WO1998024751A1 - Ungesättigte aliphatische carbonsäuren (maracenine), herstellungsverfahren und mittel gegen bakterien - Google Patents

Ungesättigte aliphatische carbonsäuren (maracenine), herstellungsverfahren und mittel gegen bakterien Download PDF

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Hans Reichenbach
Gerhard Höfle
Bettina Böhlendorf
Martina Herrmann
Herbert Irschik
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Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/58—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C59/60—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups the non-carboxylic part of the ether being unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to unsaturated aliphatic carboxylic acids (maracenins), processes for their production and agents containing unsaturated aliphatic carboxylic acids (maracenins).
  • the invention relates to unsaturated aliphatic carboxylic acids (maracenins) of the general formula:
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin A ⁇ _) of the formula
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin A2) of the formula
  • delta 4 ' 5 -trans delta 11 ' 12 -trans, delta 14 '15 -cis, delta 17 ' 18 -cis and / or with the following parameters:
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin B ⁇ ) of the formula:
  • ny 3012 (m), 2964 (m), 2931 (m), 2875 (w), 2279 (m),
  • UV methanol
  • lamdam x log epsilon
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin B2) of the formula:
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid of the formula (Maracenin C ⁇ ):
  • ny 3012 (w), 2925 (m), 285 (w), 1711 (s), 1654 (n), 1434 (m), 1412 (w), 1271 (m), 1215 (m), 1154 (s ), 1069 (w), 997 (m), 967 (m) and 924 (m) cm -1 , and
  • UV methanol
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin C) of the formula:
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin D j of the formula:
  • ny 3011 (m), 2963 (m), 2929 (m), 2873 (w), 2856 (w),
  • the invention further relates to an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin D2) of the formula:
  • the invention relates to a process for the production of unsaturated aliphatic carboxylic acids (maracenins), characterized in that
  • Sorangium cellulosum So ce 880 DSM 11252 in an aqueous medium containing carbon and nitrogen sources and mineral salts, aerobically cultivated in the presence of an adsorber resin,
  • the adsorber resin is optionally separated from the culture medium with the cells and extracted with methanol and then with acetone,
  • the invention further relates to a process for the production of unsaturated aliphatic carboxylic acids (maracenins), characterized in that
  • Sorangium cellulosum So ce 1128 DSM 11253 in an aqueous medium containing carbon and nitrogen sources and mineral salts, aerobically cultivated in the presence of an adsorber resin,
  • the adsorber resin is optionally separated from the culture medium with the cells and extracted with methanol and then with acetone,
  • Amberlite in particular Amberlite XAD-16, can be used as the adsorber resin in the process according to the invention.
  • step (d) You can also dry in step (d) with sodium sulfate.
  • Gel chromatography can also be carried out with Sephadex, in particular with Sephadex LH-20.
  • a further embodiment of the invention relates to an agent against bacteria, in particular mycobacteria and / or nocardia, containing an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin) according to the invention in addition to conventional auxiliaries and / or carriers.
  • an agent against bacteria in particular mycobacteria and / or nocardia
  • an unsaturated aliphatic carboxylic acid (maracenin) according to the invention in addition to conventional auxiliaries and / or carriers.
  • the agent according to the invention can be provided for the treatment of tuberculosis.
  • the vegetative cells are cylindrical rods with round ends, usually around 1 ⁇ m thick and 3 - 6 ⁇ m long. They appear dark in the phase contrast microscope. They move smoothly. On some nutrient media, the organism forms fruiting bodies in abundance. B. on filter paper over mineral salt agar. The fruiting bodies are dark red-brown cushions and consist of a more or less large number of sporangioles, spherical or polyhedral structures with a fixed wall, 20 to 30 ⁇ m in diameter, by flattening. In the sporangioles there are myxospores, rod-shaped permanent cells of a similar shape and size to the vegetative cells, but highly refractive and drying-resistant in the phase contrast microscope.
  • the organism grows on peptone agar, e.g. B. CY agar (Casitone, Difco, 0.3%; CaCl • H2O 0.1%; yeast extract, Difco, 0.1%; agar 1.5%; pH 7.2), however a carbohydrate, e.g. B. glucose or starch must be added.
  • the Carbohydrate can be used in a concentration of e.g. B. 0.1% can be added.
  • yeast agar e.g. B. VY / 2 agar (baker's yeast 0.5%, based on fresh weight; CaCl2 • 2H2O 0.1%; agar 1.5%; pH 7.2).
  • the strain quickly and vigorously breaks down chitin and starch.
  • So ce880 grows in liquid media partly clumped, partly in a homogeneous cell suspension, both in shake flasks (at e.g. 160 rpm) and in bioreactors (tested up to 100 liters). The cultivation takes place at 30 ° C under aerobic conditions.
  • Bioreactor with 100 1 content from Chemap (now Braun solutions), blade stirring system. Medium No. 3 (as above), additionally adsorber resin Amberlite XAD-16, 1%, v / v (Rohm and Haas, Darmstadt) and anti-foaming agent Tegosipon, 10 ml (Goldschmidt AG, Essen), but without HEPES.
  • the fermentor was inoculated with 4.8 l of preculture, which were grown in 6 x 2 l shake flasks with 800 ml of medium 3.
  • the strain forms the maracenins A and B during the fermentation.
  • Maracenin A was dissolved in methanol and applied to test sheets (6 mm in diameter) in amounts of 2 ⁇ g. These test sheets were placed on agar plates in which various test organisms were seeded in low cell density. These test plates were incubated at 30 ° C. After the test organisms had grown, the inhibitory zones were read off. The result is shown in the following table:
  • Botrytis cinerea 0 To determine the minimum inhibitory concentration, maracenin A and B in various concentrations were placed in test tubes containing a suspension of the test organisms in nutrient medium. The initial cell density was 10 cells / ml. The cultures were incubated with shaking at 30 ° C for 18 to 40 hours.
  • peptone from casein tryptically digested, Merck, 0.5%
  • Proteose Peptone Difco, 0.5%
  • Meat extract Oxoid, 0.1%
  • pH 7.0 pH 7.0
  • the minimum inhibitory concentration for L 929 mouse fibroblasts in cell cultures was 24 ⁇ g / ml for maracenin A and B. insulation
  • the precipitate (32 g) was separated by centrifugation.
  • the crude product remaining in solution (21 g) was fractionated by gel chromatography on Sephadex LH-20 with methanol as the eluent.
  • the fractions containing maracenins (1.4 g) were chromatographed on HD-SIL-18-20-60 (column: 929 x 90 mm, eluent: methanol / 0.05 mM ammonium acetate buffer 80/20, flow: 7 ml / min) - phated.
  • PC aluminum foils with silica gel 60 F 2 5 4 , layer thickness 0.2 mm, Merck art. 5554; Detection with vanillin / sulfuric acid spray reagent and heating to 120 ° C (-> violet red staining) mobile solvent: dichloromethane / acetone / methanol 85/10/5 Rf: 0.53
  • PC aluminum foils with silica gel 60 F25 4 , layer thickness 0.2 mm, Merck art. 5554; Detection with vanillin / sulfuric acid spray reagent and heating to 120 ° C (-> violet red staining) mobile solvent: dichloromethane / acetone / methanol 85/10/5 Rf: 0.51 HPLC: column: 2 x 125 mm, material: Nucleosil R 120-5C 18 ; Flow: 0.3 ml / min; Eluent: methanol / O .01 mM ammonium acetate buffer 75/25, UV detection: 220 nm Rt: 9.9 min
  • UV (methanol): lambda max (log epsilon) 205 nm (4.37).
