BRPI0011407B1

BRPI0011407B1 - molécula de ácido nucléico quimérica, polipeptídeo de fusão, vetor de expressão, sistema de vetor hospedeiro, e, métodos de produzir um polipeptídeo de fusão

Info

Publication number: BRPI0011407B1
Application number: BRPI0011407A
Authority: BR
Inventors: D Yancopoulos George; J Papadopoulos Nicholas; Davis Samuel
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2018-09-25
Also published as: CA2376379A1; YU86901A; ES2319305T3; CN1369009A; HU229156B1; DE60019415D1; NO332559B1; CN103349781A; PL208247B1; ZA200110068B; IL190234A0; FR13C0028I1; JP2011024595A; NO2013010I2; NO2013010I1; NZ515913A; LTC1183353I2; HUS1300052I1; NO20016036D0; ES2237429T3

Abstract

"molécula de ácido nucléico isolada, polipeptídeo de fusão, composição, vetor, sistema de vetor hospedeiro, método de produzir um polipeptídeo de fusão, e uso de um polipeptídeo de fusão". os polipeptídeos quiméricos modificados com farmacocinéticas melhoradas são divulgadas. especificamente, polipeptídeos do receptor de fltl quiméricos modificados que tenham sido modificados de tal modo que melhorem o seu perfil farmacocinético são divulgados. também são divulgados métodos de fabricar e usar os polipeptídeos modificados incluindo mas não limitado a usar os polipeptídeos modificados para diminuir ou inibir o vazamento de plasma e/ou a permeabilidade vascular em um mamífero.

Description

(54) Título: MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO QUIMÉRICA, POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO, SISTEMA DE VETOR HOSPEDEIRO, E, MÉTODOS DE PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO (51) Int.CI.: C12N 15/12; C12N 15/62; C12N 5/10; C07K 14/71; A61K 38/17; A61P 43/00 (30) Prioridade Unionista: 08/06/1999 US 60/138133 (73) Titular(es): REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

(72) Inventor(es): NICHOLAS J. PAPADOPOULOS; SAMUEL DAVIS; GEORGE D. YANCOPOULOS (85) Data do Início da Fase Nacional: 07/12/2001 “MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO QUIMÉRICA, POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO, SISTEMA DE VETOR HOSPEDEIRO, E, MÉTODO DE PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO”

O pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. N^e60/138.133, depositado em 8 de junho de 1999. Por todo este pedido várias publicações são dadas como referência. As divulgações destas publicações em suas totalidades são aqui incorporadas por referência neste pedido.

INTRODUÇÃO

O campo desta invenção são polipeptídeos modificados com farmacocinéticas melhoradas. Especificamente, o campo desta invenção diz respeito a polipeptídeos do receptor Fltl que tenham sido modificados de tal modo que melhorem o seu perfil farmacocinético. O campo desta invenção também diz respeito a métodos de fabricar e usar os polipeptídeos modificados incluindo mas não limitado a usar os polipeptídeos modificados para diminuir ou inibir o vazamento de plasma e/ou a permeabilidade vascular em um mamífero.

FUNDAMENTOS

A capacidade dos ligantes de polipeptídeo para ligarem-se a células e deste modo evocar uma resposta fenotípica tal como o desenvolvimento celular, sobrevivência, secreção de produto celular, ou diferenciação celular é freqüentemente mediada através dos receptores transmembrana nas células. O domínio extracelular de tais receptores (isto é, aquela porção do receptor que é demonstrada na superfície da célula) é, no geral, a parte mais distinta da molécula, visto que fornece a proteína com a sua ligação de ligante característica. A ligação de um ligante ao domínio extracelular, no geral, resulta na transdução de sinal que transmite um sinal biológico aos alvos intracelulares. Freqüentemente, esta transdução de sinal atua por intermédio de um domínio intracelular catalítico. A disposição particular de motivos de seqüência deste domínio intracelular catalítico determina o seu acesso aos substratos de quinase potenciais (Mohammadi, et α/.,1990, Mol. Cell. Biol. 11: 5068 a 5078; Fantl, et al., 1992, Cell 69: 413 a 413). Os exemplos de receptores que transduzem sinais por intermédio dos domínios intracelulares catalíticos incluem os receptores de tirosina quinases (RTKs) tal como a família Trk de receptores que são, no geral, limitados às células do sistema nervoso, a família citocina de receptores incluindo o complexo de receptor CNTF de tripartato (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454 a 1466) que também está, no geral, limitado às células do sistema nervoso, os receptores ligados à proteína G, tais como o receptor adrenérgico P2 encontrado, por exemplo, nas células do músculo cardíaco, e o receptor multimérico IgE de alta afinidade FceRI que está localizada, na maior parte, em mastóides e basófilos (Sutton & Gould, 1993, Nature 366: 421 a 428).

Todos os receptores até agora identificados parecem sofrer dimerização, multimerização, ou alguma mudança conformacional relacionada seguindo a ligação de ligante (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sei. 13: 443 a 447; Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61: 203 a 212; Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383 a 391) e as interações moleculares entre domínios intracelulares de dimerização levam à ativação da função catalítica. Em alguns exemplos, tais como o fator de crescimento relacionado a plaqueta (PDGF), o ligante é um dímero que liga duas moléculas receptoras (Hart, et al., 1988, Science, 240: 1529 a 1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905 a 8912) enquanto, por exemplo, no caso do fator crescimento epidérmico (EGF), o ligante é um monômero (Weber, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 14631 a 14636). No caso do receptor FceRI, o ligante, IgE, existe ligado ao FceRI de uma maneira monomérica e apenas toma-se ativado quando o antígeno se liga ao complexo IgE/ FceRI e reticula as moléculas de IgE adjacentes (Sutton & Gould, 1993, Nature 366: 421 a 428).

Freqüentemente, a distribuição de tecido de um receptor particular dentro de organismos superiores fornece discernimento da função biológica do receptor. Os RTKs por causa de fatores de crescimento e diferenciação, tais como o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), são amplamente expressados e portanto parecem desempenhar algum papel geral no crescimento e na manutenção de tecido. Os membros da família Trk RTK (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3: 262 a 268) de receptores são, no geral, mais limitados às células do sistema nervoso, e a família do Fator de Crescimento de Nervo que consiste do fator de crescimento de nervo (NGF), do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), da neurotrofina-3 (NT-3) e da neurotrofina-4/5 (NT-4/5), que ligam os receptores da família Trk RTK, promovem a diferenciação de diversos grupos de neurônios no cérebro e periferia (Lindsay, R. M, 1993, em Neurotrofic Factors, S. E. Loughlin & J. H. Fallon, eds., pp. 257 a 284, San Diego, CA, Academic Press). FccRI está localizado em um número muito limitado de tipos de células tais como mastóides e basófilos. Os mastóides derivam da linhagem de célula tronco hematopoiética pluripotente da medula óssea, mas completam a sua maturação no tecido seguindo a migração a partir da corrente sangüínea (Ver Janeway & Travers, 1996, em Immunobiology, 2^a Edição, M. Robertson & E. Lawrence, eds., pp. 1:3 a 1:4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher) e estão envolvidas na resposta alérgica.

Muitos estudos têm demonstrado que o domínio extracelular de um receptor fornece a ligação de ligante específica característica. Além disso, o ambiente celular em que um receptor é expressado pode influenciar a resposta biológica exibida na ligação de um ligante ao receptor. Por exemplo, quando uma célula neuronal que expressa um receptor Trk é exposta a uma neurotrofina que liga a aquele receptor, resulta a sobrevivência e diferenciação neuronais. Quando o mesmo receptor é expressado por um fibroblasto, a exposição à neurotrofina resulta na proliferação do fibroblasto (Glass, et al., 1991, Cell 66: 405 a 413).

Uma classe de mitógenos diméricos derivados de célula com seletividade para as células endoteliais vasculares foi identificada e designada de fator de crescimento celular endotelial vascular (VEGF). O VEGF foi purificado do meio de crescimento condicionado de células de glioma de rato [Conn et al., (1990), Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 87. pp 2628 a 2632]; e do meio de crescimento condicionado de células estreladas do folículo pituitário bovino [Ferrara e Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, pp. 851 a 858; Gozpadorowicz et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86, pp. 7311 a 7315] e do meio de crescimento condicionado de células U937 humanas [Connolly, D. T. et al. (1989), Science, 246, pp. 1309 a 1312]. O VEGF é um dímero com uma massa molecular aparente de cerca de 46 kDa com cada subunidade tendo uma massa molecular aparente de cerca de 23 kDa. O VEGF tem algumas similaridades estruturais com o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), que é um mitógeno para as células do tecido conectivo mas não mitogênica para as células endoteliais vasculares de vasos grandes.

O receptor de tirosina quinase ligado a membrana, conhecido como Flt, mostrou ser um receptor VEGF [DeVries, C. et al., (1992), Science, 255, pp. 989 a 991]. O receptor Flt especificamente liga o VEGF que induz a mitogênese. Uma outra forma do receptor de VEGF, designada KDR, também é conhecida ligar o VEGF e induz a mitogênese. A seqüência de cDNA parcial e quase a seqüência da proteína de comprimento completo do KDR são também conhecidas [Terman, Β. I. et al., (1991) Oncogene 6, pp. 1677 a 1683; Terman, Β. I. et al., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, pp. 1579 a 1586],

A angiogênese persistente pode causar ou exacerbar certas doenças tais como psoríase, artrite reumatóide, hemangiomas, angiofibromas, retinopatia diabética e glaucoma neovascular. Um inibidor da atividade VEGF pode ser útil como um tratamento para tais doenças e outras condições patológicas de angiogênese e de permeabilidade vascular, tais como a vascularização de tumor. A presente invenção diz respeito a um inibidor de VEGF que é baseado no receptor Fltl do VEGF.

O vazamento de plasma, um componente chave da inflamação, ocorre em um subconjunto distinto de microvasos. Em particular, na maioria dos órgãos o vazamento de plasma ocorre especificamente nas vênulas. Diferente das arteríolas e capilares, as vênulas tomam-se suscetíveis ao vazamento em resposta a numerosos mediadores inflamatórios incluindo a histamina, bradiquinina e serotonina. Uma característica da inflamação é o vazamento de plasma que resulta dos intervalos intracelulares que se formam no endotélio das vênulas. A maior parte dos modelos experimentais de inflamação indicam que estes intervalos intracelulares ocorrem entre as células endoteliais de vênulas pós capilares e de coleta (Baluk, P., et al., Am. J. Patol. 1998 152: 1463 a 1476). Foi mostrado que certas lecitinas podem ser usadas para revelar características de sítios focais de vazamento de plasma, intervalos endoteliais, e processos semelhantes a dedo nas bordas da célula endotelial em vênulas inflamadas (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62). Em particular, lecitinas vegetais foram usadas para visualizar mudanças morfológicas nas bordas da célula endotelial em vênulas inflamadas, por exemplo, da traquéia de rato. As lecitinas, tais como a conconavalina A e a ricina, que se ligam focalmente às vênulas inflamadas revelam regiões da parede de vaso subendotelial exposta por intervalos que correspondem aos locais de vazamento de plasma (Thurston, C., et al., Am J Physiol, 1996, 271: H2547-62).

As propriedades dos microvasos são dinâmicas. Doenças inflamatórias crônicas, por exemplo, estão associadas com a remodelagem microvascular, incluindo a angiogênese e a ampliação de microvaso. Os microvasos também podem ser remodelados pela aquisição de propriedades fenotípicas anormais. Em um modelo de murino de inflamação crônica das vias aéreas, os capilares das vias aéreas adquirem propriedades de vênulas, incluindo o diâmetro de vaso alargado, imunorreatividade aumentada pelo fator de von Willebrand, e imunorreatividade aumentada para a P-seletina. Além disso, estes vasos remodelados vazam em resposta a mediadores inflamatórios, ao passo que os vasos na mesma posição nas vias aéreas de camundongos normais não o fazem.

Certas substâncias mostraram diminuir ou inibir a permeabilidade vascular e/ou o vazamento de plasma. Por exemplo, as mistixinas são polipetídeos sintéticos que foram relatados inibir o vazamento de plasma sem bloquear a formação de intervalo endotelial (Baluk, P., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther, 1998, 284: 693 a 699). Também, o agonista do receptor beta 2-adrenérgico, o formoterol reduz o vazamento micro vascular pela inibição da formação do intervalo endotelial (Baluk, P. e McDonald, D. M., Am. J. Physiol., 1994, 266: L461-8).

As angiopoietinas e membros da família do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) são os únicos fatores de desenvolvimento considerados ser largamente específicos para as células endoteliais vasculares. Estudos de inativação de genes alvejados em camundongos mostraram que o VEGF é necessário para os estágios iniciais do desenvolvimento vascular e que Ang-1 é requerido para os estágios finais da remodelação vascular.

A Patente U.S. 6.011.003, concedida em 4 de janeiro de 2000, no nome de Metris Therapeutics Limited, divulga uma forma solúvel, alterada de polipeptídeo FLT que é capaz de ligação ao VEGF e deste modo exercer um efeito inibidor sobre este, o polipeptídeo compreende cinco ou domínios completos de imunoglobulina ou menos.

A Patente U.S. 5.712.380, concedida em 27 de janeiro de 1998 e designada a Merck & Co., divulga inibidores do fator de crescimento celular endotelial vascular (VEGF) que são formas solúveis de ocorrência natural ou recombinantemente engendradas com ou sem uma região de transmembrana de terminal C do receptor para VEGF.

Também designada à Merck & Co. é a Publicação PCT ISP WO 98/13071, publicada em 2 Abril de 1998, que divulga a metodologia da terapia de gene para inibição do desenvolvimento de tumor primário e de metástase pela transferência de gene de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína de receptor solúvel que se liga ao VEGF.

A Publicação PCT N² WO 97/44453, publicada em 27 de novembro de 1997, no nome de Genentech, Inc., divulga novas proteínas do receptor de VEGF quimérico que compreende seqüências de aminoácido derivadas dos receptores Fltl e KDR do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo o homólogo de murino para o receptor FLK1 do KDR humano, em que as ditas proteínas do receptor de VEGF quimérico ligam-se ao VEGF e antagonizam a sua atividade proliferativa e angiogênica de célula endotelial.

A Publicação PCT N² WO 97/13787, publicada em 17 de abril de 1997, no nome da Toa Gosei Co., LTD., divulga um inibidor de baixo peso molecular do VEGF utilizável no tratamento de doenças acompanhadas pela neovascularização tais como a de tumores sólidos. Um polipeptídeo contendo o primeiro domínio semelhante à imunoglobulina e o segundo domínio semelhante à imunoglobulina na região extracelular de um receptor FLT do VEGF mas não contendo o seu sexto domínio semelhante à imunoglobulina e o sétimo domínio semelhante à imunoglobulina apresenta uma atividade de inibidor de VEGF.

Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterli Jour. de Nucl. Med. 42: 242 a 249, divulga que porque os anticorpos monoclonais (MAbs) são básicos, as proteínas positivamente carregadas e as células mamíferas são negativamente carregadas, as interações eletrostáticas entre as duas podem criar níveis mais altos de ligação de fundo que resulta em relações baixas de tumor para órgão normal. Para superar este efeito, os investigadores tentaram melhorar a liberação de MAb pelo uso de vários métodos tais como agentes secundários bem como modificações químicas e de carga do próprio MAb.

Jensen-Pippo, et al., 1996, Pharmaceutical Research 13: 102 a 107, divulgam que a fixação de uma proteína terapêutica, o fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante (PEG-G-CSF), resulta em um aumento na estabilidade e na retenção da bioatividade in vivo quando administrada pela via intraduodenal.

Tsutsumi, et al., 1997, Thromb Haemost. 77: 168 a 173, divulgam experimentos em que a atividade trombopoiética in vivo de interleucina-6 modificada por polietileno glicol (MPEG-IL-6), em que 54 % dos 14 grupos amino de lisina de IL-6 foram ligados com PEG, foi comparada àquela de IL-6 nativa.

Yang, et al., 1995, Câncer 76: 687 a 694, divulgam que a conjugação de polietileno glicol à interleucina-2 humana recombinante (IL-2) resulta em um composto, a IL-2 modificada com polietileno glicol (PEG-IL2) que retém a atividade in vitro e in vivo de IL-2, mas exibe uma meia vida circulante acentuadamente prolongada.

R. Duncan e F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 a 306, 296 (1994) revisam esforços para melhorar a meia vida no plasma de asparaginase pela conjugação ao polietileno glicol.

A Publicação Internacional PCT N° WO 99/03996 publicada em 28 de janeiro de 1999 no nome de Regeneron Pharmaceuticals, Inc. e de The Regents of The University of Califórnia descreve polipetídeos noggin humanos modificados tendo supressões de regiões de aminoácidos básicos. Os polipetídeos noggin humanos modificados são descritos como retentores da atividade biológica embora tendo afinidade reduzida à heparina e farmacocinéticas superiores nos soros animais quando comparados ao noggin humano não modificado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está direcionada aos antagonistas de VEGF com propriedades farmacocinéticas melhoradas. Uma forma de realização preferida é uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica um polipeptídeo de fusão capaz de ligação a um polipeptídeo de VEGF que compreende (a) uma seqüência de nucleotídeo que codifica um componente do receptor de VEGF funcionalmente ligado a (b) uma seqüência de nucleotídeo que codifica um componente de multimerização, em que o componente do receptor de VEGF é o único componente do receptor de VEGF do polipeptídeo de fusão e em que a seqüência de nucleotídeo de (a) consiste essencialmente de uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido do domínio 2 de Ig do domínio extracelular de um primeiro receptor de VEGF e uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido do domínio 3 de Ig do domínio extracelular de um segundo receptor de VEGF.

Em uma outra forma de realização, o ácido nucléico isolado do primeiro receptor de VEGF é Fltl.

Em uma outra forma de realização, o ácido nucléico isolado do segundo receptor de VEGF é Flkl.

Já em uma outra forma de realização, o ácido nucléico isolado do segundo receptor de VEGF é Flt4.

Em uma outra forma de realização preferida, a seqüência de nucleotídeo que codifica o domínio 2 de Ig do domínio extracelular do primeiro receptor de VEGF está a montante da seqüência de nucleotídeo que codifica o domínio 3 de Ig do domínio extracelular do segundo receptor de VEGF.

