WO1999062933A2 - Rational designte peptide, ihre herstellung und ihre verwendung - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries

Definitions

  • the invention relates to rationally designed peptides, their preparation and their use. Areas of application of the invention are medicine and the pharmaceutical industry.
  • DCM Dilated cardiomyopathy
  • *% AK + proportion of antibody-positive patients with the respective clinical diagnosis.
  • the procedure known as immunapheresis, removes all of the immunoglobulin from the body or the bloodstream.
  • target-specific autoantibodies only small portions of the body's immunoglobulin, so-called target-specific autoantibodies, could often be attributed to the cause of the disease.
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • the pathological autoantibodies are detected in a microscopic biological test on cultivated, neonatal, spontaneously contracting rat cardiac muscle cells. Their beat frequency increases in the presence of certain ß1 receptor-specific autoantibodies.
  • the aim of the invention is to provide new peptides suitable for the binding and removal of pathogenic autoantibodies. It is based on the task of developing an effective method for generating such peptides.
  • the invention is implemented according to the claims, the subclaims are preferred variants.
  • the method according to the invention for generating peptides which are suitable for binding autoantibodies is characterized by the following steps:
  • the physicochemical space which is the size of the number of amino acids of the peptide, represents not only the sequences "around the seed peptide", but the entire sequence space.
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • the amino acid sequences of the epitopes recognized by autoantibodies on the corresponding receptors are known in detail at DCM.
  • the natural sequences of the relevant receptor areas are used in order to use them after the solid phase coupling for the elimination of the autoantibodies from the blood plasma.
  • the natural amino acid sequence (10 amino acids; pos. 107-116: ARRC YNDPKC) or partial sequences thereof from Loop2 of the ⁇ 1-adrenergic receptor was selected as the original or seed peptide.
  • This epitope contains the autoimmunologically relevant structure. It is known to bind autoantibodies and if this peptide is added to an appropriate biological test system, the autoantibodies present in the test system can be neutralized. This peptide is also coupled in a solid phase, ie it recognizes and binds the corresponding ß1-adrenergic autoantibodies from immunoglobulin fractions from patients.
  • the natural peptide does not fully fulfill this task and has a low neutralizing capacity of the autoantibodies in the biological test.
  • the peptide from the Loop2 region of the ⁇ 1-adrenergic human receptor was the starting point for the search strategy to find a peptide with higher antibody binding efficiency.
  • an amino acid sequence was identified that does not occur in nature or has never been described in the corresponding databases.
  • variants of peptides were developed with the help of a special computer-aided computation method, which obey certain physicochemical laws and accordingly have different binding properties towards autoantibodies and immunoglobulins.
  • the peptide DRFGDKDIAF was identified, which no longer has any sequence similarity to the natural epitope (Loop2) and efficiently neutralizes the effect of the autoantibodies on the pulsation frequency of the heart muscle cells in the cell biological test used. With the help of this peptide, the binding and elimination of the Loop2-specific, ßl-adrenergic autoantibodies succeed.
  • a certain number of sequence variants (DCM project: 90 variants) is generated using a defined algorithm: each amino acid residue is described with suitable physicochemical parameters.
  • DCM seed peptide these were the properties 'volume' (1) and 'hydrophobicity' (libophobia) (2).
  • the variants of the seed peptide to be produced are now preferably taken from the closer environment of the seed peptide in the chemical space, but also include some peptides far from the seed peptide.
  • sequences were chosen so that their distances from the seed peptide in chemical space approximated a Gaussian distribution (or other localized distribution).
  • the rational approach here is that peptides with a similar or even higher activity (effect, property) can be expected in the immediate vicinity of the seed peptide in the chemical space (3).
  • a Gaussian distribution of peptides is very important for the next computer-aided design step, the development of sequence-activity relationships.
  • the new peptides generated in step 1 are examined for their activity (action, desired property) using a suitable test method.
  • Figure 1 shows the result: As the distance (Euclidean distance measure) from the seed peptide increases, the average activity of the peptide variants decreases. Two peculiarities can be found: on the one hand the average activity of the peptides closely adjacent to the seed peptide is above that of the seed peptide, and on the other hand there are significant activities far away from the seed peptide. This observation confirms the knowledge-based approach and the method for the systematic generation of peptide libraries: Several non-natural peptides with an increased ability to bind antibodies compared to the seed peptide were found.
