WO1994000576A1

WO1994000576A1 - Gene hydroxylase de vitamine d

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Publication number: WO1994000576A1
Application number: PCT/JP1993/000856
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Kawauchi; Joji Sasaki; Takashi Adachi; Kazunori Hanada; Teruhiko Beppu; Sueharu Horinouchi
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-06-25
Filing date: 1993-06-24
Publication date: 1994-01-06
Anticipated expiration: 1994-12-25
Also published as: EP0653490A1; EP0653490A4; AU4357493A; KR950702247A; CA2138516A1

Description

明細書ビタミン D類水酸化酵素遺伝子技術分野

本発明は、放射菌特にノカルジァ属またはアミコラタ属に属する菌に存在し、水酸化酵素活性に関与する遺伝子、またはそれを含有する D N Aの単離及びその利用に関する。

さらに詳しくは、ノカルジァ属またはアミコラタ属に属する菌に存在し、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換する水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子またはそれを含有する D N Aに関し、これらの放射菌の染色体 D N Aの制限酵素 S a u 3 A I による部分消化によって得られ、約 3 . 8 3 kbからなる D N A断片中に存在する水酸化酵素活性の発現に関与する遺伝子またはそれを含有する D N Aに関する。背景技術

微生物を用いた酵素化学的方法（微生物変換）によりビ夕ミン D類の 1 位及び 2 5 位を水酸化する方法が知られている。（特開平 2 — 4 6 9 号公報及び特開平 2 - 2 3 1 0 8 9 号公報）。しかしながら、ビタン D類の水酸化酵素活性に関与する微生物由来の遺伝子はこれまで明かになっておらず、微生物菌体内のビタミン D類の水酸化酵素活性に関与する水酸化酵素の量を増加させたり、該水酸化酵素を工業的に生産する為には技術として不十分であった。動物の遺伝子ではビタミン D ₃ の 2 5 位水酸化酵素チトクロム P 4 5 0 のラット肝由来の遺伝子およびそのクローニングが知られている（特開平 3 — 2 3 2 4 9 3 号公報）が、クローニングした遺伝子の微生物中での酵素活性発現は不十分であった。最近になって同じラット肝由来遺伝子を酵母の細胞質内の小胞体で発現させることにより微生物中での活性発現は先に開示された方法よりも約 5 0 倍増加したことが報告された（次世代産業基盤シンポジウム、平成 3年 9 月 1 3 日）が、なおも微生物由来のビタミン D類水酸化酵素活性を有する微生物変換の変換収量には及んでいない。

ビタミン D ₃ の 2 5 位水酸化酵素チトクロム P 4 5 0 のラット肝由来の遺伝子をクローニングして微生物で効率よく発現させることに成功しても微生物由来のビ夕ミン D類水酸化酵素活性を有する微生物変換の変換収量に及ばない理由としては、動物由来の水酸化酵素よりも微生物由来の水酸化酵素のほうが 1 分子あたりの酵素活性がはるかに優れている点が挙げられる。したがって微生物由来のビ夕ミン D類水酸化酵素を発現できる遺伝子を含む組換え体 D N Aの提供、及び微生物由来のビタミン D類水酸化酵素を発現できる遺伝子を含み微生物細胞内で自己増殖可能な組換え体 D N Aを保持する形質転換微生物を取得することが望まれていた。発明の開示

本発明者らは、ビタミン D類の微生物変換に用いられるノカルジァ属またはァミコラタ属に属する放線菌の特定の酵素の産生に係る遺伝子及びそれを含む D N Aを提供すべく研究した。その結果、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換して 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D類を生成することのできる水酸化酵素活性を発現し得る遺伝子をノカルジァ属またはァミコラタ属に属する菌株から分離することに成功したさらに、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 一ヒドロキシビ夕ミン D類への水酸化活性を欠失しているかまたは活性の低い、ストレプトミセス · リビダンス ( Streptomyces 1 i vidans) 及びストレプトミセス · グリセウス ( Streptomyces gr i seus ) に該遺伝子を組み込んだプラスミドを導入することにより、係る遺伝子が発現し、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類を.2 5 ーヒドロキシビタミン D類へ、該遺伝子の起源株よりも効率よく変換できることを見出し、本発明を完成した。

本発明によれば、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換することのできる放線菌由来の水酸化酵素をコードする遺伝子、該遺伝子の D N A断片を含有する組換えプラスミド及びそれを'保持する形質転換微生物が提供される。図面の簡単な説明

第 1 図はビタミン D類の 2 5位を水酸化し 2 5 — ヒドロキシビタミン D類へ変換する水酸化酵素活性を発現する遺伝子を含有する大きさ約 3. 8 3 kbp の D N A断片の制限酵素切断地図である。図中 H i n d 111 、 S a c I 、 B c l I 、 K p n I 、 P s t I 、 B a m H I は各制限酵素を表し、数字は各制限酵素切断位置間の距離を示し kbp で表している。

第 2図は組換えプラスミド P H K 0 1 0及びその由来となったプラスミドを示している。プラスミド P I J 6 9 9 ( 1 ) を制限酵素 B g 1 IIで切断し、（ 2 ) の D N A断片をさらに T 4 D N A リガーゼで処理すると、 ( 2 ) の D N A断片は連結し、プラスミド P H K 0 1 0 ( 3 ) が得られる。

第 3図は組換えプラスミド P H K 0 3 0 の制限酵素切断地図である。かっこ内の数字はその近傍に制限酵素 S a c I 切断部位を有する側の制限酵素 H i n d III 切断部位を座標点とした場合の各制限酵素切断位置を示している。細線で示した部分はベクタープラスミドとして用いたプラスミド P H K 0 1 0 に由来する D N A 断片との相同領域を、太線は第 1 図に示した水酸化酵素活性を有する遺伝子を含有する D N A断片との相同領域をそれぞれ表している。

第 4 図は組換えプラスミド P H K 0 3 1 の制限酵素切断地図である。かっこ内の数字はその近傍に制限酵素 S a c I 切断部位を有する側の制限酵素 S a u 3 A I 切断部位を座標点とした場合の各制限酵素切断位置を示している。細線で示した部分はベクタープラスミドとして用いたプラスミド P I J 7 0 2 に由来する D N A断片との相同領域を、太線は第 1 図に示した水酸化酵素活性を有する遺伝子を含有する D N A断片との相同領域をそれぞれ表している。

第 5 図は、プラスミド P H K 0 3 0 にクローン化されたノカルジァ · ォゥトトロヒカ N— 1 0 2株の染色体 D N A由来の水酸化酵素をコードする遺伝子を含む 3 8 3 6 bpの D N A断片の塩基配列の前半部分を示す。

第 6 図は、プラスミド P H K 0 3 0 にクローン化されたノカルジァ · ォゥトトロヒカ N— 1 0 2 株の染色体 D N A由来の水酸化酵素をコードする遺伝子を含む 3 8 3 6 bpの D N A断片の塩基配列の後半部分を示す。

第 7 図は、プラスミド P H K 0 3 0 にクローン化された水酸化酵素をコードする遺伝子を含む 3 8 3 6 bpの D N A断片中でビ夕ミン D ₃ の 2 5 位水酸化活性発現部位を示す図である。

