WO1997032989A2 - Transduktionssystem beruhend auf rekombinantem aav-vektor und seine verwendung - Google Patents

Transduktionssystem beruhend auf rekombinantem aav-vektor und seine verwendung Download PDF

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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a transduction system comprising a rep-negative AAV vector and its use.
  • Transduction refers to the transmission of genes using viruses as a vector. Transduction is often used to insert genes into the genome
  • viruses are e.g. Adeno-associated viruses (AAVs) are used.
  • AAVs Adeno-associated viruses
  • AAVs are single-stranded DNA viruses belonging to the parvovirus family. For their replication, AAVs need helper viruses, especially adenoviruses or
  • AAVs integrate into the host cell genome, particularly at a specific location on chromosome 19.
  • the genome of AAVs is linear and has a length of approximately 4680 nucleotides. This comprises two reading frames which code for a structural and a non-structural gene.
  • the structural gene is called the cap gene. This is under the control of the P40 promoter and codes for three capsid proteins.
  • the non-structural gene is referred to as the rep gene and codes for the Rep proteins, Rep 78, Rep 68, Rep 52 and Rep 40. The former two are expressed under the control of the P5 promoter, while the expression of Rep 52 and Rep 40 is under the control of the P19 promoter.
  • the functions of the Rep proteins include in the regulation of replication and transcription of the AAV genome.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which a foreign DNA can be specifically integrated into the genome of cells.
  • the present invention thus relates to a transduction system comprising: (a) a rep-negative AAV vector containing a foreign DNA, and
  • the present invention is based on the applicant's finding that AAVs lacking the rep gene do not integrate into the genome of cells.
  • rep negative AAV vector refers to any AAV, i.e. Virus particles, and their DNA, which are rep negative. The latter means that there is no or only a defective rep gene.
  • Conventional methods can be used to provide a rep-negative AAV vector. For example, an AAV DNA can be changed by specific mutagenesis in the rep gene so that it becomes defective, or the rep gene is deleted by special restriction cleavage and ligation.
  • a rep-negative AAV DNA can then be transfected into cells expressing an AAV rep gene, and after infection with a helper virus, rep-negative AAVs, i.e. Virus particles.
  • the term "foreign DNA” refers to any DNA that can be integrated in a rep-negative AAV vector.
  • the foreign DNA can be non-coding or coding.
  • the foreign DNA can be a regulatory element of DNA replication and / or transcription.
  • the foreign DNA can code for a diagnostic and / or therapeutic protein. Examples of one therapeutic proteins are tumor necrosis factor, interferons, interleukins, lymphokines, growth factors, plasma proteins and receptors.
  • the foreign DNA can be inserted anywhere in the rep-negative AAV vector. It can be advantageous if the foreign DNA is present in or instead of the rep gene. It can also be advantageous if there are several foreign DNAs.
  • agent providing AAV Rep protein includes any agent that can provide an AAV Rep protein, particularly Rep 78 or Rep 68, or a portion thereof.
  • the agent can be an AAV rep
  • rep-DNA Protein or a part of it expressible DNA (rep-DNA). It is favorable if the expression of the rep-DNA is under the control of an inducible promoter, such as an antibiotic or tissue-specific promoter.
  • the rep DNA can be comprised of the genome of an AAV virus particle. It is favorable if the genome contains a defective (deleted) cap gene or an inducible one
  • the genome and the corresponding AAV virus particle can also be an agent in the above sense.
  • the agent can be an AAV-Rep protein, in particular Rep 78 or Rep 68, itself or a part thereof or a fusion protein which contains an AAV-Rep protein or a part thereof.
  • Such proteins can be provided by customary methods.
  • components (a) and (b) can be connected to one another. Such a connection can be made by conventional methods. Lying z. B. the AAV vector of component (a) as virus
  • the AAV vector is modified chemically or enzymatically.
  • biotinylated ie biotin or a biotinylated anti-AAV antibody, such as an antibody directed against the AAV proteins VP-1, VP-2 or VP-3, are bound to the AAV vector.
  • the rep-expressing DNA is mixed with DNA-binding substances, such as organic polycations, for example polylysine and / or polyornithine, or heterologous polycations with several different, positively charged amino acids.
  • An above transduction system is suitable for transducing cells.
  • the cells can be of any kind and descent.
  • the cells can be present individually or in a bandage, such as a tissue or organ.
  • the cells can also be present in or outside an organism. In the latter case, the cells can be kept in culture.
  • the cells can be healthy cells, diseased cells such as virus-infected cells or cells infected with microorganisms or single cells, or tumor cells.