  • sequence-activity relationships are modeled.
  • artificial neural networks are used for this.
  • the peptides generated in step 1 and tested in step 2 together with the seed peptide are numerically described with suitable physicochemical parameters (see step 1).
  • suitable physicochemical parameters see step 1.
  • a mathematical connection is established between the description of the properties of the peptides and their measured activity. This is an optimization process that is described in detail in the literature (4,5).
  • the consideration of both peptides with high activity and inactive peptides in this process is necessary for a meaningful modeling.
  • the defined selection of peptides in step 1 fulfills this requirement.
  • the neural network optimized in step 3 is used as a quality function for the computer-aided systematic search in the sequence space (amount of all possible peptides of a given one Length).
  • An evolutionary algorithm is used as a search strategy (this method is described in the literature (6)). The principle is as follows: In an iterative process, new variants of a parent peptide are generated by the computer program, then all variants are evaluated with regard to their ability to bind antibodies using the neural network (see step 3), and the best peptide variant (s) ) are selected as parent peptides for the next cycle.
  • the DCM project we received the sequence DRFGDKDIAF as the output of the computer program. The neural network calculated the highest activity for this peptide.
  • the sequence has an identity with the original seed peptide (see step 1) in only two positions (arginine-2, aspartic acid-7). 73% of all potentially strongly antibody-binding peptides have the Asp-7 residue according to the prediction of the neural network, 17% have an asparagine in position 7.
  • the system can also be used to generate peptides that do not have a certain property, therefore do not bind antibodies.
  • the sequence FVRRTYYPER was proposed as such by the computer system.
  • Test systems especially bioassays:
  • the peptides designed by the computer in step 4 are experimentally examined for their actual biochemical biological effect.
  • this test consisted of measuring the beat rate of embryonic rat myocytes with and without adding peptides to the medium.
  • the normal rate of increase of human antibodies against the ⁇ 1-adrenergic receptor was in the medium.
  • the exact test procedure for the DCM project is described in the literature (7).
  • the result corresponded to the expectations and predictions of the computer program:
  • the peptide DRFGDKDIAF was active, ie the rate of heart muscle cells increased by the pathogenic antibodies was depressed to the normal frequency, and the peptide FVRRTYYPER, which was designed as inactive, had no measurable effect (Figure 2) .
  • the peptide DRFGDKDIAF had more pronounced effects than the natural antigen of the ⁇ 1-adrenergic receptor at all peptide concentrations used (10 ⁇ g / ml, 1 ⁇ g / ml, 0.1 ⁇ g / ml).
  • the natural antigen had only a very weak effect (only 10% of the normal activity of the myocardial cells was observed), while the peptide designed according to the invention was able to restore 50% of the normal activity of the myocardial cells.
  • Literature :

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Abstract

Die Erfindung betrifft rational designte Peptide, ihre Herstellung und ihre Verwendung zu biotechnischen, medizintechnischen, diagnostischen und therapeutischen Zwecken. Das Verfahren zur Generierung von Peptiden, die zur Bindung von Autoantikörpern geeignet sind, ist gekennzeichnet durch Identifizierung eines Saatpeptids mit der geeigneten Aktivität; Erzeugung einer kleinen Auswahl von Peptidvarianten aus dem physikochemischen Raum um das Saatpeptid herum mit Hilfe eines computergestützten Rechenverfahrens; Synthese und Testung der Aktivität dieser Peptidvarianten; Modellierung einer quantitativen Sequenz/Aktivitäts-Beziehung mittels eines artifiziellen neuronalen Netzwerks; und Generierung von Peptiden durch simulierte Evolution im Sequenzraum mittels des trainierten neuronalen Netzwerks. Insbesondere handelt es sich um das Peptid DRFGDKDIAF.

