазми, ендотеліальних проміжків та патологічних процесів на межах ендотеліальних клітин у запалених венулах (Тпигвоп, О., еї аіІ., Ат. 9). РПузіої, 1996, 271:Н2547-62). Зокрема, рослинні лектини використовують для візуалізації морфологічних змін на межах ендотеліальних клітин у запалених венулах, наприклад, трахеї щурів. Лектини, такі як конкавалін А та рицин, котрі осередково зв'язуються з запаленими венулами, дозволяють виявити зони в стінці субендотеліальної судини з проміжками, що відповідають місцям втрати плазми (ТПигзоп, б., еї аІ,, Ат. 9. Рпузіої, 1996, 271:Н2547-62).

Капілярні судини характеризуються динамічними властивостями. Хронічні запальні захворювання, зумовлені, сч ов Зокрема, зміною мікросудин, включаючи ангіогенез та збільшення капілярних мікросудин. Капілярні судини можуть також змінитися в результаті набуття неправильних фенотипічних властивостей. В моделі хронічного і) запалення дихальних шляхів на мишах, капіляри дихальних шляхів набувають властивості венул, що виражається у збільшенні діаметру судин, підвищеній імунореактивності на фактор фон Віллебранда та підвищеній імунореактивності на Р-селектин. Крім того, проникність змінених судин може виникати під дією Ге зо таких медіаторів запалення, які не впливають на аналогічні судини дихальних шляхів у здорових мишей.

Встановлено, що певні речовини зменшують або пригнічують проникність судин та/або втрату плазми. -

Наприклад, містиксини є синтетичними поліпептидами, котрі пригнічують втрату плазми, не блокуючи утворення (-/( др ендотеліальних проміжків (ВаїЇшкК, Р. еї аІ., У. Рпаптасої. Ехр. Тег. ,1998, 284:693-9). Крім того, формотерол - агоніст бета-2-адренергічних рецепторів - зменшує проникність капілярних судин, пригнічуючи утворення « ендотеліальних проміжків (ВаїшКк, Р. апа Мсбопаїа, О.М., Ат. 9). РАузіої!. 1994, 266:1 461-8). ї-

Ангіопоетини та члени родини факторів росту ендотеліальних клітин судин (МЕСЕ) є єдиними факторами росту, котрі, як відомо, є у вищому ступені специфічними для ендотеліальних клітин судин. Дослідження з інактивації гену-мішені у мишей показують, що МЕСЕ є необхідним на ранніх стадіях розвитку судин та Апод-1 є необхідним на пізніх стадіях перетворення судин. «

В патенті США 6011003, виданому 4 січня 200Ор. фірмі Меїйгіз Тпегарецшіісв і ітйей, описано змінену з с розчинну форму поліпептиду РІ Т, яка здатна зв'язуватися з МЕСЕ і справляти таким чином інгібуючу дію на . вказаний фактор, причому даний поліпептид містить п'ять або менше повних доменів імуноглобуліну. и?» В патенті США 5712380, виданому 27 січня 1998р. фірмі Мегск 8 Со., описані інгібітори фактору росту ендотеліальних клітин судин (МЕСЕ), котрі являють собою природні або одержані методом рекомбінантних ДНК розчинні форми, які містять або не містять С-кінцеву трансмембранну зону рецептора для МЕСБЕ. -І Фірмі Мегеск 5 Со Належить заявка РСТ УМО Мо98/13071, опублікована 2 квітня 1998р., в якій описані методи генотерапії для пригнічення первинного росту пухлин та метастазів, шляхом переносу генів нуклеотидної ве послідовності, що кодує розчинний рецепторний білок, який зв'язується з МЕОЕ. - В міжнародній патентній заявці фірми Сепейесі, Іпс. РСТ МУО97/44453, опублікованій 27 листопада 1997р., 5р описані нові химерні білки рецепторів МЕСЕ, які містять амінокислотні послідовності, одержані з рецепторів ве РИН та КОК фактора росту ендотеліальних клітин судин (МЕСЕ), включаючи мишачий гомолог рецептора РІ К1

Ф КОК людини, в яких вказані химерні білки рецепторів МЕСЕ зв'язуються з МЕСЕ й справляють антагоністичну дію на проліферативну й ангіогенну активність ендотеліальних клітин.

В міжнародній патентній заявці фірми Созеії Со., ТО РСТ УМ/097/13787 опублікованій 17 квітня 1997р., дв описано низькомолекулярний інгібітор МЕСЕ, що використовується для лікування захворювань, які супроводжуються утворенням нових судин, таких як солідні пухлини. Поліпептид, що містить перший та другий

Ф) імуноглобуліноподібні домени в позаклітинній частині рецептора Р/Т МЕСЕ, але не має шостого та сьомого ка імуноглобуліноподібних доменів, справляє інгібуючу дію на МЕСЕ. зпагіїї, 9. еї аіЇ,, 1998, Те Опцапепу дог. ОЇ Мисі. Мей. 42:242-249, вказують на те, що оскільки бо Моноклональні антитіла (Маб) є основними, позитивно зарядженими білками, а клітини ссавця заряджені негативно, то електростатична взаємодія між вказаними елементами може спричиняти більш високі рівні фонового зв'язування, що призводить до низького співвідношення між об'ємом пухлини та нормального органу.

Щоб подолати вказаний ефект дослідники спробували збільшити виведення Маб різними методами, зокрема, за допомогою вторинних агентів, а також хімічної модифікації та зміни заряду самого Маб. 65 У9епзеп-Рірро сеї аїЇ., 1996, РНагптасешііса! Кезеагсп 13:102-107, вказують на те, що оброблення поліетиленгліколем лікувального білку, рекомбінантного гранулоцитарного колонієстимулюючого фактору

(РЕС-0О-С5Е) людини, збільшує стабільність й зберігає біологічну активність іп мімо при інтрадуоденальному способі введення.

Твиївиті еї аі!., 1997, Тиготь Наетозві. 77:168-73, описують експерименти, в яких тромбопоетичну активність іп мімо модифікованого поліетиленгліколем інтерлейкину-6 (МРЕС-1ІІ-6), в якому 5495 з 14 лізинових аміногруп в

І--6 зв'язано з РЕС, порівнювали з активністю природного І! -6.

Уапа еї а, 1995, Сапсег 76:687-94, вказують на те, що кон'югуючи поліетиленгліколі з рекомбінантним інтерлейкином-2 (1Ї/-2) людини, можна отримати сполуку, а саме модифікований поліетиленгліколем 1-2 (РЕС-ІЇ-2), яка зберігає іп мімо та іп міго активність І/-2, але характеризується значно більш тривалим /о періодом напіврозпаду в кровотоці.

К. Юипсап апа Р. бргеаїйсо, Сі РВагптасоКіпеї. 27:290-306, 296 (1994), описують експерименти по збільшенню періоду напіврозпаду в плазмі аспарагінази шляхом кон'югування з поліетиленгліколем.

В міжнародній патентній заявці РСТ УУО99/03996 фірми Кедепегоп РНагтасеціїсаІ5, Іпс. й правління

Каліфорнійського університету, опублікованій 28 січня 1999 р., описані модифіковані поліпептиди людини з делеціями в зонах основних амінокислот. Встановлено, що модифіковані ,ноггін"-поліпептиди людини зберігають біологічну активність, маючи більш низькою спорідненістю до гепарину й більш високою фармакокінетикою в сироватці тварини порівняно із немодифікованими ,ноггін'-поліпептидами людини.

Даний винахід відноситься до агоністів МЕС з поліпшеними фармакокінетичними властивостями.

Переважний варіант здійснення винаходу відноситься до виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що кодує злитий поліпептид, здатний зв'язувати поліпептид МЕСЕ, що включає (а) нуклеотидну послідовність, що кодує складову рецептора МЕС, функціонально зв'язаний з (б) нуклеотидною послідовністю, що кодує мультимеризуючу складову, та в якому складова рецептора МЕСЕ є єдиною складовою рецептора МЕСЕ злитого поліпептиду, при цьому нуклеотидна послідовність (4) складається по суті з нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність домену 2 Ід позаклітинного домену першого рецептору МЕОБЕ, та з сч ов Нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність домену З Ід позаклітинного домену другого рецептору МЕСБЕ. і)

В іншому варіанті здійснення винаходу виділена нуклеїнова кислота першого рецептора МЕСЕ є РІН.

В іншому варіанті здійснення винаходу виділена нуклеїнова кислота другого рецептора МЕСЕ є РІК1.

В іншому варіанті здійснення винаходу виділена нуклеїнова кислота другого рецептора МЕСЕ є РІ. Ге зо В іншому бажаний варіанті здійснення винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує домен 2 Ід позаклітинного домену першого рецептору МЕСЕ, розташована вище нуклеотидної послідовності, яка кодує - домен З Ід позаклітинного домену другого рецептору МЕСЕ. «-

В іншому бажаному варіанті здійснення винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує домен 2 Ід позаклітинного домену першого рецептору МЕСЕ, розташована нижче нуклеотидної послідовності, яка кодує «

Зв домен З Ід позаклітинного домену другого рецептору МЕОСБРЕ. ї-

В бажаному варіанті здійснення винаходу мультимеризуюча складова містить домен імуноглобуліну.

В іншому варіанті здійснення винаходу домен імуноглобуліну вибирають з групи, яка складається з домену Ес

ІдО, важкого ланцюга |до та легкого ланцюга Ід.

Бажані варіанти здійснення винаходу стосуються виділеної молекули нуклеїнової кислоти, яка містить « Нуклеотидну послідовність, що кодує модифікований злитий поліпептид рецептору РІН, в якій регіон, що кодує, ств) с молекули нуклеїнової кислоти складається з нуклеотидної послідовності, яку вибирають з групи, що містить: (а) нуклеотидну послідовність зображену на Фіг.13А-130; ;» (Б) нуклеотидну послідовність зображену на Фіг.14А-14С; (с) нуклеотидну послідовність зображену на Фіг.15А-15С; (4) нуклеотидну послідовність зображену на Фіг.16А-160; -І (е) нуклеотидну послідовність зображену на Фіг.21А-21С; (У нуклеотидну послідовність зображену на Фіг.22А-22С; ве (94) нуклеотидну послідовність зображену на Фіг.24А-24С та - (п) нуклеотидну послідовність яка внаслідок виродженості генетичного коду відрізняється від нуклеотидної 5о послідовності (а), (Б), (с), (9), (е), (9 або (9) і яка кодує молекулу злитого поліпептиду, що має ве біологічну активність модифікованого злитого поліпептиду рецептору РІН.

Ф В іншому варіанті здійснення винаходу поліпептид кодується описаними вище виділеними молекулами нуклеїнової кислоти.

Бажаний варіант здійснення винаходу стосується композиції, яка здатна зв'язувати молекулу МЕОЕ з утворенням нефункціонального комплексу, що містить мультимер злитого поліпептиду.

Крім того, бажаною є композиція в якій мультимер є димером.

Ф) В іншому варіанті здійснення винаходу вказана композиція знаходиться в носії. ка Інший варіант здійснення винаходу стосується вектору, який містить описані вище молекули нуклеїнової кислоти, включаючи експресуючий вектор, що містить описані молекули нуклеїнової кислоти, в якому молекула бо нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з послідовністю, що регулює експресію.

Інші варіанти здійснення стосуються системи вектор-хазяїн, призначеної для продукування злитого поліпептиду, яка містить експресуючий вектор в прийнятній клітині-хазяїні; системи вектор-хазяїн, в якій прийнятною клітиною-хазяїном є бактеріальна клітина, дріжджова клітина, клітина комахи або клітина ссавця; системи вектор-хазяїн, в якій прийнятною клітиною-хазяїном є клітина Е. соїї; системи вектор-хазяїн, в якій 65 прийнятною клітиною-хазяїном є клітина СО5; системи вектор-хазяїн, в якій прийнятною клітиною-хазяїном є клітина СНО.

Інший варіант здійснення винаходу стосується способу одержання злитого поліпептиду, який включає вирощування клітин системи вектор-хазяїн в умовах, що забезпечують продукування та виділення поліпептиду, одержаного таким чином.

Додаткові варіанти здійснення винаходу стосуються злитого поліпептиду, який кодується нуклеотидною послідовністю, зображеною на Фіг.1ОА-10О0 або 24А-24С, який модифіковано ацетилюванням або обробкою поліетиленгліколем, при чому ацетилювання здійснюють що найменше при 100-кратному молярному надлишку ацетилюючого реагенту, або при молярному надлишку ацетилюючого реагенту в межах від приблизно 10-кратного молярного надлишку до близько 100-кратного молярного надлишку або оброблення 7/0 поліетиленгліколем здійснюють з використанням РЕС з молекулярною масою 10000 або 20000.

Бажаний варіант здійснення винаходу стосується способу зменшення або пригнічення втрати плазми у ссавця, який включає введення ссавцю описаного вище злитого поліпептиду, включаючи варіанти здійснення винаходу в яких ссавцем є людина, а злитий поліпептид є ацетильованим або обробленим поліетиленгліколем.

Інші варіанти здійснення винаходу стосуються поліпептиду, який специфічно зв'язує ліганд рецептору МЕСЕ.

Бажаний варіант здійснення винаходу стосується способу блокування росту кровоносних судин у людини, який включає введення ефективної кількості описаного вище злитого поліпептиду.

Крім того, бажаним є спосіб пригнічення активності ліганду рецептору МЕСЕ у ссавця, який включає введення ссавцю ефективної кількості описаного вище злитого поліпептиду.

Бажані варіанти здійснення винаходу стосуються вказаних способів, в яких ссавцем є людина.

Інші варіанти здійснення винаходу стосуються способів уповільнення або запобігання росту пухлини у людини; зменшення або запобігання набряку у людини, зокрема набряку мозку; зменшення або запобігання утворення асциту у людини, зокрема асциту, обумовленого раком яєчника.

Бажані варіанти здійснення винаходу стосуються злитого поліпептиду здатного зв'язувати поліпептид МЕСБЕ, який включає (а) компонент рецептору МЕСЕ, функціонально зв'язаний з (б) мультимеризуючим компонентом, сч ов причому компонент рецептору МЕСЕ є єдиним компонентом рецептором МЕСЕ в злитому поліпептиді і складається по суті з амінокислотної послідовності домену 2 Ід позаклітинного домену першого рецептору МЕСЕ і) та амінокислотної послідовності домену З Ід позаклітинного домену другого рецептору МЕСОБЕ.

Інший варіант здійснення винаходу стосується злитого поліпептиду, в якому перший рецептор МЕСЕ є РІН.

Інший варіант здійснення винаходу стосується злитого поліпептиду, в якому другий рецептор МЕСЕ є РІК1. Ге зо Інший варіант здійснення винаходу стосується злитого поліпептиду, в якому другий рецептор МЕСЕ є РІ.

Бажані варіанти здійснення винаходу стосуються злитого поліпептиду, в якому амінокислотна послідовність « домену 2 Ід позаклітинного домену першого рецептору МЕСЕ розташовано вище амінокислотної послідовності - п домену З Ід позаклітинного домену другого рецептору МЕСЕ, і злитого поліпептиду, в якому амінокислотна послідовність домену 2 Ід позаклітинного домену першого рецептора МЕСЕ розташована нижче амінокислотної « послідовності домену З Ід позаклітинного домену другого рецептору МЕСЕ. ї-

В іншому варіанті здійснення винаходу мультимеризуючий компонент злитого поліпептиду містить домен імуноглобуліну, включаючи варіант здійснення винаходу, в якому домен імуноглобуліну вибирають з групи, що включає домен Ес Ід, тяжкий ланцюг Ідс, легкий ланцюг до.

Бажані варіанти здійснення винаходу стосуються злитого поліпептиду, який містить амінокислотну « послідовність модифікованого рецептору РІЙ, при чому амінокислотну послідовність вибирають з групи, яка з с складається з (а) амінокислотної послідовності зображеної на Фіг.13А-130; (Б) амінокислотної послідовності зображеної на Фіг.14А-14С; (с) амінокислотної послідовності зображеної на Фіг.15А-15С; (4) амінокислотної ;» послідовності зображеної на Фіг.1б6А-160; (е) амінокислотної послідовності зображеної на Фіг. 21А-21С; (5 амінокислотної послідовності зображеної на Фіг.22А-22С; та (9) амінокислотної послідовності зображеної на

Фіг. 24А-24С. -І Інший бажаний варіант здійснення винаходу стосується способу зменшення або пригнічення втрати плазми у ссавця, який включає введення вказаному ссавцю описаного вище злитого поліпептиду. о Альтернативний бажаний варіант здійснення винаходу стосується способу пригнічення активності ліганду - рецептору МЕСЕ у ссавця, який включає введення ссавцю ефективної кількості описаного вище поліпептиду.

Фігура 1. ІЕР-аналіз в гелі немодифікованого та ацетильованого білку РІН(1-3)-Рс. Немодифікований білок ве ЕН(1-3)-Рс нездатен проникати в гель із-за свого показника рі»9,3, в той час, як ацетильований білок

Ф РІН(1-3)-Ес проникає в гель та врівноважується при рі 5,2.

Фігура 2. Зв'язування немодифікованого ЕРІШ(1-3)-Єс та ацетильованого РІН(1-3)-Рс білків з планшетами, покритими Маїгіде(фФ. Немодифікований білок ЕІШН(1-3)-Єс добре зв'язується з компонентами позаклітинного ов матриксу в Маїгіде!Є, в той час, як ацетильований білок РІН(1-3)-Ес не зв'язуються з вказаними компонентами.

Фігура 3. Зв'язування немодифікованого ЕШШ(1-3)-Ес, ацетильованого ГМ(1-3)-с та обробленого

Ф) поліетиленгліколем білку РШ(1-3)-с при виконанні аналізу на основі Віасоге?. Ацетильований білок ка (стовпчики 13-16), оброблений поліетиленгліколем білок (стовпчики 17-20) та оброблений гепарином білок

РІН(1-3)-Рс (стовпчики 21-24) здатні успішно конкурувати зі зв'язаним з чіпом ВіасогеФ білком РІН(1-3)-Ес бо за зв'язування з МЕОР, порівняно з контрольним білком (стовпчики 1-4) та стороннім білком (стовпчики 5-8).

Немодифікований білок РІН(1-3)-Рс (стовпчики 5-6), ймовірно, лише частково конкурують зі зв'язаним з чіпом

Віасогеєф білком РІН(1-3)-Ес за зв'язування з МЕСЕ.

Однак в результаті промивки зв'язаних зразків 0,5М розчином ІМасі (стовпчики 7-8) одержують профіль зв'язування, аналогічний до модифікованих форм РІН(1-3)-Ес, який свідчить про те, що немодифікований білок 65 неспецифічно зв'язується з чіпом так, що цей зв'язок можна зруйнувати, здійснивши промивку сольовим розчином.

Фігура 4. Зв'язування немодифікованого ЕШШ(1-3)-Ес, ацетильованого ГМ(1-3)-с та обробленого поліетиленгліколем білку ЕН(1-3)-Єс з МЕСЕ при виконанні твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А).

Оброблені поліетиленгліколем та ацетильовані білки ЕШ(1-3)-Рс зв'язуються з МЕС зі спорідненістю, що наближається до значення, характерного для немодифікованого білку РІН(1-3)-Ес.

Фігура 5. Фармакокінетичні профілі немодифікованого ЕШ(1-3)-бс, ацетильованого РШ(1-3)-Ес та обробленого поліетиленгліколем РН(1-3)-Ес білків. Мишам Ваїр/с (23-28г) здійснюють підшкірну ін'єкцію 4мг/кг немодифікованого, ацетильованого або обробленого поліетиленгліколем білку РІН(1-3)-Ес. У мишей з хвоста беруть кров через 1, 2, 4, 6, 24 години, 2 дні та З дні після ін'єкції білку та аналізують сироватку, 70 здійснюючи стандартний аналіз ЕГІЗА, призначений для виявлення білку РІН(1-3)-Ес. Т дах для всіх білків

ЕЩЩН(1-3)-Єс знаходиться в інтервалі від б до 24 годин. С дах Для всіх білків має наступні значення: немодифікований білок: О,Обмкг/мл - О,15мкг/мл; ацетильований білок: 1,5мкг/мл - 4,Омкг/мл; та оброблений поліетиленгліколем білок: приблизно 5мкг/мл.

Фігура бА-6В. ІЕР-аналіз в гелі немодифікованого та ступінчасто ацетильованого білку РІШН(1-3)-Ес.

