WO1996028734A1 - Method of quantitating cholesterol in low-density lipoprotein - Google Patents

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Kazuhito Miyauchi
Akira Miike
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Kyowa Medex Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to a low-density lipoprotein that is important in the diagnosis of arteriosclerosis in the field of clinical diagnosis.
  • the present invention relates to a method for determining cholesterol (LDL cholesterol) in (LDL).
  • LDL cholesterol is determined by first measuring the total amount of cholesterol in the sample, then separately adding a precipitant for LDL and very low density lipoprotein (VLDL) to the sample, centrifuging, and centrifuging the supernatant.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • Cholesterol (hereinafter referred to as HDL cholesterol) in lipoprotein (HDL) was measured and calculated using the Friedewald conversion formula. Clinical Publishing Co., pp. 615, 1995).
  • HDL cholesterol lipoprotein
  • simply adding a serum sample directly to a reagent containing cholesterol esterase and cholesterol oxidase is no different from a system that measures total cholesterol, and there is no specificity for LDL cholesterol.
  • JP-A-58-165800 discloses a method for directly measuring the amount of LDL cholesterol in the presence of a special surfactant without a separation operation.
  • HDL cholesterol reacts simultaneously with LDL cholesterol, so that the LDL specificity is low, and the setting of reaction conditions is complicated, and it is difficult to apply the method to various samples.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-280812 also discloses that once LDL is aggregated, cholesterol in lipoproteins other than LDL is eliminated, the aggregated LDL is deaggregated, and LDL cholesterol is subjected to an enzymatic reaction to reduce LDL cholesterol. A method for measuring is disclosed.
  • the present inventors have determined that a) lipoproteins other than HDL, namely LDL, VLDL and In the presence of a reagent that inhibits the reaction of ilomicron (CM), HDL cholesterol is specifically reacted with a cholesterol reaction reagent to eliminate it, and then, if necessary, in the presence of a reagent that enables the reaction of LDL cholesterol.
  • Cholesterol in a sample containing 1 ⁇ 0 cholesterol can be specifically quantified without separation by using an enzyme reaction for cholesterol quantification using The cholesterol in the lipoproteins other than LDL is reacted with cholesterol to eliminate the cholesterol, and then the cholesterol reaction reagent is used to carry out an enzymatic reaction to determine cholesterol.
  • the inventors have found that cholesterol can be specifically quantified, and have reached the present invention.
  • the reaction inhibition of lipoproteins other than HDL means that the lipoproteins other than HDL are aggregated or the reactivity of the outer wall of the lipoproteins other than HDL is reduced so that only the outer wall of these lipoproteins is not selectively disrupted. By doing so, it refers to exposing cholesterol in HDL to a state capable of selectively undergoing an enzymatic reaction. Also, enabling LDL cholesterol to react refers to exposing LDL cholesterol to a state capable of undergoing an enzymatic reaction by disrupting the outer wall of LDL. Conversely, the reaction inhibition of LDL only means that LDL is aggregated or the reactivity of the outer wall of LDL is reduced to selectively prevent only the outer wall of LDL from collapsing. To expose cholesterol to a state where it can be selectively enzymatically reacted.
  • HDL cholesterol is eliminated from a sample containing LDL, and then cholesterol esterase and cholesterol oxidase or cholesterol oxidoreductase are acted on in the presence of a reagent capable of reacting LDL cholesterol, if necessary.
  • the present invention relates to a method for quantifying LDL cholesterol, characterized in that the amount of hydrogen peroxide or reduced coenzyme generated is quantified.
  • a reagent for quantifying cholesterol in LDL which comprises a reagent for inhibiting the reaction of lipoproteins other than HDL and a reagent for enabling the reaction of cholesterol in LDL, or inhibiting the reaction of lipoproteins other than HDL Cholesterol in LDL that combines a reagent that reacts with cholesterol in LDL
  • a reagent for quantifying cholesterol in LDL containing a reagent that inhibits only LDL as a component, a reagent that inhibits reaction of only LDL, and a reagent that makes cholesterol in LDL capable of reacting, It is possible to provide a reagent for quantifying cholesterol in LDL, which is obtained by combining a reagent for quantifying cholesterol or a reagent that inhibits the reaction of only LDL with a reagent that enables the reaction of cholesterol in LDL.
  • One of the above-mentioned quantification methods is to perform HD with a cholesterol reaction reagent in the presence of a reagent that inhibits riboproteins other than HDL, that is, LDL, VLDL and CM, and then react with cholesterol specifically to eliminate it.
  • Cholesterol esterase and cholesterol oxidase or cholesterol oxidoreductase are allowed to act in the presence of a reagent capable of reacting LDL cholesterol, thereby quantifying the generated hydrogen peroxide or reduced coenzyme.
  • Another method is to eliminate cholesterol in lipoproteins other than LDL using a cholesterol reagent in the presence of a reagent that inhibits only LDL, and then remove cholesterol esterase and cholesterol oxidase.
  • cholesterol oxidoreductase is activated to generate hydrogen peroxide or Is a method for quantifying reduced coenzyme.
  • cholesterol esterase and cholesterol oxidase are allowed to act on a sample containing HDL and LDL in the presence of a reagent that inhibits the reaction of lipoproteins other than HDL to generate hydrogen peroxide, and then or simultaneously.
  • Hydrogen peroxide, peroxidase and an aniline compound, peroxidase and a phenolic compound, or peroxidase and 41-aminoantipyrine to remove hydrogen peroxide.
  • LDL lipid-derived neuropeptide
  • a suitable surfactant cyclodextrins, or cholesterol esterase that acts on LDL to develop LDL cholesterol.
  • acting on LDL means exposing LDL cholesterol to a state capable of undergoing an enzymatic reaction by disrupting the outer wall of the LDL that has been inhibited.
  • cholesterol esterase and cholesterol are added to the LDL-containing sample.
  • a chromogen addition of peroxidase when using lyase
  • a reagent that can react LDL cholesterol the cholesterol ester hydrolase described below makes LDL cholesterol reactable
  • cholesterol ester hydrolase most Cholesterol esterase to be added to it by color development by adding unnecessary
  • the method of the present invention can be applied to body fluids containing LDL such as blood and urine.
  • not reactive with LDL means that the outer wall of LDL is not broken down and LDL cholesterol is not exposed to a state capable of undergoing an enzymatic reaction.
  • the amount of LDL cholesterol is calculated by comparing the absorbance measured using a standard solution containing a known concentration of LDL cholesterol under the same conditions. Note that 1 and 2 can be performed simultaneously.
  • An example of a reagent that inhibits the reaction of a riboprotein other than HDL includes a combination of an aggregating agent and a divalent metal salt.
  • the aggregating agent include heparin or a salt thereof, lintungstic acid or a salt thereof, dextran sulfate or a salt thereof, polyethylene glycol, sulfated cyclodextrin or a salt thereof, a sulfated oligosaccharide or a salt thereof, or a salt thereof.
  • the cyclodextrin include cyclodextrin, -cyclodextrin, arcyclodextrin, and the like.
  • Examples of the oligo include maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, and maltopentaose.
  • Examples include maltohexaose and maltohepnoose
  • examples of the salt include sodium salt, potassium salt, lithium salt, ammonium salt, magnesium salt and the like.
  • examples of the divalent metal salt include a magnesium salt, a calcium salt, a manganese salt, a nickel salt, a cobalt salt and the like.
  • a flocculant 0.02 to 1 OmM molecular weight of 5,000 to 20,000 Or a salt thereof, having a molecular weight of 0.1 to 1 OmM, a lintanstenic acid or a salt thereof having a molecular weight of 400 to 800, and a molecular weight of 0.0 to 5 mM having a molecular weight of 100 to 500 mM.
  • Dextran sulfate or a salt thereof 0.1 to 20 mM molecular weight 100 000 to 100 000 Dextran sulfate or a salt thereof, 0.3 to 100 mM molecular weight 400 000 to 25 Polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 0.1 to 500 mM, sulfated cyclodextrin or a salt thereof with a molecular weight of 0.1 to 300 mM, and a molecular weight of 0.1 to 5 OmM.
  • PEG Polyethylene glycol
  • a sulfated oligosaccharide of 400 to 300, a salt thereof or a mixture thereof is preferably used.
  • heparin or a salt thereof having a molecular weight of 0.01 to 1 mM and a molecular weight of 140 to 1600, and a molecular weight of 0.1 to 3 mM having a molecular weight of 500 to 700 Phosphotungstic acid or a salt thereof, 0.01 to 5 mM molecular weight 1 500 000 to 250 000 Dextran sulfate or a salt thereof, 0.1 to 10 mM molecular weight 100 000 to Dextran sulfate or its salt at 500,000, molecular weight of 1.0-5 OmM PEG of 500,000-200,000, molecular weight of 0.1--10 mM 100,000-200,000 Sulfated cyclodextrin or a salt thereof, 0.1 to 10 mM sulfated oligosaccharide having a molecular weight of 400 to 2000, a salt thereof, or a mixture thereof is used.
  • divalent metal salt examples include a magnesium salt of 0.1 to 5 OmM, a calcium salt, a manganese salt, a nickel salt, a cobalt salt and the like, and preferably, a magnesium salt of 0.1 to 50 mM is used. .
  • an anti-apoB antibody, an anti-apoC antibody, or the like can be used as a reagent that inhibits a reaction of a riboprotein other than HDL.
  • Anti-apo B and anti-apo C antibodies include anti-apo B antiserum or anti-apo C antiserum obtained by immunizing rabbits with apoprotein B or apoprotein C purified from human serum, and ammonium sulfate precipitation. IgG fraction obtained by salting, or anti-apo B monoclonal antibody or anti-apo C monoclonal antibody obtained by immunizing mice with the above-mentioned apoprotein B or apoprotein C (Introduction to monoclonal antibody experimental procedures, Ando Minami, Kodansha Scientific, 21st, 1991).
  • enzymes include commercially available animals having the ability to hydrolyze cholesterol esters, plants or microorganism-derived cholesterol esterase ⁇ lipoprotein lipase, animals that oxidize cholesterol to produce hydrogen peroxide, and plants. And cholesterol dehydrogenase derived from animals, plants and microorganisms, and the like.
  • Those obtained by chemically modifying the above enzyme with a group containing lenglycol as a main component, a group containing a saccharide in the structure of a water-soluble oligosaccharide residue or the like, a sulfopropyl group, a polyurethane group, or the like are also used.
  • these genes are obtained by genetic manipulation and introduced into another microorganism and expressed, or an enzyme chemically modified thereof, or an enzyme obtained by modifying these genes or expressed, or A chemically modified product is also preferably used.
  • a reagent (chemical modifier) for modifying the enzyme for example, a compound in which a group capable of binding to an amino group is bonded to polyethylene glycol ⁇ the N-hydroxysuccinimide group is added to polyethylene glycol VFM 4101 [manufactured by NOF CORPORATION], etc., in which a group capable of binding to an amino group such as is used, etc.), AKM series having a polyalkylene glycol structure and an acid anhydride structure, AKM series and ADM Series, ACM Series [All manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.
  • Polyethylen glycol monomethacrylate a compound in which a group capable of binding to an amino group is bonded to a copolymer of polyethylene glycol and propylene glycol.
  • Examples include a copolymer of lyl monomethyl ether and maleic anhydride.
  • Polyurethane P400 which is a chemical modifier of polyurethane (Enzyme modification set by Behringer Mannheim)
  • Dextran T400 which is a chemical modifier of dextran
  • 3-propane sultone can also be used.