  • the vegetative cells are cylindrical rods with round ends, usually around 1 ⁇ m thick and 3 - 6 ⁇ m long. They appear dark in the phase contrast microscope. They move smoothly. On some nutrient media, the organism forms fruiting bodies in abundance. B. on filter paper over mineral salt agar. The fruiting bodies are yellow-brown cushions and consist of a more or less large number of sporangioles, spherical or by mutually flattening polyhedral structures with a solid wall, 20 to 30 microns in diameter. In the sporangioles there are myxospores, rod-shaped permanent cells of a similar shape and size to the vegetative cells, but highly refractive and drying-resistant in the phase contrast microscope.
  • the organism grows on peptone agar, e.g. B. CY agar (Casitone, Pifco, 0.3%; CaCl 2 • 2H 2 0 0.1%; yeast extract, Pifco, 0.1%; agar 1.5%; pH 7.2), the however a carbohydrate, e.g. B. glucose or starch must be added.
  • the Carbohydrate can be used in a concentration of e.g. B. 0.1% can be added.
  • yeast agar e.g. B. VY / 2 agar (baker's yeast 0.5%, based on fresh weight; CaCl2 • H2O 0.1%; agar 1.5%; pH 7.2). Chitin breaks down quickly and vigorously per strain. So cell28 grows in liquid medium partly clumped, partly in a homogeneous cell suspension, both in shake flasks (at e.g. 160 rpm) and in bioreactors (tested up to 100 liters). Pie cultivation takes place at 30 ° C under aerobic conditions.
  • B. Medium No. 1 MP1 lm (peptone from casein, tryptically digested, Merck, 0.3%; CaCl 2 .2H 2 0 0.05%; MgS0 4 .7H 2 0 0.2%; pH 7.2 ), which is supplemented by a carbohydrate source, e.g. B. glucose, starch, cellulose, each 0.1%.
  • MP1 lm peptone from casein, tryptically digested, Merck, 0.3%
  • MgS0 4 .7H 2 0 0.2% pH 7.2
  • a carbohydrate source e.g. B. glucose, starch, cellulose, each 0.1%.
  • Inoculation was carried out by fermenter with 4.8 l of preculture, which were grown in 6 x 2 l shake flasks with 800 ml of medium 3 each. During the fermentation, a drop in pH below 6.9 was prevented by adding 5% KOH.
  • maracenins C and P are formed per strain.
  • various concentrations of maracenins C and P were placed in test tubes containing a suspension of the test organisms in nutrient medium.
  • the initial cell line was 10 5 cells / ml.
  • Pie cultures were incubated with shaking at 30 ° C for 18 to 40 hours.
  • peptone from casein tryptically digested, Merck, 0.5%
  • Proteose Peptone Pifco
  • Meat extract Oxoid, 0.1%
  • pH 7.0 pH 7.0
  • Test organism Minimum inhibitory concentration ( ⁇ g / ml
  • the minimum inhibitory concentration for L929 mouse fibroblasts in cell culture was 24 ⁇ g / ml for maracenin C and P. insulation
  • Precipitate (77 g) was separated by centrifugation.
  • the crude product remaining in solution (21 g) was fractionated by gel chromatography on Sephadex LH-20 with methanol as the eluent.
  • Fractions containing pie maracenine (1.7 g) were chromatographed on HP-SIL-18-20-60 (column: 929 ⁇ 90 mm, eluent: methanol / 0.05 mM ammonium acetate buffer 80/20, flow: 7 ml / min) .
  • the components were separated by preparative HPLC on Nucleosil 100-C18-7 (column: 250 x 16 mm, flow: 10 ml / min) with a mobile phase mixture of methanol and 0.05 mM ammonium acetate buffer in a ratio of 70/30.
  • PC aluminum foils with silica gel 60 F25 4 , layer thickness 0.2 mm, Merck art. 5554; Petition with vanillin / sulfuric acid spray reagent and heating to 120 ° C (-> violet red staining) mobile solvent: pichloromethane / acetone / methanol 85/10/5 (v / v / v) Rf_: 0.55
  • PC aluminum foils with silica gel 60 F25 4 , layer thickness 0.2 mm, Merck art. 5554; Detection with vanillin / sulfuric acid spray reagent and heating to 120 ° C (-> violet red staining) mobile solvent: dichloromethane / acetone / methanol 85/10/5 (v / v / v) Rf: 0.62 HPLC: column: 2 x 125 mm, material: Nucleosil R 120-5C 18 ; Flow:
  • UV (methanol): lambda max (log epsilon) 203 nm (4.16).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ungesättigte aliphatische Carbonsäuren (Maracenine) der allgemeinen Formel (I), wobei, wenn x = 2, y = 1 und (a) eine Doppelbindung, z = 0, R fehlt und (b) eine Dreifachbingung oder z = 1, R ein C1-Atom und (b) eine Doppelbindung ist oder wenn x = 3, y = 2 und (a) eine Einfachbindung, z = 0, R fehlt und (b) eine Dreifachbindung oder z = 1, R ein C1-Atom und (b) eine Doppelbindung ist.Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Mittel gegen Bakterien, insbesondere Mykobakterien und/oder Nocardien, mit einem Gehalt an einer erfindungsgemässen ungesättigten aliphatischen Carbonsäure (Maracenin) neben üblichen Hilfs-und/oder Trägerstoffen. Das erfindungsgemässe Mittel kann zur Tuberkulosebehandlung vorgesehen werden.

Description

UNGESÄTTIGTE ALIPHATISCHE CARBONSÄUREN (MARACENINE), HERSTELLUNGSVERFAHREN UND MITTEL GEGEN BAKTERIEN
Die Erfindung betrifft ungesättigte aliphatische Carbonsäuren (Maracenine) , Verfahren zu ihrer Gewinnung und Mittel mit einem Gehalt an den ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren (Mara- ceninen) .
Gemäß einer Aus führungs form betrifft die Erfindung ungesättigte aliphatische Carbonsäuren (Maracenine) der allgemeinen Formel:
20 CHχ--'CHy-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CHz==CR-0-CH=CH-CH2-
CH2-C02H
wobei, wenn x = 2, y = 1 und -"- eine Doppelbindung, z = 0, R fehlt und ='= eine Dreifachbindung oder z = 1, R ein Cl-Atom und == eine Doppelbindung ist oder, - wenn x = 3, y = 2 und --' eine Einfachbindung, z = 0, R fehlt und == eine Dreifachbindung oder z = 1, R ein Cl-Atom und == eine Doppelbindung ist .
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin Aτ_) der Formel
Figure imgf000004_0001
Maracenin A, delta4' 5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-trans, delta17'18- cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 300,40,
1H-NMR gemäß Tabelle 1, 13C-NMR gemäß Tabelle 1,
IR (KBr) ; ny = 3014 (w), 2925 (m) , 2855 (w) , 2280 (m) , 1712 (s) , 1673 (m) , 1662 (m), 1554 (w) , 1434 (m) , 1412 (m) , 1351 (w) , 1222 (s) , 1175 (w), 1059 (m), 998 (m) , 968 (m) und 920 (m) cm"1; und UV (Methanol); lamdamax (log epsilon) = 208 (4,41) und 227 (4,47) nm.
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin A2) der Formel
20 19 18 17 15 1 12 11 5 1
CH2=CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-C=C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
delta4 '5-trans, delta11' 12-trans, delta14' 15-cis, delta17' 18-cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 300,40,
1H-NMR (CDCI3, 300 MHz); delta = 2,96 (m, 2H, 15-H) und 2,82 (m,
2H, 12 -H) ppm, und 13C-NMR (CDCI3, 75,5 MHz); delta = 26,1 (C-15) und 25,8 (C-12) ppm.
