WO1993025701A1

WO1993025701A1 - Anticorps monoclonal agissant contre l'apoproteine d du surfactant des poumons humains et utilisation de cet anticorps

Info

Publication number: WO1993025701A1
Application number: PCT/JP1993/000768
Authority: WO
Inventors: Takeshi Inoue; Eiji Matsuura; Yoshio Kuroki; Toyoaki Akino; Shosaku Abe
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 1992-06-09
Filing date: 1993-06-08
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 1994-12-09
Also published as: DE69333283T2; EP0602248A4; EP0602248B1; AU4355093A; EP0602248A1; CA2115171A1; CA2115171C; DE69333283D1; ATE253643T1

Description

明細ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dに対するモノクローナル抗体およびその用途技分野

本発明は、ヒト肺サファクタントアポ蛋白 D に特異的に結合するモノクロナル抗体およびその用途に関するものである。 .

背景技術

肺は管腔臓器であり、直接外気に接する肺胞の表面は肺胞被覆層と呼ばれる外膜で被われている。肺胞被覆層の主成分はリン脂質に富んだ肺表面活性物質（肺サーファクタント）である。

肺サ一ファクタントはリン脂質（主成分はジパルミトィルホスファァチジルコリン： D P P C とホスファチジルグリセロール： P Gである）と蛋白質（約 1 0 %含有）からなるリポ蛋白であり、肺胞の空気一液体界面の表面にリン脂質が配列して肺胞の表面張力を低下させるように作用している。このため、たとえば羊水中の肺サ一ファクタント量は胎児の肺の成熟度を反映するものと考えられている。

肺サーファタタントの蛋白質部分は肺サ一ファクタントアポ蛋白（現在まで、肺サ一ファクタントアポ蛋白 A 同 B、同 C および同 Dの 4 種の存在が知られてい ¾ ) と呼ばれ、肺サーファクタント機能の発現、代謝調節、生体防御機構などにおいて重要な役割を演じていることが明ら力、にされつつある。

肺サ一ファクタントが関与する疾患としては新生児呼吸窮迫症候群（ I R D S ) 、成人呼吸窮迫症候群（ A R D S ) などが報告されている。 I R D S の新生児は、肺胞中の肺サーファクタント含量が低下して肺胞が虚脱するために安定した呼吸機能が維持できなくなる。

したがって、分娩前に羊水中の肺サーファクタント含量を測定し、生まれてくる胎児が I R D Sであるか否かを判断し、もし胎児が I R D Sである場合には出生後直ちにサーファクタントのリボソーム製剤などを投与することが可能である。

従来、羊水中の肺サーファタタントの量を測定する方法としては、レシチンとスフインゴミエリンの比（ L / S比）の測定や D P P Cの量の測定など、リン脂質に着目した方法であつたが、これらの方法は疾患との相関性が低く、定量性に欠 'け、操作性に難があるなどの種々の問題点を有し、満足できる方法ではなかった。

リン脂質に着目した方法の問題点を解決するために肺サ一ファクタントの蛋白質部分、すなわち肺サーファクタントアポ蛋白に着目し、この蛋白質に対する抗体を用いて肺サーファクタンドを検出または測定しょうとする試みも'報告されている（たとえば、特開.昭 6 2 — 6 4 9 5 6 号、特開平 4 一 9 6 6 5 号、 W 0 8 9 / 0 2 0 7 5 号、 W 0 8 9 / 0 1 6 2 4 号など参照）。

ヒト肺サーファクタントアポ蛋白は、上述したように A〜Dの 4 種類の存在が知られている。肺サーファクタントアポ蛋白 Aは分子量 2 8〜 3 8 kD a (還元条件）の親水性の蛋白質で、主に肺サーファクタントの代謝調節に関与しており、肺サ一ファクタントアポ蛋白 Bおよび C はそれぞれ分子量 8 k D a (還元条件）及び 3〜 4 k D a (還元条件）の疎水性の蛋白質で、主に肺サーファクタント自体の機能発現に関与している。

肺サーファクタントアポ蛋白 Dは分子量 4 3 kD a (還元条件）の親水性蛋白質で、その機能は充分に解明されていないものの、肺サ一ファクタントアポ蛋白 A〜（：とは異なる作用を有するであろうことが報告されている。また、肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dの羊水中での経時変化も肺サ一ファクタントアポ蛋白 Aのそれとは相違し、その機能との関連から肺組織中での肺サーファク夕ントアポ蛋白 D の検出や血中、気管支肺胞洗浄中、および羊水中の肺サーファク夕ントアポ蛋白 Dの定量および経時変化を正確に測定することに興味がもたれている。

よって、本発明の目的はヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dを特異的に検出または測定することのできるモノクローナル抗体を提供することにあり、他の目'的は得られたモノクローナル抗体を利用してヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dを特異的に検出または測定するための方法およびキットを提供することにある。発明の開示

本発明者らは、上記目的を達成すべく研究を重ねた結果、上記目的に合致したモノクローナル抗体を効率よく取得することに成功し、このモノクローナル抗体を使用することによりヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dを特異的に検出または測定できることを知見し、本発明を完成させた。

したがって、本発明はヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dに対して特異的に結合するモノクロ一ナル抗体に関するものである。

また、本発明は上記モノクローナル抗体を測定試薬として使用することを特徴とするヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dの測定法及びキットに関するものである。

さらに、本発明は上記モノクローナル抗体を抗体試薬として使用することを特徴とするヒト肺組織中におけるヒト肺サーファクタン卜アポ蛋白 Dの存在を検出するための方法及びキッ卜に関するものである。

図面の簡単な説明 '

図 1 は、モノクローナル抗体のィ厶ノブロッティング法による特異性を示したものである。

図 2 は、モノクローナル抗体（ 6 B 2 ) の反応性を示したものである。

図 3 は、モノクローナル抗体（ 7 C 6 ) の反応性を示したも'の.である。 '

図 4 は、モノクローナル抗体（ 6 B 2 及び 7 C 6 ) のィ厶ノブ口ッティング法における交叉反応性を示したものである。

図 5 は、モノクローナル抗体（ 6 B 2 及び 7 C 6 ) のサンドイッチ E L I S Aにおける交叉反応性を示したものである。

図 6 は、サンドイッチ E L I S Aにおける検量線を示したものである。

図 7 は、サンドイッチ E L I S Aにおける希釈試験の結果を示したものである。

図 8 は妊婦羊水中の肺サーファクタントアポ蛋白 D

( S P — D ) 濃度を、サンドイッチ E L I S Aで測定した結果を示したものである。

図 9 は、肺胞蛋白症患者及び健常人の気管支肺胞洗浄液中の S P — D濃度を、サンドイッチ E L I S Aで測定した結果を示したものである。

図 1 0 は、各種呼吸器疾患（肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺小細胞癌、サルコィドーシス、肺結核、肺気腫、肺炎）を伴う患者及び健常人の血清中 S P - D濃度を、サンドィツチ E L I S Aで測定したものである。

