JPH02469A - ビタミンｄ類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒドロキシビタミンＤ類の微生物を利用する
製造方法に関する。

従来の技術 有機化学的方法によりビタミンＤ類の１α及び／又は２
５位に直接水酸基を導入することは極めて困難で、その
例は未だ報告されていない。

また、微生物を用いた酵素化学的方法によりビタミンＤ
類に直接水酸基を導入する方法も、これまでに報告され
ていない。

一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により原料のビ
タミンＤ類の１α及び／又は２５位に直接水酸基を導入
することは、従来から可能であった。すなわち、１α位
に直接水酸基を導入する場合、ニワトリなどの動物の腎
のホモジネートやミドフンドリア画分を用いる方法［ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２３０巻、第２２８頁（
１９７１年）、ジャーナルオブバイオロジカルケミスト
リ＝（Ｊ、　Ｂｉｏｌｏｇ。

Ｃｈｅｆｆｉ、　）　、第２４７巻、第７５２８頁（１
９７２年）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、第２５巻、第５５１２頁（１９８６年）など
］が知られている。また、２５位に直接水酸基を導入す
る場合、ラットなどの動物の単離した肝臓にビタミンＤ
類を含む溶液を潅流させる方法［ジャーナルオブクリニ
カルインベステイゲーション（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎ
ｖｅｓｔ、　）　、第４８巻、第２０３２頁（１９６９
年）、バイオケミカルアンドバイオフィジカル　リサー
チ　コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）、第
６６巻、第６３２頁（１９７５年）］やラットなどの動
物の肝のホモジネートを用いる方法［バイオケミカルア
ンドバイオフィジカルリサーチ　コミュニケーション（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　）　、第３６巻、第２５１頁
（１９６９年）コが知られている。

発明が解決しようとする課 しかしながら、動物臓器を用いた酵素化学的方法では、
多量の動物の腎又は肝が必要であり、しかもその調製に
手間がかかり、非効率的で実用的な製造法ではない。

本発明は、より容易な操作による１α−及び／又は２５
−ヒドロキシビタミンＤ類を得る方法を提供することを
目的とする。

課題を解決するための手段 本発明者らは、特定の微生物を利用することにより、ビ
タミンＤ類の１α及び／又は２５位に直接水酸基を導入
できることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、ビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はそ
の産生する酵素を含有する溶液中に１α又は２５位に水
ＭＭ子を有するビタミンＤ類を加えて、それぞれその水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒド
ロキシビタミンＤ類又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類
の製造方法、並びにビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌
体又はその産生ずる酵素を含有する溶液中に１α及び２
５位に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、その水
素原子を水酸基に変換することを特徴とする２５−ヒド
ロキシビタミンＤＭ又は１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造方法である。す
なわち、本発明によれば、１α位又は２５位に水素原子
を有するビタミンＤ類は、それぞれその水素原子が水酸
基に変換きれ、１α及び２５位に水素原子を有するビタ
ミンＤ類は、まずその２５位水素原子が水酸基に変換さ
れ、次いで、１α位が水酸基に変換される。

本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の１α及び／又は２
５位に直接、１工程で水酸基を導入する方法であり、１
α又は２５位以外にいずれの置換基を有していてもよい
、従って、本発明においてビタミンＤ類とは、たとえば
、ビタミンＤ、系及びビタミンＤ、系の化合物であり、
その１７位側鎖の水素原子又は水酸基がフッ素などのハ
ロゲン原子、水酸基、低級アルキル基などで置換きれて
いてもよい。原料のビタミンＤ類の１α又は２５位は、
これが水素原子以外のときは水酸基であることが好まし
い。それらは、たとえば、ビタミンＤ！、ビタミンＤ８
．１α−ヒドロキシビタミンＤいｌα、２４−ジヒドロ
キシビタミンＤｓ、２５−ヒドロキシビタミンＤＡ、２
５−ヒドロキシビタミンＤ３．２４．２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ、、２３．２５−ジヒド「Ｊキシビタミン
Ｄ、、２５．２６−ジヒドロキシビタミンＤ３．２３．
２４．２５−トリとドロキシビタミンＤ８．２４．２４
−ジフルオロ−２５−ヒドロキシ−２６，２７−シメチ
ルビタミンＤ８．２５−ヒドロキシ−２６，２６，２６
，２７゜２７．２７−ヘキサフルオロビタミンＤ、など
である。

本発明に使用される放ｎ！２とは、ビタミンＤＭの１α
及び／又は２５位に水酸基を導入する能力を有する放線
菌である。それらは、たとえば、アクチツマジュラ（Ａ
ｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　）属、ロドコッカス（Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ　）属、チャイニア（Ｃｈａｉｎｉａ
）！、ストレプトパーティシリウム（Ｓｔｒｅ　ｔｏｖ
ｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アクチノプラネス（酸見
μ遍匹胡）属、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏ　１ａ
ｎｅｓ）属、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓ
　ｏｒａ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　）属、
ストレプトマイセス〈兆匹匹印パ朋）属などに属するも
のであり、好ましくは、本発明者らが埼玉県大宮市の土
壌より新たに分離した菌株であり、微生物の名称及び記
号１ストレプトマイセス・スクレロチアラスＴ−ＪＳＩ
（兆朋匹叩バ朋５ｃｌｅｒｏｔｉａｌｕｓ　Ｔ　−Ｊ　
Ｓ　１　）Ｊ及び１微生物の保管受託番号第１３７０号
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３７０）、として工業技術院微生
物工業研究所に寄託されているもの、本発明者らが山梨
県南部留郡鳥沢村の土壌より新たに分離した菌株であり
、微生物の名称１ストレプトマイセス・ロゼオスポラス
Ａ−５７９７（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓｇ朋Ａ−５７
９７）Ｊ及び１微生物の保管受託番号第１５７４号（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−１５７４）Ｊとして工業技術院微生物工
業研究所に寄託されているもの、又は、本発明者らが埼
玉県大宮市の土壌より新たに分離した菌株であり、微生
物の名称１ノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２（
Ｎｏｃａｒｄｉａ　肚印竺並垣ｃａ　Ｎ　−１０２）Ｊ
及び１微生物の保管受託番号第１５７３号（ＦＥＢ１３
８Ｐ−１５７３）、として工業技術院微生物工業研究所
に寄託されているものである。