Description

Rational designte Peptide, ihre Herstellung und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft rational designte Peptide, ihre Herstellung und ihre Verwendung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Die Reindarstellung von Biochemikalien, insbesondere von Immunglobulinen, nimmt eine zentrale Rolle bei der Bereitstellung von immunologischem Handwerkszeug im Labor ein. Hierzu gehören insbesondere die Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern, die entweder im Tier oder in der Zellkultur erzeugt wurden. Die Verwendung solcher immunologischer Biochemikalien hat in den letzten Jahrzehnten extrem zugenommen, und mit einer weiteren Verbreitung dieser immunologischen Werkzeuge in Medizin und Forschung ist zu rechnen.
Ähnliches gilt für die Bindung und Elimination von Antikörpern, insbesondere Autoantikörpern, als therapeutisches Prinzip bei einer Reihe von Krankheiten. Eine Elimination von Immunglobulinen aus dem Blutplasma und der darin enthaltenen Autoantikörper aus therapeutischen Zwecken hat sich bei solchen Krankheitsbildera wie Lupus erythematodes (SLE), idiopathische Thrombozytopenie, Vaskulitiden und dilatative Cardiomyopathie (DCM) bewährt.
In jüngster Zeit wurden weitere Krankheiten identifiziert, bei denen Autoantikörpern gegen definierte Rezeptoren eine pathogenetische Bedeutung zukommt. Bei verschiedenen Krankheiten wurden rezeptoraktive Autoantiköper gefunden (Tab.l). Als biologisches Signal zum Nachweis der Autoantikörper wurde die Änderung der spontanen Schlagfrequenz von neonatalen Rattenherzmuskelzellen verwendet. Der Tabelle 1 sind Krankheiten zu entnehmen, bei denen eine Beteiligung von Autoantikörpern gegen Rezeptoren diskutiert wird.
Tabelle 1
KRANKHEIT REZEPTOR *%AK+
1. Dilatative Cardiomyopathie (DCM) ßl-adrenerg > 80
2. Myocarditis (MC) ßl-adrenerg > 80
3. Chagas-Disease ßl-adrenerg 100
4. Herzarrhythmien ßl-adrenerg >70
5. Chagas-Disease muskarinerg-2 (M2) ?
6. Dilatative Cardiomyopathie muskarinerg-2 (M2) ?
7. allergisches Asthma ß2-adrenerg >70
8. allergische Rhinitis ß2-adrenerg ?
9. Hypertonie al-adrenerg 30-40
10. Psoriasis vulgaris al-adrenerg ca. 80
11. Präeklampsie Angiotensinll- AT 1 > 80
12. maligne Hypertonie Angiotensinll- AT 1 ?
*%AK+ : Anteil von Antikörper-positiven Patienten mit der jeweiligen klinischen Diagnose.
Referenzen: zu 1. : Wallukat et al., Biomed.Biochem.Acta 1987, 8193, 634-9; zu 2. : Wallukat et al., Biomed.Biochem.Acta 1987, 8193, 634-9; zu 3. : Ferrari et al., J.Exp.Med. 1995, 182: 55-65; zu 4. : Wallukat et al., noch unveröffentlicht zu 5. : Ferrari et al., J.Exp.Med. 1995, 182: 55-65; zu 6. : Fu et al., J.Clin.Invest. 1993,91: 1964-8; zu 7. : Wallukat et al., J.AUerg.a.Clin.Immunol. l991,88:581-7; zu 8. : Wallukat et al., J.AUerg.a.Clin.Immunol.1991,88:581-7; zu 9. : Fu et al., Lancet 1994, 3440: 1660-3; zulO. : Wallukat et al.,CongressAbstr.,J.Molec.Cell.1998 im Druck; zull. : Wallukat et al.,1998, im Druck; zul2. : Fu et al., 1998, Circulation Abstr. 94:4046
Obwohl man eine Reihe von Targets der im Blut solcher Patienten vorhandenen Autoantikörpern kennt, wird derzeit noch das gesamte Immunglobulin der Patienten aus dem Blutplasma und dem Körper entfernt, mit ihnen also auch die Autoantikörper.
