WO1999021577A1 - Compositions inhibiting smooth muscle proliferation, method for the diagnosis of arteriosclerosis, and kits therefor - Google Patents

Description

明 細 書

平滑筋増殖抑制組成物、 動脈硬化症診断方法 及びそのキッ ト

枝 術 _ ^

本発明は、 脂肪組織特異的分泌因子 a p M 1 (Adipose Most Abundant Gene Transcript 1)を有効成分とする平 滑筋増殖抑制組成物、 検体中の該 a p M 1 を測定する動 脈硬化症の診断方法及び該 a p M 1 に対する抗体を有効 成分とする動脈硬化症診断キッ トに関する。

¾ _ S 技 術

現代社会において、 脂肪の過剰蓄積である肥満が、 糖 尿病、 高脂血症、 高血圧や、 更に狭心症、 心筋梗塞等の 動脈硬化疾患の発症に関与している こ とは周知の事実で ある。 該肥満の原因には様々 な遺伝因子と環境因子¹の双 方が関与している。

最近、 レブチンを始めとする多 く の肥満遺伝子が動物 モデルから単離された。 之等単離された遺伝子群はヒ ト の肥満成立に関与すると考えられる一方で、 現代人の過 剰な食物摂取、 運動不足等の環境因子もまた、 脂肪蓄積 を介して糖尿病や動脈硬化疾患等の他の重要な要因と考 元られる。

肥満遺伝子の検索のみでな く、 過栄養状態において脂 肪組織でどのよ う な遺伝子の発現が誘導され、 それが個 体にどのよ う な影響を与えるかを明 らかにするァプロ一 チが、 上記疾患の病因解明や治療技術の確立に非常に重 要な意味がある と考え られる。

本発明の 目 的は、 肥満に関連する各種疾患、 殊に、 狭 心症、 心筋梗塞等の動脈硬化症の病因解明、 治療技術の 確立に有用な肥満関連遺伝子及びその発現物を解明 し、 之等を利用 して各種疾患の治療、 診断技術を確立する こ とにめ O ₀

本発明者 らは上記目 的よ り 鋭意研究を重ねた結果、 先 に、 脂肪の中で も腹腔内内臓脂肪の蓄積が耐糖能異常、 高脂血症、 高血圧等と密接に結びつ く こ とを明 らかに し た。 ま た、 脂肪組織発現遺伝子の大規模シークェ ンス解 析によ り、 脂肪組織には多 く の分泌蛋白質遺伝子が発現 してお り、 特に内臓脂肪において様々 な生理活胜物質遺 伝子の発現が見られる こ と も明 らかに した。 更に、 之等 既知の遺伝子に加えて、 新たに脂肪組織特異的コ ラ ーゲ ン様蛋白 a p M 1 遺伝子のク ロ ーニ ン グに も成功 した (Biochem. Biophys. Res. Commun. , 221, 286-289 ( 1996) ), こ の a p M l 遺伝子は、 2 4 4 ア ミ ノ 酸からなる分泌 蛋白質 （ a p M l ) をコー ド してお り、 6 6 ア ミ ノ 酸の コ ラーゲ ン様モチーフ （ G— X— Y ) を も ち、 補体系の C l qやコラーゲン X、 VIIとホモロ ジ一を有していた。 しかしながら、 該遺伝子及びその発現物 a p M l の生理 機能は、 未知であつた。

本発明者らは、 引続く 研究において、 上記 a p M l 遺 伝子の遺伝子工学的手法による発現、 該発現物 a p M l に対する抗体の作製、 該抗体を利用 した a p M 1 の測定 系の確立、 該測定による a p M l 血中濃度と体脂肪分布 乃至各種疾患との関連等について一連の検討を行った結 果、 殊に a p M 1 が平滑筋増殖抑制作用を有するという 事実及びその血中濃度が動脈硬化症をよ く 反映する とい う事実を新たに発見した。

また、 本発明者らは、 a p M 1 がステン ト経皮経管冠 動脈血管拡張術 （ P T C A ) 等の血管再建術後の再狭窄 の予防及び治療に有効であ り、 ひいては例えば狭心症や 心筋梗塞等の血管障害を伴う動脈硬化症等の予防及び治 療にも有効である こ とを見いだした。 本発明はかかる知 見に基づいて完成されたものである。

発 明 の 開 示

本発明によれば、 a p M 1 及びその塩から選ばれる少 な く と も 1 種の薬学的有効量を、 製剤学的に許容される 担体と共に含有する平滑筋増殖抑制組成物が提供される ( また本発明によれば、 a p M 1 及びその塩から選ばれ る少な く と も 1 種の薬学的有効量を、 製剤学的に許容さ れる担体と共に含有する血管再建術後の再狭窄の予防及 び治療組成物が提供される。

また本発明によれば、 a p M 1 及びその塩から選ばれ る少な く と も 1 種の薬学的有効量を、 製剤学的に許容さ れる担体と共に含有する動脈硬化症予防及び治療組成物 が提供される。

更に、 本発明によれば、 検体中の a p M l を、 a p M 1 に対する抗体を用いて測定し、 測定値を健常者及び動 脈硬化症患者の測定値と対比して動脈硬化症を診断する 動脈硬化症の診断方法が提供される。

加えて、 本発明によれば、 a p M l に対する抗体を有 効成分と して含む動脈硬化症の診断用キ ッ ト、 及び該診 断に有効な a p M 1 に対するモ ノ ク 口一ナル抗体が提供 される。

本発明に係わる平滑筋増殖抑制組成物は、 その有する 平滑筋増殖抑制作用を通じて、 例えば狭心症、 血栓症を 含む心筋梗塞、 脳梗塞等の血管障害を伴う動脈硬化症の 予防及び治療や、 かかる動脈硬化症の進展の予防に有効 である。 事実、 本発明組成物の有効成分とする a p M 1 は、 動脈硬化の発症を規定する細胞接着分子である V C A M ~ 1 (Vascular Cell Adhesion Molecule- 1)、 E L A M (Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule ) I C A M - 1 ( Intercelular Adhesion Molecule - 1 )等の 発現を抑制する作用を奏し得る。 こ のこ とから、 本発明 組成物は、 各種動脈硬化症の発症に抑制的に働 く のであ る。

また、 このこ とから本発明は、 血管内皮細胞における 接着分子の発現を抑制する医薬組成物をも提供する もの である。

a p M l が上記細胞接着分子の発現を抑制する という 事実よ り、 本発明組成物は、 例えば V C A M - 1 の発現 量の上昇に関連する疾患と して知られている、 好酸球浸 潤に伴われる I 型アレルギー反応と関連する気管支喘息 等の予防及び治療にも適応可能である。

また、 上記 I C A M - 1 及び E L A Mは炎症に関連す る接着分子と しても知られているので、 a p M l を有効 成分とする本発明組成物は、 かかる接着分子の発現の抑 制を通じて、 例えば抗炎症剤と してや、 慢性関節リ ウマ チ治療剤と しても適応できると考えられる。

更に、 本発明組成物は、 例えばステン ト経皮経管冠動 脈血管拡張術 （stent PTCA) 等の血管再建術後の再狭窄 の予防や治療にも有効である。 即ち、 狭心症や心筋梗塞 における冠動脈狭窄に対する血管再建術施術後には、 虚 血再灌流及び血管内皮細胞障害によ り、 血管内皮細胞に 対する接着分子が発現し、 平滑筋細胞の増殖が生じ、 再 狭窄が発症する。 本発明組成物は、 この接着分子の発現 及び平滑筋細胞の増殖を抑制する こ とによって、 血管再 建術後の虚血再狭窄のむ予防にも有効である。

本発明によ り提供される動脈硬化症の診断方法は、 平 滑筋の増殖能 （平滑筋細胞の D N A合成能） という新し い指標を利用する ものであ り、 これは、 検体中の a p M 1 量を該 a p M 1 に対する特異抗体を用いて測定、 定量 する こ とによ り実施される。

以下、 本発明組成物において有効成分とする a p M 1 の製造、 これを有効成分とする本発明組成物の調製、 該 a p M 1 に対する抗体の製造、 及び該 a p M 1 の測定に つき、 順次説明する。 '

尚、 本明細書におけるア ミ ノ酸、 ペプチ ド、 塩基配列、 核酸等の略号による表示は、 I U P A C — I U Bの規定

I UPAC- I UB Communication on Biological

Nomenclature, Eur, J, Biochera.， 1_38, 9 ( 1984" 、 Γ塩 基配列又はァ ミ ノ酸配列を含む明細書等の作成のための ガイ ドライ ン」 （平成 1 0年 6月、 特許庁編） 及び当該 分野における慣用記号に従う ものとする。

a p M 1 は、 例えば通常の遺伝子工学的手法 〔例えば Science, 224, 1431 ( 1984) ; Biochem. Biophys. Res.

Comm. , 130, 692 (1985)； Proc. atl. Acad. Sci. , USA. , 80, 5990 ( 1983)等参照〕 によ り組換え蛋白と して製造す る こ とができる。 上記において a p M 1遺伝子と しては、 本発明者らが先に確立したものを使用できる（Biochem.