Ainda em uma outra forma de realização preferida, a seqüência de nucleotídeo que codifica o domínio 2 de Ig do domínio extracelular do primeiro receptor de VEGF está a jusante da seqüência de nucleotídeo que codifica o domínio 3 de Ig do domínio extracelular do segundo receptor de VEGF.

Em uma forma de realização preferida da invenção, o componente de multimerização compreende um domínio de imunoglobulina.

Em uma outra forma de realização preferida, o domínio de imunoglobulina é selecionado do grupo que consiste do domínio Fc de IgG, da cadeia pesada de IgG, e da cadeia leve de IgG.

As formas de realização preferidas incluem uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fusão do receptor Fltl modificado, em que a região codificadora da molécula de ácido nucléico consiste de uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste de (a) a seqüência de nucleotídeo apresentada nas Figuras de 13 A a 13D (SEQIDNO: 3);

(b) a seqüência de nucleotídeo apresentada nas Figuras de 14A a 14C (SEQIDNO: 5);

(c) a seqüência de nucleotídeo apresentada nas Figuras de 15A a 15C (SEQIDNO: 7);

(d) a seqüência de nucleotídeo apresentada nas Figuras de 16A a 16D (SEQIDNO: 9);

(e) a seqüência de nucleotídeo apresentada nas Figuras de 21A a21C (SEQIDNO: 11);

(f) a seqüência de nucleotídeo apresentada nas Figuras de 22A a22C (SEQIDNO: 13);

(g) a seqüência de nucleotídeo apresentada nas Figuras de 24A a24C (SEQIDNO: 15); e (h) uma seqüência de nucleotídeo que, como um resultado da degeneração do código genético, difere da seqüência de nucleotídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), ou (g) e que codifica uma molécula de polipeptídeo de fusão tendo a atividade biológica do polipeptídeo de fusão do receptor Fltl modificado.

Em uma outra forma de realização da invenção, um polipeptídeo de fusão é codificado pelas moléculas isoladas de ácido nucléico descritos acima.

Uma forma de realização preferida é uma composição capaz de ligar uma molécula de VEGF para formar um complexo não funcional que compreende um multímero do polipeptídeo de fusão.

Também preferida é uma composição em que o multímero é um dímero.

Já em uma outra forma de realização, a composição está em um veículo.

Uma outra forma de realização é um vetor que compreende as moléculas de ácido nucléico descritas acima, incluindo um vetor de expressão que compreende uma das moléculas de ácido nucléico descrita em que a molécula de ácido nucléico está funcionalmente ligada a uma seqüência de controle de expressão.

Outras formas de realização incluídas são um sistema de vetor hospedeiro para a produção de um polipeptídeo de fusão que compreendo vetor de expressão, em uma célula hospedeira adequada; o sistema de vetor hospedeiro em que a célula hospedeira adequada é uma célula bacteriana, célula de levedura, célula de inseto ou célula de mamífero; o sistema de vetor hospedeiro em que a célula hospedeira adequada é o E. Coli', o sistema de vetor hospedeiro em que a célula hospedeira adequada é uma célula COS; o sistema de vetor hospedeiro em que a célula hospedeira adequada é uma célula CHO.

Uma outra forma de realização da invenção é um método de produzir um polipeptídeo de fusão que compreende cultivar células do sistema de vetor hospedeiro sob condições que permitam a produção do polipeptídeo de fusão e a recuperação do polipeptídeo de fusão assim produzido.

As formas de realização incluem um polipeptídeo de fusão codificado pela seqüência de ácido nucléico apresentada nas Figuras de 10A a 10D (SEQ ID NO: 1) ou nas Figuras de 24A a 24C (SEQ DD NO: 15), que foi modificada pela acetilação ou fixação em que a acetilação é realizada com um excesso molar de pelo menos 100 vezes do reagente de acetilação ou em que a acetilação é realizada com um excesso molar do reagente de acetilação variando de pelo menos cerca de um excesso molar de 10 vezes a cerca de um excesso molar de 100 vezes ou em que a fixação é 10K ou 20K PEG.

Uma forma de realização preferida inclui um método de diminuir ou inibir o vazamento de plasma em um mamífero que compreende administrar ao mamífero o polipeptídeo de fusão descrito acima, incluindo formas de realização em que o mamífero é um ser humano, o polipeptídeo de fusão é acetilado ou o polipeptídeo de fusão é polietileno glicolizado.

Uma outra forma de apresentação é um polipeptídeo de fusão que .se liga especificamente ao ligante do receptor de VEGF.

Uma forma de realização preferida da invenção é um método de bloquear o desenvolvimento de vaso sangüíneo em um ser humano que compreende administrar uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fusão descrito acima.

Também preferido é um método de inibir a atividade de ligante do receptor de VEGF em um mamífero que compreende administrar ao mamífero uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fusão descrito acima.

As formas de realização preferidas destes métodos são aquelas em que o mamífero é um ser humano.

Outras formas de realização dos métodos da invenção incluem a atenuação ou prevenção do desenvolvimento de tumor em um ser humano; a atenuação ou prevenção de edema em um ser humano, especialmente em que o edema é edema cerebral; a atenuação ou prevenção de formação de ascite em um ser humano, especialmente em que a ascite é a ascite associada ao câncer do ovário.

As formas de realização preferidas da invenção incluem um polipeptídeo de fusão capaz de ligação a um polipeptídeo de VEGF que compreende (a) um componente do receptor de VEGF funcionalmente ligado a (b) um componente de multimerização, em que o componente do receptor de VEGF é o único componente do receptor de VEGF no polipeptídeo de fusão e consiste essencialmente da seqüência de aminoácido do domínio 2 de Ig do domínio extracelular de um primeiro receptor de VEGF e a seqüência de aminoácido do domínio 3 de Ig do domínio extracelular de um segundo receptor de VEGF.

Em uma outra forma de realização do polipeptídeo de fusão, o primeiro receptor de VEGF é Fltl.

Já em uma outra forma de realização do polipeptídeo de fusão, o segundo receptor de VEGF é Flkl.

Ainda uma outra forma de realização do polipeptídeo de fusão é uma em que o segundo receptor de VEGF é Flt4.

As formas de realização preferidas incluem um polipeptídeo de fusão em que a seqüência de aminoácido do domínio 2 de Ig do domínio extracelular do primeiro receptor de VEGF está a montante da seqüência de aminoácido do domínio 3 de Ig do domínio extracelular do segundo receptor de VEGF e um polipeptídeo de fusão em que a seqüência de aminoácido do domínio 2 de Ig do domínio extracelular do primeiro receptor de VEGF está a jusante da seqüência de aminoácido do domínio 3 de Ig do domínio extracelular do segundo receptor de VEGF.

Já em uma outra forma de realização, o componente de multimerização do polipeptídeo de fusão compreende um domínio de imunoglobulina incluindo uma forma de realização em que o domínio de imunoglobulina é selecionado do grupo que consiste do domínio Fc de IgG, da cadeia pesada de IgG, e da cadeia leve de IgG.

As formas de realização preferidas incluem um polipeptídeo de fusão que compreende uma seqüência de aminoácido de um receptor Fltl modificado, em que a seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de (a) a seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras de 13 A a 13D (SEQ ID NO: 4); (b) a seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras de 14A a 14C (SEQ ID NO: 6); (c) a seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras de 15A a 15C (SEQ ID NO: 8); (d) a seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras de 16A a 16D (SEQ ID NO: 10); (e) a seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras de 21A a 21C (SEQ ID NO: 12); (f) a seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras de 22A a 22C (SEQ ID NO:

14); e (g) a seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras de 24A a 24C (SEQIDNO: 16).

Uma outra forma de realização preferida é um método de diminuir ou inibir o vazamento de plasma em um mamífero que compreende administrar ao mamífero o polipeptídeo de fusão descrito acima.

Uma forma de realização alternativa preferida é um método de inibir a atividade de ligante do receptor de VEGF em um mamífero que compreende administrar ao mamífero uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fusão descrito acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Análise em gel de IEF de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas e acetiladas. A proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada é incapaz de penetrar o gel devido ao seu pi > 9,3, ao passo que o Fltl(l-3)-Fc acetilado é capaz de penetrar o gel e equilibrar no pi 5,2.

Figura 2. Ligação de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas e Fltl(13)-Fc acetiladas a placas revestidas com Matrigel®. A proteína Fltl(13) -Fc não modificada liga-se extensivamente aos componentes da matriz extracelular no Matrigel®, ao passo que o Fltl(l-3)-Fc acetilado não se liga.

Figura 3. Ligação de Fltl(l-3)-Fc não modificada, Fltl(l-3)Fc acetilada, e Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada em um ensaio com base em Biacore. As Fltl(l-3)-Fc acetiladas (colunas 13 a 16), polietileno glicolizadas (colunas 17 a 20), e tratadas com heparina (colunas 21 a 24) são cada uma capazes de competir completamente com a Fltl(l-3)-Fc ligada à lasca de Biacore para a ligação de VEGF quando comparado ao controle (colunas 1 a

4) e à proteína irrelevante (colunas 5 a 8). A Fltl(l-3)-Fc não modificada (colunas 5 a 6) parece competir apenas parcialmente com a Fltl(l-3)-Fc ligada à lasca de Biacore para a ligação de VEGF. Entretanto, lavar as amostras ligadas com NaCl 0,5 M (colunas 7 e 8) resulta em um perfil de ligação similar ao das formas modificadas de Fltl(l-3)Fc, indicando que a proteína não modificada está exibindo ligação não específica à lasca que pode ser eliminada pela lavagem salina.

Figura 4. Ligação de Fltl(l-3)-Fc não modificada, Fltl(l-3)Fc acetilada, e Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada ao VEGF em um ensaio com base em ELISA. Tanto a proteína Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada quanto a acetilada ligam-se ao VEGF com afinidades que se aproximam daquelas da Fltl(l-3)-Fc não modificada.

Figura 5. Perfis farmacocinéticos de Fltl(l-3)-Fc não modificada, da Fltl(l-3)-Fc acetilada, e da Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada. camundongos Balb/c (2328 g) foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de Fltl(l-3)-Fc não modificada, acetilada ou polietileno glicolizada. Os camundongos foram sangrados na cauda em 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias e 3 dias depois da injeção de proteína e os soros foram ensaiados em um ensaio com base em ELISA padrão planejado para detectar a proteína Fltl(l-3)-Fc. A T_max para todas as proteínas Fltl(l-3)-Fcs foi entre os pontos de tempo de 6 horas e 24 horas. A C_max para as proteínas diferentes foi como segue: Não modificadas: 0,06 qg/ml a 0,15 qg/ml; acetilado: 1,5 qg/ml a 4,0 qg/ml; e polietileno glicolizado: aproximadamente 5 qg/ml.

Figuras 6A e 6B. Análises em gel de IEF de proteínas Fltl(l3)-Fc não modificadas e acetiladas por etapa. A proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada é incapaz de penetrar o gel devido ao seu pi > 9,3, ao passo que a maior parte das amostras de Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa (amostras em excesso de 30 a 100 vezes) foram capazes de migrar no gel e de se equilibrarem em pis variando entre 4,55 e 8,43, dependendo do grau de acetilação.

Figura 7. Ligação de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas e Fltl(l-3)-Fc acetiladas por etapa às placas revestidas com Matrigel . Como com a proteína de controle irrelevante, rTie2-Fc, a Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa (amostras em excesso de 20 a 30 vezes) não exibe qualquer ligação à placa revestida com Matrigel, ao passo que a proteína Fltl(l-3)-Fc não acetilada exibe ligação significante. A amostra de excesso de 10 vezes apresenta ligação reduzida, mas o grau de acetilação não é suficiente para bloquear completamente a ligação aos componentes da matriz extracelular.

Figura 8. Ligação de Fltl(l-3)-Fc não modificada e Fltl(l-3)Fc acetilada por etapa em um ensaio com base em Biacore. Em uma relação subestequiométrica (0,5 pg/ml de Fltl(l-3) não modificada ou Fltl(13)-Fc acetilada por etapa vs. 0,2 pg/ml de VEGF), não há Fltl(l-3)-Fc suficiente (seja não modificada ou acetilada por etapa) na solução para ligar completamente o VEGF. A 1,0 pg/ml, que aproxima-se a uma relação estequiométrica de 1:1, tanto a Fltl(l-3)-Fc não modificada quanto a acetilada por etapa são mais capazes de competir para a ligação do VEGF, mas ainda existe proteína Fltl(l-3)-Fc insuficiente (seja não modificada ou acetilada por etapa) para saturar completamente o VEGF disponível. Entretanto, a 5,0 pg/ml, que é várias vezes maior do que uma relação estequiométrica de 1:1, tanto a proteína Fltl(l-3)-Fc quanto a proteína Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa são capazes de saturar o VEGF, com respeito ao grau de acetilação.

Figura 9. Perfis farmacocinéticos de Fltl(l-3)-Fc não modificada e Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa. Camundongos Balb/c (23 a 28 g) foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de não modificadas ou amostras com excesso de 10, 20, 40, 60 e 100 vezes de Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa (3 camundongos para as amostras não modificadas, com excesso de 10, 20 e 40 vezes e 2 camundongos para excesso de 60 e 100 vezes). Os camundongos foram sangrados na cauda em 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias e 3 dias depois da injeção. Os soros foram ensaiados em um ensaio com base em ELISA planejado para detectar Fltl(l-3)-Fc. A T_max para todas as proteínas Fltl(l-3)-Fcs testadas foi no ponto de tempo de 6 horas mas a C_max foi como segue: Fltl(l-3)-Fc não modificada: 0,06 μg/ml; amostra em excesso de 10 vezes: - 0,7 μg/ml, amostra em excesso de 20 vezes - 2 μg/ml, amostra em excesso de 40 vezes - 4 μg/ml, amostra em excesso de 60 vezes - 2 μg/ml, amostra em excesso de 100 vezes - 1 μg/ml.

Figura de 10A a 10D. Seqüência de ácido nucléico e de aminoácido deduzida de Fltl(l-3)-Fc (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2, respectivamente).

Figura 11. Diagrama esquemático da estrutura de Fltl.

Figuras 12A e 12B. Análise de hidrofilicidade da seqüências de aminoácido do domínio 2 de Ig e do domínio 3 de Ig de Fltl.

Figuras de 13A a 13D. Seqüência de ácido nucléico e de aminoácido deduzida de Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:4, respectivamente).

Figuras de 14A a 14C. Seqüência de ácido nucléico e de aminoácido deduzida de Mutl: Fltl (2-3 _AB)-Fc (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO:6, respectivamente).

Figura de 15A a 15C. Seqüência de ácido nucléico e de aminoácido deduzida de Mut3: Fltl(2-3)-Fc (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8, respectivamente).

Figura de 16A a 16D. Seqüência de ácido nucléico e de aminoácido deduzida de Mut4: Fltl(l-3_R.>_N)-Fc (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente).

Figura 17. Ligação de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificada, Fltl(l-3)-Fc mutante de supressão de região básica, e mutante Fltl(l-3)_R.>N em um ensaio com base em Biacore. Na sub-relação estequiométrica (0,25 pg/ml de Fltl(l-3)-Fc de amostras não modificadas, acetiladas ou geneticamente modificadas vs. 01. pg/ml de VEGF), não há proteína Fltl(l3)-Fc suficiente para bloquear a ligação de VEGF ao Fltl(l-3)-Fc imobilizado na lasca de Biacore. Em 0,5 pg/ml de proteínas Fltl(l-3)-Fcs não modificadas, acetiladas ou geneticamente modificadas, a relação estequiométrica aproxima-se de 1:1 e existe uma capacidade aumentada para bloquear a ligação de VEGF à lasca de Biacore. Em 1,0 ug/ml de proteínas Fltl(l-3)-Fcs não modificadas, acetiladas ou geneticamente modificadas, que é uma relação estequiométrica de aproximadamente 10:1, as proteínas Fltl(l3)-Fcs são capazes de bloquear a ligação de VEGF à lasca de Biacore, mas não são equivalentes. As Fltl(l-3oB)-Fc não modificadas, acetiladas e Mutl: são essencialmente iguais na sua capacidade para bloquear a ligação de VEGF, ao passo que a Fltl(l-3_R.>_N)-Fc Mut4: é um tanto menos eficiente em bloquear ligação.

Figura 18. Ligação de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas, Fltl(l-3_AB)-Fc Mutl:, Fltl(2-3_AB)-Fc Mut2: e mutante Fltl(2-3) às placas revestidas com Matrigel®. A proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada liga-se avidamente a estes reservatórios, a proteína Mut3: Fltl(2-3)-Fc liga-se um tanto mais fracamente, a proteína Fltl(l-3_AB)-Fc Mutl: liga-se mais fracamente ainda, e a proteína Fltl(2-3eB)-Fc Mut2: mostra o melhor perfil, a ligação mais fraca do que qualquer uma das outras proteínas mutantes. A proteína mutante de glicosilação Fltl(l-3_R.>_N)-Fc Mut4: apresenta apenas benefício marginal no ensaio de Matrigel.

Figura 19. Ligação de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas, Fltl(l-3_AB)-Fc Mutl:, Fltl(2-3AB)-Fc Mut2:, e mutante Fltl(2-3) em um ensaio com base em ELISA. Nas concentrações testadas, as proteínas Fltl (13)-Fc não modificada, Fltl(l-3_AB)-Fc Mutl:, Fltl(2-3AB)-Fc Mut2:, e mutante Fltl(2-3) ligam-se similarmente ao VEGF.

Figura 20. Perfis farmacocinéticos de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas, Mutl: Fltl(l-3_ÁB)-Fc, Fltl(2-3_AB)-Fc Mut2: e mutante Fltl(2-3). A C_max para estes reagentes foi como segue: Fltl(l-3)-Fc não modificada - 0,15 pg/ml; Fltl(l-3)-Fc acetilado com excesso molar de 40 vezes - 1,5 pg/ml; e Fltl(l-3_AB)-Fc Mutl:- 0,71 μg/ml.

Figuras 21A a 21C. Seqüência de nucleotídeo e de aminoácido deduzida do receptor Fltl modificado denominada FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente).

Figuras 22A a 22C. Seqüência de ácido nucléico e de aminoácido deduzida do receptor Fltl modificado denominada FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) (SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, respectivamente).