Nach jüngst veröffentlichten Studien ist diese Elimination von Immunglobulinen und damit auch von Autoantikörpern effektiv und leistet einen erheblichen Beitrag zur Regeneration der autoimmunologisch betroffenen und geschädigten Organe und Gewebe, zur drastischen Reduktion von klinischen Symptomen, mitunter sogar zur Heilung der Patienten. Besonders gut dokumentiert ist der therapeutische Nutzen der Elimination von ßl-adrenerg wirkenden Autoantikörpern bei der Dilatativen Cardiomyopathie (DCM).
Das als Immunapherese bezeichnete Verfahren entfernt das gesamte Immunglobulin aus dem Körper bzw. dem Blutkreislauf. Hingegen könnten für die Entstehung der Krankheit oft nur kleine Teilmengen vom Immunglobulin des Körpers, sog. Target-spezifi-schen Autoantikörpern, eine Ursache der Krankheit zuzuschreiben sein.
Dies ist am besten bei der dilatativen Cardiomyopathie (DCM) untersucht. Forschungsergebnisse der letzten Jahre zeigten, daß insbesondere zwei Epitope auf extrazellulären Loops des ßl-adrenergen Rezeptors von Herzmuskelzellen an der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Wenn der Organismus gegen diese Autoantikörper produziert, tragen diese offensichtlich kausal zur Entstehung der Krankheit bei. Somit ist ein therapeutischer Erfolg durch eine Immunadsorption auch zu erwarten, wenn spezifisch die daran beteiligten Autoantikörper mit ßl-adrenerger Wirkung entfernt würden.
Der Nachweis der pathologischen Autoantikörper erfolgt dabei in einem mikroskopischen biologischen Test an kultivierten, neonatalen, spontan kontrahierenden Rattenherzmuskelzellen. Deren Schlagfrequenz erhöht sich bei Anwesenheit von bestimmten ßl-Rezeptor-spezifischen Autoantikörpern. Mit den gegenwärtig vorhandenen medizintechnischen Verfahren ist es jedoch noch nicht möglich, spezifisch die an der Pathogenese der Krankheiten beteiligten Autoantikörper zu entfernen. Dies ist der Fall, obwohl man in einigen dieser Fälle die Targets der Autoantikörper kennt bzw. beschrieben hat. Es handelt sich in diesen speziellen Fällen um Autoantikörper, die sich gegen Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen bestimmter Organe richten.
Die Erfindung hat das Ziel, neue zur Bindung und Entfernung von pathogenen Autoantikörpern geeignete Peptide bereitzustellen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein effektives Verfahren zur Generierung solcher Peptide zu entwickeln.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Generierung von Peptiden, die zur Bindung von Autoantikörpern geeignet sind, ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:
- Identifizierung eines Saatpeptids mit der geeigneten Aktivität,
- Erzeugung einer kleinen Auswahl von Peptidvarianten aus dem physikochemischen Raum um das Saatpeptid herum mit Hilfe eines computergestützten Rechenverfahrens,
- Synthese und Testung der Aktivität dieser Peptidvarianten,
- Modellierung einer quantitativen Sequenz/ Aktivitäts-Beziehung mittels eines artifiziellen neuronalen Netzwerks und
- Generierung von Peptiden durch simulierte Evolution im Sequenzraum mittels des trainierten neuronalen Netzwerks.
Der physikochemische Raum, der sich in seiner Größe aus der Zahl der Aminosäuren des Peptids ergibt, repräsentiert nicht nur die Sequenzen "um das Saatpeptid herum'', sondern den gesamten Sequenzraum.
Die Erfindung wird im folgenden am Beispiel der Dilatativen Cardiomyopathie (DCM) näher erläutert:
Die Aminosäuresequenzen der durch Autoantikörper erkannten Epitope auf den entsprechenden Rezeptoren sind bei der DCM im Detail bekannt. Es werden die natürlichen Sequenzen der betreffenden Rezeptorareale verwendet, um diese nach Festphasenkopplung zur Elimination der Autoantikörper aus dem Blutplasma zu verwenden. Es wurde die natürliche Aminosäuresequenz (10 Aminosäuren; pos. 107-116: ARRC YNDPKC) oder Teilsequenzen davon vom Loop2 des ßl-adrenergen Rezeptors als Ursprungs- oder Saatpeptid ausgewählt. Dieses Epitop enthält die autoimmunologisch relevante Struktur. Von ihr ist bekannt, daß sie Autoantikörper bindet, und wenn man in einem entsprechenden biologischen Testsystem dieses Peptid hinzufügt, kann man die Wirkung der im Testsystem vorhandenen Autoantikörper aufheben. Dieses Peptid ist auch Festphasen-gekoppelt wirksam, d. h. es erkennt und bindet aus Immunglobulinfraktionen von Patienten die entsprechenden ßl-adrenerg wirkenden Autoantikörper.