図 1 1 は、各種呼吸器疾患（特発性間質性肺炎、膠原病合併間質性肺炎、肺胞蛋白症、気管支喘息、気管支拡張症、汎細気管支炎、ハシモト病、バセドウ病）を伴う患者及び健常人の血清中 S P — D濃度を、サンドイッチ E L Γ S Aで測定した結果を示した.ものである。'

図 1 2 は、モノクローナル抗体（ 6 B 2 ) を用いて肺腺癌組織を免疫染色した時の結果を示したものである。図 1 3 は、モノクローナル抗体（ 6 B 2 ) を用いて肺扁平上皮癌組織を免疫染色した時の結果を示したものでめる

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について詳述する。

1 . モノクローナル抗体

( 1 ) 特性

本発明のモノクロ一ナル抗体はヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、その他の特性は何ら制限されるものではないが、典型的には下記の特性を有する。このようなモノクローナル抗体を使用することにより、サンプル中のヒ卜肺サーファクタントアポ蛋白 D を特異的に検出または測定することが初めて可能となったのである。

①特異性

後述の実施例に示すィ厶ノブロッティング法で抗体の特異性を調べると、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白 D に特異的に反応する。

②反応性

後述の実施例に示す E L I S A法により抗体の反応性を調べると、抗体の濃度に依存してヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D と反応する。

③交叉性 · 後述の実施例に示すィムノブロッティング法およびサンドイッチ E L I S A法により抗体の反応性を調べると、ヒト由来の肺サ一ファクタントアポ蛋白 A、同 B及び同 C とは実質的に反応しないか、反応する場合でもヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dの測定上なんら影響を及ぼさない。

④種特異性

後述の実施例に示すィ厶ノブ α ッティング法およびサンドィツチ E L I S Α法により抗体の反応性を調べると、他の動物（ラット）由来の肺サーファクタントアポ蛋白 D とは実質的に反応しないか、反応する場合でもヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dの測定上なんら影響を及ぼさない。

(2) 製造法

上述の本発明のモノクローナル抗体は公知の方法を適宜応用することにより製造することができる。

使用する免疫原はヒト肺サーファクタントアポ蛋白 D であるが、このものは例えば、ヒ卜気管支肺胞洗浄液から、好ましくは肺胞蛋白症患者の気管支肺胞洗浄液から Persson らの方法（J. Biol. C em. 2 6 5 , 5 7 5 5 , 1 9 9 0 ) などにより調製することができる。免疫原の精製度は特に制限されない。

また、ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dのアミノ酸配列の一部に対応したぺプチドを公知の方法により化学的に調製し、これを免疫原として使用してもよい。合成したペプチドの抗原性が乏しい場合には、ゥシ血清ァルブミン、キーホーノレリンぺットへモシァニンなどのノヽプテン抗原の抗体製造に常用されている高分子担体との複合体を免疫原として用いるのが好ましい。さらに、公知の D N A組換え手法を用いて調製した組換え型ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dを免疫原として使用してもよい °

免疫原を投与する動物としては、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、ラット、マウス、モルモット、ィヌ、ブ夕、ゥサギ、サル、ノ、ト、ニヮトリなどいずれであってもよく、特にマウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ャギなど力く使用上好都合である。

このような動物への免疫原の投与は常法に従って行えばよく、たとえば、完全フロインドアジンド、不完全フロインドアジュノくンド、ミョウノくンアジュノくンド、水酸化アルミニウムアジンド、百日咳菌アジュノくンドなどの各種アジュバンドと上述の免疫原とのェマルジヨンを調製し、これを上記動物の静脈内、腹腔内、皮下または皮内に投与すればよい。

投与量は、動物としてゥサギ、モルモットを使用する場合には蛋白量として 0. 0 1 〜 1 0 mg Z匹、またはマウス、ラットを使用する場合には、 0 . 0 0 1 〜 1 mg Z匹程度が好適である。 '

初回投与後、 1 〜 4 週間おきに 1 〜 5 回程度の上記と同様の追加免疫を行うことにより、動物体内でヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dに対する抗体産生を誘導する。次に、抗体産生を誘導した動物から脾細胞、 ύ ンパ節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産生細胞を常法により取得する。

抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。通常、 8 — ァザグァニン耐性株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン一グァニンホスフオリボシノレトランスフェラーゼ ( hypoxant ine guanine phosphor i bosy 1 transferase) を欠損し、ヒポキサンチン · アミノプテリン ' チミジン ( H A T ) 培地に生育できない。また細胞 ©性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞株であることが好ましい。

ミエローマ細胞株の具体例としては、 P 3 X 6 3 A g 8 ( A T C C T I B - 9 ) (Nature, 2 5 6 , 4 9 5 — 4 9 7 ( 1 9 7 5 ) ) 、 P 3 x 6 3 A g 8 U . 1 ( P 3 U 1 ) ( A T C C C R L - 1 5 9 7 ) ( Current Topics in Microbiology and Immunology, 8 J_, 1 一 7 ( 1 9 7 8 ) ) 、 P 3 x 6 3 A g 8. 6 5 3 ( A T C C C R L - 1 5 8 0 ) ( J. Immunology, 1 2 3 ， 1 5 4 8 - 1 5 5 0 ( 1 9 7 9. ) ). 、 P 2 / N S I / 1.— A g. 4 — 1 ( A T C C T I B - 1 8 ) ( Europian J. Immunology, 6 , 5 1 1 — 5 1 9 ( 1 9 7 6 ) ) 、 S p 2 / 0 - A g 1 4 ( A T C C C R L - 1 5 8 1 )

( Nature, 2 7 6 , 2 6 9 — 2 7 0 ( 1 9 7 8 ) ) などのマウスミエローマ細胞株、 2 1 0 . R C Y . A g 1 . 2 . 3 ( Y 3 - A g 1 . 2 . 3 ) ( A T C C C R L - 1 6 3 1 ) ( Nature, 2 7 7 > 1 3 1 - 1 3 3 ( 1 9 7

9 ) ) などのラットミエローマ細胞株、 U— 2 6 6 — A R 1 ( Proc. Nat 1. Acad. Sci . U. S. A. , 7 7 , 5 4 2 9

( 1 9 8 0 ) ) , G M 1 5 0 0 ( Nature, 2 8 8 , 4 8 8 ( 1 9 8 0 ) ) 、 K R - 4 ( Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 7 9， 6 6 5 1 ( 1 9 8 2 ) ) などのヒトミエローマ細胞株を例示することができる。 ―