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin B^) der Formel:
Figure imgf000005_0001
Maracenin B, 19,20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11, 12-trans , delta14'15- trans, delta 7 1 -eis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 302,41,
1H-NMR gemäß Tabelle 2,
13C-NMR gemäß Tabelle 2,
IR (KBr) ; ny = 3012 (m) , 2964 (m) , 2931 (m) , 2875 (w) , 2279 (m) ,
1712 (s), 1674 (m) , 1662 (m) , 1437 (m), 1412 (w) , 1304 (w) , 1288 (m) ,
1223 (s), 1061 (m), 968 (m) und 921 (m) cm-1, und
UV (Methanol); lamdam x (log epsilon) = 205 (4,37) nm.
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin B2) der Formel:
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH3-CH-2CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-C≡C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
19,20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-cis, delta ' -eis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 302,41,
^-H-NMR (CDC13, 400 MHz); delta = 2,81 (m, 4H, 12- und 15-H) und
13C-NMR (CDCI3, 75,5 MHz); delta = 25,8 (C-12) und 25,6 (C-15) ppm. Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin B3) der Formel:
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH -CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-C=C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
19,20-dihydro, delta4 ' 5-cis, delta11 ' 12-trans, delta14 ' 15-trans, delta ' -eis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 302,41 und
1H-NMR (CDC13, 400 MHz); delta = 6,21 (d, J = 5,7 Hz, 1H, 5-H) und 4,75 (m, 1H, 4-H) ppm.
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure der Formel (Maracenin C^) :
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH2=CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-CH=C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
Cl delta4' 5-trans, delta11 ' 12-trans, delta14 ' 15-trans, delta17'18- cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 336,86,
1H-NMR gemäß Tabelle 1, 13C-NMR gemäß Tabelle 1,
IR (KBr) ; ny = 3012 (w), 2925 (m) , 285 (w) , 1711 (s) , 1654 (n) , 1434 (m) , 1412 (w), 1271 (m) , 1215 (m) , 1154 (s) , 1069 (w) , 997 (m) , 967 (m) und 924 (m) cm-1, und
UV (Methanol); lamdamax (log epsilon) = 205 (4,25) und 224 (4,22) nm.
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin C ) der Formel:
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH2=CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-CH=C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
Cl delta4, 5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-cis, delta17' 18-cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 336,86 und
^•H-NMR (CDC13, 300 MHz); delta = 2,95 (m, 2H, 15-H) und 2,81 (m,
2H, 12-H) ppm, und
13C-NMR (CDCI3, 75,5 MHz); delta = 26,6 (C-15) und 26,1 (C-12) ppm.
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin Dj der Formel:
20 18 17 15 14 12 11
CH3CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-CH=C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
I Cl
19,20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11' 12-trans, delta14' 15- trans, delta17, 18-eis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 338,88,
^•H-NMR gemäß Tabelle 2,
13C-NMR gemäß Tabelle 2,
IR (KBr) ; ny = 3011 (m), 2963 (m) , 2929 (m) , 2873 (w) , 2856 (w) ,
1713 (m) , 1654 (s), 1446 ( ) , 1409 (m) , 1270 ( ) , 1155 (s) , 1069 (w) ,
967 (m) und 924 (m) cm-1, und
UV (Methanol); lamdamax (log epsilon) = 203 (4,16) nm.
Ferner betrifft die Erfindung eine ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin D2) der Formel:
Figure imgf000007_0001
19,20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-cis, delta17' 18-cis und/oder mit den folgenden Parametern: MG 338,88,
1H-NMR (CDCI3, 300 MHz); delta = 2,80 (m, 4H, 12- und 15-H) ppm, und
13C-NMR (CDC13, 75,5 MHz); delta = 25,7 (C-12) und 25,6 (C-15) ppm.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren (Maraceninen) , dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Sorangium cellulosum So ce 880 = DSM 11252 in einem Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie Mineralsalze enthaltendem wäßrigem Medium aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert,
(b) das Adsorberharz gegebenenfalls mit den Zellen vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol und danach mit Aceton extrahiert,
(c) die vereinigten Extrakte bis zum Auftreten einer wäßrigen Phase einengt,
(d) die wäßrige Phase mit Ethylacetat extrahiert, trocknet und das Lösungsmittel abdampft,
(e) den angefallenen Rückstand in Methanol löst, die erhaltene Lösung abkühlt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt,
(f) die verbleibende Lösung einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft,
(g) die Carbonsäuren (Maracenine) enthaltenden Fraktionen an HD- SIL-18-20-60 mit Methanol/Ammoniumacetat-Puffer als Laufmittel chromatographiert und eine Fraktion mit w-ungesättigten und eine Fraktion mit w-gesättigten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält,
(h) die erhaltenen Fraktionen einer präparativen HPLC-Chromatographie unterwirft und Fraktionen mit separierten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält und die separierten Carbonsäuren isoliert .
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren (Maraceninen) , dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Sorangium cellulosum So ce 1128 = DSM 11253 in einem Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie Mineralsalze enthaltendem wäßrigem Medium aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert,
(b) das Adsorberharz gegebenenfalls mit den Zellen vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol und danach mit Aceton extrahiert,
(c) die vereinigten Extrakte bis zum Auftreten einer wäßrigen Phase einengt,
(d) die wäßrige Phase mit Ethylacetat extrahiert, trocknet und das Lösungsmittel abdampft,
(e) den angefallenen Rückstand in Methanol löst, die erhaltene Lösung abkühlt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt,
(f) die verbleibende Lösung einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft,
(g) die Carbonsäuren (Maracenine) enthaltenden Fraktionen an HD- SIL-18-20-60 mit Methanol/Ammoniumacetat-Puffer als Laufmit- tel chromatographiert und eine Fraktion mit w-ungesättigten und eine Fraktion mit w-gesättigten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält,
(h) die erhaltenen Fraktionen einer präparativen HPLC-Chromato- graphie unterwirft und Fraktionen mit separierten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält und die separierten Carbonsäuren isoliert .
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man als Adsorberharz Amberlite, insbesondere Amberlite XAD-16 verwenden.
Ferner kann man bei Stufe (d) mit Natriumsulfat trocknen.
Ferner kann man die Gelchromatographie mit Sephadex durchführen, insbesondere mit Sephadex LH-20.
Ferner kann man die präparative HPLC-Chromatographie an einer Umkehrphase durchführen, insbesondere Nucleosil, vorzugsweise Nucleosil 100-C18-7.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Mittel gegen Bakterien, insbesondere Mykobakterien und/oder Nocardien, mit einem Gehalt an einer erfindungsgemäßen ungesättigten aliphatischen Carbonsäure (Maracenin) neben üblichen Hilfs-und/oder Trägerstoffen .
Das erfindungsgemäße Mittel kann zur Tuberkulosebehandlung vorgesehen werden.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert. Beispiel 1: Maracenine A und B
A. Beschreibung des Produktionsstammes und der biologischen Aktivität.
1. Herkunft, Taxonomie, Morphologie
Der Produktionsorganismus wurde im Juni 1992 an der GBF aus einer Bodenprobe aus der Umgebung von Massai Mara, Kenia, isoliert. Es handelt sich um einen Stamm des Myxo- bakteriums Sorangium cellulosum (Imshenetski und. Solnt- seva, 1936) (= Polyangium cellulosum) . Der Stamm wurde mit So ce880 bezeichnet.
Die vegetativen Zellen sind zylindrische Stäbchen mit runden Enden, meist um 1 μm dick und 3 - 6 μm lang. Im Pha- senkontrastmikroskop erscheinen sie dunkel. Sie bewegen sich gleitend fort . Auf manchen Nährböden bildet der Organismus massenhaft Fruchtkörper, so z. B. auf Filterpapier über Mineralsalzagar . Die Fruchtkörper sind dunkel rotbraune Polster und bestehen aus einer mehr oder weniger großen Zahl von Sporangiolen, kugeligen oder durch gegenseitige Abplattung polyedrische Gebilde mit einer festen Wand, von 20 bis 30 μm Durchmesser. In den Sporangiolen befinden sich Myxosporen, stäbchenförmige Dauerzellen von ähnlicher Gestalt und Größe wie die vegetativen Zellen, jedoch im Phasenkontrastmikroskop stark lichtbrechend und trocknungsresistent .