Aufgrund der physikochemischen Eigenschaften der Autoantikörper erfüllt das natürliche Peptid diese Aufgabe nicht in vollem Umfang und hat im biologischen Test ein geringe Neutralisationskapazität der Autoantikörper.
Das Peptid aus der Loop2-Region des ßl-adrenergen humanen Rezeptors war Ausgangspunkt für die Suchstrategie zur Auffindung eines Peptides mit höherer Antikörperbindungseffizienz. Überraschenderweise wurde eine Aminosäuresequenz identifiziert, die in der Natur nicht vorkommt bzw. in den entsprechenden Datenbänken noch nie beschrieben wurde.
Ausgehend vom Saatpeptid wurden mit Hilfe eines speziellen computergestützten Rechenverfahrens Varianten von Peptiden entwickelt, die bestimmten physikochemischen Gesetzmäßigkeiten gehorchen und entsprechend unterschiedliche Bindungseigenschaften gegenüber Autoantikörpern und Immunglobulinen haben.
Das Ausmaß der Bindung von Antkörpern an diese vom Computer vorgeschlagenen Peptide bzw. Aminosäuresequenzen wiederum bilden die Grundlage für die Berechnung von weiteren Peptiden, die die Bindung der Autoantikörper an die Peptide stufenweise optimieren.
Die Daten aus diesen Experimenten wurden wiederum nach vorgegebenen Optimierungskriterien verarbeitet. Im Ergebnis wurde eine Aminosäuresequenz berechnet, die, im Experiment geprüft, dem natürlichen Peptid überlegene Neutralisationseigenschaften gegenüber der biologischen, zellphysiologischen Wirkung von ßl-adrenergen
Autoantikörpern aufweist. Erfindungsgemäß wurde das Peptid DRFGDKDIAF identifiziert, welches keinerlei Sequenzähnlichkeit mehr mit dem natürlichen Epitop (Loop2 ) hat und in dem eingesetzten zellbiologischen Test die Wirkung der Autoantikörper auf die Pulsationsfrequenz der Herzmuskelzellen effizient neutralisiert. Mit der Hilfe dieses Peptids gelingt die Bindung und Elimination der Loop2-spezifischen, ßl-adrenerg wirkenden Autoantikörper.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Beispiel
Schritt 1:
Erzeugung von f okulierenden synthetischen Peptidbibliotheken:
Ausgehend von einem Saatpeptid (im Fall des DCM-Projektes die Sequenz ARRCYNDPKC) wird eine bestimmte Anzahl von Sequenzvarianten (DCM-Projekt: 90 Varianten) mittels eines festgelegten Algorithmus erzeugt: Jeder Aminosäurerest wird mit geeigneten physikochemischen Parametern beschrieben. Im Fall des DCM Saatpeptids waren dies die Eigenschaften 'Volumen' (1) und Ηydrophobizität' (Libophobie) (2). Dies führt zu einer mehrdimensionalen numerischen Beschreibung von Peptiden, also zur Definition eines bestimmten chemischen Raumes. Die zu erzeugenden Varianten des Saatpeptids werden nun bevorzugt aus der engeren Umgebung des Saatpeptids im chemischen Raum entnommen, aber umfassen auch einige weit vom Saatpeptid entfernte Peptide. Die Sequenzen wurden so ausgewählt, daß deren Abstände zum Saatpeptid im chemischen Raum einer Gaußverteilung (oder einer anderen lokalisierten Verteilung) angenähert wird. Der rationale Ansatz dabei ist, daß Peptide mit einer ähnlichen oder sogar höheren Aktivität (Wirkung, Eigenschaft) in der unmmittelaren Nähe um das Saatpeptid im chemischen Raum erwarten werden können (3). Zudem ist eine Gaußverteilung von Peptiden sehr wichtig für den nächsten rechnergestützten Schritt des Designs, der Entwicklung von Sequenz-Wirkungsbeziehungen.
