DD297652A5 - Verfahren zur herstellung von polypeptiden, die als blocker von calcium-kanaelen verwendbar sind - Google Patents
Verfahren zur herstellung von polypeptiden, die als blocker von calcium-kanaelen verwendbar sind Download PDFInfo
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Abstract
Diese Erfindung betrifft ein Polypeptid, das im Gift der Spinne Agelenopsis aperta vorhanden ist und Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche Aminosaeuresequenz und im wesentlichen die gleiche Wirksamkeit des Polypeptids haben. Die Polypeptide dieser Erfindung und die Salze davon blockieren Calcium-Kanaele in Zellen von vielen Organismen und sind per se verwendbar zum Blockieren der Calcium-Kanaele in Zellen, bei der Behandlung von durch Calcium-Kanaele bewirkten Krankheiten und Zustaenden und bei der Bekaempfung von wirbellosen Schaedlingen. Diese Erfindung trifft auch Zusammensetzungen, die die Polypeptide und die Salze davon aufweisen.{Polypeptidblocker; Calcium-Kanaele; Bekaempfung von wirbellosen Schaedlingen; Spinnengift; Agenelopsis aperta}
Description
Diese Erfindung betrifft ein Polypeptid, das im Gift der Spinne Agelenopsis aperta gefunden wurde und Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und im wesentlichen die gleiche Aktivität wie das Polypeptid haben. Die Polypeptide und die pharmazeutisch geeigneten Salze davon blockieren Calcium-Kanäle in Zellen, einschließlich der neuronalen und Muskel-Zellen von verschiedenen Organismen, einschließlich der wirbellosen Tiere und der Wirbeltiere. Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung der Polypeptide und ihrer Salze zum Blockieren von Calcium-Kanälon in Zellen, z. B. Zellen im nervösen und muskulären System eines Organismus, per se; in der Behandlung von Calcium-Kanal vermittelten Krankheiten und Bedingungen in einem Säugetier; und in der Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen. Ferner betrifft diese Erfindung Zusammensetzungen, die die Polypeptide und die Salze davon aufweisen.
Es ist berichtet worden, daß das Gift der Spinne Agelenopsis aperta mindestens zwei Toxine enthält, die Calcium-Ströme beeinflussen, Jackson, H., et al., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12:1078 (1987). Diese Autoren offenbaren ein Toxin, hier AG 2 bezeichnet, das ein Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton hat und Calcium-Ströme in einer großen Auswahl von Geweben unterdrückt. Ferner berichten Jackson, H., et al., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12:730 (1986) von einem anderen Toxin aus Agelenopsis aperta, das eine Komponente von etwa 6000 M. W. aufweist. Von dem Toxin wird berichtet, daß es eine präsynaptische Blockade der Übertragung bewirkt und es ist vermutet worden, daß das Toxin Calcium-Kanäle blockiert, die mit der Freisetzung von Neurotransmittern verbunden sind.
Bestimmte Polypeptide, die im Gift der Spinne Agelenopsis aperta vorhanden sind, sind in der am 28.April 1989 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 07/346,181 offenbart. Diese Polypeptide sind darin als Blocker von Calcium-Kanälen in Zellen offenbart und werden wie folgt, entsprechend den Fraktionen, in denen sie gefunden wurden, beschrieben:
Fraktion Q:
trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-;
Fraktion H1:
HjN-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cysile-cys-arg-asn-asn-asn-CONHj: FAB MS: 4198.
Fraktion H2:
gly-his-phe-thr-gly-glu-; Molekulargewicht des vollständigen Polypeptids gemäß FAB MS: 5494.
Fraktion I:
HjN-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cysile-cys-val-asn-asn-asn-CONH2; FAB MS: 4158.
Fraktion J:
fyN-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys^ys-thr-his-pro-asp-asp-ala-;
Fraktion K:
HjN'glu-asp-asn-cys-ile-ala-glu-asp-tyr-gly-iys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lys-cys-cys-arg-gly-arg-pro-cys-arg-cys-ser-met-ile-glythr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-ser-phe-ala-CONH2; FAB MS: 5274.