2. Kultur
Der Organismus wächst auf Peptonagar, z. B. CY-Agar (Casi- tone, Difco, 0,3 % ; CaCl • H2O 0,1 %; Hefeextrakt, Dif- co, 0,1 %; Agar 1,5%; pH 7,2), dem jedoch ein Kohlenhydrat, z. B. Glucose oder Stärke, zugesetzt werden muß. Das Kohlenhydrat kann in einer Konzentration von z. B. 0,1 % zugegeben werden.
Gutes Wachstum erfolgt auch auf Hefeagar, z. B. VY/2-Agar (Bäckerhefe 0,5 %, bezogen auf Frischgewicht; CaCl2 • 2H2O 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2) . Der Stamm baut Chitin und Stärke rasch und kräftig ab. In Flüssigmedien wächst So ce880 teils verklumpt, teils in homogener Zellsuspension, sowohl in Schüttelkolben (bei z. B. 160 Upm), als auch in Bioreaktoren (bis 100 1 getestet) . Die Kultivierung erfolgt bei 30 °C unter aeroben Bedingungen.
Zur Kultur in Flüssigmedium eignet sich z. B. Medium Nr. 1 : MD1 l.m. (Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck, 0,3 %; CaCl2 . 2H20 0,05 %; MgS04 . 7H20 0,2 %; pH 7,2), das durch eine Kohlenhydratquelle ergänzt ist, z. B. Glucose, Stärke, Cellulose, jweils 0,1 %.
Oder Medium Nr. 2 : Glukose . H2O 0,5 %; Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, 0,1 % ; MgS04 . 7H20 0,15 %; CaCl2 . 2H20 0,1 %; KNO3 °'2 %/' Natrium-Eisen III - EDTA 8 mg/1; K2HP04 0,0125 %; Tris . HCl 0,2 %; pH vor dem Autoklavieren 7,4.
Oder Medium Nr. 3 : Stärke, löslich, 0,8 %; Glukose . H20 0,2 %; Hefeextrakt (Difco) 0,2 % ; Sojamehl, entfettet, 0,2 %; CaCl2 • 2H20 0,1 %; MgS04 . 7H20 0,1 %; Na-Fe III - EDTA 8 mg/1; HEPES-Puffer 50 mM; pH 7 , 4 vor dem Autoklavieren. Fermentation
Beispiel :
Bioreaktor mit 100 1 Inhalt, Fa. Chemap (jetzt Braun Mel- sungen) , Blattrührsystem. Medium Nr. 3 (wie oben) , zusätzlich Adsorberharz Amberlite XAD-16, 1 %, v/v (Rohm und Haas, Darmstadt) und Antischaummittel Tegosipon, 10 ml (Goldschmidt AG, Essen) , jedoch ohne HEPES .
Der pH vor dem Autoklavieren: 7,8; Temperatur: 30 °C, Rührgeschwindigkeit: 100 U/min, Belüftung: 1800 1 Luft pro Stunde. Nach dem Autoklavieren wurde, falls nötig, der pH mit steriler 5 %iger KOH auf 7,9 eingestellt.
Der Fermentor wurde beimpft mit 4,8 1 Vorkultur, die in 6 mal 2 1 Schüttelkolben mit 800 ml Medium 3 angezogen wurden .
Während der Fermentation wurde ein Absinken des pH-Wertes unter 6,9 durch Zugabe von 5 %iger KOH verhindert.
Tabelle 1: Verlauf der Fermentation
Zeit pH p02 Glukose* Veränderungen
(Stunden) (%) (%)
0 (Start) 7,9 100
96 7,6 75 0,7
120 _ ** 55 -
145,5 - 48 -
167,5 7,3 45 0,25
192,5 - 45 - Rührgeschwindigkeit: 110 U/min
239,5 7,2 53 0,25
263,5 - 65 - Rührgeschwindigkeit: 100 U/min
287,5 - 44 0,25
335,5 (Ernte) 7,2 52 0,05
*) Glukose-Messung mit Diabur-Test 5000 von Boehringer Mannheim **) - nicht gemessen
Figure imgf000014_0001
4. Leistungen:
Der Stamm bildet während der Fermentation die Maracenine A und B. Maracenin A wurde in Methanol gelöst und auf Test- blättchen (6 mm Durchmesser) in Mengen von 2 μg aufgetragen. Diese Testblattchen wurden auf Agarplatten gelegt, in denen verschiedene Testorganismen in niedriger Zelldichte eingesäht waren. Diese Testplatten wurden bei 30 °C bebrütet. Nach Wachstum der Testorganismen wurden die Hemmhöfe abgelesen. Das Ergebnis zeigt die folgende Tabelle:
Tabelle 2 : Wachstum von Testorganismen
Testorganismus Hemmhof-Durchmesser (mm)
Maracenin A
Staphylococcus aureus 0
Bacillus subtilis 0
Micrococcus luteus 0
Nocardia corallina 29
Mycobacterium phlei 48
Mycobacterium lacticola 31
Streptococcus faecalis 0
Escheri chia coli 0
Salmonella typhimurium 0
Candida albicans 0
Rhodotorula glu tinis 0
Saccharomyces cerevisiae 0
Mucor hiemalis 0
Aspergillus niger 0
Botrytis cinerea 0 Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration wurden Maracenin A und B in verschiedenen Konzentrationen in Reagenzgläser gegeben, die eine Suspension der Testorganismen in Nährmedium enthielten. Die Anfangs-Zelldichte war 10 Zellen/ml. Die Kulturen wurden 18 bis 40 Stunden unter Schütteln bei 30 °C bebrütet.
Als Medien wurden verwendet:
Für Bakterien: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck, 0,5 %; Proteose Pepton, Difco, 0,5 %; Fleischextrakt, Oxoid, 0,1 %; pH 7,0.
Für Hefen und Pilze "Mycophil" -Medium: Phytone Pepton, BBL, 1 %; Glukose . H20 1 %. Das Ergebnis zeigt die folgende Tabelle:
Tabelle 3 : Minimale Hemmkonzentration
Testorganismus Minimale Hemmkonzentration (μg/ml]
Maracenin A B
Staphylococcus aureus 40 20
Bacill us subtil is 80 40
Corynebacterium mediolanum 20 10
Micrococcus luteus 40 40 Nocardia corallina 2,5 2,5
Mycobacterium phl ei 0,15 0,075
Mycobac terium lacti cola 0,3 0,15
Die minimale Hemmkonzentration für L 929 Maus Fibroblasten in Zellkulturen betrug für Maracenin A und B je 24 μg/ml . Isolierung
Aus einer 100 1 Kultur von Sorangium cellulosum, Stamm So ce880, wurden durch Sieben 3,5 kg eines Gemischs aus Amberlite XAD-16 und Zellen abgetrennt. Es wurde nacheinander im Batchverfahren mit insgesamt 12 1 Methanol und 11 1 Aceton extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum bei 35 °C Badtemperatur bis zum Auftreten der Wasserphase eingeengt. Diese wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und davon das Lösungsmittel im Vakuum bei 35 °C Badtemperatur abdestilliert. Der Rückstand (53 g) wurde in 150 ml Methanol gelöst und kalt gestellt (4 °C) . Der ausgefallene Niederschlag (32 g) wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Das in Lösung verbleibende Rohprodukt (21 g) wurde durch Gelchromatographie an Sephadex LH-20 mit Methanol als Laufmittel fraktioniert. Die Maracenine enthaltenden Fraktionen (1,4 g) wurden an HD-SIL- 18-20-60 (Säule: 929 x 90 mm, Laufmittel : Methanol/0 , 05 mM Ammoniumacetatpuffer 80/20, Fluß: 7 ml/min) chromatogra- phiert . Es wurden 132 mg eines Gemischs aus Maracenin Aτ_ und A2 im Verhältnis 8 : 1 sowie 119 mg eines Gemischs bestehend aus Maracenin B]_, B2 und B3 im Verhältnis 25 : 5 : 1 erhalten. Die Trennung der Komponenten erfolgte durch präpara- tive HPLC an Nucleosil 100-C18-7 (Säule: 250 x 16 mm, Fluß: 10 ml/min) mit einem Laufmittelgemisch aus Methanol und 0,05 mM Ammoniumacetatpuffer im Verhältnis 70/30.