Schritt 2:
Synthese und Test der neuen Peptidvarianten:
Die in Schritt 1 erzeugten neuen Peptide werden mit einem geeigneten Testverfahren auf ihre Aktivität (Wirkung, gewünschte Eigenschaft) untersucht. Im Fall des DCM-Projekts war dies ein ELISA System, welches die Bindung von Peptiden an humane Antikörper gegen den ßl-adrenergen Rezeptor messen konnte. Abbildung 1 zeigt das Ergebnis: Mit steigendem Abstand (Euklidisches Distanzmaß) vom Saatpeptid sinkt die mittlere Aktivität der Peptidvarianten. Zwei Besonderheiten sind zu finden, einmal liegt die mittlere Aktivität der dem Saatpeptid eng benachbarten Peptide über derjenigen des Saatpeptids, zum anderen gibt es weit entfernt vom Saatpeptid wiederum signifikante Aktivitäten. Diese Beobachtung bestätigt den wissensbasierten Ansatz und das Verfahren für die systematische Erzeugung von Peptidbibliotheken: Mehrere nicht-natürliche Peptide mit einer im Vergleich zum Saatpeptid erhöhten Fähigkeit, Antikörper zu binden, wurden gefunden.
Schritt S.¬ Entwicklung von Sequenz- Wirkungsbeziehungen:
Um eine weitere systematische Suche im Raum aller möglichen Sequenzen nach Peptiden mit einer gewünschten Antikörperbindungseigenschaft zu ermöglichen, werden Sequenz- Wirkungsbeziehungen modelliert. Hierfür werden insbesondere künstliche neuronale Netze eingesetzt. Die in Schritt 1 erzeugten und in Schritt 2 getesteten Peptide zusammen mit dem Saatpeptid werden dazu mit geeigneten physikochemischen Parametern numerisch beschrieben (siehe Schritt 1). Mit Hilfe des neuronalen Netzes wird ein mathematischer Zusammenhang zwischen der Eigenschaftsbeschreibung der Peptide und deren gemessenen Aktivität hergestellt. Dies ist ein Optimierungsprozeß, der eingehend in der Literatur beschrieben ist (4,5). Die Berücksichtigung sowohl von Peptiden mit hoher Aktivität als auch inaktiver Peptide in diesen Prozeß ist notwendig für eine sinnvolle Modellierung. Die definierte Auswahl von Peptiden in Schritt 1 erfüllt diese Voraussetzung. Im DCM-Projekt lag der Fehler der modellierten Sequenz- Wirkungsbeziehung für die Trainingdaten bei nur 15%, in der Kreuzvalidierung bei 17%. Diese Werte entsprechen den Meßfehlern in Schritt 2. Aus diesem Ergebnis kann gefolgert werden, daß das neuronale Netz einen sinnvollen mathematischen Zusammenahng zwischen einer Aminosäuresequenz und deren Eigenschaft, Antikörper zu binden, hergestellt hat.
Schritt 4:
Rechnergestützte Suche nach neuen Peptiden mit gewünschten Eigenschaften:
Das in Schritt 3 optimierte neuronale Netz wird als Gütefunktion zur rechnergestützten systematischen Suche im Sequenzraum (Menge aller möglichen Peptide einer vorgegebenen Länge) verwendet. Ein evolutionärer Algorithmus wird als Suchstrategie verwendet (diese Methode ist in der Literatur beschrieben (6)). Das Prinzip ist folgendes: In einem iterativen Prozeß werden vom Rechnerprogramm neue Varianten eines Elternpeptids erzeugt, anschließend mit Hilfe des neuronales Netzes (siehe Schritt 3) alle Varianten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Antikörper zu binden, bewertet, und die beste(n) Peptidvariante(n) werden als Elternpeptide für den nächsten Zyklus ausgewählt. Im DCM-Projekt erhielten wir die Sequenz DRFGDKDIAF als Ausgabe des Rechnerprogramms. Für dieses Peptid berechnete das neuronale Netz die höchste Aktivität. Die Sequenz weist in nur zwei Positionen (Arginin-2, Asparaginsäure-7) eine Identität mit dem ursprünglichen Saatpeptid (siehe Schritt 1) auf. 73% aller potentiell stark an Antikörper bindende Peptide haben den Asp-7 Rest gemäß der Vorhersage des neuronalen Netzes, 17% haben ein Asparagin in Position 7. Das System kann auch dazu verwendet werden, Peptide zu erzeugen, die eine bestimmte Eigenschaft nicht aufweisen, also keine Antikörper binden. Die Sequenz FVRRTYYPER wurde als eine solche vom Rechnersystem vorgeschlagen.