Figura 23. Ensaio de matriz extracelular (ECM). Os resultados deste ensaio demonstram que as proteínas FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) são consideravelmente menos grudentas ao ECM quando comparadas àproteína Fltl(l-3)-Fc.

Figuras de 24A a 24C. Seqüência de ácido nucléico e de aminoácido deduzida do receptor Fltl modificado denominado VEGFR1R2FcACl(a) (SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:16, respectivamente).

Figuras 25A a 25C. Ensaio de fosforilação. Em um excesso molar de 1,5 de Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40) ou FltlD2FlklD3.FcACl(a) transitória existe bloqueio completo do estímulo de receptor por estes três receptores Fltl modificados quando comparado à inoculação do meio de controle. Ao contrário, a FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) transitória não apresenta bloqueio significante neste excesso molar, quando comparado com a inoculação de controle positivo em VEGF. Resultados similares são observados na Figura 25B, onde os receptores Flt modificados estão em um excesso molar de 3 vezes em relação ao ligante VEGF 165. Na Figura 25C, onde os receptores Fltl modificados estão em um excesso molar de 6 vezes em relação ao ligante VEGF165, a FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) transitória pode ser agora mostrada bloquear parcialmente o estímulo induzido pelo VEGF 165 de receptores de superfície celular.

Figuras 26A e 26B. Ensaio de fosforilação. Detecção pela Western blot de VEGFR2(Flkl) fosforilada com tirosina pelo estímulo do ligante VEGF 165 mostra que os receptores de superfície celular não são fosforilados pelas amostras inoculadas que têm VEGF 165 pré incubadas com excesso molar de 1 e 2 vezes (Figura 26A) ou excesso molar de 3 e 4 vezes (Figura 26B) de FltlD2FlklD3.FcACl(a) transitória, FltlD2FlklD3.FcACl(a) estável ou VEGFRlR2-FcACl(a) transitória. Em todas as concentrações receptor de Fltl modificado testados houve ligação completa do ligante VEGF 165 durante a pré incubação, resultando em nenhum estímulo detectável de receptores de superfície celular pelo VEGF 165 não ligado quando comparado à inoculação do meio de controle.

Figura 27. Ensaio de proliferação de célula MG/R2. Os seguintes receptores Flt modificados Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a), mais um receptor irrelevante denominado Tie2-Fc como um controle negativo, foram titulados de 40nM a 20pM e incubados nas células durante 1 hora a 37° C. O VEGF 165 recombinante humano em meio definido foi depois adicionado a todos os reservatórios a uma concentração de 1,56 nM. O receptor Tie2-Fc de controle negativo não bloqueia a proliferação de célula induzida pelo VEGF 165 em nenhuma concentração ao passo que a FltlD2.FlklD3.FcACl(a) bloqueia o VEGF165 a 1,56 nM com uma meia dose máxima de 0,8 nM. A Fltl(l-3)Fc e a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) são menos eficazes em bloquear o VEGF 165 neste ensaio com uma meia dose máxima de - 2 nM. O VEGF 165 sozinho dá uma leitura de 1,2 unidades de absorbância e o fundo é 0,38 unidades de absorbância.

Figura 28. Análise de Biacore de Estequiometria de Ligação. A estequiometria de ligação foi calculada como uma relação molar de VEGF165 ligado à FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a) imobilizadas, usando-se o fator de conversão de 1000 RU equivalente a 1 ng/ml. Os resultados indicam a estequiometria de ligação de uma molécula dimérica de VEGF165 por uma molécula de FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou de VEGFRlR2-FcACl(a).

Figura 29 e Figura 30. Estequiometria Cromatográfica de Exclusão de Tamanho. FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a) em uma concentração de 1 nM (estimado ser 1000 vezes maior do que o KD da FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou interação VEGFRlR2-FcACl(a)/VEGF165) foram misturados com concentrações variadas de VEGF 165. Depois da incubação, as concentrações da FltlD2FlklD3.FcACl(a) em solução foram medidas. Os dados mostram que a adição de VEGF 165 1 nM na solução de FltlD2FlklD3.FcACl(a) bloqueia completamente a ligação de FltlD2FlklD3.FcACl(a) à superfície de VEGF165. Este resultado sugere que a estequiometria de ligação de uma molécula de VEGF 165 por molécula de FltlD2FlklD3.FcACl(a).

Figura 31. Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) sob condições nativas. O Pico #1 representa o complexo

FltlD2FlklD3.FcACl(a)/ VEGF165 e o Pico #2 representa VEGF165 não ligado. As frações eluídas entre 1,1 e 1,2 ml foram combinadas e cloridreto de guanidínio (GuHCl) foi adicionado a uma concentração final de 4,5 M para dissociar o complexo.

Figura 32. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) sob condições dissociativas. Para separar os componentes do complexo receptorligante e para determinar a sua relação molar, 50 μΐ do complexo dissociado foram carregados em uma Superose 12 PC 3.2/30 equilibrada em GuHCl 6 M e eluída. O Pico #1 representa FltlD2FlklD3.FcACl(a) e o pico #2 representa aVEGF165.

Figura 33, Figura 34 e Figura 35. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com Dispersão de Luz Em linha. A coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com um detetor de dispersão de luz MiniDawn em linha (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califórnia) e detetores de índice de retração (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japão) foi usado para determinar o peso molecular (o peso molecular) do complexo receptorligante. Como apresentado na Figura 33, o perfil de elução apresenta dois picos. O Pico #1 representa o complexo de receptor-ligante e o pico #2 representa o VEGF 165 não ligado. O peso molecular foi calculado a partir dos sinais LS e RI. O mesmo procedimento foi usado para determinar o peso molecular dos componentes individuais do complexo de receptor-ligante. O resultado destas determinações são como segue: o peso molecular do complexo FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 na posição de pico é 157 300 (Figura 33), o peso molecular de VEGF 165 na posição de pico é 44 390 (Figura 34) e o peso molecular de R1R2 no pico é 113 300 (Figura 35).

Figura 36. Análise de mapeamento e glicosilação de peptídeo. As estruturas de dissulfeto e os sítios de glicosilação na FltlD2.FlklD3.FcACl(a) foram determinados por um método de mapeamento de peptídeo. Existe um total de dez cisteínas na FltlD2.FlklD3.FcACl(a); seis das dez pertencem à região Fc. Cys27 é ligada pelo dissulfeto à Cys76. A Cysl21 - é ligada pelo dissulfeto à Cysl82. As duas primeiras cisteínas na região Fc (Cys211 e Cys214) formam uma ligação de dissulfeto intermolecular com as mesmas duas cisteínas em uma outra cadeia Fc. Entretanto, não pode ser determinado se a ligação de dissulfeto está ocorrendo entre as mesmas cisteínas (Cys211 a Cys211, por exemplo) ou entre Cys211 e Cys214. A Cys216 é ligada pelo dissulfeto à Cys306. A Cys352 é ligada pelo dissulfeto à Cys410.

Existem cinco sítios de glicosilação ligados em N possíveis na FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e descobriu-se que são glicosilados em graus variáveis. A glicosilação completa é observada em Asn33, Asnl93 e Asn282. A glicosilação parcial é observada em Asn65 e Asnl20. Os sítios de glicosilação são realçados por sublinhado na Figura.

Figura 37. Farmacocinéticas de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e VEGFRlR2-FcACl(a). camundongos Balb/c foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklDIFcACl(a) transitoriamente expressada em CHO, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) estavelmente expressada em CHO e VEGFR1R2FcACl(a) transitoriamente expressada em CHO. Os camundongos foram sangrados na cauda em 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias, 3 dias e 6 dias depois da injeção. Os soros foram ensaiados em um ELISA planejado para detectar Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2FcACl(a). A Tmax para Fltl(l-3)-Fc (A40) foi em 6 horas enquanto a T_max para a FltlD2.FlklD3.FcACl(a) transitória e estável e a VEGFRlR2-FcACl(a) transitória foi de 24 horas. A C_max para a Fltl (1 -3)-Fc (A40) foi 8 pg/ml, para ambas as transitórias (FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e VEGFRlR2-FcACl(a)) a C_max foi 18 pg/ml e a C_max para a VEGFRlR2-FcACl(a) estável foi de 30 pg/ml.

Figura 38. Farmacocinéticas de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). camundongos Balb/c foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de Fltl(l-3)-Fc (A40),

FltlD2.FlklD3.FcACl(a) transitoriamente expressadas em CHO e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) transitoriamente expressadas em CHO. Os camundongos foram sangrados na cauda em 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 e 20 dias depois da injeção. Os soros foram ensaiados em um ELISA planejado para detectar Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e

FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Fltl(l-3)-Fc (A40) não pode ser mais detectado no soro após o dia 5 ao passo que a FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) foram detectáveis durante 15 dias ou mais.

Figura 39. A Capacidade da FltlD2.FlklD3.FcACl(a) para Inibir o Desenvolvimento de Tumor de Fibrossarcoma HT-1080 In Vivo. O tratamento dia sim, dia não ou 2 vezes por semana de camundongos SCID com FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a 25 mg/Kg diminuiu significantemente o desenvolvimento de tumores subcutâneos de fibrossarcoma HT-1080.

Figura 40. A Capacidade de FltlD2.FlklD3.FcACl(a) para Inibir o Desenvolvimento de Tumor de Glioma C6 In Vivo. O tratamento dia sim, dia não ou 2 vezes por semana de camundongos SCID com FltlD2.FlklD3.FcACl(a) significantemente diminui o desenvolvimento de tumores subcutâneos de glioma C6 em doses tão baixas quanto 2,5 mg/Kg.

Figura 41. Hiperpermeabilidade Uterina Induzida pelo VEGF. PMSG subcutaneamente injetados (5 IU) para induzir a ovulação em ratos fêmeas na pré puberdade resulta em um aumento súbito de estradiol depois de 2 dias que por sua vez causa uma indução de VEGF no útero. Esta indução resulta na hiperpermeabilidade do útero e um aumento na umidade uterina. A injeção subcutânea de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) a 25 mg/kg em 1 hora depois da injeção de PMSG resulta em uma inibição de aproximadamente 50 % no aumento do peso úmido uterino.

Figuras 42A e 42B. Estimativa da Angiogênese do Corpo Lúteo Usando-se a Progesterona como uma Leitora. PMSG foi subcutaneamente injetado (5 IU) para induzir a ovulação ratos fêmeas na pré puberdade, resultando em um corpo lúteo totalmente em funcionamento contendo uma rede densa de vasos sangüíneos que secreta progesterona na corrente sangüínea para preparar o útero para a implantação. A indução da angiogênese no corpo lúteo requer o VEGF. Os níveis normais de progesterona são de cerca de 5 ng/ml e podem ser induzidos de 25 a 40 ng/ml depois da PMSG. A injeção subcutânea de Fltl(l-3)-Fc (A40) ou de FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a 25 mg/kg ou 5 mg/kg em 1 hora depois da injeção de PMSG resultou em uma completa inibição da indução da progesterona no dia 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Tem sido um problema de longa data na técnica produzir um antagonista de VEGF com base em receptor que tivesse um perfil farmacocinético que fosse apropriado em consideração ao antagonista como um candidato terapêutico. Os requerentes descrevem aqui, pela primeira vez, uma molécula de polipeptídeo quimérica, capaz de antagonizar a atividade do VEGF, que exibe propriedades farmacocinéticas melhoradas quando comparada a outros antagonistas de VEGF com base em receptor conhecidos. As moléculas de polipeptídeo quiméricas aqui descritas fornecem assim pela primeira vez moléculas apropriadas para o uso em terapias em que o antagonismo ao VEGF é um resultado desejado.

A presente invenção fornece as novas moléculas de polipeptídeo quiméricas formadas pela fusão de um domínio de ligação de ligante extracelular modificado do Receptor Fltl à região Fc da IgG.

O domínio de ligação de ligante extracelular é definido como a porção de um receptor que, na sua conformação nativa na membrana celular, é orientada extracelularmente onde esta pode contatar com o seu ligante cognato. O domínio de ligação de ligante extracelular não inclui os aminoácidos hidrofóbicos associados com o domínio transmembrana do receptor ou qualquer um dos aminoácidos associados com o domínio intracelular do receptor. No geral, o domínio intracelular ou citoplásmico de um receptor é usualmente composto de aminoácidos positivamente carregados ou polares (isto é, lisina, arginina, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico). Os 15 a 30 aminoácidos precedentes, predominantemente hidrofóbicos ou apoiares (isto é, leucina, valina, isoleucina e fenilalanina) compreendem o domínio transmembrana. O domínio extracelular compreende os aminoácidos que precedem o trecho transmembrana hidrofóbico de aminoácidos. Usualmente o domínio transmembrana é flanqueado pelos aminoácidos positivamente carregados ou polares tais como lisina ou arginina. von Heijne publicou regras detalhadas que são comumente referidas pelos técnicos habilitados quando da determinação de quais dos aminoácidos de um dado receptor pertencem aos domínios extracelulares, de transmembrana ou intracelulares (Ver von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25 a 30).

Altemativamente, websites na Internet, tais como http://ulrec3.unil.ch/software/TMPRED-fonn.html. tomaram-se disponíveis para suprir os químicos de proteína com informação a cerca de prognósticos de fabricação a respeito dos domínios de proteína.

A presente invenção fornece a construção de moléculas de ácido nucléico que codificam moléculas de polipeptídeo quiméricas que são inseridas em um vetor que é capaz de expressar as moléculas de polipeptídeo quiméricas quando introduzido em uma célula hospedeira apropriada. As células hospedeiras apropriadas incluem, mas não são limitados a células bacterianas, células de leveduras, células de insetos e células mamíferas. Qualquer um dos métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica para a inserção de fragmentos de DNA em um vetor pode ser usado para construir vetores de expressão que codificam as moléculas de polipeptídeo quiméricas sob o controle de sinais de controle transcricional/translacional. Estes métodos podem incluir DNA recombinante in vitro e técnicas sintéticas e recombinações in vivo (recombinação genética) (Ver Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols em Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ.

Assoe., Wiley-Interscience, NY).

A expressão de moléculas de ácido nucléico que codificam as moléculas de polipeptídeo quiméricas podem ser reguladas por uma segunda seqüência de ácido nucléico de modo que a molécula de polipeptídeo quimérica seja expressada em um hospedeiro transformado com a molécula de DNA recombinante. Por exemplo, a expressão das moléculas de polipeptídeo quiméricas aqui descritas pode ser controlada por qualquer elemento promotor/realçador conhecido na técnica. Os promotores que podem ser usados para controlar a expressão das moléculas de polipeptídeo quiméricas incluem, mas não são limitados à repetição de terminal longo como descrito em Squinto et al., (1991, Cell 65: 1 a 20); à região promotora que está no início do SV40 (Bemoist e Chambon, 1981, Nature 290: 304 a 310), o promotor do CMV, a repetição do terminal 5’ de M-MuLV, o promotor contido na repetição do terminal longo 3’ do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787 a 797), o promotor da timidina quinase do herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 144 a 1445), as seqüências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39 a 42); vetores de expressão procarióticos tais como o promotor da O-lactamase (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75: 3727 a 3731), ou o promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80: 21 a 25, ver também “Useful proteins from recombinant bactéria” na Scientific American, 1980, 242: 74 a 94); elementos promotores da levedura ou outros fungos tais como o promotor Gal 4, o promotor ADH (álcool desidrogenase), promotor PGK (fosfoglicerol quinase), promotor da alcalino fosfatase, e as seguintes regiões de controle transcricional animal, que exibem especificidade de tecido e foram utilizadas em animais transgênicos: a região de controle do gene da elastase I que é ativo nas células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639 a 646; Omitz et al.,

1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399 a 409; MacDonald,

1987, Hepatology 7: 425 a 515); região de controle do gene da insulina que é ativa nas células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115 a 122), região de controle do gene da imunoglobulina que é ativa em células linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647 a 658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533 a 538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436 a 1444), região de controle do vírus do tumor mamário de que é ativa em células testiculares, da mama, linfóides e mastóides (Leder et al., 1986, Cell 45: 485 a 495), região de controle do gene da albumina que é ativa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1: 268 a 276), região de controle do gene alfa-fetoproteína que é ativa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639 a 1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53 a 58); região de controle do gene da 1antitripsina alfa que é ativa no fígado (Kelsey et al, 1987, Genes and Devei. 1: 161 a 171), região de controle do gene da beta-globina que é ativa em células mielóides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338 a 340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89 a 94); região de controle do gene da proteína de mielina básica que é ativa em células de oligodendrócito no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703 a 712); região de controle do gene da cadeia leve 2 de miosina que é ativa no músculo do esqueleto (Shani, 1985, Nature 314: 283 a 286), e a região de controle do gene do hormônio de liberação gonadotrópico que é ativa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372 a 1378).

Assim, de acordo com a invenção, os vetores de expressão capazes de serem replicados em um hospedeiro bacteriano ou eucariótico que compreendo ácido nucléico que codifica a molécula de polipeptídeo quimérica como aqui descrito, são usados para transfectar o hospedeiro e por meio deste a expressão direta de tais ácidos nucléicos para produzir as moléculas de polipeptídeo quiméricas, que podem ser depois recuperadas em uma forma biologicamente ativa. Como aqui usado, uma forma biologicamente ativa inclui uma forma capaz de ligação ao VEGF.

Os vetores de expressão contendo as moléculas quiméricas de ácido nucléico aqui descritos podem ser identificados por três métodos gerais: (a) hibridização DNA-DNA, (b) presença ou ausência de funções de gene “marcador”, e (c) expressão de seqüências inseridas. No primeiro método, a presença de um gene estranho inserido em um vetor de expressão pode ser detectada pela hibridização de DNA-DNA usando-se sondas que compreendam seqüências que são homólogas às seqüências molécula de polipeptídeo quimérica inseridas. No segundo método, o sistema recombinante de vetor/hospedeiro pode ser identificado e selecionado com base na presença ou ausência de certas funções de gene “marcador” (por exemplo, atividade de timidina quinase, resistência a antibióticos, fenótipo de transformação, formação de corpo de oclusão em baculovírus, etc.) causadas pela inserção de gene estranhos no vetor. Por exemplo, se a seqüência de DNA da molécula de polipeptídeo quimérica é inserida dentro da seqüência de gene marcador do vetor, recombinantes contendo o inserto podem ser identificados pela ausência da função de gene marcador. No terceiro método, os vetores de expressão recombinantes podem ser identificados ensaiando-se o produto do gene estranho expressado pelo recombinante. Tais ensaios pode ser baseados, por exemplo, nas propriedades físicas ou funcionais das moléculas de polipeptídeo quiméricas.