これらの菌株の菌学的性状を以下に示す。

ａ、ストレプトマイセス・スクレロテアラスＴ−Ｊ　Ｓ
　１ １）形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地において分岐
しながらよく発達する。気菌糸はイースト麦芽寒天培地
、オートミール寒天培地、スターチ無機塩寒天培地、グ
リセリン・アスパラギン寒天培地でわずかに形成される
。胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で螺旋状の胞子連
鎖形態を呈する。１３子は通常１０個以上の連鎖が認め
られ表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で、その太
ききは０．５７〜１．ＯＸｏ、６４〜１．４Ｐである。

螺旋状の胞子連鎖はスターチ・無機塩寒天培地で最もよ
く発達する。栄養菌糸には菌核が観察される。また、イ
ースト麦芽寒天培地で２週間培養した場合には胞子のう
に類似した形態を呈する胞子の集束が観察きれる。べん
毛胞子は観察されない。

２）培地上での生育状態 各種培地で２８’Ｃ，１４日間培養したときの肉眼的観
察結果を第１表に示す。

第１表 ３）生理的性質 （１）生育温度範囲 スターチ・無機塩寒天培地上において２５〜３５°Ｃの
範囲で良好に生育する。

１０℃以下、４５℃以上の温度範囲では生育しない。

（り生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化：　　　　　陽性 Ｃ）脱脂乳の凝固：　　　　　　陰性 ｄ）脱脂乳のペプトン化；　　　陽性 ｅ）スターチの加水分解；　　　陽性 ｆ）メラニン様色素生成；　　　陰性 （３）炭素源の利用 （ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 以下の炭素源すべてを利用する。

Ｄ−グルフース、Ｄ−フラクトース。

イノシトール、ガラクトース、スターチ。

シュクロース、ラムノース。

Ｄ−マンニット、Ｌ−アラビノース。

Ｄ−キシロース、ラフィノース 以上の性状から本菌株が放ＩＩＩに属することは明らか
であり、上記諸性状をＩ　、　Ｓ、　Ｐ、’インターナ
ショナル・ストレプトマイセス・ブロジェクトヨ。

バージ−著「マニュアル・才ブ・デイターミナテイプ・
バクテリオロジー」第８版（１９７４年）及びワックス
マン著ｒジ・アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）
に報告きれている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はストレプトマイセス・スクレロチアテスに最も近い
性状を示していた。

以上の結果より、本菌株はストレプトマイセス・スクレ
ロチアラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はス
トレプトマイセス・スクレロチアラス　Ｔ−Ｊ　Ｓ　１
と命名した。

ｂ、ストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７９
７ １）形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、亀子はグリセリン・アスパラギン寒天培地、スターチ
無機塩寒天培地及びオートミール寒天培地などで良好に
形成される６ｗ４微鏡で観察すると胞子形成菌糸の分岐
方法は単純分岐で胞子は直鎖状に形成きれる。胞子は通
常１０個以−ヒの連鎖が認められ、培養の後期には長い
鎖状を呈し、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形で
、その太ききは０．６７〜０．７５Ｘ　１．３０〜１．
５８４である。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察きれ
ない。

２）培地上での生育状態 各種培地で３０°Ｃ１１４日間培養したときの南限的観
察結果を第２表に示す。

第２表 ３）生理的性質 （υ生育温度範囲 オートミール寒天培地上において２０〜３０℃ｃ７）Ｑ
［囲で良好に生育する。

１０°Ｃ以下、４０°Ｃ以上の温度範囲では生育しない
。

（り生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化；　　　　　陽性 Ｃ）脱脂乳の凝固；　　　　　　陰性 ｄ）脱脂乳のペプトン化；　　　陽性 ｅ）スターチの加水分解；　　　陽性 ｆ）メラニン様色素生成；　　　陰性 ｇ）細胞壁タイプ；　　　　　　　Ｉ型（３）炭素源の
利用 （ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 利用する二叶グルコース、Ｌ−アラビノース。

叶キシロース 、Ｆ）ずかに利用する＝Ｄ−フラクトース。

ラムノース 利用しない：シュクロース、イノシトール。

ラフィノース、Ｄ−マンニット 以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らかで
あり、上記諸性状を１．Ｓ、Ｐ、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」、バージ−著１
マニュアル・オブ・ディターミナティブ・バクテリオロ
ジー」第８版（１９７４年）及びワックスマン著１ジ・
アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）に報告諮れて
いる多くの既知菌種と比較した結果、本菌株はストレプ
トマイセス・ロゼオスポラスに最も近い性状を示してい
た。

以上の結果より、本菌株はストレプトマイセス・ロゼオ
スポラスと種を同じくするものと判断し、本菌株はスト
レプトマイセス・ロゼオスポラスＡ−５７９７と命名し
た。

Ｃ，ノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２１）形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則的に分岐する。また隔壁は認められない
、胞子はグリセリン・アスパラギン寒天培地及びスター
チ無機寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡で観察
すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で胞子は直鎖
状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ
、培養の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑である。

胞子の形状は円筒形で、その大きさは０．５〜０．８×
２．５〜４．３Ｐである。菌核、胞子のう、べん毛胞子
はｆｉ察されない。

２）培地上での生育状態 各種培地で３０°Ｃ５１４日間培養したときの肉眼的観
察結果を第３表に示す。

第３表 ／ ／′ ／ 、／ ／ ／ ３）生理的性質 （１）生育温度範囲 栄養寒天培地上において２０〜３０°Ｃの範囲で良好に
生育する。

１０℃以下、４０℃以上の温度範囲では生育しない。

（り生化学的性質 ａ）好気性、嫌気性の区別；　　好気性ｂ）ゼラチンの
液化；　　　　　陰性 Ｃ）脱脂乳の凝固；　　　　　　陰性 ｄ）脱脂乳のペプトン化；　　　陰性 Ｃ〉スターチの加水分解；　　　陰性 ｆ）メラニン様色素生成；　　　陰性 ｇ）硝酸還元能；　　　　　　　陰性 ０）炭素源の利用 （ブリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 利用する＝Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース。

