WO2004087762A1 - ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体 - Google Patents

ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2004087762A1
WO2004087762A1 PCT/JP2004/004331 JP2004004331W WO2004087762A1 WO 2004087762 A1 WO2004087762 A1 WO 2004087762A1 JP 2004004331 W JP2004004331 W JP 2004004331W WO 2004087762 A1 WO2004087762 A1 WO 2004087762A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
peptl
peptide transporter
cells
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/004331
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuhiko Kodama
Takao Hamakubo
Ryoichi Saitoh
Yoshiki Yamada
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2003/003975 external-priority patent/WO2003083116A1/ja
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority to EP04723785A priority Critical patent/EP1621553A4/en
Priority to US10/550,987 priority patent/US7731960B2/en
Priority to JP2005504209A priority patent/JP4551326B2/ja
Publication of WO2004087762A1 publication Critical patent/WO2004087762A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US12/712,982 priority patent/US20100247539A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that inhibits the transport activity of a peptide transporter, and a cell growth inhibitor containing the antibody as an active ingredient.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 2, Non-patent Document 2. 3, Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3, etc.
  • Peptide transporters are classified into proteins that transport peptides into cells and proteins that transport peptides out of cells. It can also be classified according to the difference in the energy source used during transport. Proton-driven peptide transporters that transport using the difference in the concentration of protons inside and outside the cell belong to the PTR family (non- Patent Document 3). On the other hand, peptide transporters that carry out transport using ATP in vivo belong to ABC family (Non-Patent Document 4).
  • Non-patent document 5 Non-patent document 6, Non-patent document 7, Non-patent document 8, Non-patent document 9, Non-patent document 10
  • drugs such as / 3-latatam antibiotics and ACE inhibitors
  • PepTl and PepT2 are proton-driven peptide transcripts that contribute to the absorption of proteins and the maintenance of a peptide nitrogen source by taking up small molecule peptides into cells.
  • a Supota, p ep Tl, PepT2 each 708 amino acids, a 12-transmembrane protein consisting of 729 (Non-patent Document 1, Non-Patent Documents 2 and 1 1).
  • Non-Patent Document 1 2 Non-Patent Document 1 3
  • Non-Patent Document 1 4 Non-Patent Document 1 4
  • PepTl is mainly expressed in the small intestine, and its expression in the kidney and kidney has been confirmed. Expression of PepT2 has been confirmed in kidney, brain, lung, and spleen. It has been reported that Pe P Tl and Pep T2 are localized in the brush border membrane of the small intestine and renal tubular epithelial cells (Non-Patent Document 15, Non-Patent Document 16, Non-Patent Document 17, Non-Patent Document 17). Patent Document 11 1).
  • Non-patent Document 18 PepTl was overexpressed in the cell membrane of human ductal carcinoma cell lines (Non-Patent Document 18), and that PepT2 mRNA was expressed in human knee duct carcinoma cell lines (Non-patent Document 1).
  • Patent Document 1 JP-A-6-261761
  • Patent Document 3 US5849525
  • Non-Patent Document 1 J. Biol. Chem., 270 (12); 6456-6463, (1995)
  • Non-Patent Document 3 Mol. Microbiol., Vol. 16, p825, (1995)
  • Non-Patent Document 4 Annu. Rev. Cell. Biol., Vol 8, p67, (1992)
  • Non-patent document 5 Ganapathy, Leibach., Curr.Biol. 3, 695-701, (1991)
  • Non-patent document 6 Nakashima et ah, Biochem. Pharm. 33, 3345-3352, (1984)
  • Non-patent document Reference 7 Friedman, Ami don., Pharm. Res., 6, 1043-1047, (1989)
  • Non-patent Reference 8 Okano et al., J. Biol. Chem, 261, 14130-14134, (1986)
  • Non-Patent Document 9 Muranushi et al., Pharm. Res., 6, 308-312, (1989)
  • Non-Patent Document 10 Friedman, Ami don., J. Control. Rel., 13, 141-146, (199 0)
  • Non-Patent Document 1 Terada, Inui, Tanpakusitsu Kakusan Kouso., Vol. 46, No5, (2001)
  • Non-patent Document 1 2 Saito, H. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 275, 1631-1637, (1995)
  • Non-Patent Document 13 Saito, H. et al., Biochim.Biopys. Acta, 1280, 173-177, (1996)
  • Non-Patent Document 15 Ogihara, H. et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 220, 848-852, (1996)
  • Non-Patent Document 16 Takahashi, K. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 286, 1037-1042 (1998)
  • Non-Patent Document 17 Hong, S. et al., Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 276, F658-F665 (1999)
  • Non-Patent Document 18 Cancer Res., 58, 519-525, (1998)
  • Non-Patent Document 19 Millennium World Congress of Pharmaceutical Sciences, (2000) Disclosure of Invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide an antibody that inhibits the transport activity of a peptide transporter, and a cell growth inhibitor containing the antibody as an active ingredient, particularly a knee.
  • An object of the present invention is to provide an agent for suppressing the growth of cancer cells such as visceral cancer.
  • the present inventors have found that a substance that inhibits the transport activity of a peptide transporter suppresses cell proliferation. Furthermore, an antibody that inhibits the transport activity of the peptide transporter was found. These findings are based on peptide transport using antibodies. It indicates that the activity of the protein can be inhibited and cell proliferation can be suppressed. In the development of growth inhibitors such as cancer cells, suppression of peptide transporter activity is considered to be an important indicator.
  • the present invention more particularly,
  • a cell growth inhibitor comprising the antibody according to any one of (1) to (4) as an active ingredient
  • an anticancer agent comprising the antibody according to any one of (1) to (4) as an active ingredient
  • the anticancer agent according to (6) which is a knee cancer.
  • a method for inhibiting the transport activity of a peptide transporter comprising contacting an antibody that binds to the peptide transporter with a cell that expresses the peptide transporter.
  • peptide transporter is PepTl or Pe P T2, the method described in (11)
  • the present invention provides an antibody capable of inhibiting the transport activity of a peptide transporter.
  • the peptide transporter of the present invention is not particularly limited. Peptide transporters that take up peptides into cells by mouth-to-mouth drive, more preferably PepTl or PepT2, and particularly preferably PepTl.
  • PepTl and PepT2 are already known (human PepT1: GenBank XM—007063, J. Biol. Chem., 270 (12); 6456-6463, (1995), human PepT2: GenBank XM-002922, Biochim. Biophys. Acta., 1235; 461-466, (1995)).
  • the antibody capable of inhibiting the transport activity of the peptide transporter of the present invention can inhibit transport via the peptide transporter (for example, uptake of the peptide into cells by the peptide transporter).
  • the peptide transporter for example, uptake of the peptide into cells by the peptide transporter.
  • Inhibiting the transport via the peptide transporter means that it is not necessary to completely block the transport of the peptide, but only if the amount of the peptide to be transported can be reduced.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited, as long as it can bind to the peptide transporter and inhibit the transport activity of the peptide transporter.
  • Mouse antibody, rat antibody, rabbit antibody, sheep antibody, camel antibody, chimeric antibody, human Antibody, human antibody, etc. can be used as appropriate.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred because a homogeneous antibody can be stably produced.
  • Polyclonal and monoclonal antibodies can be produced by methods well known to those skilled in the art.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can be basically produced as follows using a known technique. That is, a desired antigen or a cell expressing the desired antigen is used as a sensitizing antigen, which is immunized according to a usual immunization method, and the obtained immune cells are immunized by a known cell fusion method using a known cell fusion method. It can be produced by fusing with cells and screening monoclonal antibody-producing cells (hybridomas) by ordinary screening methods.
  • mammals such as mice, rats, rabbits, sheep, monkeys, and the like can be used.
  • the antigen is prepared by a known method, for example, a method using a baculovirus (for example, W098 / 46777). Etc.).
  • a peptide transporter expressed on a baculovirus membrane is used as an immunogen
  • a gp64 transgenic mouse can be used as an immunized animal (International Patent Application Publication No. WO 03/104453).