  • These chemical modifiers can be used to convert the enzyme into a group containing polyethylene glycol as the main component, a group containing polypropylene glycol as the main component, a group having a copolymer of polypropylene glycol and polyethylene glycol, a group containing a saccharide in the structure, and sulfopropyl. Group or a polyurethane group.
  • the enzyme is dissolved in a buffer solution such as a buffer solution having a pH of 8 or more, and at 0 to 50 ° C, for example, 0.01 to 500-fold molar amount of sunbrite is added. ⁇ 6 0 Stir for minutes.
  • a buffer solution such as a buffer solution having a pH of 8 or more, and at 0 to 50 ° C, for example, 0.01 to 500-fold molar amount of sunbrite is added. ⁇ 6 0 Stir for minutes.
  • This reaction solution is used as it is or, if necessary, after removing low-molecular substances by an ultrafiltration membrane.
  • Cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase and cholesterol oxidoreductase are preferably used at 0.1 to 100 uZml.
  • Cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, or cholesterol oxidoreductase that is not reactive with LDL include polyethylene glycol-based groups, polypropylene glycol-based groups, and water-soluble oligosaccharide residues.
  • cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase or cholesterol oxidoreductase is chemically modified with a saccharide-containing group, a sulfopropyl group, a polyurethane group or the like in the structure.
  • cholesterol esterase cholesterol oxidase or cholesterol oxidoreductase acting on LDL
  • unmodified cholesterol esterase cholesterol oxidase or cholesterol oxidoreductase
  • Some modifications can be used to the extent that they only affect LDL.
  • the modifying agent include the above-mentioned Sun Bright VFM 4101 [manufactured by NOF Corporation].
  • the unit used for the enzyme is preferably 0.5 to 100 uZm1.
  • Surfactants used to have reactivity with LDL include nonionic surfactants such as Triton X-100, cationic surfactants and anionic surfactants. Used in the range of ⁇ 10%.
  • cyclodextrins used to have reactivity with LDL include cyclodextrin, —cyclodextrin, arcyclodextrin, dimethyl monocyclodextrin, dimethyl / 3-cyclodextrin.
  • Trilin dimethyl-7-cyclodextrin, hydroxypropyl monocyclodextrin, hydroxyquinpropyl-1-S / cyclodextrin, hydroxypropyl-17-cyclodextrin, 2, Examples include 3,6-dimethyl-cyclodextrin, poly (1 / 3-cyclodextrin), and are used in the range of 0.1 to 10%.
  • a compound which forms a complex with magnesium is preferably used, and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), N, N, N'.N'.N “', ⁇ "'-hexaacetic acid (TTHA), trans-1,2-cyclohexanediamine N, N, N'. ⁇ ' Monotetraacetic acid (CyDTA) monohydrate and the like are used, and are used in the range of 0.05 to 2%.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • TTHA ⁇ "'-hexaacetic acid
  • CyDTA Monotetraacetic acid
  • chromogens as substrates for cholesterol oxidase, which detects hydrogen peroxide, include 4-aminoantipyrine and phenol, 4-chlorophenol, m-clevl, 3-hydroxy-2, 4,6—In addition to the combination with phenols such as tolodobenzoic acid (HT IB), it is also known as a mirinantipyrine and a Trinder reagent.
  • MCDP 10- (N-methylcarbamoyl) —3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine
  • MCDP 10- (N-methylcarbamoyl) —3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine
  • BCMA bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine
  • JP-A-62-296 a dye source described in JP-A-62-296
  • concentration of the dye source is preferably from 0.01 to 10 mg / ml, and is limited by the solubility.
  • a phosphate buffer or the like, or a buffer of Tris or Good, or the like is suitably used, and its concentration is preferably 5 to 50 OmM.
  • the pH is preferably in the range of 5-9.
  • a chemically modified cholesterol esterase is preferable, and as the cholesterol oxidase or cholesterol oxidoreductase having low reactivity with LDL, a chemically modified cholesterol esterase is used. Unmodified cholesterol oxidase or chemically modified or unmodified cholesterol oxidoreductase is used together.
  • the modifying agent include the above-mentioned Sunbright VFM411 (manufactured by NOF Corporation).
  • the unit used for the c enzyme is preferably 0.5 to 100 uZm1.
  • the dye source and the buffer As the dye source and the buffer, the dye source and the buffer described in Example 1 are similarly used.
  • NAD (P) H is measured by an absorbance at 300 to 500 nm, preferably 330 to 400 nm, for example, at 330 nm (diaphorase. It is also possible to colorimetrically determine the color of formazan dye by adding a tetrazolium salt to the color of the formazan dye. The amount of LDL cholesterol is calculated by comparing it with the absorbance measured separately using a standard solution containing a known concentration of LDL cholesterol under the same conditions.
  • Reagents that inhibit LDL only include cholesterol ester hydrolase that inhibits only LDL, and reagents that enable LDL cholesterol to react include cholesterol ester hydrolase that enables LDL cholesterol to react. , A surfactant, a chelating agent and the like.
  • surfactants and chelating agents As surfactants and chelating agents, the surfactants and chelating agents described in Example 1 are likewise used.
  • Examples of the enzyme include the enzymes described in Example 1.
  • Cholesterol ester hydrolase that inhibits only LDL includes cholesterol ester hydrolyzate prepared by adding a chemical modifier at a molar ratio of 10 times or more to cholesterol ester hydrolase derived from animals, plants or microorganisms.
  • cholesterol esterases derived from animals, plants or microorganisms Preferred are those having the same specificity as above, or those having the same specificity by modifying and expressing these genes. Specific examples include those obtained by adding a 10-fold or more molar ratio of the chemical modifier described in Example 1 to an aqueous solution of cholesterol esterase derived from microorganisms such as Pseudomonas or Chromobacterium and reacting the same.
  • the molar ratio is preferably 10 to 500 times, and is determined in view of the effect that specificity appears and the decrease in activity due to modification.
  • a cholesterol ester hydrolase that is not chemically modified for example, a part of the gene sequence of lipase derived from Brevipacterium is randomly changed and introduced into another, for example, Escherichia coli for expression.
  • a cholesterol esterase which has an enzymatic activity and inhibits only the LDL can be used.
  • Cholesterol ester hydrolase is preferably used at 0.1 to 100 uZm1.
  • heparin, lintungstic acid, dextran sulfate, sulfated cyclodextrin, sulfated oligosaccharide or a salt thereof, as long as LDL is not aggregated in step (1), or Polyethylene glycol can be added in combination with a divalent metal salt such as a magnesium salt, a calcium salt, a manganese salt, a nigel salt, and a cobalt salt.
  • a divalent metal salt such as a magnesium salt, a calcium salt, a manganese salt, a nigel salt, and a cobalt salt.
  • cyclodextrin, oligosaccharide and salt include the cyclodextrin, oligosaccharide and salt described in Example 1.
  • cholesterol esterase capable of reacting LDL cholesterol As the cholesterol esterase capable of reacting LDL cholesterol, unmodified cholesterol esterase is preferable, and it is preferable to use 0.5 to 100 u / m1.
  • cholesterol oxidase or cholesterol oxidoreductase is it preferable to use cholesterol oxidase derived from microorganisms that oxidize cholesterol to generate hydrogen peroxide, or cholesterol dehydrogenase derived from animals or microorganisms.
  • the above enzyme may be chemically modified with a group mainly composed of polyethylene glycol or a water-soluble oligosaccharide residue.
  • the molar ratio of the chemical modifier in this case is preferably 0.1 to 500 times, and is determined in view of the stabilizing effect and the decrease in activity due to the modification.
  • Cholesterol oxidase and cholesterol oxidoreductase are used at 0.1 to 100 uZm1. Preferably.
  • the enzyme is dissolved in a buffer solution such as a buffer solution having a pH of 8 or more, and at 0 to 50 ° C, for example, a predetermined-fold molar amount of sunbrite is added, and the mixture is stirred for 1 to 24 hours.c
  • the reaction solution is used as it is or after removing low molecular weight substances by an ultrafiltration membrane as needed.
  • the above-mentioned phenolic compounds and aniline compounds are similarly used, and as a pigment source and a buffering agent.
  • the dye sources and buffers mentioned above are likewise used.
  • each system of the present invention includes a system for measuring ordinary cholesterol, surfactants or cholic acids often used for activating cholesterol oxidase can also be used.
  • Various salts for solubilizing proteins such as globulin can also be used.
  • Nonionic, anionic or cationic surfactants are used in the range of 0 to 1% as the surfactant, and cholic acids such as cholic acid, dequincholic acid, taurocholic acid, and chenodeoxycholic acid are used.
  • the salts include sodium chloride, sodium sulfate, potassium chloride, potassium sulfate, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium acetate, magnesium nitrate, lithium chloride, lithium sulfate, ammonium chloride, Ammonia sulfate, calcium chloride, calcium nitrate, calcium acetate, nickel chloride, nickel nitrate, nickel acetate, cobalt chloride, cobalt nitrate, etc. are used in the range of 0 to 10 OmM.
  • FIG. 1 shows the correlation between the dilution ratio of serum containing LDL cholesterol 28.4 mg Zd1 and the absorbance measured by the method of Example 1.
  • Figure 2 shows the time course of the absorbance measured by the Hitachi 720 automatic analyzer using the method of Example 9 using HDL, LDL, VLDL and human serum separated by ultracentrifugation. .
  • Fig. 3 shows the dilution ratio of serum containing LDL cholesterol 28.4 mg / d1. 6 shows a correlation between the measured values and the absorbance measured by the method of Example 11. FIG. Next, examples will be described.
  • the following operations were carried out using, as specimens, each of which was diluted with 5, 5, and 6, respectively.
  • FIG. 1 shows the results obtained using the serum containing LDL cholesterol 28.4 mg / d1.
  • Example 1 (2) the aggregating agent and divalent metal salt used for reagent A were variously modified as follows, and serum samples were collected using a Hitachi 770 (Sample 41, Reagent A, 270 ⁇ 1, Reagent 8, 90 ⁇ 1, Reagent 901) were measured.
  • Hitachi RPL42T mouth using the method (ultracentrifugation) described in the History of Medicine, Vol. 94 (No. 8), p. 359, p. LDL cholesterol was quantified.
  • Table 1 in all cases, values that were in good agreement with the values obtained by ultracentrifugation were obtained.
  • Example 5 Using the reagent A described in Example 1 (2), replacing the peroxidase with the reagent B at a concentration of 300 u / m1 in the reagent B, and using the reagent C with a concentration of 300 u / m1. Using uZm1, the serum sample used in Example 2 was measured in the same manner as in Example 2. As a result, 18.6 mg mg d 1 was obtained, which was in good agreement with the value obtained by the superconcentration method.
  • Example 5 Using the reagent A described in Example 1 (2), replacing the peroxidase with the reagent B at a concentration of 300 u / m1 in the reagent B, and using the reagent C with a concentration of 300 u / m1. Using uZm1, the serum sample used in Example 2 was measured in the same manner as in Example 2. As a result, 18.6 mg mg d 1 was obtained, which was in good agreement with the value obtained by the superconcentration method.
  • Example 5
  • Example 2 Using reagents A and C described in Example 1 (2), instead of EMS E in reagent B, TOOS (measurement wavelength 5555 nm), DAOS (measurement wavelength 593 nm), MAOS (measurement The serum sample used in Example 2 was measured in the same manner as in Example 2 using the same concentration of the wavelength of 63 O nm) or TOPS (measurement wavelength of 550 nm). As a result, the values obtained by ultracentrifugation were 177.9 mg / d 1, 177.8 mg / d 1, 179.2 mg / dl, 178.8 mg Zd 1, respectively. Well matched values were obtained.