Schritt 5:
Überprüfung der Aktivität der entworfenen (designten) Peptide in geeigneten
Testsystemen, insbesondere Bioassays:
Die in Schritt 4 vom Rechner entworfenen Peptide werden bezüglich ihrer tatsächlichen biochemischen biologischen Wirkung experimentell untersucht. Im Beispiel des DCM- Projektes bestand dieser Test in der Messung der Schlagrate von embryonalen Ratten- Myozyten mit und ohne Peptidzugabe in das Medium. Im Medium befanden sich die normale Schlagrate erhöhende humane Antikörper gegen den ßl-adrenergen Rezeptor. Das genaue Testverfahren für das DCM-Projekt ist in der Literatur beschrieben (7). Das Ergebnis entsprach den Erwartungen und den Vorhersagen des Rechnerprogramms: Das Peptid DRFGDKDIAF war aktiv, d.h. die durch die pathogenen Antikörper erhöhte Schlagrate der Herzmuskelzellen wurde auf die normale Frequenz gedrückt, und das als nicht aktiv entworfene Peptid FVRRTYYPER zeigte keine meßbare Wirkung (Abbildung 2). Das Peptid DRFGDKDIAF wies deutlichere Effekte auf als das natürliche Antigen des ßl-adrenergen Rezeptors bei allen verwendeten Peptidkonzentrationen (10 μg/ml, 1 μg/ml, 0,1 μg/ml). Bei der Konzentration von 0,1 μg/ml hatte das natürliche Antigen nur noch sehr schwache Wirkung (nur 10% der normalen Aktivität der Myokardzellen wurde beobachtet), während das erfindungsgemäß designte Peptid in der Lage war, 50% der Normalaktivität der Myokardzellen wiederherzustellen. Literatur:
1. Harpaz, Y., Gerstein, M., Chothia, C. (1994) Struture 2, 641-649
2. Engelmann, D. A., Steitz, T. A., Goldman, A. (1986) Annu. Rev. Biosphys. Chem. 15, 321-353.
3. Eigen, M., McCaskilly und Schuster, P., (1988) J. Phys. Chem. , Vol. 92, 6881.
4. Schneider. G., Wrede P. (1993) J. Mol. Evol. 36, 586-595.
5. Schneider. G., Wrede P. (1998) Prog. Biophys. Mol. Biol., im Druck.
6. Schneider. G., Wrede P. (1994) Biophys. J. 66, 335-344,
Schneider. G., Schuchhardt, J., Wrede P. (1995) Biophys. J. 68, 434-447,
7. Wallukat, G., WoUenberger, A., Morwinski, R., Pitschner, H.-F. (1995) J. Mol. Cell. Cardiol. 27, 397-406.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Generierung von Peptiden, die zur Bindung von Autoantikörpern geeignet sind, gekennzeichnet durch folgende Schritte
- Identifizierung eines Saatpeptids mit der geeigneten Aktivität,
- Erzeugung einer kleinen Auswahl von Peptidvarianten aus dem physikochemischen Raum um das Saatpeptid herum mit Hilfe eines computergestützten Rechenverfahrens,
- Synthese und Testung der Aktivität dieser Peptidvarianten,
- Modellierung einer quantitativen Sequenz/ Aktivitäts-Beziehung mittels eines artifiziellen neuronalen Netzwerks und
- Generierung von Peptiden durch simulierte Evolution im Sequenzraum mittels des trainierten neuronalen Netzwerks.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung des Saatpeptides durch Bestimmung von Teilsequenzen der nativen Gesamtsequenz erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erzeugung der kleinen Auswahl von Peptidvarianten nach Beschreibung von physikochemischen Parametern jeder Aminosäure einzeln und in ihrer Wechselwirkung zu den benachbarten Aminosäuren mittels eines Algorithmus erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Generierung von Peptiden zur Bindung von krankheitsspezifischen Autoantikörpern.