Biophys. Res. Commun. , 221, 286-289 (1996))₀

また、 該 a p M 1 は、 上記遺伝子によ り コー ドされる ア ミ ノ酸配列情報に従って、 一般的な化学合成手法によ り製造する こ と もできる。

遺伝子工学的手法を採用 した a p M l の製造は、 よ り 詳細には、 所望蛋白をコー ドする遺伝子が宿主細胞中で 発現でき る組換え D N Aを作成し、 これを宿主細胞に導 入して形質転換し、 該形質転換体を培養する こ とによ り 行われる。

こ こで宿主細胞と しては、 真核生物及び原核生物のい ずれも用いるこ とができる。 該真核生物の細胞には、 脊 椎動物、 真核微生物等の細胞が含まれる。 脊椎動物細胞 と しては、 例えばサルの細胞である C 0 S細胞（Cell, 2 3, 175 (1981))やチャイニーズ . ハムスター卵巣細胞及び そのジヒ ドロ葉酸レダク タ一ゼ欠損株（Proc. Natl. Acad. Sci, , USA. , 77, 4216 ( 1980 ))等がよ く 用いられるが、 これらに限定される訳ではない。 脊椎動物の発現ベクターと しては、 通常発現しよう と する遺伝子の上流に位置するプロモータ一、 R N Aのス プライス部位、 ポ リ アデニル化部位及び転写終了配列等 を保有する ものを使用できる。 これは更に必要によ り複 製起点を有していてもよい。 該発現べク タ一の例と して は、 例えば S V 4 0 の初期プロモータ一を保有する p S V 2 dhf r(Mol. Cell. Biol. , 1, 854 ( 1981 ) )等を例示 できる。

また、 真核微生物と しては、 酵母が一般によ く 用いら れ、 中でもサッ カ ロ ミ セス属酵母が有利に利用できる。 酵母等の真核微生物の発現べク タ一と しては、 例えば酸 性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモータ一を有する p A Μ 8 2 (Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 80, 1(1983)) 等を利用できる。

原核生物の宿主と しては、 大腸菌や枯草菌が一般によ く 用いられる。 これらを宿主とする場合、 例えば宿主菌 中で複製可能なプラス ミ ドベク ターを用い、 こ のべクタ 一中に所望遺伝子が発現できるよう に該遺伝子の上流に プロモーター及び S D (シャイ ン · アン ド · ダルガーノ ） 塩基配列、 更に蛋白合成開始に必要な開始コ ドン （例え ば A T G ) を付与した発現プラス ミ ドを利用するのが好 ま しい。 上記宿主と しての大腸菌と しては、 ェシエリ ヒ ァ · コ リ （Escherichia coli)K 1 2株等がよ く 用いられ、 ベク ターと しては一般に p B R 3 2 2及びその改良べク 夕一がよ く 用いられるが、 これらに限定されず公知の各 種の菌株及びべク タ一も利用できる。 プロモータ一と し ては、 例えば ト リ プ トフ ァ ン（trp)プ口モーター、 1 p p プロモータ一、 l a c プロモータ一、 P L Z P Rプロモ —ター等を使用できる。

かく して得られる所望の組換え D N Aの宿主細胞への 導入方法及びこれによる形質転換方法は、 一般的方法に 従う こ とができる。

得られる形質転換体は、 常法に従い培養でき、 該培養 によ り形質転換体の細胞内、 細胞外乃至細胞膜上に目的 とする組換え蛋白が発現、 生産、 蓄積乃至分泌される。 該培養に用いられる培地と しては、 採用 した宿主細胞に 応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、 その 培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。

上記の如 く して得られる a p M 1 は、 所望によ りその 物理的性質、 化学的性質等を利用 した各種の分離操作 ( 「生化学データーブッ ク II」 、 1175- 1259 頁、 第 1 版第 1 刷、 1980年 6月 23日株式会社東京化学同人発行 ；

Biochemistry, 25(25), 8274(1986)； Eur. J. Biochem. , 163， 313( 1987)等参照）によ り分離、 精製できる。 よ り具 体的には、 例えば通常の再構成処理、 蛋白沈澱剤による 処理 （塩析法） 、 遠心分離、 浸透圧シ ョ ッ ク法、 超音波 破砕、 限外濾過、 分子篩ク ロマ ト グラフ ィ ー （ゲル濾過） 、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 イ オ ン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ―、 ァフ ィ 二ティ ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ 一 （ H P L C ) 等の各種液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 透析法、 これ らの組合せ等によ り分離、 精製でき ο

上記 a p M 1 は、 また、 そのア ミ ノ 酸配列情報に従つ て、 一般的な化学合成法によ り製造する こ とができ る。 該方法には、 通常の液相法及び固相法によ るペプチ ド合 成法が包含される。 かかるペプチ ド合成法は、 よ り 詳し く は、 ア ミ ノ 酸配列情報に基づいて、 各ア ミ ノ 酸を 1 個 ずつ逐次結合させ鎖を延長させてい く 所謂ステ ッ プワイ ズェロ ンゲー シ ヨ ン法と、 ア ミ ノ酸数個か らなる フ ラ グ メ ン トを予め合成 し、 次いで各フラ グメ ン トをカ ツ プリ ング反応させる フ ラ グメ ン ト · コ ンデンセ一 シ ョ ン法と を包含する。

上記ペプチ ド合成法に採用 される縮合反応も、 常法に 従う こ とができ る。 該方法には、 例えば、 アジ ド法、 混 合酸無水物法、 D C C法、 活性エステル法、 酸化還元法、 D P P A (ジフ エニルホスホ リ ノレアジ ド） 法、 D C C + 添加物 （ 1 — ヒ ドロキシベンゾ ト リ アゾ一ル、 N — ヒ ド ロキシサク シ ンア ミ ド、 N — ヒ ドロキシ一 5 — ノ ノレボノレ ネ ン — 2， 3 — ジカルボキシイ ミ ド等） 法、 ウ ッ ドヮー ド法等が包含される。

これら各方法に利用でき る溶媒も、 この種ペプチ ド縮 合反応に使用される こ とのよ く 知 られている一般的な も のから適宜選択する こ とができ る。 その例と しては、 例 えばジメ チルホノレムア ミ ド （ D M F ) 、 ジメ チルスルホ キシ ド （ D M S O ) 、 へキサホスホロア ミ ド、 ジォキサ ン、 テ ト ラ ヒ ドロ フラ ン （ T H F ) 、 酢酸ェチル等及び これらの混合溶媒等を挙げる こ とができ る。

尚、 上記ペプチ ド合成反応に際 して、 反応に関与しな いア ミ ノ 酸乃至ペプチ ドにおけるカルボキシル基は、 一 般にはエステル化によ り、 例えばメ チルエステル、 ェチ ルエステル、 第 3 級ブチルエステル等の低級アルキルェ ステル、 例えばべンジルエステル、 ρ — メ トキシベンジ ルエステル、 p —二 ト 口べンジルエステソレ等のァラルキ ルエステル等と して保護する こ とができ る。

また、 側鎖に官能基を有するア ミ ノ 酸、 例えばチロ シ ン残基の水酸基は、 ァセチル基、 ベン ジル基、 ベン ジル ォキシカルボニル基、 第 3 級ブチル基等で保護されて も よいが、 必ず し もかかる保護を行う必要はない。 更に、 例えばアルギニン残基のグァニジノ 基は、 ニ ト 口 基、 ト シノレ基、 p — メ ト キ シベ ンゼ ン スノレホニノレ基、 メ チ レ ン 一 2 — スルホニル基、 ベン ジルォキシカルボ二 ル基、 イ ソボルニルォキシカルボニル基、 ァダマ ンチル ォキシカルボニル基等の適当な保護基によ り保護する こ とができ る。

上記保護基を有するア ミ ノ 酸、 ペプチ ド及び最終的に 得られる蛋白質における これ ら保護基の脱保護反応 もま た、 慣用 される方法、 例えば接触還元法や、 液体ア ンモ ニァサナ ト リ ウ ム、 フ ッ化水素、 臭化水素、 塩化水素、 ト リ フルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メ タ ンスルホ ン酸等を 用いる方法等に従って実施する こ とができ る。

か く して得られる a p M 1 は、 前記 した各種の方法、 例えばイ オ ン交換樹脂、 分配ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 ゲル ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 向流分配法等のペプチ ド化学の分 野で汎用 される方法に従い、 適宜その精製を行う こ とが でき る。

本発明に係わる組成物は、 a p M 1 又はその製剤学的 に許容される塩を有効成分とする。 かかる塩には、 例え ばナ ト リ ウ ム、 カ リ ウム、 リ チウム、 カルシウ ム、 マグ ネ シゥ ム、 バ リ ウム、 ア ンモニゥム等のアルカ リ 金属塩 アル力 リ 土類金属塩及びア ンモニゥム塩等が包含される, これらの塩は当業界で周知の方法によ り調製される。 更 に、 上記塩には、 a p M 1 と適当な有機酸乃至無機酸と を常法に従い反応させて得られる酸付加塩も包含される。 代表的酸付加塩と しては、 例えば塩酸塩、 塩化水素酸塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩、 重硫酸塩、 酢酸塩、 蓚酸塩、 吉 草酸塩、 ォレイ ン酸塩、 ラウ リ ン酸塩、 硼酸塩、 安息香 酸塩、 乳酸塩、 リ ン酸塩、 p - ト ルエ ンスルホ ン酸塩