  • MC DP measurement wavelength 666 nm
  • BCMA measurement wavelength 755 nm
  • the serum sample used at a concentration of 1 mg / m 1 and used in Example 2 was measured in the same manner as in Example 2. As a result, 17.3 mg / d 1.179. OmgZd 1 and a value which was in good agreement with the value obtained by ultracentrifugation were obtained, respectively.
  • dimethyl S-cyclodextrin was used at a concentration of 2 Omg / ml in place of unmodified cholesterol esterase in reagent C.
  • the serum sample used in 2 was measured in the same manner as in Example 2. As a result, 177.4 mg / d 1 was obtained, which was in good agreement with the value obtained by ultracentrifugation.
  • Reagent A and reagent B described in Example 1 (2) were mixed at a ratio of 3: 1 to obtain Reagent D.
  • 3 ml of this solution was added to the serum sample 201 used in Example 2, and 37 After incubation for 5 minutes, the absorbance at 5.55 nm (E 1) was measured. Further, 0.75 ml of reagent C was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 5 minutes, and then the absorbance (E 2) at a wavelength of 555.5 nm was measured.
  • the LDL cholesterol concentration was calculated by performing the same operation using a standard solution having a cholesterol concentration of 200 mg Zd1 and comparing the (E2-E1) X dilution factor. did.
  • the serum sample used in Example 2 was measured using a Hitachi 72500 automatic analyzer. After addition of reagent B, the change in absorbance (E 3) was measured for 3.5 to 5 minutes.
  • the LDL cholesterol concentration was calculated by performing the same operation using a standard solution having a cholesterol concentration of 200 mg / d1 (E4), and comparing the values of E3 and E4. As a result, 18.6 mg Zd 1 was obtained, which was in good agreement with the value obtained by ultracentrifugation.
  • Fig. 2 shows the time course of HDL, LDL, VLDL and human serum separated by ultracentrifugation.
  • Serum samples used in Example 2 were measured using the above reagents and a Hitachi 72500 automatic analyzer (E5).
  • the LDL cholesterol concentration was calculated by performing the same operation using a standard solution having a cholesterol concentration of 20 Omg / d1 (E6), and comparing the values of E5 and E6. As a result, a value that was in good agreement with the value obtained by ultracentrifugation with 17 7. SmgZdl was obtained.
  • the photometric point of the automatic analyzer was set at 5 minutes after the addition of reagent B.
  • the following operations were carried out using only the samples diluted in 6/10, the same as in Example 4, the samples diluted in 10 in 10 and the same, the samples diluted in 10 in 210, and the physiological saline alone.
  • Serum used in Example 11 (2) using reagent B described in Example 11 (2) and adding reagent A to the following various combinations of aggregating agents and divalent metal salts.
  • Specimens were measured using a Hitachi 7700 automatic analyzer (conditions for sample 4 and reagent A, 270 and reagent B, 901, respectively).
  • Hitachi RPL42T rotor LDL cholesterol is quantified according to the method (ultracentrifugation) described in Hyundai Medical, Vol. 23 (No. 1), pp. 113, 1991. did.
  • Table 2 in each case, a value which was in good agreement with the value obtained by the ultracentrifugation method was obtained.
  • Example 11 Using reagent B described in (2) and replacing the PEG-modified cholesterol esterase and PEG-modified cholesterol oxidase in reagent A with the chemically modified enzyme obtained above, The serum sample used in 2) was measured in the same manner as in Example 11 (2). As a result, 22 8. Omg / d 1 and 2 29.1 mg / d 1. 22.68 m d 1 were obtained, which were in good agreement with the values obtained by ultracentrifugation.
  • Example 14 Example 11 11) In the reagent A described in (2), a force codase was used in place of peroxidase at a concentration of 300 u / m1, and 300 uZml of peroxidase and azide were used in reagent B.
  • the serum specimen used in Example 11 (2) was measured in the same manner as in Example 11 (2), using sodium 0.5 mg Zm1. As a result, 228.6 mg / d 1 was obtained, which was in good agreement with the value obtained by ultracentrifugation.
  • Example 11 Using reagent B described in 1 (2), replace TOMS (measuring wavelength 5555 nm), DAOS (measuring wavelength 5933 nm), MA0S (measuring wavelength).
  • the serum sample used in Example 11 (2) was measured in the same manner as in Example 11 (2), using the same concentration as the sample (630 nm) or TOPS (measurement wavelength: 550 nm). .
  • the results were 227.9 mg / d 1, 227.4 mg / d 225.2 mg / d and 224.8 mg d 1, respectively, which were in good agreement with the values obtained by ultracentrifugation. The values were obtained.
  • Example 11 The EMSE was removed from reagent A described in (2), and MCDP (measurement wavelength 666 nm) was replaced by reagent B in place of 4-aminoantipyrine. (Wavelength 755 nm) was used at a concentration of 0.1 mgZm1, and the serum sample used in Example 11 (2) was measured in the same manner as in Example 11 (2). As a result, 228.3 mg / d 22.9 OmgZdl and a value which was in good agreement with the value obtained by ultracentrifugation were obtained, respectively.
  • Example 11 Using reagent A described in 1 (2), reagent B contains polyquineethylene monolaurate 5 mg Zm 1 and triton X—100, 5 mg 1, sodium dodecylbenzenesulfonate 1 mg
  • the serum sample used in Example 11 (2) was measured in the same manner as in Example 11 (2). The reaction was completed within 3 minutes, resulting in 228.6 mg / d U 226.1 mg / d 2 27.Omg / d 1, which was in good agreement with the value obtained by ultracentrifugation. was gotten.
  • Example 18 Example 18