5. Verfahren nach Anspruch 1 zur Generierung von Peptiden mit Antikörperneutralisierender Wirkung in Rezeptor-spezifischen zellbiologischen Tests.
6. Verfahren zur Generierung von Peptiden, die zur Bindung von ßl-adrenerg wirkenden Autoantikörpern geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß
- die natürliche Aminosäuresequenz ARRCYNDPKC vom Loop 2 des ß-adrenergen Rezeptors oder Teilsequenzen von ihr als Saatpeptid eingesetzt wird, - die Eigenschaften 'Volumen' und 'Hydrophobizität' jedes Aminosäurerestes zur Definition des chemischen Raums um das Saatpeptid herum verwendet werden,
- eine Auswahl von 50-120 Peptidvarianten aus diesem Raum analog zu einer Gaußverteilung erfolgt,
- diese Sequenzen synthetisiert und bezüglich ihrer ß-adrenergen Aktivität getestet werden,
- die Modellierung einer quantitativen Sequenz/ Aktivitätsbeziehung mittels eines an sich bekannten neuronalen Netzwerks erfolgt,
- mittels einer Suchstrategie mit dem Kriterium Antikörper-Bindungsfähigkeit weitere Sequenzen berechnet,
- ihre ß-adrenerge Aktivität bestimmt und die aktivste Sequenz DRFGDKDIAF ermittelt wird.
7. Verwendung der nach Anspruch 1-6 generierten Peptide zu biotechnischen, medizintechnischen, diagnostischen und therapeutischen Zwecken.
8. Verwendung der gemäß Anspruch 1 bis 6 generierten Peptide zu biotechnischen, medizintechnischen und therapeutischen Zwecken zur Bindung und Elimination von Autoantikörpern bei Krankheiten, die mit rezeptor-, gewebs- oder organspezifischen Autoantikörpern assoziiert sind.
9. Verwendung der gemäß Anspruch 1 bis 6 generierten Peptide zu biotechnischen, medizintechnischen und therapeutischen Zwecken, zur Bindung und Elimination von Autoantikörpern bei dilatativer Cardiomyopathie, Myocarditis, Chagas Disease und Herzarrhythmien
10. Verwendung der gemäß Anspruch 1 bis 5 generierten Peptide zu biotechnischen, medizintechnischen und therapeutischen Zwecken, zur Bindung und Elimination von Autoantikörpern bei allergischem Asthma, allergischer Rhinitis, Hypertonie, Psoriasis vulgaris Präeklampsie und anderen Autoimmunerkrankungen, an denen Autoantikörper gegen relevante biologische Targets, wie z.B. Rezeptoren, beteiligt sind.
11. Verwendung von designten Peptiden gemäß Anspruch 7 bis 10 nach Matrixkopplung.
12. Verwendung von designten Peptiden gemäß Anspruch 7 bis 11 nach Derivatisierung und Ligandierung.
13. Verwendung von designten Peptiden gemäß Anspruch 7 bis 12 nach homologer oder heterologer Zyklisierung.
14. Verwendung von designten Peptiden gemäß Anspruch 7 bis 13 unter Nutzung von D- oder L- sowie D- und L- Aminosäuren.
15. Verwendung von designten Peptiden gemäß Anspruch 7 bis 14 in Verbindung bzw. Gemischen mit Peptiden aus natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzen.
16. Peptid DRFGDKDIAF.
17. Verwendung des Peptids nach Anspruch 15 und 16 zur Bindung und Elimination von ßl-adrenerg wirkenden Autoantikörpern.
18. Verwendung des Peptids nach Anspruch 16 in Kombination mit weiteren natürlichen oder designten Peptiden nach Anspruch 15.
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