細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエローマ細胞を選定する。

細胞融合は、イーグルの最少必須培地（ M E M) 、ダルべッコ変法イーグル培地（ D M E M ) 、 R P M I - 1 6 4 0 培地などの動物細胞培養用培地中で 1 0 ⁶ 〜

1 0 ⁸ 細胞 Zmlのミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比 1 ： 4 〜 1 0 に混合し、 3 7 °Cで 1 〜 1 0 分間細胞同士を接触させることにより効率よく融合を行うことができる。細胞融合を促進させるため、平均分子量 1， 0 0 0 〜 6， 0 0 0 のポリエチレングリコール（ P E G ) 、ポリビニールアルコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を使用することができる。また、電気パルスを利用し . た市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることもできる。

細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利用する方法を用いることができる。たとえば、細胞懸濁液を 1 5 %ゥシ胎児血清（ F C S ) 含有 R P M I 一 1 6 4 0 培地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に 1 0 ³ 〜 1 0 ⁶ 細胞ゥヱル程度まき、各ゥエルに選択培地（たとえば、 H A T培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。ミエローマ細胞として 8 —ァザグァニン耐性株、選択培地として H A T培地を用いた場合は、未融合のミエローマ細胞は培養 1 0 日目ぐらいまでに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロ（ i n v i t r o) では長期間生育できないので、培養 1 0〜 1 4 日目から生育してくる細胞をハィブリドーマとして得ることができる。

ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dを認識するモノク口一ナル抗体を産生するハイプリドーマの検索は、酵素免疫測定法（ E I A、 E L I S A ) 、ラジオィムノアツセィ（ R I A ) などによって行うことができる。たとえば、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dを吸着させた 9 6 ウエノレ E L I S A用マイクロプレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加してヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D と反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、あるはピオチン標識抗免疫グロプリン抗体を反応させたのちァビジン D—酵素標識体を反応させ、次いでいずれの場合とも各ゥエルに酵素基質を加えて発色させる。ヒト肺サーファク夕ントアポ蛋白 Dを固定化したゥエルのみで発色する培養上清を選別することにより、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白 D と特異的に反応する抗体を産生するハイプリドーマを検索することができる。

また、上記スクリーニングにおいて使用するヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D としては精製度の高いものが好ましく、たとえば、 9 0 %以上の精製度のものを使用することにより本発明のモノク α —ナル抗体を効率的にスクリーニングすることができる。

ハイプリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フイブリンゲル法、蛍光励起セルソー夕一法などにより行うことができる。

このようにして取得したノヽイブリドーマからモノクローナル抗体を産生する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。

細胞培養法においては、ハイブリドーマを 1 0 〜 1 5

% F C S 含有 R Ρ Μ I - 1 6 4 0 培地、無血清培地などの動物細胞培養用培地中で通常の方法で培養し、その培養上清液から抗体を取得することができる。

腹水から回収する方法では、ハイプリドーマと腫瘍組織適合性が一致する動物に、プリスタン（ 2 , 6 , 1 0 ,

1 4 ーテトラメチルペン夕デカン）などの鉱物油を腹腔 . 内に投与した後、たとえばマウスの場合にはハイブリド一マを約 1 0 ⁶ 細胞ノ匹腹腔内投与する。ハイプリドーマは 1 0 〜 1 8 日ほどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体を生産する。

抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、 D E A E セルロースなどの陰イオン交換体を利用するィォン交換クロマトグラフィー、プロテイン A —セファロースなどを用いるァフィ二ティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィ一などの公知の方法を適宜に選択し、組み合わせることにより精製することができる。 2. 測定法及びキット

本発明の測定法は上述の本発明のモノクローナル抗体を試薬と、して使用することを特徴としており、測定原理、条件等には制限されない。

反応様式による分類として、競合反応法と非競合反応法（ィムノメトリックアツセィ）が知られており、本発明においてはいずれの方法も採用できる。

検出方法による分類として、抗原抗体反応の結果を直接検出する非標識法（ネフェロメトリーなど）と、なんらかのマーカーを使用して検出する標識法が知られているが、本発明ではいずれの方法によってもよい。

B F分離を行う必要のあるへテロジニァス法と必要のないホモジニァス法が知られており、本発明にはいずれの方法を適用してもよい。

- 反応相による分.類として、全反応が液相で行われる液相法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法が知られているが、本発明においてはいずれの方法も採用できる。

これら、公知の一般法の中から、本発明の測定法の目的に適合する方法を適宜選択すればよい。

なお、一般的方法の詳細についてはたとえば以下の文献に詳細に記載されている。

①入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」（（株）講談社、昭和 5 4 年 5 月 1 日発行）

②石川英治ら編「酵素免疫.測定法」（第 2 版）（（株）医学書院、 1 9 8 2 年 1 2 月 1 5 日発行）

③臨床病理臨時増刊特集第 5 3 号「臨床検査のためのィ厶ノアツセィ —技術と応用一」（臨床病理刊行会、

1 9 8 3 年発行）

④ 「ノくィォテクノロジ一事典」（（株）シーエムシー、 1 9 8 6 年 1 0 月 9 日発行）

⑤ 「 Methods in ENZYMOLOGY Vol. 70 J

( Immunochemical techniques (Part A) )

⑥ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 73 」

( Immunochemical techniques (Part B) )

⑦ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 74 」

( Immunochemical techniques (Part C) )

⑧ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 84 」 '

( Immunochemical techniques (Part D ： Selected Immunoassay) )

⑨ 「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 92 」 ( Immunochemical techniques (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods" 〔⑤〜⑨はァ力デミックプレス社発行〕

また、本発明の測定法で使用する本発明のモノクロ一ナル抗体の使用態様は採用する測定法に応じたものに適宜誘導すればよい。具体的には標識化抗体、固相化抗体などを例示できる。

使用する抗体は抗体そのものであってもよいが、非特異的な吸着を防止する意味から抗体の活性フラグメントを使用するのが好ましい。

抗体の活性フラグメントは、抗体の特徴を保持するもの（たとば、 F(ab' )₂、 Fab' 、 Fab などの各種フラグメント）であればいずれのものであってもよい。これら活性フラグメントの調製は、精製抗体をパパイン、ぺプシン、トリプシンなどのプロテア一ゼを用いて限定分解する方法など公知の方法を適用して行うことができる (たとえば「免疫生化学研究法（続生化学実験講座 5 ) 」、日本生化学会編、 8 9 頁（ 1 9 8 6 年）参照）。