  • the transduction of the cells can be carried out by conventional methods. Becomes a
  • the cells can be infected with the transduction system.
  • the transduction system can e.g. can be introduced into the cells by transfection, lipofection or electroporation.
  • the cells can be infected with the virus particles.
  • the cells can be infected with the AAV vector or the agent and the DNA can be introduced into the cells as indicated above.
  • the AAV vector and the agent are each present as DNA, they can be introduced into the cells as indicated above.
  • the agent is also in the form of an AAV-Rep protein or a part thereof or as a fusion protein which contains an AAV-Rep protein or a part thereof, the agent can be introduced into the cells, for example by lipofection become.
  • the present invention can be used to transduce cells that are inside or outside an organism.
  • the present invention is particularly suitable for transducing cells from a tumor material that has been removed without these cells having to be brought into culture beforehand.
  • the present invention is therefore ideally suited for use in gene therapy, in particular of monogenic diseases, such as hemoglobin abnormalities, cystic fibrosis, subtypes of Parkinson's disease and hemophilia, of AIDS and cancer.
  • monogenic diseases such as hemoglobin abnormalities, cystic fibrosis, subtypes of Parkinson's disease and hemophilia, of AIDS and cancer.
  • the invention is illustrated by the following example.
  • transduction system As a transduction system according to the invention, one is used in which components (a) and (b) are separated from one another.
  • Expression plasmid pRc / CMV (Invitrogen) transfected, which contains an AAV rep gene under the control of the CMV promoter.
  • AAV rep gene under the control of the CMV promoter.
  • the expression of the AAV-rep gene is determined by an antibody directed against AAV-Rep 78 in the immunoblot.
  • Vector i.e. a virus particle that contains an expressible foreign DNA, e.g. contains a DNA coding for a B7 protein.
  • a specific integration of the foreign DNA on chromosome 19 is obtained. This is proven by standard procedures. Expression of the B7 protein is also obtained. This is demonstrated by an antibody directed against the B7 protein.
  • tetR is a tetracycline repressor
  • VP1 6 is the transactivation domain of the VP1 6 molecule of HSV.
  • the second expression plasmid, pUHD10-3 contains an AAV rep gene which is under the control of a promoter which is induced by the tetR-VP1 6 fusion protein. This induction is obtained when the tetracycline
  • the detection of the transfection is determined via the expression of a neomycin resistance gene on the first expression plasmid and the expression of the rep gene on the second expression plasmid.
  • the transfected cells are then infected with the rep-negative AAV vector from (a), which contains a foreign DNA coding for a B7 protein. After removal of tetracycline from the medium a specifi ⁇ specific integration is obtained of the foreign DNA on chromosome 1. 9 This is proven by standard procedures. Expression of the

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Transduktionssystem, umfassend (a) einen, eine Fremd-DNA enthaltenden, rep-negativen AAV-Vektor, und (b) ein ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel. Ferner umfaßt die Erfindung die Verwendung des Transduktionssystems.

Description

TRANSDUKΗONSSYSTEM BERUHEND AUF REKOMBINANTEM AAV- VEKTOR UND SEINE VERWENDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Transduktionssystem, das einen rep-negati- ven AAV-Vektor umfaßt, und seine Verwendung.
Mit Transduktion wird die Übertragung von Genen mittels Viren als Vektor bezeichnet. Die Transduktion wird häufig genutzt, um Gene in das Genom von
Zellen zu integrieren. Als Viren werden hierfür z.B. Adeno-assoziierte Viren (AAVs) verwendet.
AAVs sind einzelsträngige, zur Familie der Parvoviren gehörende DNA-Viren. Für ihre Replikation benötigen AAVs Helfervireπ, insbesondere Adenoviren oder
Herpesviren. In Abwesenheit von Helferviren integrieren AAVs in das Wirtszell¬ genom, insbesondere an einer spezifischen Stelle von Chromosom 19.
Das Genom von AAVs ist linear und weist eine Länge von ca. 4680 Nukleotiden auf. Dieses umfaßt zwei Leserahmen, die für ein strukturelles und ein nicht¬ strukturelles Gen kodieren. Das strukturelle Gen wird mit cap-Gen bezeichnet. Dieses steht unter der Kontrolle des P40-Promotors und kodiert für drei Capsid- Proteine. Das nicht-strukturelle Gen wird mit rep-Gen bezeichnet und kodiert für die Rep-Proteine, Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. Die beiden ersteren werden unter der Kontrolle des P5 Promotors exprimiert, während die Expres¬ sion von Rep 52 und Rep 40 unter der Kontrolle des P19 Promotors steht. Die Funktionen der Rep-Proteine liegen u.a. in der Regulation der Replikation und Transkription des AAV-Genoms.