シュクロース、Ｄ−キシロース。

Ｌ−イノシトール、Ｄ−マニトース。

Ｄ−フラクトース、ラムノース わずかに利用する：ラフィノース 以上の性状から本菌株が放線菌に属することは明らかで
あり、上記諸性状を１．Ｓ、Ｐ、’インターナショナル
・ストレプトマイセス・プロジェクト」。

バージ−著「マニュアル・才ブ・ディターミナティブ・
バクテリオロジー、第８版（１９７４年）及びワックス
マン著１ジ・アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）
に報告されている多くの既知菌種と比較した結果、本菌
株はノカルジア・オウトトＯヒ力に最も近い性状を示し
ていた。

以上の結果より、本菌株はノカルジア・オウトトロヒ力
と種を同じくするものと判断し、本菌株はノカルジア・
オウトトロヒカＮ−１０２と命名した。

本発明の方法は、放線菌の菌体又はその産生ずる酵素を
含有する溶液中で、基質ビタミンＤ類を好気的条件下で
反応きせることによって行うものである。

反応に必要な放線菌の菌体を得るためには、好気条件下
で本閑の培養を培地中で行う。

培地は主として液体培地を用い、炭素源としてグルコー
ス、マルトース、デキストロース、スターチ、アラビノ
ース、キシロースを単独又は混合して用いる。窒素源と
しては、ボリペブ）・ン。

カサミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンステーブリ
カー及びソイビーンミールなどを単独又は混合して用い
る。その他、本菌株の生育を助け、１α−及び／又は２
５−ヒドロキシビタミンＤ類の生産を促進する有機物及
び無機塩を必要番こより添加することができる。培養方
法は振とう培養、通気攪拌培養などの好気培養が適して
おり、ｐＨ６〜７．４．２８〜３０℃で２〜８日間培養
する。

この培養により得られた菌体を含有する溶液を、１α−
及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類を生産する反
応に用いる。すなわち、培養中の菌体を含む培養液をそ
のまま用いるか、培養終了後、遠心分離又はＵ過により
分離した菌体を懸濁した溶液を用いる。また、培養後に
得られた菌体を破砕後、遠心分離などにより菌体を除い
た溶液を用いる。きらにまた、菌体は光架橋性Ｉ６１詣
プレポリマー、たとえばＥＮＴ３４００［商品名；関西
ペイント（株）製］などや、ウレタン・プレポリマー、
たとえばＰＵ−９［商品名；東洋ゴム（株）製］などや
に一カラギナンなどの多糖類に固定化してから溶液に添
加してもよい。

また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同様に用い
ることもできる。

本発明において用いられる溶液は、前記培地であるか、
あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリ
ウムーフハク酸、フハク酸カリウムーフハク酸、クエン
酸ナトリウム−クエン酸、リン酸、カコジル酸ナトリウ
ム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの
緩衝液を弔独又は混合したものである。その他、緩衝液
には、目的のビタミンＤ類の生産を促進する界面活性剤
、有機物及び無機塩を必要により添加することができる
。

本発明の製造方法は、前記菌体を含有する溶液中で振と
う操作、通気攪拌操作などに付して好気条件下で行うこ
とが適しており、ｐＨ５〜８．２０〜３７°Ｃで５分間
〜９６時間攪拌振とうする。また、酸素気流下で反応す
ることができる。基質のビタミンＤ類は攪拌振とう開始
時に適量添加する。

また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は、基質
ビタミンＤ類を添加後、更に同条件下で２４〜９６時間
培養して本反応を行う。

なお、１α及び２５位に水素原子を有するビタミンＤ類
を原料とする場合、後記の高速液体クロマトグラフィー
等で生成物を確認して反応時間をさめ、２５−ヒドロキ
シビタミンＤ類又は１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ類をそれぞれ製造するこ
とができる。

これらの反応により製造されたビタミンＤ類を／Ｉｔ　
ＰＩＬするには、血液中からビタミンＤ類を採取する一
般的な方法に準じて行えばよい。たとえば、反応終了後
、反応液を有機溶媒により抽出し、濃縮乾固する。これ
を２−プロパノ−ルーｎ−ヘキサンなどの適当な溶媒に
溶解し、遠心分離により不溶物を除いた後、シリカゲル
順層カラム（たとえば、ゾルパックスＳＩＬ、米国デュ
ポン社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー又はシ
リカゲル逆層カラム（たとえば、ゾルパックスＯＤＳ。

米国デュポン社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ
ーに付すことにより目的のヒドロキシビタミンＤ類を単
離することができる。

発明の効果 本発明の方法により、ビタミンＤ類のｌα及び／又は２
５位へ直接水酸基を導入することが可能になった。すな
わち、本発明の微生物を用いる方法では、微生物や反応
溶液などの調製に手間がかからず、しかも１段階で短時
間に行うことができ、極めて容易かつ能率的である。