抗体に結合させる標識剤としては、放射性同位体（たとえば ³² P、 ³ H、 ¹⁴ C、 ^{1 25} I など）、酵素（たとえば /3 — ガラクトシダ一ゼ、ペルォキシダ一ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース — 6 — リン酸デヒドロゲナ —ゼ、力夕ラーゼ、グルコースォキシダーゼ、乳酸ォキシダーゼ、アルコ ^ "ルォキシダーゼ、乇ノアミンォキシダーゼなど）、補酵素 · 補欠分子族（たとえば、 F A D、 F M N、 A T P . ピオチン、ヘムなど）、フルォレセィン誘導体（たとえば、フルォレセインイソチオシァネート、フルォレセインチオフノレノくミルなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミン B イソチォシァネートなど）、ゥムベリフエロンおよび 1 — ァニリノー 8 — ナフ夕レンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノール誘導体（たとえば、ルミノール、イソルミノール、 N - ( 6 — ァミノへキシル）一 N — ェチルイソノレミノールなど）などを用いること.ができる。抗体またはその活性フラグメントと標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（ 1 9 8 6 年発行）第 1 0 2 〜 1 1 2 頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。

抗体を固定するための担体物質の材質としては、たとえばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン — ジビニルベンゼン共重合体、スチレン一無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリノレァミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セフアデックスなど）、ァガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セル'口一ス (ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリ力.ゲル、 'シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはァミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、ァシル基、水酸基などの官能基を導入したものであってもよい。なお、担体物質の材質は蛋白質の結合能の低いものが好ましく、このような材質としては未処理のポリスチレン、ポリ塩化ビニルが例示される。

担体物質の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などが例示され、測定法に応じた適宜な形状の担体を選択することができる。また、リボソーム（単層または多層の脂質膜）なども抗体を固定するための担体物質として使用することもできる。

モノクローナル抗体と担体物質との結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和 5 0 年 3 月 2 0 日、（株）講談社発行）参照）を採用することができる。とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は、直接行ってもよく、両物質の間に他の物質を介して行ってもよい。

測定対象のサンプルとしては、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dを含有するものであれば特に制限されない。たとえば、羊水、肺胞洗浄液、血液、血清、血漿などを例示することができる。

上記測定法に使用するキットは、本発明のモノクロ一ナル抗体をキット'の構成試薬の 1 つとして含有することを特徴とするものであり、キッ卜の他の試薬構成は採用した測定法によって異なっていてもよい。

競合反応法に基づくキットの場合には、たとえば以下の試薬構成をとりうる。

①固相化抗原（抗体）

②標識化抗体（抗原）溶液

③既知濃度の抗原液

また、サンドイッチ法に基づくキットの場合には、たとえば以下の試薬構成をとりうる。

①固相化第一抗体

②第二抗体溶液

③標識化抗ィ厶ノグ口ブリン抗体溶液

④既知濃度の抗原液

上記のキットにおいて、「抗体」とは本発明のモノク α—ナル抗体であり、「抗原」とはヒト肺サ一ファクタン卜アポ蛋白 Dであることはいうまでもない。また、ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D は多価抗原であり、サンドイッチ法に基づくキットの場合には「第一抗体」と「第二抗体」はヒト肺サーファクタントアポ蛋白 D上の同一の抗原決定基を認識するものであってもよく、異なつた抗原決定基を認識するものであってもよい。

また、サンドイッチ法に基づくキッ卜の変型としてはたとえば以下の試薬構成をとりうる。

①固相化第一抗体

②標識化第二抗体溶液

③既知濃度の抗原液 3. 検出法及びキット

本発明の検出法は、肺組織中の肺サーファクタントァポ蛋白 Dを検出するに当たり、前述の本発明のモノクローナル抗体を抗体試薬として使用することを特徴としている。したがって、標識剤、抗体の標識方法及び標識化した抗体を使用した検出方法は免疫組織診断法において常用されている方法をそのまま適用することができる。

すなわち、標識剤としては上述した放射性同位体、酵素、補酵素 ■ 補欠分子族、蛍光色素、ルミノール誘導体などを使用できる。このような標識剤を結合させる抗体は、抗体自体でもよく、そのフラグメントであってもよい。抗体またはそのフラグメントと上記標識剤との結合は常法によって行うことができる。また、抗体の標識は、標識化抗ィ厶ノグ口ブリン抗体などを用いて間接的に行なってもよレ、。

このようにして調製した標識化抗体を常法にしたがつて肺組織標本に作用させ、抗体に結合させた標識剤を視覚化することにより'肺組織中の肺サーファクタントアポ蛋白 Dを検出することができる。

上記検出法において標識剤として酵素を用いた場合、キットとしては下記の構成試薬をとりうる。

①酵素標識化抗体

②基質溶液

また、 .上記キッ小の変形としてピオチン一アビジン法を採用すれば、キットは下記の試薬から構成される。 ① ビォチン化抗体

②ァビジン化酵素

③基質溶液

なお、上記のキットにおいて、「抗体」とは本発明のモノクローナル抗体であることはいうまでもない。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。実施例 1 ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D ( S P - D ) に対するマウスモノクローナル抗体の作製

①モノクローナル抗体産生ハイプリドーマの作製

公知の方法 ( Persson, A. at al , J. Biol. Chem. 2 6 5， 5 7 5 5 , ( 1 9 9 0 ) ) により調製したヒト S P— Dを生理食塩水に溶解させ（0. 4 mgZml) 、完全フロイントアジュノくンドと 1 ： 1 の比率で混合してェマルジョンとしたものを B A L B Z cマウス（雌、 6週令）の腹腔内に 2 0 fi g / 1 0 0 μ.1 投与（ i.p.) して初回免疫とした。初回免疫後、 2週間おきに数回、同様の方法で免疫（ i.P.) した後、最終免疫としてヒト S P— D の生理食塩水溶液をマウスの尾静脈に 5 a g / 2 0 0 1 投与（ i.v.) した。

最終免疫から 3 日後にマウスの脾臓を摘出し、 R P M I - 1 6 4 0培地で洗浄して脾紬胞浮遊液を調製した。同時にマウスミエ口一マ P 3 x 6 3 A g 8 U l ( P 3 U 1 ) ( A T C C C R L — 1 5 9 7 R P M I — 1 6 4 0培地で洗浄し、脾細胞と P 3 U 1 を 1 0 ： 1 で混合した後、遠心分離して得たペレツトに 5 0 %ポリエチレングリコール（ P E G ) 1 0 0 0 含有 R P M I — 1 6 4 0 培地溶液 1 m 1を徐々に加えて細胞融合を行った。さらに、 R P M I - 1 6 4 0 培地溶液を加えて 1 0 mlとし、遠心分離して得たペレツトを 1 %ゥシ胎児血清（ F C S ) 含有 R P M I — 1 6 4 0 培地に P 3 U 1 として 3 X 1 0 細胞 0. 1 mlとなるように懸濁させ、 9 6 ゥエルマイク口タイタープレー卜に各ゥヱノレ 0. 1 mlずつ分注した。翌日、ヒポキサンチン一チミジン一アミノプテリン含有 R P M I - 1 6 4 0 培地（ H A T培地）を 0. 1 ml添加し、その後 3〜 4 日ごとに培地の半分量を新しい H A T培地で交換した。