  • Hybridomas can be prepared, for example, according to the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
  • immunization may be performed by binding to a giant molecule having immunogenicity such as albumin.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, inserting the gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and producing the same using a gene recombination technique can be used (for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • cDNA for the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the mRNA of the hybridoma using reverse transcriptase.
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and inserted into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody. It is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans such as a chimeric antibody or a humanized antibody
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a heavy chain and light chain variable region of a non-human mammal, such as a mouse antibody, and a heavy chain and light chain constant region of a human antibody, and DNA encoding the mouse antibody variable region. With the DNA encoding the constant region of the human antibody It can be obtained by ligation, integration into an expression vector, introduction into a host, and production.
  • the humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, such as a mouse antibody, is transplanted into the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • the general gene recombination method is also known. Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was constructed by several oligos made to have overlapping portions at the ends. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, and then inserted into an expression vector, which is then introduced into a host and produced. (European Patent Application Publication No.
  • EP 239400 International Patent Application Publication Number W0 96/02576
  • Human antibody FRs linked via CDRs are selected so that the complementarity-determining regions form a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • CDRs can be determined based on known techniques. For example, a database of amino acid sequences of antibodies prepared by Kabat et al. ((“Sequence of Proteins of Immunological Interest ⁇ US Dept. Health and It can be determined by examining homology using Human Services, 198 3).
  • a method for obtaining a human antibody is known.
  • a human lymphocyte is sensitized in vitro with a desired antigen or a cell expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocyte is fused with a human myeloma cell such as U266 to obtain a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication No.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by the phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • a human antibody can be obtained by preparing an appropriate expression vector into which the sequence is inserted. These methods are well known and can be referred to W0 92/01047, W0 92/20791, W0 93/06213, W0 93/11236, W0 93/19172, W0 95/0 1438, W0 95/15388 .
  • an antibody gene When an antibody gene is isolated and introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • animal cells When eukaryotic cells are used as hosts, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used.
  • Animal cells include (1) mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) amphibian cells, such as African omega oocytes, or (3) insects Cells, for example, sf9, sf21, Tn5 and the like are known.
  • plant cells cells derived from the genus Nicotiana (for example, Nicotiana, for example, Nicotiana tabacurn) are known, and they may be callus-cultured.
  • s genus, for example Saccharomyces' Celebiche Serevisiae and filamentous fungi, for example, Aspergillus (genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger) are known.
  • Aspergillus genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger
  • prokaryotic cells there is a production system using bacterial cells.
  • bacteria Escherichia coli and Bacillus subtilis are known.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, or single-chain Fv (scFv), Diabody in which Fv of H chain or L chain is linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme, for example, papain, pepsin, etc., introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M.
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 , 5879-5883).
  • the H chain V region and the L chain V region in the scFv may be derived from any of the antibodies described herein.
  • As the peptide linker connecting the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 residues is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody and a DNA encoding the L chain or L chain V region, all or a desired amino acid sequence thereof.
  • Diabody is a flag that combines variable regions with variable regions (For example, scFv etc.) (hereinafter referred to as a fragment constituting Diabody), which is linked and dimerized, and usually contains two VLs and two VHs (P. Holliger et al. Natl.Acad.Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993), EP404097, W093 / 11161, Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991), Holliger et.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used. It is also possible to bind a radioactive isotope, a chemotherapeutic agent, or a cytotoxic substance such as a bacterial toxin to the antibody.
  • PEG polyethylene glycol
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Methods for modifying antibodies have already been established in this field.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody.
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen-binding site that recognizes a different epitope on the peptide transporter molecule, or one antigen-binding site may recognize a peptide transporter and the other antigen
  • the binding site may recognize a cytotoxic substance such as a radioactive substance, a chemotherapeutic agent, or a cell-derived toxin.
  • Bispecific antibodies can be produced by combining the HL pairs of two types of antibodies, or by fusing hybridomas producing different monoclonal antibodies to produce bispecific antibody-producing fused cells. , You can also get.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • an antibody having a modified sugar chain can be used.
  • Techniques for modifying the sugar chains of antibodies are already known (for example, WO 00/61739, WO 02/31140, etc.).
  • the “antibody” in the present invention also includes these antibodies.
  • Antibodies expressed and produced as described above are used in normal protein purification. It can be purified by any known method. For example, the ability to separate and purify antibodies by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, and dialysis! O (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence immunoassay can be used. Whether or not a specific molecule binds to the peptide transporter can be measured by a known method.
  • Known methods include, for example, immunoprecipitation, West Western plotting, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay), fluorescent immunoassay, surface And a method using a biosensor utilizing the plasmon resonance phenomenon.
  • Detection of whether the antibody inhibits the transport function of the peptide transporter can be performed by a known method, for example, by labeling a substrate such as a peptide with a radioactive substance (such as 14 C) or a fluorescent substance, and then using the peptide transporter. It can be determined by measuring the amount taken up by the porter-expressing cells (International Patent Application Publication No. W0 03/083116, Development of continuation drugs 4) Biomembrane transport and tissue targeting of one drug 1, 11 ( Editing, Hiroshi Terada, Akira Tsuji)).
  • Cells targeted by the cell growth inhibitor of the present invention are not particularly limited, but are preferably cancer cells such as kidney cancer, liver cancer, lung cancer, esophagus cancer, breast cancer, and colon cancer, and are particularly preferred. Are spleen cancer cells.
  • the cell growth inhibitor of the present invention is used for the treatment and prevention of diseases caused by cell proliferation, particularly cancer such as spleen cancer.
  • the antibody of the present invention can be used as a peptide transporter transport inhibitor. You can use it.
  • the cytostatic agent can be administered orally or parenterally, and is preferably parenterally administered. Specifically, injection, nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration And the like. Examples of injection forms include systemic or local administration by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected according to the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be selected, for example, from O. OOOlmg to 100 Omg per kg of body weight at a time. Alternatively, for example, the dose can be selected within a range of 0.001 to: 1000 mg / body per patient.
  • the therapeutics of the present invention are not limited to these dosages.