Fraktion L1:
"ine amino-terminale Aminosäuresequenz, aufweisend:
HjN-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-; ungefähres Molekulargewicht des vollständigen Polypeptids etwa 20000.
Fraktion L2:
(a) es ist vorhanden in siner Fraktion des Rohgiftes der Spinne Agelenopsls aperta, die von einer C-18 Vydac*-Säule, 22 mm χ 250 mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 15ml/mln, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradientenprogramm von 5% -> 20% B, 95% -* 8C% A (0 -> 30min), dann 20% -»70% B, 80% -> 30% A (30 -> 55min), wobei A 0,1%ige wäßrige TFA und B Acetonitril ist, nach etwa 43 Minuten eluiert; und
(b) es ist vorhanden in einer Fraktion der oben beschriebenen Fraktion (a), die von einer C-18 Vydac*-Säule, 10mm x 250 mm, 300Ä Porongröße, 5μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 3,5ml/min mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradiüntenprogramm von 25% -»40% B, 75% -» 60% A (0 -> 30min), wobei A 0,1%ige wäßrige TFA und B Acetonitril ist, nach etwa 22,5 Minuten eluiert.
Fraktion M:
HiN-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-; ungefähres Molekulargewicht des vollständigen Polypeptids etwa 80000.
Verbindungen, die Calcium-Antagonisten sind, haben eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Calcium-Antagonisten können unter anderem in der Behandlung von Zuständen wie Angina, Hypertonie, Kardiomyopathien, supraventrikulärer Arrhythmien, Ösophagusachalasie, Frühgeburten und Raynaudscher Krankheit klinische Anwendung finden. Siehe W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Bt ace Javanovich Publishers, New York, NY1988, deren Lehre hier durch Querverweis aufgenommen wird. Ferner sind solche Verbindungen nützlich im Studium der Physiologie von Zellen, z.B. neuronalen und Muskel-Zellen, und in der Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen.
Diese Erfindung betrifft ein Polypoptid, das im Gift der Spinne Agelenopsis aperta vorhanden ist. Das Polypeptid dieser Erfindung und die Fraktion, in der es erfindungsgemäß vorhanden ist, ist wie folgt:
Fraktion Q:
(a) es ist vorhanden in einer Fraktion des Rohgiftes der Spinne Agelenopsis aperta, die von einer C-18 Vydac*-Säule, 22mm χ 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate vo.i 15ml/min, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradisntenprogramm von 5% —» 20% B (0 -> 30min), dann 20% —» 70% B (30 -» 55min), wobei A 0,1%ige wäßrige Trifluoressigsäure (TFA) und B Acetonitril ist, nach etwa 41,5 Minuten eluiert;
(b) es ist vorhanden In einer Fraktion der oben in (a) beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac®-Säule, 10mm x 250mm, 300Ä Porengröße, S μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 3,5ml/min, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem isokratischen System von 70% A, 30% B, wobei A0,1%ige wäßrigeTFA und B Acetonitril ist, nach 7,5 Minuten eluiert; und
(c) es hat eine am'no-terminale Aminosäuresequenz, die aufweist:
HjN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-glythr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu.
Das erfindungsgemäße Polypeptid blockiert In Zellen Calclum-Kanäle. Daher ist das Polypeptid per se brauchbar für die Blockierung von Calcium-Kanälen in Zellen. Das Polypeptid ist auch brauchbar für die Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen und in der Behandlung von Krankheiten und Zuständen von Säugetieren, die durch die Calcium-Kanal-Funktion in Zellen bewirkt werden.
Der Schutzumfang dieser Erfindung umfaßt auch Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und im wesentlichen die gleiche blockierende Wirkung auf Calcium-Kanäle haben, wie die oben beschriebenen Polypeptide. Diese Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Polypeptide aufweisen und Verfahren zum Verabreichen dieser Polypeptide.