融合から 1 4 日目にハイプリドーマのスクリーニングをした。すなわち、あらかじめヒト S P — D ( 1 0 fi g /ml) をコートし、 2 5 %ブロックエース（大日本製薬社製）含有 P B Sでブロッキングした 9 6 ウェルマイク口夕イタ一プレートに培養上清 5 0 a 1 を添加し、室温で 1 時間反応させた。 P B S 2 0 0 // 1 で 3 回洗浄した後、ピオチン化抗マウス I gG (ベクタ一社製）溶液 5 0 1 を加えて室温でさらに 1 時間反応させた。反応後、 P B Sで 3 回洗浄し、アビジン D—ペルォキシダーゼ

(ベクター社製）溶液 5 0 1 を加えて室温で 3 0 分間反応させた。さらに P B Sで同様に洗浄し、基質溶液 ( 4 —ァミノアンチピリン（ 0. 2 5 mg/ml) 、フエノール（ 0. 2 5 mg/ml) 、. 0. 4 2 5 M過酸化水素含有） .2 0 0 1 を加えて室温で反応させ、 5 5 0 nmの吸光度を測定してヒト S P — Dに特異的に反応する抗体を検出し特異抗体産生ハイブリドーマを選別した（表 1 ) 。

1 抗原特異抗体細胞増殖全ゥル数陽性ゥル数ゥエルヒ卜

SP-D 9 4 6 6 0 9 4 0 このようにして選別した各ハイブリドーマをさらに限界希釈法を用いてクローニングし、ヒト S P — D に対し極めて特異性の高い抗体を産生するハイブリドーマ 9 株

( 1 G 1 1 、 3 E 4、 3 H 4 、 5 A 4、 6 B 2、 7 A 1 0、 7 C 6、 9 E 1 、 1 0 H 1 1 ) を樹立した。

②モノクローナル抗体の調製および精製

これら 9 種の樹立株細胞を、あらカ、じめプリス夕ン 0. 5 mlで処理したマウスの腹腔内へ 3 X 1 0 ⁶ 個ずつ投与し、約 2 週間後に腹水を採取した。次に上記の腹水中から G を精製するためプロテイン A — セファロースカラ厶によるァフィ二ティークロマトグラフィーを行った。まず、プロテイン A — セファロース（フアルマシア社製） 2 0 mlを 1, 5 x 2 0 cmのガラス製カラムに充填し、 3 M塩化ナトリウムを含む 1. 5 Mグリシン緩衝液（ pH8. 9 ) にて平衡化した。次に、先の腹水を等量の同グリシン緩衝液で 2 倍希釈してカラムに加え充分量の同グリシン緩衝液で非吸着蛋白を洗浄除去した後、吸着した IgG を 0. 1 M クェン酸緩衝液（ pH3. 0 ) にて溶出した。こうして得られた IgG 画分を変性を避けるため速やかに P B S に対して 1 晚透析した。

実施例 2 モノクローナル抗体の性質の解析① （クラス . タイプの検索 )

ヒ卜 S P - D ( 1 0 n g /ml) をコートし、 2 5 %ブロックエース (大日本製薬社製）含有 P B S でブロッキング処理を施してある 9 6 ウェルマイクロタイタープレ一トにハィブリドーマの培養上清または精製モノクロ一ナル抗体溶液を添加し、 MonoAb— ID EIA キット（Zymed 社製）を用いて抗体のクラス、タイプの検索を行った。結果は表 2 に示す通りである。表 2 ク α ン IgG クラス Zタイプ

1G11 IgGl / κ

3E4 IgGl / κ

3H4 IgGl / κ

5A4 IgG2a/ κ

6B2 IgGl / κ

7A10 IgGl K

7C6 IgGl K

9E1 IgGl K

10H11 IgGl K

実施例 3 モノクローナル抗体の性質の解析② .（モノク口一ナル抗ヒト S P — D抗体の抗原特異性）ノヽイブリドーマ（ 1 G 1 1 、 3 E 4 、 3 H 4 . 5 A 4 、 6 B 2 、 7 A 1 0 , 7 C 6 、 9 E 1 、 1 0 H 1 1 ) の産生するモノク □ ーナル抗体（抗体名はそれを産生するハイブリドーマ名と同じである）の抗原特異性の確認は S D S — ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ S D S — P A G E ) を用いたィムノブロッテイング法および酵素免疫測定法（ E L I S A ) により行った。

(A) ィムノブロッテイング法による特異性の解析

S D S — P A G E は Lamral iの方法（Nature, 2 2 7 ： 6 8 0 ， 1 9 7 2 ) に準じ行った。ィムノブロッテイング法の基本操作は次の通りである。すなわち、 S D S — P A G E によって得られた分離ゲルをニトロセルロース膜に乗せ、 6 0 V、 1 2 時間通電してニトロセルロース膜に蛋白を転写した。こうして得られたニトロセルロース膜を試料の泳動ラインに沿って短冊上に切断し、一部はアミドブラックを用いて蛋白を染色した。他の膜は 0. 5 % Triton X- 1 0 0 及び 2 %スキムミルク含有 P B S に 3 7 °C、 1 時間浸してブロッキング処理を行った後、 P B Sで適宜希釈したモノクローナル抗体溶液を室温で 1 時間反応させた。 P B Sで充分洗浄した後、ペルォキシダーゼ標識抗マウス G 抗体を室温で 1 時間反応させた。さらに、ニトロセルロース膜を同様に洗浄し、基質溶液（カラーディベロッパー（バイオラッド社製） 3 0 mg、メタノール 1 0 ml、 P.B S- 5 0 mし 3 0 %過酸化水 . 素水 3 0 1 含有）と反応させ、適当に発色した時点で水洗いをして反応を停止させた。

ヒト S P - Dは、還元条件下、分子量 4 3 kDa を示す。ヒト S P — D画分を還元条件下で電気泳動し、ィムノブロッティング法によりモノクローナル抗体の反応特異性を調べた。その結果、図 1 に示したように 9 種のモノクローナル抗体（レーン 1 ： 1 G 1 1 、レーン 2 ： 3 E 4 、レーン 3 ： 3 H 4 、レーン 4 ： 5 A 4 、レーン 5 ： 6 B 2 、レーン 6 : 7 A 1 0 、レーン 7 : 7 C 6 、レーン 8 ： 9 E 1 、レーン 9 ： 1 0 H 1 1 ) はいずれも分子量 3 kDa のヒト S P — Dに極めて強い反応性を示した。また、モノクローナル抗体（ 7 C 6 ) は調製時に派生したと思われる分子量約 3 8 kDa のヒト S P — D の分解物に対しても極めて強い反応性を示した。