Es hat sich nun gezeigt, daß rekombinante AAVs, d.h. AAVs, die eine Fremd-
DNA enthalten, oftmals nicht in das Genom von Zellen integrieren, wodurch auch die Fremd-DNA nicht dorthin gelangt. Letzteres ist aber für eine Manipula¬ tion von Zellen, insbesondere im Rahmen einer Gentherapie, wichtig und zum Teil unverzichtbar. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem eine Fremd-DNA gezielt in das Genom von Zellen integriert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Transduktionssystem, umfassend: (a) einen, eine Fremd-DNA enthaltenden, rep-negativen AAV- Vektor, und
(b) ein ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß AAVs, denen das rep-Gen fehlt, nicht in das Genom von Zellen integrieren.
Der Ausdruck "rep-negativer AAV-Vektor" betrifft jegliches AAV, d.h. Virus- Partikel, und dessen DNA, die rep-negativ sind . Letzteres bedeutet, daß kein oder nur ein defektes rep-Gen vorliegt. Zur Bereitstellung eines rep-negativen AAV-Vektors können übliche Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann eine AAV-DNA durch spezifische Mutagenese im rep-Gen so verändert werden, daß dieses defekt wird, oder das rep-Gen wird durch spezielle Restriktions¬ spaltung und Ligierung deletiert. Eine rep-negative AAV-DNA kann dann in Zellen transfiziert werden, die ein AAV-rep-Gen exprimieren, und nach Infektion mit einem Helfervirus werden rep-negative AAVs, d .h. Virus-Partikel, erhalten.
Der Ausdruck "Fremd-DNA" betrifft jegliche DNA, die in einem rep-negativen AAV-Vektor integriert sein kann. Die Fremd-DNA kann nicht-kodierend oder kodierend sein. In ersterem Fall kann die Fremd-DNA ein Regulator-Element der DNA-Replikation und/oder Transkription sein. In letzterem Fall ist es günstig, wenn die Fremd-DNA exprimierbar ist, wobei es besonders vorteilhaft ist, wenn die Expression unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wie eines gewebespezifischen Promotors, steht. Ferner kann die Fremd-DNA für ein diagnostisches und/oder therapeutisches Protein kodieren. Beispiele eines therapeutischen Proteins sind Tumornekrosefaktor, Interferone, Interleukine, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, Plasmaproteine und Rezeptoren. Desweiteren kann die Fremd-DNA an beliebiger Stelle des rep-negativen AAV-Vektors inse¬ riert sein. Von Vorteil kann es sein, wenn die Fremd-DNA in oder anstelle des rep-Gens vorliegt. Weiterhin kann es günstig sein, wenn mehrere Fremd-DNAs vorliegen.
Der Ausdruck "ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel" umfaßt jegliches Mittel, das ein AAV-Rep-Protein, insbesondere Rep 78 oder Rep 68, oder einen Teil davon bereitstellen kann. Beispielsweise kann das Mittel eine ein AAV-Rep-
Protein bzw. einen Teil davon exprimierbare DNA (rep-DNA) sein. Günstig ist es, wenn die Expression der rep-DNA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promo¬ tors, wie eines Antibiotikum- oder Gewebe-spezifischen Promotors, steht. Die rep-DNA kann vom Genom eines AAV-Virus-Partikels umfaßt sein. Günstig ist es, wenn das Genom ein defektes (deletiertes) cap-Gen bzw. einen induzierbaren
Promotor für das cap-Gen und/oder defekte (deletierte) ITR-Sequenzen aufweist. Das Genom und das entsprechende AAV-Virus-Partikel können ebenfalls ein Mittel in vorstehendem Sinne sein. Ferner kann das Mittel ein AAV-Rep-Protein, insbesondere Rep 78 oder Rep 68, selbst oder ein Teil davon bzw. ein Fusions- protein ist, das ein AAV-Rep-Protein oder einen Teil davon enthält. Die Bereit¬ stellung solcher Proteine kann durch übliche Verfahren erfolgen.