Немодифікований білок РІШ(1-3)-с не здатен проникати в гель із-за свого показника рі » 9,3, в той час, як більшість зразків ступінчасто ацетильованого білку РІН(1-3)-Ес (зразки, ацетильовані 30-100-кратним молярним надлишком) проникають в гель та врівноважуються при рі 4,55-8,43 залежно від ступеню ацетилювання.

Фігура 7. Зв'язування немодифікованого РІШН(1-3)-Ес та ступінчасто ацетильованого РІШ(1-3)-Ес білків з планшетами, покритими Маїгідек!. Як і в випадку зі стороннім контрольним білком, гТіе2-Ес, ступінчасто ацетильований білок РІН(1-3)-Ес (зразки, ацетильовані 20- та ЗО-кратним молярним надлишком) не зв'язуються з планшетом, покритим Маїгіде(Ф, в той час, як неацетильований білок РІН(1-3)-Рс характеризується значним зв'язуванням. Зразок, адетильований 10-кратним молярним надлишком, відрізняється зниженим зв'язуванням, але даний ступінь ацетилювання не є достатнім для повного блокування зв'язування з компонентами позаклітинного матриксу. с

Фігура 8. Зв'язування немодифікованого РІН(1-3)-Рс та ступінчасто ацетильованого РІШН(1-3)-Ес білків при виконанні аналізу на основі ВіасогефФ. При субстехіометричному співвідношенні (0,5мкг/мл немодифікованого або і) ступінчасто ацетильованого білку) для повного зв'язування МЕСР. При концентрації 1,Омкг/мл, яка наближається до стехіометричного співвідношення 1:1, як немодифікований білок, так і ступінчасто ацетильований білок

РІН(1-3)-Єс краще конкурують за зв'язування з МЕСЕ, однак при цьому все ще недостатньо білку РІН(1-3)-Ес Ге зо (немодифікованого або ступінчасто ацетильованого білку) для повного насичення наявного МЕСЕ. Однак при концентрації 5,Омкг/мл, яка в декілька разів вища ніж стехіометричне співвідношення 1:1, як білок -

РІН(1-3)-Рс, так і ступінчасто ацетильований білок РІЙ(1-3)-Рс здатні насичувати МЕСЕ незалежно від ступеню -/- де ацетилювання.

Фігура 9. Фармакокінетичні профілі немодифікованого ГМ(1-3)-с та ступінчасто ацетильованого «

ЕН(1-3)-Рс білків. Мишам Ваїр/с (23-28г) здійснюють підшкірну ін'єкцію 4мг/кг немодифікованого білку або ї- ступінчасто ацетильованих 10-, 20-, 40-, 60- та 100-кратним надлишком білків РІШН(1-3)-Ес (3 миші для немодифікованого білку та зразків, ацетильованих 10-, 20- та 40-кратним надлишком, 2 миші для зразків, ацетильованих 60- та 100-кратним надлишком). У мишей з хвосту беруть кров через 1, 2, 4, 6, 24 години, 2 дні та З дні після ін'єкції. Сироватку аналізують за допомогою стандартного аналізу на основі ЕГІЗА, призначеного « для виявлення білку РІН(1-3)-Ес. Т дах для всіх випробуваних білків РІН(1-3)-Ес відповідає б годинам. Стах Має ств) с наступні значення: немодифікований білок ЕШ(1-3)-Ес - 0,0бмкг/мл; зразок, ацетильований 10-кратним . надлишком, - 0,7мкг/мл, зразок, ацетильований 20-кратним надлишком, - 2мкг/мл, зразок, ацетильований и? 40-кратним надлишком, - 4Ммкг/мл, зразок, ацетильований боО-кратним надлишком, - мкг/мл, зразок, ацетильований 100-кратним надлишком, -1Омкг/мл.

Фігура 10А-100. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність білку РІН(1-3)-Ес. -І Фігура 11. Схематичне зображення структури РІН.

Фігура 12А та 128. Аналіз гідрофільності амінокислотних послідовностей домену 2 Ід та домену З Ід РІН. ве Фігура 13А-130. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність Мий: РІНИ(1-ЗАд)-Ес. - Фігура 14А-14С. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність Ми: РІЙ (2-3Ад)-Ес.

Фігура 15А-15С0. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність МиїЗ: ЕН(2-3)-Ес. ве Фігура 16А-160. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність Ме: ЕН(1-Зд-м)-Ес. 4) Фігура 17. Зв'язування немодифікованого білку ЕШ(1-3)-Ес, мутанту з делецією основної області

ЕЩ(1-3)-с, та мутантного білку РІН(1-3)0-м, при виконанні аналізу на основі Віасоге?Ф. При субстехіометричному співвідношенні (0,25мкг/мл РШ(1-3)-Єс немодифікованих, ацетильованих або генетично Модифікованих зразків на 0,1мкг/мл МЕСЕ) білку РІН(1-3)-Єс недостатньо для блокування зв'язування МЕСЕ з білком РІН(1-3)-Ес, іммобілізованому на чіпі ВіасогеФ. При концентрації О,5мкг/мл немодифікованого, о ацетильованого або генетично модифікованого білку РІШН(1-3)-Ес стехіометричне співвідношення наближається ко до 1:1 та при цьому зростає здатність блокувати зв'язування МЕСЕ з чіпом ВіасогеФ. При концентрації 1,Омкг/мл немодифікованого, ацетильованого або генетично модифікованого білку РІН(1-3)-Ес, яка приблизно відповідає бо стехіометричному співвідношенню 10:1, білки. РІН(1-3)-Ес здатні блокувати зв'язування МЕСЕ з чіпом Віасогеф, але їхня дія не є еквівалентною. Немодифікований та ацетильований білок, а також мутантний білок МиЙИ: РШ (1-Заб)-Ес по суті однаково блокує зв'язування МЕС, у той час як мутантний білок Ми: РЇїї 1(1-3 й-2м)-Ес блокує зв'язування менш ефективно.

Фігура 18. Зв'язування немодифікованого білку. РІН(1-3)-Ес, МийМ: РІН(1-3 Ав)-Рс, Ми: РІЙ (2-3Ав)-Ес та 65 РЕШ(2-3) мутантних білків з планшетами, покритими Маїгідек. Немодифікований білок РІН(1-3)-Ес інтенсивно зв'язується з вказаними лунками, білок Миї8З: РІШ(2-3)-Рс зв'язується дещо слабше, Мий: РІЙ(1-3 /Адв)-Ес зв'язується ще слабше та білок Ми: ЕШ(2-Зар)-Рс має кращий профіль, зв'язуючись значно слабше, ніж будь-які інші мутантні білки. Глікозильований мутантний білок Ми: РШ(1-3 д-м)-Рс характеризується мінімальною перевагою при виконанні аналізу з використанням Маїгідеке.

Фігура 19. Порівняння немодифікованого білку. РІН(1-3)-Ес, Мий: РІН(1-3 Ав)-Рс, Ми: РІЙ (2-3АВ)-Ес та

ЕН(2-3) мутантних білків при виконанні аналізу на основі ЕПІЗА. При випробуваних концентраціях не модифікований білок РІНИ(1-3)-Єс й мутантні білки Мий: РІИ(1-ЗАд)-Рс, Ми: РІ (2-3Ав)-Ес та РІ (2-3) однаково зв'язують МЕОБЕ.

Фігура 20. Фармакокінетичні профілі немодифікованого білку. РІН(1-3)-Рс, Мий: РІНИ(1-ЗАВ)-Рс, Ми: РІ 70. (2-3Ав)-Ес та РІЙ (2-3) мутантних білків. Зазначені реагенти мають наступні значення С дах: немодифікований білок. РІНС1-3)-Ес - 0.15мкг/мл; білок ЕШН(1-3)-Ес, ацдцетильований 40-кратним молярним надлишком -1,5мкг/мл;

Мий: РІН«Т-ЗАдВ)-Ес - О,7мкг/мл.

Фігура 21А-21С. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність модифікованого рецептору РІН, позначеного ЕИО2.РІКТОЗ.Есд С (а).

Фігура 22А-22С. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність модифікованого рецептору РІН, позначеного РИ 02.МЕСЕКЗОЗ.ЕсдсС1 (а).

Фігура 23. Аналіз позаклітинного матриксу (ЕСМ). Результати даного аналізу вказують на те, що білки

ЕНО2.РІК1О3.РсАСст(а) та РНОг.МЕСЕКЗОЗ,ЕсАс та) значно гірше зв'язуються з ЕСМ, ніж білок РІН(1-3)-Ес.

Фігура 24А-24С. Нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовність модифікованого рецептору РІН, позначеного МЕСЕКІТК2-Есдс са).

Фігура 25А-25С. Аналіз фосфорилювання. При 1,5 молярному надлишку білку РІН(1-3)-Ес, ЕШ(1-3)-Ес (А40) або тимчасово експресованого білку ЕН О2РІК1О3.РслдСт(а) повністю блокується стимуляція рецептору трьома приведеними раніше модифікованими рецепторами РІН, порівняно із стимуляцією контрольним середовищем.

На відміну від цього тимчасово експресований білок ЕНМО2МЕСЕКЗОЗ.РслСт(а) не спричиняє суттєвого сч блокування при вказаному молярному надлишку порівняно із стимуляцією позитивним контрольним білком (о)

МЕОСР. Аналогічні результати показано на Фіг.258, де модифіковані рецептори ГРІЄ використано в трикратному молярному надлишку відносно ліганду МЕСЕ165. На Фіг.25С, де модифіковані рецептори РІЙ використано в шестикратному молярному надлишку відносно ліганду МЕСЕ165, показано, що тимчасово експресований білок с 20 ЕНО2МЕСЕКЗОЗ.ЕсАс та) частково блокує зумовлену МЕСЕ165 стимуляцію рецепторів на поверхні клітини.

Фігура 26А-268. Аналіз фосфорилювання. Виявлення за допомогою вестерн-блотингу фосфорильованого - тирозином білку МЕСЕКАЗ(РІКІ) в результаті стимуляції лігандом МЕСЕ165 вказує на те, що рецептори на «- поверхні клітини не фосфорилюються стимулюючими зразками, які містять МЕСЕ165, який попередньо інкубують з 1- та 2-кратним молярним надлишком (Фіг.26А) або 3- або 4-кратним молярним надлишком (Фіг.268) тимчасово Ж з5 експресованого білку РІШНО2РІКІОЗ.РсдСт(а), постійно експресованого білку ЕШО2РІК1О3.ЕсдСт(а) або їч- тимчасово експресованого білью»у МЕСЕК1ТК2-ЕсАСт(а). З усіма випробуваними концентраціями модифікованого рецептору РІЙ відбувається повне зв'язування ліганду МЕСЕ165 під час попереднього інкубування, в наслідок чого відсутня детектовна стимуляція рецепторів на поверхні клітин незв'язаним МЕСЕ165 порівняно зі стимуляцією контрольним середовищем. «

Фігура 27. Аналіз проліферації клітин Мо/К2. Приведені далі модифіковані рецептори БІ зокрема - с РІНС1-3)-Рс, РН02.РІК1О3.ЕсаАС (а) та РНТО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАс т (а), а також сторонній рецептор, позначений як ц Тіе2-Ес, використовуваний як контрольний зразок, титрують в межах від 40 нМ до 20 пМ й інкубують на клітинах "» на протязі 1 години при 372. Потім в усі лунки додають рекомбінантний білок МЕСЕ165 людини в концентрації 1,56 нМ, що знаходиться в середовищі певного складу. Негативний контрольний рецептор Тіе2-Ес, який використовується в будь-якій концентрації, не блокує проліферацію клітин зумовлену МЕСЕ165, тоді як - І ЕНО2.РІКТ1О3.РсАСс (а) блокує 1,56 нМ МЕСЕ165 при половині максимальної дози, що становить 0,8 нМ. Білки ї» РН(1-3)-Рс та ЕШО2 МЕСЕКЗОЗ.РсдСт(а) менш ефективно блокують МЕСЕ165 в даному аналізі при половині максимальної дози, що становить 72 НМ. Використовуваний окремо білок МЕСЕ165 дає результат, який -й становить 1,2 одиниці поглинання, при цьому фонове поглинання становить 0,38 одиниці. ї» 50 Фігура 28. Дослідження стехіометрії зв'язування методом ВіасогеФ). Стехіометрію зв'язування обчислюють у вигляді молярного співвідношення зв'язаного МЕСЕ165 до іммобілізованого ЕНО2.РІК1ОЗ.Бс о АсСт(а) або ії; МЕСЕКІК2-ЕсдСт(а), використовуючи коефіцієнт перетворення, рівний 1000 щурячих одиниць (КУ), еквівалентний нг/мл. Результати вказують на те, що стехіометрія зв'язування дорівнює одній димерній молекулі

МЕСЕ165 на одну молекулу ЕНО2.РІКТОЗ.ЕслдСт(а) або МЕСЕК1ТК2-ЕсдС1(а). 29 Фігура 29 й Фігура 30. Визначення стехіометрії витіснювальною хроматографією. ЕМ О2РІКТОЗ.ЕсдСт(а) або

ГФ) МЕСЕКІК2-ЕсАс та) в концентрації 1 НМ (яка в 1000 разів перевищує КО взаємодії ЕТО2РІКТОЗ.ЕсдСт(а) або 7 МЕСЕКІК2-ЕсАСт(а)ЕСЕ165) змішують з різними концентраціями МЕСЕ165. Після інкубації визначають концентрацію в розчині вільного МЕСЕКТК2-ЕсдСт (а). Дані вказують на те, що додавання 1 НМ МЕСЕ165 в бор Розчин ЕНО2РІКТОЗ.РсдСт(а) повністю блокує зв'язування РШНО2РІКІОЗ.Рс дСт(а) з поверхнею МЕСЕ165.

Отриманий результат дає змогу припустити, що стехіометрія зв'язування дорівнює одній молекулі МЕСЕ165 на одну молекулу ЕН О2РІК1ОЗ.ЕсдС (а).

Фігура 31. Витіснювальна хроматографія (5ЗЕС) за природних умов. Пік Мої відповідає комплексу

ЕНО2РІКТОЗ.РсАСт(а)//ЕСЕ165, й пік Мо2 відповідає незв'язаному білюу МЕСЕ165. Фракції, елюйовані в межах 65 1,1 та 1,2мл, об'єднують й додають гідрохлорид гуанідіну (ЗиНСЇ) до кінцевої концентрації 4,5М для дисоціації комплексу.

Фігура 32. Витіснювальна хроматографія (ЗЕС) за умов дисоціації. Щоб розділити компоненти комплексу рецептор-ліганд й визначити їхнє молярне співвідношення, 5Омкл дисоційованого комплексу завантажують на колонку з суперозою Зирегозе 12 РС 3.2/30, врівноважену ЄМ розчином ЗиНСІ, й елюють. Пік Мо1 відповідає

ЕНО2РІКІОЗ.Рс АС а), й пік Ме2 відповідає МЕСЕ 165.

Фігура 33, Фігура 34 та Фігура 35. Витіснювальна хроматографія (ЗЕС) із розсіюванням світла в оперативному режимі. Для визначення молекулярної маси (МУУ) комплексу рецептор-ліганд використовують хроматографічну колонку для витіснювальної хроматографії з детектором розсіювання світла в оперативному режимі Міпібамж/п (Уууай Тесппоіоду, Запіа Ваграга, СаїЇйогпіа) й детекторами показника заломлення (КІ) 70 (Зпітааг2и, Куоб, дарап). Як показано на Фіг.33, профіль елюювання має два піки. Пік Мо1 відповідає комплексу рецептор-ліганд, й пік Мо2 відповідає незв'язаному біль»л МЕСЕ165. Молекулярну масу обчислюють на основі сигналів розсіяння світла (15) й показник заломлення (КІ). Аналогічну процедуру використовують для визначення молекулярної маси окремих компонентів комплексів рецептор-ліганд. Далі наведено результати вказаних визначень: молекулярна маса комплексу ЕШО2РІК1О3.ЕРс АС1(ау//ЕСЕ165 в положенні піку дорівнює 75 157300 (Фіг.33), молекулярна маса МЕСЕ165 в положенні піку дорівнює 44390 (Фіг.34) й молекулярна маса К1К2 в положенні піку дорівнює 113300 (Фіг.35).

Фігура 36. Пептидне картування й аналіз глікозилювання. Дисульфідні структури та сайти глікозилювання в

ЕНО2РІКТО3.Ес Ас (а) визначають методом пептидного картування. ЕК О2РІК1О3.ЕРс АС 1(а) містить в загалом десять цистеїнів, шість з яких відносяться до області Ес. Суз121 зв'язаний дисульфідним зв'язком з Суз182.

Два перших цистеїни в області Ес (Суз211 й Суз214) утворюють міжмолекулярний дисульфідний зв'язок з двома аналогічними цистеїнами в іншому ланцюзі Ес. Однак неможливо визначити, чи утворюється дисульфідний зв'язок між однаковими цистеїнами (наприклад, Суз211 з Сувз211) або між Сувг211 та Сувз214. Сувз216 зв'язаний дисуфідним зв'язком із Суз306. Суз325 зв'язаний дисуфідним зв'язком із Суз410.

В РИ О2РІКТОЗ.ЕсАСт(а) нараховується п'ять ймовірних М-зв'язаних сайтів глікозилювання, котрі, як Ге відомо, глікозильовані по різному. Повне глозилювання спостерігається в сайтах Азп33, Азп193 та Авп282. (5)

Часткове глозилювання спостерігається в сайтах Азпб5 та Азп120. Сайти глозилювання на фігурі підкреслені.

Фігура 37. Фармакокінетика РІН(1-3)-Ес (А40), РНО2РІКТ1ОЗ.РсдС (а) або МЕСЕК1ТК2-ЕсАсС (а). Мишам Ваїр/с підшкірно вводять ін'єкцію 4мк/кг ЕН (1-3)-Ес (А40), РИМ О2РІКТОЗ.РсАс (а), тимчасово експресованого в яєчнику китайського хом'яка (СНО), ЕН О2РІК1О3.Рс АС (а), постійно експресованого в СНО, та МЕСЕК1ТК2-ЕсАСс (а), ре) тимчасово експресованого в СНО. У мишей з хвоста беруть кров через 1, 2, 4, 6, 24 години, 2 доби, З доби, та « 6 діб після ін'єкції. Сироватку аналізують за допомогою ЕГІЗА, призначеного для виявлення РІШН(1-3)-Ес (А40),

ЕШО2РЇК1О3.ЕсАст (а) або МЕСЕВ1Б2-ЕслдсСт1(а). Тлах для ЕІН(1-3)-Ес (А40) становить б годин, в той часяк Тахо ОС тимчасово та постійно експресованого білку РІМО2РІКТОЗ.РслСт(а) й постійно експресованого /-«ф

МЕСВЕКІТК2-ЕсАс та) становить 24 години. Стах ДЛЯ РІШ(1-3)-Ес (А40) дорівнює 8мкг/мл, С пах ДЛЯ тимчасово м експресованих білків РИ О2РІКТОЗ.ЕслСт(а) та МЕСЕК1ТК2-ЕсдСт(а) дорівнює 18мкг/мл й Стах для постійно експресованого більюу МЕСЕК1ТК2-ЕсАСсС а) становить ЗОмкг/мл.

Фігура 38. Фармакокінетика РІШН(1-3)-Ес (А40), ЕН О2.РІКТОЗ.ЕсАсС (а) та ЕННО2.МЕСЕКЗОЗ-ЕсаАсС (а). Мишам

Ваїр/с підшкірно вводять ін'єкцію 4мк/кг ЕН (1-3)-Ес (А40), РНЙО2.РІК1О3.РсАс (а), тимчасово експресованого в « яєчнику китайського хом'яка (СНО), та РНО2.МЕСЕКЗОЗ-Рс АС а), постійно експресованого в СНО. У мишей з щу с хвоста беруть кров Через 1,2,5, 6, 7, 8, 12, 15, 20 діб після ін'єкції. Сироватку аналізують за допомогою ц ЕПІЗА, призначеного для виявлення РІШН(1-3)-Ес, ЕШНО2.РІК1ОЗ.Рс АСт(а) або ЕНШО2.МЕСЕКЗОЗ-ЕсАС а). ,» ЕІН(1-3)-Єс (А40) не було виявлено в сироватці Через 5 діб, а РШО2.РІКІОЗ.Рс дСт(а) та

ЕШНО2.МЕСЕКЗОЗ-ЕсАс та) були виявлені через 15 та більше діб.