第 8 図は、水酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列の前半部分を示す。

第 9 図は、水酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列の後半部分を示す。発明を実施するための最良の形態本発明の水酸化酵素をコードする遺伝子またはそれを含む D N A断片は、 2 5位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5位水素原子を水酸基に変換して 2 5 - ヒドロキシビタミン D類を生成する水酸化酵素活性を発現し得る遺伝子であれば、それが他の種類の基質をも水酸化するものであってもよい。また、水酸化酵素をコードする遺伝子またはそれを含む D N A断片の起源としては、 2 5位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5位水素原子を水酸基に変換し、 2 5 — ヒドロキシビタミン D類を生成する能力を有する放線菌の染色体 D N Aに由来ずるものが好適に用レ、られる。そのようなものとしてはノカルジァ ■ ォゥトトロヒカ ( Nocardia autorophi ca 、現在では一般にァミコラタ ■ ォゥトトロヒカ（Amycolata autotrophica) に分類されている）やアミコラタ ' サッルネア（Amycolata saturnea) などを挙げることができる o

他方、水酸化酵素をコードする遺伝子またはそれを含有する D N Aを導入するために用いるベクタープラスミドとしては放線菌内にあって自律増幅可能であり、かつ宿主細胞の分裂に際して安定に娘細胞に受け継がれていく安定保持性に優れたものであればよく、使用する宿主によって自由に選ぶことができる。ベクタ一プラスミドの具体的なものとしては例えば公知の P I J 7 0 2 ( atz et al. , J. Gen. Microbiol. , 1 2 9， 2 7 0 3 ( 1 9 8 3 ) ) や P I J 6 9 9 ( Kieser et. al. , Gene, 6 5 , 8 3 ( 1 9 8 8 ) ) を制限酵素 B g 1 11 消化することによって得られる P H K O 1 0 (第 2 図）等を挙げることができる。

本発明で提供する水酸化酵素をコードする遺伝子またはそれを含む D N Aは、上記したベクタ一プラスミドに導入され、例えば、本発明者の命名するところの後述するプラスミド P H K 0 3 0 や P H K 0 3 1 などが得られ o

本発明で提供する水酸化酵素をコ一ドする遺伝子とは、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換し、 2 5 — ヒドロキシビタミン D類を生成する反応を触媒する水酸化酵素産生に関与する D N Aをレ、う。

本発明における 2 5 位に水素原子を有するビ夕ミン D 類とは、例えば、ビタミン D ₂ 誘導体、ビタミン D ₃ 誘導体、ビタミン D ₄ 誘導体、ビタミン D ₅ 誘導体、ビ夕ミン D ₆ 誘導体、ビタミン D ₇ 誘導体を言い、それらの 1 7 位側鎖が水素原子、水酸基、低級アルキル基などで置換されているものでもよい。具体的には、ビタミン D ₂ 、ビタミン D ₃ 、ビタミン D ₄ 、ビタミン D ₅ 、ビ夕ミン D ₆ 、ビタミン D ₇ 、 2 4 — ォキソビタミン D ₃ 、 1 ひーヒドロキシビタミン D ₂ 、 1 ひーヒドキシビタミン D ₃ 、 1 ひ一ヒドロキシビタミン D ₄ 、 1 ひ一ヒドロキシビタミン D ₅ 、 1 ーヒドロキシビタミン D ₆ 、 1 α — ヒドロキシビタミン D ₇ 、 1 ひ一ヒドロキシー 2 4 — ォキソビタミン D ₃ 、 2 4 — ヒドロキシビタミン D ₃ 、 2 3 — ヒドロキシビタミン D ₃ 、 2 3 — ヒドロキシビタミン D ₄ 、 1 a , 2 3 — ジヒドキシビタミン D ₃ 1 a , 2 3 — ジヒドロキシビタミン D ₄ 、 2 6 — ヒドロキシビタミン D ₂ 、 2 6 — ヒドロキシビタミン D ₃ 、 2 6 — ヒドロキシビタミン D ₄ 、 2 3 ， 2 4 — ジヒドロキシビタミン D ₃ 、 2 3 , 2 6 — ジヒドロキシビタミン D ₃ 、 2 3 , 2 6 — ジヒドロキシビタミン D ₄ 、ビ夕ミン D ₃ 、 2 6 ， 2 3 — ラクトン、 1 ひーヒドロキシビ夕ミン D ₃ 、 2 6 , 2 3 — ラクトン、 2 4 ， 2 4 — ジフルォロビタミン D ₃ 、 2 4 , 2 4 — ジクロ口ビタミン D ₃ 2 6 ， 2 6 ， 2 6 ， 2 7 ， 2 7， 2 7 —へキサフルォロビタミン D ₃ 、 2 4 ， 2 4 — ジフルオロー 2 5 — ヒドロキシ一 2 6 ， 2 7 — ジメチルビ夕ミン D ₃ などがある。

本発明の水酸化酵素をコードする遺伝子またはそれを含む D N Aを含有する組換えプラスミドの調製はそれ自体公知の方法で行うことができる（例えば

D. A. Hopwood り Genetic Manup 1 a t i on of

S t rep t omvces " , A Laboratory Maunual , The John I nnes Foundation, 1 9 8 5 ) ₀

組換えプラスミドの調製方法

1) ベクタ一プラスミド

ベクタープラスミドは放線菌で安定に複製増殖を維持できるものであれば何でも用いることができるが、それらのベクタープラスミドから使用目的に応じて誘導されたものも含まれる。例えばストレプトミセス ' リビダンス丁八ー 2 2 0 (微生物の保管受託番号、微ェ研菌寄第 1 2 9 6 2号；工業技術院微生物工業研究所）ゃストレブトミセス . グリセウス T A— 2 2 1 (微生物の保管受託番号、微ェ研菌寄第 1 2 9 6 3号；工業技術院微生物工業研究所）を用いて公知のプラスミド例えば P I J 7 0 2、 P I J 6 9 9 を制限酵素 B g 1 IIによって消化して得られた P H K 0 1 0 (第 2図）等をべクタ一として用いることができる。これらのプラスミドは選別標識 (マ一カー）としてチォストレプトン耐性（以下、「 T h i o r ^r 」という）が付与されており、

T h i o r ^r を示す形質転換株を選別することにより組換えプラスミドの調製を容易に行うことができる。

2) ビ夕ミン D類水酸化酵素活性を発現する遺伝子を含む D N Aのクローニング

上述の 2 5位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 位を水酸化し 2 5 — ヒドロキシビタミン D類に変換する水酸化酵素活性を発現する遺伝子を含む放線菌（例えば、ノカルジァ · ォゥトトロヒカなど）の菌体より染色体 D N Aを公知の方法、例えば Murmurの方法（ J. Mol.

Biol., 3 , 2 0 8 ( 1 9 6 1 ) ) で抽出する。抽出された D N Aを適当な制限酵素（市販品；例えば宝酒造製や和光純薬製等）により切断すれば、目的の遺伝子を含む D N A断片が他の D NA断片と共に得られる。このようにして得られる D N A断片の混合物から目的の遺伝子を含む D N Aを含有する組換えプラスミドを調製するには、まず目的の遺伝子を含む D N A断片の末端と結合し得るように処理されたベクタープラスミドへ該 D N A断片を組込む。次に生成された各種の組換えプラスミドによる宿主菌の形質転換を行った後、例えば T h i o r ^r を示す組換えプラスミド含有形質転換体を選別する。次いで選別された形質転換体から目的の形質を発現する形質転換体を選別することにより目的の遺伝子を含む D N Aを含有する組換えプラスミドを選別することができる。

例えば、ノカルジァ · ォゥトトロヒ力の染色体 D N A を制限酵素 S a υ 3 A I により 3〜 2 O kbの D N A断片となるように部分分解（例えば！¹. Magniatisら、