As células da presente invenção podem expressar transitoriamente ou, preferivelmente, constitutiva e permanentemente as moléculas de polipeptídeo quiméricas.

As moléculas de polipeptídeo quiméricas podem ser purificadas por qualquer técnica que permita a formação subsequente de uma molécula de polipeptídeo quimérica estável, biologicamente ativa. Por exemplo, e não por via de limitação, os fatores podem ser recuperados das células como proteínas solúveis ou como corpos de inclusão, das quais podem ser extraídos quantitativamente pelo cloridreto de guanidínio 8 M e diálise (ver, por exemplo, Builder, et al., Patente US N² 5.663.304). De modo a purificar mais os fatores, a cromatografia de troca de íon convencional, a cromatografia de interação de hidrofóbicos, a cromatografia de fase reversa ou filtração em gel podem ser usados.

Em uma forma de realização da invenção, a seqüência de nucleotídeo que codifica o primeiro componente está a montante da seqüência de nucleotídeo que codifica o segundo componente. Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a seqüência de nucleotídeo que codifica o primeiro componente está a jusante da seqüência de nucleotídeo que codifica o segundo componente. Outras formas de realização da invenção podem ser preparadas em que a ordem do primeiro, segundo e terceiro componentes de polipeptídeo de fusão são rearranjados. Por exemplo, se a seqüência de nucleotídeo que codifica o primeiro componente é designada 1, a seqüência de nucleotídeo que codifica o segundo componente é designada 2 e a seqüência de nucleotídeo do terceiro componente é designada 3, então a ordem dos componentes no ácido nucléico isolado da invenção como lido a partir de 5’ para 3’ pode ser qualquer uma das seis combinações seguintes: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; ou 3,2,1.

A presente invenção também tem utilidades de diagnóstico e terapêutica. Em particular, as formas de realização da invenção, os métodos de detectar aberrações na função ou expressão das moléculas de polipeptídeo quiméricas aqui descritas podem ser usados no diagnóstico de distúrbios. Em outras formas de realização, a manipulação das moléculas de polipeptídeo quiméricas ou de agonistas ou antagonistas que ligam as moléculas de polipeptídeo quiméricas podem ser usados no tratamento de doenças. Em outras formas de realização, a molécula de polipeptídeo quimérica é utilizada como um agente para bloquear a ligação de um agente de ligação ao seu alvo.

Por via de exemplo, mas não de limitação, o método da invenção pode ser útil no tratamento de condições clínicas que são caracterizadas pela permeabilidade vascular, edema ou inflamação tal como edema cerebral associado com dano, acidente vascular cerebral ou tumor; edema associado com distúrbios inflamatórios tal como psoríase ou artrite, incluindo a artrite reumatóide; asma; edema generalizado associado com queimaduras; ascites e efusão pleural associadas com tumores, inflamação ou trauma; inflamação crônica das vias aéreas; síndrome do vazamento capilar; sépse; doença renal associadas com o vazamento aumentado de proteína; e distúrbios oculares tais como degeneração macular relacionada com a idade e retinopatia diabética.

Uma análise da seqüência de aminoácido de Fltl(l-3)-Fc revelou a presença de um número inusitadamente alto (46) do resíduo aminoácido básico de lisina. Uma análise IEF de Fltl(l-3)-Fc mostrou que esta proteína tem pi maior do que 9,3, confirmando o prognóstico de que a proteína é muito básica. Levantou-se a hipótese de que a natureza básica da proteína Fltl(l-3)-Fc fosse a causa da sua ligação aos componentes da matriz extracelular e que esta interação podería ser a causa da meia vida extremamente curta detectável no soro circulante exibido pela Fltl(l-3)-Fc quando injetada em camundongos. A fim de testar esta hipótese, a proteína Fltl(l-3)-Fc foi acetilada nos resíduos de lisina para reduzir a carga básica. A Flt 1 (1 =3)-Fc acetilada foi depois testada nos ensaios descritos abaixo.

Os seguintes exemplos são oferecidos por via de ilustração e não por via de limitação.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Expressão da proteína Fltl(l-3)-Fc em células CHO Kl.

Usando-se técnicas padrão da biologia molecular (ver por exemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoe., Wiley-Interscience, NY), o gene que codifica a Fltl(13)-Fc foi inserido no vetor de expressão pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) em um sítio de clonagem múltipla a jusante do promotor CMV. As células CHO Kl foram transfectadas com a construção de DNA de pEE14.1/Fltl(l-3)-Fc usando-se lipofectamina (Gaithersburg, MD). As células CHO Kl transfectadas foram cultivadas em DMEM isento de glutamina (JRH, Kansas City, MO) contendo 25 μΜ de metionina sulfoximina (MSX) da Sigma Inc., St. Louis, MO, e os expressores da proteína altamente recombinantes foram obtidos pela avaliação dos sobrenadantes de célula CHO Kl de mais de 100 colônias isoladas coletadas a mão usando-se um imunoensaio padrão que captura e detecta Fc humano. O clone coletado a mão selecionado foi amplificado na presença de 100 μΜ de MSX seguido por uma segunda rodada de avaliação dos clones amplificados. O clone de produção mais alta teve uma produtividade específica da proteína recombinante Fltl(l-3)-Fc de 55 pg/célula/dia.

O clone selecionado foi expandido em frascos T de 225 cm (Corning, Acton, MA) e depois em garrafas de rolagem de 8,5 litros (Corning, Acton, MA) usando-se o meio de cultura de célula descrito acima. As células foram removidas das garrafas de rolagem pela tripsinização padrão e colocadas em 3,5 litros de meio de suspensão. O meio de suspensão é compreendido de meio ISCHO isento de glutamina (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 5 % soro fetal bovino (FBS da Hyclone Labs, Logan, UT), 100 μΜ de suplemento MSX e GS (JRH Scientific, Kansas City, MO) em um biorreator Celligen de 5 litros (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) a uma densidade de 0,3 χ 10⁶ células/ml. Depois que as células atingiram uma densidade de 3,6 x 10⁶/ml e foram adaptadas para suspensão foram transferidas para um biorreator de 60 litros (ABEL, Allentown, PA) a uma densidade de 0,5 χ 10⁶ células/ml em 20 litros de meio ISCHO com 5 % de soro fetal bovino. Depois de dois dias um adicional de 20 litros de ISCHO + 5 % de soro fetal bovino foi adicionado ao biorreator. As células foram deixadas crescer por mais dois dias atingindo uma densidade final de 3,1 χ 10⁶ células/ml e uma concentração final de Fltl(l-3)-Fc na colheita foi de 95 mg/litro. Na colheita as células foram removidas por filtração de fluxo tangencial usando-se Filtros Prostak de 0,45 μιη (Millipore, Inc., Bedford, MA).

Exemplo 2: Purificação de proteína Fltl(l-3)-Fc obtida das células CHO

Kl

A proteína Fltl(l-3)-Fc foi inicialmente purificada pela cromatografia de afinidade. Uma coluna de Proteína A foi usada para ligar, com alta especificidade, a porção Fc da molécula. Esta proteína purificada por afinidade foi depois concentrada e passada em uma coluna SEC. A proteína foi depois eluída no tampão de formulação. O seguinte descreve estes procedimentos em detalhes.

Materiais e Métodos

Todos os produtos químicos foram obtidos da J.T. Baker, Phillipsburg, NJ com a excepção do PBS; que foi obtido como um concentrado 10X da Life Technologies, Gaitersburg, MD. As resinas Protein A Fast Flow e Superdex 200 grau de preparação foram obtidas da Pharmacia, Piscataway, NJ. O equipamento e as membranas para a concentração da proteína foram obtidos da Millipore, Bedford, MA.

Aproximadamente 40 litros de meio condicionado de CHO filtrado em 0,45 pm contendo a proteína Fltl(l-3)-Fc foi aplicado a uma coluna de Protein A Fast Flow de 290 ml (10 cm de diâmetro) que foi equilibrada com PBS. A coluna foi lavada com PBS contendo 350 mM de NaCl e 0,02 % de CHAPS e a proteína ligada foi eluída com 20 mM de Ácido Cítrico contendo 10 mM de Na₂HPO₄. O único pico na eluição foi coletado e o seu pH foi elevado até a neutralidade com NaOH 1 M. As frações eluídas foram concentradas até aproximadamente 9 mg/ml usando membranas de celulose 10K regeneradas tanto por filtração de fluxo tangencial quanto por concentração de célula agitada. Para remover agregados e outros contaminantes, a proteína concentrada foi aplicada a uma coluna empacotada com resina Superdex 200 grau de preparação (10 cm x 55 cm) e conduzida em PBS contendo 5 % de glicerol. As frações de pico principal foram reunidas, filtradas estéreis, aliquotadas e armazenadas a -80° C.

Exemplo 3: Acetilação da proteína Fltl(l-3)-Fc.

Duas miligramas da proteína Fltl(l-3)-Fc foram acetiladas como descrito no manual de instrução fornecido com o conjunto de modificação sulfo-NHS-acetato (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat.

#26777).

Exemplo 4: Caracterização da proteína Fltl(l-3)-Fc acetilada.

(a.) Análise IEF: A Fltl(l-3)-Fc e a Fltl(l-3)-Fc acetilada foram analisadas pela análise IEF padrão. Como mostrado na Figura 1, a proteína Fltl(l-3)-Fc não é capaz de migrar no gel e portanto deve ter um pi maior do que 9,3, o pi mais alto no padrão. Entretanto, a Fltl(l-3)-Fc acetilada é capaz de migrar no gel e equilibrar em um pi de aproximadamente 5,2. Este resultado demonstra que a acetilação reduz a carga líquida positiva da proteína e portanto consideravelmente o seu pi.

(b.) Ligação aos componentes da matriz extracelular

Para testar quanto a ligação aos componentes da matriz extracelular, a Fltl(l-3)-Fc e a Fltl(l-3)-Fc acetilada foram testadas em um ensaio planejado para imitar a interação com os componentes da matriz extracelular. Neste ensaio, placas de cultura de tecido de 96 reservatórios são revestidas com Matrigel (placa de 96 reservatórios de matriz de camada fina de Biorrevestimento MATRIGEL®, Catálogo #40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). As placas são incubadas com concentrações variáveis de proteína Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc acetilada ou rTie2-Fc (um controle irrelevante) são adicionadas aos reservatórios. As placas são incubadas durante 1 a 2 horas na temperatura ambiente ou a 37° C graus e depois a detecção das proteínas ligadas é realizada pela adição de um anticorpo secundário de Fc anti-humano conjugado com fosfatase alcalina aos reservatórios. Finalmente, substrato de fosfatase alcalina é adicionado aos reservatórios e a densidade ótica é medida. A Figura 2 mostra o resultado deste ensaio. Como a proteína de controle irrelevante rTie2-Fc, a Fltl(l-3)-Fc acetilada não exibe qualquer ligação à placa revestida com Matrigel, ao passo que a proteína Fltl(l-3)-Fc não acetilada exibe ligação significante. Este resultado indica que a acetilação de resíduos de aminoácido básico é um modo eficaz para interferir com as interações de carga que existem entre as proteínas positivamente carregadas e os componentes negativamente carregados da matriz extracelular sendo estes evidenciados in vivo.

Exemplo 5: Polietileno glicolização da proteína Fltl(l-3)-Fc.

Embora a polietileno glicolização (polietileno glicol - PEG) de proteínas foi mostrada aumentar a sua potência in vivo pelo realce da estabilidade e da biodisponibilidade enquanto minimiza a imunogenicidade (ver as referências acima citadas), é contra-intuitivo que as moléculas polietileno glicoladas que são muito grandes para serem filtradas pelos glomérulos renais possam melhorar as suas propriedades farmacocinéticas. Sem estar ligado pela teoria, os Requerentes postularam que a polietileno glicolação das moléculas Fltl(l-3)-Fc pudessem melhorar as propriedades farmacocinéticas, possivelmente não pela alteração da carga positiva ou pela diminuição do pi da Fltl(l-3)-Fc, mas ao invés pela proteção física das cargas positivas da interação com a matriz extracelular. Os Requerentes decidiram tentar melhorar as propriedades farmacocinéticas das moléculas Fltl(l-3)-Fc pela incorporação de filamentos de PEGs de 20K como descrito abaixo. Materiais e Métodos

Fltl(l-3)-Fc purificada derivada de células CHO (ver acima) foi usada nos experimentos de polietileno glicolação seguintes. PEGs funcionalizados foram obtidos da Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicine da Sigma, St. Louis, MO; coluna Superose 6 da Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS como um concentrado 10X da Life Technologies, Gaitersburg, MD; Glicerol da J. T. Baker, Phillipsburg, NJ; e géis pré moldados Bis-Tris da Novex, CA.

Filamentos de PEG 20K funcionalizados com porções de terminal específicos de amina foram usados em estudos de reação de pequena escala que foram ajustados para avaliar diferentes condições de reação em que a estequiometria de PEG;proteína foi variada. Com base nestas reações e nas análises de amostras em SDS-PAGE padrão, a Fltl(l-3)-Fc em uma concentração de 1,5 mg/ml foi reagida no pH 8,1 com moléculas de SPA-PEG 20K (propionato de succinimidila de PEG) em uma relação molar de monômero de PEG para Fltl(l-3)-Fc de 1:6. A reação foi deixada processar a 8° C durante a noite. Para a purificação inicial, os produtos de reação foram aplicados a uma coluna Superose 6 de 10 mm x 30 cm equilibrada com PBS contendo 5 % de Glicerol. A coluna mostrou separar as moléculas Fltl (1 -3)Fc polietileno glicolizadas com base no grau de polietileno glicolização. As frações correspondentes que pareceram ser Fltl(l-3)-Fc dimérica primariamente mono-polietileno glicolizada e di-polietileno glicolizada, como julgado pelos padrões de faixa nos géis de SDS-PAGE redutores e não redutores foram reunidas. A concentração de proteína foi determinada medindo-se a absorbância a 280 nm. A proteína Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada foi filtrada estéril, aliquotada e armazenada a -40° C.

Exemplo 6: Ligação de Fltl(l-3)-Fc não modificada, acetilada e polietileno glicolizada em um ensaio com base em Biacore.

As proteínas Fltl(l-3)-Fcs não modificadas, acetiladas e polietileno glicolizadas foram testadas em um ensaio com base em Biacore para avaliar a sua capacidade para ligar ao ligante de Fltl, VEGF. Neste ensaio, a proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada foi imobilizada na superfície de uma lasca de Biacore (ver Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, quanto aos procedimentos padrão) e uma amostra contendo 0,2 pg/ml de VEGF e Fltl(l-3)-Fc não modificada, Fltl(l-3)-Fc acetilada ou Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada (cada uma a 25 pg/ml) foi passada sobre as lascas revestidas com Fltl(l-3)-Fc. Para minimizar os efeitos de ligação não específica, as amostras ligadas foram lavadas com uma lavagem de 0,5 M NaCl. Em uma amostra, a Fltl(l-3)-Fc não modificada foi misturada com heparina. A heparina é uma molécula negativamente carregada e a proteína Fltl(1-3)-Fc é uma molécula positivamente carregada, de modo que quando as duas moléculas são misturadas juntas, devem interagir através das suas respectivas cargas. Isto essencialmente neutraliza a carga inerentemente positiva da Fltl(l-3)-Fc fazendo com que a molécula se comporte como se fosse quimicamente ou geneticamente modificada de modo a reduzir a sua carga e a sua tendência para ligar por intermédio das interações de carga. Como mostrado na Figura 3, a Fltl(l-3)-Fc acetilada (colunas 13 a 16), polietileno glicolizada (colunas 17 a 20), e tratada com heparina (colunas 21a 24) são cada uma capazes de competir completamente com a Fltl(l-3)-Fc ligada a lasca de Biacore quanto a ligação VEGF quando comparado ao controle (colunas 1 a 4) e à proteína irrelevante (colunas 5 a 8). A Fltl (1 -3)Fc não modificada (colunas 5 a 6) pareceu competir apenas parcialmente com a Fltl(l-3)-Fc ligada à lasca Biacore quanto a ligação de VEGF. Entretanto, a lavagem das amostras ligadas com NaCl 0,5 M (colunas 7 a 8) resultou em um perfil de ligação similar ao das formas modificadas de Fltl(l-3)-Fc, indicando que a proteína não modificada exibiu ligação não específica para a lasca que pode ser eliminada pela lavagem salina.

Exemplo 7; Ligação de Fltl(l-3)-Fc não modificada, acetilada e polietileno glicolada em um ensaio com base em ELISA

Proteínas Fltl(l-3)-Fcs não modificadas, acetiladas e polietileno glicolizadas foram testadas em um ensaio com base em ELISA padrão para avaliar a sua capacidade para ligar ao receptor ligante de Fltl do VEGF. Como mostrado na Figura 4, tanto as proteínas quanto a Fltl(1-3)-Fc acetilada são capazes de ligação ao VEGF, demonstrando que modificar a proteína pela polietileno glicolização ou acetilação não destrói a sua capacidade para ligar o seu ligante.

Exemplo 8: Análises farmacocinéticas de Fltl(l-3)-Fc não modificada,

Fltl(l-3)-Fc acetilada e Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada.

Experimentos in vivo foram planejados para avaliar os perfis farmacocinéticos das proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas, das Fltl(l-3)-Fc acetiladas e das Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizadas. Camundongos Balb/c (23 a 28 g; 3 camundongos/grupo) foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de Fltl(1-3)-Fc não modificada, acetilada ou polietileno glicolizada. Os camundongos foram sangrados na cauda em 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias e 3 dias depois da injeção de proteína. Os soros foram ensaiados em um ensaio com base em ELISA padrão planejado para detectar proteína Fltl(l-3)Fc. Em resumo, o ensaio envolve revestir uma placa de ELISA com VEGF, a ligação dos soros contendo Fltl(l-3)-Fc não modificada, acetilada ou polietileno glicolizada, e reportando com um anticorpo anti-Fc ligado à fosfatase alcalina. Como mostrado na Figura 5, a T_max para todas as proteína Fltl(l-3)-Fcs foi entre os pontos de tempo de 6 horas e 24 horas. A C_max para as proteínas diferentes foi como segue: Não modificada: 0,06 μ/ml a 0,15 pg/ml; acetilada: 1,5 pg/ml a 4,0 pg/ml; e polietileno glicolizada: aproximadamente 5 pg/ml. Exemplo 9: Acetilação de Fltl(l-3)-Fc por etapas

Para determinar que a quantidade mínima de acetilação é necessária para eliminar a ligação aos componentes da matriz extracelular, um experimento foi planejado que acetilou a proteína Fltl(l-3)-Fc em um maneira por etapas usando-se quantidades crescentes em excesso molar de reagente de acetilação na mistura de reação de acetilação. A faixa de excesso molar foi como segue: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90; e 100 moles de reagente de acetilação por 1 mol de monômero de Fltl(l-3)-Fc. As reações foram realizadas como detalhado no manual de instrução fornecido com o conjunto de modificação de sulfo-NHS-Acetato (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat.# 26777).