  • the therapeutic agent of the present invention can be formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, la test edition, Mark Publishing Company, Easton, USA), using a pharmaceutically acceptable carrier or additive. It may include things with it. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a graph showing the results of detecting the inhibition of PepTl activity of an anti-human PepTl monoclonal antibody in a PepTl-expressing virus.
  • FIG. 2 is a graph showing the ability of AT-264 to inhibit PepTl in BaF3 cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing the nucleotide sequence of the constructed gp64 gene.
  • FIG. 7 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 8 is a diagram showing the structure of the constructed pCAG-gp64 vector.
  • glycylsarcosine was diluted with HBSS (pH 6.0) to a final concentration to prepare a substrate solution.
  • mouse monoclonal antibodies (clone 119, clone 253, and clone 113) that recognize the extracellular region of human PepTl were diluted with PBS to a final concentration of 200 g / mL to obtain an antibody solution.
  • 20 L (50, ug protein) of PepTl-expressing budding baculovirus solution with His-tag added to the N-terminal and 20 L of the antibody solution were mixed and pre-incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • reaction stop solution ice-cold HBSS (pH 7.4)
  • FIG. 1 shows the inhibition of PepTl activity by an anti-human PepTl monoclonal antibody.
  • PepTl activity in the absence of antibody was expressed as 100 as a control.
  • clone 119 inhibited PepT1 activity by about 20% and clone 253 by about 10% as compared to the control.
  • This inhibition of PepTl activity was statistically significant (Student's t test). From the above, it was found that the anti-PepTl antibody could have the ability to inhibit the transport activity of PepTl.
  • amino acid sequence of the heavy chain variable region of clone 119 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • AT-264 has a structure represented by the following structural formula. The following experiment confirmed that this compound was an inhibitor of peptide transporter (PepT).
  • AT-264 was dissolved in RPMI1640-10 mM Hepes (hereinafter abbreviated as medium), 0.5% ethanol and 0.5% DMS0 to prepare a 2.5 mM AT-264 solution. This solution was diluted with a medium to prepare 0.625 and 0.0625 mM AT-264 solutions.
  • the human vicinal cancer strain AsPC-1 was prepared at 5 ⁇ 10 4 cells / mL in a medium containing 50% FBS. This suspension was seeded at 40 zL / well (2 ⁇ 10 3 cells) on a 96-well plate coated with Collagen type I, and 160 L of AT-264 solution was added. C0 2 incubator and cultured for 6 days (100 units / mL penicillin after 2 days of culture, added 0. lmg / mL streptomycin), after 6 days of culture was quantified the number of viable cells in MTS assay.
  • Figure 3 shows the results of the cell proliferation test.
  • AT-264 In the presence of 2 mM AT-264, cell growth was inhibited by about 30%, and even at 0.5 mM, although slightly. Under a microscope, no morphological change of AsPC-1 was observed even in the presence of AT-264. From the results of RT-PCR, the expression of PepTl was more predominant in AsPC-1 than in PepT2. Based on the above, it was considered that the suppression of cell proliferation by AT-264 was due to the inhibition of PepTl function rather than nonspecific cytotoxicity.
  • AT-264 was dissolved in RPMI1640-lOmM Hepes, 100 units / mL penicillin, 0.1 mg / mL streptomycin (hereinafter abbreviated as medium), 0.5% ethanol, 0.5% DMS0, and 2.5 mM AT- 264 solutions were prepared. This solution was diluted with a medium to prepare 0.625 and 0.0625 mM AT-264 solutions. BxPC-3 was adjusted to 5 ⁇ 10 4 cells / mL in a medium containing 50% FBS. The suspension was seeded at 40 ⁇ L / well (2 ⁇ 10 3 cells) on a 96-well plate coated with Collagen type 1, and 160 L of AT-264 solution was added thereto. C0 to 6 ⁇ cultured in 2 incubator, the number of viable cells was quantified by MTS assay after 6 days in culture.
  • Figure 5 shows the results of the cell proliferation test.
  • Cell proliferation was inhibited by about 75% in the presence of 2mM AT-264 and about 20% at 0.5mM. Under microscopic observation, no morphological change of B X PC-3 was observed even in the presence of AT-264.
  • the expression of PepT2 was predominant in BxPC-3 as compared to PepTl. From the above, it was considered that the cell growth suppression by AT-264 was not due to cytotoxicity but due to inhibition of PepT2 function. Therefore, it was found that the substance that inhibits the transport activity of PepTl or Pe pT2 becomes a cytostatic.
  • mice were prepared according to the method described in International Patent Application Publication No. W0 03/104453. That is,
  • the gp64 gene sequence (GenBank Acc No. 9627742) is designated as type I, 5 'primer 64F1 with EcoRI recognition sequence and KOZ AK sequence at the 5' end, and 3 'primer 64R1 with EcoRI recognition sequence at the 5' end (Fig. 6 Using FIG. 7), PCR was performed under the following conditions.
  • the composition of the PCR reaction solution is xlO ExTaq buffer 5 ⁇ , ExTaq included dNTP 4 ⁇ , ⁇ ⁇ le / L 64F1 ⁇ ⁇ ⁇ , 10 ⁇ mol / L 64R1 ⁇ ⁇ ⁇ , 500 pg / ⁇ ⁇ pBac- ⁇ -blue ⁇ ⁇ ⁇ , 5 unit / ⁇ ⁇ ExTaq 0.5 ⁇ ⁇ , diw 37.5 ⁇ L.
  • the reaction sequence is as follows.
  • E. coli DH5a was transformed. Perform colony PCR using T7 and SP6 primers and The clones containing the target gene were identified by analyzing the nucleotide sequence using the ABI Prism377 DNA sequencer, BigDye Cycle Sequence kit, and T7 or SP6 primers using the clones in which the clones were confirmed. From this clone, a fragment containing gp64, which was confirmed to have no mutation in the nucleotide sequence, was excised with EcoRI, inserted into pCAGGSl that was also EcoRI-powered, and transformed into E. coli DH5 ⁇ . The clone as designed was 37 ° C De ⁇ cultured using LB medium 250 mL, to give a fine papermaking 5 8 1.6 ⁇ 8 plasmids using Endofree MAXI kit.
  • the DNA fragment for injection was prepared as follows. PCAGGS Betata one that was first ⁇ the g P 64 gene -; a (pCAG gp64 Figure 8), was treated with Sail and Pstl, was excised fragment (about 3. 8 kb) containing the gp64 gene. This fragment (about 3.8 kb) was recovered with a Gel Extraction Kit (QIAGEN), and diluted with PBS to 3 ng / ⁇ l to obtain a DNA fragment for injection.
  • PCAGGS Betata one that was first ⁇ the g P 64 gene -; a (pCAG gp64 Figure 8), was treated with Sail and Pstl, was excised fragment (about 3. 8 kb) containing the gp64 gene. This fragment (about 3.8 kb) was recovered with a Gel Extraction Kit (QIAGEN), and diluted with PBS to 3 ng / ⁇ l to obtain a DNA fragment for injection.
  • QIAGEN Gel Extraction Kit
  • Mouse pronuclear stage eggs to which DNA fragments were injected were collected as follows. First, 5 iv of PMSG was intraperitoneally administered to Balb / c female mice (CLEA Japan), and 48 hours later, 5 iv of hCG was intraperitoneally administered to perform superovulation. . This female mouse was crossed with a male mouse of the same strain. On the morning following mating, the oviduct of the mouse whose plug was confirmed was allowed to flow, and the mouse pronuclear stage eggs were collected.
  • the DNA fragment for injection was injected into pronuclear stage eggs using a micromanipulator (Latest technology of gene targeting (Yodosha), 190-207 20000).
  • the DNA fragment was injected into 373 BALB embryos, and the next day, 216 embryos that had developed at the 2-cell stage were placed in the oviduct of the recipient female on day 1 of pseudopregnancy, about 10 per side (2 per animal). (Around 0).
  • PepTl-expressing budding baculovirus used as an immunogen was prepared as follows.
  • PepTl is a transporter that is a membrane protein.
  • the structure of PepTl is known (GenBank XM-007063, J. Biol. Cem. 270 (12): 6456-6463 (1995)).
  • the full-length PepTl gene was isolated from the human kidney library using PCR.
  • the transfer vector pBlueBacHis-PepTl was prepared by inserting the full-length human PepTl gene into P BlueBacHis2A (Invitrogen), followed by Bac-N-Blue transfection kit.
  • a recombinant virus for human PepTl expression was prepared by introducing a transfer vector into Sf9 cells together with Bac-N-Blue DNA using (Invitrogen). That is, pBlueBacHis-PepTl was added to Bac-N-Blue DNA, and 1 mL of Grace's medium (GIBC0) 20 iL of Cell FECTIN reagent was added, mixed, and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. 2 ⁇ 10 6 Sf9 cells washed once with Grace's medium were dropped.
  • GIBC0 Grace's medium
  • an antibody that binds to PepT has the ability to inhibit the transport activity of a peptide transporter.
  • These antibodies can be used as cytostatic agents, for example, for treatment and prevention of cancer.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、PepTに結合する抗体がペプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有することが見出された。これらの抗体は、細胞増殖抑制剤として、例えば癌の治療や予防への利用が可能である。