Das Gift wird von der Spinne Agelenopsls aperta mittels Melken durch elektrische Reizung nach dem Fachmann wohlbekannten Standardverfahren erhalten. Vorzugsweise wird ein Verfahren eingesetzt, das Schutzmaßnahmen gegen eine Kontamination des Gesamtgiftes durch abdominal wieder Hervorgewürgtes oder Hämolymphe hat. Solche Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. Das so erhaltene Gesamtgift wird im gefrorenen Zustand bei etwa -78°C gelagert, bis es zur unten beschriebenen Reinigung verwendet wird.
Die Reinigung der Bestandteile des Gesamtgiftes wird durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen (HPLC) auf einer Vielzahl von präparation oder semi-präparativen Säulen, z. B. C-4 und C-18 Vydac*-Säulen (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801) erreicht. Der Peaknachweis wird monochromatisch bei 220 bis 230nm ausgeführt. Eine weitere Analyse der Fraktionen kann zum Beispiel mit polychromen UV-Daten, gesammelt mit einem Waters 990 Diodenarray-Detector (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757), erreicht werden. Die Fraktionen von den Säulen werden mit bekannten Verfahren gesammelt, z. B. durch das Verwenden eines ISCO/„FOXY"-Fraktionssammlers und eines ISCO2159 Peak-Detectors (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Die Fraktionen werden in geeignet dimensionierten Gefäßen gesammelt, z. B. sterilen Polyäthylen-Laboratoriumsgefäßen. Die Konzentrierung der Fraktionen wird dann durch Lyophilisation des Elutionsmittels, gefolgt von einer Lyophilisation des Wassers erreicht. Die Reinheit der resultierenden Bestandteilfraktionen kann durch chromatographische Analyse unter Verwendung einer analytischen Säule mit einem Gradientensystem bestimmt werden, da? isokratischer als das System ist, das für die letzte Reinigung der Fraktionen verwendet wurde.
Die Strukturen, die die jeweiligen Fraktionen aufweisen, werden nach bekannten analytischen Verfahren, z.B. durch Massenspektrometrie und magnetische Kernresonanz bestimmt. Das Polypeptid der Fraktion Q wird nach bekannten Verfahren sequenziert. Zum Beispiel kann eine S-Pyridylethylierung der Cystin-Reste der zu untersuchenden Polypeptide in Lösung durchgeführt werden, gefolgt von einer Aminosäuresequenzierung des Polypeptide. Ein solches Verfahren zur S-Pyridylethylierung ist wie folgt. Etwa 1-10 \ig des Polypeptids werden aufgelöst oder in bis zu 50μΙ eines Puffers verdünnt, der durch Mischen 1 Teils 1 MTris · HCI, pH 8,5, enthaltend 4mM EDTA und 3 Teile 8M Guanidin HCI hergestellt wurde. Dann werden 2,5μΙ 10%iges wäßriges 2-Mercaptoethanol zugegeben und das Gemisch wird bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden 2μΙ 4-Vinylpyridin (frisches Reagenz unter Argon bei -200C gelagert) zugegeben und das Gemisch wird für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon inkubiert. Das Gemisch wird dann entsalzt, vorzugsweise durch Chromatographie auf einer kurzen Säule mit umgekehrter Phase. Die rückgewonnenen alkylierten Polypeptide werden dann nach bekannten Vorfahren sequenziert.
Bei der Durchführung dieser Erfindung und beim Anwenden des oben umrissenen allgemeinen Verfahrens wurde gefunden, daß eine geeignete Säule für die Anfangsfraktionierung des Giftes eine C-18 Vydac®-Säule, 22 mm χ 250 mm, 300 A Porengröße, 10μ Teilchengröße, ist. Diese Säule wird mit einer Flußrate von 15 ml/min unter Verwendung eines linearen Gradientenprogrammsvon95%->80%A,5%->20%B(0->30min),dann80%-»30%A,20%->70%B(30->55min),wobei A 0,1%ige wäßrige Trifluoressigsäure (TFA) und B Acetonitril ist, eluiert. Die Fraktionen werden wie oben beschrieben gesammelt. Eine so erhaltene Fraktion, bezeichnet Q', wurde für die weitere Reinigung gewählt. Die Elutionszeit derr Fraktion Q' war etwa 41,5 Minuten.