Exemplo 10: Caracterização da Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapas.

(a.) Análise IEF. Proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificada e Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa foram analisadas pela análise IEF padrão. Como mostrado nas Figuras 6A e 6B, a proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada não foi capaz de migrar no gel devido ao seu pi extremamente alto (maior do que 9,3). Entretanto, a maior parte das amostras da Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa (amostras de 30 a 100 vezes de excesso molar) foram capazes de migrar no gel e equilibrar em pis variando entre 4,55 e 8,43, dependendo do grau de acetilação da proteína. Este resultado demonstra que a acetilação pode mudar a carga positiva da proteína de uma maneira dependente da dose e que a redução do pi pode ser controlada controlando-se o grau de acetilação.

(b.) Ligação de Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa aos componentes da matriz extracelular

Para testar quanto a ligação aos componentes da matriz extracelular, a Fltl(l-3)-Fc e a Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa foram testadas no ensaio descrito acima planejado para imitar a interação com os componentes da matriz extracelular. Concentrações variáveis de proteína Fltl(1 -3)-Fc não modificada, Fltl(1 -3)-Fc acetilada por etapa (amostras de 10, 20 e 30 vezes de excesso molar), ou rTie2-Fc (um controle irrelevante) foram adicionadas aos reservatórios. As placas foram incubadas durante 1 a 2 horas na temperatura ambiente ou a 37° C e depois a detecção de proteínas ligadas foi realizada pela adição de um anticorpo secundário de Fc anti-humano conjugado com fosfatase alcalina aos reservatórios. O substrato de fosfatase alcalina foi subsequentemente adicionado aos reservatórios e a densidade ótica medida. A Figura 7 mostra o resultado deste ensaio. Como a proteína de controle irrelevante rTie2-Fc, a Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa (amostras de 20 e 30 vezes de excesso molar) não exibiram qualquer ligação significante às placas revestidas com Matrigel, ao passo que a proteína Fltl(l-3)-Fc não acetilada exibiu ligação significante. A ligação é saturável, indicando que a proteína Fltl(l-3)-Fc pode ser ligada a sítios específicos, ao invés de uma interação mediada por carga mais geral que podería não ser saturável. A amostra de excesso molar de 10 vezes mostrou ligação reduzida, mas o grau de acetilação não foi suficiente para bloquear completamente a ligação aos componentes da matriz extracelular. As amostras de excesso molar de 20 vezes e superiores não demostraram nenhuma ligação detectável, a despeito do fato de que pela análise IEF (Figura 6A e 6B) as amostras de excesso molar inferior ainda tiveram uma carga positiva líquida grande. Este resultado demonstra que não é necessário acetilar completamente todos os aminoácidos básicos disponíveis de modo a eliminar a ligação aos componentes da matriz extracelular.

(c.) Ligação da Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa em um ensaio com base em Biacore.

Proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas e acetiladas por etapa foram testadas em um ensaio com base em Biacore para avaliar a sua capacidade para ligar ao ligante de Fltl, VEGF. Neste ensaio, a proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada (0,5, 1,0 ou 5,0 ug/ml) foi imobilizada na superfície de uma lasca de Biacore (ver, Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, quanto a procedimentos padrão) e uma solução contendo 0,2 pg/ml de VEGF e Fltl(l-3)-Fc não modificada (a 0,5, 1,0 ou 5,0 pg/ml) ou 10 amostras diferentes de Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa (a 0,5, 1,0 ou 5,0 pg/ml cada uma) foram passadas sobre a lasca revestida com Fltl(l-3)-Fc. Como mostrado na Figura 8, em uma relação subestequiométrica (0,5 pg/ml de Flt(l-3) não modificada ou Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa vs. 0,2 pg/ml de VEGF), não há Fltl(l-3)-Fc suficiente (seja não modificada ou acetilada por etapa) na solução para ligar completamente o VEGF. A 1,0 pg/ml, que aproxima-se de uma relação estequiométrica de 1:1, tanto a Fltl(l-3)-Fc não modificada quanto a acetilada por etapa são mais capazes de competir para a ligação ao VEGF, mas ainda não há proteína Fltl(l-3)-Fc suficiente (seja não modificada ou acetilada por etapa) para ligar completamente o VEGF disponível. Entretanto, a 5,0 pg/ml, que é várias vezes maior do que uma relação estequiométrica de 1:1, tanto a proteína Fltl(l-3)-Fc quanto a proteína Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa são capazes para ligar o VEGF, independente do grau de acetilação. Isto claramente demonstra que a acetilação não altera a capacidade da Fltl (1 -3)-Fc para ligar VEGF.

(d.) Análises farmacocinéticas da Fltl(1-3)-Fc acetilada por etapa

Experimentos in vivo foram planejados para ensaiar os perfis farmacocinéticos de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas e Fltl(l-3)-Fc acetiladas por etapa. Camundongos Balb/c (23 a 28 g) foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de amostras não modificadas ou de excesso molar de

10, 20, 40, 60 e 100 vezes de Fltl(l-3)-Fc acetilada por etapa (3 camundongos para amostras não modificada, de excesso molar de 10, 20 e 40 vezes e 2 camundongos para amostras de excesso molar de 60 e 100 vezes). Os camundongos foram sangrados na cauda a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias e 3 dias depois da injeção. Os soros foram ensaiados em um ensaio com base em ELISA planejado para detectar Fltl(l-3)-Fc (descrito acima). A Figura 9 detalha o resultado deste estudo. A T_max para todas as proteína Fltl(l-3)-Fcs testadas foi no ponto de tempo de 6 horas mas a C_max foi como segue: Flt 1(1 3)-Fc não modificada: 0,06 pg/ml; amostra de excesso molar de 10 vezes: 0,7 pg/ml, amostra de excesso molar de 20 vezes - 2 pg/ml, amostra de excesso molar de 40 vezes - 4 pg/ml, amostra de excesso molar de 60 vezes 2 pg/ml, amostra de excesso molar de 100 vezes - 1 pg/ml. Este resultado demonstra que a acetilação ou polietileno glicolização de Fltl(l-3)-Fc significantemente melhora o seu perfil farmacocinético.

Exemplo 11: Construção de mutante de supressão de região básica da

Fltl(l-3)-Fc designado Mut 1: Fltl(l-3AR)-Fc.

Com base na observação de que a Fltl(l-3)-Fc acetilada, que tem um pi abaixo de 6, tem farmacocinéticas muito melhor do que a Fltl (13)-Fc não modificada altamente positiva (pi > 9,3), foi indagado se a diferença nas farmacocinéticas poderíam ser atribuídas à carga líquida da proteína, que a faz grudenta a componentes da matriz extracelular negativamente carregados, ou se houvesse talvez localizações específicas na superfície da proteína Fltl(l-3)-Fc que constituíssem sítios de ligação específicas para os componentes da matriz extracelular. Por exemplo, muitas proteínas são conhecidas por terem sítios de ligação de heparina, que consistem freqüentemente de um agrupamento de resíduos básicos. Algumas vezes estes resíduos são encontrados em um cacho na seqüência primária da proteína; algumas das literaturas têm identificado “seqüências de consenso” para tais sítios de ligação de heparina (ver por exemplo Hileman, et al., 1998, Bioessays 20(2): 156 a 167). Em outros casos, a estrutura cristalina conhecida de uma proteína revela um cacho de resíduos positivamente carregados na superfície de uma proteína, mas os resíduos vêm de regiões diferentes da seqüência primária e são apenas levadas juntas quando a proteína se dobra na sua estrutura terciária. Assim é difícil deduzir se um resíduo isolado de aminoácido forma parte de um cacho de resíduos básicos na superfície da proteína. Entretanto, se existe um cacho de resíduos de aminoácido positivamente carregados na seqüência primária, este não é exorbitante para supor que os resíduos estejam espacialmente próximos um dos outros e poderíam portanto ser parte de um sítio de ligação de componente de matriz extracelular. O receptor Fltl foi estudado extensivamente e vários domínios foram descritos (ver por exemplo Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Câncer Res 88: 867 a 876). Referindo-se ao ácido nucléico e à seqüência de aminoácido apresentada nas Figuras 10A a 10D (SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente) deste pedido, pode-se identificar a seqüência de sinal para a secreção que está localizada no início da seqüência e estende-se até a glicina codificada pelos nucleotídeos 76 a 78. A proteína madura começa com Ser-Lys-Leu-Lys, começado no nucleotídeo 79 da seqüência de ácido nucléico. O domínio 1 de Ig da Fltl estende-se do nucleotídeo 79 ao 393, terminando com os aminoácidos Ser-Asp-Thr O domínio 2 de Ig da Fltl estende-se do nucleotídeo 394 ao 687 (que codifica Gly-Arg-Pro até Asn-Thr-Ile), e o domínio 3 de Ig da Fltl estende-se do nucleotídeo 688 até 996 (que codifica Ile-Asp-Val até Asp-Lys-Ala). Existe uma seqüência de aminoácido ligada em ponte, Gly-Pro-Gly, codificada pelos nucleotídeos 997 a 1005, seguido pela seqüência de nucleotídeo que codifica Fc humano (nucleotídeos de 1006 a 1701 ou aminoácidos Glu-Pro-Lys a Pro-Gly-Lys-parada).

Uma análise mais detalhada da seqüência de aminoácido Fltl revela que existe um cacho, a saber, resíduos de aminoácido 272 a 281 (KNKRASVRR) das Figuras 10A a 10D (SEQ ID NO: 2), em que 6 dos 10 resíduos de aminoácido são básicos. Esta seqüência está localizada no domínio 3 da Ig de Fltl do receptor (ver Figura 11), que não é por si só essencial para a ligação do ligante do VEGF, mas que confere uma afinidade de ligação superior ao ligante. Um alinhamento da seqüência do domínio 3 de Ig com aquela do domínio 2 de Ig revela que nesta região, existe alinhamento muito deficiente entre os dois domínios Ig, e que existem cerca de 10 aminoácidos adicionais no domínio 3 de Ig. Uma análise dos perfis de hidrofilicidade (software de computador MacVector) destes dois domínios indica claramente a presença de uma região hidrofílica na proteína (Figuras 12A a 12B). Estas observações levantaram a possibilidade de que a conformação tridimensional atual do domínio 3 da Ig de Fltl deixaram algum tipo de protrusão que não está no domínio 2 da Ig de Fltl. Para testar esta hipótese, os 10 aminoácidos adicionais foram suprimidos e a proteína resultante foi testada para ver se a supressão podería afetar as farmacocinéticas favoravelmente sem comprometer seriamente a afinidade ao receptor para VEGF. Esta construção de DNA, que foi construída usando-se as técnicas da biologia molecular padrão (ver por exemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoe., Wiley-Interscience, NY) no vetor de expressão pMT21 mamífero (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), é chamado de Mutl: Fltl(l-3àB)-Fc· A construção Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc foi derivada do Fltl(l-3)Fc pela supressão dos nucleotídeos 814 a 843 (apresentada nas Figuras 10A a 10D - SEQ ID NO: 1), que suprime a seqüência de 10 resíduos de aminoácido altamente básicos Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg do domínio 3 da Ig de Fltl.

A construção final de DNA foi verificada na seqüência usando-se um seqüenciador de DNA ABI 3 73A e o Taq Dideoxi Terminator Cicie Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). A seqüência de Mutl: Fltl(l-3â_B)-Fc é apresentada nas Figuras 13A a 13D (SEQ ID NO: 3 e 4, respectivamente).

Exemplo 12: Construção de Fltl(l-3)-Fc mutante de supressão de região básica designada Mut: Fltl (2-3 ar)-Fc.

Uma segunda construção mutante de supressão, designada Mut2: Fltl (2-3 _AB)-Fc, foi derivada da construção Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc pela supressão do domínio 1 da Ig de Fltl codificado pelos nucleotídeos 79 a 393 (ver Figuras 10A a 10D - SEQ ID NO: 1); por conveniência, os nucleotídeos 73 a 78 (TCA GGT) foram mudados para TCC GGA. Isto introduziu um sítio de restrição (BspEI) sem alterar a seqüência de aminoácido associada, SerGly. Esta construção de DNA, que foi construída usando-se técnicas padrão de biologia molecular (ver por exemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoe., WileyInterscience, NY) no vetor de expressão mamífero pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), foi também verificado na seqüência usando-se um seqüenciador de DNA ABI 373A e Taq Dideoxi Terminator Cicie Sequencing Kit (Applicated Biosystems, Inc., Foster City, CA). A seqüência de Mut2: Fltl (2-3a_B)-Fc é apresentada nas Figuras 14A a 14C (SEQ ID NO: 5).

Exemplo 13: Construção de mutante de supressão de Fltl(l-3)-Fc designada Mut3: Fltl(2-3)-Fc.

Uma terceira construção mutante de supressão, designada Mut3: Fltl(2-3)-Fc, foi construída do mesmo modo como a construção Mut2: Fltl(2-3a_B)-Fc, exceto que o domínio 3 da Ig de Fltl foi deixada intacta (a região de aminoácidos básicos não foram suprimidas). A construção foi construída usando-se técnicas padrão de biologia molecular e a construção final foi verificada na seqüência como descrito acima. A seqüência de Mut3: Fltl(2-3)-Fc é apresentada nas Figuras 15A a 15C (SEQ ID NO: 7 e 8, respectivamente).

Exemplo 14: Construção de mutante de N-glicosilação de região básica de

Flt(l-3)-Fc designada Mut4: Fltl(l-3_R.>_N)-Fc.

Uma construção final foi feita em que um sítio de Nglicosilação foi introduzido no meio da região básica do domínio 3 da Ig de

Fltl. Esta construção foi designada Mut4: Fltl(l-3_R.>_N)-Fc e foi fabricada mudando-se os nucleotídeos 824 e 825 de GA para AC, mudando consequentemente o resíduo codificado Arg (AGA) em um resíduo Asn (AAC) (ver Figuras 10A a 10D - SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente). A seqüência de aminoácido resultante é portanto mudada de Arg-Ala-Ser para Asn-Ala-Ser, que se iguala ao sinal canônico (Asn-Xxx-Ser/Thr) para a adição de um sítio de N-glicosilação no resíduo Asn. A seqüência de Mut4: Fltl(l-3_R.>_N)-Fc é apresentada nas Figuras 16A a 16D (SEQ ID NO: 9 e 10, respectivamente).

Exemplo 15: Caracterização de Fltl(l-3)-Fc acetilada.

Mutantes Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc e Mut4: Fltl(í-3_R.>_N)-Fc.

(a.) Ligação aos componentes da matriz extracelular

Para determinar se as três proteínas modificadas foram mais ou menos prováveis de ter propriedades farmacocinéticas melhoradas, placas de 96 reservatórios revestidas com Matrigel (como descrito acima) foram incubadas com concentrações variáveis das proteínas mutantes e detectadas com anticorpos conjugados Fc/fosfatase alcalina anti-humano. Como mostrado na Figura 18, este experimento mostrou que embora a proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada possa ligar-se avidamente a estes reservatórios, a proteína Mut3: Fltl(2-3)-Fc liga-se um pouco mais fracamente, a proteína Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc liga-se mais fracamente ainda, e a proteína Mut2: Fltl(2-3_AB)-Fc mostrou o melhor perfil, ligante-se mais fracamente do que qualquer uma das outras proteínas mutantes. A proteína mutante em glicosilação Mut4: Fltl(l-3_R.>_N)-Fc mostrou apenas benefício marginal no ensaio de Matrigel. Estes resultados confirmam a hipótese de que uma seqüência linear de aminoácidos positivos pode ser suprimida da seqüência primária resultando em uma diminuição na interação de carga com os componentes da matriz extracelular.

(b.) Ligação de Mutl: Fltl(l-3AR)-Fc e Mut4: Fltl(l-3_R.>N)-Fc em um ensaio com base em Biacore.

Proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas e acetiladas e Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc e Mut4: Fltl(l-3_R.>_N)-Fc geneticamente modificadas foram testadas em um ensaio com base em Biacore para avaliar a sua capacidade para ligar-se ao ligante Fltl, VEGF. Neste ensaio, a proteína Fltl(l-3)-Fc não modificada (0,25, 0,5, ou 1,0 μg/ml) foi imobilizada na superfície de uma lasca de Biacore (ver Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, quanto aos procedimentos padrão) e uma solução contendo 0,1 μg/ml de VEGF e sobrenadante de célula COS purificada ou contendo Fltl(l-3)-Fc não modificada (a aproximadamente (0,25, 0,5 ou 1,0 pg/ml)), Fltl(l-3)Fc acetilada, purificada (a (0,25, 0,5 ou 1,0 μ£/πι1), sobrenadante de célula COS contendo Mutl Fltl(l-3_AB)-Fc (a aproximadamente (0,25, 0,5 ou 1,0 qg/ml)), ou sobrenadante de célula COS contendo Mut4: Fltl(l-3_R_>_N)-Fc (a aproximadamente (0,25, 0,5 ou 1,0 μg/ml) foram passadas sobre as lascas revestidas com Fltl(l-3)-Fc. Como Mostrado na Figura 17, na sub-relação estequiométrica (0,25 μο/ιηΐ Fltl(1-3)-Fc de amostras não modificadas, acetiladas ou geneticamente modificadas vs. 01. μg/ml de VEGF), a proteína Fltl(l-3)-Fc é insuficiente para bloquear a ligação de VEGF ao Fltl(l-3)-Fc imobilizado na lasca de Biacore. A 0,5 qg/ml de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificadas, acetiladas ou geneticamente modificadas, a relação estequiométrica aproxima-se de 1:1 e existe uma capacidade aumentada para bloquear a ligação de VEGF à lasca de Biacore. A 1,0 μg/ml de proteínas Fltl(l-3)-Fcs não modificadas, acetiladas ou geneticamente modificadas, que é aproximadamente uma relação estequiométrica de 10:1, as proteínas Fltl(l3)-Fcs são capazes de bloquear a ligação de VEGF à lasca de Biacore, mas não são equivalentes. Não modificadas, acetiladas e Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc são essencialmente iguais na sua capacidade para bloquear a ligação de VEGF, ao passo que a Mut4: Fltl (1-3_R_>_N)-Fc é um pouco menos eficiente no bloqueio à ligação. Este resultado confirma a hipótese de que é possível reduzir a ligação não específica de uma molécula positivamente carregada removendo-se geneticamente uma seqüência linear de aminoácidos que sejam de modo predominante negativamente carregados.