In einem erfindungsgemäßen Transduktionssystem können die Komponenten (a) und (b) miteinander verbunden sein. Eine solche Verbindung kann durch übliche Verfahren erfolgen. Liegen z. B. der AAV-Vektor der Komponente (a) als Virus-
Partikel und das Mittel der Komponente (b) als rep-exprimierende DNA vor, so ist es günstig, wie folgt vorzugehen: Der AAV-Vektor wird chemisch oder enzyma- tisch modifiziert. Beispielsweise wird er biotinyliert, d.h. Biotin oder ein biotiny- lierter Anti-AAV-Antikörper, wie ein gegen die AAV-Proteine VP-1 , VP-2 oder VP-3 gerichteter Antikörper, werden an den AAV-Vektor gebunden. Die rep- exprimierende DNA wird mit DNA-bindenden Substanzen, wie organischen Polykationen, z.B. Polylysiπ und/oder Polyornithin, bzw. heterologen Polykatio- nen mit mehreren unterschiedlichen, positiv geladenen Aminosäuren gemischt. Besonders günstig ist es, die rep-exprimierende DNA mit Pσlylysin und Streptavi- din zu mischen, wodurch Polylysin an die DNA und Streptavidin an das Polylysin binden. Der biotinylierte AAV-Vektor und die Streptavidin-Polylysin-modifizierte DNA werden dann gemischt, wodurch die Bindung zwischen den Komponenten (a) und (b) erhalten wird.
Ein vorstehendes Transduktionssystem eignet sich zur Transduktion von Zellen. Diese können jeglicher Art und Abstammung sein. Ferner können die Zellen einzeln oder in einem Verband, wie einem Gewebe oder Organ, vorliegen. Auch können die Zellen in oder außerhalb eines Organismus vorliegen. In letzterem Fall können die Zellen in Kultur gehalten sein. Desweiteren können die Zellen gesun¬ de Zellen, erkrankte Zellen, wie Virus-infizierte oder durch Mikroorganismen bzw. Einzeller befallene Zellen, oder Tumorzellen sein.
Die Transduktion der Zellen kann durch übliche Verfahren erfolgen. Wird ein
Transduktionssystem verwendet, bei dem die Komponenten (a) und (b) mitein¬ ander verbunden sind und der AAV-Vektor und/oder das Mittel als Virus-Partikel vorliegen, so können die Zellen mit dem Transduktionssystem infiziert werden. Liegen allerdings der AAV-Vektor und das Mittel als DNA vor, so kann das Transduktionssystem z.B. durch Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation in die Zellen eingebracht werden.
Wird ein Transduktionssystem verwendet, bei dem die Komponenten (a) und (b) nicht miteinander verbunden sind und der AAV-Vektor und das Mittel als Virus- Partikel vorliegen, so können die Zellen mit den Virus-Partikeln infiziert werden.
Liegen allerdings der AAV-Vektor als Virus-Partikel und das Mittel als DNA bzw. umgekehrt vor, so können die Zellen mit dem AAV-Vektor bzw. dem Mittel infiziert und die DNA, wie vorstehend angegeben, in die Zellen eingebracht werden. Liegen ferner der AAV-Vektor und das Mittel jeweils als DNA vor, so können diese, wie vorstehend angegeben, in die Zellen eingebracht werden.
Liegt weiterhin das Mittel in Form eines AAV-Rep-Proteins oder eines Teils davon bzw. als Fusionsprotein vor, das ein AAV-Rep-Protein oder einen Teil davon enthält, so kann das Mittel z.B. durch Lipofektion in die Zellen eingeführt werden.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Fremd-DNA in das Genom von Zellen zu integrieren. Als Integrationsort wird häufig eine spezifische Stelle von Chromosom 1 9 erhalten. Ferner ist die gewebespezifische Expression der Fremd-
DNA möglich. Desweiteren kann die Bereitstellung eines AAV-Rep-Proteins in den transduzierten Zellen zeitlich begrenzt werden, was günstige Einflüsse auf die Zellen haben kann.
Weiterhin ist die vorliegende Erfindung nicht auf bestimmte Zellen oder deren
Umgebung begrenzt. Die vorliegende Erfindung kann genutzt werden, Zellen zu transduzieren, die sich in einem Organismus oder außerhalb eines solchen befinden. Insbesondere eignet sich die vorliegende Erfindung bestens, Zellen eines entnommenen Tumormaterials zu transduzieren, ohne daß diese Zellen vorher in Kultur gebracht werden mußten.
Die vorliegende Erfindung eignet sich daher bestens, in der Gentherapie, ins¬ besondere von monogenen Erkrankungen, wie Hämoglobin-Anomalien, zystische Fibröse, Subtypen des Morbus Parkinson und Hämophilien, von AIDS und Krebserkrankungen, eingesetzt zu werden.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.
Beispiel: Transduktion von Zellen mit einem erfindungsgemäßen Transduk- tionssystem
Als erfindungsgemäßes Transduktionssystem wird ein solches verwendet, bei dem die Komponenten (a) und (b) voneinander getrennt sind.