"Molecular Cloning Cold Spring Harbor

Laboratory, 2 8 2頁， 1 9 8 2年）し、得られる該 D N A断片を制限酵素 B g 1 11により切断開環した P H K 0 1 0 と混合し、 Τ 4 D Ν Α リガーゼ（市販品；宝酒造製など）で該 D NA断片と P H K 0 1 0 の連結処理を行う。これによつて、染色体 D N Aの断片が導入された目的の組換えプラスミドを含有する連結混合物を得る。連結混合物から目的の組換えプラスミドを選別するには、該連結混合物を 2 5位に水素原子を有するビ夕ミン D類の 2 5 ーヒドロキシビ夕ミン D類への水酸化活性を欠失しているかまたは水酸化活性の低い放線菌のプロトプラスト（protoplast) に導入し、寒天平板上に塗抹する'。すなわち寒天平板上、チォストレブトンを加えた軟寒天培地に該プロトプラストを混合したものを重層する。重層後、該寒天平板を培養すると、組換えプラスミドを有する形質転換株はチォストレブトンに耐性を示すのでコロニーとして生育する。次にこのコロニーの中から目的の形質を発現することのできる形質転換微生物を選抜する o

すなわち各コロニーの菌体を液体培地に接種し、通気欖はん培養し充分生育させる。次に菌の生育した培養液にビタミン D ₃ (vitamin D ₃ ) を添加し、通気攪はん培養を継続した後、ブライ · アンド · ダイヤ一法

( Bligh and Dyer method ) に準じて溶媒抽出を行う。抽出物の分析は公知のビタミン D類の分析法（例えば Methods in Enzymology, 1 2 3 , 1 2 7 — 1 5 4 ( 1 9

8 6 ) ) に準じて行えばよく、順相シリカゲルカラム (例えば、ゾルバックス S I L、米国デュポン社製）を用いた、高速液体クロマトグラフィーの保持時間、生成物の紫外部吸収スぺクトル及び Ε I 一 M Sスぺクトルを標準品（ 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ ( 2 5 ( 0 H ) D 3 ) 、オランダ、デュファー社製）と比較することにより抽出物中に 2 5 ( 0 H ) D 3 の生成を確認することができる。

以上の方法により 2 5 ( 0 H ) D 3 の生成が確認されるコロニー、すなわち、 2 5位に水素原子を有するビ夕ミン D類を水酸化して 2 5 — ヒドロキシビタミン D類に' 変換する活性を有する水酸化酵素をコードする遺伝子を含む D N Aを含有する組換えプラスミドを保持するコロ二一を選抜することができる。したがって、このコロニ一の菌体がら前述のプラスミド抽出法によってべクタ一プラスミドに 2 5 位に水素原子を有するビ夕ミン D類を水酸化して 2 5 — ヒドロキシビタミン D類に変換する活性を有する水酸化酵素をコードする遺伝子を含む D N A が含有された組換えプラスミドを取得することができる。このようにして得られた組換えプラスミドとしては例えば、 P H K 0 3 0 や P H K 0 3 1 を挙げることができる。 3) 組換えプラスミドの具体的説明

上述の方法によって得られる組換えプラスミド P H K 0 3 0 や P H K 0 3 1 (実施例並びに第 3 図および第 4 図参照）について、具体的に述べる。

(1) プラスミド P H K 0 3 0 または P H K 0 3 1 による水酸化酵素活性の確認

プラスミド P H K 0 3 0 または P H K 0 3 1 の含有する挿入 D N A断片が 2 5 位に水素原子を有するビ夕ミン D類を水酸化して 2 5 — ヒドロキシビタミン D類に変換する活性を有する水酸化酵素をコードする遺伝子を含むことは次のことから理解される。すなわちプラスミド P H K 0 3 0 または P H K 0 3 1 を含有する組換え株からこのプラスミドを除去（例えばァクリジン色素などを用いて該組換え株を処置する）することによって生じるプラスミド除去株はチォストレプトン感受性になり、同時にビタミン D類の水酸化活性の消失を伴うことから理解される。さらに該プラスミド除去株を宿主としてプラスミド P H K 0 3 0 または P H K 0 3 1 を用いて再形質転換すると得られる再形質転換株はすべて T h i o r ^r を形質発現すると共にビタミン D類水酸化活性の復帰が確認される。

(2) プラスミド P H K 0 3 0

第 3図に示す制限酵素切断地図を有するプラスミド P H K 0 3 0 は制限酵素 H i n d III を作用させることにより、 3. 8 kbp と 4 . 7 kb の D N A断片部分に分けることができる。このうち 3. 8 kb の D N A断片の両末端の数十 bp以内に制限酵素 S a u 3 A I 切断部位を有しており、これより内側の部分にノカルジァ * ォゥトトロヒ力の染色体に由来する水酸化酵素をコードする遺伝子が含まれる。もう一方の D N A断片はプラスミド P H K 0 1 0 ( 5 . 0 kbp , 第 2図）に由来する部分である。 P H K 0 1 0 は組換えによって P H K 0 3 0 中に 2 0 0〜 3 0 0 bp消失した D N A断片として含有されている。プラスミド P H K 0 3 0 は該プラスミドを単独に含む形質転換株から調製することができる。

(3) プラスミド P H K 0 3 1

第 4 図にプラスミド P H K 0 3 1 の制限酵素切断地図を示す。プラスミド P H K 0 3 1 はプラスミド P I J 7 0 2を制限酵素 B g 1 IIで切断し開環して得られる D N A断片とプラスミド P H K 0 3 0 を制限酵素 _§_a u 3 A I を作用させることにより得られる約 3 . 8 kbp の D N A断片を T 4 D N A リガーゼで連結させることによって得られる大きさ 9. 5 kbp のプラスミドである。プラスミド P H K 0 3 1 は該プラスミドを単独に含む形質転換株から調製することができる。また、ブラスミド P H K 0 3 1 を制限酵素 S a u 3 A I を作用させることにより得られる約 3. 8 kbp の D N A断片を制限酵素 B 1 Πで開環したプラスミド P H K 0 1 0 と結合させることによって、プラスミド P H K 0 3 0 と同じ制限酵素地図を有し、プラスミド P H K 0 3 0 と完全に一致するプラスミドを得ることができる。さらに、プラスミド P H K 0 3 0 と P H K 0 3 1 の双方にビ夕ミン D類の水酸化活性が確認されたことから、プラスミド P H K 0 3 0 の制限酵素 H i n d ill を作用させることにより得られる約 3. 8 3 kbp の D NA断片に水酸化酵素をコードする遺伝子が含まれることを確認することができる。この約 3. 8 3 kbp の D N A断片は、第 1 図に示した制限酵素地図を有している。

水酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列の決定

上記した例えばプラスミド P H K 0 3 0 にクーロン化された水酸化酵素をコードする遺伝子を含有する

約 3. 8 3 kbp の D N A断片を得、この D N A断片を用いてジデォキシ ■ チェイン · 夕一ミーネー夕一法により例えば S E Q U E NA S E D N A Sequenc i ng K i tを使用して、水酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定することができる。後述する実施例 8 に示されるように、プラスミド P H K 0 3 0 にクーロン化されたノカルジァ · ォゥトトロヒ力 N - 1 2 0 株の染色体 D N A由来の D N A断片は 3 8 3 6 bpであり、上流から 2 3 0 0 bpにィニシエーションコドンを持ち、 1 1 9 4 bp、 3 9 8 アミノ酸からなるオープンリーディングフレームがあることが明かとなつた（第 5 図及び第 6 図参照）。