  • Example 11 Using unmodified cholesterol in reagent B using reagent A described in (2) In place of the roll esterase, polyoxyethylene monolaurate 5 mg / ml, Triton X—100, 5 mg / m 1 or sodium dodecylbenzenesulfonate 1 mg nom 1 was used. )) was measured in the same manner as in Example 11 (2). The reaction was completed within 3 minutes, resulting in 227.9 mg / d 1, 229.2 mg / dl, and 226.lmgZdl, respectively, which were in good agreement with the values obtained by ultracentrifugation. .
  • Example 11 (2) Using the reagent B described in Example 11 (2), and using the same concentration of dequincholic acid or taurocholic acid instead of cholic acid in reagent A, the serum sample used in Example 11 (2) was used. The measurement was performed in the same manner as in Example 11 (2). As a result, 229.9 mgZdl and 225.7 mg / d1 were obtained, which were in good agreement with the values obtained by ultracentrifugation.

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Description

明 細 書
低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法
技 術 分 野
本発明は、 臨床診断の分野において動脈硬化の診断で重要な低密度リポ蛋白
(LDL) 中のコレステロール （以下、 LDLコレステロールという） の定量法 に関する。
背 景 技 術
従来、 LDLコレステロールの定量は、 まず検体中の総コレステロール量を測 定した後、 別途検体に LDLおよび超低密度リポ蛋白 （VLDL) の沈殿剤を添 加し遠心分離して上清の高密度リポ蛋白 （HDL) 中のコレステロール （以下、 HDLコレステロールという） 量を測定し、 Friedewaldの換算式から算出すると いう方法により行われていた （日本臨床 広範囲 血液 ·尿化学検査 免疫学的 検査 上巻、 日本臨床社出版、 6 1 5頁、 1 995年） 。 この方法では、 総コレ ステロール量と HDLコレステロール量の 2つを測定する必要があり、 また遠心 分離操作等が必要で、 煩雑であった。 しかしながら、 単純に血清検体を直接コレ ステロールエステラーゼとコレステロールォキシダーゼが含有された試薬に添加 しても、 総コレステロール量を測定する系と変わりがなく、 LDLコレステロ一 ルに特異性がない。
特開昭 58 - 1 65800には、 特殊な界面活性剤の存在下、 分離操作なしに 直接 LD Lコレステロール量を測定する方法が開示されている。 しかしながら、 該方法では、 LDLコレステロールと同時に HDLコレステロールも反応してお り LDL特異性が低く、 また、 反応の条件設定が煩雑であり多様な検体に適用す ることが困難である。
また、 特開平 7 - 2808 1 2には、 LDLを一旦凝集させた後 LDL以外の リポ蛋白中のコレステロールを消去し、 さらに凝集した LDLを解凝集させ、 LDLコレステロールを酵素反応させて LDLコレステロール量を測定する方法 が開示されている。
発 明 の 開 示
本発明者らは、 a) HDL以外のリポ蛋白すなわち LDL、 VLDLおよび力 イロミ クロン （CM) を反応阻害する試薬の存在下、 コレステロール反応試薬を 用いて HDLコレステロールを特異的に反応させて消去した後、 必要により LDL コレステロールを反応可能化する試薬の存在下、 コレステロール反応試薬を用い てコレステロール定量の酵素反応をさせることにより、 特に分離することなく 1^0しを含有する試料中の 0しコレステロールを特異的に定量できること、 b) LDLのみを反応阻害し、 コレステロール反応試薬を用いて LDL以外のリ ボ蛋白中のコレステロールを反応させて消去した後、 コレステロール反応試薬を 用いてコレステロール定量の酵素反応をさせることにより、 特に分離することな く LDLを含有する試料中の LDLコレステロールを特異的に定量できることを 見い出し、 本発明に至った。
ここで、 HDL以外のリポ蛋白を反応阻害するとは、 HDL以外のリポ蛋白を 凝集させるか HDL以外のリポ蛋白の外壁の反応性を弱めてこれらリポ蛋白の外 壁のみを選択的に崩壊されなくすることにより、 HDL中のコレステロールを選 択的に酵素反応を受け得る状態にさらしめることをいう。 また、 LDLコレステ ロールを反応可能化するとは、 LDLの外壁を崩壊させることにより、 LDLコ レステロールを酵素反応を受け得る状態にさらしめることをいう。 また、 LDL のみを反応阻害するとは、 逆に L D Lを凝集させるか L D Lの外壁の反応性を弱 めて L D Lの外壁のみを選択的に崩壊ざれなくすることにより、 L D L以外のリ ポ蛋白中のコレステロールを選択的に酵素反応を受け得る状態にさらしめること をいう。
本発明は、 LDLを含有する試料から HDLコレステロールを消去した後、 必 要により L D Lコレステロールを反応可能化する試薬の存在下、 コレステロール エステル加水分解酵素およびコレステロ一ル酸化酵素またはコレステロール酸化 還元酵素を作用させ、 発生する過酸化水素または還元型補酵素を定量することを 特徴とする L D Lコレステロールの定量法に関する。
また、 本発明により、 HDL以外のリポ蛋白を反応阻害する試薬および LDL 中のコレステロールを反応可能化する試薬を成分とする LDL中のコレステロ一 ルの定量試薬、 あるいは HDL以外のリポ蛋白を反応阻害する試薬と LDL中の コレステロールを反応可能化する試薬を組み合わせてなる LDL中のコレステロ —ルの定量試薬を提供することができる。
さらに、 本発明により、 LDLのみを反応阻害する試薬を成分とする LDL中 のコレステロールの定量試薬、 LDLのみを反応阻害する試薬および L D L中の コレステロールを反応可能化する試薬を成分とする LDL中のコレステロールの 定量試薬、 あるいは LDLのみを反応阻害する試薬と LDL中のコレステロール を反応可能化する試薬を組み合わせてなる LDL中のコレステロ一ルの定量試薬 を提供することができる。
上記定量法の 1つとしては、 HDL以外のリボ蛋白すなわち LDL、 VLDL および CMを反応阻害する試薬の存在下、 コレステロール反応試薬を用いて HDし コレステロールを特異的に反応させて消去した後、 必要により LDLコレステロ ールを反応可能化する試薬の存在下、 コレステロールエステル加水分解酵素およ びコレステロール酸化酵素またはコレステロール酸化還元酵素を作用させ、 発生 する過酸化水素または還元型補酵素を定量する方法が、 また、 別の方法としては、 LDLのみを反応阻害する試薬の存在下にコレステロール反応試薬を用いて LDL 以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後、 コレステロールエステル加水 分解酵素およびコレステロ一ル酸化酵素またはコレステロ一ル酸化還元酵素を作 用させ、 発生する過酸化水素または還元型補酵素を定量する方法があげられる。 例えば、 HDL以外のリポ蛋白を反応阻害する試薬の存在下、 HDLおよび LD Lを含有する試料にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ ール酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、 次いでまたは同時に、 力タラ ーゼ、 パーォキシダーゼとァニリン化合物、 パーォキシダ一ゼとフエノール化合 物またはパーォキシダーゼと 4一ァミノアンチピリンを添加して過酸化水素を消 去し、 その後、 色素源 （力タラ一ゼを使用した場合はバーオキシダ一ゼも添加す る） および適当な界面活性剤、 シクロデキストリン類、 あるいは LDLに作用す るコレステロールエステル加水分解酵素を添加して発色させることにより、 LDL コレステロールを定量することができる。 ここで、 LDLに作用するとは、 反 阻害された LDLの外壁を崩壊させることにより、 LDLコレステロールを酵素 反応を受け得る状態にさらしめることをいう。
また、 LDLのみを反応阻害する試薬の存在下、 LDLを含有する試料にコレ ステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ一ル酸化酵素および色素源を 添加して発色させ、 このとき LDL以外のリボ蛋白中のコレステロールが反応し た後の吸光度の変化を測定することにより、 LDLコレステロールを定量するこ とができる。
また、 LDLのみを反応阻害する試薬 （次述のコレステロールエステル加水分 解酵素が LDLのみを反応阻害する場合は不要） の存在下、 LDLを含有する試 料にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ一ル酸化酵素を作用 させて過酸化水素を生成させ、 次いでまたは同時に、 カタラーゼ、 バーオキシダ —ゼとァニリ ン化合物、 パ一ォキシダーゼとフエノール化合物またはパーォキシ ダーゼと 4ーァミ ノアンチピリ ンを添加して過酸化水素を消去し、 その後、 色素 源 （力夕ラーゼを使用した場合はパーォキシダーゼも添加する） および LDLコ レステロールを反応可能化する試薬 （次述のコレステロールエステル加水分解酵 素が LDLコレステロールを反応可能化する場合は不要） 、 コレステロールエス テル加水分解酵素 （最初に加えるコレステロールエステル加水分解酵素が L D L コレステロ一ルを反応可能化する試薬により LDLコレステロールと反応可能に なる場合は不要） を添加して発色させることにより、 LDLコレステロールを定 量することができる。
本発明方法は、 血液、 尿などの LDLを含有する体液に適用できる。
次に、 本発明の定量法について例をあげて説明する。
例 1
① HDL以外のリボ蛋白を反応阻害する試薬を含む中性付近の緩衝液を一定量 の検体に添加し、 例えば 37°Cで数分間加温して LDL、 VLDLおよび CMを 反応阻害し、 ② LDLと反応性のないコレステロールエステル加水分解酵素 （好 ましくは化学修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素） 、 LDLと反応 性のないコレステロール酸化酵素 （好ましくは化学修飾されたコレステロール酸 化酵素） [またはコレステロール酸化還元酵素 （好ましくは化学修飾されたコレ ステロール酸化還元酵素） ] および力夕ラーゼ、 バーオキシダ一ゼとァ二リ ン化 合物、 パーォキシダ一ゼとフエノール化合物またはパーォキシダーゼと 4ーァミ ノアンチピリン [または NAD (P) ] を加えて HD Lコレステロールを反応さ せて消去し、 ③界面活性剤、 シクロデキスト リ ン類、 キレート剤、 LDLに作用 するコレステロールエステル加水分解酵素 （好ましくは化学修飾されていないコ レステロールエステル加水分解酵素） 、 LDLに作用するコレステロール酸化酵 素 （好ましくは化学修飾されていないコレステロール酸化酵素） または LDLに 作用するコレステロール酸化還元酵素 （好ましくは化学修飾されていないコレス テロール酸化還元酵素） および色素源を添加 [コレステロール酸化還元酵素を用 いる場合には、 無添加または NAD (P) を添加] して LDLコレステロールを 過酸化水素に導き、 発色させ [または NAD (P) Hに導き] 、 ④生成する色素 の極大波長における吸光度を分光光度計で測定する [コレステロ一ル酸化還元酵 素を用いる場合には、 NAD (P) Hの増加を、 300〜 500 n m、 好ましく は 330〜4 00 nm、 例えば 340 n mでの吸光度で測定する （ジァホラーゼ、 テトラゾリゥ厶塩を添加してホルマザン色素の発色に導き、 ホルマザン色素を比 色定量することも可能である） ] 。 ここで、 LDLと反応性がないとは、 LDL の外壁を崩壤させず、 LDLコレステロールを酵素反応を受け得る状態にさらし めないことをいう。 LDLコレステロール量は、 別途同じ条件下で既知濃度の LDLコレステロ一ルを含む標準液を用レ、て測定した場合の吸光度と比較して算 出する。 なお、 ①および②は同時に行うこともできる。