Description

ぺプチドトランスポータ一の輸送活性を阻害する抗体 技術分野
本発明は、 ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体、 及び該抗体 を有効成分とする細胞増殖抑制剤に関する。 背景技術
哺乳動物は、 生体外から栄養源を取り込む必要性があり、 細胞には多くの輸送 タンパク質が存在することが知られている。 ぺプチドの輸送を行っているのはぺ プチドトランスポーター （ペプチド輸送タンパク質） であり、 現在までに多数の ペプチドトランスポーターが見出されている （非特許文献 1、 非特許文献 2、 非 特許文献 3、 特許文献 1、 特許文献 2、 特許文献 3など） 。 ペプチドトランスポ —ターはぺプチドの細胞内への流入を行うタンパク質と細胞外への流出を行うタ ンパク質に分けられる。 又、 輸送の際に利用するエネルギー源の違いによっても 分類することができ、 細胞内外のプロトンの濃度差を利用して輸送を行うプロト ン駆動型ペプチドトランスポーターは、 PTRファミ リーに属する （非特許文献 3 ) 。 一方、 生体内の ATPを使用して輸送を行うペプチドトランスポーターは ABC フアミリーに属する（非特許文献 4 )。
ぺプチドトランスポーターはジぺプチド、 トリぺプチドなどの小分子ぺプチド だけでなく、 /3 -ラタタム抗生物質、 ACE阻害剤などの薬剤の輸送にも関与してい ることが報告されている（非特許文献 5、 非特許文献 6、 非特許文献 7、 非特許 文献 8、 非特許文献 9、 非特許文献 1 0 )。
PepTlおよび PepT2は小分子ぺプチドを細胞内に取り込むことによりタンパク質 の吸収ゃぺプチド性窒素源の維持に寄与しているプロトン駆動型ぺプチドトラン スポーターであり、 pepTl、 PepT2はそれぞれアミノ酸 708個、 729個からなる 12回 膜貫通型タンパク質である (非特許文献 1、 非特許文献 2、 非特許文献 1 1 ) 。
PepTlおよび PePT2も β—ラクタム抗生物質やべスタチンなどの薬物を輸送する ことが報告されている（非特許文献 1 2、 非特許文献 1 3、 非特許文献 1 4 )。
PepTlは主に小腸で発現し、 腎臓、 脖臓での発現も確認されている。 PepT2は腎 臓、 脳、 肺、 脾臓での発現が確認されている。 PePTl、 PepT2は小腸や腎尿細管上 皮細胞の刷子縁膜に局在していることが報告されている（非特許文献 1 5、 非特 許文献 1 6、 非特許文献 1 7、 非特許文献 1 1 )。
また、 ヒト腠管癌株で PepTlが細胞膜に過剰発現していること（非特許文献 1 8 ) 、 および PepT2の mRNAがヒト膝管癌株で発現していること （非特許文献 1
9 ) が報告されている。 しかしながら、 PepTlおよび PePT2の癌細胞増殖への関与 は不明であり、 PepTlおよび PepT2の機能を阻害することにより癌細胞の増殖に影 響を与えるか否かの議論は行われていなかつた。
〔特許文献 1〕 特開平 6- 261761
〔特許文献 2〕 特開平 11- 172
〔特許文献 3〕 US5849525
〔非特許文献 1〕 J. Biol. Chem. , 270 (12)； 6456-6463, (1995)
〔非特許文献 2〕 Biochim. Biophys. Acta. , 1235； 461-466, (1995)
〔非特許文献 3〕 Mol. Microbiol. , Vol. 16， p825, (1995)
〔非特許文献 4〕 Annu. Rev. Cell. Biol. , Vol8, p67, (1992)
〔非特許文献 5〕 Ganapathy, Leibach. , Curr. Biol. 3, 695-701, (1991) 〔非特許文献 6〕 Nakashima et ah , Biochem. Pharm. 33, 3345 - 3352， (1984) 〔非特許文献 7〕 Friedman, Ami don. , Pharm. Res. , 6, 1043-1047, (1989) 〔非特許文献 8〕 Okano et al. , J. Biol. Chem, 261, 14130-14134, (1986) 〔非特許文献 9〕 Muranushi et al. , Pharm. Res. , 6, 308-312， (1989)
〔非特許文献 1 0〕 Friedman, Ami don.， J. Control. Rel. , 13, 141-146, (199 0)
〔非特許文献 1 1 ] Terada, Inui, Tanpakusitsu Kakusan Kouso. , Vol. 46, No5, (2001)
〔非特許文献 1 2〕 Saito, H. et al. , J. Pharmacol. Exp. Ther.， 275， 1631- 1637, (1995)
〔非特許文献 1 3〕 Saito, H. et al. , Biochim. Biopys. Acta, 1280, 173-177, (1996)
〔非特許文献 1 4〕 Terada, T. et al. , J. Pharmacol. Exp. Ther. , 281, 141 5-1421 (1997)
〔非特許文献 1 5〕 Ogihara, H. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 220, 848-852, (1996)
〔非特許文献 1 6〕 Takahashi, K. et al. , J. Pharmacol. Exp. Ther.， 286, 1 037-1042 (1998)
〔非特許文献 1 7 ] Hong, S. et al. , Am. J. Physiol. Renal. Physiol. , 276, F658-F665 (1999)
〔非特許文献 1 8〕 Cancer Res. , 58, 519-525, (1998)
〔非特許文献 1 9〕 Millennium World Congress of Pharmaceutical Sciences, (2000) 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 ぺプチ ドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体、 及び該抗体を有効成分とする細 胞増殖抑制剤、 特に膝臓癌などの癌細胞増殖抑制剤を提供することにある。
本発明者らは、 ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する物質が細胞増 殖を抑制することを見出した。 さらに、 ペプチドトランスポーターの輸送活性を 阻害する抗体を見出した。 これらの知見は、 抗体を用いてペプチドトランスポー ターの活性を阻害させ、 細胞増殖を抑制しうることを示すものである。 癌細胞な どの増殖抑制剤の開発において、 ぺプチドトランスポーターの活性の抑制は重要 な指標となると考えられる。
本発明は、 より詳しくは、
(1)ぺプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体
(2)ぺプチドトランスポーターが PepTl又は Pep T2である、 (1)に記載の抗体
(3)ペプチドトランスポーターが PepTlである、 （2)に記載の抗体
(4)モノクローナル抗体である、 （1) 〜（3)のいずれかに記載の抗体
(5) (1)〜 (4)のいずれかに記載の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤
(6) (1)〜(4)のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤
(7)膝臓癌である、 （6)に記載の抗癌剤
(8)ペプチドトランスポーターに結合する抗体を、 ぺプチドトランスポーターを 発現する細胞に接触させることを含む、 ぺプチドトランスポーターの輸送活 性を阻害する方法
(9)ぺプチドトランスポーターが PepTlまたは PepT2である、 （8)に記載の方法
(10)ぺプチドトランスポーターが PepTlである、 （9)に記載の方法
(11)ぺプチドトランスポーターに結合する抗体を、 ぺプチドトランスポーターを 発現する細胞に接触させ、 該ぺプチドトランス1ポーターの輸送活性を阻害す ることを含む、 細胞の増殖を抑制する方法
(12)ペプチドトランスポーターが PepTlまたは PePT2である、 （11)に記載の方法
(13)ぺプチドトランスポーターが PepTlである、 （12)に記載の方法
(14)細胞が癌細胞である、 （11)〜（13)のいずれかに記載の方法
(15)癌細胞が勝臓癌細胞である、 （14)に記載の方法
を、 提供するものである。
本発明は、 ぺプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体を提供す る。 本発明のペプチドトランスポーターは特に限定されないが、 好ましいのはプ 口トン駆動によりぺプチドを細胞内に取り込むぺプチドトランスポーターであり、 さらに好ましいのは PepTlまたは PepT2であり、 特に好ましいのは PepTlである。
PepTlおよび PepT2の塩基配列、 アミノ酸配列は既に知られている （ヒト PepT 1： GenBank XM— 007063、 J. Biol. Chem. , 270 (12) ; 6456-6463, (1995)、 ヒ ト PepT2： GenBank XM一 002922、 Biochim. Biophys. Acta. , 1235 ;461-466, (1995) ) 。
本発明のぺプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体は、 ぺプチ ドトランスポーターを介した輸送 (例えば、 ペプチドトランスポーターによる細 胞内へのぺプチドの取り込み） を阻害することが可能な抗体であれば特に限定さ れない。 ペプチドトランスポーターを介した輸送を阻害するとは、 ペプチドの輸 送を完全に遮断する必要はなく、 輸送されるペプチドの量を減少させることがで きればよレヽ。
本発明の抗体は、 ペプチドトランスポーターと結合し、 ペプチドトランスポー ターの輸送活性を阻害することができれば特に限定されず、 マウス抗体、 ラット 抗体、 ゥサギ抗体、 ヒッジ抗体、 ラクダ抗体、 キメラ抗体、 ヒト化抗体、 ヒト抗 体等を適宜用いることができる。 抗体は、 ポリクローナル抗体であってもモノク 口ーナル抗体であってもよいが、 均質な抗体を安定に生産できる点でモノクロー ナル抗体が好ましい。 ポリクローナル抗体おょぴモノクローナル抗体は当業者に 周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用 し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 所望の抗原や所望の抗原を発現す る細胞を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、 通常の スクリーニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞 （ハイブリ ドーマ） を スクリーニングすることによって作製できる。 免疫される動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 サル、 などの哺乳動物を用いることができる。 抗原の調製は公知の方法、 例えばバキュロウィルスを用いた方法 （W098/46777な ど） 等に準じて行うことができる。 免疫原として、 バキュロウィルス膜上に発現 したべプチドトランスポーターを用いる場合には、 免疫動物として gp64トランス ジエニックマウスを用いることができる (国際特許出願公開番号 W0 03/10445 3) 。