( ト シレー ト） 、 クェン酸塩、 マレイ ン酸塩、 フマル酸 塩、 コハク酸塩、 酒石酸塩、 スルホ ン酸塩、 グリ コール 酸塩、 ァスコルビン酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩及びナ プシレー ト等を例示できる。

本発明に係わる組成物は、 一般には、 上記有効成分の 薬学的有効量を適当な医薬担体と共に含む医薬製剤形態 に調製'され、 実用される。

上記医薬製剤に利用できる担体と しては、 製剤の使用 形態に応じて通常使用される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 滑沢剤等の希釈剤或は賦 形剤等を例示でき る。 これらは得られる製剤の投与単位 形態に応じて適宜選択使用できる。

医薬製剤の投与単位形態と しては、 各種の形態が治療 目的に応じて選択できる。 その代表的な ものには、 錠剤、 丸剤、 散剤、 粉末剤、 顆粒剤、 カプセル剤等の固体投与 形態や、 溶液、 懸濁剤、 乳剤、 シロ ッ プ、 エ リ キシル等 の液剤投与形態が含まれる。 これ らは投与経路に応 じて 経口剤、 非経口剤、 経鼻剤、 経膣剤、 坐剤、 舌下剤、 軟 膏剤等に分類され、 それぞれ通常の方法に従い、 調合、 成形乃至調製する こ とができ る。 上記医薬製剤には、 ま た通常の医薬製剤に使用 し得る各種の成分、 例えば安定 化剤、 殺菌剤、 緩衝剤、 等張化剤、 キ レー ト剤、 p H調 整剤、 界面活性剤等を適宜添加でき る。

上記安定化剤と しては、 例えばヒ ト血清アルブ ミ ンゃ 通常の L —ア ミ ノ 酸、 糖類、 セルロ ース誘導体等を例示 でき る。 之等は単独で又は界面活性剤等と組合せて使用 でき る。 特に この組合せによれば、 有効成分の安定性を よ り 向上させ得る場合がある。

上記 L — ア ミ ノ 酸は、 特に限定はな く、 これには例え ばグリ シ ン、 システィ ン、 グルタ ミ ン酸等が包含される c 上記糖類と して も特に限定はな く、 例えばグルコース- マ ンノ ース、 ガラ ク ト ース、 果糖等の単糖類、 マ ンニ ト —ル、 イ ノ シ トール、 キシ リ トール等の糖アルコール、 シ ョ 糖、 マル ト 一ス、 乳糖等の二糖類、 デキス ト ラ ン、 ヒ ドロキシプロ ピルスタ ーチ、 コ ン ドロイ チ ン硫酸、 ヒ アル口 ン酸等の多糖類等及びそれ らの誘導体等を使用で 。 界面活性剤と して も特に限定はな く、 イ オ ン性及び非 イオ ン性界面活性剤のいずれも使用でき る。 これには例 えば、 ポ リ オキシエチ レ ング リ コールソノレビタ ンアルキ ルエステル系、 ポ リ ォキシエチ レ ンアルキルエー テル系、 ソノレビタ ンモノ ァ シルエステル系、 脂肪酸グリ セ リ ド系 等が包含される。

セルロース誘導体と して も特に限定はな く、 メ チルセ ノレ 口 一 ス、 ェチノレセノレ ロ ー ス、 ヒ ド ロ キ シェチノレセソレ ロ ー ス、 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピノレセノレ ロ ー ス、 ヒ ド ロ キ シ プロ ピルメ チルセノレロース、 カルボキシメ チルセルロースナ ト リ ゥム等が挙げられる。

糖類の添加量は、 有効成分 当 り 約 0. 0 0 0 1 m g以上、 好ま し く は約 0. 0 1 〜 ： L O m gの範囲から 選ばれるのが適当である。 界面活性剤の添加量は、 有効 成分 l ^ g当 り約 0. O O O O l m g以上、 好ま し く は 約 0. 0 0 0 1 〜 0. O l m gの範囲か ら選ばれるのが 適当である。 ヒ ト血清アルブ ミ ンの添加量は、 有効成分 1 g当 り約 0. 0 0 0 l m g以上、 好ま し く は約

0. 0 0 1 - 0. l m gの範囲から選ばれるのが適当で ある。 ア ミ ノ 酸は、 有効成分 1 u g当 り約 0. 0 0 1 〜 1 0 m gの範囲か ら選ばれるのが適当である。 ま た、 セ ルロース誘導体の添加量は、 有効成分 l ^ g当 り 約 0. O O O O l m g以上、 好ま し く は約 0. 0 0 1 〜 0. 1 m gの範囲から選ばれるのが適当である。

本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、 広範囲 から適宜選択でき、 通常約 0. 0 0 0 0 1 〜 7 0重量％、 好ま し く は 0. 0 0 0 1 〜 5 重量％程度の範囲から選ば れるのが適当である。

更に、 上記医薬製剤中に適宜添加する こ とができ る緩 衝剤と しては、 ホウ酸、 リ ン酸、 酢酸、 クェン酸、 ε — ア ミ ノ カプロ ン酸、 グルタ ミ ン酸及び 又はそれらに対 応する塩 （例えばそれらのナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩等のアルカ リ 金属塩ゃァ ルカ リ 土類金属塩） 等を例示できる。 等張化剤と しては、 塩化ナ ト リ ウム、 塩化カ リ ウム、 糖類、 グリ セ リ ン等を 例示できる。 またキレー ト剤と しては、 ェデ ト酸ナ ト リ ゥム、 クェン酸等を例示できる。

本発明医薬製剤には、 液剤に加えて、 該液剤を凍結乾 燥化し保存し得る状態に した後、 用時水、 生埋的食塩水 等を含む緩衝液等に溶解して適当な濃度に調製して使用 される用時溶解剤も包含される。

本発明医薬製剤を錠剤の形態に成形するに際しては、 前記担体と して、 例えば乳糖、 白糖、 塩化ナ ト リ ウム、 ブ ドウ糖、 尿素、 デンプン、 炭酸カルシウム、 カオ リ ン- 結晶セルロース、 ゲイ酸、 リ ン酸カ リ ウム等の賦形剤 ； 水、 エタ ノ ール、 プロパノ ール、 単シロ ッ プ、 ブ ドウ糖 液、 デンプン液、 ゼラチ ン溶液、 カルボキシメ チルセル ロース、 ヒ ドロキシプロ ピソレセゾレロース、 メ チノレセノレ口 —ス、 ポ リ ビニルピロ リ ドン等の結合剤 ； カルボキシメ チノレセノレ口一スナ ト リ ゥム、 カノレボキシメ チゾレセノレ口一 スカノレシゥ 厶、 低置換度ヒ ドロキシプロ ピルセソレロース、 乾燥デンプン、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 カ ンテ ン末、 ラ ミ ナラ ン末、 炭酸水素ナ ト リ ウム、 炭酸カルシウム等の 崩壊剤 ； ポ リ オキシエチ レ ンソルビタ ン脂肪酸エステル 類、 ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウ ム、 ステア リ ン酸モノ グ リ セ リ ド等の界面活性剤 ； 白糖、 ステア リ ン、 カカオバタ 一、 水素添加油等の崩壊抑制剤 ； 第 4 級ア ンモニゥム塩基、 ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウム等の吸収促進剤 ； グ リ セ リ ン、 デンプン等の保湿剤 ； デンプン、 乳糖、 カオ リ ン、 ベン ト ナイ ト、 コ ロイ ド状ゲイ酸等の吸着剤 ； 精製タルク、 ステア リ ン酸塩、 ホウ酸末、 ポ リ エチ レ ング リ コール等 の滑沢剤等を使用でき る。

更に錠剤は、 必要に応じ通常の剤皮を施 した錠剤、 例 えば糖衣錠、 ゼラチ ン被包錠、 腸溶被錠、 フ ィ ルムコー ティ ング錠或は二重錠乃至多層錠とする こ とができ る。

丸剤の形態に成形する に際しては、 担体と して例えば ブ ドウ糖、 乳糖、 デンプン、 カカオ脂、 硬化植物油、 力 ォ リ ン、 タルク等の賦形剤 ； アラ ビアゴム末、 ト ラガン ト末、 ゼラチ ン、 エタ ノ ール等の結合剤 ； ラ ミ ナラ ン、 力 ンテ ン等の崩壊剤等を使用でき る。

カプセル剤は、 常法に従い通常有効成分を上記で例示 した各種の担体と混合 して硬質ゼラチ ンカプセル、 軟質 カプセル等に充填 して調製される。

経口投与用液剤は、 慣用される不活性希釈剤、 例えば 水を含む医薬的に許容される溶液、 ェマルジ ヨ ン、 懸濁 液、 シ ロ ッ プ、 エ リ キシル等を包含する。 該液剤には更 に湿潤剤、 乳剤、 懸濁剤等の助剤を含ませる こ とができ、 これ らは常法に従い調製される。