更に、 P H K 0 3 0 をサブクローニングし、後述する実施例 2 に示した方法と同様な方法で活性部位を調べたところ、上流から 1 3 4 O bpに存在する S a c I サイ卜から 3 8 3 0 bpの H i n d I 11 サイトまでの 2 4 9 0 bpのフラグメントにビタミン D ₃ の 2 5 位水酸化酵素活性があることが判った（第 7 図参照）。このことから、第 5 図及び第 6 図に示したオープンリーディングフレー厶にビタミン D ₃ 類の 2 5 位水酸化活性が存在することが示唆された。

以上により、水酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列は第 8 図及び第 9 図に示したような塩基配列を有することが明かとなつた。

放線菌の説明

本発明において使用されるあるいは得られる放線菌の詳細な説明は次の通りである。

(1) ノカルジァ · ォゥトトロヒカ N— 1 0 2

本菌は微生物の.保管受託番号、微ェ研条寄第 1 5 .7 3 号（ F E R M B P — 1 5 7 3 ) として工業技術院微生物工業研究所に寄託されており、その菌学的性状は特開平 2 — 4 6 9 号に詳細に述べられている。なお、本菌は化学分類法によりアミコラタ · ォゥトトロヒカ

( Amycolata autorophica ) に分類される場合力ある ( Lecheva 1 i er ら； Int. J. Sy s t . Bacter i o 1. , 3— 6，

2 9 ( 1 9 8 6 ) ) o

(2) ストレプトミセス · リビダンス T A— 2 2 0

本菌は微生物の保管受託番号、微ェ研菌寄第 1 2 9 6

2号（ F E R M P — 1 2 9 6 2 ) として 1 9 9 2 年 5 月 2 0 日に工業技術院微生物工業研究所に寄託され、その後 1 9 9 3年 6 月 1 4 日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され受託番号として F E R M B P — 4 3

3 7 が付与されている。本菌株はストレプトミセス · リビダンス T K 2 4 と同一の菌である。 T K 2 4 株は

Genetic Manipulation of Streptomyces" 、 A Labora toru Manual , The John I nnes Foundation, 1 9 8 5 に記載されており、放線菌の宿主として世界中で用いられている。

(3) ストレプトミセス ' グリセウス T A— 2 2 1

本菌は微生物の保管受託番号、微ェ研菌寄第 1 2 9 6 3 号（ F E R M P — 1 2 9 6 3 ) として 1 9 9 2 年 5 月 2 0 日に工業技術院微生物工業研究所に寄託され、その後 1 9 9 3 年 6 月 1 4 日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され受託番号として F E R M B P — 4 3 3 6 が付与されている。本菌株はストレプトミセス . グリセウス I F O 1 3 3 5 0 (財団法人発酵研究所保存株）を起源とする突然変異株であるストレプトミセス · グリセウス H H— 1 と同一の菌であり、その菌学的性状は明かにされている（ H H— 1 株： Horinouchiら； J. Bacte riol. , 1 5 8. 4 8 1 ( 1 9 8 4 ) ) 。なお、ストレブトミセス . グリセウス I F 0 1 3 3 5 0及び本菌はストレプトミセス · ビキニェンシス

( Streptomyces bikiniensis に分類される場合力ある。

(4) ストレプトミセス · リビダンス T A— 2 2 2

本菌株は本発明により得られる組換えプラスミド P H K 0 3 0 を保持する形質転換菌株であり、ストレブトミセス · リビダンス T A— 2 2 0 にプラスミド P H K 0 3 0が導入された菌株に相当する。

(5) ストレプトミセス . グリセウス T A— 2 2 3

本菌株は本発明により得られる組換えプラスミド P H K 0 3 1 を保持する形質転換菌株であり、ストレブトミセス · グリセウス T A— 2 2 1 にプラスミド P H K 0 3 1 が導入された菌株に相当する。

形質転換菌株を用いた 2 5 一ヒドロキシビ夕ミン D類の m

本発明の組換えプラスミドを保持する形質転換菌株を用いた 2 5 — ヒドロキシビタミン D類の製造は該形質転換菌体またはその産生する水酸化酵素を含有する溶液中で、基質ビ夕ミン D類を好気的条件下で反応させることによって行うものであり、例えば特開平 2 — 4 6 9号公報に記された、放線菌を使用した方法に準じて行うことができる。ただし、反応に必要な形質転換菌株の菌体を得るために培養する培地の成分の中に大豆由来の物質、例えば大豆粉ゃソィぺプトンは含まれても含まれなくても 2 5 一ヒドロキシビ夕ミン D類の製造を実施できる。すなわち特に大豆粉由来の物質を添加しなくても該形質転換菌株の水酸化活性は発現し、効率よく 2 5 — ヒドロキシビタミン D類を製造することができる。

以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

実施例 1 組換えプラスミドの調製法と形質転換

ノカゾレジァ ' ォゥトトロヒカ N— 1 0 2 株をグリシン 0 . 5 %を添加したトリプチック · ソィ液体培地（米国ディフコ社製） 1 0 0 mlの入った 5 0 0 ml容の坂ロフラスコに接種し 2 8 °Cで 4 日間培養した。この培養液から菌体を遠心分離（ 5 0 0 rpm 、 2 0 分間）して得た。この菌体から Marmurの方法 ( J. ol. Biol. , 3 , 2 0 8 ( 1 9 6 1 ) ) に準じて全 D N Aを抽出、精製し、 T E S緩衝液（ 5 0 mMトリス —塩酸、 pH 8 ) で 1 6 時間透析して供与体 D N A とした。

このようにして得られた供与体 D N A 5 gを制限酵素 S a u 3 A I (酵素活性 3 ュニット、宝酒造製；以後、制限酵素は実施例の中で特に記載しない限り、宝酒造製または和光純薬製を用い、反応条件はそれらの添付資料に従った）を用いて 3 7 °Cで反応させ 3〜 2 0 kbの D N A断片になるように部分消化した（反応時間 4 5 秒）。この反応液は 7 0 °Cで 1 5 分間処理することによつて失活させた。この反応溶液を D E 8 1 ペーパー（ヮットマン社製）に付し、 3 kb以上の D N Aを回収した。次にプラスミド P I J 6 9 9 からプラスミド P H K 0 1 0 を調製した（第 2 図参照）。 P I J 6 9 9 ( 5

g ) 、制限酵素 B g 1 Π ( 2 0 ユニット）、 B a m H I ( 2 0 ユニット）を含む緩衝液（ H緩衝液； 5 0 mMトリス塩酸、 pH 7 . 5 、 1 0 mM塩化マグネシウム、 1 mMジチオスレイト一ル、 1 0 mM塩化ナトリウム）中で、 3 7 °C、 2 時間反応した後、エタノール沈澱処理

( 2 . 5 倍容量の一 2 0 °Cのエタノールを加え、 — 7 0 °Cで 3 0 分間放置後、 1 5 , 0 0 0 rpm で 1 0 分間遠心して D N Aを回収する処理）して D N A断片を回収したこの D N A断片を 1 0 0 1 の T E緩衝液（ 1 O mMトリス塩酸、 PH 8 、 I mME T D A ) に溶解した後、 B A P処理（ D N A溶液 1 0 0 〃 1 、 1 M トリス塩酸（ pH 9 ) 1 2 a 1 、ノくクテリアルアルカリフォスファタ一ゼ（ E . c 0 1 i C 7 5 宝酒造製） 4 〃 1 ( 2 ユニット）、水 4 1 からなる溶液中で酵素反応する）を 3 7 °C、 2 時間行った。反応後、反応液を 0 . 8 %ァガロースゲル電気泳動（泳動装置； T A K A R A H E - 1 3 型、ァガロース； Seakem Agarose ME (宝酒造製）、緩衝液； 4 0 mMトリス酢酸、 2 0 mM酢酸ナトリウム、 2 mM E D T A、 1 8 mM N a C 1 、 pH 8 ) に付し、 D E 8 1 ペーパーで約 5 kbのプラスミド P H K 0 1 0 (第 2 図の（3))に相当する D N A断片（第 2 図の（2))を回収した。プラスミド P H K 0 1 0 はこの D N A断片を D N A T 4 リガ一ゼ処理することにより得られるが、この D N A断片をそのまま次の組換えプラスミドの調製に使用した。