ハイブリ ドーマの作製は、 たとえば、 ミルスティンらの方法 (Kohler. G. and Milstein, C. , Methods Enzymol. (1981) 73： 3-46 ) 等に準じて行うことがで きる。 抗原の免疫原性が低い場合には、 アルブミン等の免疫原性を有する巨大分 子と結合させ、 免疫を行えばよい。
また、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからクローユングし、 適当なベクターに糸且 み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組 換え型抗体を用いることができる （例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kin gdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。 具体的には、 ハイプリ ドーマ の mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 （V領域） の cDNAを合成する。 目 的とする抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、 これを所望の抗体定常領域 (C領域） をコードする DNAと連結し、 これを発現ベクターへ組み込む。 または、 抗体の V領域をコードする DNAを、 抗体 C領域の DNAを含む発現ベクターへ組み込ん でもよい。 発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御のもとで 発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現ベクターにより宿主細胞 を形質転換し、 抗体を発現させることができる。
本発明では、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的 に改変した遗伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ (Chimeric) 抗体、 ヒト化 (Hu manized ) 抗体などを使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製 造することができる。 キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウス抗体 の重鎖、 軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体であり、 マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと 連結し、 これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得 ることができる。
ヒト化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 ヒト以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; complementarity determining reg ion) をヒ ト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遗伝子 組換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレー ムワーク領域 (framework region； FR) を連結するように設計した DNA配列を、 末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオ チドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DN Aと連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させる ことにより得られる （欧州特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576参照） 。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、 相補性決定領域が 良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体 の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレ ームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, K. et al. , Cancer Res. (1 993) 53， 851-856) 。
なお、 当業者であれば公知技術に基づき CDRを決定することができ、 例えば、 K abatらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（("Sequence of Prot eins of Immunological Interest^ US Dept. Health and Human Services, 198 3)を用いて、 相同性を調べることにより決定することができる。
また、 ヒト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒトリンパ球を vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒトミ エローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 抗原への結合活性を有する所望のヒト抗 体を得ることもできる (特公平 1-59878参照) 。 また、 ヒ ト抗体遺伝子の全ての レパートリ一を有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所 望のヒ ト抗体を取得することができる （国際特許出願公開番号 W0 93/12227, W0 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照) 。 さら に、 ヒト抗体ライプラリーを用いて、 パンユングによりヒト抗体を取得する技術 も知られている。 例えば、 ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) としてファ ージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファージ を選択することができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結 合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。 抗原 に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、 当該配列を挿入した適当な発現べ クタ一を作製し、 ヒト抗体を取得することができる。 これらの方法は周知であり、 W0 92/01047, W0 92/20791, W0 93/06213, W0 93/11236, W0 93/19172, W0 95/0 1438, W0 95/15388を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一且単離し、 適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、 適 当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。 真核細胞を宿主 として使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用いることができる。 動 物細胞としては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば、 CH0, COS, ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) , HeLa, Vero, (2) 両生類細胞、 例えば、 アフリカッメガエ ル卵母細胞、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9, sf21, Tn5などが知られてい る。 植物細胞としては、 ニコティアナ ( cotiana 属、 例えばニコティアナ . タバカム (Nicotiana t abac urn) 由来の細胞が知られており、 これをカルス培養 すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス (^accharomyce s) 属、 例えばサッカロミセス 'セレビシェ
Figure imgf000009_0001
serevisiae 、 糸 状菌、 例えば、 ァスペルギルス {Aspergillus 属、 例えばアスペスギルス .二 ガー {Aspergillus niger) などが知られている。 原核細胞を使用する場合、 細 菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 coli ) 、 枯草菌 が知られている。 これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入 し、 形質転換された細胞お n vi troで培養することにより抗体が得られる。
また、 抗体は PepTに結合し、 PepTの機能を阻害するかぎり、 抗体の断片又はそ の修飾物であってもよい。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F(ab' ) 2、 Fv、 または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェィン Fv (s cFv) , Diabodyが挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ぺプ シンなどで処理し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現さ せる（例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、 Bette r, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academ ic Press, Inc.、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (198 9) 178, 476-496, Academic Press, Inc.、 Lamoyi, E. , Methods in Enzymolog y (1989) 121, 663-669、 Bird, R. E. et al.， TIBTECH (1991) 9, 132- 137参 照）。 scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 こ の scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカー、 好ましくはぺプチドリンカ 一を介して連結される（Huston, J. S. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A (1988) 85, 5879-5883)。 scFvにおける H鎖 V領域おょぴ L鎖 V領域は、 本明細書に 抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結するぺ プチドリンカーとしては、 例えば 12- 19残基からなる任意の一本鎖ぺプチドが用 いられる。 scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、 それらの配列のうちの 全部又は所望のァミノ酸配列をコードする DNA部分を铸型とし、 その両端を規定 するプライマー対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにペプチドリンカ 一部分をコードする DNA、 およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規 定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。 また、 一旦 sc Fvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現ベクター、 およぴ該 発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ることができる。 これらの 抗体断片は、 前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、 宿主により産生させる ことができる。 Diabodyは、 可変領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグ メント (例えば、 scFv等) (以下、 Diabodyを構成するフラグメント） を 2つ結合 させて二量体化させたものであり、 通常、 2つの VLと 2つの VHを含む（P. Holliger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、 W093/ 11161号、 Johnson et al. , Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991)、 Holli ger et al. , Protein Engineering, 9, 299-305, (1996)、 Perisic et al. , Str ucture, 2， 1217—1226, (1994)、 John et al. , Protein Engineering, 12 (7) , 5 97-604, (1999)、 Holliger et al, . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 90, 6444-6448, (1993)、 Atwell et al. , Mol. Immunol. 33， 1301-1312， (1996) )。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合し た抗体を使用することもできる。 又、 抗体に放射性同位元素、 化学療法剤、 細菌 由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。 このような 抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができ る。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野において、 すでに確立されている。
本発明で使用される抗体は二重特異性抗体 (bispecific antibody)であっても よい。 二重特異性抗体はペプチドトランスポーター分子上の異なるェピトープを 認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であつてもよいし、 一方の抗原結合 部位がぺプチドトランスポーターを認識し、 他方の抗原結合部位が放射性物質、 化学療法剤、 細胞由来トキシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。 二重特異 性抗体は 2種類の抗体の HL対を結合させて作製することもできるし、 異なるモノ クローナル抗体を産生するハイプリ ドーマを融合させて、 二重特異性抗体産生融 合細胞を作製し、 得ることもできる。 さらに、 遺伝子工学的手法により二重特異 性抗体を作製することも可能である。
又、 本発明においては、 糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。 抗体の糖鎖改変技術は既に知られている （例えば、 W0 00/61739、 W0 02/31140な ど） 。 本発明における 「抗体」 にはこれらの抗体も包含される。
前記のように発現、 産生された抗体は、 通常のタンパク質の精製で使用されて いる公知の方法により精製することができる。 例えば、 プロテイン Aカラムなど のァフィ二ティーカラム、 クロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせることにより、 抗体を分離、 精製すること 力！、さ O (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spr ing Harbor Laboratory, 1988)。
抗体の抗原結合活性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David La ne， Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用するこ とができる。 例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定 法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。 特定の分子がペプチドトランスポーターに結合するか否かは、 公知の方法によ り測定することができる。 公知の方法としては、 例えば、 免疫沈降法、 ウェスト ウェスタンプロッティング法、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免 疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） 、 蛍光免疫法、 表面プラズモン共鳴現象を 利用したバイオセンサーを用いた方法、 などが挙げられる。
抗体がぺプチドトランスポーターの輸送機能を阻害するか否かの検出は公知の 方法、 例えば、 放射性物質 （14Cなど） 、 蛍光物質などでペプチドなどの基質を 標識し、 該基質がぺプチドトランスポーター発現細胞に取り込まれた量を測定す ること等により判断することができる （国際特許出願公開番号 W0 03/083116、 続医薬品の開発 4一薬物の生体膜輸送と組織標的化 1, 11 (編集、 寺田弘、 辻彰） など） 。
本発明の細胞増殖抑制剤の標的となる細胞としては特に限定はされないが、 好 ましいのは脖臓癌、 肝臓癌、 肺癌、 食道癌、 乳癌、 大腸癌などの癌細胞であり、 特に好ましいのは脾臓癌細胞である。 本発明の細胞増殖抑制剤は、 細胞増殖に起 因する疾患、 特に脾臓癌などの癌の治療、 予防を目的として使用される。
本発明の抗体はぺプチドトランスポーターの輸送阻害剤として利用しうるが、 参考例において示したように細胞増殖抑制作用を有するため細胞増殖抑制剤とし ても利用しうる。 細胞増殖抑制剤は、 経口、 非経口投与のいずれでも可能である 、 好ましくは非経口投与であり、 具体的には、 注射剤型、 経鼻投与剤型、 経肺 投与剤型、 経皮投与型などが挙げられる。 注射剤型の例としては、 例えば、 静脈 内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射などにより全身または局部的に投与 することができる。 また、 患者の年齢、 症状により適宜投与方法を選択すること ができる。 投与量としては、 例えば、 一回につき体重 lkgあたり O. OOOlmgから 100 Omgの範囲で選ぶことが可能である。 あるいは、 例えば、 患者あたり 0. 001〜： 1000 00mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。 し力 しながら、 本発明の治療薬 はこれらの投与量に制限されるものではない。 また、 発明の治療薬は、 常法に従 つて製剤化することができ （例えば、 Remington s Pharmaceutical Science, la test edition, Mark Publishing Company, Easton, U. S. A) 、 医薬的に許容され る担体や添加物を供に含むものであってもよレ、。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗ヒト PepTlモノクローナル抗体の、 PepTl発現ウィルスにおける PepTl 活性の阻害を検出した結果を示すグラフである。 ウィルス膜上の PepTl活性は、 ウィルスの [14C]グリシルザルコシンの取り込み量として測定した。 データは平 均土 SD (n=3-4) で表示している。
図 2は、 BaF3細胞における AT- 264の PepTl阻害能を示すグラフである。
図 3は、 AT- 264のヒト膝臓癌株 AsPC-1に対する細胞増殖抑制効果を示すグラフで ある。 データは平均土 S. D. (n=3-4) で表示した。
図 4は、 BaF3/PepT2における AT-264の PepT2阻害能を示すグラフである。 データ は平均 ±S. D. (n=3-4) で表示した。
図 5は、 AT - 264のヒト脾臓癌株 BxPC- 3に対する細胞増殖抑制効果を示すグラフで ある。 データは平均土 S. D. (n=6) で表示した。
図 6は、 構築した gp64遺伝子の塩基配列を表す図である。 図 7は、 図 6の続きを示す図である。
図 8は、 構築した pCAG - gp64ベクターの構造を表す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではない。
[実施例 1 ] gp64TgMによる抗 pepTl抗体作製
PBSに懸濁した lmgのタンパク量に相当する PepTl- BVと 200ngの百日咳毒素を gp6
4トランスジヱニックマウス （国際特許出願公開番号 W0 03/104453) に皮下注射 する事により初回免疫を行った。 以後の免疫は同様に調製した 500 /x gタンパク量 相当の PepTl- BV (ただし百日咳毒素は含まない） を皮下注射することにより行つ た。 最終免疫は 250 /x gタンパク量相当の PepTl- BVを尾静注する事により行った。 このマウスから脾臓細胞を調製し、 通常のポリエチレングリコールを使用する方 法によってマウス P3U1細胞との細胞融合を行った。 スクリーユングは BaF/3- PepT 1細胞を用いた FACSで行った。 更に BaF/3- PepT2細胞を用いた FACSにより PepTl特 異的に結合するモノクローナノレ抗体 （クローン 113、 クローン 119、 クローン 25
3) を樹立した。
[実施例 2 ] PepTl輸送活性阻害能の測定
[14C]グリシルザルコシンを終濃度 になるように HBSS (pH6. 0) で希釈し、 基質溶液とした。 また、 ヒ ト PepTlの細胞外領域を認識するマウス型モノクロ一 ナル抗体 （クローン 119、 クローン 253、 クローン 113) を終濃度 200 g/mLになる ように PBSで希釈し、 抗体溶液とした。 N末端に His- tagを付加した PepTl発現出芽 バキュロウィルス溶液 20 L (50 ,u g蛋白) と抗体溶液 20 Lを混合し、 37°Cで 1時 間プレインキュペートした。 予め、 37°Cで加温していた基質溶液 160 Lをウィル ス溶液に添加し、 反応を開始させた。 1分後、 氷冷していた HBSS (pH7. 4) (以下、 「反応停止液」 と略す） を lmL添加し、 反応を停止させた。 直ちにウィルスを含 む反応液を混合セルロース膜フィルターを用いて吸引濾過し、 5mLの反応停止液 で 2回洗浄した。 膜フィルターを液体シンチレーシヨンバイアルに移し、 クリア ゾル Iを 5mL添加してフィルターを溶解させた。 溶解後、 液体シンチレーシヨン力 ゥンターでフィルタ一上の放射能を計測した。 基質溶液を添加する前に反応停止 液を添加して同様の操作を行い、 フィルタ一^ =の非特異的吸着を計測し、 各実験 の数値から差し引いた。