非経口投与用液剤、 例えば滅菌水性乃至非水性溶液、 ェマルジ ヨ ン、 懸濁液等への調製に際 しては、 希釈剤と して例えば水、 エチルアルコール、 プロ ピ レ ング リ コ一 ル、 ポ リ エチ レ ングリ コール、 エ トキシィ匕イ ソステア リ ルアルコ ール、 ポ リ オキシ化イ ソ ステア リ ノレアルコ 一ル、 ポ リ オキシエチ レ ンソルビタ ン脂肪酸エステル及びオ リ —ブ油等の植物油等を使用でき る。 該液剤にはまた注入 可能な有機エステル類、 例えばォ レイ ン酸ェチル等を配 合する こ と もでき る。 これ らには更に通常の溶解補助剤- 緩衝剤、 湿潤剤、 乳化剤、 懸濁剤、 保存剤、 分散剤等を 添加するこ と もできる。

医薬製剤の滅菌は、 例えばバクテ リ ア保留フ ィ ルタ ー を通過させる濾過操作、 殺菌剤の配合、 照射処理及び加 熱処理等によ り実施できる。 また、 医薬製剤は使用直前 に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解する こ とのできる 滅菌固体組成物形態に調製して、 使用直前に滅菌する こ と もできる。

坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、 担 体と して、 例えばポ リ エチレングリ コール、 カカオ脂、 高級アルコール、 高級アルコールのエステル類、 ゼラチ ン及び半合成グリ セライ ド等を使用できる。

ペース ト、 ク リ ーム、 ゲル等の軟膏剤の形態に成形す るに際しては、 希釈剤と して、 例えば白色ワセ リ ン、 ノ、。 ラ フィ ン、 グ リ セ リ ン、 セルロース誘導体、 プロ ピ レ ン グ リ コール、 ポ リ エチ レ ング リ コール、 シ リ コ ン、 ベン トナイ ト及びオ リ 一ブ油等の植物油等を使用できる。 経鼻又は舌下投与用製剤は、 周知の標準賦形剤を用い て、 常法に従い調製することができる。

尚、 本発明医薬製剤中には、 必要に応じて着色剤、 保 存剤、 香料、 風味剤、 甘味剤等や他の医薬品等を含有さ せる こ と もできる。

上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がな く、 各種製 剤形態、 患者の年齢、 性別その他の条件、 疾患の程度等 に応じて決定される。 例えば錠剤、 丸剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、 注射剤は 単独で又はブ ドウ糖ゃァ ミ ノ酸等の通常の補液と混合し て静脈内投与され、 更に必要に応じ単独で筋肉内、 皮內、 皮下も し く は腹腔内投与され、 坐剂は直腸内投与され、 経膣剤は膣内投与され、 経鼻剤は鼻腔內投与され、 舌下 剤は口腔内投与され、 軟膏剤は経皮的に局所投与される。

上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量及びそ の投与量は、 特に限定されず、 所望の治療効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条件等に応じて広 範囲よ り適宜選択される。 通常好ま し く は、 血中におけ る有効成分濃度が約 l 〜 2 0 0 ^ g Z m l、 よ り好ま し 'く は約 1 0 〜 2 0 g m 1 程度となる量を目安と して 決定されるのがよい。 該製剤は 1 日に 1 回又は数回に分 けて投与する こ とができる。

以下、 a p M l に対する特異抗体の製造につき詳述す れば、 該 a p M 1 に対する特異抗体は、 a p M l、 その 断片乃至之等をハプテンと して含む複合蛋白を免疫抗原 と して利用 して、 抗血清 （ポ リ ク ロ一ナル抗体） 及びモ ノ ク 口一ナル抗体と して製造する こ とができる。

これら抗体の製造方法自体は、 当業者によ く 理解され ているとこ ろであり、 本発明抗体の製法もこれら常法に 従う こ とができる（例えば続生化学実験講座 「免疫生化学 研究法」 、 日本生化学会編 （ 1986) 等参照）。

よ り詳し く は、 a p M l に対するモノ ク ローナル抗体 は、 例えば上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞 (免疫細胞） と哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞 (hybridoma)を作成し、 これよ り a p M l を認識する所望 抗体を産生する ク ローンを選択し、 該ク ローンの培養に よ り製造できる。

上記において用いられる免疫抗原と しての a p M 1 と しては、 特に限定はな く、 既に公知の遺伝子組換え技術 に従い製造された組換え a ρ Μ 1、 その一部のア ミ ノ酸 配列を有するペプチ ド、 之等と他の担体との複合物等の いずれでもよい。 尚、 上記' a p M l は、 脂肪組織特異的 分泌因子と して知られており、 これと同等の活性乃至作 用を有する蛋白、 例えば G B P 2 8 (Gelatin-binding p rotein of 28 kDa)もまた、 上記免疫抗原と して同様に利 用する こ とができる。

上記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物と し ては、 特に制限はな く、 細胞融合に使用する形質細胞腫 細胞との適合性を考慮して選択するのが好ま し く、 一般 にはマウス、 ラッ ト、 兎等が有利に用いられる。 免疫は一般的方法によ り、 例えば上記免疫抗原を哺乳 動物に静脈内、 皮內、 皮下、 腹腔内注射等によ り 投与す る こ とによ り 行われる。 好ま し く は、 免疫抗原を、 所望 によ り 通常のア ジュバン ト と併用 して、 供試動物に 2〜 1 4 日毎に数回、 総投与量が約 1 0 0 〜 5 0 0 g Zマ ウス程度となる よ う に投与する こ とによ り行われる。 免 疫抗原と しては、 上記最終投与の約 3 日後に摘出 した脾 臓細胞を使用するのが好ま しい。

更に、 上記免疫細胞と融合される他方の親細胞と して の哺乳動物の形質細胞腫細胞と しては、 既に公知の種々 の もの、 例えば p 3 (p3/X63-Ag8) [Nature, 256, 495- 497(1975)) > ρ 3 - U 1 (Current Topics in

Microbiology and Immunology, 81. 1-7(1978)) > N S - 1 (Eur. J. Immunol.， 6， 51ト 519(1976))、 M P C - 1 1 (Cell, 8, 405-415(1976))、 S P 2 / 0 (Nature, 276, 269-270(1978))、 F O ( J. Imm画 1. Meth.， 35, 1-21

(1980)〕、 x 6 3. 6. 5. 3. ( J. Immunol. , 123. 1548- 1550(1979)) . S 1 9 4 (J. Exp. Med. , 148, 313-323

( 1978))等や、 ラ ッ ト における R 2 1 0 (Nature, 277, 131- 133 (1979))等の骨髄腫細胞等を使用でき る。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、 公知 の方法ヽ例えば Milsteinらの方法（Method in Enzymology, Vol.73, pp.3(1981)〕等に準じて行う こ とができる。 よ り具体的には、 上記融合反応は、 通常の融合促進剤、 例 えばポ リ エチ レ ングリ コール（ p E G )、 センダイ ウィル ス（H V J )等の存在下に、 通常の培地中で実施でき る。 培地には更に融合効率を高めるためにジメ チルスルホキ シ ド等の補助剤を必要に応じて添加するこ と もでき る。

免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、 通常の方法 と変り はな く、 例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞 を約 1 〜 1 0倍用いるのが普通である。 融合反応時の培 地と しては、 形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される各 種のもの、 例えば R P M I — 1 6 4 0培地、 M E M培地、 その他のこの種細胞培養に一般に利用される ものを例示 できる。 通常之等培地は牛胎児血清（F C S )等の血清補 液を抜いてお くのがよい。

融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、 上記培地内でよ く 混合し、 予め 3 7 °C程度に加温した P E G溶液、 例えば平均分子量 1 0 0 0 〜 6 0 0 0程度 の ものを、 通常培地に約 3 0〜 6 0 w/v%の濃度で加えて 混ぜ合せる こ とによ り行われる。 以後、 適当な培地を逐 次添加して遠心し、 上清を除去する操作を繰返すこ とに よ り所望のハイプリ ドーマが形成される。

得られる所望のハイブリ ドーマの分離は、 通常の選別 用培地、 例えば H A T培地（ヒポキサンチン、 ア ミ ノ プテ リ ン及びチ ミ ジ ンを含む培地）で培養するこ とによ り行わ れる。 H A Τ培地での培養は、 目的とするハイプリ ドー マ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、 通常数日〜数週間行えばよい。 かく して得られるハイブ リ ドーマは、 通常の限界希釈法によ り 目的とする抗体の 検索及び単一ク ロー ン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、 例えば E L I S A法

(Engvall, E. , Meth. Enzymol. , ， 419- 439(1980)〕ヽ プ ラ一ク法、 スポッ ト法、 凝集反応法、 ォクテロ二一

( 0 uchterlony)法、 ラ ジオィムノ ア ッセィ（R I A )法等 の一般に抗体の検出に用いられている種々 の方法〔 「ハイ プリ ドーマ法とモノ ク ローナル抗体」 、 株式会社 R & D プラニング発行、 第 30-53頁、 昭和 57年 3月 5'日〕 に従い実 施でき、 こ の検索には前記免疫抗原が利用できる。

かく して得られる a p M l を認識する所望のモノ ク ロ ーナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 通常の培地で 継代培養する こ とができ、 また液体窒素中で長期間保存 するこ とができる。