HDL以外のリボ蛋白を反応阻害する試薬の一例としては、 凝集剤および 2価 の金属塩の組合せがあげられる。 凝集剤としては、 へパリンもしくはその塩、 リ ンタングステン酸もしくはその塩、 デキストラン硫酸もしくはその塩、 ボリェチ レングリコール、 硫酸化シクロデキスト リ ンもしくはその塩、 硫酸化オリゴ糖も しくはその塩またはこれらの混合物等があげられ、 シクロデキストリ ンとしては、 ひーシクロデキス ト リ ン、 —シクロデキス ト リ ン、 アーシクロデキス ト リ ン等 があげられ、 オリゴ搪としては、 マルト トリオース、 マルトテトラオース、 マル トペンタオース、 マル卜へキサオース、 マルトヘプ夕オース等があげられ、 塩と しては、 ナトリウム塩、 カリウム塩、 リチウム塩、 アンモニゥム塩、 マグネシゥ 厶塩等があげられる。 2価の金属塩としては、 マグネシウム塩、 カルシウム塩、 マンガン塩、 ニッケル塩、 コバルト塩等があげられる。
凝集剤としては、 0. 02〜 1 OmMの分子量 5000〜20000のへパリ ンもしくはその塩、 0. 1〜 1 OmMの分子量 4 0 0 0〜8 0 0 0のリンタング ステン酸もしくはその塩、 0. 0 〜 5mMの分子量 1 0 0 0 0〜5 0 0 0 0 0 のデキス トラン硫酸もしくはその塩、 0. 1〜 2 0 mMの分子量 1 0 0 0〜 1 0 0 0 0のデキストラン硫酸もしくはその塩、 0. 3〜 1 0 0 mMの分子量 4 0 0 0〜2 5 0 0 0のボリエチレングリコール （P EG) 、 0. l〜5 0mM の分子量 1 0 0 0〜 3 0 0 0の硫酸化シクロデキス ト リ ンもしく はその塩、 0. 1〜5 OmMの分子量 4 0 0〜3 0 0 0の硫酸化オリゴ糖もしくはその塩ま たはそれらの混合物等が好ましく用いられる。 さらに好ましくは、 0. 0 3〜 1 mMの分子量 1 4 0 0 0〜 1 6 0 0 0のへパリ ンもしくはその塩、 0. 1〜 3 mM の分子量 5 0 0 0〜 7 0 0 0のリンタングステン酸もしくはその塩、 0. 0 1〜 5 mMの分子量 1 5 0 0 0 0〜 2 5 0 0 0 0のデキストラン硫酸もしくはその塩、 0. 1〜 1 0 mMの分子量 1 0 0 0〜 5 0 0 0のデキストラン硫酸もしくはその 塩、 1. 0〜5 OmMの分子量 5 0 0 0〜2 2 0 0 0の PEG、 0. 1 - 1 0 mM の分子量 1 0 0 0〜 2 0 0 0の硫酸化シクロデキス ト リ ンもしく はその塩、 0. 1〜 1 0 mMの分子量 4 0 0〜2 0 0 0の硫酸化ォリゴ糖もしくはその塩ま たはそれらの混合物等が用いられる。
2価の金属塩としては、 0. 1〜5 OmMのマグネシウム塩、 カルシウム塩、 マンガン塩、 ニッケル塩、 コバルト塩等があげられ、 好ましくは、 0. 1〜5 0 mMのマグネシウム塩が用いられる。
HDL以外のリボ蛋白を反応阻害する試薬としては、 抗アポ B抗体、 抗アポ C 抗体等を用いることもできる。 抗アポ B抗体、 抗アポ C抗体としては、 人血清よ り精製したアポ蛋白 Bまたはアポ蛋白 Cを家兎に免疫して得られる抗アポ B抗血 清または抗アポ C抗血清を硫安沈殿、 塩折して得られる I gG画分、 あるいは上 記アポ蛋白 Bまたはアポ蛋白 Cをマウスに免疫して得られる抗アポ Bモノクロー ナル抗体、 抗アポ Cモノクローナル抗体 （単クローン抗体実験操作入門、 安東民 衛著、 講談社サイエンティフィ ック、 2 1頁、 1 9 9 1年） 等があげられる。 酵素としては、 通常市販されている、 コレステロールエステルを加水分解する 能力を有する動物、 植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼゃリポ プロテインリパーゼ、 コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する動物、 植 物または微生物由来のコレステロールォキシダーゼ、 動物、 植物または微生物由 来のコレステロールデヒ ドロゲナーゼ等があげられ、 これら酵素の特異性、 安定 性をさらにあげるためにボリエチレングリコールを主成分とする基、 ポリプロピ レングリコールを主成分とする基、 水溶性のオリゴ糖残基等の構造に糖類を含む 基、 スルホプロピル基、 ポリウレタン基等で上記の酵素を化学的に修飾したもの も用いられる。 また、 遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、 別の微生物に 導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、 あるいはこれ らの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等 も好適に用いられる。
酵素を修飾するための試薬 （化学修飾剤） としては、 例えば、 ポリエチレング リコールにァミ ノ基と結合可能な基を結合させた化合物 {ポリエチレングリコー ルに N—ヒ ドロキシサクシンィミ ド基等のァミノ基と結合可能な基を結合させた サンブライ ト V F M 4 1 0 1 [日本油脂 （株） 製] 等 } 、 ボリアルキレングリ コール構造および酸無水物構造を有するサンブライ ト A K Mシリーズ、 同 A D M シリーズ、 同 A C Mシリーズ [いずれも日本油脂 （株） 製：化学工学論文集、 第
2 0巻、 第 3号、 4 5 9頁、 1 9 9 4年] 、 ポリエチレングリコールとボリプロ ピレンダリコールの共重合体にァミノ基と結合可能な基を結合させた化合物、 ポ リェチレングリ コールモノ メタク リルモノ メチルエーテルと無水マレイン酸の共 重合体等があげられる。 また、 ポリウレタンの化学修飾剤であるポリウ レタン P 4 0 0 0 act i vated (ベ一リ ンガーマンハイム社製 Enzyme modi f i cat i on set 能書） 、 デキス トランの化学修飾剤であるデキストラン T 4 0 , TCT-act i vated
(同） 、 し 3—プロパンサルトン等も使用できる。 これら化学修飾剤により、 酵素を、 ポリエチレングリコールを主成分とする基、 ポリプロピレングリコール を主成分とする基、 ポリプロピレングリコールとボリエチレングリコールの共重 合体を有する基、 構造に糖類を含む基、 スルホプロピル基、 ポリウレタン基等で 修飾することができる。
次に、 酵素に上記化学修飾剤を反応させる方法を例示するが、 これによつて制 約されない。 まず、 酵素を p H 8以上のへぺス緩衝液等の緩衝液中に溶解し、 0 〜5 0 °Cで例えば 0 . 0 1〜 5 0 0倍モル量のサンブライ トを添加し、 5 ~ 6 0 分間撹拌する。 この反応液をそのままあるいは必要に応じて限外濾過膜により低 分子物を除去して用いる。 コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロ一 ル酸化酵素およびコレステロール酸化還元酵素は、 0. l〜 1 0 0 uZm lで使 用するのが好ましい。
LDLと反応性のないコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール 酸化酵素あるいはコレステロール酸化還元酵素としては、 ポリエチレングリコー ルを主成分とする基、 ポリプロピレングリコールを主成分とする基、 水溶性のォ リゴ糖残基等の構造に糖類を含む基、 スルホプロピル基、 ボリウレタン基等でコ レステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素あるいはコレステ ロール酸化還元酵素を化学的に修飾したものが好ましい。
LDLに作用するコレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化 酵素あるいはコレステロール酸化還元酵素としては、 未修飾のコレステロ一ルェ ステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素あるいはコレステロール酸化還元 酵素が好ましいが、 これらを安定化させるために若干の修飾を加えたものも LDL のみに作用する範囲で使用できる。 修飾剤としては、 上記サンブライ 卜 VFM 4 1 0 1 [日本油脂 （株） 製] 等があげられる。 酵素の使用単位としては、 0.5 〜 1 0 0 uZm 1が好ましい。
LDLと反応性をもたせるために使われる界面活性剤としては、 トリ トン X— 1 0 0などのノニオン系界面活性剤、 カチオン系界面活性剤あるいはァニオン系 界面活性剤があげられ、 0. 0 2〜 1 0 %の範囲で使用される。 また、 LDLと 反応性をもたせるために使われるシクロデキストリ ン類としては、 ひーシクロデ キス ト リ ン、 —シクロデキス ト リ ン、 アーシクロデキス ト リ ン、 ジメチル一ひ ーシクロデキスト リ ン、 ジメチルー /3—シクロデキス ト リ ン、 ジメチルー 7—シ クロデキス ト リ ン、 ヒ ドロキシプロピル一ひーシクロデキス ト リ ン、 ヒ ドロキン プロピル一 /S—シクロデキストリ ン、 ヒ ドロキシプロピル一 7—シクロデキス卜 リ ン、 2, 3, 6—〇ーメチルー —シクロデキス ト リ ン、 ポリ 一 /3—シクロデ キストリ ン等があげられ、 0. 1〜 1 0 %の範囲で使用される。 また、 LDLと 反応性をもたせるために使われるキレート剤としては、 マグネシウムと錯体を形 成する化合物が好ましく用いられ、 エチレンジァミ ン四酢酸 （EDTA) 類、 ト リエチレンテトラミ ン— N, N, N'.N'.N"', Ν"'—六酢酸 （TTHA) 、 ト ランス— 1 , 2—シクロへキサンジァミ ン一 N, N, N' . Ν' 一四酢酸 （CyDTA) 1水和物等があげられ、 0. 0 0 5〜2%の範囲で使用される。 過酸化水素を 検出するコレステロ一ル酸化酵素の基質となる色素源としては、 一般に使用され る 4—ァミノアンチピリ ンとフエノール、 4一クロ口フエノール、 m—クレブ一 ル、 3—ヒ ドロキシ— 2， 4， 6— トリョード安息香酸 （HT I B) 等のフエノ —ル類との組合せの他、 4一了ミ ノアンチピリンと トリンダー試薬として知られ ている （同仁化学研究所第 1 9版総合カタログ、 1 9 9 4年） N—スルホプロピ ルァニリン、 N—ェチルー N— ( 2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピル） 一 m— トルイジン （T〇〇S) 、 N—ェチル一 N— （2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロ ピル） 一 3, 5ージメチルァニリン （MAOS) 、 N—ェチルー N— （ 2—ヒ ド 口キン— 3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ トキシァニリ ン （DA〇S) 、 N ーェチルー N—スルホプロピル一 m— トルイジン （TO P S) 、 N— （ 2—ヒ ド 口キシ— 3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ トキシァニリン （HDAOS) 、 N， N—ジメチルー m— トルイジン、 N, N—ジスルホプロピル一 3, 5—ジメ トキシァニリ ン、 N—ェチルー N—スルホプロピル一m—ァニシジン、 N—ェチ ルー N—スルホプロピルァニリ ン、 N—ェチルー N—スルホプロピル一 3, 5 - ジメ トキシァニリ ン、 N—スルホプロピル一 3, 5—ジメ トキシァニリ ン、 N— ェチル—N—スルホプロピル— 3, 5—ジメチルァニリ ン、 N—ェチルー N— ( 2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピル） 一 m—ァニシジン、 N—ェチルー N— ( 2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピル） ァニリン、 N—ェチルー N— （ 2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ トキシァニリン等のァニリ ン類 あるいは N—ェチルー N— （ 3—メチルフエニル） 一 N' —サクシニルエチレン ジァミ ン （EMS E) 、 N—ェチルー N— （ 3—メチルフエニル） 一 N' —ァセ チルエチレンジァミ ン等との組合せが使用できる。 また、 高感度の色素源として、 特公昭 6 0— 3 34 7 9で示される 1 0— （N -メチルカルバモイル） — 3, 7 一ビス （ジメチルァミノ） フエノチアジン （MCDP) 、 特公平 4 - 2 7 8 3 9 で示されるビス [ 3—ビス （ 4ークロロフエニル） メチルー 4 -ジメチルァミ ノ フエニル] ァ ミ ン （BCMA) 、 特開昭 6 2 - 2 9 6で示される色素源等も使用 可能であり、 これらに 4一アミノアンチピリンあるいは上記で示したトリ ンダ一 試薬を組み合わせて用いることもできる。 色素源の濃度としては、 0. 0 1〜10 mg/m lが好ましく、 溶解度の関係で制限される。