(B) E L I S Aによる特異性の解析

精製ヒト S P — Dの 5 mMトリス溶液（ 1. 0 g /mK pH7. 4 ) を 5 0 n 1 ずつ 9 6 ウェルマイク口夕イタ一プレートの各ゥエルに添加し、 4 °Cで 1 晚放置した後、 P B S で 3 回洗浄した。 0. 5 % Tr it on 1 0 0 — X及び 2 %スキムミルク含有 P B S 2 0 0 1 を各ゥエルに添加し、室温で 1 時間放置してブロッキングを施した。 P B Sで 3 回洗浄した後、モノクローナル抗体溶液 5 0 〃 1 を入れ室温で 1 時間反応させた。 P B S 2 0 0 // 1 で 3 回洗浄した後、ピオチン化抗マウス IgG (ベクタ一社製）溶液 5 0 1 を加えて室温でさらに 1 時間反応させ . た。反応後、 P B Sで 3 回洗浄し、アビジン D —ペルォキシダーゼ（ベクタ一社製）溶液 5 0 1 を加え、室温で 3 0 分間反応させた。さらに P B Sで同様に洗浄し、基質溶液（ 0 — フ二レンジァミン（ 0. 2 mg/ml) 及び 0. 4 2 5 M過酸化水素含有 0. 1 Mクェン酸緩衝液 pH5. 0 ) 1 0 0 // 1 を加えて室温で反応させた後、 2 N硫酸 1 0 0 u 1 を加えて反応を停止させ、 4 9 2 nniの吸光度を測定した。図 2 及び図 3 に示すごとく、モノクローナル抗体（ 6 B 2 および 7 C 6 ) のヒト S P — D ( 1. 0 Pi g /ml) に対する反応性は濃度依存的であった。結果は示していないが、他のモノクロ一ナル抗体（ 1 G 1 1 、 3 E 4 、 3 H 4 、 5 A 4 、 7 A 1 0 . 9 E 1 、 1 0 H 1 1 ) に関し、ても同様の現象を確認している。

実施例 4 モノクローナル抗体の性質の解析③ （モノクローナル抗ヒト S P — D抗体の交叉反応性）

ハイプリドーマの産生するモノクローナル抗体（ 6 B 2 及び 7 C 6 ) のヒト S P — Aおよびラット S P — Dに対する交叉反応性の確認を S D S — P A G E を用いたィ厶ノブロッティング法およびサンドイッチ E L I S Aにより行った。

ヒトおよびラット S P — Dは前述した Persson らの方法により、またヒト S P — Aは Kurokiらの方法（ Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A. 8 5 , 5 5 6 6 , 1 9 8 8 ) により調製した。

(A) ィ厶ノブロッティング法.による交叉.反応性の解析

ヒト S P — D画分、ヒト S P — A画分、ラット S P — D画分およびヒト羊水（妊娠 3 8 週）を還元条件下で電気泳動し、ィムノブロッティング法にてモノクローナル抗体の交叉反応性を調べた。

ブロッテイングの結果より（レーン 1 ：ヒト S P — D、レーン 2 ：ヒト S P — A、レーン 3 ：ラット S P — D、レーン 4 ：ヒト羊水）、それぞれのモノクローナル抗体 ( 6 B 2 及び 7 C 6 ) は分子量 4 3 kDa のヒト S P — D、ヒト S P — Dの二量体と思われる約 9 0 kDa の蛋白質及びヒト羊水中の S P — Dに対して極めて強い反応性を示した。また、モノクローナル抗体（ 7 C 6 ) は、ヒト S P — D調製時に派生したと思われる分子量約 3 8 kDa のヒト S P — D分解物に対しても極めて強い反応性を示した。これに対し、両モノクローナル抗体とも還元条件で分子量約 2 6〜 3 8 kDa を示すヒト S P — Aに対しては全く反応性を示さず、ヒト S P — A画分中に微量に混在すると思われる分子量 4 3 kDa のヒ卜 S P — Dに対してのみわずかに反応した。一方、両モノクローナル抗体はラット S P — D (還元下、分子量約 4 3 kDa を示す）に対してはほとんど反応性を示さなかった（図 4 ) 。

(B) サンドイッチ E L I S Aによる交叉反応性の解析本発明のモノクローナル抗体（ 6 B 2 及び 7 C 6 ) のヒト S P — A及びラット S P — D に対する交叉反応性を両モノクロ一ナル抗体を用いたサンドィツチ E L I S A により調べた。サンドイッチ E L I S Aの基本操作法は次の通りである。モノクローナル抗体（ 6 B 2 ) の P B S溶液 1 0 〃 g mlを 5 0 μ. 1 ずつ 9 6 ウエノレマイクロタイ夕一プレートの各ゥヱルに添加し、 4 °Cで 1 晚放置した後、 P B S で 3 回洗浄した。 0. 5 % Triton X- 1 0 0 及び 2 %スキムミノレク含有 P B S 2 0 0 〃 1 を各ゥエルに添力 [J し、さらに室温で 1 時間放置してブロッキングを施した。 P B Sで 3 回洗浄した後、ヒト S P — Dの P B S溶液を 5 0 1 を添加し、 4 °Cで 1 晚放置した。 P B S 2 0 0 〃 1 で 3 回洗浄した後、ピオチン化モノクローナル抗体（ 7 C 6 ) の P B S溶液（ 0. 5 % Triton X- 1 0 0 及び 0. 1 %スキムミノレク含有） 1 0 z g /mlを 5 0 u 1 加えて室温で 4 時、間反応させた。反応後、 P B Sで 3 回洗浄し、アビジン D —ペルォキシダーゼ（ベクタ一社製）溶液 5 0 1 を加えて室温で 3 0 分間反応させた。さらに P B Sで同様に洗浄し、基質溶液（ 3 mM 3 , 3 ' , 5 , 5 ' ーテトラメチルベンジジン及び 0. 0 0 5 %過酸化水素含有 0. 2 Mクェン酸緩衝液 pH3. 8 ) 1 0 0 〃 1 を加え室.温で反応させた後、 2 N硫酸 1 0 0 〃 1 を加えて反応を停止させた後、 4 5 0 nmの吸光度を測定した。

交叉反応性（％ ) は次式により算出した。

50%結合性（吸光度 0. 6 に

相当する）を得るためのヒ

ト S P — D濃度（50 ng/ml)

交叉反応性（％) = X 100

50%結合性（吸光度 0. 6 に.