抗ヒト PepTlモノクローナル抗体による PepTl活性阻害を図 1に示した。 抗体非 存在下での PepTl活性を対照として 100で表した。 3種類の抗ヒト PepTlモノクロ一 ナル抗体の中で、 対照に比べてクローン 119で約 20%、 クローン 253で約 10%の PepT 1活性を阻害した。 この PepTl活性阻害は統計的 （Studentの t検定） に有意であ つた。 以上より、 抗 PepTl抗体は PepTlの輸送活性阻害能を有し得ることが判明し た。
なお、 クローン 119の重鎖可変領域のァミノ酸配列を配列番号： 1に示した。
[参考例 1 ] AT- 264の PepTl活性阻害作用
AT- 264は下記構造式で示される構造を有している。 本化合物がぺプチドトラン スポーター （PepT) の阻害剤であることを以下の実験により確認した。
Figure imgf000015_0001
マウス骨髄由来細胞株 BaF3にヒト PepTlを強制発現させた細胞 （以下、 BaF3/Pe pTlと略す） を用いて、 AT- 264の PepTl阻害能力を検討した。 その結果、 放射性基 質 [14C]グリシルザルコシンの細胞への取り込みは濃度依存的に阻害された （図 2 ) 。 以上より、 AT- 264は PepTlの機能を阻害することが明らかとなった。
[参考例 2 ] AT- 264のヒト膝臓癌株 AsPC- 1に対する細胞増殖抑制作用
AT - 264を RPMI1640-10mM Hepes (以下、 培地と略す) 、 0. 5%エタノール、 0. 5% DMS0で溶解し、 2. 5mM AT- 264溶液を調製した。 また、 この溶液を培地で希釈し て 0. 625ならびに 0. 0625mM AT- 264溶液を調製した。
ヒト勝臓癌株 AsPC- 1を 50%FBSを含む培地で 5 X 104細胞/ mLに調製した。 この懸 濁液を 40 z L/well (2 X 103細胞） で Collagen type Iコート済みの 96wellプレー トに蒔き、 160 Lの AT- 264溶液を添加した。 C02インキュベーターで 6日間培養し (培養 2日後に 100units/mLペニシリン、 0. lmg/mLストレプトマイシンを添加） 、 培養 6日後に、 生細胞数を MTS assayで定量化した。
図 3に細胞増殖試験結果を示した。 2mM AT- 264存在下で約 30%、 0. 5mMでも若干 ではあるが細胞増殖抑制が認められた。 顕微鏡下での観察において、 AsPC- 1の形 態変化は AT- 264存在下でも見られなかった。 また、 RT - PCRの結果から、 AsPC - 1で は PepTlの発現が PepT2に比べて優勢であった。 以上より、 AT-264による細胞増殖 抑制は、 非特異的細胞毒性ではなく PepTlの機能阻害によると考えられた。
[参考例 3 ] AT- 2δ4の PepT2活性阻害作用
マウス骨髄由来細胞株 BaF3にヒト PepT2を強制発現させた細胞 （以下、 BaF3/Pe pT2と略す） を用いて、 AT- 264の PePT2阻害能力を検討した。 その結果、 放射性基 質 [ ]グリシルザルコシンの細胞内への取り込みは濃度依存的に阻害された （図 4 ) 。 以上より、 AT- 264は PepTlのみならず、 PepT2の機能を阻害することが明ら かとなつた。
[参考例 4 ] AT- 264のヒ ト膝臓癌株 BxPC- 3に対する細胞増殖抑制作用
AT— 264を RPMI1640- lOmM Hepes, 100units/mLぺニシリン， 0. lmg/mLストレブト マイシン （以下、 培地と略す) 、 0. 5%エタノール、 0. 5% DMS0で溶解し、 2. 5mM AT- 264溶液を調製した。 また、 この溶液を培地で希釈して 0. 625ならびに 0. 0625m M AT - 264溶液を調製した。 BxPC- 3を 50%FBSを含む培地で 5 X 104細胞/ mLに調製した。 この懸濁液を 40 μ L/w ell (2 X 103細胞） で Collagen typelコート済みの 96wellプレートに蒔き、 160 Lの AT- 264溶液を添カ卩した。 C02インキュベーターで 6曰間培養し、 培養 6日後に生 細胞数を MTS assayで定量化した。
図 5に細胞増殖試験結果を示した。 2mM AT-264存在下で約 75%、 0. 5mMでも約 2 0%の細胞増殖抑制が認められた。 顕微鏡下での観察において、 BXPC- 3の形態変化 は AT- 264存在下でも見られなかった。 また、 RT- PCRの結果から、 BxPC-3では PepT 2の発現が PepTlに比べて優勢であった。 以上より、 AT- 264による細胞増殖抑制は、 細胞毒性ではなく PepT2の機能阻害によると考えられた。 従って、 PepTlまたは Pe pT2の輸送活性を阻害する物資は細胞増殖抑制剤となることが判明した。
[参考例 5 ] gp64トランスジヱニックマウスの作製
gP64トランスジヱニックマウスは国際特許出願公開番号 W0 03/104453に記載 の方法に従って作製した。 即ち、
1 ) gp トランスジエニックベクターの構築
gp64の遺伝子配列 （GenBank Acc No. 9627742) を錶型とし EcoRI認識配列と KOZ AK配列を 5'末端に有する 5' primer 64F1と EcoRI認識配列を 5'末端に有する 3' prim er 64R1 (図 6、 図 7 ) を用い、 以下の条件で PCRを行った。
PCR反応溶液の組成は、 xlO ExTaq buffer 5 μ Ι, ExTaq付属 dNTP 4 μ Ι, ΙΟ μ ιηο le/L 64F1 Ι μ Ι, 10 μ mole/L 64R1 Ι μ Ι, 500 pg/ μ ΐ pBac- Ν- blue Ι μ Ι, 5 uni t/ μ ΐ ExTaq 0. 5 μ Ι, diw 37. 5 μ Lとした。 反応シーケンスは次のとおりである。
94°C 5min→
(94°C 15sec, 57°C 30sec, 72。C 30sec) x 25 cycles →
72°C Train→
4°C forever
増幅されたバンドを pGEM- Teasyにサブクローニング後、 E. coli DH5 aをトラン スフオームした。 T7および SP6プライマーを用いて colony PCRを行い、 インサー トが確認されたクローンを用いて ABI Prism377 DNA sequencerと BigDye Cycle S equence kitと T7プライマーあるいは SP6プライマーにより塩基配列を解析し目的 の遺伝子を含むクローンを確認した。 このクローンから塩基配列に変異が入って いないことを確認した gp64を含む断片を EcoRIにより切り出し、 同じく EcoRI力ッ トした pCAGGSlに挿入し、 E. coli DH5 αをトランスフォームした。 設計通りのク ローンを 250mLの LB培地を用い 37°Cでー晚培養し、 Endofree MAXI kitを用いて精 製し 581. 6 ^ 8のプラスミドを得た。
2 ) 遺伝子の導入
インジェクション用 DNAフラグメントは、 次のようにして調製した。 まず gP64 遺伝子を揷入した pCAGGSベタタ一（pCAG - gp64；図 8 )を、 Sailおよび Pstlで処理 した後、 gp64遺伝子を含む断片 (約 3. 8kb)を切り出した。 この断片（約 3. 8kb)を、 Gel Extraction Kit (QIAGEN)により回収し、 3 ng/ μ 1になるように PBS—で希釈 してィンジェクション用 DNAフラグメントとした。
DNAフラグメントを注入するマウス前核期卵は、 次のようにして回収した。 す なわち、 まず Balb/c系雌マウス（日本クレア）に 5 i. uの PMSGを腹腔内投与、 さら に 48時間後 5 i. uの hCGを腹腔内投与することによって、 過排卵処理した。 この雌 マウスを同系統の雄マウスと交配させた。 交配の翌朝、 プラグを確認したマウス の卵管を権流してマウス前核期卵を回収した。
ィンジェクション用 DNAフラグメントは、 マイクロマニピュレーターを用いて 前核期卵へ注入した （ジーンターゲテイングの最新技術 （羊土社） 、 190-207 20 00) 。 DNAフラグメントを 373個の BALBん胚へ注入し、 翌日、 2細胞期に発生して いた胚 216個を、 偽妊娠 1日目の受容雌の卵管に片側当たり 10個前後 （1匹あたり 2 0個前後） を移植した。
[参考例 6 ] PepTl発現出芽バキュロウィルス （PepTl- BV) の調製
免疫原として用いる、 PepTl発現出芽バキュロウィルスを次のようにして調製 した。 PepTlは、 膜蛋白質であるトランスポーターである。 PepTlの構造は公知で ある（GenBank XM— 007063、 J. Biol. C em. 270 (12)： 6456-6463 (1995) )。
ヒト腎臓ライブラリーから PCRを用いて完全長の PepTl遺伝子を単離した。 完全 長のヒ ト PepTl遺伝子を PBlueBacHis2A (Invitrogen) に挿入することでトランス ファーベクター pBlueBacHis- PepTlを作製した後、 Bac-N - Blue transfection kit
(Invi trogen) を用いて Bac- N- Blue DNAと共にトランスファーベクターを Sf9細 胞に導入することでヒ ト PepTl発現用組換えウィルスを調製した。 即ち、 の p BlueBacHi s - PepTlを Bac- N-Blue DNAに加え、 さらに lmLの Grace' s培地（GIBC0) 20 i Lの Cell FECTIN試薬を加え、 混和し、 室温で 15分間静置した後、 Grace' s培地 で 1回洗浄した 2 X 106個の Sf9細胞に滴下した。 室温で 4時間静置した後、 さらに 2 mLの完全培地（10%ゥシ胎児血清（Sigma社製）、 100units/mLのペニシリン、 及び 1 00 μ g/mLストレプトマイシン（GIBC0- BRL社製）を含む Grace' s培地）を加え、 2で C で培養した。 相同糸且換えにより作製されたヒト PepTl発現用,祖換えウィルスはキ ット添付の指示書に従い二度の純化を行った後、 組換えウィルスのウィルススト ックを得た。
ヒ ト PepTlを発現する出芽型ウィルスの調製は以下のようにして行った。 すな わち、 上記により調製した組換えウィルスを M0I= 5となるように 500mLの Sf9細胞 (2 X lOVmL)に感染させた。 27°Cで 3日間培養した後、 培養液を 800 X gで 15分間 遠心分離し、 細胞ならぴに細胞破砕物を除去した。 遠心分離により回収した上清 は 45, 000 X gで 30分間遠心した後、 沈殿物を PBSに懸濁し、 さらに 800 X gで 15分遠 心することで細胞成分を除去した。 上清は再度 45, 000 X gで 30分間遠心した後、 沈澱物を PBSに再懸濁したものを出芽型ウィルス画分とした。 産業上の利用の可能性
本発明者らによって、 PepTに結合する抗体がぺプチドトランスポ一ターの輸送 活性阻害能を有することが見出された。 これらの抗体は、 細胞増殖抑制剤として、 例えば癌の治療や予防への利用が可能である。