上記ハイブリ ド一マからの所望抗体の採取は、 該ハイ プリ ドーマを、 常法に従って培養してその培養上清と し て得る方法やハイブリ ドーマをこれと適合性のある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法等が 採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適 しており、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。

上記のごと く して得られる抗体は、 更に塩析、 ゲル濾 過法、 ァフ ィ二ティ ク ロマ トグラ フ ィ ー等の通常の手段 によ り精製するこ とができる。 かぐ して、 a p M 1 に特 異反応性を有する所望の a p M 1 モノ ク ローナル抗体が 得られる。

本発明はまた、 検体中の a p M 1 の測定技術、 これに よる動脈硬化症の診断法をも提供する ものである。

上記動脈硬化症の診断は、 患者の血液又は尿よ り得ら れた検体中の a p M l 量を a p M l に対する抗体を用い る液相系又は固相系免疫検定法により測定し、 測定値を 動脈'硬化症患者の同値及び正常者の同値と対比する こ と によ り、 即ち検体における a p M l 量値が健常人のそれ に比して高いか低いかを判定する こ とによ り行われる。

こ こで免疫検定法と しては、 サン ドイ ッチ法を用いる E L I S A法が好ま しい。

この方法につき詳述すれば、 その原理は酵素抗体法に 基づいている。 即ち、 この方法によれば、 例えば、 まず 9 6 ゥエルプレー トに抗ヒ ト a p M l モノ ク ローナル抗 体（第 1 抗体）を固相化し、 更に非特異吸着を防ぐために ブロ ッキングを行う （固相化反応）。 次に、 上記モノ ク ロ —ナル抗体固相化プレー トにヒ ト a p M 1 標準液又は検 体を加えて反応させる（第 1反応）。 プレー トを洗浄後、 抗ヒ ト a p M l 抗体（第 2抗体）を加えて反応させる（第 2 反応）。 プレー トを洗浄し、 H R P標識抗ゥサギ I g G抗 体（第 3抗体）を加えて反応させる（第 3反応）。 プレー ト を洗浄後、 基質を加えて酵素反応を行い（第 4反応）、 活 性を波長 4 9 2 n mにおける吸光度と して読みとる。

上記においては、 第 1 抗体と してポ リ ク ロ一ナル抗体 を、 第 2抗体と してモノ ク ローナル抗体を用いる こ とも できる。

上記方法に従えば、 用いる標準液又は検体中の a p M 1 濃度が高いほど、 強い酵素活性 （吸光度） が認められ る。 上記標準液の吸光度をプロ ッ ト して標準曲線 （検量 線） を作製し、 検体の吸光度を該検量線と対比させれば、 検体中の a p M l を簡便に読みとる こ とができ、 かく し て、 検体が動脈硬化症に罹患しているか否かの診断が行 い得る。

更に、 本発明に係わる上記動脈硬化症の診断は、 特定 のキッ トの利用によ り簡便に実施可能であ り、 本発明は かかるキッ トをも提供する。

以下、 本発明キッ ト及びこれを利用 して検体中の a p M 1 量を検出する方法につき詳述する。

本発明キッ トを利用 した検定法において、 検体と して は尿又は血液 （特に空腹時の血清又は血漿） が好ま しく、 之等は被検者よ り採取、 採血後、 常法に従い調製できる。

本発明に係わるキッ トは、 a p M l に対するモノ ク ロ ーナル抗体又はポ リ ク ロ一ナル抗体（抗 a p M l抗体）を 必須成分と して、 これと a p M l に対するポ リ ク ローナ ル抗体又はモノ ク ロ ーナル抗体のそれぞれとの組合わせ、 或いは上記モノ ク ローナル抗体どう しの組合わせを含有 するのが好ま しい。

上記モノ ク ローナル抗体は、 好ま し く は予め固定化さ れたプレー ト上の担体と結合させた固相化されたプレー ト形態と して用いられるのがよい。 また、 了フ ィ ニ ィ テ ィゲル形態と してそのまま用いる こ とでき、 また該ゲル を振とう及び遠心分離が可能であつてァフ ィ ニィ ティ ゲ ル非結合フラク シ ョ ンの抽出可能な適当な容器及至テス トチューブに調製して用いる こ ともできる。

また予め適当な緩衝液、 例えば 0. 0 1 M ト リ ス塩酸 緩衝液 （ p H 7. 4 )+ 0. 1 5 M N a C 1 等の緩衝液 で上記固相化プレー 卜又はゲルを平衡化してお く こ とも 好ま しい。 更に上記固相化プレー ト又はゲルには、 例え ばアジ化ナ ト リ ゥム等の通常の保存剤を含ませる こ とが できる。

更なる本発明キッ ト成分と して E L I S Aのための第 2抗体と して、 標識した抗ヒ ト a p M l ポ リ ク ロ一ナル 抗体を供給するのがよ り好ま しい。 尚、 本発明キッ トに は、 必要に応じてサッ カ ロースゃゥシ血清蛋白質等の安 定化剤及び Z又は保存剤を添加配合するこ とができる。 この保存剤はキッ 卜の使用に際し、 実験値に影響を与え ないものから選択され、 例えば代表的には希釈したアジ ィ匕ナ ト リ ゥム等を例示できる。

また本発明キッ トには、 水溶性も し く は水と混和し得 るグリ セ リ ン、 アルコール類、 グリ コール類、 グリ コェ 一テル類、 等を含有させる こ と、 及び脱脂質のためのェ タ ノ 一ゾレ と ジェチノレエ一 テノレ、 メ タ ノ ーノレと ジェチノレエ 一テル、 ク ロ口ホルムとメ タノ ールのような混合有機溶 媒等を含有させるこ と もできる。

ffiの な^ 月

図 1 は、 a p M 1遺伝子の塩基配列を含むプラス ミ ド の制限酵素地図を示す。

図 2 は、 組換え a p M 1 を用いて作製したスタ ンダー ドカーブを示す。

図 3 は実施例 3 に従って測定された a p M l の平滑筋 抑制作用を示すグラフである。 図 4 は実施例 4 に従って測定された冠動脈疾患患者及 び健常人の血中 a p M 1 レベルを示すグラフである。

図 5 は実施例 5 に従って測定された接着分子の細胞表 面での発現レベルを a p M l が濃度依存的に抑制するこ とを示すグラフである。

発明 実施するための最良の形態

以下、 本発明をよ り詳し く 説明するため実施例を挙げ るが、 本発明は之等に限定されない。

実施例 1

組換え apMlの製造

( 1 ) apMlの大腸菌での発現

1) apMl PCR

apMl遺伝子の塩基配列及び該遺伝子配列でコ 一 ドされ るア ミ ノ酸配列は、 ジーンノくンク（gene bank)にァクセッ シ ヨ ン番号 D 4 5 3 7 1 と して登録されている。 そのコ —ディ ング領域（C D S )は、 配列番号 2 7 〜 7 6 1 番目 に示されている。 その推定ア ミ ノ酸配列は配列番号 1 に 示すとおりである。 該配列において、 1 — 1 4番目はシ グナルぺプチ ドであり、 1 5 - 2 4 4番目が成熟型 apM 1 である。

apMl遺伝子は、 阪大第二内科船橋先生よ り供与された プラス ミ ドを铸型と して PCR法によ り増幅した。 apMl遺伝 子の塩基配列を含むプラス ミ ドの制限酵素地図を、 図 1 に示す。

PCRプライマーは、 apMl遺伝子の塩基配列のう ち、 69〜 761番の 693bpを増幅し、 その 5'末端に Nde Iサイ トを、 3' 末端に BamHIサイ トを増設するように設計し、 自動 D N A 合成機によ り製造した。 この PCRプライマ一の配列は、 配 列番号 3 (forward)及び 4 (reverse)に示す通り である。

2) apMl遺伝子のサブク ロ一ニング

上記 1)で得られた PCR産物を pT7 Blue T - Vector (ノバゲ ン（Novagen)社製）にサブク ロ一ニングし、 その塩基配列 (pT7- apMl)に変異がないこ とを確認した。

3) 発現べク タ一の構築

発現べク 夕一pET3c (ノバゲン社製）を Ndel及び BamHIで 消化し、 約 4600bpの断片得た。 また、 上記 1)で得た pT7- apMlを Ndel及び BamHIで消化し、 約 700bpの断片を得た。 これらの断片をライゲーシ ヨ ン し、 得られた発現べクタ 一を pET3c - apMlと した ₀

4) 大腸菌での発現

宿主大腸菌である BL21(DE3)pLysSを、 上記 3)で得た pET3c-apMl ' 卜ラ ンスフ 才 ーム しヽ 2xT. Y. Amp. ( 卜 リ ブ 卜 ン 1 6 g、 酵母抽出物 1 0 g及び N a C 1 5 g )で培養し た。 菌体が対数増殖期に入ったところで IPTG (イ ソプロ ピル 一 D —チォガラク ト ピラノ シ ド） を添加し、 組 換え apMlの生逢を誘導した。 IPTGによる誘導前後の大腸 菌及び IPTG誘導後のィ ンクルージ ョ ンボディ ー（大腸菌の 不溶性画分）をサンプリ ングし、 SDS- PAGE及びウェスタ ン ブロ ッテイ ングにより apMlの発現を確認した。