Maracenin Ax delta ' 5-trans, delta11, 12-trans, delta14,15- trans, delta17 ' 18-cis
Maracenin A2 delta4 ' 5-trans, delta11, 12-trans, delta14,15- eis, delta17, 18-cis Maracenin Bi 19 , 20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11, 12- trans, delta1 /15-trans, delta ' -eis
Maracenin B' 19, 20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11' 12- trans, delta 15-cis, delta ' -eis
Maracenin B- 19,20-dihydro, delta4 ' 5-cis, delta11'12- trans, delta14 ' 15-trans, delta17' 18-cis
C. Physikalische Eigenschaften
Maracenin A^ :
Summenformel C_gH24θ3 MG 300.40
PC: Aluminiumfolien mit Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck-Art. 5554; Detektion mit Vanillin/Schwefelsäure-Sprühreagenz und Erhitzen auf 120 °C ( ->Violettrotfärbung) Laufmittel: Dichlormethan/Aceton/Methanol 85/10/5 Rf: 0.53
HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleoesilR 120-5C18; Fluß: 0.3 ml/min; Laufmittel: Methanol/0.01 mM Ammoniumacetat- puffer 75/25, UV-Detektion : 220 nm Rt_: 7.2 min
XH-NMR (CDC13, 300 MHz): ε. Tabelle 4
13 C-NMR (CDCI3, 75.5 MHz) : s. Tabelle 4
IR (KBr) : V 3014 (w), 2925 (m), 2855 (w), 2280 (m) , 1712 (s) ,
1673 (m) , 1662 (m), 1554 (w) , 1434 (m) , 1412 (m) ,
1351 (w), 1222 (s), 1175 (w) , 1059 (m) , 998 (m) , 968 (m) 920 cm"1 (m) . UV (Methanol) : lambdamax (log epsilon) = 208 (4.41), 227 nm
(4.47) .
HPLC-MS ( ESI ) : m/z = 299 [M-Hj
Maracenin A2 :
Charakteristische von Maracenin Aj_ abweichende Daten:
HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C1s; Fluß: 0.3 ml/min; Laufmittel : Methanol/0.01 mM Ammoniumacetatpuffer 75/25, UV-Detektion: 220 nm R : 7.0 min
^-H-NMR (CDC13, 300 MHz) : δ = 2.96 (m, 2H, 15-H), 2.82 ppm (m,
2H, 12-H
13C-NMR (CDCI3, 75.5 MHz): δ = 26.1 (C-15), 25.8 ppm (C-12)
Maracenin B^ :
Summenformel C19H 6θ3 MG 302.41
PC: Aluminiumfolien mit Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck-Art. 5554; Detektion mit Vanillin/Schwefelsäure-Sprühreagenz und Erhitzen auf 120 °C ( ->Violettrotfärbung) Laufmittel: Dichlormethan/Aceton/Methanol 85/10/5 Rf: 0.51 HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C18; Fluß: 0.3 ml/min; Laufmittel : Methanol/O .01 mM Ammoniumacetat- puffer 75/25, UV-Detektion : 220 nm R-t : 9.9 min
^-H-NMR (CDC13, 300 MHz): s. Tabelle 5 13C-NMR (CDCI3, 75.5 MHz): s. Tabelle 5
IR (KBr) : v = 3012(m), 2964 (m) , 2931 (m) , 2875(w), 2279 (m) ,
1712 (s), 1674 (m), 1662 (m) , 1437 (m), 1412 (w) ,
1304 (w), 1288 (m), 1223 (s) , 1061 (m) , 968 (m) , 921 cm (m) .
UV (Methanol) : lambdamax (log epsilon) = 205 nm (4.37).
HPLC-MS (ESI) : m/z = 301 [M-H]
Elementaranalyse :
gef. 74.0 %C 8.7 %H 17.2 % O ber. 75.6 %C 8.7 %H 15.9 % O
Maracenin B2 :
Charakteristische von Maracenin Bη_ abweichende Daten:
HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C18; Fluß: 0.3 ml/min; Laufmittel: Methanol/0.01 mM Ammoniumace- tatpuffer 75/25, UV-Detektion: 220 nm Rt : 8.9 min
XH-NMR (CDCI3, 400 MHz) : δ = 2.81 (m, 4H, 12- und 15-H) 13C-NMR (CDCI3, 75.5 MHz) : δ = 25.8 (C-12) , 25.6 ppm (C-15)
HPLC-MS (ESI) : m/z 301 [M-H]
Maracenin B3 :
Charakteristische von Maracenin B]_ abweichende Daten:
HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C18; Fluß: 0.3 ml/min; Laufmittel : Methanol/0.01 mM Ammoniumace- tatpuffer 75/25, UV-Detektion: 220 nm Rt : 10.6 min
1H-NMR (CDCI3, 400 MHz) : δ = 6.21 (d, J = 5.7 Hz, 1 H, 5-H),
4.75 ppm (m, 1H, 4-H)
HPLC-MS (ESI) : m/z 301 [M-H]
Tabelle 4: NMR-Daten von Maracenin ^ in CDC13 (^-H: 300 MHz; 13C: 75.5 MHz)
# δc (in ppm) δH (ppm) M JH,H (HZ)
1 178.0 —
2 34.1 2.43 t 7.3
3 21.8 2.31 q 7.3
4 108.7 5.57 dt 12.0, 7.3
5 144.6 6.27 d 12.0
7 84.1 ...
8 44.1 ...
9 17.6 2.22 m
10 27.2 2.22 m
11 128.8 5.43 m
12 128.8 5.43 m
13 30.5 2.75 m
14 129.2 5.43 m
15 128.3 5.43 m
16 30.8 2.88 m
17 130.3 5.43 m
18 129.6 6.02 t 11.0
19 132.1 6.62 dt 16.8, 11.0
20 117.4 5.19 d 16.8
5.10 d 10.2
Tabelle 5: NMR-Daten von Maracenin Bx in CDCI3 (-""H: 300 MHz; 13C: 75.5 MHz)
# δc (in ppm) δH (ppm) M JH,H (HZ)
1 178.0 —
2 34.1 2.44 t 7.3
3 21.9 2.31 q 7.3
4 108.7 5.57 dt 12.0,7.3
5 144.6 6.27 d 12.0
7 84.1 ...
8 44.1 ...
9 17.6 2.23 m
10 27.2 2.23 m
11 129.1 5.43 m
12 128.5 5.43 m
13 30.5 2.72 m
14 128.7 5.43 m
15 129.0 5.43 m
16 30.3 2.72 m
17 126.9 5.33 m
18 132.3 5.40 m
19 20.5 2.03 pent 7.5
20 14.3 0.95 t 7.5 Beispiel 2 : Maracenine C und D
A. Beschreibung des Produktionsstammes und der biologischen Aktivität
1. Herkunft, Taxonomie, Morphologie
Der Produktionsorganismus wurde im Oktober 1994 an der GBF aus einer Bodenprobe von den weißen Bergen auf Kreta isoliert. Es handelt sich um einen Stamm des Myxobakteriums Sorangium cellulosum (Imshenetski und. Solntseva, 1936) (= Polyangium cellulosum) . Der Stamm wurde mit So cell28 bezeichnet .