Фігура 39. Здатність ЕНО2.РІКТОЗ.РсдСт(а) пригнічувати ріст пухлини фібросаркоми НТ-1080 іп мімо. і Введення мишам ЗСІЮ через день або два ризи на тиждень ЕНО2.РІКТ1ОЗ.РсАст(а) в кількості 25мг/кг суттєво їх зменшує ріст підшкірних пухлин фібросаркоми НТ-1080.

Фігура 40. Здатність ЕНО2.РІКТОЗ.РсАсСт(а) пригнічувати ріст пухлини гліоми Сб іп мімо. Введення мишам - ЗСІЮО через день або два ризи на тиждень ЕИ02.РІКТОЗ.ЕРсдСт1(а) в кількості 2,5мг/кг суттєво зменшує ріст ьч 20 підшкірних пухлин гліоми Сб.

Фігура 41. МЕОСР-індукована підвищена проникність матки. Підшкірне введення РМЗО (5м.е.) з метою овуляції с самиць щурів в пубертатному періоді стимулює викидання естрадіолу Через 2 доби, що в свою чергу викликає індукцію МЕСЕ в матці. Вказана індукція збільшує проникність матки й вміст в ній рідини. Підшкірне введення

РНС1-3)-Рс (А40), ЕНО2.РІКТОЗ.РсдСт(а) або ЕНО2.МЕСЕКЗОЗ3-ЕсАс (а) в дозі 25мг/кг через 1 годину після введення РМБО приблизно на 5095 зменшує масу рідини в матці.

ГФ) Фігура 42А-428. Оцінка ангіогенезу жовтого тіла з використанням прогестерону як стимулюючого агенту. 7 Підшкірне введення РМ5О (5м.е.) для індукування овуляції самок щурів в пубертатному періоді викликає утворення активного жовтого тіла з щільною сіткою кровоносних судин, яку секретує прогестерон в кровоток, готуючи матку до запліднення. Для утворення кровоносних судин в жовтому тілі є необхідним МЕСЕ. Рівні бо прогестерону в стані спокою дорівнюють приблизно 5нг/мл й можуть бути доведені до 25-40нг/мл після введення

РМ5О. Підшкірна ін'єкція ЕШН(1-3)-Ес (А40) або РШОЮО2.РІКТОЗ.Рс дСт(а) в дозі 25мг/кг або Ббмг/кг через 1 годину після введення РМ5О повністю пригнічує індукцію прогестерону на 4-й добу.

Докладний опис винаходу б В даній галузі давно існує проблема одержання антагоністу МЕСЕ на основі рецептора, фармакологічний профіль якого дав би змогу розглядати антагоніст як можливий лікарський засіб. Автори даного винаходу вперше описують молекулу химерного поліпептиду, здатного пригнічувати активність МЕСЕ, яка має поліпшені фармакокінетичними властивостями порівняно з іншими відомими антагоністами МЕСЕ на основі рецептору.

Молекули химерного поліпептиду, що розглядаються в даному описі винаходу, вперше стали придатні для

Використання в лікувальній практиці, метою якої є пригнічення активності МЕСЕ.

Даний винахід стосується нових молекул химерного поліпептиду, одержаним шляхом злиття модифікованого позаклітинного зв'язуючого ліганд домену рецептора РІН з регіоном Ес імуноглобуліну О (Ід).

Позаклітинний зв'язуючий ліганд домен визначається як частина рецептору, котрий за своєю нативною конформацією в клітинній мембрані має позаклітинну орієнтацію, де він може контактувати зі спорідненим 70 лігандом. Позаклітинній зв'язуючий ліганд домен не має гідрофобних амінокислот, характерних для трансмембранного домену рецептору, чи будь-яких інших амінокислот, характерних для внутрішньоклітинного домену рецептору. Внутрішньоклітинний або цитоплазматичний домен рецептору звичайно містить позитивно заряджені або полярні амінокислоти (тобто лізин, аргінін, гістидин, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту). Попередні (15-30), переважно гідрофобні або неполярні амінокислоти (тобто лейцин, валін, ізолейцин й фенілаланін) утворюють трансмембранний домен. Позаклітинний домен містить амінокислоти, котрі передують гідрофобному трансмембранному фрагменту амінокислот.

Трансмембранний домен зазвичай фланковано позитивно зарядженими або неполярними амінокислотами, такими як лізин чи аргінін. Фон Гейне опублікував детальні правила, що дозволяють спеціалістам в даній галузі визначити, які амінокислоти даного рецептору відносяться до позаклітинним, трансмембранним або 2о Внутрішньоклітинним доменам (див. моп Неїпе, 1995, ВіоЕвззаув 17:25:30). Інформацію про прогнозування доменів білку можна також одержати та таких вебсайтах в мережі Інтернет, як Пйр:// цігес3. пипії. сп/віймте/ПГМРКЕО гогт. піті.

Даний винахід відноситься до конструювання молекул нуклеїнових кислот, що кодують молекули химерних поліпептидів, які вбудовують у вектор, здатний експресувати молекули химерних поліпептидів, при введенні в с ов придатну клітину-хазяїна. Придатними клітинами-хазяїнами є, але не обмежуються ними, бактеріальні клітини, дріжджові клітини, клітини комах й клітини ссавців. Для конструювання експресуючих векторів, що кодують і) молекули химерних поліпептидів під контролем сигналів транскрипційного/трансляційного контролю, можна використовувати будь-які методи, що використовуються спеціалістами в даній області в даній галузі для вбудовування фрагментів рекомбінантних ДНК й методи синтезу іп мійго й рекомбінації іп мімо (генетичну Ге зо рекомбінацію) (см. ЗатрбгооК, еї аїЇ., МоІесшаг Сіопіпу, А І арогаїогу Мапиаї!Ї, Соїд Зргіпд Нагброг І арогаїйогу;

Ситепі Ргоїосоїв іп Моїіесшаг Віоїоду, Ед». А!йзиреї, еї а). геепе Аввос, УМіПеу-Іпіегесіепсе, МУ). «

Експресію молекул нуклеїнових кислот, що кодують молекули химерних поліпептидів, можна регулювати другою -/- ди нуклеотидною послідовністю так, щоб молекула химерного поліпептиду була експресована в хазяїні, трансформованому молекулою рекомбінантної ДНК. Наприклад, експресію описаних молекул химерних « поліпептидів можна регулювати будь-яким промотором/енхансером, відомим в даній галузі. Промотори, які ї- можна використовувати для регулювання експресії молекул химерних поліпептидів, включають, але не обмежуються ними, довгій кінцевий повтор, описаний в статті Скуіїнто та ін. (Здціпіо еї аїЇ., 1991, Сеї 65:1-20); ранній промоторний регіон 5М40 (Вегпоїзі апа Спатброп, 1981, Майте 290:304-310), промотор СМУ, 5-кінцевий повтор М-Ми! М, промотор, що знаходиться в довгому 3'-кінцевому повторі вірусу саркоми Рауса « СХататою еї аї., 1981, Сеї/ 22:787-797), промотор тимідинкінази герпесу (УУадпег еї аї., 1981, Ргос. Май. с Асай. беї. ИО.5.А. 78:144-1445), регуляторні послідовності гену металотіоніну (Вгіпвіег еї аї.,1982, Майшге 296:39-42); прокаріотичні експресуючі вектори, такі як промотор Д-лактамази (Мійа-Катагой еї аї., 1978, ;» Ргос. Май. Асай. Зсі. О.5.А. 75:3727-3731) або (ас-промотор (ОеВоег еї аіЇ., 1983, Ргос. Май). Асай. зсоі.

О.Б.А. 80:21-25, див. також "Овеїші ргоївіпв їтот гесотріпапі бБасіегіа" іп Зсіепійс Атегісап, 1980, 242:14-94); промотори з дріжджів або інших грибів, такі як промотор (ба 4, промотор АН -і (алкогольдегідрогеназа), промотор РОК (фосфогліцерокіназа), промотор лужної фосфатази, а також наступні регіони транскрипційного контролю тварин, які характеризуються тканинною специфічністю й використовуються шк в трансгенних тваринах: регіон генного контролю еластази І, що є активним в ацинарних клітинах підшлункової - залози (Зм/й еї аїЇ., 1984, Се 38:639-646; Огпії; еї аїЇ., 1986, Соій Зргіпд Нагрог бутр. Опцапі. Віо). 5о 50:399-409; Масропаїа, 1987, Нераїпоіюду 7:425-515); регіон генного контролю інсуліну, що є активним в те бета-клітинах підшлункової залози (Напапап, 1985, Маїшге, 315: 115-122), регіон генного контролю

Ф імуноглобуліну, що є активним в лімфоїдних клітинах ((згоззспеді еї аїЇ., 1984, СеїІ, 38:647-658; Адатевз еї аі., 1985, Майте 318:533-538; АїІехапдег еї аїЇ., 1987, Мої. Сей. Віої. 7:1436-1444), регіон вірусного контролю пухлини молочної залози у мишей, що є активним в клітинах яєчка, молочної залози, лімфоїдних та тучних клітинах (Гедег еї аї., 1986, Сеї! 45:485-495), регіон генного контролю альбуміну, що є активним в печінці (РіпКегі еї аіІ., 1987, Сепез апа Оемеї. 1:268-276), регіон генного контролю альфа-фетопротеїну, що є (Ф, активним в печінці (Ктитіаці еї аї., 1985, Мої. СеїЇ. Віої. 5:1639-1648; Наттег еї аїЇ., 1987, Зсіепсе ко 235:53:58), регіон генного контролю альфа 1-антитрипсину, що є активним в печінці (Кеїзеу еї а!., 1987, Сепев апа Оемеї. 1:161-171), регіон генного контролю бета-глобіну, що є активним в мієлоїдних клітинах (Модгат еї бо аї., 1985, Маїшге, 315:338-340; КоПавз еї аї!., 1986, СеїІ 46:89-94), регіон генного контролю основного білку мієліну, що є активним в олігодендроцитах головного мозку (Кеаднеай еї аї., 1987, Сеї! 48:703-712), регіон генного контролю легкого ланцюгу міозину, що є активним в скелетних м'язах (Зпапі, 1985, Майшге, 314:283-286), регіон генного контролю гонадотропного гормону, що є активним в гіпоталамусі (Мазоп еї аї., 1986, Зсіепсе 234:1372-1378). 65 Таким чином, згідно з даним винаходом експресуючі вектори, здатні реплікуватися в бактеріальному й еукаріотичному хазяїні, а також містять нуклеїнову кислоту, що кодує згадану раніше молекулу химерного поліпептиду, використовують для трансфекції хазяїна, таким чином регулюючи експресію цих нуклеїнових кислот з метою продукування молекул химерного поліпептиду, які потім можуть бути виділені в біологічно активній формі. Термін біологічно активна форма", використовується тут у значенні форма здатна зв'язуватися з МЕСБЕ.

Експресуючі вектори, що містять описані молекули химерної нуклеїнової кислоти, можна ідентифікувати за трьома спільними ознаками: (а) гібридизація ДНК-ДНК, (Б) наявність або відсутність гену-,маркеру" та (с) експресія вбудованих послідовностей. У відповідності до першої ознаки наявність чужорідного гену, вбудованого в експресуючий вектор, можна знайти за гібридизацією ДНК-ДНК, використовуючи зонди, що містять послідовності, які гомологічні вставленим послідовностям молекул химерних поліпептидів. У відповідності до 7/0 другого підходу рекомбінантну систему вектор/хазяїн можна ідентифікувати й вибрати зважаючи на наявність гену-,маркеру" (наприклад, активність тимідинкінази, стійкість до антибіотиків, фенотип трансформації, утворення тілець включення в бакуловірусі та ін.), які викликані введенням чужорідних генів у вектор.

Наприклад, якщо послідовність ДНК молекули химерного поліпептиду вбудована в послідовність гену-маркеру вектору, рекомбінанти, які місять вставку, можна визначити за відсутністю функції гену-маркеру. У 7/5 Відповідності до третього підходу рекомбінантні експресуючі вектори можна ідентифікувати, аналізуючи продукт чужорідного гену, експресований рекомбінантом. Такі аналізи можуть бути основані, наприклад, на фізичних або функціональних властивостях молекул химерних поліпептидів.

Клітини, згідно даного винаходу, можуть тимчасово або переважно структурно й постійно експресувати молекули химерних поліпептидів.

Молекули химерних поліпептидів можна очистити будь-яким методом, який у подальшому дозволяє одержати стійку, біологічно активну молекулу химерного поліпептиду. Як приклад, що не обмежує об'єм винаходу, можна привести той факт, що фактори можна виділити з клітин у вигляді розчинних білків або тілець включення, з котрих їх можна екстрагувати в кількісному співвідношенні 8М розчином гідрохлориду гуанідіну або діалізом (див., наприклад, Виїйаег, е( аіІ., 05 Раїепі Мо. 5,663,304). Для подальшого очищення факторів можна сч ов Використовувати стандартну іонообмінну хроматографію, гідрофобну хроматографію, хроматографію з оберненою фазою та гельфільтрацію. і)

У відповідності з одним варіантом здійснення винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує першу складову, розташована вище неклеотидної послідовності, що кодує другу складову. У відповідності з одним варіантом здійснення винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує першу складову, розташована нижче неклеотидної (ду зо послідовності, що кодує другу складову.

Можливі інші варіанти здійснення винаходу, в яких змінено порядок розташування першої, другої й третьої - складових злитого поліпептиду. Наприклад, якщо нуклеотидна послідовність, що кодує першу складову, «- позначена 1, нуклеотидна послідовність, що кодує другу складову, позначена 2 й нуклеотидна послідовність третьої складової позначена 3, то порядок складових у виділеній нуклеїновій кислоті згідно даного винаходу « під час зчитування від 5-кінця до 3-кінця може являти собою будь-яку з перерахованих далі наступних ї- комбінацій: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 або 3,21.

Даний винахід може бути використаний для діагностичних й терапевтичних цілей. У відповідності з деякими варіантами здійснення винаходу, маніпулюючи молекулами химерних поліпептидів, агоністами й антагоністами, котрі зв'язують молекули химерних поліпептидів, можна лікувати хвороби. У відповідності з деякими варіантами «

Здійснення винаходу молекулу химерного поліпептиду можна використовувати як агент, що блокує зв'язування в с зв'язуючого агенту з його мішенню.

Й Як приклад, що не обмежує об'єм винаходу, слід зазначити, що спосіб за даним винаходом можна ефективно а використовувати для лікування клінічних станів, які характеризуються проникністю судин, набряком або запаленням, таких як набряк головного мозку, спричинений травмою, інсультом або пухлиною; набряк, спричинений запальними процесами, такими як псоріаз або артрит, включаючи ревматоїдний артрит; астма, -І генералізований набряк, спричинений опіками; асцити й плеврит, спричинені пухлинами, запаленням чи травмою; хронічне запалення дихальних шляхів; синдром проникності капілярних судин; сепсис; захворювання о нирок, викликане підвищеною втратою білку; захворювання очей, такі як стареча дегенерація жовтої плями й - діабетична ретинопатія.

Аналіз амінокислотної послідовності ЕЩШ(1-3)-Єс вказує на наявність незвично великої кількості (46) ве основного амінокислотного залишку лізину. ІЕЕБ-аналіз ЕМ (1-3)-Єс показує, що значення рі білку перевищує

Ф 9,3 підтверджуючи припущення, що даний білок є у вищому ступені основним. Існує гіпотеза про те, що основна природа білку РІШН(1-3)-Єс змушує його зв'язуватися з компонентами зовнішнього матриксу і що вказана взаємодія може бути викликано надзвичайно коротким періодом напіврозпаду в сироватці, характерним для дво ГІН(1-3)-Рс, при ін'єкційному введенні мишам. Для перевірки даної гіпотези білок РШ(1-3)-Єс ацетилюють у залишків лізину, щоб зменшити основність. Ацетильований білок РІН(1-3)-с випробовують, виконуючи описані (Ф, нижче аналізи. ка Наступні приклади приведено лише для ілюстрування й не обмежують об'єм винаходу.

Приклади во Приклад 1. Експресія білку РІН(1-3)-Ес в клітинах СНО К1

Використовуючи стандартні методи молекулярної біології (див. Моіесціаг Сіопіпу, А І арогаїогу Мапиаї! (бБатргооК, еї аїЇ.,, Соїй Зргіпд Нагрог Іарогайгу), Сипепі Ргоїосоіїв іп МоїІесшаг Віоіоду (Едв. А!йзибеї, еї аі. Огеепе РибБіІ. Аввос, УМіІеу-Іпіегзсіепсе, МУ), ген, що кодує Р (1- 3)-Ес, вводять вектор, що експресує рРЕЄЕ14.1 (1о0пла Віоіодіез, ріс) на сайті множинного клонування нижче промотору СММ. Клітини СНО К!1 65 трансфекують конструкцією ДНК рЕЕ14.1/2И(1-3)-Рс ОМА використовуючи ліпофектамін (Сайпегвзриго, МО).

Трансфековані клітини СНО Кі вирощують на середовищі ОМЕМ (КН, Капвзаз СйЙу, МО), що не містить глутаміну, яке включає 25 мкМ метіонінсульфоксиміну (М5Х) фірми Зідта Іпс., Зі оціз, МО, й одержують експресори рекомбінантного білку, досліджуючи супернатанти клітин СНО К! з більш як 100 вручну зібраних ізолятів колоній за допомогою стандартного імуноаналізу, який дозволяє визначити й виділити Ес людини. Відібраний зібраний вручну клон ампліфікують в присутності Т00мкм МЗХ й виконують другу серію досліджень ампліфікованих клонів. Специфічна продуктивність рекомбінантного білку Рй1(1-3)-с самого клону, що продукує, становить 25пг/клітину/на добу.

Вибраний клон розмножують в Т-подібних колбах місткістю 225см2 (Сотіпо, Асіоп, МА) і потім вводять у флакони, що обертаються ємністю 8,5л (Согпіпд, Асіоп, МА), використовуючи описані вище середовища для 70 Культивування клітин. Клітини видаляють з флаконів, що обертаються за допомогою стандартної обробки трипсином й поміщують в З3,5л суспензійного середовища. Суспензійне середовище являє собою безглутамінове середовище ІЗСНО (Ігміпе Зсіепійіс, Запіа Апа, СА), що містить 590 фетальної телячої сироватки (ЕВ5 фірми

Нусіопе І арз, Годап, ОТ), 100мкМ М5Х та добавку 55 (УКН Зсіепійіс, Капзаз Спйу, МО) що знаходиться в біореакторі Сеїїїдеп місткістю Бл (Мем/ Вгипемліск Зсіепіййс, Мем Вгипем/іск, М.) з густиною 0,3х109 клітин/мл. 75 Коли клітини досягають щільності 3,6х10 5 клітин/мл й адаптуються до суспензії, їх переносять в біореактор ємністю 60 л (АВЕС, Аїепіомлп, РА) з густиною 0.5х109 клітин/мл в 20л середовища ІЗСНО з 5965 фетальною телячою сироваткою. Через два дні в біореактор додатково вводять 20л середовища ІЗСНО з 595 фетальною телячою сироваткою. Клітини вирощують на протязі ще двох днів до досягнення кінцевої щільності, яка становить 3,1х109 клітин/мл, при цьому кінцева концентрація ЕШН(1-3)-Єс під час збору клітин становить оБМГ/л. Зібрані клітини видаляють фільтрацією тангенціального потоку, використовуючи 0,45мкм фільтри РгозвіаКк (Міїїроге, Іпс., Ведтога, МА).