(a) Zellen der menschlichen Zervix-Karzinom-Linie HeLa werden mit einem
Expressionsplasmid pRc/CMV (Invitrogen) transfiziert, das ein AAV-rep- Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. In Vorversuchen mit einem solchen Expressionsplasmid wurde gezeigt, daß eine Transfek- tionseffizienz von 30-60 % erreicht werden kann. Die Expression des AAV-rep-Gens wird durch einen gegen AAV-Rep 78 gerichteten Antikör¬ per im Immunoblot bestimmt.
Die transfizierten Zellen werden dann mit einem rep-negativen AAV-
Vektor, d.h. einem Virus-Partikel, infiziert, der eine exprimierbare Fremd- DNA, z.B. eine für ein B7-Protein kodierende DNA, enthält. Es wird eine spezifische Integration der Fremd-DNA am Chromosom 19 erhalten. Dies wird durch übliche Verfahren nachgewiesen. Ferner wird eine Expression des B7-Proteins erhalten. Dies wird durch einen gegen das B7-Protein gerichteten Antikörper nachgewiesen.
(b) Zellen der menschlichen Zervix-Karzinom-Linie HeLa werden mit zwei Ex- pressionsplasmiden transfiziert. Das eine, pUHD 1 5- 1 , kodiert für das Fu- sionsprotein tetR-VP1 6 (vgl. Gossen, M. et al., PNAS USA 89 ( 1992),
5547-5551 ) . tetR ist ein Tetracyclin-Repressor, während VP1 6 die Trans¬ aktivierungsdomäne des VP1 6-Moleküls von HSV ist. Das zweite Ex¬ pressionsplasmid, pUHD10-3, enthält ein AAV-rep-Gen, das unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das Fusionsprotein tetR-VP1 6 induziert wird. Diese Induktion wird erhalten, wenn Tetracyclin dem
Medium entzogen wird. Der Nachweis der Transfektion wird über die Expression eines Neomycin-Resistenz-Gens auf dem ersten Expressions¬ plasmid und die Expression des rep-Gens auf dem zweiten Expressions¬ plasmid bestimmt.
Die transfizierten Zellen werden dann mit dem rep-negativen AAV-Vektor von (a), der eine für ein B7-Protein kodierende Fremd-DNA enthält, infi¬ ziert. Nach Wegnahme von Tetracyclin aus dem Medium wird eine spezifi¬ sche Integration der Fremd-DNA am Chromosom 1 9 erhalten. Dies wird durch übliche Verfahren nachgewiesen. Ferner wird eine Expression des
B7-Proteins erhalten. Dies wird durch einen gegen das B7-Protein gerich¬ teten Antikörper nachgewiesen. Vorstehende Daten weisen darauf hin, daß ein erfindungsgemäßes Transduk¬ tionssystem in der Lage ist, eine Fremd-DNA spezifisch in das Genom von Zellen zu integrieren.

Claims

Patentansprüche
1 . Transduktionssystem, umfassend
(a) einen, eine Fremd-DNA enthaltenden, rep-negativen AAV-Vektor, und
(b) ein ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel.
2. Transduktionssystem nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der rep-negative AAV-Vektor als DNA vorliegt.
3. Transduktionssystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA exprimierbar ist.
4. Transduktionssystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA unter der Kontrolle eines induzierbareπ Promotors steht.
5. Transduktionssystem nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das Mittel eine exprimierbare rep-DNA ist.
6. Transduktionssystem nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die rep-DNA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.
7. Transduktionssystem nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die rep-DNA vom Genom eines AAV-Virus-Partikels umfaßt ist.
8. Transduktionssystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Genom ein defektes bzw. deletiertes cap-Gen enthält.
9. Transduktionssystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Genom defekte ITR-Sequenzen enthält.
10. Transduktionssystem nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekenn- zeichnet, daß das Mittel ein AAV-Rep-Protein ist.
1 1 . Transduktionssystem nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der AAV-Vektor mit dem Mittel verbunden ist.
12. Verwendung des Transduktionssystems nach einem der Ansprüche 1 - 1 1 zur Transduktion von Zellen.
13. Verwendung nach Anspruch 1 2, wobei die Zellen für eine Gentherapie be¬ stimmt sind .
14. Verwendung nach Anspruch 1 2 oder 1 3, wobei die Zellen gesunde, er¬ krankte oder Tumorzellen sind .
1 5. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 - 14, wobei die Zellen in einem Organismus vorliegen.
1 6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 2 - 14, wobei die Zellen außerhalb eines Organismus vorliegen .
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