相当する）を得るための類

似物質濃度（ ng/ml) この結果、ヒト S P — Aに対する交叉反応性は 0. 2 % 以下であり、またラット S P — D に対する交叉反応性は 0. 2 5 %以下であった（図 5 , 表 3 ) 。

なお、同一試料を用いた前述のィムノブロッティングによる交叉反応性の解析では、両抗体（ 6 B 2 及び 7 C 6 ) は 2 6 〜 3 8 kDa の S P — Aに対しては全く反応性を示さず、 S P — A画分中に微量混在するものと思われる S P — D に反応することから、ヒト S P — Aに対する実際の交叉反応性はさら（こ低いものと考えられる。表 3 類似物質 50%結合性を得る交叉反応性ための濃度（ng/ml) (%) ヒト SP-D 50 100

ヒ卜 SP - A >25, 000 <0.2 ラツ 1、 SP-D >20， 000 <0.25

(C) 本発明のモノクロ一ナル抗体は前述の通りヒト S P 一 Dに対して特異的に反応するものであり、そのうち固相化モノクローナル抗体（ 7 C 6 ) 及び Nakaneらの方法 ( Immunoassays in the clinical laboratory. Alan R. Liss Inc. , New York, 81， 1979) により調製した西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ標識化モノクローナル抗体（ 6 B 2 ) の組み合わせを用いることにより、 .ヒト S.P — D に対する特異的かつ高感度なサンドイッチ E L I S Aを確立した。サンドイッチ E L I S Aの基本操作方法は次の通りである。

モノクローナル抗体（ 7 C 6 ) の P B S溶液 1 0 〃 g m l を 1 0 0 〃 1 ずつ 9 6 ウエノレマイクロ夕イタ一プレートの各ゥヱルに添加し、 4 °Cで 1 晚放置した後、 P B Sで 3 回洗浄した。 1 %ゥシ血清アルブミン（ B S A ) 含有 P B S 2 0 0 fi 】を各ゥヱルに添加し、さらに室温で 1 時間放置してブロッキングを施した。 P B Sで 3 回洗浄した後、ヒト S P — Dの 0 . 5 % Triton X- 1 0 0 含有 P B S溶液を 1 0 0 〃 1 添加し、室温で 1 晚放置した。 P B S 2 0 0 1 で 3 回洗浄した後、西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識化モノクローナル抗体（ 6 B 2 ) の 0 . 5 % Triton X— 1 0 0 及び 1 % B S A含有 P B S溶液 2 〃 g Zm l を 1 0 0 ^ 1 加え、室温で 2 時間反応させた。反応後、 P B Sで 3 回洗浄し、基質溶液 ( 0 . 3 m M 3， 3 ' 、 5 , 5 ' —テトラメチルベンジジン及び 0 . 0 0 5 %過酸化水素含有 0 . 2 Mクェン酸緩衝液 P H 3 .' 8 ) 1 0 0 z l を加え、室温で 2 0 分反応させた後、 2 N硫酸 1 0 0 1 を加えて反応を停止させ、 4 5 0 n mの吸光度を測定した。

① 検量線

Persson らの方法により調製した精製ヒト S P — Dの 0 . 5 % Triton X— 1 0 0 含有 P B S溶液を標準物質としてサンドイッチ E L I S Aを行った。その結果濃度 3 . 1 3 n g Zm l 〜 2 0 0 n g Zm l の範囲において、ヒト S P — D濃度依存性の良好な検量線が得られた（図 6 ) o

② 添加回収試験及び希釈試験

本発明のサンドィツチ E L I S Aの基本性能を評価するために、ヒト羊水検体に対する精製ヒト S P — Dの添加回収試験及びヒト羊水検体の希釈試験を行った。添加回収試験においては、ヒト羊水検体に精製ヒト S P— D の 0 . 5 % Triton X— 1 0 0含有 P B S溶液（ 0， 1 2. 5 , 2 5， 5 0 n g. m l ) を加え、サンドイツチ E L I S Aにて測定した。その結果、精製ヒト S P— Dの良好な回収率（ 9 4 . 4〜 1 1 1 . 2 %) が示された（表 4 ) 。一方、ヒト羊水検体を用いた希釈試験では、検体の希釈率と S P — D測定値との間に良好な直線性が示された（図 7 ) 。

表 4

•/mi is ii

o c p r _ J ΠJ ί f Urnu 畏 c p _ n Fnl IN M是. f IHnJl M ιΐXν半

( n o / m 1

( /0、

1 0 8.3

12 5 20 4 12 1 96.8

25 0 31 a 23 6 94 4

50 0 56.0 47.7 95.4

2 0 14.0

12.5 27.4 13.4 107.2

25.0 38.4 24.4 97.6

50.0 62.4 48.4 96.8

3 0 35. 1

12.5 49.0 13.9 111.2

25.0 59.8 24.7 98.8

50.0 82.4 47.3 94.6

③ 交叉反応性

サンドィツチ E L I S Aのヒト S P — D類似物質に対する交叉反応性を調べるため、ヒト S P— A及びラット S P _ D、さらに対照としてヒト S P— Dの段階希釈溶液を調製し、サンドイッチ E L I S Aにおける反応'性を検討するとともに、次式によりそれぞれの交叉反応性を出した。

50%結合性を得るための

ヒト SP - D濃度（60ng/ml)

交叉反応性 0

X 100

50%結合性を得るための

類似物質濃度（ng/ml) この結果、ヒト S P— Aに対する交叉反応性は 0 . 3 % 以下であり、またラット S P— Dに対する交叉反応性は 0 . 6 %であった（表 5 ) 。

なお、同一試料を用いた前述のィムノブロッティングによる交叉反応性の解析では、両抗体（ 6 B 2 及び 7 C 6 ) は 2 6 〜 3 8 kDa のヒト S P — Aに対しては全く反応性を示さず、 S P — A画分中に微量混在するものと思われるヒト S P — D に反応することから、ヒト S P — A に対する実際の交叉反応性はさらに低いものと考えられる o 表 5 類似物質 50%結合性を得る交叉反応性（％) ための濃度（ng/ml) ヒ卜 SP - D 60 100 ヒ卜 SP - D >20480 く 0.3 ラッ卜 SP. 10240 0.6 実施例 5 生体試料中の S P - D濃度の測定

実施例 4 ( c ) のサンドイッチ E L I S Aに従い、妊婦羊水、肺胞蛋白症患者の気管支肺胞洗浄液、さらに間質性肺炎 · 肺胞蛋白症及びその他の呼吸器疾患を伴った患者の血清中の S P — D濃度を測定した。