(c.) Ligação de Mutl: Fltl(l-3AR)-Fc, Mut2: Fltl(2-3ar)-Fc,

Mut3: Fltl(2-3)-Fc, e em um ensaio com base em ELISA,

Para determinar se as três proteínas mutantes poderíam ligar o ligante de Fltl VEGF, experimentos de ligação foram feitos em que placas de 96 reservatórios revestidas com VEGF foram incubadas com concentrações variáveis da respectiva proteína mutante, e em seguida lavagem, a quantidade ligada foi detectada pela incubação com um anticorpo Fc anti-humano conjugado com fosfatase alcalina e quantificada colorimetricamente pela adição de um substrato apropriado de fosfatase alcalina. Como mostrado na Figura 19, este experimento mostrou que todas as proteína mutantes puderam ligar-se ao VEGF de modo similar, nas concentrações testadas.

Exemplo 16: Análises farmacocinéticas de Fltl(l-3)-Fc acetilada, Mutl:

Fltl(l-3Aw)-Fc e Fltl(l-3)-Fc não modificada.

Experimentos in vivo foram planejados para ensaiar os perfis farmacocinéticos de Fltl(l-3)-Fc não modificada, Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc e da proteína Fltl(l-3)-Fc acetilada em excesso molar de 40 vezes. Camundongos Balb/c (25 a 30 g) foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de proteínas Fltl(l-3)-Fc não modificada, Fltl(l-3)-Fc acetilada em excesso molar de 40 vezes e Mutl: Fltl(l-3_AB)-Fc (4 camundongos cada). Estes camundongos foram sangrados na cauda a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias, 3 dias e 5 dias depois da injeção. Os soros foram ensaiados em um ELISA planejado para detectar a proteína Fltl(l-3)-Fc que envolve revestir uma placa de ELISA com VEGF, a ligação da Fltl(l-3)-Fc e reportar com um anticorpo anti-Fc ligado à fosfatase alcalina. Como mostrado na Figura 20, a C_max para estes reagentes foi como segue: Fltl(l-3)-Fc não modificada - 0,15 pg/ml; Fltl(l-3)-Fc acetilada em excesso molar de 40 vezes - 1,5 pg/ml; e Mutl: Fltl (1-3_ab)-Fc - 0,7 pg/ml.

Exemplo 17: Construção do vetor receptor Fltl modificado

O racional para a construção de versões modificadas do receptor Fltl (também conhecido como VEGFR1) foi com base na observação de que a seqüência de proteína de Fltl foi altamente básica, e foi portanto provável de grudar na matriz extracelular (ECM). A natureza altamente básica de Fltl provavelmente explica porque a Fltl(l-3)-Fc não modificada (descrita acima) tem farmacocinéticas deficientes que a tomam difícil de usar como um agente terapêutico. Como descrito acima, a forma quimicamente modificada de Fltl(l-3)-Fc acetilada em excesso molar de 40 vezes, daqui em diante denominada A40, exibiu um perfil farmacocinético (PK) enormemente melhorado em relação à Fltl(l-3)-Fc não acetilada. Portanto, tentativas foram feitas para engendrar moléculas de DNA que pudessem ser usadas para expressar formas recombinantemente modificadas de uma molécula de receptor Fltl que possuísse o perfil PK melhorado exibido pela A40 e ainda manter a capacidade para ligar-se firmemente ao VEGF.

É conhecido na literatura que o primeiro domínio Ig de Fltl (que tem uma carga líquida de +5 no pH neutro) não é essencial para a ligação firme ao VEGF, assim este domínio foi suprimido. O terceiro domínio Ig (tendo uma carga líquida de +11) não é essencial para a ligação, mas confere afinidade mais alta ao VEGF do que o segundo domínio Ig, assim ao invés de suprimi-lo totalmente, este foi substituídos com os domínios equivalentes do receptor Fltl referentes ao Flkl (também conhecido como VEGFR2) e Flt4 (também conhecido como VEGFR3). Estas moléculas quiméricas (denotadas R1R2 (Fltl.D2.FlklD3.FcACl(a) e VEGFRlR2-FcACl(a) e R1R3 (Fltl.D2.VEGFR3D3-FcACl(a) e VEGFRl R3-FcACl (a) respectivamente, em que RI e FltlD2 = domínio 2 da Ig de Fltl (VEGFRl); R2 e FlklD3 = domínio 3 da Ig de Flkl (VEGFR2); e R3 e VEGFR3D3 = domínio 3 da Ig de Flt4 (VEGFR3)) foram muito menos pegajosos ao ECM, como julgado por um ensaio in vitro de ligação ECM como descrito abaixo, teve PK enormemente melhorado como descrito abaixo. Além disso, estas moléculas foram capazes para ligar VEGF firmemente como descrito abaixo e bloquear a fosforilação do receptor Flkl nativo expressado em células endoteliais como descrito abaixo.

(a) Construção do plasmídeo de expressão pFltlD2.FlklD3.FcACl(a)

Os plasmídeos de expressão pMT21.Fltl(l-3).Fc (6519 pares de base) e pMT21.Flk-l(l-3).Fc (5230 pares de base) são plasmídeos que codificam a resistência à ampicilina e versões alvejadas com Fc de domínios Ig 1-3 de Fltl humano e Flkl humano, respectivamente. Estes plasmídeos foram usados para a construção de um fragmento de DNA que consiste de uma fusão do domínio 2 da Ig de Fltl com o domínio 3 da Ig de Flkl, usandose a amplificação por PCR dos respectivos domínios Ig seguido por outras rodadas de PCR para se obter a fusão dos dois domínios em um único fragmento. Para o domínio 2 da Ig de Fltl, os iniciadores de amplificação 5’ e 3’ foram como segue:

5’: bsp/fltlD2 (5 ’-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3 ’) SEQIDNO: 18.

3’:FltlD2-FlklD3.as (5’-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3’) - SEQ ID NO: 19.

O iniciador de amplificação 5’ codifica um sítio de enzima de restrição BspEI a montante do domínio 2 da Ig de Fltl, definido pela seqüência de aminoácido GRPFVEM (que corresponde aos aminoácidos 27 a 33 das Figuras 21A a 21C - SEQ ID NO: 12). O iniciador 3’ codifica o complemento reverso da extremidade 3’ do domínio 2 da Ig de Fltl fundida diretamente no início 5’ do domínio 3 da Ig de Flkl, com o ponto de fusão definido como TIID de Fltl (que corresponde aos aminoácidos de 123 a 126 das Figuras 21A a 21C - SEQ ID NO: 12) e continuando no WLS (que corresponde aos aminoácidos de 127 a 130 das Figuras 21A a 21C — SEQ ID NO: 12) de Flkl.

Para o domínio 3 da Ig de Flkl, os iniciadores de amplificação 5’ e 3’ foram como segue:

5’: FltlD2-FlklD3.s (5’-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG G-3’) SEQ ID NO: 21.

3’: FlklD3/apa/srf.as (5 ’-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3 ’)

- SEQ ID NO: 22.

O iniciador de amplificação 5’ codifica a extremidade do domínio 2 da Ig de Fltl fundida diretamente no início do domínio 3 da Ig de Flkl, como descrito acima. O iniciador de amplificação 3’ codifica a extremidade do domínio 3 da Ig de Flkl, definida pelos aminoácidos VRVHEK (que correspondem aos aminoácidos de 223 a 228 das Figuras 21A a 21C - SEQ ID NO: 12), seguido por uma seqüência ligada em ponte que inclui uma seqüência de reconhecimento para a enzima de restrição Srfl, e codifica os aminoácidos GPG. A seqüência ligada em ponte corresponde aos aminoácidos de 229 a 231 das Figuras 21A a 21C - SEQ ID NO: 12.

Depois de uma rodada de amplificação por PCR para produzir os domínios individuais, os produtos foram combinados em um tubo e submetidos a uma outra rodada de PCR com os iniciadores bsp/fltlD2 e FlklD3/apa/srf.as (descritos acima) para produzir o produto de fusão. Este produto de PCR foi subsequentemente digerido com as enzimas de restrição BspEI e Smal e o fragmento resultante de 614 pares de base foi subclonado nos sítios de restrição de BspEI até Srfl do vetor pMT21/AB2.Fc, para criar o plasmídeo pMT21/FltlD2.FlklD3.Fc. A seqüência de nucleotídeo do inserto de fusão de gene FltlD2-FlklD3 foi verificada pela análise de seqüência padrão. Este plasmídeo foi depois digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Srfl e o fragmento resultante de 702 pares de base foi transferido nos sítios de restrição de EcoRI até Srfl do plasmídeo pFltl(l-3)B2-FcACl(a) para produzir o plasmídeo pFltlD2.FlklD3.FcACl(a). O DNA completo e as seqüências de aminoácido deduzidas da molécula FltlD2.FlklD3.FcACl(a) quimérica está apresentada nas Figuras 21A a 21C - SEQ ID NO: 11 e 12.

(b) Construção do plasmídeo de expressão pFltlD2VEGFR3D3FcACl(a)

O plasmídeo de expressão pMT21.Fltl(l-3).Fc (6519 pares de base) codifica a resistência à ampicilina e uma versão alvejada em Fc de domínios de 1 a 3 da Ig de receptor Fltl humano. Este plasmídeo foi usado para produzir um fragmento de DNA contendo o domínio 2 da Ig de Fltl pela PCR. O RNA da linha de célula HEL921.7 foi usado para produzir o domínio 3 da Ig de Flkl, usando-se a metodologia padrão de RT-PCR. Uma outra rodada de amplificação por PCR foi usada para obter a fusão dos dois domínios Ig em um único fragmento fundido. Para o domínio 2 da Ig de Fltl, os iniciadores de amplificação 5’ e 3’ foram como segue:

5’: bsp/fltlD2 (5 ’-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3 ’) SEQ ID NO: 24.

3’: FfrlD2.VEGFR3D3.as (TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT) - SEQ IDNO: 25.

O iniciador de amplificação 5’ codifica um sítio de restrição BspEI a montante do domínio 2 da Ig de Fltl, definido pela seqüência de aminoácido GRPFVEM (que corresponde aos aminoácidos de 27 a 33 das Figuras 22A a 22C - SEQ ID NO: 14). O iniciador de amplificação 3’ codifica o complemento reverso da extremidade do domínio 2 da Ig de Fltl fundida diretamente no início do domínio 3 da Ig de VEGFR3, com o ponto de fusão definido como TIID da Fltl (que corresponde aos aminoácidos de 123 a 126 das Figuras 22A a 22C - SEQ ID NO: 14) e continuando no IQLL de VEGFR3 (que corresponde aos aminoácidos de 127 a 130 das Figuras 22A a 22C - SEQ ID NO: 14). Para o domínio 3 da Ig de VEGFR3, os iniciadores 5’ e 3’ usados para a RT-PCR foram como segue:

5’:R3D3.s (ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA) SEQ ID NO: 27.

3’:R3D3.as (ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)

SEQ ID NO: 28.

Ambos os iniciadores de amplificação 5’ e 3’ igualam-se à seqüência de VEGFR3. O produto de amplificação de 296 pares de base desta reação de RT-PCR foi isolado por técnicas padrão e submetido a uma segunda rodada de PCR para adicionar seqüências adequadas para permitir a fusão do domínio FltlD2 com o domínio FlklD3 e a fusão dos domínios FlklD3 e Fc por intermédio de uma ponte GPG (ver abaixo). Os iniciadores de amplificação foram como segue:

5’:FltlD2.VEGFR3D3.s (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG) SEQIDNO: 29.

3’: VEGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT) SEQIDNO: 30.

O iniciador de amplificação 5’ codifica a extremidade 3’ do domínio 2 da Ig de Fltl fundido diretamente no início (extremidade 5’) do domínio 3 da Ig de VEGFR3, como descrito acima. O iniciador de amplificação 3’ codifica a extremidade 3’ do domínio 3 da Ig de VEGFR3, definida pelos aminoácidos VIVHEN (que correspondem aos aminoácidos de 221 a 226 das Figuras 22A a 22C - SEQ ID NO: 14), seguido por uma seqüência ligada em ponte que inclui uma seqüência de reconhecimento para

Srfl, e codifica os aminoácidos GPG. A seqüência de ligação em ponte corresponde aos aminoácidos de 227 a 229 das Figuras 22A a 22C - SEQ ID NO: 14.

Depois de uma rodada (para o domínio 2 da Ig de Fltl) ou duas rodadas (para o domínio 3 da Ig de Flt4) de PCR para produzir os domínios individuais de Ig, os produtos de PCR foram combinados em um tubo e submetidos a uma outra rodada de amplificação por PCR com os iniciadores de amplificação bsp/fltlD2 e VEGFR3D3/srf.as descritos acima, para produzir o produto de fusão. Este produto de PCR foi subsequentemente digerido com as enzimas de restrição BspEI e Smal e o fragmento resultante de 625 pares de base foi subclonado nos sítios de restrição BspEI até Srfl do vetor pMT21/FltlAB2.Fc (descrito acima), para criar o plasmídeo pMT21/FltlD2.VEGFR3D3.Fc. A seqüência do inserto da fusão de gene FltlD2-VEGFR3D3 foi verificada pela análise de seqüência padrão. Este plasmídeo foi depois digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Srfl e o fragmento resultante de 693 pares de base foi subclonado nos sítios de restrição EcoRI até Srfl do plasmídeo pFltl(l-3)AB2-FcACl(a) para produzir o plasmídeo designado pFltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). A seqüência de aminoácido completa de DNA deduzida da molécula de FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) quimérica é apresentada nas Figuras de 22A a 22C - - SEQ ID NO: 13 e 14.

Exemplo 18: Ensaio de Ligação que Liga a Matriz Extracelular (ECM)

As placas revestidas de ECM (Becton Dickinson Catálogo # 35-4607) foram reidratadas com DME quente suplementado com glutamina (2 mM), 100 U de penicilina, 100 U de estreptomicina e 10 % de BCS por pelo menos 1 hora antes de adicionar as amostras. As placas foram depois incubadas durante 1 hora na temperatura ambiente com concentrações variáveis de FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) começado em 10 nM com diluições subsequentes de 2 vezes em PBS mais 10 % de BCS. As placas foram depois lavadas 3 vezes com PBS mais 0,1 % de Triton-X e incubadas com anticorpo Fc anti-humano conjugado com fosfatase alcalina (Promega, 1:4000 em PBS mais 10 % de BCS) durante 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram depois lavadas 4 vezes com PBS 0,1 % de Triton-X e solução tampão de fosfatase alcalina /pNPP (Sigma) foi adicionada para o desenvolvimento de cor. As placas foram lidas a I = 405 a 570 nm. Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 23 e demonstra que as proteínas FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) são consideravelmente menos pegajosas à ECM quando comparadas à proteína Fltl(l-3)-Fc.

Exemplo 19: Expressão transitória de pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) em células CHO-K1 (EIA)

Uma cultura em escala grande (2 litros) de células E. coli DH10B que carregam o plasmídeo pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) descrito acima no Exemplo 17(a) foi cultivada durante a noite em Caldo Terrífico (TB) mais 100 pg/ml de ampicilina. No dia seguinte, o DNA plasmídico foi extraído usando-se um conjunto QLAgen Endofree Megaprep seguindo o protocolo da fabricante. A concentração do DNA plasmídico purificado foi determinado pelas técnicas padrão usando-se um espectrofotômetro de UV e fluorímetro. O DNA plasmídico foi verificado pela digestão padrão de enzima de restrição de alíquotas usando-se as enzimas de restrição EcoRI mais Notl e Asei. Todos os fragmentos digeridos pelas enzimas de restrição corresponderam aos tamanhos prognosticados quando analisados em um gel de agarose a 1 %.

Quarenta placas de petri 15 cm foram plaqueadas com células CHO-K1/E1A a uma densidade de 4 χ 10⁶ células/placa. O meio de plaqueamento foi Gibco Ham’s F-12 suplementado com Soro fetal bovino (FBS) Hyclone a 10 %, 100 U penicilina/100 U de estreptomicina e glutamina (2 mM). No dia seguinte cada placa de células foi transfectada com 6 pg do DNA plasmídico pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) usando-se Gibco Optimem e Gibco Lipofectamina em 12 ml de volume, seguindo o protocolo do fabricante. Quatro horas depois da adição da mistura de transfecção às células, 12 ml/placa de Optimem suplementado com 10 % de FBS foi adicionado. As placas foram incubadas a 37° C em uma incubadora a 5 % de CO2 durante a noite. No dia seguinte o meio foi removido de cada placa e 25 ml do meio de expressão (Gibco CHO-S-SFM II suplementado com glutamina (2 mM) e 1 mM de butirato de sódio) foi adicionado. As placas foram incubadas a 37° C durante 3 dias. Depois de 3 dias de incubação, o meio foi aspirado de cada placa e centrifugado a 400 rpm em um rotor de caçamba oscilante para pelotizar as células. O sobrenadante foi decantado em frascos estéreis de 1 litro e a purificação da proteína expressada foi realizada como descrito abaixo.