また、 HDLを消去する際にパーォキシダーゼと共に使用されるフエノール化 合物およびァニリン化合物としては、 前記のフエノール類および了ニリ ン類が同 様に使用される。
緩衝剤としては、 燐酸塩などの他、 トリス、 グッ ドの緩衝剤等が好適に使用さ れ、 その濃度としては 5〜50 OmMが好ましい。 p Hは 5〜 9の範囲がよい。 例 2
①ァスコルビン酸ォキシダ一ゼを含む緩衝液に検体を添加し、 これに LD Lと の反応性が低い （すなわち LDLのみを反応阻害する） コレステロールエステル 加水分解酵素、 LDLとの反応性が低いコレステロール酸化酵素 （または LDL との反応性が低いコレステロール酸化還元酵素） およびパーォキシダーゼと色素 源 [または NAD (P) ] を含む試薬を添加する。 ② LDL以外のリポ蛋白中の コレステロールの反応が先に終了するので、 その後の吸光度の変化を分光光度計 で測定し、 別途同じ条件下で既知濃度の LDLコレステロ一ルを含む標準液を用 いて測定した場合の吸光度の変化と比較して LDLコレステロール量を算出する。
LDLとの反応性が低いコレステロールエステル加水分解酵素としては、 化学 修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が好ましく、 LDLとの反応性 が低いコレステロール酸化酵素あるいはコレステロール酸化還元酵素としては、 化学修飾されたもしくは未修飾のコレステロ一ル酸化酵素あるいは化学修飾され たもしくは未修飾のコレステロール酸化還元酵素が共に用いられる。 修飾剤とし ては、 上記サンブライ ト VFM4 1 0 1 [日本油脂 （株） 製] 等があげられる c 酵素の使用単位としては、 0. 5〜 1 00 uZm 1が好ましい。
色素源および緩衝剤としては、 例 1に記載した色素源および緩衝剤が同様に使 用される。
例 3
① LDLのみを反応阻害する試薬 （次述のコレステロールエステル加水分解酵 素が LDLのみを反応阻害する場合は不要）、 コレステロールエステル加水分解 酵素、 コレステロール酸化酵素 （またはコレステロール酸化還元酵素） および力 タラーゼ、 パーォキシダーゼとァニリン化合物、 パーォキシダーゼとフエノール 化合物またはバーオキシダ一ゼと 4ーァミノアンチピリン [または NAD (P) ] を含む緩衝液に検体を加えて LDL以外のリボ蛋白中のコレステロールを反応さ せて消去し、 ② LDLコレステロールを反応可能化する試薬 （次述のコレステロ ールエステル加水分解酵素が LDLコレステロールを反応可能化する場合は不要 ) 、 コレステロールエステル加水分解酵素 （最初に加えるコレステロールエステ ル加水分解酵素が L D Lコレステロールを反応可能化する試薬により L D Lコレ ステロールと反応可能になる場合は不要） および色素源を添加 [または無添加も しくは NAD (P) を添加] し （カタラーゼを使用した場合はパーォキシダーゼ も添加する） て LDLコレステロールを過酸化水素に導き、 発色させ [または NAD (P) Hに導き] 、 ③生成する色素の極大波長における吸光度を分光光度 計で測定する [コレステロール酸化還元酵素を用いる場合には、 NAD (P) H の増加を、 300〜 500 n m、 好ましくは 330〜 4 00 n m、 例えば 34 0 nmでの吸光度で測定する （ジァホラ一ゼ、 テトラゾリゥム塩を添加してホルマ ザン色素の発色に導き、 ホルマザン色素を比色定量することも可能である） 】 。 L D Lコレステロール量は、 別途同じ条件下で既知濃度の LDLコレステロール を含む標準液を用いて測定した場合の吸光度と比較して算出する。
LDLのみを反応阻害する試薬としては、 LDLのみを反応阻害するコレステ ロールエステル加水分解酵素等が、 LDLコレステロ一ルを反応可能化する試薬 としては、 LDLコレステロールを反応可能化するコレステロールエステル加水 分解酵素、 界面活性剤、 キレート剤等があげられる。
界面活性剤およびキレート剤としては、 例 1に記載した界面活性剤およびキレ 一ト剤が同様に使用される。
酵素としては、 例 1に記載した酵素があげられる。
LDLのみを反応阻害するコレステロールエステル加水分解酵素としては、 動 物、 植物または微生物由来のコレステロールエステル加水分解酵素にモル比とし て 1 0倍以上の化学修飾剤を添加して調製したコレステロールエステル加水分解 酵素の他、 動物、 植物または微生物由来のコレステロールエステル加水分解酵素 で同様の特異性を有するもの、 あるいはこれらの遣伝子を改変し発現させて同様 の特異性を与えたものが好ましい。 具体的には、 シユードモナスあるいはクロモ バクテリゥム等微生物由来のコレステロールエステラーゼの水溶液に 1 0倍以上 のモル比の例 1 に記載した化学修飾剤を添加して反応させたもの等があげられる c 化学修飾剤のモル比は、 好ましくは 1 0〜5 0 0倍で、 特異性が出現する効果と 修飾による活性の低下を鑑みて決定される。 また、 化学修飾されていないコレス テロールエステル加水分解酵素として、 例えばブレビパクテリゥム由来のリパー ゼの遺伝子配列の一部をランダムに変化させ、 別の例えば大腸菌に導入して発現 させ、 その中で酵素活性がありかつ L D Lのみを反応阻害するコレステロールェ ステラ一ゼを生産しているものをスクリ一二ングで拾い出して大量培養し生産し たものも使用できる。 コレステロールエステル加水分解酵素は、 0 . 1〜 1 0 0 u Zm 1で使用するのが好ましい。 また、 上記特異性を上げるため、 ①の段階で、 L D Lを凝集させない範囲で、 へパリン、 リ ンタングステン酸、 デキストラン硫 酸、 硫酸化シクロデキストリ ン、 硫酸化オリゴ糖もしくはこれらの塩、 あるいは ボリエチレングリ コールと、 マグネシウム塩、 カルシウム塩、 マンガン塩、 ニッ ゲル塩、 コバルト塩等の 2価の金属塩を併用して添加することもできる。 シクロ デキストリ ン、 ォリゴ糖および塩としては、 例 1 に記載したシクロデキストリ ン、 ォリゴ糖および塩があげられる。
L D Lコレステロールを反応可能化するコレステロールエステル加水分解酵素 としては、 未修飾のコレステロールエステラーゼが好ましく、 0 . 5〜 1 0 0 u /m 1で使用するのが好ましい。
コレステロール酸化酵素あるいはコレステロール酸化還元酵素としては、 コレ ステロールを酸化して過酸化水素を生成する微生物由来のコレステロールォキシ ダーゼ、 動物または微生物由来のコレステロールデヒ ドロゲナ一ゼが好ましく用 いられるか、 これら酵素の特異性、 安定性をさらにあげるためにポリエチレング リコールを主成分とする基や水溶性のォリゴ糖残基等で上記の酵素を化学的に修 飾してもよい。 この場合の化学修飾剤のモル比は、 好ましくは 0 . 1〜5 0 0倍 で、 安定化効果と修飾による活性の低下を鑑みて決定される。 コレステロール酸 化酵素およびコレステロール酸化還元酵素は、 0 . 1〜 1 0 0 u Zm 1 で使用す るのが好ましい。
次に、 酵素に上記化学修飾剤を反応させる方法を例示するが、 これによつて制 約されない。 まず、 酵素を p H 8以上のへぺス緩衝液等の緩衝液中に溶解し、 0 〜5 0 °Cで例えば所定倍モル量のサンブライ トを添加し、 1〜2 4時間撹拌する c この反応液をそのままあるいは必要に応じて限外濾過膜により低分子物を除去し て用いる。
L D L以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する際にパーォキシダーゼと 共に使用されるフエノール化合物およびァニリン化合物としては、 前記のフエノ ール類およびァニリン類が同様に使用され、 色素源および緩衝剤としては、 前記 の色素源および緩衝剤が同様に使用される。
上記本発明の各系は、 通常のコレステロールを測定する系を含んでいるため、 コレステロ一ル酸化酵素を活性化するためによく使用される界面活性剤あるいは コール酸類も使用可能であり、 また、 グロブリン等の蛋白等を可溶化するための 種々の塩類を使用することもできる。 界面活性剤としては、 ノニオン系、 ァニォ ン系、 カチオン系の界面活性剤が 0〜 1 %の範囲で使用され、 コール酸類として は、 コール酸、 デォキンコール酸、 タウロコール酸、 ケノデォキシコール酸等が 0〜5 %の範囲で使用され、 塩類としては、 塩化ナトリウム、 硫酸ナトリウム、 塩化カリウム、 硫酸カリウム、 塩化マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 酢酸マグ ネシゥム、 硝酸マグネシウム、 塩化リチウム、 硫酸リチウム、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥ厶、 塩化カルシウム、 硝酸カルシウム、 酢酸カルシウム、 塩化二 ッゲル、 硝酸ニッケル、 酢酸ニッケル、 塩化コバルト、 硝酸コバルト等が 0〜 1 0 O m Mの範囲で使用される。
図面の簡単な説明
第 1図は、 L D Lコレステロール 2 2 8 . 4 m g Z d 1を含む血清の希釈倍率 と実施例 1の方法により測定された吸光度との相関関係を示すものである。
第 2図は、 超遠心法で分離した H D L、 L D L、 V L D Lおよび人血清を使用 して実施例 9の方法により日立 7 2 5 0自動分析機で測定した吸光度のタイムコ ースを示すものである。
第 3図は、 L D Lコレステロール 2 2 8 . 4 m g / d 1を含む血清の希釈倍率 と実施例 1 1の方法により測定された吸光度との相関関係を示すものである。 次に実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 LD Lコレステロールの定量
( 1 ) 酵素の化学修飾
シユードモナス由来のコレステロールエステラーゼ 1 gを 2 OmMリ ン酸緩衝 液 （pH= 8 ) 1 0 Om lに溶解し、 5 °Cに冷却後、 これにサンブライ ト VFM 4 1 0 1 [日本油脂 （株） 製] 1 5 gを添加して 4時間反応させた。 試薬 Bの P E G修飾コレステロールエステラーゼとしては、 この反応液のまま使用した (PEG部分分子量 = 6000) 。 また、 ブレビパクテリゥ厶由来のコレステロール ォキシダーゼ 1 gおよびサンブライ ト VFM4 1 0 し 0. 1 gを用いて前記 と同様に反応させた。 試薬 Bの P EG修飾コレステロールォキシダ一ゼとしては， この反応液のまま使用した （PEG部分分子量 = 6000) 。
( 2) LDLコレステロールの定量
試薬 A 3—モルホリノプロパン
スルホン酸 （MOPS) 緩衝剤 2 0 mM (p H = デキストラン硫酸 0 7 g/ 1
硫酸 · 7水和物 7 5 g/ 1
アジ化ナトリウム 0 1 g/ 1
ァスコルビン酸ォキシダ一ゼ 3 u / 1 試薬 B MO P S緩衝剤 2 0 mM (pH= 7) パーォキシダーゼ 3 0 u/m \
P E G修飾コレステロールエステラーゼ 1 u /m 1
P E G修飾コレステロールォキシダーゼ 3 u / 1 コール酸ナ ト リウム 5 g/ 1
EMS E 0 3 g/ 1 試薬 C MO PS緩衝剤 2 0 mM (pH= 7) 未修飾コレステロールエステラーゼ 2 u/m 1 4ーァミ ノアンチピリ ン 0. 4 g/ 1
LDLコレステロール 2 2 8. 4 mg/d 1を含む血清を、 ①そのまま、 ②生 理食塩水で 8 0希釈したもの、 ③同 6 1 0希釈したもの、 ④同 4ノ 1 0希 釈したもの、 ⑤同 2ノ 1 0希釈したもの、 および⑥生理食塩水のみのそれぞれを 検体として下記の操作を行った。
検体 2 0〃 1を試薬 A, 2. 2 5m lに添加し、 3 7でで 5分間インキュべ一 シヨンし、 次いで試薬 B, 0. 7 5m lを添加し、 3 7 °Cで 5分間インキュベー シヨ ンして HDLコレステロールを消去し、 このときの 5 5 5 nmにおける吸光 度 （E 1 ) を測定した。 さらに、 試薬 C, 0. 7 5m lを添加し、 3 7°Cで 5分 間ィンキュベーションした後に波長 5 5 5 nmにおける吸光度 （E 2) を測定し た。 LDLコレステロールの濃度は、 コレステロール濃度 2 0 OmgZd 1の標 準液を用いて同様の操作を行い、 （E 2— E 1 ) X希釈倍率の値を比較すること により算出した。 ただし、 希釈倍率とは （試薬 A+試薬 B) / (試薬 A+試薬 B +試薬 C) の容量比である。