及履刻 以下、実施例及び試験例をあげて本発明をきらに詳細に
説明する。

実施例１ スターｆ１％、マルトース１％、デキストリン１％、ソ
イビーンミール１．５％、肉エキス０．３％、カザミノ
酸０．５％、炭酸カルシウム０．４％、　ｐＨ７，０の
無菌液体培地５０ｄの入った５００ｍＱの三角フラスコ
５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロデアラ
スＴ−Ｊ　Ｓ　１を１白金耳ずつ接種し、３０°Ｃで４
８時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心
分離して菌体を集め、この菌体を１５ｍＭトリス−酢酸
、２５ｍＭコハク酸ナトリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウ
ム及び２００ｍＭシュクロースからなるｐＨ７，４の緩
衝液（以下、緩衝液Ａと略す）２００ｄに懸濁し、ｉｌ
Ｔびこの懸濁液を遠心分離して菌体を集めた。この菌体
をきらにｔｉｆｔ衝液Ａ　２００ｍＱに充分攪拌して懸
濁し、５００ｍ１ｌの三角フラスコ５本にそれぞれ４０
ｒ＋ｔｌｌずつ分注し、３０℃で５分間保温した。その
三角フラスコ５木のそれぞれに４００−のエタノールに
溶解した４００題の基１２５−ヒドロキシビタミンＤ、
を添加し、３０″Ｃで４５分間攪拌振とうした。各三角
フラスコの反応液を集め、塩化メチレン１１で抽出し、
塩化メチレン后を４０°Ｃ以下で減圧乾固後、直ちに２
−プロパツール：ｎ−ヘキｔン；１：９の混合溶媒７．
５ｍｌに溶解し、−２０℃で３時間放置した。これを遠
心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清液
を４０℃以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフ
ィー［ゾルバ・／クスＳＩＬ、米国デュポン社製］に付
した。

’ｆｆｌ　出ｍ　媒；　２−プロパツール：ｎ−ヘキサ
ン＝１　：　９　。

カラム温度；２５°Ｃ２溶出速度；１．５ｙｎＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた０次に
これを４０″Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１：９゜ カラム温度；　４０”Ｃ、溶出速度；１．０ｍ１ｌ／分
。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
を２００（得た。　これは市販の１α、２５−ジヒドａ
キシビタミンＤ、（デュファー社製、オランダ）の標品
と液体クロマトグラフィ−の保持時間［ゾルバ・７クス
ＳＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開
裂／くターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍａｚ”　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−Ｈ，Ｏ）　、　３
８０（Ｍ”−２Ｈ！Ｏ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１２９　、１１６　、１１１　。

実施例２ 実施例１と同様にして、２４．２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、から１α、　２４．２５−トリヒドロキシビタ
ミンＤ、を得た。

実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾル
パックスＳＩＬ］における保持時間は、２９．４分であ
った。

最大紫外部吸収： λ１１６ｚ−２６５ａｍ（エタノール）Ｅ　　Ｉ　−Ｍ
　Ｓ（ｍ／ｚ）： ４３２（Ｍ”）　、　４１４（Ｍ”−Ｈｌｏ＞　、　３
９６（Ｍ”−２ＨｆＯ）　。

２８７．２６９．２５１．１５２，１３４．１１６．５
９実施例３ 実施例１と同様にして、２５−ヒドロキシビタミンＤ、
から１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、を得た。

実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾル
パックスＳＩＬ］における保持時間は、１４．４分であ
った。

最大紫外部吸収： λｍａｚ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）： ４２８（Ｍ”）　、　４１０（Ｍ”−Ｈ＊０）　、　３
９２（Ｍ”−２８ｔＯ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１１６　、５９実施例４ 実施例１と同様にして、　２４．２４−ジフルオロ−２
５−ヒドロキシ−２６，２７−シメチルビタミンＤ、か
ら１α、２５−ジヒドロキシ−２４，２４−ジフルオロ
−２６，２７−シメチルビタミンＤ、を得た。

最大紫外部吸収： λｗａｘ”　２６５　ｎｍ（ｒ、タノール）Ｅ　Ｉ−Ｍ
Ｓ（ｍ／ｚ）： ４８０（Ｍ”）　、　２８７　、２６９．２５１　、１
５２．１３４　、１１６実施例５ 実施例１と同様にして、２５−ヒドロキシ−２６，２６
゜２６、２７．２７．２７−ヘキサフルオロビタミンＤ
、から１α、２５−ジヒドロキシ−２６，２６，２６，
２７，２７，２７−ヘキサフルオロビタミンＤ、を得た
。

最大紫外部吸収： λｍａｘ−２６５ｎｍ（エタノール） Ｅ　Ｉ−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ５２４（Ｍ”）　、　２８７　、２６９　、２５１　、
１５２　、１３４　、１１６実施例６ グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コー
ンスチーブリ力−０，５％、塩化ナトリウム０５デ≦、
炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５
０ｍ１の入った５００ｍ１ｌの三角フラスコ５本のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７
９７を１白金耳ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を１５ｍＭ　トリス−酢酸、２５ｍＭ
フハク酸ナトリウム及び２ｍＭ酢酸マグネシウムからな
るｐＨ７，４の緩衝液（以下、緩衝液Ｂと略す）２００
ｍｌに懸濁し、ストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ
−５７９７の菌懸濁液を調製した。この菌懸渭液を再び
遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液Ｂ
　２００ｍ１ｌに充分攪拌して懸濁し、５００ｍ１ｌの
三角フラスコ５本にそれぞれ４０ｍ１ｌずつ分注し、３
０°Ｃで５分間保温した。その三角フラスコ５本のそれ
ぞれに１００４のエタノールに溶解したｚｏｏ、ｇの基
質２５−ヒドロキシビタミンＤ、をｆｌｉ　加し、３０
°Ｃで９０分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応
液を集め、塩化メチレン１１で抽出し、塩化メチレン層
を４０’Ｃ以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパツール
：ｎ−ヘキサン−１：９の混合溶媒７．５ｍｌに溶解し
、−２０℃で３時間放置した。

これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。こ
の上清液を４０’Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速ン１クロ
マトグラフィー［ジノしパックスＳＩＬ。

米国デュポン社製］に付した。

ｒＮ　出ｍ　媒；　２−プロパツール：ｎ−ヘキサン−
１：９Ｉ カラム温度；２５“Ｃ９溶出速度；１．５ｄ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの画分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜ カラム温度、　４０’Ｃ、溶出速度；１．０ｍ９７分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの画分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
を２００尾得九０　これは市販の１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ、（デュファー社製２オンンダ）の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパックスＳ
ＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｌｌ１６ｘ”　２６５　ｎｏ＋（エタノ−ル）Ｅ　ｒ
−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　、　３９Ｊ３（Ｍ”−Ｈ，Ｏ）　、　
３８０（Ｍ”−２Ｈ，Ｏ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１２９　、１１６　、１１１　。