Приклад 2. Очищення білку РІН(1-3)-Ес одержаного з клітин СНО К1

Білок. РШН(1-3)-Єс спершу очищують афінною хроматографією. Колонку Ргоївеіп А використовують для зв'язування з високою специфічністю Ес частини молекули. Очищений за спорідненістю білок концентрують й с пропускають через колонку ЗЕС. Потім білок елюють. Далі докладно описані вказані способи. Ге)

Матеріали й методи

Всі хімічні речовини надані фірмою 9. Т. ВакКег, РпПїйїрзриго, МО, за виключенням РВ5, який надано у вигляді 10-кратного концентрату фірмою І їе Тесппоіодієв, Сайпегеригд, МО. Смоли для препаратів Ргоїевіп А

Базі Ріом/ та Зирегдех 200 надані фірмою Рпагтасіа, Різсаїамжау, М). Обладнання й мембрани для ее, концентрування білку надані фірмою МіШіроге, Весдіога, МА. «І

Приблизно 40л відфільтрованого через 0,45мкм фільтри кондиційованого клітинами СНО середовища, що містить білок РІН(1-3)-Єс, вводять в 290мл колонку Ргоїеіп А Равзі Ріом/ (діаметром 1Осм), яку попередньо -- врівноважують РВ5. Колонку промивають РВ5, який містить ЗБОММ Масі й 0.029565 СНАРБ, й зв'язаний білок «Її елюють 20ММ лимонною кислотою, із 10ММ МагНРО,. в результаті елюювання одержано один пік, його показник

Зо рН доведено до нейтрального значення 1М розчином Маон. Фракції елюата концентрують приблизно до Умг/мл - фільтрацією тангенціального потоку через регенеровані целюлозні мембрани з молекулярною масою 10000 й концентруванням клітин, які перемішують. Щоб видалити агрегати та інші забруднюючі домішки, концентрований білок вводять в колонку заповнену смолою для препаратів Зирегдех 200 (10см х 55см), та досліджують в РВ5, « що містить 595 гліцерину. Основні пікові фракції об'єднують та фільтрують за стерильних умов відбирають 7 70 аліквоту білку й зберігають при -802С. с Приклад 3. Ацетилювання білку ЕН а-3)-Ес :з» Два міліграми білку РІН(1-3)-Єс ацетилюють у відповідності до інструкцій, що додаються до набору для модифікування сульфо-МНоЗ-ацетатом (Ріегсе Спетіса! Со., Коскога, І, Саї. 526777).

Приклад 4. Дослідження ацетильованого білку РІН(1-3)-Е - 15 (а) ІЕР-аналіз. Білок ЕШН(1-3)-с й ацетильований білок РІН(1-3)-Єс аналізують, виконуючи стандартний

ІЕгР-аналіз. Як показано на Фіг.1, білок РІН(1-3)-с не здатний проникати у гель, от чому він повинен мати т» показник рі більший 9.3, що є найбільшим показником рі в контролі. Однак ацетильований білок РіШ(1-3)-Ес - може проникати в гель й врівноважується при рі близько 5,2. Одержаний результат вказує на те, що ацетилювання значно зменшує сумарний позитивний заряд білку, а також показник рі. т» 50 (Б) Зв'язування з компонентами позаклітинного матриксу

Ф Зв'язування білку ЕШ(1-3)-Єс й ацетильованого білку ЕШ(1-3)-Рс з компонентами позаклітинного матриксу досліджують методом, що імітує взаємодію з компонентами позаклітинного матриксу. При виконанні даного методу 96б-лункові планшети для культивування тканини покривають Маїгідекю (96-лункові планшети з тонким шаром матриксу МАТКІСЕЇ, Саї 540607, Весіоп ОРісКіпзоп І аржмаге, Ведіога, МА). Планшети інкубують, додаючи 59 в лунки різні концентрації ЕйИ(1-3)-Єс, ацетильованого білку Рй1(1-3)-Єс або гТіе2-Ес (сторонній

ГФ) контрольний білок) Планшети інкубують на протязі 1-2 годин за кімнатної температури або при 372 й г визначають зв'язані білки, додаючи в лунки вторинне, кон'юговане з лужною фосфатазою антитіло до Ес людини.

Потім в лунки додають субстрат на основі лужної фосфатази й вимірюють оптичну густину. На Фіг.2 показано результати даного аналізу. Подібно до стороннього контрольного білку гТіе2-Ес, ацетильований білок 60 , й - мод й

ЕН(1-3)-Рс не зв'язується з планшетом, вкритим Маїгіде(фФ, в той час як неацетильований білок Р(1-3)-Ес характеризується значним зв'язуванням. Одержані результати вказують на те, що ацетилювання основних амінокислотних залишків є ефективним способом пригнічувати взаємодію зарядів, яка має місце між позитивно зарядженими білками й негативно зарядженими компонентами позаклітинного матриксу іп мімо. в5 Приклад 5. Оброблення білку Р1-3)-Ес поліетиленгліколем

Як відомо, оброблення білків поліетиленгліколем (РЕС) підвищує активність іп мімо, збільшуючи стабільність й біологічну доступність мінімізуючи імуногенність (див. наведені раніше посилання), є інша думка проте, що молекули оброблені поліетиленгліколем занадто великі щоб бути відфільтрованими нирковими клубочками, що покращує їхні фармакокінетичні властивості. Не обмежуючи себе лише теорією, Заявники припустили, що оброблення молекул РШШ(1-3)-Єс поліетиленгліколем може покращити фармакокінетичні властивості, але не внаслідок зміни позитивного заряду або зменшення значення рі РШ(1-3)-Ес, а в результаті фізичного захисту позитивним зарядом від взаємодії з позаклітинним матриксом. Заявники вирішили спробувати покращити фармакокінетичні властивості молекул ЕШ(1-3)-Єс шляхом поєднання ланцюгів поліетиленгліколів з молекулярною масою 20000, як буде описано далі. 70 Матеріали та методи

Очищений білок РЕйЙ1(1-3)-Єс виділений з клітин СНО (див. раніше), використовують в наступних експериментах з оброблення поліетиленгліколем. Функціоналізовані поліетиленгліколі надані фірмою Зпеагмайег

Роїутегз, НипівзмШе, А! біцин надано фірмою Зідта, Зі оціз, МО; колонка з суперозою Зирегозе 6 фірмою

Рпагтасіа, Різсаїажшау, МО; РВБ5 у вигляді 10-кратного концентрату ІПйе Тесппоіодіев, Сайпетгвзриго, МО; 7/5 ліцерол фірмою .. Т. Вакег, РАПШірзбиго, М; та преформовані гелі Вів-Тгіз надані фірмою Момех, СА.

В лабораторних дослідженнях використані ланцюги РЕС з молекулярною масою 20000, які мають функціональні аміноспецифічні кінцеві частини, які призначені для оцінювання різних умов реакцій, в яких змінюється стехіометрія РЕС: білок. Виконуючи зазначені реакції й аналізуючи зразки стандартним методом електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності д од еци л сульфату натрію (5О5-РАСЕ), білок 20. РМ(1-3)-Рс в концентрації 1,5мг/мл реагує при рН 8.1 із молекулами ЗРА-РЕС (сукцинімідилпропіонат РЕ) з молекулярною масою 20000 при молярному співвідношенню РЕС й мономеру ЕШ(1-3)-Ес, що становить 1:6.

Реакцію виконують при 82С на протязі ночі. Для первинного очищення продукти реакції вводять у колонку з суперозою Зиурегозе 6, 10мм х ЗОсм, врівноваженою РВ5, що містить 595 гліцерину. В колонці відбувається розділення молекул оброблених поліетиленгліколем відповідно до ступеня оброблення поліетиленгліколем. Га

Об'єднують фракції, які відповідають моно- та диполіетиленглікозильованому димерному білку РІН(1-3)-Ес, судячи з характеру смуг на відновлюючих гелях для ЗО5-РАСЕ. Концентрацію білку визначають, вимірюючи і) оптичну густину при 280 нм. Оброблений поліетиленгліколем білок РІН(1-3)-Ес фільтрують за стерильних умов, відбирають аліквоту білку й зберігають при -4026.

Приклад 6. Зв'язування немодифікованого, ацетильованого й обробленого поліетиленгліколем білку (Се)

ЕЩ1-3)-Ес при виконанні аналізу на основі Віасоге

Немодифіковані, ацетильовані й оброблені поліетиленгліколем білки ЕН(1-3)-Єс випробовують, виконуючи З аналіз на основі Віасогетб, з метою оцінювання їхньої здатності до зв'язування з лігандом РІЙ, МЕСРЕ. При ч виконанні даного аналізу немодифікований білок РІШН(1-3)-Єс іммобілізують на поверхні чіпу Віасоге?Ф (див. інструкцію з використання чіпу ВіІАсогеФ фірми РІагтасіа, Іпс., Різсаїажау, МУ для проведення стандартних З з5 аналізів) й зразок, що містить 0,2мкг/мл МЕСЕ та немодифікований, ацетильований оброблений /Їч« поліетиленгліколем білок РШ(1-3)-Єс (кожний в концентрації 25мкг/мл) пропускають через чіп, вкритий

РІНК1-3)-Ес. Для того щоб звести до мінімуму ефекти неспецифічного зв'язування, зв'язані зразки промивають 0,5М масі. В одному зразку немодифікований білок ЕШ(1-3)-Ес змішують з гепарином. Гепарин має негативно « заряджену молекулу, тому при змішуванні цих двох речовин вони повинні взаємодіяти завдяки своїм зарядам.

Це по суті нейтралізує позитивний заряд білку ЕШ(1-3)-Рс, при цьому молекула набуває властивості хімічно - с або генетично модифікованої молекули, внаслідок чого зменшується її заряд й здатність зв'язуватись в а результаті взаємодії зарядів. Як показано на Фіг.3, ацетильовані (стовпці 13-16), оброблені "» поліетиленгліколем (стовпці 17-20) й оброблені гепарином (стовпці 21-24) здатні повністю конкурувати зі зв'язаним з чіпом ВіасогеФ білком ЕШ(1-3)-Єс за зв'язування з МЕСЕ порівняно із контрольним зразком (стовпці 1-4) й стороннім білком (стовпці 5-8). Немодифікований білок РІШН(1-3)-ЕРс (стовпці 5-6), як видно, -і лише частково конкурує зі зв'язаним з чіпом ВіасогеФ білком РІН(1-3)-Єс за зв'язування з МЕСР. Однак, їз промиваючи зв'язані зразки 0.5М розчином Масі (стовпці 7-8), одержують профіль зв'язування, аналогічний модифікованим формам білку РШН(1-3)-Ес, який свідчить про те, що немодифікований білок утворює - неспецифічний зв'язок з чіпом, який можна зруйнувати, виконуючи промивання сольовим розчином.

Приклад 7. Зв'язування немодифікованого, ацетильованого й обробленого поліетиленгліколем білку ть ЕН(1-3)-Ес п і і і ЕГІЗА ри виконанні аналізу на основі 4) Немодифіковані, ацетильовані й оброблені поліетиленгліколем білки РІШ(1-3)-Єс випробовують, за допомогою стандартного аналізу на основі ЕГІ5ЗА, з метою оцінювання їхньої здатності зв'язувати ліганд МЕСЕ рецептору РІЙ. Як показано на Фіг.4, як оброблені поліетиленгліколем, так і ацетильовані білки. ЕН(1-3)-Ес здатні зв'язуватися з МЕСРЕ, засвідчуючи те, що модифікація білку обробленням поліетиленгліколем або ацетилюванням не впливає на його здатність зв'язувати вказаний ліганд. о Приклад 8. Фармакокінетичний аналіз немодифікованого. ацетильованого й обробленого поліетиленгліколем іме) білку РІН(1-3)-Ес

Експерименти іп омімо виконують для контролю фармакокінетичних профілів немодифікованого, 60 ацетильованого й обробленого поліетиленгліколем білку ЕШН(1-3)-Ес. Мишам ВаїбБ/с (23-28г; З миші в групі) під шкіру вводять 4мг/кг немодифікованого, ацетильованого й обробленого поліетиленгліколем білку РІШН(1-3)-Ес. У мишей з хвоста беруть кров через 1, 2, 4, 6, 24 години, 2 доби, З доби після ін'єкції білку. Сироватку аналізують за допомогою стандартного аналізу на основі ЕІ ІЗА, призначеного для виявлення білку РІН(1-3)-Ес.

Процедуру аналізу можна коротко описати наступним чином: планшет для ЕГІЗА вкривають МЕСЕ, зв'язують 65 сироватку, що містить немодифікований, ацетильований й оброблений поліетиленгліколем білку РІН(1-3)-Ес, виявляють результати, використовуючи антитіла до Ес, зв'язані з лужною фосфатазою. Як показано на

Фіг.5, Ттлах для всіх білків РІН(1-3)-Єс знаходиться в інтервалі від 6 до 24 годин. Стах Для різних білків має наступні значення: немодифікований білок: 0,06-0,15мкг/мл; ацетильований білок: 1,5-4,Омкг/мл; поліетиленглікозильований білок: приблизно 5мкг/мл.

Приклад 9. Ступінчасте ацетилювання білку РІН(1-3)-Ес

Щоб визначити мінімальний рівень ацетилювання, необхідний для пригнічення зв'язування з компонентами клітинного матриксу, проводять ступінчасте ацетилювання білку ЕШ(1-3)-Єс, використовуючи зростаючі кількості молярного надлишку ацетилюючого реагенту в реакційній суміші. Використовують наступні молярні надлишки: 0,10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 та 100 молів ацетилюючого реагенту на їмоль мономеру 7/0 РН(1-3)-Рс. Реакції виконують відповідно до інструкцій, що додаються до набору для модифікації сульфо-МНоЗ-ацетатом (Ріегсе Спетіса! Со., Коскіога, І, Саї. 526777).

Приклад 10. Дослідження ступінчасто айетильованого білку ЕШН(1-3)-Ес, (а) ІЕгР-аналіз. Немодифікований білок ЕМ(1-3)-с та ступінчасто ацетильовані білки РІН(1-3)-Ес було досліджено за допомогою стандартного методу ІЕР-аналізу. Як показано на Фіг.бА-6В, немодифікований білок 75 РН(1-3)-Рс не здатен проникати в гель тому, що має надзвичайно високе значення рі (вище за 9.3). Однак більшість ступінчасто ацетильованих білків ЕШ(1-3)-Ес (зразки ацетильовані 30-100-разовим молярним надлишок) здатні проникати в гель й врівноважуються при значеннях рі 4,55-8,43 залежно від ступеня ацетилювання. Одержаний результат вказує на те, що ацетилювання може змінювати позитивний заряд білку залежно від дози, і що значення рі можна зменшити регулюючи ступінь ацетилювання. (Б) Зв'язування ступінчасто ацетильованого білку ЕШН(1-3)-Ес з компонентами позаклітинного матриксу.

Білок РІШН(1-3)-с та ступінчасто ацетильований білок РШ(1-3)-с випробовують на зв'язування з компонентами позаклітинного матриксу, виконуючи раніше описаний аналіз, який дозволяє імітувати взаємодію з компонентами позаклітинного матриксу. В лунки планшету додають різні концентрації немодифікованого білку

ЕІН(1-3)-Рс, ступінчасто ацетильованого білку ЕШ(1-3)-с (зразки, ацетильовані 10-, 20- та З0-кратним сч Молярним надлишком) або білок гТіе2-Рс (сторонній контрольний білок). Планшети інкубують на протязі 1-2 години при кімнатній температурі або 372С та визначають зв'язані білки, додаючи в лунки вторинне, кон'юговане і) з лужною фосфатазою антитіло до Ес людини. Потім в лунки додають субстрат на основі лужної фосфатази й вимірюють оптичну густину. На Фіг.7 показано результати даного аналізу. Подібно до стороннього білку гГіе2-Ес ступінчасто ацетильований білок РІН(1-3)-Ес (зразки, ацетильовані 20- та ЗО-разовим молярним надлишком) Ге) зо незначно зв'язується з планшетом, вкритим МаїйгідекЕ, тоді як неацетильований білок РІН(1-3)-Ес характеризується значним зв'язуванням. Зв'язування є насичуваним, вказуючи на те, що білок РІН(1-3)-Ес в скоріш за все зв'язується зі специфічними сайтами, а не бере участь в більш загальній зумовленій зарядом «-- взаємодії, яка не може бути насичуваною. Зразок, ацетильований 10-разовим молярним надлишком, характеризується меншим зв'язуванням, але такий ступінь ацетилювання не є достатнім для повного блокування З

Зз5 Зв'язування з компонентами позаклітинного матриксу. У зразків, адетильованих 20-разовим та більше молярним ї- надлишком, визначене зв'язування відсутнє, не зважаючи на те, що при виконанні ІЕР-аналізу (Фіг.бА, 6В) у зразків, адметильованих більш низьким молярним надлишком, відмічено великий сумарний позитивний заряд.

Одержаний результат вказує на те, що необов'язково повністю ацетилювати всі наявні основні амінокислоти, щоб подолати зв'язування з компонентами позаклітинного матриксу. « (с.) Зв'язування ступінчасто ацетильованого РІН(1-3)-Ес при визначенні в Віасоге системі шщ с Немодифіковані та ступінчасто ацетильовані РШ(1-3)-Ес поліпептиди було тестовано за допомогою аналізу з й використанням Віасоге набору з метою оцінки їх можливості зв'язуватися з Р лігандом - МЕСЕ. В цьому «» аналізі немодифікований РШ(1-3)-Ес протеїн (0.5, 1.0 або 5.Омкг/мл) було іммобілізовано на поверхні Віасоге чіпа (дивися інструкцію до Віасоге чіпа, Рпагтасіа, Іпс., Різсаїамлау, МО, для стандартних процедур) та розчин, що містить 0.2мкг/мл МЕСЕ, та будь-який немодифікований РіН(1-3)-Рс (при будь-якому значенні 0.5, -і 1.0 або 5.Омкг/мл) або десять різних ступінчасто ацетильованих РЇШ(1-3)-Ес зразків (при будь-якому значенні 0.5, 1.0 або 5.Омкг/мл) наносять на покритий Бй(1-3)-Єс чіп. Як показано на Фіг.8, за умов ть субстехіометричного відношення (0.5 мкг/мл будь-якого з немодифікованого БИ (1-3) або ступінчасто - ацетильованого ЕйЙ1(1-3)-Ес, 0.2мкг/мл МЕСР), кількість ЕйЙ1(1-3)-с (будь-якого, немодифікованого або 5р ступінчасто ацетильованого) недостатня у розчині для того, щоб повністю зв'язати МЕСЕР. За умов, коли те кількість становить 1.Омкг/мл, яка наближається до стехіометричного відношення 1:1, обидва немодифікований

Ф та ступінчасто ацетильований РЇШ(1-3)-Єс мають найкращі можливості до повного зв'язування з МЕСЕ, проте все ще ця здатність до повного зв'язування РіШ(1-3)-Єс протеїну (будь-якого, немодифікованого чи ступінчасто ацетильованого) до МЕСЕ є не повною. Проте, за умов, коли кількість складає 5.Омкг/мл, що є у багато разів більше, ніж стехіометричне відношення 1:1, обидва РШ(1-3)-Єс та ступінчасто ацетильований РіН(1-3)-Ес поліпептидиздатні зв'язувати МЕСЕ, завдяки ступеню ацетилювання. Це наочно демонструє, що ацетилювання іФ) не змінює здатність РІШ(1-3)-Ес протеїнів до зв'язування МЕС. ко (д.) Фармакокінетичний аналіз ступінчасто ацетильованного РІШ(1-3)-Ес

Іп мімо експерименти було виконано з метою одержати фармакокінетичні профілі немодифікованих 6во ЕЙН(1-3)-Єс та ступінчасто ацетильованих Рй1(1-3)-Ес протеїнів. Вар/с мишам (23-28г) було проведено ін'єкцію підшкірно 4мг/кг немодифікованого або такого, що у 10, 20, 40, 60 та 100 разів перевищував молярний надлишок зразків ступінчасто ацетильованого ЕШ|(1-3)-Ес (3 миші для немодифікованих зразків, які у 10, 20 та 40 разів перевищували молярний надлишок та 2 миші для зразків, які у 60 та 100 разів перевищували молярний надлишок). У мишей брали кров з хвоста Через 1, 2, 4, 6, 24 години, 2 та З дні після ін'єкції. Сироватку було 65 досліджено з використанням ЕГІЗА методу, який призначено для визначення РіН(1-3)-Рс (описано вище). На

Фіг.9 подано детальні результати цього дослідження. Тї лах для усіх Ей(1-3)-Єс протеїнів, що вивчали,

становила б годин, проте Стах становила як вказано далі: немодифікований РШ(1-3)-Ес: О,Обмкг/мл; зразок з 10 разовим молярним надлишком: 0,7мкг/мл; зразок з 20 разовим молярним надлишком: 2мкг/мл; зразок з 40 разовим молярним надлишком: 4мкг/мл; зразок з б6О разовим молярним надлишком: 2мкг/мл; зразок з 100 дазовим молярним надлишком: мкг/мл. Ці результати демонструють, що ацетилювання або легування

ЕН(1-3)-Ес значно поліпшує його фармакокінетичний профіль.