Exemplo 20: Construção do vetor de expressão de pVFGFR!R2FcACl(a)

O plasmídeo de expressão pVEGFRlR2.FcACl(a) foi construído pela inserção de DNA que codifica aminoácidos SDT (que corresponde aos aminoácidos de 27 a 29 das Figuras 24A a 24C - SEQ ID NO: 16) entre aminoácidos 26 e 27 Fltl d2-Flkld3-FcACl(a) das Figuras 21A a 21C (GG) (SEQ ID NO: 12) e a remoção do DNA que codifica os aminoácidos GPG que correspondem aos aminoácidos de 229 a 231 da Figura. A seqüência de aminoácido SDT é nativa ao Receptor Fltl e foi adicionada de volta para diminuir a probabilidade de processar o N terminal heterogêneo. A GPG (seqüência ligada em ponte) foi removida de modo que os domínios da Ig de Fltl e Flkl foram fundidos diretamente uns aos outros. As seqüências de aminoácido deduzidas e do DNA completo da molécula pVEGFRlR2.FcACl(a) quimérica são apresentadas nas Figuras de 24A a 24C (SEQIDNO: 15 e 16).

Exemplo 21 : Processo de Cultura de Célula Usada para Produzir

Receptores Fltl Modificados (a) Processo de Cultura de Célula Usada para Produzir FltlD2.FlklD3.FcACl(a)

O processo para a produção da proteína FltlD2.FlklD3.FcACl(a) usando-se o plasmídeo de expressão pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) descrito acima no Exemplo 1 envolve a cultura em suspensão de células do ovário de hamster chinês recombinantes (CHO Kl/El A) que constitutivamente expressam o produto de proteína. As células são cultivadas em biorreatores e o produto de proteína é isolado e purificado pela cromatografia de afinidade e de exclusão de tamanho. O processo é fornecido in maiores detalhes abaixo.

Expansão Celular

Dois frascos T confluentes de 225 cm² contendo a linhagem de célula que expressa FltlD2.FlklD3.FcACl(a) foram expandidos pela passagem de células em oito frascos T de 225 cm² no meio (GMEM + 10 % de soro, GIBCO) e incubados a 37° C e 5 % de CO₂. Quando os frascos aproximaram-se da confluência (aproximadamente de 3 a 4 dias) as células foram destacadas usando-se tripsina. O meio fresco foi adicionado para proteger as células doutra exposição à tripsina. As células foram centrifugadas e recolocadas em suspensão em meio fresco depois transferidas a oito garrafas rolantes de 850 cm e incubadas a 37° C e 5 % de CO₂ até confluentes.

Cultura de Suspensão em Biorreatores

As células cultivadas garrafas rolantes foram tripsinizadas para destaca-las da superfície e lavadas com meio de cultura de suspensão. As células são assepticamente transferidas para um biorreator de 5 litros (New Brunswick Celligen Plus) onde as células são cultivadas em 3,5 litros de cultura de suspensão. O meio de cultura de suspensão foi um modificação de glicose baixa isento de glutamina de IS-CHO (Irvine Scientific) ao qual 5 % de soro fetal bovino (Hiclone), suplemento GS (Life Technologies) e 25 μΜ de metionina sulfoximina (Sigma) foram adicionados. O pH foi controlado a 7,2 pela adição de dióxido de carbono ao gás de entrada ou pela adição de uma solução líquida de carbonato de sódio ao biorreator. O nível de oxigênio dissolvido foi mantido a 30 % de saturação pela adição de oxigênio ou nitrogênio ao gás de entrada e a temperatura controlada a 37° C. Quando uma densidade de 4 xlO⁶ células/ml foi atingida as células foram transferidas para um biorreator de 40 litros contendo o mesmo meio e ajustes para controlar o biorreator. O ajuste de temperatura foi reduzido para 34° C para retardar o desenvolvimento celular e aumentar a taxa relativa de expressão de proteína.

(b) Processo de Cultura de Célula Usada para Produzir FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)

As mesmas metodologias como descritas acima para FltlD2.FlklD3.FcACl(a) foram usadas para produzir FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a).

Exemplo 22: Colheita e Purificação de Receptores Fltl Modificados (a) Colheita e Purificação de FltlD2.FlklD3.FcACl(a)

A proteína do produto foi assepticamente colhida do biorreator enquanto se retém as células usando módulos de filtração de fluxo tangencial Millipore Prostak e uma bomba mecânica de baixo cisalhamento (Fristam). O meio fresco foi adicionado ao biorreator para substituir aquele removido durante a filtração de colheita. Aproximadamente 40 litros de filtrado colhido foram depois carregados em uma coluna de 400 ml contendo a resina Protein A Sefarose (Amersham Pharmacia). Depois de carregar, a resina foi lavada com tampão contendo 10 mM de fosfato de sódio, 500 mM de cloreto de sódio, pH 7,2 para remover qualquer proteína contaminante não ligada. A proteína FltlD2.FlklD3.FcACl(a) foi eluída com um tampão de citrato no pH 3,0. A proteína eluída foi neutralizada pela adição de base de Tris e congelada a-20° C.

Diversos lotes congelados de proteína FltlD2.FlklD3.FcACl(a) da etapa de Proteína A acima foram descongelados, reunidos e concentrados usando-se uma membrana de filtração de fluxo tangencial de corte de peso molecular nominal 30kD (NMWCO) Millipore. A proteína foi transferida para um concentrador de célula agitado (Millipore) e mais concentrada a 30 mg/ml usando uma membrana NMWCO de 30kD. A proteína concentrada foi carregada em uma coluna de exclusão de tamanho empacotada com resina Superdex 200 (Amersham Pharmacia) que foi equilibrada com solução salina tamponada com fosfato mais 5 % de glicerol. O mesmo tampão foi usado para conduzir a coluna. As frações que correspondem ao dímero FltlD2.FlklD3.FcACl(a) foram reunidas, filtradas estéril através de um filtro de 0,22 mícron, aliquotadas e congeladas.

(b) Colheita e Purificação de FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)

As mesmas metodologias como descritas acima para FltlD2.FlklD3.FcACl(a) foram usados para colher e purificar a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a).

Exemplo 23 Ensaio de Fosforilação para VEGFR2 Transitoriamente

Expresso

Células endoteliais da veia umbilical humana primárias (HUVECs), inoculação de 4 a 6, foram privadas de alimento durante 2 horas em meio de glicose alta DME isento de soro. Amostras contendo 40 ng/ml (1 nM) de VEGF 165 humano, que é um ligante para o receptores de VEGF Fltl, Flkl e Flt4(VEGFR3) foram preparados e foram pré incubados durante 1 hora na temperatura ambiente com quantidades variáveis dos receptores de Fltl modificados Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) e FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) em meio de glicose alta DME isento de soro contendo 0,1 % de BSA. As células foram inoculadas durante 5 minutos com as amostras preparadas acima +/- VEGF 165, seguido pela lise de célula total usando o tampão completo de lise. Os lisados de célula foram imunoprecipitados com um anticorpo direcionado contra o término C do receptor VEGFR2. Os lisados imunoprecipitados foram carregados em 4 a 12 % de gel de SDS-PAGE Novex e depois transferidos para a membrana PVDF usando metodologias padrão de transferência. A detecção de VEGFR2 fosforilado foi feita pela imunomancha com o mAb anti-fosfo Tirosina chamado 4G10 (UBI) e reagida usando reagente ECL (Amersham).

As Figuras 25A a 25C e 26A a 26B mostram o resultado deste experimento. A Figura 25A a 25C revela que a detecção pela Western blot de VEGFR2(Flkl) tirosina fosforilado pela estimulação do ligante VEGF 165 mostra que os receptores de superfície celular são fosforilados em níveis que variam dependendo de qual receptor Fltl modificado é usado durante as pré incubações com VEGF. Como é observado na Figura 25A, em um excesso molar de 1,5 de Fltl(13)-Fc , Fltl(l-3)-Fc (A40) ou FltlD2FlklD3.FcACl(a) transitório existe o bloqueio completo do estímulo do receptor por estes três receptores Fltl modificados quando comparado à inoculação do meio de controle. Ao contrário, o FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) transitório não apresenta bloqueio significante neste excesso molar, quando comparado com a inoculação de VEGF de controle positivo. Resultados similares são observados na Figura 25B, onde os receptores Flt modificados estão em um excesso molar de 3 vezes em relação ao ligante VEGF 165. Na Figura 25C, onde os receptores Fltl modificados estão em um excesso molar de 6 vezes em relação ao ligante VEGF165, o FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) transitório pode ser agora mostrado ser parcialmente bloqueador do estímulo induzido pelo VEGF 165 de receptores de superfície celular.

Na Figura 26A a 26B, a detecção pela Western blot de VEGFR2(Flkl) fosforilado com tirosina pelo estímulo do ligante VEGF 165 mostra que os receptores de superfície celular não são fosforilados pelas amostras inoculadas que têm VEGF 165 pré incubados com excesso molar de 1 e 2 vezes (Figura 26A) ou excesso molar de 3 e 4 vezes (Figura 26B) de FltlD2FlklD3.FcACl(a) transitório, FltlD2FlklD3.FcACl(a) estável ou VEGFRlR2-FcACl(a) transitório. Em todas as concentrações de receptores Fltl modificados testadas houve a ligação completa de ligante VEGF 165 durante a pré incubação, não resultando em nenhum estímulo detectável de receptores de superfície celular pelo VEGF 165 não ligado quando comparado à inoculação de meio de controle.

Exemplo 24: Bioensaio de Proliferação de Célula

A população de célula de teste é de células MG87 que foram estavelmente transfectadas com um plasmídeo de expressão que contém um inserto de DNA que codifica o domínio extracelular de VEGFR2(Flkl) fundido ao domínio TrkB de quinase intracelular, produzindo assim uma molécula quimérica. A razão do domínio TrkB de quinase intracelular ter sido usado ao invés do domínio VEGFR2(Flkl) de quinase intracelular nativo é que o domínio de quinase intracelular de VEGFR2(Flkl) não causa uma resposta proliferativa forte quando estimulada pelo VEGF 165 nestas células.

r

E conhecido que as células MG87 contendo o receptor TrkB de comprimento completo dão uma resposta proliferativa robusta quando estimulada com BDNF, de modo que o domínio TrkB de quinase intracelular foi engendrado para substituir o domínio de quinase intracelular de VEGFR2(Flkl) para se levar vantagem desta capacidade de resposta proliferativa.

5x10 células/reservatório foram plaqueadas em uma placa de 96 reservatórios e deixadas sedimentar durante 2 horas a 37° C. Os seguintes receptores Flt modificados Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a), mais um receptor irrelevante denominado Tie2-Fc como um controle negativo, foram titulados de 40 nM a 20 pM e incubados nas células durante 1 hora a 37° C. O VEGF 165 recombinante humano em meio definido foi depois adicionado a todos os reservatórios em uma concentração de 1,56 nM. As placas foram incubadas durante 72 horas a 37° C e depois MTS (reagente dowen, Promega) adicionado e as placas foram incubadas durante um adicional de 4 horas. Finalmente, as placas foram lidas em um espectrofotômetro a 450/570 nm. Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 27. O receptor de controle Tie2-Fc não bloqueia a proliferação de célula induzida pelo VEGF 165 em nenhuma concentração ao passo que o FltlD2.FlklD3.FcACl(a) bloqueia 1,56 nM de VEGF165 com uma meia dose máxima de 0,8 nM. Fltl(l-3)-Fc e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) são menos eficazes em bloquear VEGF165 neste ensaio com uma meia dose máxima de ~ 2 nM. O VEGF 165 sozinho dá uma leitura de 1,2 unidades de absorbância e o fundo é de 0,38 unidades de absorbância.

Exemplo 25: Estequiometria de Ligação de Receptores Flt Modificados ao VEGF165 (a) Análise de BIAcore

A estequiometria de interação de FltlD2FlklD3.FcACl(a) e

VEGFRlR2-FcACl(a) com VEGF165 humano foi determinada medindo-se o nível de ligação de saturação do VEGF às superfícies de FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a) ou medindo-se a concentração de VEGF 165 necessário para impedir completamente a ligação de FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a) à superfície da lasca de BIAcore com VEGF.

Os receptores Flt modificados FltlD2FlklD3.FcACl(a) e VEGFRlR2-FcACl(a), foram capturados com um anticorpo específico antiFc que foi primeiro imobilizado em uma lasca de Biacore (BIACORE) usando a química de ligação de amina. Uma superfície de anticorpo em branco foi usada como um controle negativo. O VEGF 165 foi injetado a uma concentração de 1 nM, 10 nM e 50 nM nas superfícies de FltlD2FlklD3.FcACl(a) e VEGFRlR2-FcACl(a) a 10 μΐ/min durante uma hora. Um sinal de ligação em tempo real foi registrado e a ligação de saturação foi obtida na extremidade de cada injeção. A estequiometria de ligação foi calculada como uma relação molar do VEGF 165 ligado para o FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a) imobilizados usando o fator de conversão de 1000 RU equivalente a 1 ng/ml. O resultado indicou a estequiometria de ligação de uma molécula dimérica de VEGF 165 por uma molécula de FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a) (Figura 28).

Em solução, FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou VEGFR1R2FcACl(a) a uma concentração de 1 nM (estimada ser 1000 vezes mais alta do que o KD do FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou da interação VEGFR1R2FcACl(a)/VEGF165) foram misturados com concentrações variadas de VEGF 165. Depois de uma hora de incubação, as concentrações do FltlD2FlklD3.FcACl(a) livre em solução foram medidas como um sinal de ligação a uma superfície de VEGF 165 ligado à amina. Uma curva de calibração foi usada para converter o sinal de ligação do BIAcore ao FltlD2FlklD3.FcACl(a) para a sua concentração molar. Os dados mostraram que a adição de 1 nM de VEGF165 na solução de FltlD2FlklD3.FcACl(a) bloqueou completamente a ligação de FltlD2FlklD3.FcACl(a) à superfície do VEGF 165. Este resultado sugeriu a estequiometria de ligação de uma molécula de VEGF165 por uma molécula de FltlD2FlklD3.FcACl(a) (Figura 29 e Figura 30). Quando a concentração de FltlD2FlklD3.FcACl(a) foi plotada como uma função da concentração de VEGF 165 adicionada, a curva da porção linear foi de -1,06 para FltlD2FlklD3.FcOCl(a) e de -1,07 para VEGFRlR2-FcACl(a). A magnitude da curva, muito próxima a uma negativa, foi indicativa de que uma molécula de VEGF 165 liga-se a uma molécula de FltlD2FlklD3.FcACl(a) ou de VEGFRlR2-FcACl(a).

(b) Cromatografia de Exclusão de Tamanho FltlD2FlklD3.FcACl(a) foi misturado com um excesso de 3 vezes de VEGF 165 e o complexo de receptor-ligante foi purificado usando-se uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho Pharmacia Superose 6. O complexo de receptor-ligante foi depois incubado em um tampão contendo cloridreto de guanidina 6 M de modo a dissociá-lo em suas proteínas componentes. A FltlD2FlklD3.FcACl(a) foi separada do VEGF165 usandose a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho Superose 6 conduzida em cloreto de guanidínio 6 M. De modo a determinar a estequiometria do complexo, diversas injeções de FltlD2FlklD3.FcACl(a) e VEGF165 foram feitas e a altura do pico ou a intensidade de pico integrada foram plotadas como uma função da concentração da proteína injetada. A calibração foi feita sob condição idêntica a uma usada na separação dos componentes do complexo FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF. A quantificação da composição do complexo FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF foi com base nas curvas de calibração. O resultado deste experimento são apresentados na Figura 28, que mostra a relação de VEGF165 para FltlD2FlklD3.FcACl(a) em um complexo para ser 1:1.

Exemplo 26: Determinação da Estequiometria de Ligação do Complexo de FltlD2FlklD3FcACl(a)/VEGF165 pela Cromatografia de Exclusão de

Tamanho

Preparação do Complexo FItlD2FlklD3FcACl(a)/VEGF165

VEGF 165 (concentração = 3,61 mg/ml) foi misturado com FltlD2.FlklD3.FcACl(a) transitoriamente expressado em célula CHO (concentração = 0,9 mg/ml) em relação molar de 3:1 (VEGF165:FltlD2.FlklD3.FcACl(a)) e incubados durante a noite a 4° C.

(a) Cromatografía de Exclusão de Tamanho (SEC) sob Condições Nativas

Para separar o complexo do excesso de VEGF 165 não ligado, 50 μΐ do complexo foram carregados em uma Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 que foi equilibrada em tampão de PBS. A amostra foi eluída com o mesmo tampão na razão de fluxo de 40 μΐ/min. na temperatura ambiente. Os resultados desta SEC são mostrados na Figura 31. O Pico #1 representa o complexo e o pico #2 representa VEGF 165 não ligado. As frações eluídas entre 1,1 e 1,2 ml foram combinadas e cloridreto de guanidínio (GuHCl) foi adicionado para uma concentração final de 4,5 M para dissociar o complexo.

(b) Cromatografía de Exclusão de Tamanho (SEC) sob Condições Dissociativas

Para separar os componentes do complexo receptor-ligante e para determinar a sua relação molar, 50 μΐ de complexo dissociado como descrito acima foi carregado em uma Superose 12 PC 3.2/30 equilibrada em GuHCl 6 M e eluída com a mesma solução em uma razão de fluxo de 40 μΐ/min. na temperatura ambiente. Os resultados desta SEC são mostrados na Figura 32. O Pico #1 representa FltlD2FlklD3.FcACl(a) e o pico #2 representa VEGF 165.

(c) Cálculo da Estequiometria do Complexo FltlD2FlklD3.FcACl(a):VEGF165

A estequiometria do complexo receptor-ligante foi determinada a partir da área do pico ou da altura do pico dos componentes. As concentrações de VEGF165 e FltlD2FlklD3.FcOCl(a) que correspondem à altura do pico ou à área do pico, respectivamente, foram obtidas a partir das curvas padrão para VEGF 165 e Fltl D2FlklD3.FcACl(a). Para obter uma curva padrão, quatro concentrações diferentes (0,04 mg/ml a 0,3 mg/ml) de cada um dos componentes foram injetadas em uma coluna Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 equilibrada em cloreto de guanidínio 6 M e eluída com a mesma solução na razão de fluxo de 40 μΐ/min. na temperatura ambiente. A curva padrão foi obtida plotando-se a área de pico ou as alturas de pico vs a concentração de proteína. A razão molar de VEGF 165 :

FltlD2FlklD3.FcACl(a) determinada a partir da área de pico dos componentes foi de 1,16. A razão molar de VEGF165 :

FltlD2FlklD3.FcACl(a) determinada a partir da altura de pico dos componentes foi de 1,10.