5) 結果及び考察

上記に従い大腸菌で発現した発現物は、 apMlのァ ミ ノ 酸配列において、 シグナル配列を除いた 15番 Glyから 244 番 Asnまでの 230ア ミ ノ酸で、 N端に開始コ ドン由来の Met が付加されている。 そのア ミ ノ 酸配列は、 配列番号 2 に 示される とおりである。

前述の方法で得られた大腸菌を SDS- PAGEで分析したと ころ、 IPTG誘導後の大腸菌及びイ ンクルージ ョ ンボディ —において約 30kDのバン ドが確認できた。

次に、 2種類の抗体（ポリ クローナル抗体（合成ペプチ ド）） でウェスタ ンブロ ッテイ ングを行ったところ、 両方の抗 体と もにその約 30kDのバン ドと反応しており、 宿主大腸 菌とは全く 反応は認められなかつた。

また、 この約 30kDのバン ドを切り 出 して N端 10ア ミ ノ酸 の配列を確認したところ、 予想された配列と同 じであり、 マイナー成分と して N端の Metがはずれている ものも確認 された。 以上の結果から、 約 30kDの蛋白質と して組換え apMlが 発現している こ とが明らかとなった。 また発現した組換 え apMlの殆どは、 イ ンクル一ジ ョ ンボディ 一と して菌体 内に蓄積されていた。

( 2 ) 組換え apMlの大腸菌からの精製

組換え apMlの大腸菌からの精製は、 以下の 5つのステツ プにて行った。

1) 大腸菌の培養

発現べク 夕一 pET3c-apMlで トラ ンスフ ォーム した大腸 菌 BL21(DE3)pLysS (ノノ ゲン社製）を 2χΤ· Y. Amp. Cm. (卜 プ ト ン 16g、 酵母抽出物 10g、 ク ロラ ムフ ヱニコ ール 25 ^ g/ml及び N a C 1 5g)で前培養（37°C、 振盪培養）し、 翌 日、 その培養液を 100倍量の 2xT. Y. Amp.で希釈して更に培 養した。 2〜3時間培養して培養液の OD550が 0.3〜0.5にな つたところで、 最終濃度 0.4m(iの IPTGを添加し、 組換え apMlの生産を誘導した。 IPTG添加後約 3〜 5時間で培養液 を遠心分離（5000rpm、 20分、 4°C )し、 得られた大腸菌の 沈殿を凍結保存した。

2) 大腸菌からのイ ンクルージ ョ ンボディ 一の調製

大腸菌の沈殿を 50mM Tris-HCl(pH8.0)に懸濁し、 リ ゾ チームで 37° (：、 1時間処理した後、 最終濃度 0.2%の ト リ ト ン X— 1 0 0 (TritonX- 100， 片山化学社製）を添加 した, その溶液を超音波処理（BRANSON SONIFIER, output

control 5, 30sec. )し、 遠心分離 （ 12000，、 30分、 4°C ) して沈殿を回収した。 その沈殿を 0.2% TritonX-100を添 加 した 50mM Tris- HCl(pH8.0)25mlに懸濁し、 超音波処理 (同上条件）を行った。

得られた溶液を遠心分離し、 沈殿を再度同様の操作で 洗浄し、 得られた沈殿をイ ンクル一ジ ョ ンボディ ーと し た。

3) イ ンクノレ一ジ ョ ンボディ 一の リ フ ォールデイ ング

イ ンクルージョ ンボディ 一を少量の 7M塩酸グァニジン， lOOmM Tris-HCl(pH8.0), 1% 2MEに可溶化した。 その溶液 を 200倍量の 2M Urea, 20raM Tris - HCl(pH8.0)に滴下して希 釈し、 4°Cで 3晚放置した。

4) リ フ ォールデイ ング溶液の濃縮

リ フ ォールデイ ングした溶液を遠心分離（9000rpni、 30 分間、 4°C)し、 得られた上清をア ミ コ ン YM-10メ ンブラ ン を用いた限外濾過で約 100倍に濃縮した。 その濃縮液を

20mM Tris - HCl(pH8.0)にて透析し、 0.45 mの フ イ ソレター で瀘過した。

5 ) DEAE- 5PWによる陰イオン交換 HPLC

上記 4)で得られたサンプノレを DEAE- 5PW (東ソ一社製）に よる陰イオン交換高速液体ク ロマ トグラフ ィ 一（HPLC)に よ り分離、 精製 した。 開始バッ フ ァ 一は 20mM Tris- HC1 (pH7.2)で、 溶出は 1M NaClのグラ ジ ェ ン ト （0→ 1M NaCl/ 60ral)で行い、 280nmの吸収でモニタ ー した。 フ ラ ク シ ョ ンは 1mlずつ行い、 各フ ラ ク シ ョ ンを SDS- PAGEして分析し た。

6) 結果および考察

組換え apMlは、 大腸菌にイ ンクル一 ジ ョ ンボディ 一と して発現 していたので、 精製に際 してはイ ンクルー ジ ョ ンボディ 一の可溶化及び リ フ ォ ールディ ングを行った。 その結果、 組換え apMlは可溶化され、 陰イ オ ン交換カラ ムで分離された。 その ピーク のフ ラ ク シ ョ ン（フ ラ ク シ ョ ン No.30- 37)を SDS- PAGEで分析した と こ ろ、 約 30kDの/ ン ドが観察された。 このと き、 ノ ッ ク グラ ウ ン ドに薄 く ス メ ァなバン ドが確認されたが、 蛋白質の殆どは組換え apMlである と考え られたので、 この約 30kDのノくン ド（組換 え apMl)を、 引き続 く ゥサギ及びマウスの免疫のための抗 原と して用いた。

( 3 ) apMlに対するポ リ ク ロ一ナル抗体及びモノ ク ロ一 ナル抗体の作製

1) ポ リ ク ローナル抗体の作製

組換え apMl 100 g/bodyを等量の コ ンプリ ー ト アジュ バン ト と混合 して 5匹のゥサギに 2週間おき に 8回免疫 して 抗 apMlポ リ ク 口 一ナル抗体（認識番号；OCT9101〜OCT9105) を得た。

2) モノ ク ローナル抗体の作製

組換え apMl 20 g/bodyを等量のコ ンプリ 一 トア ジュノ ン 卜 と混合 してマウスに 2週間おきに 3回免疫 し、 細胞融 合の 3日前にア ジュバン トな しで最終免疫 した。 マウス脾 臓 リ ンパ球と ミ エローマ細胞の細胞融合は PEG法にて行い、 HAT培地でハイ プ リ ドー マを選択した。

apMl抗体產生株のスク リ ーニ ングは、 抗原（組換え apM 1)をコ ーテ ィ ングしたィ ムノ プレー トを用いた ELISAで行 い、 限界希釈法でハイ ブ リ ドーマをク ローニングした。

かく して、 KOC09101- K0C09111と名付けた apMl抗体産生 ハイ ブ リ ドーマ 1 1株を得た。 その内の一つのハイ ブ リ ドーマ （受託者が付 した識別のための表示 ： KOCO9108) は、 1 9 9 8年 6月 8 日 （原寄託日 ） に、 日本国茨城県つ く ば市東 1 丁目 1番 3号に住所を有する通商産業省工業 技術院生命工学技術研究所に受託されてお り、 1 9 9 8 年 1 0月 7 日 に原寄託よ り ブダぺス ト条約に基づ く 寄託 への移管請求が受領された。 その受託番号は F E R M B P — 6 5 4 2 である。

シ ングルク ロー ンにな っ たハイ ブ リ ドー マをプリ スタ ン処理 したマウス腹腔内に投与 して腹水を得た（認識番号 ； ANOC9101〜 9111)。

3) 抗体の精製

得 られたゥサギ抗血清（ポ リ ク ローナル抗体）及びマウ ス腹水（モノ ク ローナル抗体）は、 プロテイ ン Aカ ラ ムで精 製 した。

4) apMlの動物細胞での発現

apMlの cDNAを EcoRIで切 り 出 し、 発現べク タ - pCIneo (プロメ ガ社製）の EcoRIサイ ト に挿入 した。 この pCIneo- apMlを GIBCO BRし社の U ipof ect AM I NEを用いて COS - 1細胞 (ATCC CRL1650)に ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン し、 72時間後の 培養上清及び細胞を回収 した。

5) apMlの ウェスタ ンブロ ッ テ ィ ング

最初に、 脂肪組織抽出液、 COS- 1細胞、 COS- 1細胞培養 上清、 健常人血漿、 組換え apMlを、 2ΜΕ('ι )で SDS- PAGEし、 ニ ト ロセソレロースメ ンブラ ンに ト ラ ンスフ ァ 一 した。

このメ ンブラ ンを apMlモノ ク 口一ナル抗体（ANOC9104) と反応させ、 次いで HRP標識抗体と反応させた後、 ECL (ァ マ シ ャ ム社製ウェスタ ンブロ ッ テ ィ ング検出試薬）を用い て検出を行っ た。