このプラスミド P H K 0 1 0 に相当する D N A断片 ( 1 g ) と上記の制限酵素 S a u ' 3 A I 処理によつて得られた染色体 D N A断片（ 5 // g ) を T 4 D N A リガーゼ（ 1 7 . 5 ユニット）を含む L G緩衝液（ 3 0 mM トリス塩酸、 pH 7 . 5、 6 mM塩化マグネシウム、 1 0 mM ジチオスレィトール、 5 0 〃 g mlゥシ血清アルブミン、 0 . 5 mM A T P ) 2 0 〃 1 中で 4 、 1 6 時間反応した。この処理により組換えプラスミドが反応液中に得られた。この組換えプラスミドは目的の遺伝子を含み水酸化酵素活性を発現できるものとそうでないものの混合物であるため、この組換えプラスミド混合物から目的の組換えプラスミドを選別するため、ビタミン D類を 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D類に変換する能力を本来持たないかもしくは極めて低い能力しか持たない放線菌であるストレプトミセス · リビダンス T A— 2 2 0 のプロトプラストに該組換えプラスミド混合物を導入した。

すなわち、 1 %グルコース、 3 4 %シュクロース、 0 . 3 %酵母エキス、 0 . 3 %麦芽エキス、 0 . 5 9 ぺプトン、 0 . 6 %グリシン、 5 mM塩化マグネシゥ厶から成る ¥ £ 1^ £培地 1 0 0 1111を含む 5 0 0 1111容の坂ロフラスコにストレプトミセス ' リビダンス T A— 2 2 0 を 3 0 °Cで 4 8 時間往復振とう培養した。この培養液から 3 ， 0 0 0 r pm 、 1 0 分間の遠心で菌体を得、 3 5 0 mMシュクロース溶液にこの菌体を懸濁し洗浄した。これを遠心し得られた菌体を再び L緩衝液（「 L Y S I S

B U F F E R J ； " Genetic Manipulation of

Streptomyces 、 A Laboratoru Manual, The John

Innes Foundation, 1 9 8 5 に記載されている） 1 0 ml に懸濁し、これに 2 0 0 mgのリゾチームを加えて溶解し 3 0 °Cで 1 時間反応すると T A — 2 2 0 株のプロトプラストが生成した。この反応液中にはプロトプラストと未反応の菌が混在している為、脱脂綿で濾過しその濾液を 3 ， 0 0 0 rpm 1 0 分間の遠心することによりプロトプラストを多量に含む沈澱物を得た。この沈澱物を 3 mlの L緩衝液に懸濁した。この懸濁液は 7 . 5 m 1のグリセ口ールを添加することにより一 2 0 °Cで長期間保存が可能なプロトプラスト溶液となる。

このプロトプラスト溶液 5 0 u 1 に上述の該組換えプラスミド混合物の溶液 2 0 a 1 を 0 でで加えゆるやかに攪はんしプロトプラストを均一に分散させた。これに 5 0 0 a 1 の 2 5 %ポリエチレングリコ一ノレ # 1 0 0 0 、 2 . 5 % シュクロース、 0 . 0 2 5 %硫酸カリウム、 0 . 0 0 5 % リン酸二水素カリウム、 1 0 0 mM塩化力ルシゥ厶、 5 0 mMトリスーマレイン酸、 pH 8 からなる溶液を 0 °Cで加えゆるやかに攪はんした。攪はん後この溶液を 4 2 °Cに保温した軟寒天培地（シュクロース 1 0 . 3 g、塩化マグネシウム六水加物 1 g、 0 . 2 9 4 g、 2 5 mMトリス塩酸、 PH 8 、寒天 0 . 6 5 g ) 5 0 mlに混合したものを 3 mlずつ再生培地を含むシャ一レに上層した。再生培地は 4 8 O mlのシュクロース 6 1 . 8 g、ダルコース 6 . 0 g、硫酸カリウム 0 . 1 5 g、塩化マグネシゥム六水加物 6 . 0 7 g、カザミノ酸 0 . 0 6 g、酵母エキス 3 . 0 g、微量金属塩溶液（ 4 0 mg/ 1 塩化亜鉛、 2 0 0 mg/ 1 塩化第二鉄六水和物、 1 0 mg/ 1 塩化第二銅二水和物、 1 0 mgZ 1 塩化マンガン四水和物、 1 0 mg Z l 四ほう酸ナトリウム十水和物、 1 0 mg/ 1 七モリブデン酸アンモニゥム四水和物） 1 . 2 ml、 L 一プロリン 1 . 8 g、寒天 1 3 . 2 gを含む溶液に 0 . 5 % リン酸二水素カリウム 6 mし 3 . 6 8 %塩化カノレシゥ厶 4 8 mし 0 . 2 5 M トリス—塩酸緩衝液（ pH 6 ) 6 0 mlを加えたォートクレーブした後シャーレに 2 7 mlずつ分注して作成した。再生培地にプロトプラスト溶液を含む軟寒天培地を上層後、 2 8 °Cで 1 6 時間培養した。培養後、軟寒天培地に終濃度 2 0 0 a g mlになるようにチォストレプトンを添加した溶液 4 2 °C ) を上層し、さらに 2 8 °C で 7 2 時間培養した。以上の操作によってシャーレ 1 枚あたり 2 0 0 株の形質転換株コロニーを得た。

実施例 2 ビタミン D類の 2 5 位を水酸化し 2 5 - ヒド口キシビ夕ミン D類へ変換する能力を有する形質転換株のスクリーニング実施例 1 で得られた各形質転換株コロニーから菌体をそれぞれ微生物変換用培地（ 1 . 5 %グルコース、

1 . 5 %ノくクトソィトン（ディフコ製）、 0 . 5 %コーンスチープリカ一、 0 . 5 %塩化ナトリウム、 pH

7 . 3 ) を 1 0 mlを含む大型試験管（ 2 5 腿 ø ) に接種し、 2 8 °Cで 3 日間通気攪はん培養した。これにビ夕ミン 0₃ l m を 5 0 〃 1 のエタノールに溶かし、 5 0 〃 1 のツイーン 8 0 ( Tween 8 0 ) と共に添加した。添加後、再び 2 8 °Cで 3 日間通気攪はん培養した。培養終了後、培養液をプライ · アンド · ダイヤー法（ J. Lipid Res. , 7， 7 3 9 ( 1 9 6 6 ) ) で抽出し、塩化メチレン層抽出物を高速液体クロマトグラフィー（ H P L C、カラム；ゾルノくックス S I L 4 . 6 隨 ø X 2 5 cm、溶媒； n —へキサン； 2 — プロノ、。ノール = 3 ： 2 2 、装置；島津 L C 一 4 A ) に付した。その結果、各形質転換株の中から標準物質の 2 5 — ヒドロキシビタン D ₃ (デュファ —社製、オランダ）と保持時間の一致するピークの認められた株を 1 次スクリ一二ングとして選抜した。