実施例７ グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コー
ンスデーブリカ−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、
炭酸カルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５
０ｍ１の入った５００ｍＱの三角フラスコ５本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２を１白金耳
ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振とう培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、この菌
体を緩衝液Ｂ　２００ｍＨに懸濁し、ノカルジア・オウ
トトロヒカＮ−１０２の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をさら
に緩衝液Ｂ　２００ｍＱに充分攪拌して懸濁し、５００
ｍＱの三角フラスコ５本にそれぞれ４０ｍ１ずつ分注し
、３０℃で５分間保温した。その三角フラスコ５本のそ
れぞれに１００μのエタノールに溶解した２００尾の基
質２５−ヒドロキシビタミンＤ、を添加し、３０’Ｃで
４５分間攪拌振とうした。

各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレン１１で抽
出し、塩化メチレン届を４０°Ｃ以下で減圧乾固後、直
ちに２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝１＝９の混合溶
媒７．５ｍＱに溶解し、−２０°Ｃで３時間放置した。

これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。こ
の上清液を４０°Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速液体クロ
マトグラフィー［ゾルバ・ＺクスＳＩＬ、米国デュポン
社製］に付した。

溶出？１１［；２−プロパツール：ｎ−へキサ７　。

１＝９゜ カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度Ｈ１，５ｍ１ｌ／分。

）オドダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤＭの紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ　、米国デュポン社製］
に付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜ カラム温度；４０℃、溶出速度；１．（１ｍＱ／分。

）オドダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大極電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
を１００尾得尾得　これは市販の１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ、（デュファ−社製、オランダ）の標品
と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパックスＳ
ＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍａｘ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ　−Ｍ
　Ｓ（ｍ／ｚ）Ｈ ４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−１１ｆｆｉＯ）　
、　３８０（Ｍ”−２Ｈ！Ｏ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１２９　、１１６　、１１１　。

実施例８ スクーチ１％、マルトース１％、デキストリン１％、ソ
イビーンミール１．５％、肉エキス０．３％、カブミノ
酸０．５％、次階カルシウム０．４％、　１）Ｈ７，０
の無菌液体培地５０ｍ１ｌの入った５００−の三角フラ
スコ５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレｉ］
チアラスＴ−Ｊ　Ｓ　１を１白金耳ずつ接種し、３０°
Ｃで４８時間攪拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌体を緩衝液Ａ　２０
０ｍＱに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離して菌体を
集めた。　この菌体をきらに緩衝液Ｂ２００ｍ１１に充
分攪拌して懸濁し、５００ｍ１１の三角フラスコ５本に
それぞれ４０ｄずつ分注し、３０°Ｃで５分間保温した
。　その三角フラスコ５本のそれぞれに１００μのエタ
ノールに溶解した２００題の基質１α−ヒドロキシビタ
ミンＤ、を添加し、３０℃で９０分間攪拌振とうした。

各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレン１１で抽
出し、塩化メチレン層を４０℃以下で減圧乾固後、直ち
に２−プロパツール：ｎ−ヘキサン−１＝９の混合溶媒
７．５ｍＱに溶解し、−２０°Ｃで３時間放置した。こ
れを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この
上清液を４０°Ｃ以下で減圧上濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー［ツルパックスＳＩＬ、米国デュポン社製
］に付した。

溶出ｉ媒；２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝１＝９゜ カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度；１．５ｍＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大扉電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１：９゜ カラム温度；４０℃、溶出速度；１．０＋ｎｌｌ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大扉電子社製）で１′！＋ｑ定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０″Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒド［１キシビタミンＤ
、を２０Ｐｇ得た。　　これは市販の１α、２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ、（デュファー社製、オランダ）の
標品と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパック
ス５ＩＬＩ、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λ、ａｘ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−ＨｔＯ）　、　３
８０（Ｍ”−２Ｈ，Ｏ）　。

２８７、２６９．２５１．１５２．１３４．１２９．１
１６．１１１　。

実施例９ グルツース１．５％、ソイビーンミール１．５％、コー
ンスチーブリカ−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、
次階カルシウムＯ６２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５
０ｍ１ｌの入った５００ｒｄの三角フラスコ５木のそれ
ぞれにストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７
９７を１白金耳ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、この菌体を緩衝液Ｂ　２００ｒｄに懸濁し、ス
トレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ　−５７９７の菌
懸濁液を調製した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌
体を集めた。この菌体をさらに緩衝液Ｂ２００ｍ１に充
分攪拌して懸濁し、　５００ｍ１ｌの三角フラスＴ１５
本にそれぞれ４０ｍＱずつ分注し、３０°Ｃで５分間保
温した。　その三角フラスコ５本のそれぞれに１００−
のエタノールに溶解した２００Ｐｇの基質１α−ヒドロ
キシビタミンＤ、を添加し、３０°Ｃで１８０分間攪拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチ
レン１１で抽出し、塩化メチレン層を４０°Ｃ以下で減
圧乾固後、直ちに２−プロパツール＝ｎ−ヘキサン＝１
：９の混合溶媒７．５ｍＱに溶解し、−２０°Ｃで３時
間放置した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清
液を得た。この上清液を４０°Ｃ以ドで減圧上濃縮し、
高速液体クロマトグラフィー［ゾルパックスＳＩＬ、米
国デュポン社製］に付した。

溶出溶媒；２−プロバノールニｎ−ヘキサンエ１：９゜ カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度：１．５ｍＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの画分を集めた。次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤ５．米国デュポン社製］に
付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１　：　９　。

カラム温度；４０°Ｃ１溶出速度；　Ｌ、Ｏｄ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大揺電子社製〉で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ８を
５０尾得た。　　これは市販の１α、２５−ジヒドロキ
シビタミンｐｍ（デュファー社製、オランダ）の標品と
液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルパックスＳＩ
Ｌ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂バ
クーンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍＢ−２６５ｒ＋ｍ（エタノール） Ｅ　　Ｉ　−Ｍ　Ｓ（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−Ｈｌｏ）　、　３
８０（Ｍ”−２Ｈ，Ｏ）　。