Fraktion Q' wurde einer weiteren Reinigung unter Verwendung einer C-18 Vydac*-Säule, 10mm χ 250mm, 300Ä Porengröße, 5,0μ Teilchengröße, einer Flußrate von 3,5ml/min und unter Verwendung eines isokratischen Systems aus 70% 0,1 %iger wäßriger TFA, 30% Acetonitril unterworfen. Fraktionen wurden wie oben beschrieben gesammelt. Fraktion Q eluierte von der Säule nach etwa 7,5 Minuten. Es vurde auch gefunden, daß eine Fraktion, die nach etwa 8,3 Minuten eluierte, ein Polypeptid enthielt, das in der US-Patentanmeldung Nr.07/346,181 als Fraktion K beschrieben wurde. Fraktion Q enthielt ein Polypeptid mit einer amino-terminalen Aminosäuresequenz, aufweisend:
H2N-lys-lys-lys-cys-ilθ-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys·lys-trp·gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg·gly·cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thrasn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
Durch den Offenbarungsvorteil hinsichtlich der in Fraktion Q des Giftes von Agelenopsls aperta vorhandenen Verbindung, ist es nun möglich diese Verbindung durch andere Verfahren als durch Isolierung/Reinigung des Gesamtgiftes zu erhalten. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken durch das Klonieren einer codieren den Sequenz für das Polypeptid oder Teile davon hergestellt werden. Zum Beispiel können Hybridisierungssonden, die aus der nun bekannten Aminosäuresequenz-Information des Polypeptids Nutzen ziehen, gemäß Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann zum Klonieren einer codierenden Sequenz für das vollständige Polypeptid wohlbekannt sind. Eine Kombination von rekombinanten DNA-Techniken und In vitro Proteinsynthese kann auch eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide herzustellen. Solch ein In vitro Proteinsynthese-Verfahren beinhaltet, ist jedoch nicht darauf beschränkt, die
Verwendung eines ABI 430 A Festphasen-Peptid-Synthesizers (Applied Biosystems, Ine, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) unter Einsatz der Standard-Menifield-Chemie oder anderer Festphasen-Chemien, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
In der Technik ist es wohlbekannt, daß bestimmte Aminosäure-Substitutionen in Polypeptiden ausgeführt werden können, die die Funktion der Polypeptide nicht oder nicht wesentlich beeinflussen. Die genauen Substitutionen, die möglich sind, variieren von Polypeptid zu Polypeptid. Die Bestimmung der erlaubten Substitutionen kann durch Verfahren erreicht werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Daher liegen alle Polypeptide mit einer im wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz und einer im wesentlichen gleichen blockierenden Wirkung auf Calcium-Kanäle im Schutzumfang dieser Erfindung. Die erfindungsgemäßen Polypeptide blockieren irreversibel Calcium-Kanäle, die in einer Vielzahl von Zellen vorhanden sind, z. B. in fellen im nervösen und muskulären System von wirbellosen Tieren und Wirbeltieren. Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide Calcium-Kanäle zu blockieren wird durch das folgende Verfahren demonstriert. Zerebelläre Körnerzellen werden aus dem Zerebellum von 8 Tage alten Ratten hergestellt (Wilkin, G. P., et al., Brain Res.: 115:181-199,1976). Quadrate (1 cm2) aus Aclar (Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, N.J., 07719) werden mit poly-L-Lysin beschichtet und in Schalen mit 12 Vertiefungen, die 1 ml Eagles-Basal-Medium enthalten, untergebracht. Die Zellen werden dissoziiert und aliquote Teile, enthaltend 