LDLコレステロール 2 2 8. 4 mg/d 1を含む血清を用いて得られた結果 を第 1図に示す。
実施例 2
実施例 1 ( 2) に記載した試薬 Bおよび試薬 Cを使用し、 試薬 Aに用いる凝集 剤および 2価の金属塩を下記のように種々組み換えて、 血清検体を日立 7 0 7 0 自動分析機 （検体 4 1、 試薬 A, 2 7 0 〃 1、 試薬8, 9 0 〃 1、 試薬 9 0 1の条件） でそれぞれ測定した。 一方、 日立 RPL 4 2 T口一ターを用 い、 医学のあゆみ、 第 9 4巻 （第 8号） 、 3 5 9頁、 1 9 7 5年に記載の方法 (超遠心法） に準じて LDLコレステロールを定量した。 その結果、 第 1表に示 すようにいずれの場合も超遠心法で得られた値とよく一致した値が得られた。
ィ、 リ ンタングステン酸 1 0 mg/m l
硫酸 Mg · 7水和物 7. 5 mg/m 1 O. デキス トラン硫酸
ナ ト リウム（MW-4000) 1 g m 硫酸 Mg · 7水和物 1 0 mg/ m へパリ ンナト リウム 1 0 m gx m 塩化 C a · 2水和物 1 0 m gz m
PEG 2 0 0 0 0 5 0 m g/m 硫酸 Mg · 7水和物 5 m g/m ホ、 リ ンタングステン酸 1 0 m g/m デキス トラン硫酸
ナト リウム（園 =200000) 5 m g /m 硫酸 M g · 7水和物 5 m g/m へ、 リ ンタングステン酸 1 0 mg/m へパリ ンナト リウム 7. 5 m g/m 硫酸 Mg · 7水和物 7. 5 m g Zm ト、 リ ンタングステン酸 1 0 m /m P E G 6 0 0 0 7. 5 m g/m 硫酸 Mg · 7水和物 7. 5 m g/
第 1 表
Figure imgf000019_0001
実施例 3
サンブライ ト VFM4 1 0 1に代えて、 サンブライ ト A KM 1 5 1 1 [日本 油脂 （株） 製] ボリウレタン P 4 0 0 0 activated (ベーリ ンガ一マンハイム 社製） あるいはデキストラン T 4 0, TCT— activated (ベ一リンガーマンハ ィム社製） を使用し、 実施例 1 ( 1 ) と同様にして酵素を化学修飾した。 実施例 1 ( 2) に記載した試薬 Aおよび試薬 Cを使用し、 試薬 Bにおいて PEG修飾コ レステロールエステラーゼおよび P E G修飾コレステロールォキシダーゼに代え て上記で得られた化学修飾酵素を使用し、 実施例 2で使用した血清検体を実施例 2と同様にして測定した。 その結果、 それぞれ、 1 7 8. OmgZd 】 179.1 mg/ά 1. 1 7 9. 8mg/d I と超遠心法で得られた値とよく一致した値が 得られた。
実施例 4
実施例 1 ( 2) に記載した試薬 Aを使用し、 試薬 Bにおいてパーォキシダーゼ に代えて力夕ラーゼを 3 0 0 u/m 1の濃度で使用し、 試薬 Cにパ一ォキシダー ゼ 3 0 uZm 1を加えて使用し、 実施例 2で使用した血清検体を実施例 2と同様 にして測定した。 その結果、 1 7 8. 6mgノ d 1 と超谆心法で得られた値とよ く一致した値が得られた。 実施例 5
実施例 1 ( 2 ) に記載した試薬 Aおよび試薬 Cを使用し、 試薬 Bにおいて EMS Eに代えて TO OS (測定波長 5 5 5 nm) 、 DAOS (測定波長 5 9 3 nm) 、 MAOS (測定波長 6 3 O nm) あるいは TO P S (測定波長 5 5 0 nm) を同濃度で使用し、 実施例 2で使用した血清検体を実施例 2と同様にして 測定した。 その結果、 それぞれ、 1 7 7. 9mg/d 1 , 1 7 7. 8mg/d 1 , 1 7 9. 2mg/d l、 1 7 8. 8 m g Z d 1 と超遠心法で得られた値とよく一 致した値が得られた。
実施例 6
実施例 1 ( 2) に記載した試薬 Aおよび試薬 Bを使用し、 試薬 Cにおいて 4一 ァミノアンチピリ ンに代えて MC DP (測定波長 6 6 6 nm) あるいは BCMA (測定波長 7 5 5 nm) を 0. 1 mg/m 1の濃度で使用し、 実施例 2で使用し た血清検体を実施例 2と同様にして測定した。 その結果、 それぞれ、 1 7 8. 3 mg/d 1. 1 7 9. OmgZd 1 と超遠心法で得られた値とよく一致した値が 得られた。
実施例 7
実施例 1 ( 2) に記載した試薬 Aおよび試薬 Bを使用し、 試薬 Cにおいて未修 飾コレステロールエステラーゼに代えてジメチルー S—シクロデキストリ ンを 2 Omg/m 1の濃度で使用し、 実施例 2で使用した血清検体を実施例 2と同様 にして測定した。 その結果、 1 7 7. 4mg/d 1 と超遠心法で得られた値とよ く一致した値が得られた。
実施例 8
実施例 1 ( 2) に記載した試薬 Aと試薬 Bとを 3 ： 1の比率で混合して試薬 D とし、 この溶液 3m 1に実施例 2で使用した血清検体 2 0 1加えて、 37 で 5分間インキュベーションし、 このときの 5 5 5 nmにおける吸光度 （E 1 ) を 測定した。 さらに、 試薬 C, 0. 7 5m lを添加して、 3 7°Cで 5分間インキュ ベ一ションした後に波長 5 5 5 nmにおける吸光度 （E 2) を測定した。 LDL コレステロールの濃度は、 コレステロール濃度 2 0 0 m gZd 1の標準液を用い て同様の操作を行い、 （E 2—E 1 ) X希釈倍率の値を比較することにより算出 した。 ただし、 希釈倍率とは、 （試薬 D) / (試薬 D+試薬 C) の容量比である c その結果、 1 7 7. 6mgZd 1 と超遠心法で得られた値とよく一致した値が得 られた。
実施例 9
試薬 A MOP S緩衝剤 1 0 mM (pH= 7) 硫酸 Na 2 m g/m 1 EMS E 0. 3 mg/m 1 ァスコルビン酸ォキンダーゼ 3 /m 1 試薬 B MO P S緩衝剤 1 0 mM (p H= 7 )
4ーァミノアンチピリ ン 0 5 m g/ m 1 コール酸ナトリウム 3 m g/m 1
P E G修飾コレステロールエステラーゼ 5 υ /m 1 未修飾コレステロールォキシダーゼ 7 u / 1 パーォキシダーゼ 1 0 u / 1
PEG修飾コレステロールエステラーゼとしては、 実施例 1で使用したのと同 じものを用いた。
上記の試薬を用い、 日立 7 2 5 0自動分析機を使用して、 実施例 2で使用した 血清検体を測定した。 試薬 B添加後 3. 5分から 5分の吸光度変化 （E 3 ) を測 定した。 L D Lコレステロールの濃度は、 コレステロール濃度 2 0 0 m g/d 1 の標準液を用いて同様の操作を行い （E 4 ) 、 E 3と E 4の値を比較することに より算出した。 その結果、 1 7 8. 6mgZd 1 と超遠心法で得られた値とよく 一致した値が得られた。
なお、 第 2図に超遠心法で分離した HDL、 LDL、 VLDLおよび人血清の タイムコースを示す。
実施例 1 0
試薬 A MOPS緩衝剤 1 0 mM (pH= 7) デキストラン硫酸 ナト リウム（漏 =500000) 0. m g/ m 1 硫酸 Mg · 7水塩 5 m g Zm 1 EMS E 0. m g/m 1 パーォキシダ一ゼ 1 0 υ /m 1
P E G修飾コレステロールエステラーゼ 2 uZm 1 未修飾コレステロールォキシダーゼ 3 u /m 1 ァスコルビン酸ォキシダーゼ 3 u /m 1 試薬 B MO P S緩衝剤 1 0 m (pH= 7)
4—ァミ ノアンチピリ ン 0. 5 m g / m 1 トリ トン X - 1 0 0 3 m g/ 1 EDTA - 4ナ ト リウム 5 u / .1
P E G修飾コレステロールエステラーゼとしては、 実施例 1で使用したのと同 じものを用いた。
上記の試薬を用い、 日立 7 2 5 0自動分析機を使用して、 実施例 2で使用した 血清検体を測定した （E 5) 。 L D Lコレステロールの濃度は、 コレステロール 濃度 2 0 Omg/d 1の標準液を用いて同様の操作を行い （E 6) 、 E 5と E 6 の値を比較することにより算出した。 その結果、 1 7 7. SmgZd l と超遠心 法で得られた値とよく一致した値が得られた。 なお、 自動分析機の測光点は、 試 薬 B添加 5分後とした。
実施例 1 1
( 1 ) 酵素の化学修飾
シユー ドモナス由来のコレステロールエステラーゼ 1 gを 2 OmMリ ン酸緩衝 液 （ p H= 8 ) 1 0 0 m l に溶解し、 1 5 °Cに冷却後、 これにサンブライ ト VFM4 1 0 1 [日本油脂 （株） 製] 2 5 gを添加して 4時間反応させた。 試薬 Bの PEG修鈽コレステロールエステラーゼとしては、 この反応液のまま使用し た （P E G部分分子量 = 6000) 。 また、 ブレビバクテリウム由来のコレステロ一 ルォキシダーゼ 1 gおよびサンブライ ト VFM4 1 0 し 0. 5 gを用いて前 記と同様に反応させた。 試薬 Aの PEG修飾コレステロールォキシダ一ゼとして は、 この反応液のまま使用した （PEG部分分子量 =6000) 。
(2) LDLコレステロールの定量
試薬 A MO PS緩衝剤 2 0 mM (pH= 7) 硫酸 Mg · 7水和物 2 S/ l
パーォキシダ一ゼ 3 0 u κ m 1
P E G修飾コレステロールエステラーゼ 2 u /m 1
P E G修飾コレステロールォキシダーゼ 5 u /m 1 コール酸ナトリウム 1 g/ \
EMS E 0 3 g/ \
ァスコルビン酸ォキシダーゼ 3 u /m 1 試薬 B MO PS緩衝剤 2 0 mM (pH= 7) 未修飾コレステロールエステラーゼ 3 /m 1
4ーァミノアンチピリン 0. 4 g/ 1 超遠心法で測定して L D Lコレステロール 22 8. 4 mg/d 1を含む血清を、 ①そのまま、 ②生理食塩水で 8/ 1 0希釈したもの、 ③同 6/ 1 0希釈したもの、 ④同 4ノ 1 0希釈したもの、 ⑤同 2 1 0希釈したもの、 および⑥生理食塩水の みのそれぞれを検体として下記の操作を行った。
検体 2 0〃 1を試薬 A， 2. 2 5m lに添加し、 3 7 °Cで 5分間インキュべ一 シヨンして LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した。 次いで、 試薬 B, 0. 7 5m lを添加し、 3 7 °Cで 5分間インキュベーションした後に波長 6 0 0 nmにおける吸光度を測定した。 得られた結果を第 3図に示す。
一方、 別途前もって試薬 Aと試薬 Bとを 3 ： 1の比率で混合した液にコレステ ロール 2 0 0 mg/d 1の標準液 20 μ. 1を添加し、 3 7 °Cで 5分間ィンキュベ —シヨンした後に波長 6 0 0 nmにおいて測定し得られた吸光度より、 上記血清 検体の LDLコレステロール濃度を算出したところ、 22 9. TmgZd l と超 遠心法で得られた値とよく一致した値が得られた。 実施例 1 2
実施例 1 1 ( 2) に記載した試薬 Bを使用し、 試薬 Aに下記の種々の組合せの 凝集剤および 2価の金属塩を加えて使用し、 実施例 1 1 ( 2) で使用した血清検 体を日立 7 0 7 0自動分析機 （検体 4 し 試薬 A, 2 7 0 し 試薬 B, 9 0 1の条件） でそれぞれ測定した。 一方、 日立 RPL 4 2 Tローターを用い、 現代医療、 第 2 3巻 （第 1号） 、 1 1 3頁、 1 9 9 1年に記載の方法 （超遠心法） に準じて LDLコレステロールを定量した。 その結果、 第 2表に示すようにいず れの場合も超遠心法で得られた値とよく一致した値が得られた。
ィ、 リ ンタングステン酸 0. 1 mg/m
硫酸 Mg · 7水和物 1 mgZm 口、 アキス トラン f 酸
ナト リゥム（MW=20000) 0. 1 mg m
硫酸 Mg · 7水和物 2 m g/m ハ、 へパリ ンナ ト リウム 0. 3 mg/m
塩化 C a · 2水和物 3 mg/m 二、 PEG 2 0 0 0 0 2 0 m g/m
硫酸 Mg · 7水和物 3 m g/m ホ、 リ ン夕ングステン酸 0. 1 m g/m
デキス トラン硫酸
ナ ト リウム ( W=200000) 0. 1 m g /
硫酸 M g · 7水和物 2 m g/m へ、 リ ンタングステン酸 0. 1 m g/m
へパリ ンナ ト リウム 0. 1 m g/m
硫酸 Mg · 7水和物 2 m g/m ト、 デキストラン硫酸（MW=500000) 0. 1 m g/m 1
PEG 6 0 0 0 5 m g/m 1