その結果、 脂肪組織抽出液、 pCIneo- apMl/COS- 1細胞及 び健常人血漿で約 35kDのバン ドが確認できたが、 pCIneo /COS - 1細胞及び pC I neo/COS-1細胞培養上清では確認でき な力、 つ た。

pCIneo- apMl/COS-1細胞培養上清では、 非常に薄く 見え に く いけれども、 35kDのバン ドを確認できた。

実施例 2

検体中 aplilの測定

1 ) apM 1のウェスタ ンブロ ッティ ング

健常人血漿を PBSで 10倍に希釈し、 その 5 1を 2ME ）、 (-)で SDS- PAGEして二 ト ロ セノレ 口 一 ス フ イ ノレタ ー に ト ラ ン スフ ァー した。 そのフ ィ ノレ夕一をブロ ッキングした後に 1000倍希釈した抗 apMlポ リ ク 口 一ナル抗体（0CT9101〜 9105)或ぃは5^ g/mlに調製した抗 apMlモノ ク ロ ーナル抗 体（ANOC9101〜 9111)と反応させ、 ついで HRP標識抗ゥサギ IgG抗体又は HRP標識抗マゥス IgG抗体と反応させて、 ECL によ り検出 した。

その結果、 全てのポ リ ク ロ一ナル抗体で 2ME( + )の場合 約 35kDの、 また 2ME (-)の場合約 70kDの、 apMlのノくン ドが 確認できた。 また、 モノ ク ローナル抗体の場合、

ANOC9104及び ANOC9108が apMlのノくン ドと強く 反応した。 こ のこ とから、 EL ISAに用いるモノ ク ローナル抗体は、 ANOC9104及び ANOC9108が適当である と考えられた。

2) apMl ELISAの作製

apMlモノ ク ロ ーナル抗体（ANOC9108)をィムノ プレー ト にコーティ ングし、 各ゥエルをブロ ッキングした後、 apMlのスタ ンダ一 ド及びサンプルを添加してィ ンキュベ — 卜 した。 プレー トの各ゥエルを洗浄し、 希釈した aplil ポ リ ク ローナル抗体（OCT9104)を添加 してィ ンキュベー ト した。 プレー トの各ゥエルを洗浄し、 希釈した HRP標識抗 ゥサギ IgG抗体を添加 してイ ンキュベー ト した。 プレー ト の各ゥエルを洗浄し、 0PDを用いてゥエルを発色させ、 492ηπιの吸収を測定した。 スタ ンダー ドの apMlには、 大腸 菌に発現した組換え apMlを精製し、 BSAを標準と したプロ ティ ンア ツセィ で蛋白質量を定量したものを用いた。

その結果、 上記 ANOC9108と OCT9104との組合せの検出範 囲は、 0. lng/ml〜 20ng/mlであった。

3) 正常人血漿のゲル濾過及びウェスタ ンブロ ッテイ ング 上記の apMl ELISAで正常人血漿を測定したと ころ、 ゥ エスタ ンブロ ッテイ ングの結果から考えられる濃度が得 られなかった。 そこで、 正常人血漿を Superosel2(フ ァル マシア社製）を用いてゲル濾過し、 各フラ ク シ ョ ンを SDS -PAGEして、 ANOC9104を用いたウェスタ ンブロ ッティ ング で分析した。 また、 分子量マーカーを同一条件でゲル濾 過し、 apMlの溶出 した位置と比較検討した。

その結果、 apMlは分子量 290kD以上のフラク シ ョ ンにブ ロー ドに溶出 していた。 このこ とから、 血中の apMlは他 の血漿成分と会合して 290kD以上の大きな分子を形成し、 そのために抗体の認識部位がマスク されている ものと考 えられた。 そこで、 SDSを含むバッ フ ァーで血清を処理す れば抗体が反応できるよう になるのではと考え、 次の検 討を行

4) 血漿サンプルの処理

血漿を SDSを含むバッ フ ァ ーで煮沸処理し、 それらの処 理条件（煮沸時間、 SDSバッ フ ァ 一との混合比）について検 討した。 煮沸時間については、 SDSバッ フ ァ一で 10倍に希 釈した正常人血漿を 10秒、 30秒、 1分、 3分、 5分、 10分間 それぞれ煮沸し、 血漿原液から最終 5000倍に希釈して apMlを測定した。 SDSバッ フ ァ一との混合比については、 正常人血漿を 2倍、 3倍、 5倍、 10倍、 20倍量の SDSバッ フ ァ 一にそれぞれ希釈したものを 5分間煮沸し、 最終 10000 . 倍に希釈して apMlを測定した。

その結果、 正常血漿のウェスタ ンブロ ッテイ ングの結 果と一致する程度の レベルで apMlが検出できた。 そのと きの処理条件を検討したところ、 血漿を SDSバッ フ ァ一で 10倍に希釈して 5分間煮沸処理するのが適当である と考え られた。

5) 血漿サンプルの希釈

apMl ELISAの検出範囲力 ^TOpg/nil^ SOng/mlであり、 apM lの血中濃度が μ gオーダ一である こ とから、 血清（血 漿）は希釈して測定する必要があるので、 適正な希釈倍率 を求めるために SDS処理した血漿を段階希釈して apM lを測 定した。 即ち、 正常人血漿を SDS処理し、 それを最終 200 倍から 10万倍まで段階希釈して apM lの測定を行つた。

その結果、 EL I SAの測定範囲内であれば希釈倍率に比例 して apM lが検出され、 その吸光度等から して最終 5000倍 程度で測定する こ とが適当であるこ とが判った。

6 ) 採血条件の検討

正常人の血液を血清、 へパリ ン、 EDTAの各採血条件で 採血し、 apM lを測定して採血条件の違いによる apM lの測 定値について検討した。 即ち、 正常人 10名についてそれ ぞれ採血し、 血清（血漿）を SDS処理して最終 5000倍に希釈 して apM lの測定を行つた。

その結果、 試験した正常人 10名の血液中 apM l測定値は、 これら血液の採血法による違いを、 ほとんど認められな 力、つた o

7 ) サンプルの保存条件の検討

apM l測定検体の保存条件の検討を、 血漿および SDS処理 後のサンプルについて行った。 血漿の保存条件と しては、 4°C、 室温、 37。Cで 1日、 2日、 3日、 6日間放置したものを また、 血漿の凍結融解による影響については、 1回、 2回、 4回、 8回の凍結融解を繰り返したものをそれぞれ SDS処理 し、 最終 5000倍に希釈して a pM lの測定を行った。 SDS処理 後のサンプルについては、 血漿を SDSバッ フ ァ一で 10倍に 希釈して 5分間煮沸処理し、 その溶液を 10倍に希釈したも のについて同様の実験を行った。

その結果、 上記条件では a_PM 1の測定値には殆ど影響は 見られなかった。 また、 同様に凍結融解に関しても血漿 および SDS処理後のサンプルで行ったが、 殆ど影響はなか つた。

8 ) 日内変動、 日差変動の検討

正常人の血清（血漿）中 apM lの測定における 日内変動お よび日差変動について検討した。 日内変動については、 同一の検体を 8重に測定して CV値を求めた。 また、 日差 変動については、 同一の検体を日を変えて 4回繰り返し測 定し CV値を求めた。

その結果、 日 内変動については CV値が 5 %以内で、 日差 変動に関 しては CV値が 10 %以内であつた。

9 ) 特異性の検討

ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ャギ、 ラ ッ ト、 マウスの血清につ いて apM l EL I SAを行い、 測定系の特異性について検討し た。 それぞれの動物の血清を SDSバッ フ ァ ーで処理し、 最 終 100倍から 8 100倍まで段階希釈して apM lの測定を行つた, その結果、 ゥシ、 ゥマにおいて 10%程度のク ロスが確認 されたが、 その他の動物においては殆ど確認されなかつ た。

実施例 3

a p M l の平滑筋増殖抑制作用

ヒ ト動脈平滑筋細胞（ク ローンテッ ク社製）を、 プラス チッ ク製プレー トに 1 X 1 0 ⁴ノじ111²の濃度で播種し、

1 0 % F B S (ギブコ社製）、 1 0 0 I U Z m 1 ぺニシ リ ン及び 1 O O ^ g Z m l ス ト レプ ト マイ シ ンを添加した D M E M (ギブコ社製） 中で一夜放置し、 3 7 °Cで 5 % C 0 ₂及び 9 5 %空気中で培養した。

ヒ ト動脈平滑筋細胞による D N A合成を、 〔メ チル ³ H〕 —チ ミ ジン取り込み量にて測定した（4 回繰り返し）。

即ち、 9 6 ゥエルプレー トに播種した細胞を、 2 % F B S添加 D M E M中で、 l O /^ g Z m l の a p M l及 び/又は対照のため 1 0 n g / m 1 の H B — E G F (組 換えヒ トへパ リ ン結合性 E G F様成長因子、 R & D シス テムズ社製） を用いて 2 4時間処理した。 次いで、 〔メ チル ³ H〕 —チ ミ ジンを 1 C i Zゥエルで 5 時間添加 し た。 処理細胞を ト リ プシ ン処理し、 ガラス繊維フ ィ ルタ 一上に自動細胞収穫機を用いて取り 出 し、 その後、 〔メ チル ³H〕 一チ ミ ジン取り込み量を直接； 8 —カウ ンタ一に て測定した。