次に 1 次スクリ一ニングで選抜した菌株を上述の微生物変換用培地 5 0 mlを含む 5 0 0 mlの坂口フラスコに接種し、 2 8 °Cで 3 日間通気攪はん培養し、これにビタミ D ₃ 5 呢を 2 5 0 .. 1 のエタノールに溶かし、 2 5 0 H 1 のツイ一ン 8 0 と共に添加した後さらに 2 8 °Cで 3 日間通気攪はん培養した。培養終了後、培養液をプライ，アンド，ダイヤー法で抽出し、塩化メチレン層抽出物を順相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ H P L C、カラム；ゾルノくックス S I L 4 . 6 腿 ø X 2 5 cm、溶媒； n —へキサン： 2 — プロノ、。ノール = 3 : 2 2 、装置；島津 L C 一 4 A ) に付した。標準物質の 2 5 ーヒドロキシビタミン D ₃ (デュファー社製、オランダ）と保持時間の一致するピークを生成物として分取し、これを逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー ( H P L C、カラム；ブルノくックス 0 D S 4 . 6 讓 ø X 2 5 cm , 溶媒；水：メタノール = 1 ： 9 、装置；島津 L C - 4 A ) に付した。標準物質の 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D ₃ (デュファー社製、オランダ）と保持時間の一致するピークを分取し、紫外線吸収スぺクトラ厶（日立 2 2 O A分光光度計を使用）及びマススぺクトル（ E I 一 M S、 J E 0 L J M S - S X 1 0 2 質量分析計を使用）を測定した。以上の 2次スクリーニングの結果、ストレプトミセス · リビダンス T A— 2 2 2 株の生成物の高速液体クロマトグラフィーの保持時間、紫外線吸収スぺクトラム及びマススぺクトル開裂パターンが標準物質の 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ (デュファー社製、オランダ）と完全に一致し、本生成物が 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ であること（Method in En zy mo logy, 1 2 3 ， 1 2 7 ( 1 9 8 6 ) ) 、すなわちストレブトミセス - リビダンス T A— 2 2 2株がビタミン D類の 2 5 位を水酸化し 2 5 一ヒドロキシビ夕ミン D類へ変換する能力を有する形質転換株であることが確認された。ストレプトミセス · リビダンス T A— 2 2 2株の生成物

( 1 ) ゾルノくックス S I L高速液体クロマトグラフィー

カラムサイズ； 4 . 6 隨 0 X 2 5 cm、

溶出溶媒； n —へキサン： 2 — プロノノール = 3 ： 22. カラム温度； 2 5 °C、溶出速度； 1 . δ πιΙΖ分、島津 L C — 4 Αで測定。

生成物標品の保持時間； 4 . 0 分

(2) ゾルノくックス 0 D S高速液体クロマトグラフィー

カラムサイズ； 4 . 6 mm ø X 2 5 cm .

溶出溶媒；水：メタノール = 1 ： 9 、

カラム温度； 4 0 °C、溶出速度； 1 . O mlZ分、島津 L C 一 4 Aで測定。

生成物標品の保持時間； 8 . 0 分

(3) 最大紫外部吸収：

λ _mex = 2 6 5 nm (エタノール中）

(4) E I - M S ( m / z ) ：

. 4 0 0 ( M + ) 、 3 8 2 ( M+ — H ₂ 0 ) 、 2 7 1 、

2 5 3 、 1 3 6 、 1 1 8 、 5 9

実施例 3 形質転換株ストレプトミセス · リビダンス T A— 2 2 2 株の培養によるプラスミド P H K 0 3 0 の調製及びストレプトミセス · リビダンス T A - 2 2 0 株の再形質転換

実施例 2 に記載されたスクリ一二ング方法によって、ビタミン' D類の 2 5 位を水酸化し、 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D類へ変換する能力を付与された形質転換株ストレプトミセス . リビダンス T A— 2 2 2株が選択された。これは、この株が特定のプラスミド（プラスミド P H K 0 3 0 ) を含有しているためにビタミン D ₃ を 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ へ変換できるようになつたものと考えられる。このプラスミドを調製し、ストレプトミセス · リビダンスを再形質転換してその確認を行った。すなわち、実施例 1 に示した Y E M E培地 5 0 mlを入れた 5 0 O mlの坂口フラスコにストレプトミセス ' リビダンス T A— 2 2 2株を接種し、 2 8 °Cで 7 2 時間通気攪はん培養を行った。この培養液から菌体を遠心分離（ 3 ， 0 0 0 rpm 、 2 0 分間）によって集めた。集められた菌体から粗プラスミド混合物を、一般に知られているニュ一トラノレ · ライシス法 ( Neutral Lysis: 「 " Genetic Manipulation of Streptomyces 、 A Laboratory

Manual , The John Innes Foundation, 1 9 8 5 」の第 8 2 頁に記載されている）で抽出し、 T E S緩衝液中の粗プラスミド混合物溶液として得た。これを次に塩化セシゥムー臭化工チジゥム平行密度勾配遠心法

「 "Molecular Cloning ， A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, 1 9 8 9 」の第 1 欄、第 4 2 頁に記載されている）で精製し、プラスミド P H K 0 3 0 を純粋な閉環状プラスミドとして単離した。

組換えプラスミド P H K ひ 3 0 における挿入 D N A断片の大きさは 0 . 8 %ァガロースゲル電気泳動によって算出された。すなわち、組換えプラスミド P H K 0 3 0 を 0 . 5 gを制限酵素 B a m H I で反応すると組換えプラスミド P H K 0 3 0 は 1 力所で切断された直鎖状 D N Aとなり、その大きさが判別できる。プラスミド P H K 0 3 0 の大きさは約 8 . 5 kbp であることが判明した。また、制限酵素 H i n d III を用いるとプラスミド P H K 0 3 0 は 2箇所で切断され、それぞれ 3. 8 kbp と 4 . 7 kbp の D N A断片が得られた。なお、分子量マ一カーとしてラムダ D N A ( λ D N A ) の制限酵素 H i n d III 切断断片または 0 X 1 7 4 D N Aの

H a e III 切断断片を用い、それぞれの電気泳動の移動度からプラスミド P H K 0 3 0 の B a m H I 消化による D N A断片の大きさを測定した。同様にして制限酵素 S a c I 、 B c 1 I 、 k p n I 、 P s t I を用いてプラスミド P H K O 3 0 を消化切断し、それぞれの断片の大きさから制限酵素切断地図を作成すると第 3 図のようになった。プラスミド P H K O 1 0 (第 2図の (3))の H i n d ill 切断箇所は 2箇所であることからプラスミド P H K O 3 0 の H i n d 111 消化によって得られる 3. 8 kbp の D N A断片の両末端の数十 bp以内に制限酵素 S a u 3 A I 切断部位を有しており、これより内側の部分にノカルジァ · ォゥトトロヒ力の染色体に由来する該水酸化酵素遺伝子が含まれることが判明した。また、 H i n d 111 消化によって得られるもう一方の D N A断片はプラスミド P H K O 1 0 ( 5 . 0 kbp 、第 2 図の（3) ) に由来する部分であり、これが組換えによって P H K 0 3 0 中に 2 0 0 〜 3 0 0 bp消失した D N A断片として含有されていることが判明した。

なお、このようにして得られた組換えプラスミド P H K 0 3 0 を用いて実施例 1 に記載した方法でストレプトミセス ' リビダンス T A — 2 2 0 を再形質転換した。この再形質転換によって得られた形質転換株 2 0 株についてビタミン D ₃ から 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ への変換能について検討したところ、すべての株で変換能が認められた。また、これらから分離されたプラスミド P H K 0 3 0 であった。