Die vegetativen Zellen sind zylindrische Stäbchen mit runden Enden, meist um 1 μm dick und 3 - 6 μm lang. Im Pha- senkontrastmikroskop erscheinen sie dunkel . Sie bewegen sich gleitend fort. Auf manchen Nährböden bildet der Organismus massenhaft Fruchtkörper, so z. B. auf Filterpapier über Mineralsalzagar . Die Fruchtkörper sind gelbbraune Polster und bestehen aus einer mehr oder weniger großen Zahl von Sporangiolen, kugeligen oder durch gegenseitige Abplattung polyedrische Gebilde mit einer festen Wand, von 20 bis 30 μm Durchmesser. In den Sporangiolen befinden sich Myxosporen, stäbchenförmige Dauerzellen von ähnlicher Gestalt und Größe wie die vegetativen Zellen, jedoch im Phasenkontrastmikroskop stark lichtbrechend und trocknungsresistent .
2. Kultur
Der Organismus wächst auf Peptonagar, z. B. CY-Agar (Casi- tone, Pifco, 0,3 %; CaCl2 • 2H20 0,1 %; Hefeextrakt, Pifco, 0,1 %; Agar 1,5%; pH 7,2), dem jedoch ein Kohlenhydrat, z. B. Glucose oder Stärke, zugesetzt werden muß. Das Kohlenhydrat kann in einer Konzentration von z. B. 0,1 % zugegeben werden.
Gutes Wachstum erfolgt auch auf Hefeagar, z. B. VY/2-Agar (Bäckerhefe 0,5 %, bezogen auf Frischgewicht; CaCl2 • H2O 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2) . Per Stamm baut Chitin rasch und kräftig ab. In Flüssigmedium wächst So cell28 teils verklumpt, teils in homogener Zellsuspension, sowohl in Schüttelkolben (bei z. B. 160 Upm), als auch in Bioreaktoren (bis 100 1 getestet) . Pie Kultivierung erfolgt bei 30 °C unter aeroben Bedingungen.
Zur Kultur in Flüssigmedium eignet sich z. B. Medium Nr. 1 : MP1 l.m (Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck, 0,3 %; CaCl2 . 2H20 0,05 %; MgS04 . 7H20 0,2 %; pH 7,2), das durch eine Kohlenhydratquelle ergänzt ist, z. B. Glucose, Stärke, Cellulose, jweils 0,1 %.
Oder Medium Nr. 2. : Glukose . H2O 0,5 % ; Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, 0,1 %; MgS04 . 7H20 0,15 %; CaCl2 . 2H20 0,1 %; KNO3 0,2 % ; Natrium-Eisen III - EPTA 8 mg/1; K2HP04 0,0125 %; Tris . HCl 0,2 %; pH vor dem Autoklavieren 7,4.
Oder Medium Nr. 3 : Stärke, löslich, 0,8 %; Glukose . H20 0,2 %; Hefeextrakt (Pifco) 0,2 %; Sojamehl, entfettet, 0,2 %; CaCl2 • 2H20 0,1 %; MgS04 . 7H20 0,1 %; Na-Fe III - EPTA 8 mg/1; HEPES-Puffer 50 mM; pH 7 , 4 vor dem Autoklavieren . Fermentation
Beispiel :
Bioreaktor mit 100 1 Inhalt, Fa. Bioengineering, Wald, Schweiz, Blattrührsystem. Medium Nr. 3 (wie oben), zusätzlich Adsorberharz Amberlite XAP-16, 1 %, v/v (Rohm und Haas, Parmstadt) und Antischaummittel Tegosipon, 10 ml (Goldschmidt AG, Essen) , jedoch ohne HEPES .
Per pH vor dem Autoklavieren: 7,8; Temperatur: 30 °C, Rührgeschwindigkeit: 100 U/min, Belüftung: 1800 1 Luft pro Stunde. Falls nötig, wurde der pH nach dem Autoklavieren mit 5 %iger KOH auf 7,9 eingestellt.
Per Fermentor wurde beimpft mit 4,8 1 Vorkultur, die in 6 mal 2 1 Schüttelkolben mit je 800 ml Medium 3 angezogen wurden. Während der Fermentation wurde ein Absinken des pH-Wertes unter 6,9 durch Zugabe von 5 %iger KOH verhindert .
Tabelle 6: Verlauf der Fermentation
Zeit PH p02 Glukose*
(Stunden) (%) (%)
0 (Start) 7,9 100 _**
48 - 88 -
216 7,3 40 0,5
264 7,2 40 0,25
336 7,3 58 0
360 (Ernte) 7,3 61 0
*) Glukose-Messung mit Diabur-Test 5000 von Boehringer
Mannheim **) - nicht gemessen 4. Leistungen:
Per Stamm bildet während der Fermentation die Maracenine C und P. Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen wurden Maracenin C und P in verschiedenen Konzentrationen in Reagenzgläser gegeben, die eine Suspension der Testorganismen in Nährmedium enthielten. Pie Anfangs-Zelldiehte war 105 Zellen/ml. Pie Kulturen wurden 18 bis 40 Stunden unter Schütteln bei 30 °C bebrütet.
Als Medien wurden verwendet:
Für Bakterien: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck, 0,5 % ; Proteose Pepton, Pifco, 0,5 %; Fleischextrakt, Oxoid, 0,1 %; pH 7,0.
Für Hefen und Pilze "Mycophil" -Medium: Phytone Pepton, BBL, 1 %; Glukose . H20 1 %. Pas Ergebnis zeigt die folgende Tabelle:
Tabelle 7 : Minimale Hemmkonzentration
Testorganismus Minimale Hemmkonzentration (μg/mll
Maracenin C P
Staphylococcus aureus 40 20
Bacillus subtilis 40 40
Corynebacterium mediolanum 40 10
Mi crococcus l u teus 40 40
Nocardia corallina 10 10
Mycobacterium phl ei 1,25 0,63
Mycobac teri um lacti cola 1,25 5
Pie minimale Hemmkonzentration für L929 Maus Fibroblasten in Zellkultur lag für Maracenin C und P bei 24 μg/ml . Isolierung
Aus einer 100 1 Kultur von Sorangium cellulosum, Stamm So cell28, wurden durch Sieben 3 kg eines Gemischs aus Amberlite XAP-16 und Zellen abgetrennt. Es wurde nacheinander im Batch- verfahren mit insgesamt 12 1 Methanol und 11 1 Aceton extrahiert. Pie vereinigten Extrakte wurden im Vakuum bei 35 °C Badtemperatur bis zum Auftreten der Wasserphase eingeengt. Piese wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und davon das Lösungsmitel im Vakuum bei 35 °C Badtemperatur abdestilliert. Per Rückstand (98 g) wurde in 375 ml Methanol gelöst und kalt gestellt (4 °C) . Per ausgefallene Niederschlag (77 g) wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Pas in Lösung verbleibende Rohprodukt (21 g) wurde durch Gelchromatographie an Sephadex LH-20 mit Methanol als Laufmittel fraktioniert. Pie Maracenine enthaltenden Fraktionen (1.7 g) wurden an HP-SIL- 18-20-60 (Säule: 929 x 90 mm, Laufmittel: Methanol/0 , 05 mM Ammoniumacetatpuffer 80/20, Fluß: 7 ml/min) chromatogra- phiert . Es wurden 800 mg eines Gemischs aus Maracenin C^ und C2 im Verhältnis 11 : 1 sowie 250 mg eines Gemischs aus Maracenin }_, und P2 im Verhältnis 3 : 1 erhalten. Pie Trennung der Komponenten erfolgte durch präparative HPLC an Nucleosil 100-C18-7 (Säule: 250 x 16 mm, Fluß: 10 ml/min) mit einem Laufmittelgemisch aus Methanol und 0.05 mM Ammoniumacetatpuffer im Verhältnis 70/30.