結果を図 3 に示す。 該図は、 縦軸に相対 D N A合成比 をと り、 コ ン ト ロール（control, 何等の供試薬剤を用い ない場合）、 a p M 1添加の場合（本発明）、 H B - E G F 添加の場合（対照）及び a p M 1 + H B — E G F添加の場 合（本発明）の各結果を棒グラフにて示したものである。

該図よ り、 a p M l がヒ ト平滑筋細胞の D N A合成 (平滑筋の増殖） を抑制する作用を奏する こ とが明 らか である。 即ち、 a p M l の添加によれば、 コン ト 口一ノレ の D N A合成を有意 （ p く 0. 0 0 1 ) に抑制しており、 また H B — E G F添加によ り促進される D N A合成の場 合においても、 これを有意 （ p < 0. 0 0 1 ) に抑制す るこ とが明らかとなつた。

このこ とから、 a p M 1 は平滑筋増殖抑制組成物と し て有効である こ とが判る。

実施例 4

冠動脈疾患患者の血中 a p M 1 レベルの測定

冠動脈造影により Ί 5 %以上狭窄がある と認められた 患者 （ C A Dひ）と表示する） 男性 2 4名及び女性 1 0 名 及び 7 5 %までの狭窄しかない患者 （ C A D ( - )と表示） 男性 6 6名及び女性 3 9名につき、 それらの各血液を採 取し、 血漿中の a p M 1 レベルを、 実施例 2に記載した 本発明方法に従い測定した。

同時に、 各患者の臍の高さの位置で C Tをと り該 C T よ り各患者の腹腔内脂肪面積 （VFA， Visceral Fat Area, cm²) を算出 した。

血漿 a p M 1 レベル（ a g 1 )を縦軸と し、 V F A を横軸と して、 上記各測定値及び算出値の関連を、

C A D ( + )と C A D ( + )以外の値で対応しない t —検定に より評価した。 その結果を図 4 に示す。

該図よ り、 冠動脈疾患を有する患者 （ C A D ( + )) 群の a p M 1 レベルは、 腹腔内脂肪面積 （ V F A ) の大小に 関わりな く 低く、 このこ とから、 a p M l が高度の冠動 脈狭窄の存在の診断に有効であるこ とが判った。

また、 a p M l が動脈硬化症の発症、 進展の指標と し て重要であり、 その治療への応用における有用性が示唆 された。 a p M 1 の動脈硬化症発症抑制作用

9 6 ゥエルプレー トに播種したヒ ト大動脈血管内皮細 胞（HAEC: Human Arotic Vascular Endothelial Cells, ク ロネテイ ク ス社よ り購入）を、 血管内皮細胞培地中で培 養 （ 5 % C 0₂下、 3 7 °C ) した。 ベク 卜 ンディ ツキンソ ン社製 「バイオコー ト」 を用い、 コ ンフ リ ューエン ト (confluent)になるまで培養し、 その後培地を T C M

1 9 9 (tissue culture medium ··大阪大学微生物研究、 ナ 力ライテスク社） + 0. 5 % F C S (ゥ シ胎児血清 ： 日本 生物材料社製） + 3 % B S A (ゥシ血清アルブ ミ ン ： シ グマ社製） に変更した。

次いで、 実施例 1 で得られた組換え a p M 1 の 1、 5、 1 0、 2 5及び 5 0 / g Zm l を添加 し、 更に 1 8時間 培養し、 その後、 ヒ ト組換え T N F — （ R & D社製、 Tumor Necrosis Factor- a ： 10U/ml) を添力 Πし、 6 時間 培養した （ a p M l 添加の実験群） 。

また、 対照群と して、 上記組換え a p M 1 無添加群 ( T N F — α刺激のみ） を設けた。

上記 T N F — α による刺激で H A E C表面に発現する V C A M - 1 (Vascular Cell Adhesion Molecule - 1)、 E L A M (Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule)及 び I C A M— 1 ( Intercelular Adhes ion Molecule - 1)の 接着分子蛋白発現レベルを a p M l が抑制するかどうか をヽ eelト ELISA法 ( Takami, S. , et al. , Circuation, 9 7(8), 721- 728(1998))に従って検討した。 尚、 I C A M — 1 抗体と しては、 DAK0社の 6. 5 B 5を用いた。

a p M l 添加群と無添加群とを比較して有意差検定を、 ステュ一デン ト - テス ト（Student test)により行った。 V C A M - 1 についての結果を図 5 に示す。

図 5 において、 横軸は a p M 1 添加量 （ g Z m 1、 一は無添加を示す） を、 縦軸は T N F — α無刺激の場合 に H A E Cがその細胞表面に発現する接着分子蛋白

( V C A Μ - 1 ) の発現量を基準 （ 1 ) と して、 各実験 群及び対照群における同接着分子蛋白発現量の相対値を 示す。

図 5 よ り、 以下のこ とが判る。 即ち、 a p M l は 1 g Zm l の濃度から濃度依存的に、 H A E Cにおいて T N F — α刺激によ り増加した接着分子 V C A M— 1 の 発現を有意に抑制した （ p < 0. 0 5 ) 。

また、 他の主要な接着分子である E L A M I 及び

C A M— 1 の発現も、 a p M l が同様に抑制するこ と力 確認された。

血管内皮細胞の損傷とそれに伴われる単球の接着は、 動脈効果の発症に重要である こ とが報告されている

(Ross,R.， Nature, 362(6423), 801 -804(1993)) ₀ この 動脈効果の発症過程を規定する接着分子 （ V C A M - 1、 E L A M、 I C A M— 1 など） の発現を a p M l が抑制 したという事実は、 該 a p M 1 が動脈硬化の発症に抑制 的に作用する こ とを意味する ものであり、 このこ とから、 a p M 1 は動脈硬化症の予防剤と して有効であるこ とカ 明 らかとなつた。

産業上の利用の可能件.

本発明によれば、 a p M 1 を有効成分とする平滑筋増 殖抑制組成物、 血管内皮細胞における接着分子発現抑制 組成物が提供され、 これは医薬品分野で有用である。 ま た、 本発明によれば、 a p M 1 に特異的な抗体を利用 し た a p M 1 の測定技術が提供され、 これによつて、 動脈 硬化症の新しい診断方法が確立できる。

Claims

請 求 の 範 囲

1. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l 及び薬学的に許容 されるその塩から選ばれる少な く と も 1 種の薬学的有 効量を、 製剤学的に許容される担体と共に含有する平 ' 滑筋増殖抑制組成物。

2. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l 及び薬学的に許容 されるその塩から選ばれる少な く と も 1 種の薬学的有 効量を、 製剤学的に許容される担体と共に含有する動 脈硬化症予防及び治療組成物。

0 3. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M 1 及び薬学的に許容 されるその塩から選ばれる少な く と も 1 種の薬学的有 効量を、 製剤学的に許容される担体と共に含有する血 管再建術後の再狭窄予防及び治療組成物。

4. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l に対する抗体を有5 効成分と して含有する動脈硬化症の診断薬。

5. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l に対するモノ ク ロ —ナル抗体生産能を有し、 F E R M B P — 6 5 4 2 と して寄託されているハイブリ ドー マ K O C O

9 1 0 8₀

0 6. ハイブリ ドーマ Κ 0 C Ο 9 1 0 8 が産生する脂肪組 織特異的分泌因子 a p M 1 に対するモノ ク ロ ーナル抗 体。

7. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M 1 に対する抗体を有 効成分と して含有する動脈硬化症の診断用キッ ト。

8. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l及び薬学的に許容 されるその塩から選ばれる少な く とも 1 種の薬学的有 効量を、 平滑筋増殖抑制処置を要求される患者に投与 する、 平滑筋増殖抑制方法。

9. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l 及び薬学的に許容 されるその塩から選ばれる少な く と も 1 種の薬学的有 効量を、 動脈硬化症の処置を要求される患者に投与す る、 動脈硬化症の予防及び治療方法。

1 0. 脂肪組織特異的分泌因子 a p M 1及び薬学的に許 容されるその塩から選ばれる少な く と も 1 種の薬学的 有効量を、 血管再建術後の再狭窄予防及び治療の処置 を要求される患者に投与する、 血管再建術後の再狭窄 予防及び治療方法。

1 1. 検体中の脂肪組織特異的分泌因子 a p M l を、 脂 肪組織特異的分泌因子 a p M 1 に対する抗体を用いて 測定し、 測定値を健常者及び動脈硬化症患者の測定値 と対比して動脈硬化症を診断する動脈硬化症の診断方 法。

1 2. 平滑筋増殖抑制組成物の製造のための、 脂肪組織 特異的分泌因子 a p M 1 及び薬学的に許容されるその 塩から選ばれる少な く とも 1種の使用。

3. 動脈硬化症予防及び治療組成物の製造のための、 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l及び薬学的に許容さ れるその塩から選ばれる少な く とも 1種の使用。

4. 血管再建術後の再狭窄予防及び治療組成物の製造 のための、 脂肪組織特異的分泌因子 a p M l及び薬学 的に許容されるその塩から選ばれる少な く と も 1種の 使用。

5. 動脈硬化症診断薬の製造のための、 脂肪組織特異 的分泌因子 a p M 1 に対する抗体の使用。