Приклад 11: конструкція делеційного мутанта на основі РІШН(1-3)-Ес регіону, позначеного Мий: РІК1-3Ав)-Ес

Базуючись на спостереженні, що ацетильований РйЙ(1-3)-бс, який має рі нижче 6, має набагато кращі фармакокінетичні показники, ніж високо позитивний немодифікований РйЙ(1-3)-Ес (рі » 9.3), постає питання, чи 7/0 можна було б віднести різницю в фармакокінетиках до негативного заряду протеїну, що сприяє його зв'язуванню з негативно зарядженими компонентами зовнішньоклітинного матриксу, або можливо були специфічні ділянки на поверхні ЕЙШ(1-3)-Ес протеїну, що обумовлює специфічні місця зв'язування для компонентів зовнішньоклітинного матриксу. Наприклад, про багато протеїнів відомо, що вони мають місця зв'язування гепарину, що часто складаються з кластеру залишків основ. Інколи ці залишки знаходять у кластері на первинній послідовності 75 протеїну; деякі джерела ідентифікують "консенсусні послідовності" для таких місць зв'язування гепарину (дивися, наприклад, Ніетап еї аї., 1998, Віоаззауз 20(2): 156-67). В інших випадках відома кристалічна структура білка відповідає кластеру позитивно заряджених залишків на поверхні протеїну, проте залишки походять з різних регіонів первинної послідовності та тільки об'єднуються разом, коли протеїн набуває четвертичної структури. Таким чином, важко вирішити, чи утворює амінокислотний залишок кластер основних го залишків на поверхні протеїну. Проте, якщо у первинній послідовності є кластер з позитивно заряджених амінокислотних залишків, не є неможливим припускати, що залишки розташовані тісно до інших і могли б, таким чином, бути частиною місця зв'язування компоненту зовнішньоклітинного матриксу. РИ! рецептор вивчено ретельно і описано різні домени (дивися, наприклад, Тапака еї аЇ.,, 1997, дрп. У. Сапсег Кев. 88:867-876).

Розглядаючи нуклеотидну та амінокислотну послідовності, зображені на фігурах ТОА-100 даної заявки, можна с ідентифікувати сигнальну послідовність для регуляції секреції, яка розташована на початку послідовності і доходить до гліцину, що кодується нуклеотидами 76-78. Дозрілий білок бере початок з 5ег-І ув-І ец-І уз, о починаючи з нуклеотиду 79 нуклеотидної послідовності. Домен 1 Ід рецептора РН охоплює нуклеотиди 79-393 і закінчується амінокислотами Зег-Азр-Тиг. Домен 2 Ід рецептора РН охоплює нуклеотиди 394-687 (які кодуть амінокислоти від СІуУ-Агд-Рго до Авп-ТІ-Не), і домен З Ід рецептора Р охоплює нуклеотиди 688-996 (які Ге) зо Кодують амінокислоти від Пе-Азр-Ма! до Авр-Іуз-АІа). Зазначений білок має зв'язувальну амінокислотну послідовність (місток), Сіу-Рго-СІу, яка кодується нуклеотидами 997-1005, за якою розташована нуклеотидна в послідовність, яка кодує Ес людини (нуклеотиди 1006-1701 або амінокислоти від іІШ-Рго-Г ув до «--

Ргго-С1у-ІЇ ув-термінуючого кодону).

Більш детальний аналіз амінокислотної послідовності ЕІ показує, що існує кластер, а саме амінокислотні - з5 залишки 272-281 (КМККАЗМЕК), що показані на фігурах ТОА-100, в яких б з 10 амінокислотних залишків є ї- основними. Дана послідовність розташована в домені З Ід рецептора РІЙ (дивися фігуру 11), та сама собою не має суттєвого значення для зв'язування ліганда МЕСЕ, але визначає підвищену спорідненість зв'язування з лігандом. Порівняльний аналіз послідовності домена З Ід з послідовністю домена 2 Ід показує, що в даній області два домени Ід мають низький рівень співставлення один з одним, та в домені З Ід існує приблизно 10 « додаткових амінокислот. Аналіз профілей гідрофільності (програмне забезпечення МасМесіог) двох зазначених у) с доменів чітко вказує на наявність гідрофільної області в білку (фігура 12А-128). На базі одержаних даних й можна припустити, що справжня тритинна конформація домену З Ід рецептора РИ робить можливим деяке «» розширення, яке є неможливим в домені 2 Ід рецептора РІ. Для перевірки даної гіпотези видаляють 10 додаткових амінокислот та досліджують одержаний білок з метою визначити, чи впливає вказана делеція позитивно на фармакокінетику без серйозного погіршення спорідненості рецептора до МЕСЕ. Конструкція ДНК, -і створена за стандартними методами молекулярної біології (дивися, наприклад, Моїесшціаг Сіопіпо, А І арогайгу

Мапиа! (ЗатбгооК, еї аїЇ., Соїй Зргіпд Нагрог Іарогайгу), Сиптепі Ргоїосоіїв іп Моїіесшаг Віоіоду (Евдв. ть А!йзибреї, еї аЇ., ОСгеепе Рирі. Авзвос., УМіПеу-Іпіегесіепсе, МУ) в векторі експресії рМТ21 ссавця (Сепеїйісв - Іпвійшіе, Іпс., Сатбргідде, МА), зветься Ми: Р (1-3 Ав)-Рс. Конструкцію Ми: РШЦ(1-ЗАд)-Ес одержують з

РІН(1-3)-Єє шляхом делеції нуклеотидів 814-843 (позначених на фігурах 10А-100), що дозволяє видалити е високоосновну послідовність, яка складається З 10 амінокислотних залишків 4) І ув-Авп-І уз-Ага-АІа-Зег-МаІ-Агд-Аго-Аго, з домену З Ід рецептора РІЙ.

Послідовність кінцевої конструкції ДНК секвеновано за допомогою секвенатора ДНК АВІ 37ЗА та набору для циклічного секвенування термінатора дидезокси методом (Арріїеі Віозувіетв, Іпс., Бовіег СПу, СА).

Послідовність Мий: РІНИ(1-ЗАвд)-Рс показано на фігурах 13А-130. о Приклад 12. Створення мутанта з делецією основної області РІН(1-3)-Ес, позначеного Ми: РІН(2-ЗАв)-Ес

Друга делеційна мутантна конструкція, позначена як Ми: РІН(2-3 Двд)- Ес, одержана з конструкції Мийі: де РІНЦ1-ЗАв)-Рс шляхом делеції домена 1 Ід рецептора РІЙ, який кодується нуклеотидами 79-393 (дивися фігуру 10А-1003); для зручності нуклеотиди 73-78 (ТСА ОСТ) замінено на ТСС ОСА. Завдяки цьому введено сайт 60 рестрикції(ВзрЕЇ!) без зміни пов'язаної з ним амінокислотної послідовності Зег-СІу. Вданій конструкції ДНК, створеній стандартними методами молекулярної біології (дивися, наприклад, Моіесшіаг Сіопіпо, А І арогайгу

Мапиа! (ЗатбгооК, еї аїЇ., Соїй Зргіпд Нагрог Іарогайгу), Сиптепі Ргоїосоіїв іп Моїіесшаг Віоіоду (Евдв.

А!ЇзибБреї, еї аї,, Огеепе Рирі. Авзвос., УМПеу-Іпіегесіепсе, МУ) у векторі експресії рМТ21 ссавця (Сепеїйісв

Іпвійшіе, Іпс., Сатбгідде, МА), послідовність також було секвеновано за допомогою секвенатора ДНК АВІ 373А бо та набору для циклічного секвенування термінатора дидезокси методом (Арріїед Віозузіетв, Іпс., Говієг Су,

СА). Послідовність Ми: РІЙ (2-3Ав)-Ес показано на фігурах 14А-1460.

Приклад 13. Створення делеційного мутанта РІН(1-3)-Ес. позначеного як МиїЗ: РІН(2-3)-Ес

Третя делеційна мутантна конструкція, позначена як Миї3: ЕШШ(2-3)-Ес, створена аналогічно мутантній

Конструкції Ми: РІН(2-3Ав)-Ес, за виключенням того, що домен З Ід рецептора РІЙ залишили без змін (амінокислоти основної області не видалено). Дану конструкцію створено за стандартними методами молекулярної біології та її послідовність секвеновано так, як це описано вище. Послідовність МиїЗ:

РН(2-3)-Ес показано на фігурах 15А-156.

Приклад 14. Створення М-глікозильованого мутанта основної області ЕН (1-3)-ЕС, позначеного як Ми: 70. РН (1-36-м)-Ес

Було створено кінцеву конструкцію, в якій сайт М-глікозування введено в середину основної області домену

З Ід рецептора РІЙ. Дану конструкцію, позначену як Ми: РИ (1-3в8-м)-Ес, створено шляхом заміни нукпеотидів 824-825 вд СА до АС, послідовно замінюючи кодуємий залишок Аго (АСА) залишком Азп (ААС) (дивися фігури 10А-100). Тому одержана амінокислотна послідовність змінилася з Агд-Аіа-Зег на Азп-АЇІа-Зег, яка відповідає 75 обов'язковому сигналу (Азп-Ххх-Зег/ТНг) для додавання сайту М-глікозування в залишку Авп. Послідовність Миї4:

РИ (1-З3д-м)-Ес показано на фігурах 16А-160.

Приклад 15. Дослідження ацетильованого білка РІН(1-3)-Єс та мутантів Ми: РІН(1-3 Ав)-Ес Та Мій: РІЙ (1-3д-м)-Ес (а) Зв'язування з компонентами зовнішньоклітинного матриксу

З метою визначити, чи мають три модифікованих білка поліпшені фармакокінетичні властивості, 96б-луночні планшети, покриті Маїгіде!ї, (описано вище) інкубують при різних концентраціях мутантних білків та вивчають кон'юговані з лужною фосфатазою антитіла проти Ес людини. Як показано на фігурі 18, виконаний експеримент свідчить, що, коли немодифікований білок РІШН(1-3)-Ес інтенсивно зв'язується з вказаними лунками, то білок

МиїЗ3: РШН(2-3)-Рс зв'язується дещо слабкіше, білок Ми: Пи(1-Здв)-Рс зв'язується ще слабкіше та білок Ми: сі

РН-(2-3АВ)-Ес характеризується найкращим профілем - його зв'язування є найбільш слабким ніж у будь-якого о іншого мутантного білка. Глікозильований мутантний білок Миші: ЕІН(1-Зв-м)-Ес має мінімальну перевагу, про що свідчать результати аналізу на Маїгідем. Одержані результати підтверджують гіпотезу про те, що лінійну послідовність позитивно заряджених амінокислот можна видалити з первинної послідовності, в результаті чого зменшується взаємодія зарядів з компонентами внутрішньоклітинного матриксу. (Се) (Б) Зв'язування Миї!: РІНС(1-3Ав)-Рс та Ми: РН(1-Зд-ем)-Рс при виконанні аналізу на основі Віасоге «

Немодифіковані та ацетильовані білки РІН(1-3)-Рс, а також генетично модифіковані білки Мий: ЕИ(1-ЗАВ)-Ес та Миї4: РІН(1-З5-м)-Ес досліджують, виконуючи аналіз на основі Віасоге, з метою оцінки їх спроможності ж" зв'язуватися з лігандом РІ - МЕСРЕ. При виконанні даного аналізу немодифікований білок РІН(1-3)-Ес (0,25, « 0,5 або 1,Омкг/мл) імобілізують на поверхні чіпа Віасоге (дивися інструкції по використанню чіпа Віасоге,

Зо фірми РІагтасіа, Іпс., Різсаїамлау, МО, для виконання стандартних аналізів) та розчин, що містить 0О,Тмкг/мл о

МЕСЕ та очищений немодифікований білок РМ1(1-3)-Єс або супернатант клітин СО5, що містить немодифікований білок ЕШН(1-3)-Ес (концентрація приблизно 0,25, 0,5 або 1,О0мкг/мл), очищенний ацтильований білок РІН(1-3)-Ес (концентрація 0,25, 0,5 або 1,Омкг/мл), супернатант клітин СО5, що містить Миїй!: РН(1-3 Ав)-Ес « (концентрація приблизно 0,25, 0,5 або 1,Омкг/мл), або супернатант клітин СО5, що містить Ми4: РІН(1-Зд-м)-Ес (концентрація 0,25,0,5 або 1,0мкг/мл), пропускають крізь чіп, покритий ЕШ(1-3)-с. Як показано на фігурі З с 17, за умови субстехіометричного співвідношенні (0,25мкг/мл. РІН(1-3)-с немодифікованих, ацетильованих або "з генетично модифікованих зразків на 0,Тмкг/мл МЕСЕ) білка ЕН(1-3)-Ес недостатньо, щоб блокувати зв'язування " МЕС з РІН(1-3)-Рс, який імобілізовано на чіпі Віасоге. При концентрації 0О,б5мкг/мл немодифікованих, ацетильованих або генетично модифікованих білків ЕШН(1-3)-Ес стехіометричне співвідношення наближається до 11, при цьому збільшується здатність білків блокувати зв'язування МЕСЕ з чіпом Віасоге. При концентрації - 1,0мкг/мл немодифікованих, ацетильованих або генетично модифікованих білків ЕШ(1-3)-Ес стехіометричне їз співвідношення наближається до 10:11, в результаті чого білкі ЕН(1-3)-с забезпечують зв'язування МЕСЕ з чіпом Віасоге, проте їх здатність не є еквівалентною. Немодифіковані, ацетильовані білки та Миї!: ЕКК1-ЗАв)-Ес - по суті однаково блокують зв'язування МЕСРЕ, у той час як Ми: РІН(1-3 в-м)-Ес блокує зв'язування менш «їз» 20 ефективно. Одержані результати підтверджують гіпотезу про те, що можна зменшити неспецифічне зв'язування позитивно зарядженої молекули шляхом генетичного видалення лінійної послідовності переважно негативно с заряджених амінокислот. с) Зв'язування Миїй!: РІМЙКК1-3 Ад)-Рс, Ми: ЕЩ2-ЗАв)-Ес та Миїв: РН(2-3)-Рс при виконанні анапіза на основі

ЕПЗА

99 Здатність трьох мутантних білків зв'язувати ліганд МЕСЕ рецептора РІШ визначають, виконуючи

ГФ) експерименти по зв'язуванню, в яких 96-луночні планшети, покриті МЕСЕ, інкубують з різними концентраціями т відповідного мутантного білка, після промивання визначають зв'язану кількість ліганда при інкубації культури з лужною фосфатазою, кон'югованою з антитілом проти Ес людини, та проводять кількісне визначення колориметричним методом, додаючи відповідний субстрат на основі лужної фосфатази. Як показано на фігурі 60 19, результати даного експерименту свідчать про те, що всі мутантні білки здатні однаково зв'язувати МЕСЕ при досліджуваних концентраціях.

Приклад 16. Фармакокінетичний аналіз ацетильованого білка РШ(1-3)-Рс. Ми: РІИ(1-ЗАв)-Ес та немодисрікованого білка РІН(І-3)-Ес

Експерименти іп мімо виконують для оцінки фармакокінетичних профілей немодифікованого білка РІН(1-3)-Ес, бо Ми: РІН(1-3ЗАв)-Ес та ацетильованого 40-разовим молярним надлишком білка РІН(1-3)-Ес. Мишам Ваїр/с (25-30г)

проводять підшкірну ін'єкцію 4мг/кг немодифікованого білка РІШ(1-3)-Ес, адетильованого 40-разовим молярним надлишком білка РІШН(1-3)-Рс та білка Мий: ЕШ(1-ЗАв)-Ес (по4 миші в кожній групі). У мишей з хвоста беруть кров через 1, 2, 4, 6, 24 години, 2 дні, З дні та 5 днів після ін'єкції. Сироватку аналізують за допомогою анапіза ЕГІЗА, призначеного для визначення білка РН(1-3)-Ес, який складається з того, що планшети для ЕГІЗА покривають МЕСЕ, здійснюють зв'язування РІН(1-3)Ес та зчитують дані, використовуючи антитіло проти Ес, зв'язане з лужною фосфатазою. Як показано на фігурі 20, С дах для зазначених реагентів має такі значення: немодифікований білок ЕШ(1-3)-Ес - 0,15мкг/мл; ацтильований 40-разовим молярним надлишком білок

РІНЦ(1-3)-Рс - 1,5мкг/мл та Ми: РИ (1-3Ав)-Ес 0,7мкг/мл.

Приклад 17. Створення вектора модифікованого рецептора РІЙ

Логічним обгрунтуванням для створення модифікованих варіантів рецептора РІН (відомого також як МЕСЕК1) є те, що білкова послідовність Р! є високоосновною і, можливо, тому зв'язується з зовнішньоклітинним матриксом (ЕСМ). Основний характер РІЙ, очевидно, пояснює той факт, що немодифікований білок РІН(1-3)-Ес (описаний вище) має погану фармакокінетику, що затруднює його використання як лікарського засобу. Як 75 зазначалося вище, хімічно модифікована форма ацетильованого 40-молярним надлишком білка РІШН(1-3)-Ес, який далі зветься А40, має набагато кращій фармакокінетичний (РК) профіль у порівнянні з неацетильованим білком РІН(1-3)-Ес. Тому було зроблено спроби зконструювати молекули ДНК, які можна використовувати для рекомбінантної експресії модифікованих форм молекули рецептора РІЙ, що мають поліпшені фармакокінетичні профілі, характерні для А40, які проте зберігають здатність міцно зв'язуватися з МЕОСЕ.

З наукової літератури відомо, що перший домен Ід рецептора РІЇ (який має загальний заряд 5 при нейтральному рН) не має істотного значення для міцного зв'язування з МЕСЕ, тому даний домен видаляють.

Третій домен Ід (який має загальний заряд 411) не має істотного значення для зв'язування, проте, визначає більш високу спорідненість до МЕСЕ, ніж другий домен Ід, тому його повністю не видаляють, а замінюють еквівалентними доменами РІКІ (відомого також як МЕСЕКЗ) та ЕРА (відомого також як МЕСЕКЗ), спорідненими до Га ре рецептора Р. Одержані химерні молекули (позначені відповідно як КІ1К2 (РІН.О02.РІЮЮЗ.Рс дСл1(а) та

МЕСЕКІК2-ЕсАст(а) та ККЗ (РНО2.МЕСЕКЗОЗ-ЕсАсСт(а) та МЕСЕКІКЗ-ЕсАст (а) відповідно, де К1 та ЕКІС2 о - домен 2 Ід рецептора РІЙ (МЕСЕКТ); К2 та РІКТО5 - домен З Ід рецептора РІК! (МЕСЕК2) та КЗ та МЕСЕКЗОЗ - домен З Ід рецептора РІМ (МЕСЕКЗ), у набагато меншому ступені зв'язуються з ЕСМ, про що свідчать результати описаного нижче аналізу зв'язування з ЕСМ іп міо, та мають набагато кращу фармакокінетику, як це описано (Се) нижче. Крім того, зазначені молекули здатні міцно зв'язуватися з МЕСЕ та блокувати фосфорилювання « нативного рецептора РІК1, який експресується в ендотеліальних клітинах, як це описано нижче. (а) Створення експресуючої плазміди РЕМО2.РІКТОЗ.ЕсАсС (а) -

Експресуючі плазміди рмтТ21.РЩШ(1-3).Єс (6519 пар основ) та рмМт21.РІК-1(1-3).1Єс (5230 пар основ) є « плазмідами, які кодують стійкість до ампіциліну та Ес-мічені варіанти доменів 1-3 (д рецепторов РІЙ та РІК! людини. Вказані плазміди використовують для створення фрагменту ДНК, який складається з химери домену 2 і -

Ід рецептора РШЇ з доменом З Ід рецептора РІКІ, що досягається ампліфікацією відповідних доменів Ід за допомогою реакції полімеразного ланцюга (РСК) з наступним виконанням циклу РСК для злиття зазначених двох доменів в один фрагмент. Для домену 2 Ід рецептора Р використано нижче наведені затравки для « ампліфікації 5'- та 3-кінців: 5: рзрйН 02 (5-«САСТАССАСТССОБАООТАСАССТТТСОТАСАС АТО-3) т с З'РШНО2-РІК1О3.а(5-СОБАСТСАСААССАСАТСТАТОАТТО ТАТТОСТ-3) ч Праймер для ампліфікації 5'-кінця кодує сайт рестрикційного ферменту ВерЕЇ, що розташований вище за » домен 2 Ід рецептора РІЙ та визначається амінокислотною послідовністю ОСКРЕМЕМ (яка відповідає амінокислотам 27-33 на фігурах 21А-21С). Праймер для 3'-кінця кодує зворотній комплемент 3'-кінця домену 2 Ід рецептора РІН, злитий безпосередньо з 5-кінцем, який починається біля домену З Ід рецептора РІК, де точка - злиття позначена як ТО рецептора РІН, (що відповідає амінокислотам 123-126 на фігурах 21А-21С) та який їз доходить до УМІ 5 (що відповідає амінокислотам 127-130 на фігурах 21А-21С) рецептора РІК1.