Claims

請求の範囲
1. ぺプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体。
2. ぺプチドトランスポーター力 SPepTl又は PePT2である、 請求項 1に記載の抗体。
3. ぺプチドトランスポーターが PepTlである、 請求項 2に記載の抗体。
4. モノクローナル抗体である、 請求項 1〜3のいずれかに記載の抗体。
5. 請求項 1〜4のいずれかに記載の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
6. 請求項 1〜4のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
7. 膝臓癌である、 請求項 6に記載の抗癌剤。
8. ペプチドトランスポーターに結合する抗体を、 ペプチドトランスポーターを 発現する細胞に接触させることを含む、 ぺプチドトランスポーターの輸送活 性を阻害する方法。
9. ペプチドトランスポーターが PepTlまたは PePT2である、 請求項 8に記載の方 法。
10. ペプチドトランスポーターが PepTlである、 請求項 9に記載の方法。
1 1. ペプチドトランスポーターに結合する抗体を、 ペプチドトランスポーター を発現する細胞に接触させ、 該ぺプチドトランスポーターの輸送活性を阻 害することを含む、 細胞の増殖を抑制する方法。
12. ペプチドトランスポーターが PepTlまたは PepT2である、 請求項 11に記載の 方法。
13. ペプチドトランスポーターが PepTlである、 請求項 12に記載の方法。
14. 細胞が癌細胞である、 請求項 11〜： 13のいずれかに記載の方法。
15. 癌細胞が脾臓癌細胞である、 請求項 14に記載の方法。
PCT/JP2004/004331 2003-03-28 2004-03-26 ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体 Ceased WO2004087762A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04723785A EP1621553A4 (en) 2003-03-28 2004-03-26 ANTIBODIES INHIBITING TRANSPORT ACTIVITY OF PEPTIDE TRANSPORTERS
US10/550,987 US7731960B2 (en) 2003-03-28 2004-03-26 Antibodies that inhibit transport activity of peptide transporters
JP2005504209A JP4551326B2 (ja) 2003-03-28 2004-03-26 ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体
US12/712,982 US20100247539A1 (en) 2003-03-28 2010-02-25 Antibodies that Inhibit Transport Activity of Peptide Transporters

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2003/003975 WO2003083116A1 (en) 2002-03-29 2003-03-28 Emthod of screening transporter inhibitor
JPPCT/JP03/03975 2003-03-28
JP2003110898 2003-04-15
JP2003-110898 2003-04-15

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/712,982 Continuation US20100247539A1 (en) 2003-03-28 2010-02-25 Antibodies that Inhibit Transport Activity of Peptide Transporters

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004087762A1 true WO2004087762A1 (ja) 2004-10-14

Family

ID=35529802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/004331 Ceased WO2004087762A1 (ja) 2003-03-28 2004-03-26 ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体

Country Status (4)

Country Link
US (2) US7731960B2 (ja)
EP (1) EP1621553A4 (ja)
JP (2) JP4551326B2 (ja)
WO (1) WO2004087762A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050004227A1 (en) * 2001-10-16 2005-01-06 Ryoichi Saitoh Cell growth inhibitor
ATE458498T1 (de) * 2001-12-04 2010-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Zellwachstumshemmer mit anti-pept-antikörper
JPWO2003083116A1 (ja) * 2002-03-29 2005-08-04 中外製薬株式会社 トランスポーター阻害物質スクリーニング方法
US7750204B2 (en) * 2002-06-05 2010-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing antibody
JP4551326B2 (ja) * 2003-03-28 2010-09-29 中外製薬株式会社 ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体
EP1731032B1 (en) * 2004-03-31 2016-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Transgenic mice carrying gene for soluble form of membrane protein useful for antibody production against a target antigen, and methods using thereof
EP3177637B8 (en) 2014-08-06 2020-08-19 Georgia State University Research Foundation, Inc. Kpv for treating colorectal cancer and ibd

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003033024A1 (fr) * 2001-10-16 2003-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibiteur de proliferation cellulaire

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL108499A (en) 1993-02-04 2000-02-29 Lilly Co Eli Mammalian influx peptide transporter
US5500346A (en) 1993-06-29 1996-03-19 Eli Lilly And Company Monoclonal antibodies to human influx peptide transporter
US5849525A (en) 1994-03-09 1998-12-15 Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions corresponding to a proton-coupled peptide transporter and methods of making and using same
JPH08134100A (ja) 1994-11-09 1996-05-28 Unitika Ltd 糖鎖特異的抗体の製造方法
KR19990071666A (ko) 1995-11-30 1999-09-27 이경하 술파미드 유도체
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
JPH11172A (ja) 1997-06-11 1999-01-06 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ペプチド輸送タンパク質遺伝子を含むｄｎａ、ベクター及び微生物
US6867017B1 (en) 1998-10-23 2005-03-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services ATP-binding transporter (ABC7) and methods for detection of anemia and ataxia
AU776865B2 (en) 1998-11-10 2004-09-23 University Of Rochester T cells specific for target antigens and methods and vaccines based thereon
JP4552056B2 (ja) 1999-11-15 2010-09-29 独立行政法人科学技術振興機構 後天的免疫寛容の獲得方法
JP2001197846A (ja) 2000-01-18 2001-07-24 Ys New Technology Kenkyusho:Kk 免疫寛容動物の作製方法
AU2002236526B9 (en) * 2000-11-15 2008-05-01 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sol-fusin: use of GP64-6His to catalyze membrane fusion
ATE458498T1 (de) * 2001-12-04 2010-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Zellwachstumshemmer mit anti-pept-antikörper
JPWO2003083116A1 (ja) 2002-03-29 2005-08-04 中外製薬株式会社 トランスポーター阻害物質スクリーニング方法
US7750204B2 (en) * 2002-06-05 2010-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing antibody
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
US20040223970A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-11 Daniel Afar Antibodies against SLC15A2 and uses thereof
JP4551326B2 (ja) * 2003-03-28 2010-09-29 中外製薬株式会社 ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体
EP1731032B1 (en) 2004-03-31 2016-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Transgenic mice carrying gene for soluble form of membrane protein useful for antibody production against a target antigen, and methods using thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003033024A1 (fr) * 2001-10-16 2003-04-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibiteur de proliferation cellulaire

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIANG R. ET AL: "Human Intestinal H+/Peptide cotransporter", J. BIOL. CHEM., vol. 270, no. 12, 1995, pages 6456 - 6463, XP002912968 *
LIU W. ET AL: "Molecular cloning of PEPT 2, a new member of the H+/peptide cotransporter family, from human kidney", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1235, 1995, pages 461 - 466, XP002980263 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP4551326B2 (ja) 2010-09-29
US20100247539A1 (en) 2010-09-30
JPWO2004087762A1 (ja) 2006-08-24
EP1621553A1 (en) 2006-02-01
JP2010248202A (ja) 2010-11-04
US7731960B2 (en) 2010-06-08
EP1621553A4 (en) 2006-08-23
US20060210569A1 (en) 2006-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101568051B1 (ko) Ａｎｅｘｅｌｅｋｔｏ에 결합하는 단일클론항체, 및 그의 이용
KR102573257B1 (ko) 섬유증의 치료를 위한 항-fam19a5 항체의 용도
CN113474362B (zh) 对cd44特异性的抗体
JP5795538B2 (ja) ヒトのラミニン５アルファ３鎖のｌｇ４−５ドメインに対するモノクローナル抗体
JP6550385B2 (ja) Ｃｃｒ９に対する抗体およびその用途
JP5512824B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合するヒト抗体
CN107298713B (zh) 一种抗pd-l1抗体及应用、制备方法、试剂盒和药物
CN101014367B (zh) 使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的辅助疗法
WO2007129457A1 (ja) アルツハイマー病および癌の治療薬
CA2442318A1 (en) Antibodies against cancer
KR102701695B1 (ko) 항-dkk-1 항체를 사용하여 암을 치료하기 위한 바이오마커로서의 베타-카테닌의 용도
JP2010248202A (ja) ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体
JP2010013471A (ja) 抗ＰｅｐＴ抗体を含有する細胞増殖抑制剤
EP3992205A1 (en) Sars coronavirus-2 spike protein binding compounds
JPWO2001082968A1 (ja) 細胞増殖抑制剤
WO2007097461A1 (ja) Ｃ型肝炎治療用抗体
WO2022023292A2 (en) Corona virus spike protein-targeting antibodies and use thereof
AU2016202118A1 (en) Carrier immunoglobulins and uses thereof
JP6944701B2 (ja) ＣＤ１１ｂアンタゴニストを含む劇症型急性肺炎治療用組成物
JPWO2005105144A1 (ja) 潜在型ＴＧＦ−βの活性化抑制剤
WO2025101747A1 (en) Methods and compositions for treatment of pulmonary hypertension
KR20220002098A (ko) Lgals3bp에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
BR112022006760B1 (pt) Anticorpo anti-receptor semelhante a quemerina 1 ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo e usos preventivos ou terapêuticos do mesmo
HK1149767A (en) Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof
HK1107010B (en) Adjuvant therapy with the use of anti-glypican 3 antibody

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005504209

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004723785

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004723785

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10550987

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10550987

Country of ref document: US