２８７．２６９．２５１．１５２．１３４．１２９．１
１６．１１１　。

実施＠ｌＯ グルコース１．５％、ソイビーンミール１．５％、フン
スチーブリ力−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、次
階カルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５０
ｍ１ｌの入った５００ｍＱの三角フラスコ５本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２を１白金耳
ずつ接種し、３０°Ｃで４８時間攪拌振とう培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、この菌
体を緩衝液Ｂ　２００ｍＱに懸濁し、ノカルシア・オウ
トトロヒカＮ−１０２の菌懸濁液を調製した。この菌懸
濁液を再び遠心分離して菌体を集めた。この菌体をきら
に緩衝液Ｂ　２００ｍＱに充分攪拌して懸濁し、５００
ｍＱの三角フラスコ５木にそれぞれ４０ｍＱずつ分注し
、３０°Ｃで５分間保温した。その三角フラスコ５本の
それぞれに１００−のエタノールに溶解した２００尾の
基質１α−ヒドロキシビタミンＤ、を添加し、３０°Ｃ
で９０分間攪拌振とうした。各三角フラスコの反応液を
集め、塩化メチレン１１で抽出し、塩化メチレン層を４
０°Ｃ以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパツール：ｎ
−ヘキサン；１：９の混合溶媒７．５ｍｌに溶解し、−
２０℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性画分
を除き、上清液を得た。この上清液を４０°Ｃ以下で減
圧上濃縮し、高速液体クロマトグラフィーしゾルパック
スＳＩＬ、米国デュポン社製コに付した。

ｉｌ［媒；２−プロパツール：ｎ−へ−１−サン−１：
９゜ カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度；１．５ｍＱ／分２）
オドダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　。

大揺電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１５．４分付近のピークの両分を集めた０次に
これを４０°Ｃ以下で減圧ａｔｉｆｉシ、高速液体クロ
マトグラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社
製］に付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜ カラム温度；４ｏ’ｃ、ｉｓ出速度；　１．０ｍ９７分
。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

火源電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの両分を集めた。これを
４０’Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら減圧ａ縮乾固す
ることにより、１α、２５−ジヒド［１キンビタミンＤ
、を３５０尾得九０　これは市販の１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤｉ（デュファー社製、オランダ）の標
品と液体クロマトグラフィーの保持時間［ゾルバ・Ｚク
スＳＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： ＾□ｚ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−ＭＳ（
ｆｆｉ／Ｚ）： ４１６（Ｍ”）　　、　　３９８（Ｍ”−ＨｌＯ）、　
　３８０（Ｍ’−２８＊０）。

２８７、２５９．２５１．１５２．１３４．１２９．１
１６．１１１゜実施例１１ 実施例８と同様にして、１α、２４−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、から１α、２４．２５−　トリヒドロキシビタ
ミンＤ、を得た。

実施例１と同条件の高速液体クロ７トグラフイー［ゾル
パックスＳＩＬコにおける保持時間は、２９．４分であ
った。

最大紫外部吸収： λｍａｘ’１！　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ−
ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４３２（Ｍ”）　、　４１４（Ｍ”−ＨｌＯ）　、　３
９６（Ｍ”−２Ｈ１０）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１１６　、５９実施例１２ ノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２を、グルツー
ス１．５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスチー
ブリ力−０，５％、塩化ナトリウム０．５％、次階カル
シウム０．２％、ｐＨ７，０（７）無菌液体培地５ｏ＋
Ｔｌｌ１ノ入った５００ｍ１ｌの三角フラスコ１本に１
白金耳接種し、３０゛Ｃで４８時間攪拌振とぅ培養した
。対数増殖期中にあるノカルジア・オウトトロヒカＮ　
−１０２の培養液中に２５０４のエタノールに溶解した
基質ビタミン０．５■及び０．５ｍＱのツイーン８０を
添加し、これを再び３０°Ｃで４８時間攪拌振とう培養
した。培養終了後、この培養液を塩化メ゛チレン２００
ｍ１で抽出し、塩化メチレン層を４０’Ｃ以下で減圧乾
固後、直ちに２−プロパノール二〇−ヘキサン＝１＝９
の混合溶媒３ｍ１１に溶解し、−２０°Ｃで３時間放置
した。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得
た。この上清液を４０’Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速液
体クロマトグラフィー［ゾルパックスＳＩＬ、米国デュ
ポン社製］に付した。

ｍ　出ｒＲＢ　；　２−プロパツール：ｎ−へキサン＝
３：２２゜ カラノ・温度；２５℃、　溶出速度ＨＬ５ｍｌｌ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズＭ　９９
０　、日本ウォーターズ社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤｙＡの紫外部吸収パターンと一致す
る保持時間４．０分付近のピークの両分を集めた。次に
これを４０℃以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグラ
フィー［ゾルパックスｏｐｓ、米国デュポン社製コに付
した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１：９゜ カラム温度；４０℃、溶出速度；　１．Ｏｄ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズＭ　９９
０　、日本ウォーターズ社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ［の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間８，０分付近のピークの両分を集めた。これを
４０℃以下で、窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固する
ことにより、２５−ヒドロキシビタミンＤ、を５００尾
得九０これは市販の２５−ヒドロキシビタミンＤ、（デ
ュファー社製、オランダ〉の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間［ゾルパックスＳＩＬ］、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。

最大紫外部吸収： λ、、ｘｘ　２６５　ａｍ（エタノール〉Ｅ　Ｉ−ＭＳ
（ｍ／ｚ）： ４００（Ｍ＋）、　３８２（Ｍ”−Ｈ，Ｏ）　、　２７
１　、２５３　、１３６　。