Для домену З Ід рецептора РІК1 використано нижче наведені праймери для ампліфікації 5'- та 3'-кінців: - 5 ЕМ102-РІК103.5 (Ї-АСААТСАТАСАТОТООСТТСТОАСТоС СТСТСАТОО-3)) їх 50 3" РІКТОЗ/ара/вП.авз. (Б-СЗАТААТОСССОООСССТТТТСАТОСА СССТОАСААДАТО-3)

Праймер для ампліфікації 5'-кінця кодує кінець домену 2 Ід рецептора РІЙ, злитий безпосередньо з

І) початком домену З Ід рецептора РІК!І, як це описано вище. Праймер для ампліфікації 3'-кінця кодує кінець домену З Ід рецептора РІКІ1, який визначається амінокислотами МКМНЕК (які відповідають амінокислотам 223-228 на фігурах 21А-21С), за якими йде з'єднувальна послідовність, яка містить розпізнавальну послідовність для рестрикційного ферменту БП! та кодує амінокислоти ЗРО. З'єднувальна послідовність

Ге! відповідає амінокислотам 229-231 на фігурах 21А-216.

Після циклу ампліфікації РСК з метою одержання окремих доменів продукти з'єднують у пробірці та піддають де ще одному циклу РСК з використанням праймерів рзр/ПНО2 та РІКІОЗ/ара/5пП.аз (описаних вище) для одержання злитого продукту. Далі продукт РСК розщеплюють рестрикційними ферментами ВеріЇ та Зтаї та 60 одержаний фрагмент довжиною 625 пар основ субклонують на сайтах рестрикції з ВерЕ!І до ЗП! вектора рмМтТ21/А482.Рс, створюючи таким чином плазміду рМТ21/ЕК02.РІКТО5.Ес. Нуклеотидну послідовність злитої вставки гену ЕШО2-РІКТОЗ перевіряють, виконуючи стандартне секвенування. Вказану плазміду далі розщеплюють рестрикційними ферментами ЕсоК!І та Зп! та одержаний фрагмент довжиною 702 пар основ переносять на сайти рестрикції з ЕсоКІ до ЗП плазміди рЕШ(1-3)82-ЕсАсСт1(а), з метою отримання плазміди бо РРНО2.РІКТОЗ.РсдСті(а). Повна ДНК та виведені амінокислотні послщовності химерної молекули

ЕНО2.РІКТО5.ЕсАс та) показано на фігурах 21А-216. (Б) Створення експресуючої плазміди РРНКО2МЕСЕКЗОЗЕсАСс (а)

Експресуюча плазміда рМТ21.ЕЩ(1-3).Єс (6519 пар основ) кодує стійкість до ампіциліну та Ес-мічений варіант доменів 1-3 Ід рецептора РИ людини. Дану плазміду використовують для одержання фрагменту ДНК, що містить домен 2 Ід рецептора РН за допомогою РОК. РНК з лінії клітин НЕ! 921.7 використовують для одержання домену З Ід рецептора РІК! за допомогою стандартного метода КТ-РСК. Ще один цикл ампліфікації РСК виконують з метою злиття двох доменів Ід в один злитий фрагмент. Для домену 2 Ід рецептора РІЙ використовують нижче наведені праймери для ампліфікації 5-та 3'-кінців: 70 5'бзр/НН02 (5-«САСТАССАСТССОСАСОСТАСАССТТТСОТАСА САТО-3) 3 ЕШНО2.МЕСЕРКЗОЗ.а(Т Сто ОСААСАОСТОСАТАТСТАТО АТТОТАТТОСТ) (в) Створення експресуючої плазміди РРНКО2МЕСЕКЗОЗЕсАСс (а)

Експресуюча плазміда рМТ21.ЕЩ(1-3).Єс (6519 пар основ) кодує стійкість до ампіциліну та Ес-мічений варіант доменів 1-3 Ід рецептора РН людини. Дану плазміду використовують для одержання фрагменту ДНК, що 75 містить домен 2 Ід рецептора РІЙ за допомогою РОК. РНК з лінії клітин НЕ! 921.7 використовують для одержання домену З Ід рецептора РІКІ за допомогою стандартного метода КТ-РСК. Ще один цикл ампліфікації РОК виконують з метою злиття двох доменів Ід в один злитий фрагмент. Для домену 2 Ід рецептора РІЙ використовують нижче наведені праймери для ампліфікації 5-та 3'-кінців: 5'бзр/НН02 (5-«САСТАССАСТССОСАСОСТАСАССТТТСОТАСАСА ТО-3) 3 ЕШНО2.МЕСЕРКЗОЗ.а(Т Сто ОСААСАОСТОСАТАТСТАТОА ТТОТАТТОСТ)

Праймер для ампліфікації 5'-кінця кодує сайт рестрикції ВерЕЇ, розташований вище за домен 2 Ід рецептора

РМ, що визначається амінокислотною послідовністю ЗКРЕМЕМ (яка відповідає амінокислотам 27-33 на фігурах 22А-22С). Праймер для ампліфікації 3З'-кінця кодує зворотній комплемент кінця домена 2 Ід рецептора РІЙ, злитий безпосередньо з початком домену З Ід рецептора МЕСЕКЗ, де точка злиття позначена як ТО рецептора СУ

РН (що відповідає амінокислотам 123-126 на фігурах 22А-22С),та доходить до ОЇ рецептора МЕСЕКЗ (що о відповідає амінокислотам 127-130 на фігурах 22А-22С).

Для домену З Ід рецептора МЕСЕКЗ використовують нижче наведені 5'- та 3'-кінцеві праймери для виконання

КТ-РСК: 5: 303.5 (АТССАОСТОТТОСССАСОААСТСОСТОвАОСТОСТОСТА) (Се) 3: К303.аз (АТТТТСАТОСАСААТОАССТСОСТОСТСТСССОАААТСОВ)

Праймери для ампліфікації 5'- та 3- відповідають послідовності МЕСЕКЗ. Продукт ампліфікації довжиною 296 З пар основ, одержаний в результаті виконання реакції КТ-РСК, виділяють стандартними методами та піддають ч другому циклу РСК для введення прийнятних послідовностей, необхідних для злиття доменів РНО2 та РІК1О5, а також доменів РІКТО5 та Ес за допомогою містка ОРО (дивися нижче). Використовують нижче наведені праймери З для ампліфікації: ч- 5: РШО2.МЕСЕКЗОЗ.5 (ТСАТАСАТАТССАОСТОТТОСССАСОСААс ТСОСТОбАС) 3: МЕСЕКЗОЗ/8п.аз (ВАТААТОСССОСОССАТТТТСАТОСАСААТ САССТСОСТ)

Праймер для ампліфікації 5'-кінця кодує 3'-кінець домену 2 Ід рецептора РІЙ, злитого безпосередньо з « початком (5-кінця) домену З Ід рецептора МЕСЕКЗ, як це описано вище. Праймер для ампліфікації 3'-кінця кодує З-кінець домену З Ід рецептора МЕСЕКЗ, що визначається амінокислотами МІМНЕМ (що відповідають - с амінокислотам 221-226 на фігурах 22А-22С), за якими йде з'єднувальна послідовність, яка включає а розпізнавальну послідовність для 5П! та кодує амінокислоти СРО. З'єднувальна послідовність відповідає "» амінокислотам 227-229 на фігурах 22А-226.

Після одного циклу (для домену 2 Ід рецептора РІ) або двох циклів (для домену З Ід рецептора РІК) РСК, виконана з метою одержання окремих доменів Ід, продукти РОК з'єднують в пробірці та піддають еще одному -і циклу ампліфікації РСК з використанням описаних вище ампліфікуючих праймерів Б5р/РНО2 та їз МЕСЕКЗОЗ/зП.аз з метою одержання злитого продукту. Далі продукт РСК розщеплюють за допомогою рестрикційних ферментів ВерЕЇ та Зта! та одержаний фрагмент довжиною 625 пар основ субклонують в сайти - рестрикції ВерЕ! - п! вектора рмтТ21/РИАВ2.ЕРс (описаного вище) з метою створення плазміди їх 50 рМТ21/ЕИИ102.МЕСЕКЗОЗ.Ес. Послідовність злитої вставки гена ЕИО2-МЕСЕКЗОЗ перевіряють, виконуючи стандартне секвенування. Вказану плазміду далі розщеплюють рестрикційними ферментами ЕсокіІ та 5 та 4) одержаний фрагмент довжиною 693 пар основ субклонують в сайти рестрикції ЕсоК! - Зп плазміди рРЕШН(1-3)АВ2-ЕсАс (а) та одержують плазміду, позначену РРНО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАс (а). Повна ДНК та виведена амінокислотна послідовність химерної молекули ЕН О2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАс (а) показано на фігурах 22А-226.

Приклад 18. Аналіз зв'язування зовнішньоклітинного матриксу (ЕСМ)

ГФ) Покриті ЕСМ планшети (Мо35-4607 за каталогом Весіоп Оіскіпвоп) повторно гідратують теплим ЮОМЕ, з додаванням глутаміну (2ММ), 100 од. пеніциліну, 10бод. стрептоміцинату та 1095 ВС5, протягом, зокрема, 1 ді години перед введенням зразків. Далі планшети інкубують протягом 1 години за кімнатної температури з різними концентраціями ЕМО2.ККООЗ.Ес АСт(а) та ЕНО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАСт(а), починаючи з концентрації ТОнНМ з 60 наступним 2-разовим розведенням в РВЗ та додаванням 1095 ВС5. Далі планшети тричі промивають РВ5 з 0,190

Тиійоп-Х та інкубують з кон'югованим з лужною фосфатазою антитілом проти Ес людини (Рготеада, 1:4000 в РВ5 з 10956 ВС5) протягом 1 години за кімнатної температури. Планшети 4 рази промивають РВЗ з 0,190 Тийоп-Х, додають буфер на основі лужної фосфатази та розчин рМРР (Зідта) з метою забарвлення культури. Результати зчитують при | - 405-57О0нм. Результати експерименту, показані на фігурі 23, свідчать про те, що ступінь бо зв'язування білків ЕК1О2.РІКТОЗ.ЕсАСт (а) та ЕНМТО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАст (а) з ЕСМ набагато менший у порівнянні з білком РІН(1-3)-Ес.

Приклад 19. Тимчасова експресія РЕНО2.РІК1О3. Есдаге) в клітинах СНО- КІ (ЕТА)

Велика кількість (2л) культури клітин ОНІТОВ Е. соїї, що містять плазміду РЕШО2.РІКТОЗ.ЕсАСст(а), описану вище в прикладі 17(а), вирощують протягом ночі в бульоні ТВ, що містить 100мкг/мл ампіциліну. Наступного дня плазмідну ДНК екстрагують, використовуючи набір СіАдеп Епдоїтее Медаргер у відповідності до інструкцій виробника. Концентрацію очищенної плазмідної ДНК визначають за стандартними методами, використовуючи ультрафіолетовий спектрофотометр та флуориметр. Плазмідну ДНК перевіряють за стандартним методом розщеплення рестрикційним ферментом аліквот зразків з використанням рестрикційних ферментів ЕсокЧемої! та 70 АвеІ. Всі фрагменти, розщеплені рестрикційними ферментами, відповідають прогнозованим розмірам за результатами аналізу на 195 агарозному гелі.

Сорок 15см чашок Петрі засівають клітинами СНО-КТ/ЕТА з щільністю 4 х 109 клітин/учашку. Як середовище для чашок Петрі використовують середовище Е-12 фірми Сібсо Нат, з додаванням 1095 фетальної телячої сироватки (ЕВ5), 100бод. пеніциліну//Обод. стрептоміцину та глутамін (2ММ). Наступного дня всі чашки з 75 клітинами трансфікують бмкг плазмідної ДНК рЕНО2.РІКТО5.ЕсаАсСт (а), використовуючи препарати Оріїтет та

Проїтесіатіпе фірми сірсо в об'ємі 12мл у відповідності до інструкцій виробника. Через чотири години після додавання до клітин трансфікуючої суміші додають 12мл/чашку препарату Оріїтет, що містить 1095 ЕВ5. Чашки інкубують за температури 372С в інкубаторі з 595 СО» протягом ночі. Наступного дня середовище видаляють з всіх чашок та додають 25мл експресуючого середовища (СНО-5-5ЕМ ІІ фірми сбібрсо, з додаванням глутаміну (2мММ) та 1мМ бутирату натрію). Чашки інкубують за температури 372С протягом З днів. Після інкубації протягом З днів середовище відсмоктують із всіх чашок та центрифугують із швидкістю 400обертів/хвилину в роторі з корзиною, що качається, з метою осадження клітин. Супернатант розливають в стерильні флакони місткістю 1л та експресований білок очищують, як це описано нижче.

Приклад 20. Створення експресуючого вектора РМЕСЕК1ТК2-ЕсАдС (а) с

Експресуючу плазміду РУЕСЕКТК2.РсАСт(а) створюють шляхом введення ДНК, що кодує амінокислоти ЗОТ (9 (які відповідають амінокислотам 27-29 на фігурах 24А-24С), між амінокислотами 26 та 27

ЕНО2-РІКТО3-РсдСт(а) на фігурах 21А-21С0 (50), та видалення ДНК, що кодує амінокислоти ОРО, які відповідають амінокислотам 229-231 на даній фігурі. Амінокислотна послідовність ОТ, споріднена з рецептором с

РІН, її вводять для зменшення можливості гетерогенного процесингу М-кінця. СРО (з'єднувальну послідовність) видаляють з метою досягнення прямого злиття доменів РІЙ та РІК! Ід один з одним. Повна ДНК та виведені «І амінокислотні послідовності химерної молекули РМЕСЕКІТК2.ЕсдсСт (а) показано на фігурах 24А-246. -

Приклад 21. Спосіб культивування клітин, що використовується з метою продукування модифікованих рецепторів РІЙ « (а) Спосіб культивування клітин, що використовується з метою продукування РШНОЗ.РІКТОЗ.ЕсАсСт (а) їч-

Спосіб продукування білка РНО2.РІКТОЗ.Ес АС1(а) з використанням експресуючої плазміди рРЕШО2.РІКТО5.РсдСті(а), що описано вище в прикладі 71, включає застосування суспензійної культури рекомбінантних клітин яєчника китайського хом'ячка (К1/ЕТА СНО), які звичайно експресують білковий продукт.

Зазначені клітини вирощують в біореакторах, білююовий продукт виділяють та очищують шляхом афінної та « конкурентної хроматографії. Даний спосіб більш детально описано нижче. 8 с Розмноження клітин а Лінію клітин, що експресує ЕНО2.РІКТ1О8.ЕслдсС1(а) та знаходиться в двох Т-225см? колбах, які забезпечують я злиття клітин, розмножують пасеровані клітин у вісьмох Т-225см 2 колбах з середовищем (ЗМЕМ ж 1096 сироватки, фірма СІВСО) та інкубують за температури 372С та 596 СО». Коли в колбах відбувається злиття клітин (приблизно через 3-4 дні), клітини відокремлюють за допомогою трипсину. Додають свіже середовище з - метою захистити клітини від подальшого впливу трипсину. Клітини центрифугують, повторно суспендують в ї» свіжому середовищі, переносять до вісьмох флаконів ємкість 850см 2, що обертаються, та інкубують при температурі 372С та 595 СО» до злиття. - Суспензійна культура в біореакторах «» 20 Клітини, вирощені у флаконах, що обертаються, відокремлюють від поверхні, проводять обробку трипсином та промивають середовищем з суспензійної культури. Клітини переносять за асептичних умов до біореактору с ємкістю бл (Мем Вгипеміск Сеїйдеп Рів), де клітини вирощують в З,5л суспензійної культури. Середовищем для суспензійної культури є модифіковане середовище ІЗ-СНО без глутаміна з низьким вмістом глюкози (Ігміпе

Зсіепійіс), до якого додають 595 фетальної телячої сироватки (Нусіопе), добавку 55 (Ше Тесппоіодіев) та 25 25МКМ метионинсульфоксиміну (Зідта). Показник рН доводять до 7,2, додаючи у біореактор вуглекислий газ до

ГФ) газу, що подається, або рідкий розчин карбонату натрію. Розчинений кисень підтримують на рівні З095 кю насищення, додаючи кисень або азот до газу, що подається, за температури 372С. Після досягнення щільності, що дорівнює 4 х 109 клітин/мл, клітини переносять до біореактору ємкістю 40л, що містить таке ж середовище во та має аналогічні параметри. Температуру знижують до 3492С, з метою уповільнити ріст клітин та збільшити відносну швидкість експресії білка. (в) Спосіб культивування клітин, що використовується з метою продукування ЕН О2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАст Та)

З метою продукування ЕРНО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАс та) використовують ті ж способи, які описано вище з метою одержання РНО2.РІКТО5.ЕсАс (а). 65 Приклад 22. Збір та очищення модифікованих рецепторов РІН (а)

Сбір та очищення ЕНО2.РІКТОЗ.ЕсАст1(а)

Білковий продукт збирають за асептичних умов в біореакторі, зберігаючи клітини за допомогою модулів для фільтрації тангенційного потоку Мійроге Ргозіак та механічного насосу із слабим зусилллям здвигу (Ргізіат).

В біореактор додають свіже середовище з метою заміни середовища, видаленого під час фільтрації зібраних клітин. Приблизно 40л фільтрату зібраних клітин вводять до 400мл колонки, заповненої смолою Ргоїеіп А

Зерпагозе (Атегепат РНагтасіа). Введену смолу промивають буфером, що містить Л0ММ фосфату натрію,

Б5БООММ хлориду натрію, рН 7,, щоб видалити будь-які незв'язані забруднюючі білки. Білок

ЕШНО2.РІК1О5.РсАСт(а) елюють цитратним буфером з рН 3,0. Елюїрований білок нейтралізують, додаючи

Тгів-основу та заморожують при -2026.

Декілька заморожених партій РЕШО2.РІКТОЗ.ЕРсдСт(а) білка А, одержаних при виконанні вище описаної стадії, розморожують, з'єднують та концентрують, використовуючи мембрану для фільтрації тангенційного потоку, яка відокремлює речовини з номінальною молекулярною масою ЗОкДа (ММУУСО). Білок переносять в концентратор з перемішуванням клітин (Міййроге) та концентрують до ЗОмг/мл, використовуючи мембрану

ММУУСО для ЗОкДа. Концентрований білок вводять до витісняючої колонки, заповненої смолою Зирегаех 200 75 (Атегепат РНагтасіа), яка врівноважена фізіологічним розчином з фосфатним буфером та 595 гліцерину. Такий же буфер використовують для промивання колонки. Фракцій, які відповідають димеру РНО2.РІКТО5.Ес АСТ(а), об'єднують, фільтрують в стерильних умовах через фільтр 0,22 мікрони, беруть аліквоту білка та заморожують. (5) Збір та очищення ЕРН102.МЕСЕКЗОЗ.ЕРсАс та)

З метою збору та очищення ЕШНО2./ЕСЕКЗОЗ.ЕсАс та) використовують ті ж способи, які описано вище з 20 метою одержання ЕШО2.РІКТОЗ.Еслс 1(а).