6,25 χ 10β Zellen, werden in jede Aclar-Quadrate enthaltende Vertiefung gegeben. Cytosin-beta-D-arabinofuranosid (Endkonzentration 10μΜ) wird 24 Stunden nach dem Plattieren zugegeben. Die Zellen werden für die Fura 2-Analyse nach 6,7 und 8 Tagen der Kultivierung verwendet. Die Zellen (an den Aclar-Quadraten haftend) werden in eine Schale mit 12 Vertiefungen überführt, die 1 ml 2 μΜ Fura2/AM (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, 97402) in HEPES-Puffer (enthaltend 0,01 % Rinderserumalbumin, 0,01 % Dextrose, pH 7,4, magnesium-frei) enthalten. Die Zellen werden 40min bei 37X inkubiert; der Fura2/AM-enthaltende Puffer wird entfernt und ersetzt durch 1 ml des gleichen Puffers ohne Fura 2/AM. In eine Quarzküvette werden 2,0ml vorgewärmter (370C) Puffer gegeben. Die Zellen auf dem Aclar werden in der Küvette untergebracht und die Küvette wird in einen thermostatisierten (370C) Halter, ausgerüstet mit einem Magnetrührer, gesteckt und die Fluoreszenz wird mit einem Fluoreszenzspektrophotometer (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania) gemessen. Das Γ-luoreszenzsignal wird etwa 2min stabilisiert. Dann werden 5-20μΙ einer Stammlösung der zu untersuchenden Verbindung in phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in geeigneten Konzentrationen in d). Küvette gegeben. Die Kalibration des Fluoreszenzsignals und die Fura 2/AM-Leckkorrektur wurden unter Verwendung der eingeführten Verfahren von Nemeth et al., J. Biol. Chem. 262: 5188 (1987) nach dem Abschluß jedes Versuchs durchgeführt, der maximale Fluoreszenzwert (Fmax) wird durch die Zugabe von lonomycin (35μΜ) bestimmt und der minimale Fluoreszenzwert (Fmin) wird durch die anschließende Zugabe von EGTA (12 mM), um Calcium zu chelieren, bestimmt. Durch das Verwenden des vorerwähnten Verfahrens wird das Auftreten der Calcium-Kanal-Blockierung durch eine Versuchsverbindung durch eine Abnahme der Fluoreszenz nach Zugabe der Versuchsverbindung angezeigt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind per se als Calcium-Kanal-Blocker in Zellen verwendbar. Diese Verbindungen sind z. B. aur'n verwendbar in der Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen und in der Behandlung von Krankheiten und Zuständen, die dutch die Funktion der Calcium-Kanäle In den Zellen eines Säugetiers bewirkt werden, z. B. Angina, Hypertonie, Kardiumyopathien, supraventrikuläre Arrhythmien, Ösophagusachalasie, Frühgeburten und Raynaud's Krankheit. Ferner sind diese Verbindungen nützlich zum Studium der Physiologie von Zellen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Zellen des nervösen und muskulären Systems.
Im Schutzumfang dieser Erfindung liegen auch die pharmazeutisch geeigneten Salze der erfindungsgemäßen Polypeptide. Solche Salze werden durch Verfahren gebildet, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel können Basensalze der Polypeptide nach konventionellen Verfahren hergestellt werden.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid einem Säugetier verabreicht werden soll, kann es allein oder in Verbindung mit pharmazeutisch geeigneten Trägern oder Streckmitteln in einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach pharmazeutischer Standardpraxis verabreicht werden. Die Polypeptide können oral oder parenteral auf dem für die Verabreichung der Polypeptide bevorzugten parenteralen Weg verabreicht werden. Die parenteral Verabreichung beinhaltet intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und topische Verabreichung.