実施例 4 形質転換株ストレプトミセス · リビダンス T A— 2 2 2 株からのプラスミドの除去とプラスミド P H K 0 3 0 による再形質転換

プラスミド P H K 0 3 0 が導入されたことによってビ夕ミン D類の 2 5 位を水酸化し、 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D類へ変換する能力を付与された形質転換株ストレブトミセス · リビダンス T A— 2 2 2株カヽらァクリフラビンまたはプロトプラスト再生によってプラスミド P H K 0 3 0 が脱落、除去された T A— 2 2 2 D株を取得した。この株はプラスミド P H K 0 3 0 の除去に伴ってチォストレプトンに感受性であった。また、この株は実施例 2 に記載された方法と同じ方法で 2 5 — ヒド αキシビ夕ミン D ₃ への変換能の有無を調べたところ、変換活性は認められなかった。次いでプラスミド P H K 0 3 0 を用いてプラスミド除去株 T A— 2 2 2 D株を実施例 1 に記載した方法で形質転換した。この形質転換で得られた再形質転換株はチォストレプトンに耐性になっており、また実施例 2 に記載された同じ方法で、 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ への変換能を調べたところ変換活性の復帰が認められた。実施例 5 プラスミド P H K 0 3 1 の調製

実施例 3 に記載された方法と同様の方法で、プラスミド P I J 7 0 2 を制限酵素 B g 1 I Iで切断し開環して得られる D N A断片と、プラスミド P H K 0 3 0 を制限酵素 S a u 3 A I で消化することにより得られる約 3 . 8 kbp の D N A断片を、 T 4 D N A リガーゼで連結させることによって、新たに大きさ 9 . 5 kbp のプラス ^ド P H K 0 3 1 を調製した。第 4 図に示されるプラスミド P H K 0 3 1 の大きさ及び各種制限酵素による切断地図は実施例 3 と同様にして作成した。

実施例 6 プラスミド P H K 0 3 1 による形質転換株ストレブトミセス · グリセウス T A— 2 2 3 株の造成とビ夕ミン D ₃ から 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ への変換得られたプラスミド P H K 0 3 1 を導入する宿主微生物として、ビタミン D類を 2 5 — ヒヒドロキシビタミン D類に変換する能力を本来持たないかもしくは極めて低い能力しか持たない放線菌であるストレプトミセス . グリセウス T A— 2 2 1 株のプロトプラストを使用し、実施例 1 に記載された方法と同様の方法により、プラスミド P H K 0 3 1 を導入した形質転換株としてストレブトミセス · グリセウス T A— 2 2 3株を得た。実施例 2 に記載された同じ方法で、ストレプトミセス · グリセウス T A— 2 2 3株のビタミン 0₃ から 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D ₃ への変換能を調べたところ変換活性が認めら

^ X /こ o

なお、プラスミド P H K 0 3 1 を制限酵素 S a u 3 A I を作用させることにより得られる約 3. 8 kbp の D N A断片を制限酵素 B 1 I Iで開環したプラスミド P H K 0 1 0 と結合させたところ、プラスミド P H K 0 3 0 と同じ制限酵素地図を有し、プラスミド P H K 0 3 0 と完全に一致するプラスミドを得られた。プラスミド P H K 0 3 0 と P H K 0 3 1 の双方にビタミン D類の水酸化活性が確認されたことから、プラスミド P H K 0 3 0 の制限酵素 H i n d III を作用させることにより得られる約 3. 8 kbp の D N A断片に該水酸化酵素遺伝子が含まれることが判明した。

実施例 7 形質転換株によるビタミン D ₂ から 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₂ への変換及び 1 α— ビタミン D _s 力、ら 1 α， 2 5 — ジヒドロキシビタミン D ₃ への変換 1) 形質転換株ストレプトミセス ' リビダンス Τ Α— 2 2 2株を用い、実施例 2 と同様にしてビタミン D ₂ から 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₂ を得た。得られた 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₂ の高速液体クロマトグラフィーの保持時間、紫外線吸収スぺクトラム及びマススぺクトル開裂バタ一ンは、ノカルジァ · ォゥトトロヒカ N— 1 0 2株を用いてビタミン D ₂ を変換して得られる標準物質の 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₂ と完全に一致した。 ( 1 ) ゾルノくックス S I L高速液体クロマトグラフィー

カラムサイズ； 4 . 6 mm ø X 2 5 cm ,

溶出溶媒； n — へキサン： 2 —プロノ、。ノール = 3 : 22、カラム温度； 2 5 °C、溶出速度； 1 . 5 mlZ分、島津 L C 一 4 Aで測定。

生成物標品の保持時間； 3 . 9 分

(2) 最大紫外部吸収：

λ _max = 2 6 5 nm (ェタノ一ノレ中）

(3) E I - M S ( m / r ) ：

4 1 2 ( M + ) 、 3 9 4 ( M + — H ₂ 0 ) 、 2 7 1 、 2 5 3 、 1 3 6 、 1 1 8 、 5 9

2) 形質転換株ストレプトミセス ' リビダンス T A— 2 2 2株を用い、実施例 2 と同様にして 1 ひ一ビタミン D ₃ から 1 ひ， 2 5 — ジヒドロキシビタミン D ₃ を得た。得られた 1 ひ， 2 5 — ジヒドロキシビタミン D ₃ の高速液体クロマトグラフィーの保持時間、紫外線吸収スぺクトラム及びマススぺクトル開裂パターンは標準物質の 1 a , 2 5 — ジヒドロキシビタミン D ₃ (デュファー社製、オランダ）と完全に一致した。

( 1 ) ゾルノくックス S I L高速クロマトグラフィー

カラムサイズ； 4 . 6 mm ø X 2 5 cm , 溶出溶媒； n —へキサン： 2 — プロノ、。ノール = 3 : 22、カラム温度； 2 5 °C、溶出速度； 1 . 5 ml/分、島津 L C — 4 Aで測定。

生成物標品の保持時間； 1 4 . 5 分

(2) 最大紫外部吸収：

λ _max = 2 6 5 nm (エタノール中）

(3) E I - M S ( m / z ) ：

4 1 6 ( M + ) 、 3 9 4 ( M ⁺ — H ₂ O ) 、 3 8 0 ( M + - 2 H ₂ 0 ) 、 2 8 7 、 2 6 9 、 2 5 1 、 1 5 2 、 1 3 4 、 1 2 9 、 1 1 6 、 1 1 1 、 5 9

3) 形質転換株ストレプトミセス ' グリセウス T A - 2 2 3 を用いて実施例 2 と同様にして、ビタミン D ₂ から 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₂ 及び 1 ひ一ビタミン D ₃ から 1 ひ， 2 5 — ジヒドロキシビタミン D ₃ を得た。

実施例 8 ビタミン D ₃ から 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D 3 への変換能の形質転換株とノカルジァ · ォゥトトロヒ力との比較

実施例 2 に記載した方法と同様にして、各形質転換株とノカルジァ · ォォゥトトロヒカ N— 1 0 2 株を用いてビタミン D ₃ を変換したときの 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ 生成量を以下の表に示す。変換時間は 7 2 時間でそれぞれの菌株における 2 5 — ヒドロキシビタミン D ₃ 生成量を比較した。第 1 表微生物 25- ヒド口キジ - レ、'

ヒタ h ？、 fi旦 .