(A) 妊婦羊水中の S P — D濃度

妊娠 2 6 週〜 4 0 週の妊婦羊水 2 1 検体中の S P — D 濃度を測定した結果、妊娠 3 0 週以上の羊水（ 1 3 例）では、妊娠 3 0 週以下の羊水（ 8 例.）に比べて S P — D 濃度が明らかに高値を示した（図 8 ) 。このことより、羊水中 S P— D濃度は胎児肺の熟成度を反映するとともに、羊水中 S P — D濃度の測定は、 I R D S を伴う胎児の診断に有用である可能性が示された。

( B ) 気管支肺胞洗浄液中の S P - D濃度

肺胞蛋白症患者（ 1 3 例）、特発性肺線維症（ I P F ) 、サルコイドーシス（ S a r ) 及び健常人（ 1 3 例）の気管支肺胞洗浄液について S P - D濃度を測定した結果、肺胞蛋白症患者では、健常人に比べて明らかに S P— D濃度が高値を示すことが示された（図 9 ) 。このことより、気管支肺胞洗浄液中の S P — D濃度の測定は、肺胞蛋白症患者の診断に有用である可能性が示された。なお、 I P Fおよび S a r では健常人の値とほぼ同レ 'めった。

( C ) 各種呼吸器疾患を伴う患者血清中の S P - D濃度

特発性間質性肺炎、膠原病合併間質性肺炎、肺胞蛋白症、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺小細胞癌、サルコィドーシス、肺結核、肺気腫、肺炎、気管支喘息、気管支拡張症、汎細気管支炎等、各種呼吸器疾患を伴う患者、及び対照として健常人の血清中 S P - D濃度を測定した。その結果、特発性間質性肺炎、膠原病合併間質性肺炎等の間質性肺炎及び肺胞蛋白症患者では、健常人に比べて明らかに高値を示した（図 1 0 及び 1 1 ) '。このことより、血清中 S P - D濃度の測定は、上記種々の疾患の鑑別診断に有用であることが示された。

実施例 6 免疫組織染色外科的切除及び剖検によって得られた肺癌組織（腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌）及び他臓器癌組織をホルマリン固定、、。ラフィン包埋し、モノクローナル抗体を用いた A B C法による免疫組織学的検討を行った。

すなわち、組織切片をキシレンをもちいて十分に脱パラフィン化した後、エタノール濃度を段階的に変えて水和し、水洗した。次に 0. 3 %過酸化水素含有メタノール中に室温で 3 0 分間浸すことにより内因性ペルォキシダーゼ活性をのぞき、次いで P B S に 5 分間浸すことで洗浄し、この洗浄を 3 回繰り返した。次に 1 0 %ゥマ血清含有 P B S に室温で 3 0 分間浸すことでブロッキングを施した後、 P B Sで適宜希釈したモノクローナル抗体ヒト S P — D抗体またはモノクローナル抗ヒト S P — A抗体を滴下し、室温で 3 0 分間反応させた後 P B Sで同様に洗浄した。次にピオチン化抗マウス I gG 抗体（ベクタ一社製 ) を滴下し、室温で 3 0 分間反応させた後 P B S で同様に洗浄し、続いて A B C試薬（ベクター社製）を滴下し、室温で 3 0 分間反応させた。 P B Sで 3 回洗浄した後、ペルォキシダーゼ基質溶液（ベクター社製）を滴下して室温で反応させ、適当に発色した時点で水洗をして発色反応を停止させ、切片を封入した。

その結果、 S P — Dは、肺腺癌の 3 6 例中 2 5 例及び肺扁平上皮癌の 5 例中 4 例でそれぞれ陽性であり、他の組織型の肺癌及び他臓器癌ではすべて陰性であつた。. また、参考として行った S P — Aに関しては、肺腺癌の 3 6 例中 1 8 例が陽性であり、 S P — D及び S P — Aの少なくとも一方が陽性なものは 3 6 例中 3 1 例であった。このことから、 S P — Dおよび S P — Aに対する抗体を組み合わせて用いることにより陽性率が向上し、肺原発の腺癌の診断により有用であることを確認した。なお、モノクローナル抗ヒト S P — D抗体（ 6 B 2 ) を用いて肺腺癌及び肺扁平上皮癌由来の肺組織を免疫組織染色させた時の典型的な例を図 1 2 及び図 1 3 に示す。

産業上の利用可能性

本発明のモノクローナル抗体は、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dに特異的に結合するものであり、このようなモノクローナル抗体を抗体試薬として使用することによりヒト肺サ一ファク夕ントアポ蛋白 Dを特異的に検出または測定することが初めて可能となったのである。このため、本発明のモノクローナル抗体はヒト肺サーファク夕ントアポ蛋白 Dの機能解明のための一つのツールとして有用であり、また本発明の検出法または測定法及びそれに使用するキットは、 I R D S、 A R D S、肺胞蛋白症、間質性肺炎、肺腺癌、肺扁平上皮癌などの呼吸器疾患の診断に有用なものと思われる。

Claims

請求の範囲

1 . ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dに対して特異的に結合するモノクローナル抗体。

2. 下記の特徴を有する、請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体。

①特異性

ヒト由来の他の抗原性物質とは実質的に反応せず、ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dのみに反応する。

②反応性

抗体の濃度に依存してヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D と反応する。

③交叉性

ヒト由来の肺サーファクタントアポ蛋白 A、同 B および同 C とは実質的に反応しない。

④種特異性

ラット由来の肺サーファクタントアポ蛋白 D とは実質的に反応しない。

3. 請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体を測定試薬として使用することを特徴とする、ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D の測定法。

4. 請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体を 1 つの構成試薬として含有してなる、ヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 Dを測定する.ためのキット。 . . .

5. 標識化した請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体を抗体試薬として使用することを特徵とする、ヒト肺組織中におけるヒト肺サ一ファクタントアポ蛋白 D の存在を検出するための方法。

6. 請求の範囲第 1 項記載のモノクローナル抗体を 1 つの構成試薬として含有してなる、ヒト肺組織中におけるヒト肺サーファクタントアポ蛋白 Dの存在を検出するためのキット。

7. 生体試料中のヒト肺サーファクタントアポ蛋白 D を測定または検出し、呼吸器疾患の診断に利用するためのキット。

8. ヒト肺サーファクタントの測定または検出に、請求項 1 記載のモソクローナル抗体を使用する、請求項 8 記載のキット。

9. 生体試料が、羊水、気管支肺胞洗浄液、血清、肺組織から選ばれたものである、請求項 8 記載のキット。

1 0. 呼吸器疾患が、 I R D S、 A R D S、肺胞蛋白症、間質性肺炎、肺腺癌、肺扁平上皮癌から選ばれたものである、請求項 8 記載のキット。