Für die orale Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide kann die Verbindung zum Beispiel in Form von Table (ten oder Kapseln oder als wäßrige Lösung oder Suspension verabreicht werden. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung werden üblicherweise Trägerstoffe zugegeben, die üblicherweise Lactose und Getreidestärke und Gleitmittel, z. B. Magnesiumstearat, beinhalten. Für die orale Verabreichung in Kapselform sind Lactose und getrocknete Getreidestärke verwendbare Verschnittmittel. Wenn wäßrige Suspensionen für die orale Verwendung erforderlich sind, wird der wirksame Inhaltsstoff mit Emulgatoren und Suspensionsmitteln kombiniert. Wenn gewünscht, können bestimmte Süßungsmittel und/oder Geschmacksstoffe zugegeben werden.
Für die intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane oder intravenöse Verwendung werden üblicherweise sterile Lösungen des wirksamen Inhaltsstoffes hergestellt und derpH der Lösungen sollte geeignet eingestellt und gepuffert sein. Für die intravenöse Verwendung sollte die Gesamtkonzentration an gelösten Stoffen gesteuert werden, um die Präparation isotonisch zu machen. Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon in einem menschlichen Patienten verwendet wird, wird die tägliche Dosierung normalerweise durch den verordnenden Arzt bestimmt. Überdies wird die Dosierung mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des individuellen Patienten, als auch mit der Schwere der Symptome des Patienten und der Wirksamkeit der verabreichten speziellen Verbindungen variieren.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder ein Salz davon zur Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen verwendet wird, wird das Polypeptid dem wirbellosen Tier direkt verabreicht oder die Umwelt des wirbellosen Tieres wird damit versehen. Zum Beispiel kann eine erfindungsgemäße Verbindung als Lösung auf das wirbellose Tier gesprüht werden. Die Menge an Verbindung, die erforderlich ist, um dieses wirbellose Tier zu bekämpfen, wird mit dem wirbellosen Tier und den Umweltbedingungen variieren und wird von der Person bestimmt, die die Verbindung anwendet. Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon für physiologische Studien an Zellen verwendet wird, wird das Polypeptid den Zellen nach Verfahren verabreicht, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel wird das Polypeptid den Zellen in einem geeigneten physiologischen Puffer verabreicht. Eine geeignete Konzentration der erf indungsger laßen Verbindungen zur Verwendung in solchen Studien ist 100μΜ. Jedoch kann die Konzentration des Polypeptids in solchen Studien
größer oder viel kleiner als 100μΜ sein. Die Menge an zu verabreichender Verbindung wird durch den Fachmann nach wohlbekannten Verfahren bestimmt.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und dürfen nicht als Beschränkung des Schulzumfangs dieser Erfindung verstanden werden.
eine C-18 Vydac*-Säule (22mm χ 250mm, 300 A Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer
95% -» 80% A(O -»30min), dann 20%-* 70% B, 80% ->30%A (30 -> 55min), woeiA0,1%igewäßrigeTFAund B Acetonitril ist, eluiert. Der Peaknachweis wurde monochromatisch bei 220-230nm ausgeführt und Fraktionen wurden mit einem ISCO/ „FOXV-Fraktionssammler und einem ISCO 2150 Peak-Detektor gesammelt. Fraktionen wurden von 20 Minuten bis 60 Minuten gesammelt. Fraktion Q' wurde nach etwa 41,5 Minuten gesammelt.
aus 70% A, 30% B, wobei A0,1%ige wäßrige TFA und B Acetonitril ist, eluiert. Der Peaknachweis wurde unter Verwendung eines
Die Fraktionen Q und K, die Polypeptide enthalten, wurden dann nach wohlbekannten Verfahren durch Lyophylisation des Elutionsmlttels, gefolgt von einer Lyophilisation des Wassers für die Sequenzierung vorbereitet.