Приклад 23. Аналіз фосфорилювання тимчасово експресованого МЕСЕК2

Первинні ендотеліальні клітини пупкової вени людини (НОМЕС) (4-6 пасажів), витримують протягом 2 годин в безсироватковому середовищі ОМЕ з високим вмістом глюкози. Зразки, що містять 4Онг/мл (1НМ) МЕСЕ165 людини, який є лігандом для рецепторів РШН, РІК! та ЕК (МЕСЕКЗ) МЕСЕ, попередньо інкубують протягом 1 с 25 години за кімнатної температури з різними кількостями модифікованих рецепторів РІ, таких як ЕШ(1-3)-Ес, Ге)

РНК1-3)-Рс (А40), РН О2РІК1О3.РсаАсСт (а) та РНО2МЕСЕКЗОЗ,ЕсАс т (а), в безсироватковому середовищі ОМЕ з високим вмістом глюкози, що включає 0,195 ВЗА. Клітини стимулюють протягом 5 хвилин одержаними вище зразками 17- МЕСЕ165 та лізують цільними клітинами, використовуючи буфер для повного лізису. Клітинні лізати імуноосаджують антитілом проти С-кінця рецептора МЕСЕК2. Імуноосадженні лізати вміщують на 4-1295 гель шо 30 Момех для БОЗ-РАСЕ та далі переносять на полівінілденфторидну мембрану за допомогою стандартних методів чЕ переносу. Фосфорилювання МЕСЕК2 вивчають з використанням іммуноблотингу з використанням антифосфотирозинового моноклонального антитіла, позначеного 4510 (ВІ), та забарвлюють за допомогою -

ЕСІ -реагенту (Атегейпаті). чЕ

На фігурах 25А-25С та 26А-268 наведено результати даного експерименту. На фігурах 25А-25С показано, що 32 визначення вестерн-блотингом фосфорильованого тирозином МЕСЕКАЗ(РІКІ) в результаті стимуляції лігандом т

МЕСЕ165 свідчить про те, що рецептори на поверхні клітини фосфорильовані в різному ступені в залежності від того, який модифікований рецептор РШ використано під час попередньої інкубації з МЕСЕР. Як показано на фігурі 25А, при 1,5 молярному надлишку РШ(1-3)-Ес, ЕШ(1-3)-Ес (А40) або тимчасово експресованого «

РНО2РІКТОЗ.РсдсСт(а) повністю блокується стимуляція рецептора зазначеними трьома модифікованими З7З 70 рецепторами Р у порівнянні з стимуляцією контрольним середовищем. На відміну від цього тимчасово с експресований білок ЕНМО2МЕСЕКЗОЗ.ЕсАсСт(а) не викликає значного блокування при зазначеному молярному :з» надлишку у порівнянні з стимуляцією позитивним контрольним білком МЕСР. Аналогічні результати наведено на фігурі 258, де модифіковані рецептори Ріїї використані в триразовому молярному надлишку відносно ліганду

МЕСРЕ165. На фігурі 25С показано, що у тому випадку, коли модифіковані рецептори Р використані в -1 шестиразовому молярному надлишку відносно ліганду МЕСЕ 165, тимчасово експресований білок

ЕШНО2МЕСЕКЗОЗ,ЕсАсС та) частково блокує викликану МЕСЕ165 стимуляцію рецепторів на поверхні клітин. ве На фігурі 26А-26ОВ8 показано, що визначення вестерн-блотингом тирозинового фосфорильованого - МЕСЕКА(РІКІ) в результаті стимуляції лігандом МЕСЕ165 свідчить, що рецептори клітинної поверхні не фосфорильовані стимулюючими зразками, які містять МЕСЕ165, попередньо ін-кубований з 1- та 2-разовим - молярним надлишком (фігура 26А) або 3- та 4-разовим молярним надлишком надлишком (фігура 268)

Ф тимчасово експресованого білка ЕН О2РІК1О3.ЕсАСт(а), постійно експресованого білка ЕН О2РІК1О3.РсаАС (а) або тимчасово експресованого білка МЕСЕК1ТК2-ЕсдСт(а). При всіх досліджених концентраціях модифікованого рецептора РІЙ відбувається повне зв'язування ліганда МЕСЕ165 під час попередньої інкубації, в результаті дв Чого не визначено стимуляції рецепторів на поверхні клітин незв'язаним МЕСЕ165 у порівнянні із стимуляцією контрольним середовищем.

Ф) Приклад 24. Біоаналіз проліферації клітин ко Популяція досліджуваних клітин є клітинами МО87, які стійко трансфековані експресуючою плазмідою, яка містить ДНК-вставку, що кодує зовнішньоклітинний домен МЕСЕКА(РІКІ), злитий з внутрішньоклітинним доменом бо Кінази ТгКВ, які таким чином утворюють химерну молекулу. Причина використання внутрішньоклітинного домену кінази ТткВ замість нативного внутрішньоклітинного домену кінази МЕСЕКЗ(РІКІ) складається з того, що внутрішньоклітинний домен кінази МЕСЕКЗ(РІК1І) не викликає сильної проліферативної реакції при стимуляції

МЕСЕ165 в зазначених клітинах. Відомо, що в клітинах МО87, які містять повнорозмірний рецептор Т/КкВ, виникає сильна проліферативна реакція при стимуляції ВОМЕ, тому внутрішньоклітинний домен кінази МЕСЕКА(РІК1) 65 Замінюють внутрішньоклітинним доменом кінази ТІкВ, щоб скористатися перевагами цієї здатності до проліферативної відповіді.

х 103 клітин/лунку культивують в 96-луночному планшеті протягом 2 годин за температури 372С. Нижче зазначені модифіковані рецептори Б отакі яко ЕЙЩ(1-3)-Ес, РНО2.РІКТОЗ. с 0 АС1 (а) (та

ЕШНО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАсСт(а), а також сторонній рецептор, що зветься Тіе2-Рс та що використовується як 5 негативний контрольний зразок, титрують в діапазоні від 40НМ до 20пМ та інкубують на клітинах протягом 1 години за температури 372С. Далі до всіх лунок додають рекомбінантний МЕСЕ165 людини в середовищі, що характеризується певним складом з концентрацією 1,56нМ. Планшети інкубують протягом 72 годин за температури 372С, додають МТЗ (Омжмеп'з геадепі, Рготеда) та планшети інкубують ще 4 години. Далі планшети зчитують за допомогою спектрофотометра при 450/57О0нм. Результати даного експерименту показано на фігурі 70.27. Контрольний рецептор Тіе2-Ес, що використовується в будь-якій концентрації, не блокує викликану МЕСЕ165 проліферацію клітин, в той час як ЕНО2.РІКТОЗ.Рс АдС1(а) блокує 1,56 нМ МЕСЕ165 за умов використання половини максимальної дози, що дорівнює 0,8нМ. РІШН(1-3)-Ес та РШО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАСтТ(а) менш ефективно блокує МЕСЕ165 в даному аналізі при використанні половини максимальної дози, що дорівнює 72 НМ. Якщо

МЕСЕ165 використовується окремо, результат дорівнює 1,2 одиниці поглинання, при цьому фонове 12 випромінення дорівнює 0,38 одиниці поглинання.

Приклад 25. Стехіометрія зв'язування модифікованих рецепторов РЇЗМЕСЕ165(а)

Аналіз на основі Віасоге

Стехіометрію взаємодії ЕН О2РІКОЗ.ЕсАСсС (а) та МЕСЕКІК2-ЕсдСт(а) з МЕСЕ165 людини визначають шляхом вимірювання рівня насичення зв'язування МЕСЕ з поверхнями ЕНО2РІК1О3.Ес АСТ(а) або МЕСЕКІК2-ЕсаС (а) 720 або вимірювання концентрації МЕСЕ165, що необхідно з метою повного попередження зв'язування

ЕНО2РІКТОЗ.РсАст (а) або МЕСЕК1ТК2-ЕсАс а) з поверхнею чіпа Віасоге, покритого МЕСБЕ.

Модифіковані рецептори РБїї, такі як ЕН О2РІКТОЗ.Рс АСтТ(а) та МЕСЕКІТК2-ЕсдСт(а), що захоплюються специфічним антитілом проти Ес, яке було першим імобілізовано на чіпі Віасоге (Віасоге) методом зв'язування з с аміном. Як негативний контрольний зразок використовують поверхню контрольного антитіла. Проводили ін'єкцію

МЕСЕ165 в концентрації їнм, ЛОНМ та 5Онм на поверхні ЕН О2РІКТОЗ.РсдСт(а) та МЕСЕКІТК2-ЕсдСт(а).- із (8) швидкістю 1Омкл/мин протягом однієї години. Регіструють реальний час сигналу зв'язування і зв'язування насичення досягають в кінці кожної ін'єкції. Стехіометрію зв'язування обчислюють у вигляді молярного відношення зв'язаного МЕСЕ165 до імобілізованго РШО2РІК1ОЗ. с АСт(а) або МЕСЕКІ1К2-ЕслАса), «я використовуючи коефіцієнт перерахунку, який дорівнює 1000 щурячим одиницям, які є еквівалентними нг/мл.

Результати показують, що стехіометрія зв'язування дорівнює одній димерній молекулі МЕСЕ165 на одну З молекулу ЕН О2РІКТОЗ.РсаАСт(а) або МЕСЕК1ТК2-ЕсАс а) (фігура 28). «--

Білок РНО2РІКТОЗ.ЕсдСт1 (а) або МЕСЕК1К2-ЕсАСсСТ (а), що знаходиться в розчині з концентрацією 1НМ (яка в 1000 разів перевищує КО взаємодії ЕМ О2РІКТОЗ.ЕсдСт(а) або МЕСЕК1К2-ЕсАаСт1(а)//ЕСЕ165), змішують з З різними концентраціями МЕСЕ165. Через годину інкубації концентрації вільного ЕИО2РІК1ОЗ. Ес АСт(а) у ї- розчині вимірювали як відношення сигналу зв'язування до амінозв'язаної МЕСЕ165 поверхні. Калібрувальну криву використовують з метою перетворення показника сигналу зв'язування ЕМ О2РІКТ1ОЗ.Ес АС (а) з ВІАсоге в його молярну концентрацію. Наведені дані показують, що додавання їнМ МЕСЕ165 у розчин «

ЕШНО2РІКТОЗ.РсдСт(а) повністю блокує зв'язування ЕШО2РІК1ОЗ.Бс дСт(а) з поверхнею МЕСЕ165. Цей 70 результат дозволяє думати, що стехіометрія зв'язування дорівнює одній молекулі МЕСЕ165 на одну молекулу 8 с РНО2РІКІОЗ.РсдсСті(а) (фігура 29 та фігура 30). При побудові кривої залежності концентрації з РНО2РІКТОЗ.РсАсСт(а) від доданої концентрації МЕСЕ165 нахил лінійної частини дорівнював - 1,06 для

ЕНО2РІКТОЗ.РсАсСт(а) та - 1,07 для МЕСЕК1ТК2-Ес АС1(а). Величина нахилу, дуже близька до негативного нахилу, свідчила про те, що одна молекула МЕСЕ165 зв'язувалася з однією молекулою чи -І ЕШНО2РІК1О3.РсАСт (а), чи МЕСЕК1ТК2-ЕсдС (а). (Б) Конкурентна хроматографія ве ЕНО2РІКІО3.ЕсАСТІ (а) було змішано з трьохразовим надлишком МЕСЕ165 та рецептор-лігандний комплекс - було очищено з використанням колонки для конкурентної хроматографии РНагтасіа Зирегозе 6. Далі 5ор рецептор-лігандний комплекс інкубували в буфері, що містить бМ гідрохлориду гуанідіну, з метою його ть розщеплення на складові білки.

Ф ЕНО2РІК1О3.Ес АС (а) відокремлювали від МЕСЕ165 в колонці для конкурентної хроматографії З,регозе 6 в бМ хлориді гуанідину. З метою визначити стехіометрію комплексу, проводили декілька ін'єкцій

ЕН О2РІКТОЗ.РсАсСт(а) та МЕСЕ165 та будували пік висоти або пік інтегрованої інтенсивності як функцію концентрації введеного білка. Калібрування було виконано за умов, ідентичних тим, що використані при о відокремленні компонентів комплексу ЕМ О2РІК1О3.ЕслСт1(а)//ЕСР. Кількісне визначення складу комплексу

ЕН О2РІКТ1ОЗ3.гсАСтТ(а)//ЕСЕ було проведено на базі калібрувальних кривих. Результати даного експерименту, о наведені на фігурі 28, показують, що співвідношення МЕСЕ165 до ЕН О2РІКТОЗ.ЕсАс (а) в комплексі дорівнює 1:11. 60 Приклад 26. Визначення стехіометрії зв'язування комплекса ЕН О2РІК1О3.Рс АСТ(ау//ЕСЕ165 за допомогою конкурентної хроматографії

Одержання комплексу ЕШО2РІК1О3.ЕсАС1т(а/ЕС 165

МЕСЕ165 (концентрація - З,бімг/мл) змішують з РШО2.РІКТО5.ЕРс дС1(а), тимчасово експресованим в в клітинах СНО, (концентрація - О,Умг/мл) в молярному відношенні 3:11 (МЕСЕ165:ЕНО2.РІК1ОЗ.Рс Ас (а)) та інкубують протягом ночі за температури 42С.

(а) Конкурентна хроматографія (5ЕС) в природних умовах

Щоб відокремити комплекс від надлишку незв'язаного МЕСЕ165, 5Омкл комплексу вводили в колонку

РПпагтасіа Зирегозе 12 РС 3.2/30, яка була урівноважена буфером на основі РВ5. Зразок елюювали тим же буфером з швидкістю потоку 4Омкл/хвилину за кімнатної температури. Результати ЗЕС показано на фігурі 31. Пік

Мо1 відповідав комплексу, а пік Мо2 відповідав незв'язаному МЕСЕ165. Фракції, елюйовані в діапазоні 1,1 та 1,2мл, з'єднували і додавали гідрохлорид гуанідіну (ЗИНСІ) до кінцевої концентрації 4,5М з метою дисоціації комплексу. (Б) Конкурентна хроматографія (5ЕС) за умов дисоціації 70 З метою поділити компоненти комплексу рецептор-ліганд та визначити їх молярне співвідношення, 5ОмМкл описаного вище дисоційованого комплексу вводили в колонку Зуирегозе 12 РОС 3.2/30, урівноважену 6М розчином

СИиНСІ, та елюювали тим же розчином з швидкістю потоку 4Омкл/хвилину за кімнатної температури. Результати

ЗЕС показано на фігурі 32. Пік Мо1 відповідає ЕН О2РІК1О3.РсдсСт1(а), а пік Мо2 відповідає МЕСЕ165. (с) Обчислення стехіометрії комплексу ЕН О2РІКТОЗ.ЕсАСт(а)МЕСЕ165

Стехіометрію комплексу рецептор-ліганд визначали з урахуванням площі або висоти піків компонентів.

Концентрації МЕСЕ165 та ЕН О2РІКІОЗ.РсадСт(а), що відповідали висоті або площі піків, одержували на базі стандартних кривих для МЕСЕ165 та ЕН О2РІК1О3.Рсадст(а). З метою побудувати стандартну криву, здійснювали ін'єкцію чотирьох різних концентрацій (0,04мг/мл - 0,Змг/мл) будь-якого компоненту в колонку РНаптасіа

Зипрегозе 12 РО 3.2/30, врівноважену ЄМ розчином хлорида гуанідіну, та елюювали тим же розчином з швидкістю потоку 40мкл/хвилину за кімнатної температури. Стандартну криву одержували, накреслюючи графік площі або висоти піку в залежності від концентрації білка. Молярне співвідношення МЕСЕ165:РШНО2РІКІОЗ.Рс АСст(а), визначене на основі площі піків компонентів, дорівнювало 1,16. Молярне співвідношення

МЕСЕ165:ЕНИО02РІКТО3.ЕсАС (а), визначене на основі висоти піків компонентів, дорівнювало 1,10.

Приклад 27. Визначення стехіометрії комплексу ЕК О2РІКТОЗ3.ЕслСт1(ау//ЕСЕ165 за допомогою конкурентної ЄМ хроматографії з світлорозсіюванням в оперативному режимі Ге)

Одержання комплексу

МЕСЕ165 змішували з тимчасово експресованим в клітинах СНО білком ЕНО2.РІКТО5.ЕсадСт(а) в молярному співвідношенні 3:11 (МЕСЕ165: ЕН О2РІКТОЗ.РсаАСт(а)) та проводили інкубацію протягом ночі за температури 426. (а) Конкурентна хроматографія (ЗЕС) з світлорозсіюванням в оперативному режимі ї-оі

З метою визначення молекулярної маси (ММУУ) комплексу рецептор-ліганд використовували колонку для чЕ конкурентної хроматографії з детектором світлорозсіювання в оперативному режимі Міпібамп (Уууай Тесппоіоду, зЗапіа Вагбрага, СаїЇйогпіа) та детектори показника заломлення (КІ) (Зпітаайд2и, Куою, дарап). Зразки вводили в - колонку Зурегозве 12 НК 10/30 (Ріагтасіа), врівноважену буфером на основі РВ5, та елюювали таким же «Ж буфером з швидкістю потоку О,бмл/хвилину за кімнатної температури. Як показано на фігурі 33, профіль

Зо елюювання мав два піки. Пік Мої відповідав комплексу рецептор-ліганд, та пік Мо2 відповідав незв'язаному -

МЕСЕ165. Молекулярну масу обраховували на основі сигналів І 5 та КІ. Аналогічну процедуру використовували з метою визначення молекулярної маси окремих компонентів комплексу рецептор-ліганд. Одержано наступні результати зазначених визначень: молекулярна маса комплексу ЕН О2РІКТОЗ.ЕРс АСТ(а)//ЕСЕ165 в положенні « піка дорівнювала 157300 (фігура 33), молекулярна маса МЕСЕ165 в положенні піку дорівнювала 44390 (фігура з 70 34) та молекулярна маса К1К2 в положенні піку дорівнювала 113300 (фігура 35). с Одержані дані свідчили про те, що стехіометрія співвідношення компонентів в комплексі :з» РНО2РІКТОЗ.ЕсАСт(ау/мЕСЕ дорівнює 1:11, оскільки це відповідає сумі молекулярних мас для

ЕН О2РІК1О3.РсАСст (а) та МЕСЕ165. Важливо зазначити, що вказаний спосіб дозволяє довести кінець кінцем, що

Комплекс ЕН О2РІКТОЗ.РсАСт(а)//ЕСЕ165 дійсно складається з однієї молекули ліганда МЕСЕ165 та однієї -І молекули ЕН О2РІК1ОЗ.ЕсдС са).

Приклад 28. Пептидне картування ЕН О2.РІКТОЗ.ЕсадСт1(а) те Дисульфідні структури та сайти глікозилювання в ЕИО2.РІКТОЗ.Рс АС1(а) визначають методом пептидного - картування. У відповідності до даного методу білок спочатку розщеплювали трипсином. Розщеплені трипсином їх 50 фрагменти аналізували та ідентифікували за допомогою ВЕРХ разом з масспектрометрією та секвенуванням

М-кінця. Відновлення трипсинового гідролізату допомагає ідентифікувати фрагменти, що мають дисульфідні 4) зв'язки. Обробка трипсинового гідролізату препаратом РМСавзе Е (с1ІукКо, Момай, СА) допомагає ідентифікувати фрагменти з М-зв'язаними сайтами глікозилювання. Підсумок результатів подано на фігурі 36.

ЕШНО2.РІК1О3.РсдсСт(а) містить загалом десять цистеїнів, шість з яких належать до області Ес.

Встановлено, що Сувз27 зв'язаний дисульфідним зв'язком з Суз7б. Сувгі21 зв'язаний дисульфідним зв'язком з о Сузів2. Перші два цистеїни в області Ес (Суз211 та Сувз214) утворюють міжмолекулярний дисульфідний зв'язок з такими ж двома цистеїнами в іншому ланцюгу Ес. Проте, оскільки зазначені два цистеїни неможливо відокремити їмо) один від одного ферментативним шляхом, не можна визначити, чи існує дисульфідний зв'язок між однаковими цистеїнами (наприклад, між Суз211 та Сувз211) або між Сувз211 та Суз214. Встановлено, що Сувз216 пов'язаний 60 дисульфідним зв'язком з Суз306. Встановлено, що Суз352 пов'язаний дисульфідним зв'язком з Суз410.

ЕНО2.РІК1О3.РсАс (а) містить п'ять можливих М-пов'язаних сайтів глікозилювання. Встановлено, що всі п'ять сайтів глікозильовані в різному ступені. Повне глікозилювання спостерігається на сайтах Авп33 (амінокислотна послідовність МІТ), Авпі93 (амінокислотна послідовність МТ) та Авп282 (амінокислотна послідовність МТ). Крім того, часткове глікозилювання знайдено на сайтах Азпб5 та Азпі20. Сайти бо глікозилювання підкреслено на фігурі 36.