Exemplo 27: Determinação da Estequiometria do Complexo

FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 pela Cromatografia de Exclusão de

Tamanho com Dispersão de Luz Em linha

Preparação do Complexo

VEGF 165 foi misturado com a proteína

FltlD2.FlklD3.FcACl(a) expressada transitoriamente em CHO na relação molar de 3:1 (VEGF165:FltlD2FlklD3.FcACl(a)) e incubados durante a noite a 4° C.

(a) Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) com Dispersão de Luz Em linha

A coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com um detetor de dispersão de luz MiniDawn em linha (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califórnia) e detetores de índices de retração (RI) (Shimadzu, Kioto, Japão) foi usada para determinar o peso molecular (MW) do complexo de receptor-ligante. As amostras foram injetadas em uma coluna Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada em tampão de PBS e eluída com o mesmo tampão a uma razão de fluxo de 0,5 ml/min. na temperatura ambiente. Como mostrado na Figura 33, o perfil de elução mostra dois picos. O Pico #1 representa o complexo de receptor-ligante e o pico #2 representa o VEGF 165 não ligado. O peso molecular foi calculado a partir dos sinais LS e RI. O mesmo procedimento foi usado para determinar o peso molecular dos componentes individuais do complexo de receptor-ligante. Os resultados destas determinações são como segue: o peso molecular do complexo FltlD2FlklD3.FcACl(a)/ VFGF165 na posição de pico é 157 300 (Figura 33), o peso molecular de VEGF165 na posição de pico é 44 390 (Figura 34) e o peso molecular de R1R2 no pico é 113 300 (Figura 35).

Estes dados indicam que a estequiometria do complexo FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF é de 1:1 como corresponde à soma de pesos moleculares para FltlD2FlklD3.FcACl(a) e VEGF165. Importantemente, este método conclusivamente provou que o complexo FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VFGF165 foi na verdade composto apenas de uma molécula de ligante VEGF165 e apenas uma molécula da FltlD2FlklD3.FcACl(a).

Exemplo 28: Mapeamento de Peptídeo de FltlD2.FIklD3.FcACl(a)

As estruturas de dissulfeto e os sítios de glicosilação na FltlD2.FlklD3.FcACl(a) foram determinados por um método de mapeamento de peptídeo. Neste método, a proteína foi primeiro clivada com tripsina. Fragmentos trípticos foram analisados e identificados pela HPLC ligada com espectrometria de massa, além disso a uma técnica de seqüenciamento de terminal N. A redução dos digestos trípticos foi utilizada para auxiliar a identificar fragmentos contendo ligação de dissulfeto. O tratamento do digesto tríptico com PNGase F (Glyko, Novato, CA) foi utilizado para auxiliar a identificar os fragmentos com sítios de glicosilação ligados em N. Os resultados estão resumidos na Figura 36 anexa.

Existe um total de dez cisteínas na FltlD2.FlklD3.FcACl(a); seis delas pertencem à região Fc. Cys27 foi confirmada estar ligada pelo dissulfeto à Cys76. Cysl21 é confirmada estar ligada pelo dissulfeto à Cys 182. As primeiras duas cisteínas na região Fc (Cys211 e Cys214) formam uma ligação de dissulfeto intermolecular com as mesmas duas cisteínas em uma outra cadeia de Fc. Entretanto, porque estas duas cisteínas não podem ser enzimaticamente separadas uma da outra, não pode ser determinado se a ligação de dissulfeto está ocorrendo entre as mesmas cisteínas (Cys211 a Cys211, por exemplo) ou entre Cys211 e Cys214. A Cys216 é confirmada estar ligada pelo dissulfeto à Cys306. Cys 352 é confirmada estar ligada pelo dissulfeto à Cys410.

Existem cinco sítios de glicosilação ligados em N em FltlD2.FlklD3.FcACl(a). Todos os cinco deles foram descobertos estar glicosilados em graus variáveis. A glicosilação completa foi observada em Asn33 (seqüência de aminoácido NIT), Asnl93 (seqüência de aminoácido NST), e Asn282 (seqüência de aminoácido NST). Além disso, a glicosilação parcial é observada em Asn65 e Asnl20. Os sítios de glicosilação estão realçados por sublinhado na Figura 36.

Exemplo 29: Análise Farmacocinética de Receptores Flt modificados (a) Análise Farmacocinética de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) e VEGFRlR2-FcACl (a)

Camundongos Balb/c (25 a 30 g) foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) transitoriamente expressada em CHO, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) estavelmente expressada em CHO e VEGFRlR2-FcACl(a) transitoriamente expressada em CHO. Os camundongos foram sangrados na cauda em 1,2, 4, 6, 24 horas, 2 dias, 3 dias e 6 dias depois da injeção. Os soros foram ensaiados em um ELISA planejado para detectar Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a). O ELISA envolve revestir uma placa de ELISA com VEGF165, a ligação para detectar Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ou VEGFRlR2-FcACl(a) e reportando com um anticorpo anti-Fc ligado a peroxidase de rábano. Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura 37. A T_max para Fltl(l-3)-Fc (A40) foi em 6 horas enquanto a T_max para a FltlD2.FlklD3.FcACl(a) transitória e estável e a VEGFRlR2-FcACl(a) transitória foi de 24 horas. A C_max para a

Fltl(l-3)-Fc (A40) foi de 8 pg/ml. Para ambas as transitórias (FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e VEGFRlR2-FcACl(a)) a C_max foi de 18 gg/ml e a C_max para a VEGFRlR2-FcACl(a) estável foi de 30 pg/ml.

(b) Análise Farmacocinética de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)

Camundongos Balb/c (25 a 30 g) foram subcutaneamente injetados com 4 mg/kg de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) transitoriamente expressada em CHO e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) transitoriamente expressada em CHO. Os camundongos foram sangrados na cauda em 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 e 20 dias depois da injeção. Os soros foram ensaiados em um ELISA planejado para detectar Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). O ELISA envolve revestir uma placa de ELISA com 165, ligante o Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ou FltlD2.VFGFR3D3.FcACl(a) e reportando com um anticorpo anti-Fc ligado a peroxidase de rábano. A Fltl(l-3)Fc (A40) não pode mais ser detectada no soro após o dia 5 ao passo que a FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) foram detectáveis durante 15 dias ou mais. Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 38.

Exemplo 30: Avaliação da capacidade da FltlD2.FlklD3.FcACl(a) para

Inibir o Desenvolvimento de Tumor Jw Vivo

Para avaliar a capacidade da FltlD2.FlklD3.FcACl(a) para inibir o desenvolvimento de tumor in vivo um modelo em que as suspensões de célula de tumor são implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos machos com imunodeficiência grave combinada (SCID) foi utilizado. Duas linhas de célula, a linha de célula de fibrossarcoma HT-1080 humano (ATCC acesso N² CCL-121) e a linha de célula de glioma C6 de rato (ATCC acesso N² CCL-107), cada uma das quais exibiram morfologias e características de desenvolvimento distintamente diferentes, foram usadas neste ensaio. A primeira dose de FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (a 25 mg/Kg ou como indicado nas Figuras 39 e 40) foi dada no dia da implantação do tumor. Os animais subsequentemente receberam injeções subcutâneas de Fltl(l-3)Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ou veículo dia sim dia não (EOD) ou duas vezes por semana (2X/semana) por um período de 2 semanas. Depois de 2 semanas, os animais foram perfusados com fixador, os tumores foram removidos e as amostras foram embaralhadas às cegas. O volume do tumor foi determinado medindo-se o comprimento e a largura de tumores subcutâneos visíveis. Tanto a Fltl(l-3)-Fc (A40) quanto a FltlD2.FlklD3.FcACl(a) reduziram significantemente o desenvolvimento dos tumores formados pelas células HT-1080 e C6. Os resultados destes experimentos são mostrados na Figura 39 e na Figura 40.

Exemplo 31: O Efeito de VEGF165 e de Receptores Flt Modificados no

Sistema Reprodutivo Feminino

O padrão estereotípico de remodelação vascular que ocorre no útero e no ovário durante o curso do ciclo reprodutivo foi bem caracterizado, tomando estes tecidos particularmente bem adaptados ao estudo de mecanismos que regulam a angiogênese, remodelação vascular e regressão vascular. Na verdade, os estudos de hibridização in situ nos tecidos reprodutivos forneceu a primeira evidência clara de que o VEGF atua como um mediador da angiogênese fisiológica em roedores maduros, bem como em seres humanos e primatas não humanos (Phillips et al, 1990; Ravindranat et al, 1992; Shweiki et al, 1993; Kamat et al, 1995). Visto que a angiogênese cíclica e a remodelação vascular são características proeminentes do ovário e do útero normais, não é surpreendente que o desenvolvimento anormal de vaso sangüíneo e/ou a disfunção vascular tenham sido descoberto caracterizar muitas condições patológicas que afetam estes órgãos. Além disso, considerase que estas anormalidades patogênicas vasculares sejam causadas ou perpetuadas pela expressão desregulada de um ou mais fatores angiogênicos ou anti-angiogênicos, mais proeminentemente o VEGF.

Por exemplo, a angiogênese anormal é características da doença ovariana policística, endometriose e carcinoma endometrial, e em cada caso o VEGF é sobre expressado no tecido afetado (Kamat et al, 1995; Shifren et al, 1996; Guidi et al, 1996; Donnez et al, 1998). Considera-se também que a sobre expressão de VEGF desempenhe um papel patogênico no estabelecimento da hiperpermeabilidade vascular sistêmica na síndrome da hiperestimulação ovariana (McClure et al, 1994; Levin et al, 1998) e na pré eclampsia (Baker et al, 1995; Sharkey et al, 1996). Além disso, o VEGF foi implicado como o fator de permeabilidade responsável para a produção de ascites associadas com o carcinoma ovariano e outros tumores (Senger et al, 1983; Boocock et al, 1995). Os agentes que eficazmente neutralizam as ações biológicas de VEGF podem ser razoavelmente prognosticado ser de benefício terapêutico nas condições acima e relacionadas.

A angiogênese e a remodelação vascular também são marcas da implantação blastocística e do desenvolvimento placental (Findlay, 1986). O VEGF é fortemente expressado tanto na decídua maternal quanto nos trofoblastos embriônicos, onde considera-se para a primeira expansão estimulada e hiperpermeabilidade da vasculatura uterina durante o período de periimplantação e a formação subsequentemente mediada de ambos os componentes maternal e embriônico da vasculatura placental (Shweiki et al, 1993; Cullinan-Bove e Koos, 1993; Chakraborty et al, 1995; Das et al, 1997). O VEGF também é requerido para a angiogênese lútea e a secreção de progesterona associada necessária para preparar o útero para a implantação (Ferrara et al, 1998). Assim, os agentes que inibem as ações biológicas do VEGF podem provar serem úteis como agentes contraceptivos (impedindo a implantação) ou como um abortifaciente nos estágios iniciais da gestação. A última aplicação poderia encontrar uso particular como uma intervenção não cirúrgica para o término de gravidez ectópica.

Embora a expressão dos receptores de VEGF seja amplamente confinado ao endotélio vascular em tecidos reprodutivos normais, a Fltl também é expressada pelos trofoblastos na placenta tanto nos seres humanos quanto nos animais (Clark et al, 1996; He et al, 1999) onde foi proposto desempenhar um papel na invasão de trofoblasto. Interessantemente, tanto a Fltl quanto a KDR (Flkl) são expressadas pela linha de célula de coriocarcinoma BeWo (Chamock-Jones et al, 1994), e VEGF foi mostrado promover a síntese e a fosforilação da tirosina da MAP quinase nestas células. Além disso, os carcinomas ovarianos primários e metastáticos não apenas para expressar alto níveis de VEGF, mas - além disso para o endotélio vascular - as próprias células de tumor expressam KDR e/ ou Fltl (Boocock et al, 1995). Estas descobertas sugerem que o VEGF pode estar não apenas criticamente envolvido na geração e manutenção da vasculatura de tumor, mas que pelo menos em alguns tumores de origem reprodutiva o VEGF pode auxiliar um papel autócrino, sustentando diretamente a sobrevivência e a proliferação das células de tumor. Assim os agentes que bloqueiam as ações do VEGF pode ter aplicações particularmente benéficas para o tratamento de tumores de origem reprodutiva.

Métodos e Resultados (a) Estimativa da Hiperpermeabilidade Uterina Induzida pelo

VEGF

A gonadotrofina do soro de égua prenha (PMSG) foi subcutaneamente injetada (5 IU) para induzir a ovulação em ratos fêmeas na pré puberdade. Isto resulta em um aumento repentino de estradiol após 2 dias que por sua vez causa uma indução de VEGF no útero. E relatado que esta indução resulta na hiperpermeabilidade do útero e um aumento no peso do útero úmido 6 horas depois e, portanto, pode ser potencialmente bloqueada pelos receptores Flt modificados Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Neste modelo in vivo, o peso normal do útero de rato é de cerca de 50 mg e este pode ser induzido para 300 a 350 mg pela PMSG. A dissecação do tecido revela que todo este peso é água. A injeção subcutânea de Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) e FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) a 25mg/kg em 1 hora depois da injeção de PMSG resulta em uma inibição de cerca de 50 % do aumento mo peso uterino úmido. Aumentar a dose do receptor Flt modificado não reduz mais o aumento no peso úmido sugerindo que existe um componente independente do VEGF para este modelo. Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 41.

(a) Estimativa de angiogênese de corpo lúteo usando-se progesterona como uma leitora

A gonadotrofina do soro de égua prenha (PMSG) foi subcutaneamente injetada (5 IU) para induzir a ovulação em ratos fêmeas na pré puberdade. Isto resulta em um funcionamento completo do corpo lúteo contendo uma densa rede de vasos sangüíneos depois de 4 dias que permite a secreção de progesterona na corrente sangüínea de modo a preparar o útero para a implantação do útero. A indução de angiogênese no corpo lúteo requer o VEGF; portanto, bloquear o VEGF pode resultar em um falta de novos vasos sangüíneos e assim uma falta de progesterona secretada na corrente sangüínea. Neste modelo in vivo, os níveis de repouso de progesterona são de cerca de 5 ng/ml e estes podem ser induzidos a um nível de 25 a 40 ng/ml depois da PMSG. A injeção subcutânea de Fltl(l-3)-Fc (A40) ou

FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a 25 mg/kg ou 5 mg/kg em 1 hora, depois da injeção de PMSG resulta em uma completa inibição da indução de progesterona no dia 4. Os resultados deste experimento são mostrados nas Figuras 42A a 42B.

Exemplo 33: Análise Farmacocinética de Fltl(l-3)-Fc (A40) e Fltl(1-3)Fc polietileno glicolizado

A Fltl(l-3)-Fc foi polietileno glicolizada com PEG lOkD ou PEG 20kD e testada em camundongos balb/c quanto ao seu perfil farmacocinético. Ambas as formas de Fltl(l-3)-Fc polietileno glicolizada foram descobertas ter perfis de PK muito melhores do que a Fltl(l-3)-Fc (A40), com a T_max ocorrendo em 24 horas para as moléculas polietileno glicolizadas como oposto a 6 horas para a Fltl (1 -3)-Fc (A40).

Exemplo 34: ELISA de VEGF165 para Testar a Afinidade de Variantes de

Receptor Fltl Modificado pM de VEGF165 foram incubados durante a noite na temperatura ambiente com variantes de receptor Fltl modificado variando de 160 pM a 0,1 pM. As variantes de receptor Fltl modificado usadas neste experimento foram Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) transitoriamente expressada, FltlD2VEFGFR3D3FcACl(a) transitoriamente expressada, Fltl-(13nas)-Fc, Fltl(l-3_R.>c)-Fc e Tie2-Fc. A Fltl(l-3_NAs)-Fc é uma versão modificada da Fltl(l-3)-Fc em que a seqüência de aminoácido KNKRASVRRR altamente básica é substituída pela NASVNGSR, resultando na incorporação de dois novos sítios de glicosilação e uma redução líquida de cinco cargas positivas, ambas com o propósito de reduzir os efeitos desfavoráveis desta seqüência em relação ao PK. A Fltl(l-3_R_>c)-Fc é uma modificação em que um único resíduo de arginina (R) dentro da mesma seqüência de aminoácido básico é mudado para uma cisteína (C) (KNKRASVRRR -> KNKÇASVRRR) para permitir a polietileno glicolização naquele resíduo, que pode depois proteger a região básica de exercer os seus efeitos desfavoráveis sobre o PK. Depois da incubação a solução foi transferida para uma placa contendo um anticorpo de captura para VEGF 165 (R&D). A quantidade de VEGF 165 livre foi depois determinada usando-se um anticorpo para reportar o VEGF 165. Isto mostrou que a variante do receptor Fltl modificado com a afinidade mais alta para o VEGF 165 (determinada como a quantidade mais baixa de VEGF165 livre) foi a FltlD2FlklD3.FcACl(a), seguida pela Fltl(l-3)-Fc e Fltl(13)-Fc (A40) e depois pelas Fltl(l-3_R.>c)-Fc, Fltl(l-3_NAS)-Fc e

FltlD2VEFGFR3D3-FcACl(a). A Tie2Fc não tem nenhuma afinidade com o VEGF165.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucléico quimérica, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína de fusão capaz de ligar o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), consistindo em um domínio 2 semelhante à imunoglobulina (Ig) de um primeiro receptor VEGF Fltl, e um domínio 3 de Ig de um segundo receptor VEGF Flkl ou Flt4, e um componente de multimerização, a região codificadora da molécula de ácido nucléico consiste em uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em:

(a) seqüência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 11;

(b) seqüência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 13; e (c) seqüência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 15.
2. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1.
3. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucléico é funcionalmente ligada a uma seqüência de controle de expressão.
4. Sistema de vetor hospedeiro para a produção de um polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 3, em uma célula hospedeira adequada, em que a célula hospedeira é um microorganismo.
5. Sistema de vetor hospedeiro de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira adequada é a de E. coh.
6. Método de produzir um polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar células do sistema de vetor hospedeiro como definido na reivindicação 4 ou 5, sob condições que permitam a produção do polipeptídeo de fusão e a recuperação do polipeptídeo de fusão assim produzido.

Petição 870170001062, de 05/01/2017, pág. 10/20
7. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que consiste em uma seqüência de aminoácido de um receptor Fltl modificado, selecionada do grupo que consiste em:

(a) sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 12;

5 (b) sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 14; e (c) sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 16.

Petição 870170001062, de 05/01/2017, pág. 11/20

1/55 ;··