Die Aminosäureanalyse der alkylierten Polypeptide der Fraktionen Q und K wurde durch die Verwendung des Waters Pico-Tag-Verfahrens gemäß den Herstellerangaben erhalten. Die Sequenzdaten wurden mit einem Applied Biosystems Model 470A Protein/Peptid-Sequenzer (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) mit wäßriger TFA-Umwandlung gesammelt. Die Analyse der resultierenden Phenylthiohydantoin-Aminosäuren erfolgte on-line mit einem Applied Biosystems Model 12OA PTH-Analysator oder off-line auf einer DuPont Zorbax PHT-Säule (Biomedical Product Department, Chromatography Products, E. I. duPont de Nemours and Co., Inc., 1007 Market Street, Wilmington, Delaware 19898). Als Resultat der Aminosäureanalyse wurde die amino-terminale Aminosäuresequenz eines Teils des in der Fraktion Q enthaltenen Polypeptids bestimmt als:
HjN-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-glycys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thrasn-cys-glu-cys-lys-pri-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
Als Resultat der Aminosäureanalyse wurde auch bestimmt, daß Fraktion K das Polypeptid der oben beschriebenen und in der US-Patentanmeldung Nr.07/346,181 r'fenbarton Fraktion K enthält.
Claims (1)
- Vorfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen Polypeptide, mit den folgenden identifizierenden Kennzeichen(a) es ist vorhanden in einer Fraktion des Rohgiftes der Spinne Agelenopsis aperta, die von einer C-18 Vydac®-Säule, 22 mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 15ml/min, mit einem Lösungsmittelsystem mit einem linearen Gradientenprogramm von 5% -> 20% B, 85% -» 80% A (0 -» 30rnin), dann 20%-* 70% B, 00% -> 30% A (30-> 55min), wobei A 0,1%ige wäßrige TFA und B Acetonitril ist, nach etwa 41,5 Minuten eluiert;(b) es ist vorhanden in einer Fraktion der oben in (a) beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac®-Säule, 10mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 5 μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 3,5 rp l/m in und eines isokratischen Lösungsmittelsystems aus 70% A, 30% B, wobei A 0,1%ige wäßrige TFA und B Acetonitril ist, nach etwa 7,5 Minuten eluiert; und(c) es hat eine amino-terminale Aminosäuresequenz, die aufweist: H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asptyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asncys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-ieu;es ist ein Polypeptid mit einer im wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz und einer im wesentlichen gleichen blockierenden Wirkung auf Calcium-Kanäle wie das Polypeptid und die pharmazeutisch geeigneten Salze davon, dadurch gekennzeichnet, daß das Gesamtgift von Agelenopsis aperta von einer C-18 Vydac®-Säule, 22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Flußrate von 15 ml/min und eines Lösungsmittelsystems mit einem linearen Gradientenprogramm von 5% -> 20% Acetonitril, 95% -» 80% 0,1%igo wäßrige Trifluoressigsäure (0 -> 30 min), dann 20% -» 70% Acetonitril, 80% ~> 30% 0,1%ige wäßrige Trifluoressigsäure (30-> 55 min) und monochromatischen Peaknachweis bei 220-230 nm eluiert wird; daß die Fraktion, die nach etwa 41,5 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-18 Vydac®-Säule, 10mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 5μ Teilchengröße, geladen wird und unter Verwendung ein Flußrate von 3,5ml/min und eines isokratischen Lösugnsmittelsystems aus 70% 0,1%igei-Trifluoressigsäure und 30% Acetonitril und Peaknachweis bei 220-230 nm eluiert wird; daio die Fraktion, die nach etwa 7,5 Minuten eluieren, gesammelt wird und wahlweise lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird; oder daß das Polypeptid alternativ nach per se bekannten Verfahren synthetisiert wird; und wenn Polypeptide gewünscht werden, die eine zu dem Polypeptid im wesentlichen gleiche Aminosäuresequenz haben, ein solches Polypeptid oder Polypeptide mit per se bekannten Verfahren synthetisiert wird; und daß die Polypeptide wahlweise nach per se bekannten Verfahren in pharmazeutisch geeignete Salze davon umgewandelt werden.
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