１１８．５９ 実施例１３ ノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２を、グルフー
ス１，５％、ソイビーンミール１．５％、コーンスゲ・
−ブリカー〇、５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カ
ルシウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ
７，０の無菌液体培地５０ＩＴＩｌｌの入った５００ｒ
Ｉｔｌ！の三角フラスコ１本に１白金耳液種し、３０℃
で４８時間攪拌振とう”；５Ｒした。対数増殖期中にあ
るノカルジア・オウトトロヒカＮ　−１０２の培養液中
に２５０Ｐｆ１のエタノールに溶解した基質ビタミンＤ
、５■及び０．０５ｍ１のツイーン８０を添加し、これ
を再び３０℃で６０時間攪拌振とう培養した。培養終了
後、この培養液を塩化メチレン２００ｒ＋ｔｌｌで抽出
し、塩化メチレン層を４０°Ｃ以下で減圧乾固後、直ち
に２−プロパノール二〇−ヘキサン−１：９の混合溶媒
３ｒｄに溶解し、−２０°Ｃで３時間放置した。これを
遠心分離し不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清
液を４０°Ｃ以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＳＩＬ、米国デュポン社製コに
付した。

溶出溶媒；２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝３：２２
゜ カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度Ｈ１，５ｍＱ／分。

）オドダイオードアレイ検出器（ウォーターズＭ９９０
．日本つォーターズ社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間１４，５分付近のピークの両分を集めた６次に
これを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製コに
付した。

溶出溶媒；水：メタノール−１：９゜ カラム温度；４０°ｂ フォトダイオードアレイ検出器（つオーターズＭ９９０
．日本ウォーターズ社製）で測定６溶出後、ビタミンＤ
類の紫外部吸収パターンと一致する保持時間５．６分付
近のピークの両分を集めた。これを４０℃以下で、窒素
ガス置換しながら減圧濃縮乾固することにより、１α、
２５−ジヒドロキシビタミンＤ、を５０題得た。　　こ
れは市販の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、（ア
ユファー社製。オランダ）の標品と液体クロマトグラフ
ィーの保持時間［ゾルパックスＳＩＬ］、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。

最大紫外部吸収： λｍ８ｘ＝２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅｌ−ＭＳ（ｍ
／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　、　３９８（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　、　３
８０（Ｍ”−２ＨｔＯ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１２９　、１１６　。

１１１．５９ 実施例１４ 実施例１２と同様にして、ビタミンＤＪから２５−ヒト
【コキシビタミンＤ、を得た。

実施例１２と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾ
ルパックスＳＩＬ］における保持時間は、３．９分であ
った。

最大紫外部吸収： λｍａｘ＝　２６５　ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ　−Ｍ
　Ｓ（ｍ／ｚ＞： ４１２（Ｍ”）　、　３９４（Ｍ”−Ｈ！Ｏ）　、　２
７１　、２５３　、１３６　。

１１８．５９ 実施例１５ 実施例１３と同様にして、ビタミンＤ、から１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ、を得た。

実施例１３と同条件の高速液体クロマトグラフィー［ゾ
ルパックスＳＩＬ］における保持時間は、１３，８分で
あった。

最大紫外部吸収： λ（ＢＢｚ−２６５ｎｍ（エタノール）Ｅ　Ｉ　−ＭＳ
（ｍ／ｚ）： ４２８（Ｍ”）　、　４１０（Ｈ”−Ｈ，Ｏ）　、　３
９２（Ｍ”−２８，Ｏ）　。

２８７　、２６９　、２５１　、１５２　、１３４　、
１１６　、５９実施例１６ （１）ノカルジア・オウトトロヒカＮ−１０２を、グル
ツース１．５％、ソイビーンミール１．５％、フ−ンス
チーブリ力−０５％、塩化ナトリウム０．５％、炭酸カ
ルシウム０．２％、ｐＨ７，０の無菌液体培地５０ｍＱ
の入った５００ｍＭの三角フラスコ１本に１白金耳接種
し、２８°Ｃで９６時間撹拌振とう培養した。

（２）以下の操作は２°Ｃないし８°Ｃの間で行った。

（１）で得られた菌体をｌｏｍＭ　トリス−酢酸、２ｍ
ＭＭ酸マグネシウム、７ｍＭ２−メツしカプトエタノー
ル及び２０％グリセリンからなるｐＨ７，４の緩衝液（
以下、緩衝液Ｃと略す）２００ｍＭに懸濁し閉部濁液と
してこれを遠心分離して得られた菌体を再び１００ｍＭ
のｉａ衝液Ｃに懸濁して閉部濁液とした。この懸濁ン夜
をディスパーザ−（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲ−ＲＡＸ■：商
品名、ＩＫＡ−ＷＥＲＫ社製）で２分間処理して菌体を
破砕し、菌体破砕、液とし、次にこれを遠心分離してそ
の上清液を得た。得られた−に清液にポリエチレングリ
コール６０００を終濃度２５％になるように攪拌しなが
ら少しづつ加えてこれを溶解した後、３０分間４°Ｃで
放置した６次に、この溶液を遠心骨はし、上清液を捨て
た後、粗酵素沈殿物を得た。

（３）　（２）で得られた沈殿物の約５００１７ｇ蛋白
質含量に相当する粗酵素を含む２０ｍＭ　トリス−酢酸
、７０ｍＷニコチンアミド、　２ｍＭ　ｆｈ酸マグネシ
ウム、１００ｍＭ　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　、　　５　ｍＭ　
Ａ　Ｔ　Ｐ　、　　６　ｍＭグルコース−６−リン酸、
ｐＨ７，４から成る酵素反応溶液１５ｍ１ｌにグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ５ユニット及び１５０
μのエタノールに溶かしたビタミンＤ　ｍ　３■を加え
、２８°Ｃで３０分間攪拌振とうし、酵素反応を行なっ
た。

（４）クロロホルム：メタノール＝１＝２の混合溶媒４
５ｍ１を（３）の酵素反応溶液に加え、反応を停止させ
た後、反応生成物をブライ・アンド・ダイヤ−（ｂｌｉ
ｇｈ　＆　ｄｅｙｅｒ）法で抽出した。抽出後、得られ
たクロロホルム画分を４０℃以下で減圧乾固後、直ちに
２−プロパツール：ｎ−ヘキサン＝１＝９の混合溶媒２
５０−に溶解し、これを高速液体クロマトグラフィー［
ゾルパックスＳＩＬ、米国デュポン社製］に付した。