Maracenin C^_ delta4 '5-trans, delta11' 12-trans, delta14'15- trans, delta1 ' -eis
Maracenin C' delta4, 5-trans, delta11, 12-trans, delta14, 15- cis, delta17, 18-cis
Maracenin Pη_ 19,20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11' 12- trans, delta14 ' 15-trans, delta17' 18-cis
Maracenin P2 19, 20-dihydro, delta ' 5-trans, delta11' 12- trans, delta14 ' 15-cis, delta17 ' 18-cis
C. Physikalische Eigenschaften
Maracenin C-,
Summenformel C19H25O3CI MG 336.86
PC: Aluminiumfolien mit Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck-Art. 5554; Petektion mit Vanillin/Schwefelsäure-Sprühreagenz und Erhitzen auf 120 °C (- >Violettrotfärbung) Laufmittel : Pichlormethan/Aceton/Methanol 85/10/5 (v/v/v) Rf_: 0.55
HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C18; Fluß:
0.3 ml/min; Laufmittel : Methanol/0.01 mM Ammoniumace-tat- puffer 75/25, UV-Petektion : 220 nm Et : 8.1 min
LH-NMR (CPCI3, 300 MHz) : s. Tabelle 8
13C-NMR (CPCI3, 75.5 MHz): s. Tabelle 8 IR (KBr) : v = 3012 (w), 2925(m), 2859 (w) , 1711(s), 1654 (m) , 1434 (m), 1412 (w), 1271 (m) , 1215 (m) , 1154 (s), 1069 (w), 997 (m), 967 (m) , 924 cm_1(m).
UV (Methanol) : lambdamax (log epsilon) = 205 (4.25), 224 nm
(4.22) .
HPLC-MS (ESI) : m/z = 335 [M(35Cl)-H]
Maracenin C2 :
Charakteristische von Maracenin C^ abweichende Daten:
HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C18; Fluß: 0.3 ml/min; Laufmittel: Methanol/0.01 mM Ammonium- acetatpuffer 75/25, UV-Detektion: 220 nm Rt : 7.8 min
1H-NMR (CDCI3, 300 MHz): δ = 2.95 (m, 2H, 15-H), 2.81 ppm (m,
2H, 12-H)
13 C-NMR (CDCI3, 75.5 MHz) : δ = 26.6 (C-15), 26.1 ppm (C-12)
Maracenin D^ :
Summenformel C19H27θ3Cl MG 338.88
PC: Aluminiumfolien mit Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck-Art. 5554; Detektion mit Vanillin/Schwefelsäure-Sprühreagenz und Erhitzen auf 120 °C ( ->Violettrotfärbung) Laufmittel: Dichlormethan/Aceton/Methanol 85/10/5 (v/v/v) Rf: 0.62 HPLC: Säule: 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C18; Fluß:
0.3 ml/min; Laufmittel: Methanol/0.01 mM Ammoniumace-tat- puffer 75/25, UV-Detektion: 220 nm Et = 9-8 min
^•H-NMR (CDC13, 300 MHz): s. Tabelle 9 13C-NMR (CDC13, 75.5 MHz): s. Tabelle 9
IR (KBr) : v = 3011 (m) , 2963 (m) , 2929 (m) , 2873 (w) , 2856 (w) , 1713 (m) , 1654 (s), 1446 (m) , 1409 (m) , 1270 (m) , 1155(s), 1069 (w), 967(m), 924 (m) cm"1.
UV (Methanol) : lambdamax (log epsilon) = 203 nm (4.16).
HPLC-MS (ESI) : m/z = 337 [M(35Cl)-H]
Elementaranalyse :
gef . 67.2 %C 8.0 %H 14.2 %0 10.5 %C1 ber . 67.3 %C 8.0 %H 14.2 %0 10.5 %C1
Maracenin D2 :
Charakteristische von Maracenin Dj_ abweichende Daten:
HPLC: Säule 2 x 125 mm, Material: NucleosilR 120-5C18; Fluß: 0.3 ml/min; Laufmittel: Methanol/0.01 mM Ammoniumacetatpuffer 75/25, UV-Detektion: 220 nm R^: 10.1 min
^-H-NMR (CDCI3, 300 MHz) : δ = 2.80 ppm (m, 4H, 12- und 15-H) 13C-NMR (CDCI3, 75.5 MHz): δ = 25.7 (C-12), 25.6 ppm (C-15)
Tabelle 8: NMR-Daten von Maracenin Cx in CDC13 (-""H: 300 MHz; 13C: 75.5 MHz)
# δc (in ppm) δH (ppm) M JH.H (HZ)
1 178.5 —
2 34.3 2.43 t 7.2
3 22.5 2.30 q 7.2
4 110.3 5.22 dt 12.1 , 7.2
5 143.2 6.26 d 12.1
7 141.5 ...
8 109.7 5.14 m
9 27.3 2.14 m
10 26.4 2.14 m
11 129.0 5.42 m
12 128.6 5.42 m
13 30.4 2.74 m
14 129.2 5.42 m
15 128.3 5.42 m
16 30.8 2.88 m
17 130.3 5.42 m
18 129.6 6.02 t 11.0
19 132.1 6.62 dt 17.0, 11.0
20 117.4 5.19 d 17.0
5.10 d 11.0
Tabelle 9: NMR-Daten von Maracenin Dx in CDC13 ( : 300 MHz; 13C: 75.5 MHz)
# δc (in ppm) δH (ppm) M JH,H (HZ)
1 178.5 —
2 34.3 2.42 t 7.3
3 22.5 2.28 q 7.3
4 110.2 5.22 dt 12.3, 7.3
5 143.2 6.26 d 12.3
7 141.4 ...
8 109.7 5.15 m
9 27.3 2.14 m
10 26.4 2.14 m
11 129.1 5.41 m
12 128.5 5.41 m
13 30.4 2.73 m
14 128.8 5.41 m
15 128.9 5.41 m
16 30.3 2.73 m
17 126.9 5.33 m
18 132.3 5.38 m
19 20.5 2.03 pent 7.5
20 14.3 0.95 t 7.5

Claims

Patentansprüche
1. Ungesättigte aliphatische Carbonsäuren (Maracenine) der allgemeinen Formel :
20 CHx--CHy-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CHz==:CR-0-CH=CH-CH2-
CH2-C02H
wobei,
- wenn x = 2, y = 1 und ""- eine Doppelbindung, z = 0, R fehlt und == eine Dreifachbindung oder z = 1, R ein Cl-Atom und == eine Doppelbindung ist oder, - wenn x = 3, y = 2 und --* eine Einfachbindung, z = 0, R fehlt und =*= eine Dreifachbindung oder z = 1, R ein Cl-Atom und =*= eine Doppelbindung ist.
2. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin A]_) der Formel
Figure imgf000035_0001
Maracenin A, delta4' 5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-trans, delta17' 18- cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 300,40,
^-H-NMR gemäß Tabelle 1, 13C-NMR gemäß Tabelle 1,
IR (KBr) ; ny = 3014 (w) , 2925 (m), 2855 (w) , 2280 (m) , 1712 (s) , 1673 (m) , 1662 (m) , 1554 (w) , 1434 (m) , 1412 (m) , 1351 (w), 1222 (s) , 1175 (w), 1059 (m), 998 (m) , 968 (m) und 920 (m) cm-1; und UV (Methanol); lamdamax (log epsilon) = 208 (4,41) und 227 (4,47) nm.
3. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin A2) der Formel
20 19 18 17 15 1 12 11 5 4 1
CH2=CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-C≡C-O-CH=CH-CH2CH2-C00H
delta4 '5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-cis, delta17' 18-cis und/oder mit den folgenden Parametern: MG 300 , 40 ,
1H-NMR (CDC13, 300 MHz); delta = 2,96 (m, 2H, 15-H) und 2,82 (m,
2H, 12-H) ppm, und
13C-NMR (CDCI3, 75,5 MHz); delta = 26,1 (C-15) und 25,8 (C-12) ppm.
4. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin B]_) der Formel :
Figure imgf000036_0001
Maracenin B,
19 , 20 -dihydro , delta4 ' 5 -trans , delta11 ' 12 -trans , delta14 ' 15- trans , delta ' - eis und/oder mit den folgenden Parametern :
MG 302,41,
1H-NMR gemäß Tabelle 2,
13C-NMR gemäß Tabelle 2,
IR (KBr) ; ny = 3012 (m) , 2964 (m) , 2931 (m), 2875 (w) , 2279 (m) ,
1712 (s), 1674 (m), 1662 (m) , 1437 (m), 1412 (w) , 1304 (w), 1288 (m) ,
1223 (s) , 1061 (m), 968 (m) und 921 (m) cm-1, und
UV (Methanol); lamdamax (log epsilon) = 205 (4,37) nm.
5. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin B2) der Formel :
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH3-CH-2CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-C≡C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
19, 20-dihydro, delta ' 5-trans, delta11 ' 12-trans, delta14 ' 15-cis, delta ' -eis und/oder mit den folgenden Parametern: MG 302 , 41 ,
1H-NMR (CDC13, 400 MHz); delta = 2,81 (m, 4H, 12- und 15-H) und
13C-NMR (CDCI3, 75,5 MHz); delta = 25,8 (C-12) und 25,6 (C-15) ppm.
6. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin B3) der Formel :
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH3-CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-C≡C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
19,20-dihydro, delta4 ' 5-cis, delta11 ' 12-trans, delta14' 15-trans, delta17' -eis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 302,41 und
1H-NMR (CDC13, 400 MHz); delta = 6,21 (d, J = 5,7 Hz, 1H, 5-H) und 4,75 (m, 1H, 4-H) ppm.
7. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure der Formel (Maracenin C ) :
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH2=CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-CH=C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
Cl delta4' 5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-trans, delta17'18- cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 336, 86,
1H-NMR gemäß Tabelle 1, 13C-NMR gemäß Tabelle 1,
IR (KBr) ; ny = 3012 (w) , 2925 (m), 2859 (w) , 1711 (s), 1654 (n) , 1434 (m), 1412 (w), 1271 (m) , 1215 (m) , 1154 (s) , 1069 (w), 997 (m) , 967 (m) und 924 (m) cm"1, und
UV (Methanol); lamdamax (log epsilon) = 205 (4,25) und 224 (4,22) nm .
8. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin C2) der Formel :
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
CH2=CH-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH2-CH=C-0-CH=CH-CH2CH2-COOH
Cl
delta4' 5-trans, delta11' 12-trans, delta14 ' 15-cis, delta17' 18-cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 336,86 und
1H-NMR (CDCI3, 300 MHz); delta = 2,95 (m, 2H, 15-H) und 2,81 (m,
2H, 12-H) ppm, und
13C-NMR (CDCI3, 75,5 MHz); delta = 26,6 (C-15) und 26,1 (C-12) ppm.
9 . Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin Dη_ ) der Formel :
Figure imgf000038_0001
19,20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11 ' 12-trans , delta14' 15- trans, delta17' 18-cis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 338,88,
1HH-NMR gemäß Tabelle 2, 13 C-NMR gemäß Tabelle 2, IR (KBr) ; ny = 3011 (m), 2963 (m) , 2929 (m) , 2873 (w) , 2856 (w) , 1713 (m), 1654 (s), 1446 (m) , 1409 (m) , 1270 (m) , 1155 (s) , 1069 (w), 967 (m) und 924 (m) cm-1, und UV (Methanol); lamdamax (log epsilon) = 203 (4,16) nm.
10. Ungesättigte aliphatische Carbonsäure (Maracenin D2) der Formel :
20 19 18 17 15 14 12 11 5 4 1
Figure imgf000039_0001
19,20-dihydro, delta4 ' 5-trans, delta11, 12-trans, delta14 ' 15-cis, delta17' 18 -eis und/oder mit den folgenden Parametern:
MG 338,88,
1H-NMR (CDC13, 300 MHz); delta = 2,80 (m, 4H, 12- und 15-H) ppm, und
13C-NMR (CDCI3, 75,5 MHz); delta = 25,7 (C-12) und 25,6 (C-15) ppm.
11. Verfahren zur Gewinnung von ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren (Maraceninen) , dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Sorangium cellulosum So ce 880 = DSM 11252 in einem Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie Mineralsalze enthaltendem wäßrigem Medium aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert,
(b) das Adsorberharz gegebenenfalls mit den Zellen vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol und danach mit Aceton extrahiert,
(c) die vereinigten Extrakte bis zum Auftreten einer wäßrigen Phase einengt,
(d) die wäßrige Phase mit Ethylacetat extrahiert, trocknet und das Lösungsmittel abdampft,
(e) den angefallenen Rückstand in Methanol löst, die erhaltene Lösung abkühlt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt, (f) die verbleibende Lösung einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft,
(g) die Carbonsäuren (Maracenine) enthaltenden Fraktionen an HD- SIL-18-20-60 mit Methanol/Ammoniumacetat-Puffer als Laufmittel chromatographiert und eine Fraktion mit w-ungesättigten und eine Fraktion mit w-gesättigten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält,
(h) die erhaltenen Fraktionen einer präparativen HPLC-Chromatographie unterwirft und Fraktionen mit separierten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält und die separierten Carbonsäuren isoliert .
12. Verfahren zur Gewinnung von ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren (Maraceninen) , dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Sorangium cellulosum So ce 1128 = DSM 11253 in einem Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie Mineralsalze enthaltendem wäßrigem Medium aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert,
(b) das Adsorberharz gegebenenfalls mit den Zellen vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol und danach mit Aceton extrahiert,
(c) die vereinigten Extrakte bis zum Auftreten einer wäßrigen Phase einengt,
(d) die wäßrige Phase mit Ethylacetat extrahiert, trocknet und das Lösungsmittel abdampft,
(e) den angefallenen Rückstand in Methanol löst, die erhaltene Lösung abkühlt und den sich bildenden Niederschlag abtrennt, (f) die verbleibende Lösung einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft,
(g) die Carbonsäuren (Maracenine) enthaltenden Fraktionen an HD- SIL-18-20-60 mit Methanol/Ammoniumacetat-Puffer als Laufmittel chromatographiert und eine Fraktion mit w-ungesättigten und eine Fraktion mit w-gesättigten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält,
(h) die erhaltenen Fraktionen einer präparativen HPLC-Chromatographie unterwirft und Fraktionen mit separierten Carbonsäuren (Maraceninen) erhält und die separierten Carbonsäuren isoliert .
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorberharz Amberlite, insbesondere Amberlite XAD- 16 verwendet.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Stufe (d) mit Natriumsulfat trocknet.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelchromatographie mit Sephadex durchführt, insbesondere mit Sephadex LH-20.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die präparative HPLC-Chromatographie an einer Umkehrphase durchführt, insbesondere Nucleosil, vorzugsweise Nucleosil 100-C18-7.
17. Mittel gegen Bakterien, insbesondere Mykobakterien und/oder Nocardien, mit einem Gehalt an einer ungesättigten aliphatischen Carbonsäure (Maracenin) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 neben üblichen Hilfs-und/oder Trägerstoffen. - 4α -
18. Mittel nach Anspruch 17 zur Tuberkulosebehandlung.
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