Приклад 29. Фармакокінетичний аналіз модисрікованихрецепторів Рії

(а) Фармакокінетичний аналіз РІН(1-3)-Ес (А40), ЕН О2.РІК1О3. ЕсАсСТт (а) та МЕСЕК1К2-ЕсАс (а)

Мишам Ваїбр/с (25-30г) підшкірно вводили 4мг/кг РШН(1-3)-Рс (А40), тимчасово експресованого в клітинах

СНО білка ЕНО2.РІКТО5.ЕсдСт(а), постійно експресованого в клітинах СНО білка ЕНО2.РІК1ОЗ.РсаАС(а) та тимчасово експресованого в клітинах СНО білка МЕСЕКІТК2-ЕсдС1і(а) У мишей з хвоста брали кров через 1,2,4, 6,24 години, 2 дні, З дні та б днів після ін'єкції Сироватку аналізували за допомогою аналізу ЕГІЗА, призначеного для визначення РІШ(1-3)-с (А40), РШО2.РІКТОЗ. Ес АСт(а) або МЕСЕКІК2-ЕсаСт(а). При виконанні аналізу ЕГІЗА планшети для ЕЇІЗА вкривали МЕСЕ165, зв'язують з ним досліджуваний білок

ЕН(1-3)-Рс (А40), РИШО2.РІКТОЗ.ЕсаСт(а) або МЕСЕКІТК2-ЕсдСті(а) та зчитують результати за допомогою 170 антитіла проти Ес, зв'язаного з пероксидазою з хріну. Результати експериментів показано на фігурі 37. Тлах ДЛЯ

ЕМУ (1-3)-Ес (А40) відповідає б годинам, в той час, як Т пах для тимчасово та постійно експресованого білка

ЕШО2.РІКТОЗ.ЕсАсС (а) та тимчасово експресованого білела МЕСЕК1К2-ЕсАСТ (а) відповідає 24 годинам. Стах для РІН(1-3)-Ес (А40) дорівнювало 8мкг/мл. Для обох тимчасово експресованих білків (РН О2.РІКТОЗ.Ес АС (а) та МЕСЕКІ1К2-РсдСт(а)) Стах дорівнювало 18Змкг/мл та Стах для постійно експресованого білка 12 МЕСЕВ1В2-Еслдс1 (а) дорівнювало ЗОмкг/мл. (Б) Фармакокінетичний аналіз ЕІН(1-3)-Ес (А40). ЕМО02.РІКТОЗ.ЕсАсС (а) та ЕНМТО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАс та)

Мишам Ваїбр/с (25-30г) підшкірно вводили 4мг/кг РШН(1-3)-Рс (А40), тимчасово експресованого в клітинах сно білка РНО2.РІКТО5.РсдСті(а) та тимчасово /експресованого в клітинах СНО білка

ЕШНО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАсСт(а). У мишей з хвоста брали кров через 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 та 20 днів після ін'єкції. Сироватку аналізували за допомогою аналізу ЕГІБА, призначеного для визначення РШ|(1-3)-Ес,

РНО2.РІКТОЗ.гсАсСт(а) та ЕИО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАсСт(а). При виконанні аналізу ЕГІБА планшети для ЕГІЗА вкривали МЕСЕ165, зв'язували з ним білок РІН(1-3)-Ес, ЕМ1О02.РІКТО5.ЕсАСт(а) або ЕШО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАСс та) та результати визначали за допомогою антитіла проти Ес, зв'язаного з пероксидазою з хріну. РІШН(1-3)-Ес (А40) с ов не знайдено в сироватці через 5 днів, в той час, як РІНО2.РІКТОЗ.Рс АСТ(а) та РРО? МЕСЕКЗОЗ.ЕсАсС а) знайдено через 15 або більше днів. Результати даного експерименту показано на фігурі 38. і9)

Приклад 30. Оцінка здатності ЕН О2.РІК1О3.ЕсдСт(а) пригнічувати ріст пухлини іп мімо

З метою оцінки здатності ЕК О2.РІК1ОЗ.ЕсаАСт (а) пригнічувати ріст пухлини іп мімо використовують модель на тваринах, яку одержують шляхом імплантації суспензії пухлинних клітин підшкірно в правий біксамцям мишей «(о з тяжким комбінованим імунодефіцитом (ЗСІБ). При виконанні даного аналізу використовують дві лінії клітин, зокрема, лінію клітин фібросаркоми людини НТ-1080 (Мо доступа АТС СС -121) та лінію клітин гліоми щурів Сб ч (Мо доступа АТСС ССІ -107), які чітко розрізняються за морфологічною характеристикою та характеристиками - росту. Першу дозу РШЮО2. РІК1ОЗ3. РсАсС (а) (в дозі 25мг/кгабо, як показано на фігурах 39 та 40) вводять в « день імплантації пухлини. Далі тваринам роблять підшкірні ін'єкції РІН(1-3)-Ес (А40), РНО2.РІКТО5.ЕслС (а) або носія через день або два рази на тиждень протягом 2 тижнів. Через 2 тижні тваринам шляхом перфузії вводять в. фіксатор, пухлину видаляють та зразки аналізують сліпим методом. Об'єм пухлини визначають шляхом виміру довжини та ширини видимих підшкірних пухлин. Як ЕШ(1-3)-Ес (А40), так і ЕМО2.РІКТОЗ.ЕсдСт(а). значно знижують ріст пухлин, утворених клітинами НТ-1080 та Сб. Результати зазначених експериментів наведено на « фігурах 39 та 40.

Приклад 31. Вплив МЕСЕ165 та модифікованих рецепторів Ріїї на жіночу репродуктивну систему З с Стереотипні ділянки зміни судин, які мають місце в матці та яєчнику протягом репродуктивного циклу, добре "» досліджені, що робить зазначені тканини особливо придатними для вивчення механізмів, що регулюють " ангіогенез, зміни та руйнування судин. Дійсно, дослідження репродуктивних тканин методом гібридизації іп зйи вперше чітко продемонструвало, що УМЕСЕ діє як медіатор фізіологічного ангіогенезу у дорослих гризунів, також як і у людини та нелюдиноподібних приматів (Риййре еї аЇ., 1990; Ваміпагапає еї аї!.,, 1992; Зпмеїкі еї ш- аІ-., 1993; Катаї еї аІ. 1995). Оскільки циклічний ангіогенез та зміни судин є головними характеристиками ї5» нормального яєчника та матки, не дивно, що аномальний ріст та/"або дисфункцію кровоносних судин стали вважати ознаками багатьох патологічних станів, які впливають на дані органи. Крім того, вважають, що вказані - патогенні аномалії кровоносних судин викликані або зумовлені неправильною експресією одного або декількох їх 20 ангіогенних або антиангіогенних факторів, зокрема, МЕСБЕ.

Наприклад, аномальний розвиток кровоносних судин характерний для полікістозного захворювання яєчника, щи ендометриозу та внутрішньматочного рака, і в кожному випадку має місце надлишок експресованого в ураженій тканині МЕСЕ (Катаї еї аїЇ., 1995, Зпйтеп еї аї., 1996; Сціаії еї аіІ., 1996; Юоппе; еї аі., 1998). Вважають також, що надекспресія МЕСЕ бере участь у патогенезі розвитку підвищеної проникливості судин у випадку 22 синдрома гіперстимуляції яєчника (МеСіцге еї аЇ., 1994; Іеміп еї аЇ., 1998) та прееклампсії (ВаКег е! аї.,

ГФ) 1995; Зпагкеу еї аї., 1996). Крім того, МЕСЕ діє як фактора збільшення проникливості, що викликає асцит, характерний для раку яєчника та інших пухлин (Зепдег еї а!., 1983; Воососк еї аї!., 1995). Здається можливим, де що речовини, які ефективно нейтралізують біологічну дію МЕСЕ, повинні мати терапевтичну дію при лікуванні вищезазначених та споріднених захворювань. 6о Ангіогенез та зміни судин є також ознаками імплантації бластоцисти та розвитку плаценти (РіпаІау, 1986).

МЕС інтенсивно експресується в оболонці матки, що відпадає, та ембріональних трофобластах, де зазначений фактор спочатку стимулює поширення та підвищену проникливість судинної сітки матки в період запліднення та наступного утворення як материнських, так і ембріональних компонентів судинної сітки плаценти (ЗпугеїКі еї аі., 1993; СицПпап-Воме апа Кооз, 1993; Спакгаропу еї аї., 1995; ЮОаз еї аїЇ., 1997). МЕСЕ також викликає бо розвиток кровоносних судин жовтого тіла та зумовлену ним секрецію прогестерону, що необхідно для підготовки матки до запліднення (Регтага еї аіЇ., 1998). Таким чином, речовини, які пригнічують біологічну активність

МЕСРБЕ, можуть бути корисними як протизачаткові засоби (з метою попередження запліднення) або засобів, що викликають аборт на ранніх стадіях вагітності. Останнє застосування може бути особливо корисним як нехірургічний спосіб переривання ектопічних вагітностей.

Незважаючи на те, що експресія рецепторів МЕСЕ в основному обмежена ендотелієм судин в нормальних репродуктивних тканинах, Р також експресується трофобластами в плаценті людини та тварин (Сіагк еї аї., 1996; Не еї аї., 1999), де, як вважають, даний білок бере участь в інвазії трофобластів. Цікаво зазначити, що

РН та КОК (РІК!) експресуються лінією клітин хоріокарциноми Веумо (Спагпоск-допез еї а!., 1994), при цьому 7/0 встановлено, що МЕОРЕ стимулює синтез ДНК та фосфорилювання тирозином МАР-кінази в зазначених клітинах.

Крім того, первинні та метастатичні пухлини яєчника не тільки експресують більші кількості МЕСЕ, але - у додаток до судинного ендотелію - пухлинні клітини самі секретують КОК та/або РІЙ (ВоососкКк еї аї., 1995).

Одержані результати дозволяють припустити, що МЕС не тільки відіграє суттєву роль в утворенні та збереженні судинної сітки пухлини, але й, зокрема, в деяких пухлинах репродуктивних органів МЕСЕ відіграє допоміжну 7/5 роль, чим створює умови для виживання та проліферації пухлинних клітин. Таким чином, речовини, які блокують дію МЕСЕ, можна ефективно застосовувати для лікування пухлин репродуктивних органів.

Способи та результати (а) Оцінка МЕСР-індукованої підвищеної проникливості матки

Гонадотропін сироватки вагітної кобили (РМЗО) вводили підшкірно (5м.д.) самкам щурів з метою індукування овуляції В препубертатному періоді. Це стимулює викид естрадіолу через 2 дні, що в свою Чергу викликає індукцію МЕСЕ в матці. Як відомо, вказана індукція викликає підвищену проникливість матки та збільшення сирої маси матки через б годин, що потенціально можна блокувати модифікованими рецепторами Ріїї, такими як

ЕН(1-3)-Рс (А40), РШНО2.РІКТ1ОЗ.ЕсаСт(а) та ЕНО2.МЕСЕКЗОЗЕсАСт(а). В даній моделі іп мімо нормальна маса матки щура дорівнює приблизно 5О0мг, причому її можна збільшити до 300-350мг за допомогою РМ5О. с

Зневоднення тканини показує, що маса збільшується за рахунок води. Підшкірна ін'єкція. РІН(1-3)-Ес (А40),

РНО2.РІКТОЗ.гсАСт(а) та РИО2.МЕСЕКЗОЗ.ЕсАСт(а) в дозі 25мг/кг через 1 годину після ін'єкції РМБ5О о приблизно на 5095 пригнічує збільшення сирої маси матки. Збільшення дози модифікованого рецептора Рії не скорочує збільшення сирої маси, що дозволяє припустити, що зазначена модель має незалежний від МЕСЕ компонент. Результати даного експерименту показано на фігурі 41. Ге) (а) Оцінка ангіогенезу жовтого тіла з використанням прогестерону як тестуючого агенту

Гонадотропін сироватки вагітної кобили (РМЗО) вводили підшкірно (5м.д.) самкам щурів з метою індукування З овуляції в препубертатному періоді. Через 4 дні утворюється активне жовте тіло з щільною сіткою кровоносних -- судин, яке секретує прогестерон в кровообіг, що готує матку до запліднення. З метою індукування утворення кровоносних судин в жовтому тілі є необхідним МЕСЕ; тому блокування МЕСЕ має усунути утворення нових З з5 Кровоносних судин та, таким чином, зменшити кількість прогестерону, що секретується в кровоток. В даній рч- моделі іп мімо рівні прогестерону у стані спокою дорівнюють приблизно бнг/мл та можуть бути збільшені до 25-40нг/мл після введення РМБО. Підшкірна ін'єкція ЕШН(1-3)-с (А40) або ЕМУО2. РІКТО5 Рс Ас (а) в дозі 25мг/кг або 5мг/кг через 1 годину після введення РМ5О повністю пригнічує індукцію прогестерону на 4-ий день. «

Результати даного експерименту показано на фігурах 42А-428.

Приклад 33. Фармакокінетичний аналіз ЕШН(1-3)-Ес (А40) та обробленого поліетиленгліколем РШ(1-3)-Ес - с ЕН(1-3)-єс оброблюють поліетиленгліколем з довжиною ланцюга 1ОкДа або 20кДа та досліджують їх ц фармакокінетичний профіль, використовуючи мишей ВаїЇр/с. Встановлено, що обидві, оброблені "» поліетиленгліколем форми РІН(1-3)-Єс мають набагато кращі фармакокінетичні профілі, ніж РІШН(1-3)-Ес (А40), при цьому Ттлах для оброблених поліетиленгліколем молекул відповідає 24 годинам у порівнянні з 6 годинами

ЕН(1-3)-Ес (А40). -| Приклад 34. Аналіз МЕСЕ165 за допомогою ЕЕГ ІЗА з метою визначення спорідненості модифікованих їз варіантів рецепторів БШ 10п1М МЕСЕ165 інкубували протягом ночі за кімнатної температури з модифікованими варіантами рецепторів - РН в кількості від 1б0пМ до 0,1пМ. При виконанні даного експерименту використовували такі модифіковані їз 50 варіанти рецепторів ЕШ, як ЕІШН(1-3)-Ес, РІН(1-3)-Ес (А40), тимчасово екс-пресований ЕИО2РІК1О3. Ес АСІ(а), тимчасово експресований РІПО2МЕРСРКЗОЗ-РсдС (а), РІН(1-3АВ)-Ес,. РІН(1-Здос)-Ес та Тіе2-Ес. РН(1-348в)-Ес

І) є модифікованим варіантом РШН(1-3)-Ес, в якому високоосновну амінокислотну послідовність КМККАВБУККК замінено на МАЗБММОЗК, що дозволяє ввести два нових сайти глікозилювання та сумарно видалити п'ять позитивних зарядів з метою зменшення шкідливого впливу даної послідовності на фармакокінетичний профіль.

ММ(1-3в-с)-Ес є модифікацією, в якій один залишок аргиніна (КК) в тій же основній амінокислотній

Ге! послідовності замінено на цистеїн (С) (КМККАЗМККК -» КМКСАБМАКК), що робить можливою обробку поліетиленгліколем в даному залишку, завдяки чому основна область перестає впливати шкідливо на о фармакокінетичний профіль. Після інкубації розчин переносять на планшет, що містить імобілізоване антитіло для МЕСЕ165 (КУ). Далі визначають кількість вільного МЕСЕ165, використовуючи антитіло з метою визначення 60 вільного МЕСЕ165. Одержані результати показують, що модифікованим варіантом рецептора РІЙ з найбільшою спорідненістю до МЕСЕ165 (який визначається у вигляді найменшої кількості вільного МЕСЕ165) є

ЕШО2РІКІОЗ.РсдсСт (а), за яким йдуть ЕН(1-3)-Ес та ЕШН(1-3)-Ес (А40) і далі РІН(1-3 д-с)-Ес, РІН(1-3Ав)-Ес та

ЕНМО2МЕРОЕКЗОЗ-ЕсАсСТ (а). Тіе2Ес не має спорідненості до МЕСЕ 165. б5

Claims (23)

Формула винаходу

1. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує злитий поліпептид, що має здатність до зв'язування МЕСЕ поліпептиду, яка містить: (а) нуклеотидну послідовність, яка кодує компонент першого рецептора фактора росту ендотеліальних клітин судин (МЕСЕ), що переважно містить імуноглобуліновий (Ід) домен 2 першого МЕСЕ рецептора, оперативно зв'язану з (Б) нуклеотидною послідовністю, що кодує компонент другого МЕСЕ рецептора, що переважно містить імуноглобуліновий домен З другого МЕСЕ рецептора; та (с) нуклеотидною послідовністю, що кодує мультимеризуючий компонент, де першим МЕСЕ рецептором є РИ, а другим МЕСЕ рецептором є РІК! або РІ4 та компоненти МЕСЕ рецептора за (а) та (Б) є єдиними компонентами МЕСЕ рецептора злитого поліпептиду.

2. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність, що кодує Ід домен 2 зовнішньоклітинного домену першого МЕСЕ рецептора розташовується за нуклеотидною послідовністю, 75 що кодує Ід домен З зовнішньоклітинного домену другого МЕСЕ рецептора.

З. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність, що кодує Ід домен 2 зовнішньоклітинного домену першого МЕСЕ рецептора розташовується перед нуклеотидною послідовністю, що кодує Ід домен З зовнішньоклітинного домену другого МЕСЕ рецептора.

4. Молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що мультимеризуючий компонент містить імуноглобуліновий домен.

5. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 4, яка відрізняється тим, що імуноглобуліновий домен вибрано з групи, яка включає Ес домен дО та важкий ланцюг до.

6. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи: Ге! (а) нуклеотидна послідовність, зображена на Фіг. 21А-21С; (5) (Б) нуклеотидна послідовність, зображена на Фіг. 22А-22С; (с) нуклеотидна послідовність, зображена на Фіг. 24А-24С; (а) нуклеотидна послідовність, яка є результатом виродженості генетичного коду, яка відрізняється від нуклеотидних послідовностей (а), (Б) або (с). (Се)

7. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що компоненти злитого поліпептиду « розташовані в комбінації: 1,2,3; 1,3,2; 21,3; 2,3,1; 3,1,2 або 3,21, де 1 означає компонент першого МЕСЕ рецептора, 2 означає компонент другого МЕСЕ рецептора, та З є мультимеризуючим компонентом. -

8. Злитий поліпептид, який здатний зв'язуватися з поліпептидом МЕСЕ, що кодується молекулою нуклеїнової « кислоти за будь-яким з пп. 1-7.

9. Клонуючий вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-7. -

10. Вектор експресії, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що молекула нуклеїнової кислоти оперативно зв'язана з експресійною контрольною послідовністю.

11. Спосіб одержання векторної системи хазяїна для продукування злитого поліпептиду, який включає « введення вектору експресії за п. 10 до прийнятної клітини-хазяїна.

12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що прийнятною клітиною-хазяїном є бактеріальна клітина, - с клітина дріжджів, клітина комах або клітина ссавців. и

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що прийнятною клітиною-хазяїном є Е. соїї або СНО клітина. є»

14. Спосіб одержання злитого поліпептиду, який включає вирощення клітин векторної системи хазяїна, одержаної відповідно до способу за будь-яким з пп. 11-13, за умов, що дозволяють продукування злитого поліпептиду та відновлення злитого поліпептиду, одержаного таким чином. -і

15. Димерний антагоніст фактора росту ендотеліальних клітин судин (МЕСРЕ), що містить два злиті їх поліпептиди за п. 1.

16. Димерний антагоніст за п. 15, який відрізняється тим, що є модифікованим шляхом ацетилювання або - пегування. їх 50

17. Злитий поліпептид, здатний зв'язуватися з поліпептидом МЕСБЕ, який містить: (а) компонент МЕСЕ рецептора, що переважно містить імуноглобуліновий (Ід) домен 2 РН МЕСЕ рецептора 4) та Ід домен З РІЙ або РІ МЕС рецептора; та (Б) мультимеризуючий компонент, де компонент МЕСЕ рецептора за (а) є єдиним компонентом МЕСЕ рецептора злитого поліпептиду.

18. Злитий поліпептид за п. 17, який відрізняється тим, що мультимеризуючий компонент містить о імуноглобуліновий домен.

19. Злитий поліпептид за п. 18, який відрізняється тим, що імуноглобуліновий домен вибраний з групи, що їмо) включає Ес домен дО та важкий ланцюг до.

20. Злитий поліпептид за п. 19, який містить амінокислотну послідовність, зображену на Фіг. 21А-21С, Фіг. бо 22А-22С або Фіг. 24А-24С.

21. Спосіб гальмування активності фактора росту ендотеліальних клітин судин (МЕСЕ) у ссавця, який включає введення ссавцеві ефективної кількості злитого поліпептиду за будь-яким з пп. 17-20 або димерного антагоніста за п. 15 або 16.

22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що ссавець є людиною. 65

23. Спосіб за п. 21 або 22, який застосовується для уповільнення або запобігання росту пухлини, зменшення або запобігання набряку, зменшення або запобігання утворенню асцитів, зниження або гальмування плазматичного просякання у ссавців або блокування росту кровоносних судин у людини. с о (се) зо «І - «І ї- -

с . а -І с» шк їдою 4) (Ф) ко во б5