溶出［Ｋ；２−プロパツール：ｎ−ヘキサン−３：２２
゜ カラム温度；２５°Ｃ１溶出速度；１．５ｍ１ｌ／分。

）すトダ・ｆオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００
　。

火源゛ＩＥ子社製）で４！り定。

（５）　＜４）の高速液体クロマトグラフィーの溶出後
、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間４．０分付近のピークの両分を集めた。

次にこれを４０’Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー［ツルパックスＯＤＳ、米［１デュポン社
製］に付した。

溶出溶媒：水：メタノール＝１：９゜ カラム温度；４０°Ｃ１溶出速度、　１．０ｍＱ／分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

大間電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間８．０分付近のピークの両分を集めた。これを
４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しなから減圧濃縮乾固す
ることにより、２５−ヒドロキシビタミンＤ、を１１６
Ｐ１ｇ得た。これは市販の２５−ヒドロヤシビタミンＤ
ｍ（デュファー社製、オランダ）の標品と液体クロマト
グラフィーの保持時間［ゾルパックスＳ　Ｉ　Ｌ］、紫
外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パターンが
完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍＢｚ＝　２６５　ｒｕｎ（エタノール）Ｅ　Ｉ−Ｍ
Ｓ（ｍ／ｚ）： ４００（Ｍ”）　、　３８２（Ｍ”−Ｈ＊Ｏ）　、　２
７１　、２５３　、１３６　。

１１８．５９ （６）　（４）の高速液体クロマトグラフィーの溶出後
、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する保持時
間１４．５分付近のピークの両分を集めた。

次にこれを４０°Ｃ以下で減圧濃縮し、高速液体クロマ
トグラフィー［ゾルパックスＯＤＳ、米国デュポン社製
］に付した。

溶出溶媒；水：メタノール＝１　：　９　。

カラム温度；４０℃、溶出速度；　１．０ｍ９７分。

フォトダイオードアレイ検出器（ＭＣＰＤ　３５００　
。

天場電子社製）で測定。

溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間５．６分付近のピークの画分を集めた。　これ
を４０°Ｃ以下で、窒素ガス置換しながら１ｆ−Ｉ　Ｉ
Ｅ　ｅ４￥Ｊ乾固することにより、１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ、を２０Ｐｇ得た。これは市販の１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤｍ（デュファー社袈、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフィの保持時間［
ゾルパックスＳＩＬ］、紫外線吸収スペクトラム、マス
スペクトル開裂パターンが完全に一致した。

最大紫外部吸収： λｍＢ−２６５ｎｍ（エタノール） ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）： ４１６（Ｍ”）　　、　　３９８（Ｍ”−ＨｆｉＯン　
、　　３８０（Ｍ”−２Ｈ，０ン　。

２８７、２６９．２５１　、１５２．１３４．１２９．
１１６゜１１１．５９ 、−（験例 １α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、のインビトロ薬
理活性試験［ラジオリセブターアッセイ法］ニワトリの
胎児の腸管より調製された１α、２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ、リセブタ−［ヤマサ醤油（株）］を１１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオ
スレイトール、１０ｍＭモリブデン酸ナトリウム、ｐＨ
７，４の緩衝液に懸濁させ、これをノセブター溶液（プ
ロティン約０．５ｍｇ／　ｍＱ　）として使用した。

このリセブター溶液に、５０％エタノールに溶解した被
検薬［１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ。

の標品（デュファー社製、オランダ）］及び実施例１で
得られた１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤＩを３又
は１０−１１０１〜１０−’Ｍになるように添加した０
次いで１Ｈ−１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、（
約０．４μＭ）を添加し、０°Ｃで３時間インキュベー
ションして反応を行った。リセブター結合物と非結合物
の分離はチャコール法を用いた。特異的結合量は、上記
反応より得られる総語合量から１０μＭの１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ、存在下に得られる非特異的結
合量を差し引いて求めた。被検薬の結合能は、リセブタ
ーへのＩＨ−１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、の
結合を５０％阻害する濃度（ｔｃｓｅ）で示した。

以上、実施例１．６．７．８．１３及び１６で得られた
ｌα、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、は、ラジオクセ
ブタ−アッセイ法によるインビトロ薬理試験において、
市販の標品と同一の活性を示した。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はその産
   生する酵素を含有する溶液中に１α又は２５位に水素原
   子を有するビタミンＤ類を加えて、それぞれその水素原
   子を水酸基に変換することを特徴とする１α−ヒドロキ
   シビタミンＤ類又は２５−ヒドロキシビタミンＤ類の製
   造方法
2. （２）ビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はその産
   生する酵素を含有する溶液中に１α及び２５位に水素原
   子を有するビタミンＤ類を加えて、その水素原子を水酸
   基に変換することを特徴とする２５−ヒドロキシビタミ
   ンＤ類又は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ類の製
   造方法
3. （３）放線菌がストレプトマイセス属又はノカルジア属
   に属する菌である請求項（１）又は（２）に記載の製造
   方法
4. （４）放線菌がストレプトマイセス・スクレロチアラス
   Ｔ−ＪＳ１（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｓｃｌｅ
   ｒｏｔｉａｌｕｓ￥Ｔ−ＪＳ１）である請求項（１）又
   は（２）に記載の製造方法
5. （５）放線菌がストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ
   −５７９７（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｒｏｓｅ
   ｏｓｐｏｒｕｓ￥Ａ−５７９７）である請求項（１）又
   は（２）に記載の製造方法
6. （６）放線菌がノカルジア．オウトトロヒカＮ−１０２
   （￥Ｎｏｃａｒｄｉａ￥￥ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ￥
   Ｎ−１０２）である請求項（１）又は（２）に記載の製
   造方法