硫酸 Mg · 7水和物 2 mg/m 1
第 2 表
Figure imgf000025_0001
実施例 1 3
サンブライ ト VFM4 1 0 1に代えて、 サンブライ ト AKM 1 5 1 1 [日本 油脂 （株） 製] 、 ポリウレタン P 4 0 0 0 activated (ベーリンガーマンハイム 社製） あるいはデキストラン T 4 0, TCT— activated (ベ一リ ンガーマンハ ィム社製） を使用し、 実施例 1 1 ( 1 ) と同様にして酵素を化学修飾した。 実施 例 1 1 (2) に記載した試薬 Bを使用し、 試薬 Aにおいて PEG修飾コレステロ ールエステラーゼおよび P EG修飾コレステロールォキシダーゼに代えて上記で 得られた化学修飾酵素を使用し、 実施例 1 1 (2) で使用した血清検体を実施例 1 1 (2) と同様にして測定した。 その結果、 それぞれ、 22 8. Omg/d 1 , 2 2 9. 1 m g/d 1. 2 2 6. 8 m d 1 と超遠心法で得られた値とよく一 致した値が得られた。
実施例 1 4 実施例 1 1 (2) に記載した試薬 Aにおいてパーォキシダーゼに代えて力タラ ーゼを 3 0 0 u/m 1の濃度で使用し、 試薬 Bにパ一ォキシダーゼ 3 0 0 uZml およびアジ化ナトリウム 0. 5mgZm 1を加えて使用し、 実施例 1 1 ( 2) で 使用した血清検体を実施例 1 1 (2) と同様にして測定した。 その結果、 228.6 mg/d 1 と超遠心法で得られた値とよく一致した値が得られた。
実施例 1 5
実施例 1 1 ( 2) に記載した試薬 Bを使用し、 試薬 Aにおいて EMS Eに代え て TO〇S (測定波長 5 5 5 nm) 、 DAOS (測定波長 5 9 3 nm) 、 MA0S (測定波長 6 3 0 nm) あるいは TOPS (測定波長 5 5 0 nm) を同濃度で使 用し、 実施例 1 1 (2) で使用した血清検体を実施例 1 1 (2) と同様にして測 定した。 その結果、 それぞれ、 227. 9 mg/d 1 , 2 2 7. 4 m g/d 22 5. 2 mg/d し 224. 8 m gノ d 1 と超遠心法で得られた値とよく一 致した値が得られた。
実施例 1 6
実施例 1 1 (2) に記載した試薬 Aにおいて EMSEを削除し、 試薬 Bにおい て 4ーァミ ノアンチピリ ンに代えて MC D P (測定波長 6 6 6 nm) あるレ、は B CM A硫酸塩 （測定波長 75 5 nm) を 0. 1 mgZm 1の濃度で使用し、 実 施例 1 1 ( 2) で使用した血清検体を実施例 1 1 ( 2) と同様にして測定した。 その結果、 それぞれ、 22 8. 3 mg/d 22 9. OmgZd l と超遠心法 で得られた値とよく一致した値が得られた。
実施例 1 7
実施例 1 1 ( 2) に記載した試薬 Aを使用し、 試薬 Bにポリオキンエチレンモ ノラウレート 5mgZm 1、 トリ トン X— 1 0 0， 5 m g 1あるレ、はドデシ ルベンゼンスルホン酸ナトリウム 1 mg/m 1を加えて使用し、 実施例 1 1 ( 2) で使用した血清検体を実施例 1 1 ( 2) と同様にして測定した。 反応は 3分以内 に終了し、 その結果、 それぞれ、 22 8. 6 mg/d U 22 6. 1 m g/d 2 27. Omg/d 1 と超遠心法で得られた値とよく一致した値が得られた。 実施例 1 8
実施例 1 1 (2) に記載した試薬 Aを使用し、 試薬 Bにおいて未修飾コレステ ロールエステラーゼに代えてポリオキシエチレンモノラウレート 5mg/m l、 トリ トン X— 1 00， 5 mg/m 1あるいはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ ゥ厶 1 mgノ m 1を使用し、 実施例 1 1 (2) で使用した血清検体を実施例 1 1 (2) と同様にして測定した。 反応は 3分以内に終了し、 その結果、 それぞれ、 227. 9 mg/d 1 , 229. 2mg/d l、 226. lmgZd l と超遠心 法で得られた値とよく一致した値が得られた。
実施例 1 9
実施例 1 1 (2) に記載した試薬 Bを使用し、 試薬 Aにおいてコール酸に代え てデォキンコール酸あるいはタウロコール酸を同濃度で使用し、 実施例 1 1 (2) で使用した血清検体を実施例 1 1 (2) と同様にして測定した。 その結果、 それ ぞれ、 229. 9 mgZd l、 225. 7 m g / d 1と超遠心法で得られた値と よく一致した値が得られた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 煩雑な分離操作の不要な簡便な LDLコレステロールの定量 法を提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 低密度リポ蛋白 （LDL) を含有する試料から高密度リボ蛋白 （HDL) 中のコレステロールを消去した後、 コレステロールエステル加水分解酵素および コレステロ一ル酸化酵素またはコレステロ一ル酸化還元酵素を作用させ、 発生す る過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする LDL中のコレス テロールの定量法。
2. コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素また はコレステロール酸化還元酵素を作用させる際に LDL中のコレステロールを反 応可能化する試薬を存在させることからなる請求の範囲 1記載の LDL中のコレ ステロールの定量法。
3. HDL中のコレステロールを消去する方法が、 HDL以外のリボ蛋白を反 応阻害する試薬の存在下、 化学修飾もしくは未修飾のコレステロールエステル加 水分解酵素および化学修飾もしくは未修飾のコレステロ一ル酸化酵素または化学 修飾もしくは未修飾のコレステロール酸化還元酵素を作用させる方法である請求 の範囲 2記載の LDL中のコレステロールの定量法。
4. HDL以外のリポ蛋白を反応阻害する試薬が、 へパリンもしくはその塩、 リンタングステン酸もしくはその塩、 デキストラン硫酸もしくはその塩、 ポリエ チレンダリコール、 硫酸化シクロデキスト リ ンもしくはその塩、 硫酸化ォリゴ糖 もしくはその塩またはこれらの混合物、 および 2価の金属塩からなる請求の範囲 3記載の L D L中のコレステロールの定量法。
5. HDL以外のリポ蛋白を反応阻害する試薬が、 抗アポ B抗体または抗アポ C抗体である請求の範囲 3記載の LD L中のコレステロールの定量法。
6. 化学修飾コレステロールエステル加水分解酵素、 化学修飾コレステロール 酸化酵素または化学修飾コレステロ一ル酸化還元酵素における修飾部分か、 ポリ ェチレングリコールを主成分とする基、 ポリプロピレングリコールを主成分とす る基、 ボリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する 基、 構造に糖類を含む基、 スルホプロピル基またはポリウレタン基である請求の 範囲 3〜 5記載の LDL中のコレステロールの定量法。
7. LDL中のコレステロールを反応可能化する試薬が、 ノニオン系、 カチォ ン系もしくはァニオン系界面活性剤、 シクロデキストリン類、 化学修飾もしくは 未修飾であつて LDLに作用するコレステロ一ルエステル加水分解酵素、 化学修 飾もしくは未修飾であって LDLのみに作用するコレステロール酸化酵素または 化学修飾もしくは未修飾であつて LDLに作用するコレステロ一ル酸化還元酵素 である請求の範囲 3〜 6記載の LDL中のコレステロールの定量法。
8. HDL中のコレステロールを消去する方法が、 LDLのみを反応阻害する 試薬の存在下に LDL以外のリボ蛋白中のコレステロールを消去する方法である 請求の範囲 1記載の LDL中のコレステロールの定量法。
9. LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後に LDL中のコレ ステロールを反応可能化する試薬を加えることからなる請求の範囲 8記載のし DL 中のコレステロールの定量法。
10. LDLのみを反応阻害する試薬が、 化学修飾もしくは未修飾であって LDL のみを反応阻害するコレステロールエステル加水分解酵素である請求の範囲 9記 載の LDL中のコレステロールの定量法。
11. 化学修飾コレステロールエステラーゼにおける修飾部分が、 ボリエチレン グリコールを主成分とする基、 ポリプロピレングリコールを主成分とする基、 ポ リプロピレングリコールとポリエチレンダリコールの共重合体を有する基、 構造 に糖類を含む基、 スルホプロピル基またはポリウレタン基である請求の範囲 10記 載の LDL中のコレステロールの定量法。
12. L D L中のコレステロールを反応可能化する試薬が、 LDL中のコレステ 口一ルを反応可能化するコレステロ一ルエステル加水分解酵素である請求の範囲 9〜11記載のし0し中のコレステロールの定量法。
13. LDL中のコレステロールを反応可能化する試薬が、 界面活性剤またはキ レー卜剤である請求の範囲 9〜11記載の LDL中のコレステロールの定量法。
14. コレステロールエステル加水分解酵素、 コレステロール酸化酵素またはコ レステロール酸化還元酵素が、 動物、 植物または微生物由来の酵素あるいはそれ らの遺伝子を取り、 別の微生物に導入して発現させた酵素、 あるいはこれらの遺 伝子を改変して発現させた酵素である請求の範囲 1〜13記載の LDL中のコレス テロールの定量法。
15. 過酸化水素を定量する方法が、 過酸化水素をパーォキシダーゼと色素源の 作用で色素に変換して定量する方法である請求の範囲 1〜14記載の LDL中のコ レステロールの定量法。
16. HDL以外のリポ蛋白を反応阻害する試薬および LDL中のコレステロ一 ルを反応可能化する試薬を成分とする L DL中のコレステロ一ルの定量試薬。
17. HDL以外のリポ蛋白を反応阻害する試薬と LDL中のコレステロールを 反応可能化する試薬を組み合わせてなる LDL中のコレステロ一ルの定量試薬。
18. HDL以外のリボ蛋白を反応阻害する試薬が、 へパリンもしくはその塩、 リンタングステン酸もしくはその塩、 デキストラン硫酸もしくはその塩、 ポリエ チレングリコール、 硫酸化シクロデキストリンもしくはその塩、 硫酸化ォリゴ糖 もしくはその塩またはこれらの混合物、 および 2価の金属塩からなる請求の範囲 16または 17記載の LD L中のコレステロールの定量試薬。
19. HDL以外のリボ蛋白を反応阻害する試薬が、 抗アポ B抗体または抗ァボ C抗体である請求の範囲 16または 17記載の LDL中のコレステロールの定量試薬 c
20. LDL中のコレステロールを反応可能化する試薬が、 ノニオン系、 カチォ ン系もしくはァニオン系界面活性剤、 シクロデキストリン類、 化学修飾もしくは 未修飾であって LDLに作用するコレステロールエステル加水分解酵素、 化学修 飾もしくは未修飾であって LDLのみに作用するコレステロール酸化酵素または 化学修飾もしくは未修飾であって LDLに作用するコレステロール酸化還元酵素 である請求の範囲 16〜19記載の L D L中のコレステロールの定量試薬。
21. LD Lのみを反応阻害する試薬を成分とする LDL中のコレステロールの ¾：里 s^¾¾。
22. LD Lのみを反応阻害する試薬および LDL中のコレステロールを反応可 能化する試薬を成分とする LDL中のコレステロールの定量試薬。
23. LDLのみを反応阻害する試薬と LDL中のコレステロールを反応可能化 する試薬を組み合わせてなる LDL中のコレステロールの定量試薬。
24. LDLのみを反応阻害する試薬が、 化学修飾もしくは未修飾であって LDL のみを反応阻害するコレステロールエステル加水分解酵素である請求の範囲 21〜 23記載の LDL中のコレステロールの定量試薬。
25. 化学修飾コレステロールエステラーゼにおける修飾部分が、 ボリエチレン グリコールを主成分とする基、 ボリプロピレングリコールを主成分とする基、 ポ リプロピレンダリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、 構造 に糖類を含む基、 スルホプロピル基またはボリウレタン基である請求の範囲 24記 載の L D L中のコレステロールの定量試薬。
26. LDL中のコレステロールを反応可能化する試薬が、 LDL中のコレステ 口一ルを反応可能化するコレステロールエステル加水分解酵素である請求の範囲 21〜25記載の LDL中のコレステロ一ルの定量試薬。
27. LDL中のコレステロールを反応可能化する試薬が、 界面活性剤またはキ レ一卜剤である請求の範囲 21〜25記載の LDL中のコレステロ一ルの定量試薬。
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