ノノ Π U r

3王 β¾里

( S Zml培地）ノカルジァ · ォォゥ卜卜 α 1 6 . 7

ヒカ N— 1 0 2

ストレプトミセス，リビダ 2 0 . 4

ンス T A— 2 2 2

ストレプトミセス · グリセ 4 0 . 0

ウス T A — 2 2 3 実施例 8 P H K 0 3 0 にクーロン化された 3 . 8 3 kbp の D N A断片の塩基配列の決定

P H K 0 3 0 にクーロン化された 3 . 8 kbp の D N A 断片 1 〃 gを 8 0 0 bp以下の長さになるよう各種制限酵素を用いて分解した。ここで得られた D N A分解物と、同種の制限酵素を用いて切断した M l 3 m p 1 8 R F (宝酒造） 0 . 5 〃ぉょび1^ 1 3 111 1 9 1¾ ? (宝酒造） 0 . 5 〃 gを T 4 D N A リガーゼ（ 8 ユニット）を含む L G緩衝液（ 3 0 mMトリス塩酸、 pH 7 . 5 、 6 mM塩化マグネシウム、 1 0 mMジチオスレイト一ノレ、 5 0 g Zmlゥシ血清アルブミン、 0 . 5 m M A T P ) 2 0 〃 1 中で 4 °C、 1 6 時間反応した。この処理により組換え体 D N Aが反応液中に得られた。この組換え体 D N Aを塩化カノレシゥム処理（Maniatic et al. , Molecular Cloning, p 2 5 0 , ( 1 9 8 2 ) ) した大腸菌 J M 1 0 9 株 ( C. Yani sch-Perrson, et al . , Gene 3 3 , p i 0 3 ，（ 1 9 8 5 ) ) に導入した。これを、 1 mMィソプ口ピル一 /3 — D — チォ一ガラクトピラノシド（ I P T G、宝酒造製）と 0 . 0 3 % 5 — プロモー 4 — クロロー 3 — インドリノレ一 / S — D — ガラクトシド（ X— g a 1 、宝酒造製）および別途培養した J M 1 0 9 株 0 . 2 mlを含む 4 2 でに保温した軟寒天培地（ 1 % トリプトン、

0 . 5 %酵母エキス、 l % N a C l 、 0 . 5 %寒天） 2 . 5 mlに添加し、 2 7 mlの L寒天培地（ 1 % トリブトン、 0 . 5 %酵母エキス、 l % N a C l 、 1 . 5 %寒天）上に重層し、 3 7 °Cで 1 6 時間培養することによりプラークを得た。ここで調製したプラークを J M 1 0 9 株に吸着させて培養し、その培養上清から 1 本鎖 D N A を抽出し（Messing et al. , Gene， 3 3 ， 1 0 3 ( 1 9 8 5 ) ) 、ジデォキシン ' チェイン · ターミネータ一法 ( Sanger. F. et al. , Pro Nat 1. Acad. Sci. U. S. A. , 7 4 ， 5 4 6 3 , ( 1 9 7 7 ) ) により、 S E Q U E N A S E D N A S eqencing Kit (東洋紡社）を使用して、塩基配列を決定した。

その結果、 P H K 0 3 0 にク一ロン化されているノカルジァ · ォゥトトロヒカ N— 1 0 2 染色体 D N A由来 D N A断片は 3 8 3 6 bpであり、上流から 2 3 0 O bpにィシェ一シヨンコドンを持つ、 1 1 9 4 bp、 3 9 8 アミノ酸からなるオープンリーディングフレームがあることが明かとなった（第 5 図及び第 6図）。

更に、 P H K 0 3 0 をサブクロ一ニングし、実施例 2 に示した方法と同様な方法で活性部位を調べたところ、上流から 1 3 4 O bpに存在する S a c I サイトから 3 8 3 0 bpの H i n d ill サイトまでの 2 4 9 0 bpのフラグメントにビ夕ミン D ₃ の 2 5位水酸化酵素活性があることが判った（第 7図）。このことから、第 5 図及び 6 に示したオープンリーディングフレーム（アミノ酸に翻訳した部分）にビタミン D ₃ の 2 5位水酸化活性が存在することが示唆された。

以上により、水酸化酵素をコードする遺伝子は第 8 図及び第 9図に示した塩基配列を有するところが明らかになつた。

産業上の利用可能性

2 5 位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換し、 2 5 — ヒドロキシビタミン D類を生成する水酸化酵素活性を発現する遺伝子はこれまでラットなど高等動物のみに見出されてきた。

本発明は微生物に起源をもち、高等動物に見出されたものとは異なる構造を有する、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換し 2 5 一ヒドロキシビ夕ミン D類を生成する水酸化酵素活性を発現する遺伝子を提供する。また、本発明は、 2 5 位に水素原子を有するビ夕ミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換し、 2 5 — ヒドロキシビタミン D類を生成する水酸化酵素活性を有する水酸化酵素をコードする遺伝子に関し、該遺伝子の D N A断片を含有する組換えプラスミドを提供する。さらに該遺伝子を含有する組換えブラスミドを他の微生物に導入することによって得られる形質転換微生物が提供される。この形質転換微生物は、 2 5 位に水素原子を有するビタミン D類を 2 5 — ヒドロキシビ夕ミン D類へ該遺伝子の起源株よりも効率よく変換できる。従って、該形質転換微生物は活性型ビタミン D 3 などのビタミン D類の製造プロセスに応用すること力できる。

本発明が提供する該遺伝子を含有する組換えプラスミドを該遺伝子の起源株ゃビタミン D類の水酸化能を有する微生物（例えば特開平 2 — 4 6 9 号公報ゃ特開平 2 - 2 3 1 0 8 9 号公報に記載の微生物）に導入することにより、その遺伝子の増幅効果によって、変換効率のよい株または単位基質（ビ夕ミン D類）の変換時間の短い株の育種や、その微生物の保有するビ夕ミン D類の 1 位水酸化能と共同して 1 ひ， 2 5 — ジヒドロキシビ夕ミン D類を効率よく生産できる株の育種が期待できる。

Claims

請求の範囲

1. 2 5 位に水素原子を有するビ夕ミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換することのできる放線菌由来の水酸化酵素をコードする遺伝子、またはそれを含む D N A。

2. 水酸化酵素をコードする遺伝子を含む D N Aが、 2 5 位に水素原子を有するビ夕ミン D類の 2 5 位水素原子を水酸基に変換する能力を有する放線菌の染色体に由来する約 3 . 8 3 kbの D N A断片であって第 1 図で表される制限酵素切断地図を有する請求の範囲第 1 項記載の D N A。

3. 水酸化酵素をコードする遺伝子が、第 8 図及び第 9 図に記載のァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を有する請求の範囲第 1 項記載の水酸化酵素をコードする遺伝子。

4. 放線菌がノカルジァ（Nocardia) 属またはアミコラタ ( Amycolata ) 属である請求の範囲第 1 項から第 3 項のいずれか 1 項記載の水酸化酵素をコードする遺伝子、またはそれを含む D N A。

5. 放線菌がノカルジァ ' ォゥトトロヒカ（^cardia autotrophica) である請求の範囲第 1 項から第 4 項のいずれか 1 項記載の水酸化酵素をコードする遺伝子、またはそれを含む D N A ₀

6. 請求の範囲第 1 項から第 5 項のいずれか 1 項記載の水酸化酵素をコードする遺伝子、またはそれを含む D N Aを含有する組換え体 D N A。

7. 微生物細胞内で自己増殖可能な請求の範囲第 6 項記載の組換え体 D N A。

8. プラスミド P H K 0 3 0 または P H K 0 3 1 である請求の範囲第 7項記載の組換え体 D N A。

9. 請求の範囲第 7 項または第 8 項記載の組換え体 D N Aを保持する形質転換微生物。

10. 形質転換微生物がストレプトミセス，リビダンス ( Streptomyces 1 i vidans) T A - 2 2 2 またはストレプ卜ミセス · グリセウス ( Streptomyces griseus ) T A - 2 2 3 である請求の範囲第 9 項記載の形質転換微生物。