WO2004106930A1 - イムノクロマトグラフ法 - Google Patents

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WO2004106930A1
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immunochromatographic
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membrane
surfactant
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Tetsuya Ono
Takayuki Fujii
Kazuyuki Sugiyama
Takashi Kuroda
Masahide Kawamura
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Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
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    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel immunochromatography method.
  • plasma or serum is separated from whole blood in advance to remove blood cell components, etc.
  • centrifugation requires a centrifuge and is rarely used by general clinicians in consultation rooms.
  • a method of separating plasma using a filter requires time as well as additional costs as in a certain force centrifugation method.
  • a filter for example, a plasma filter; Fujifilm
  • a reagent Nihon Kohden Cell Tack Chem
  • a hemolytic assay method Patent Document 4
  • red does not affect the measurement.
  • the reagent using the immunochromatography method which uses gold colloidal immunochromatography, which is characterized by coloring in red, and visually judges the results using various colored or colored base materials, uses hemolysis. Is a fatal problem. Therefore, in order to maintain the blood cell components on the plasma separation pad under mild conditions in which erythrocytes are not crushed or lysed, it often takes time S to develop the immunochromatograph.
  • the amount of developed plasma is greatly affected by the viscosity of the whole blood sample, which often impairs quantitative performance.
  • the separation and elution rates of plasma often differed greatly due to the influence of the matrix such as the viscosity of the whole blood sample. Therefore, there is even a device (Roche) that measures the development time after plasma separation by a plasma separation pad, rather than the time after dropping a whole blood sample, and then performs correction measurement of the degree of staining (Roche).
  • the blood cell component reaches the immunochromatographic development membrane to some extent. Therefore, when a test sample is developed by immunochromatography, such as enzyme immunochromatography, and then further developed, such as a washing solution or an enzyme substrate solution, separately from the test sample solution, the plasma separation pad is used.
  • the blood cell component that oozes out and reaches the immunochromatographic development membrane inhibits the development of the component that later develops, and as a result, it is impossible to measure by the normal immunochromatography method.
  • the immunochromatography method for measuring antigens on red blood cells is used to deliberately disrupt red blood cells using an immunochromatographic developing membrane (5-100 zm) with a very large pore size.
  • An immunochromatographic developing membrane (5-100 zm) with a very large pore size is known.
  • Patent Document 5 A reagent for developing an immunochromatographic developing membrane without performing the method.
  • Patent Document 5 A reagent for developing an immunochromatographic developing membrane without performing the method.
  • this is also characterized in that the erythrocyte component is not crushed, as in the above-mentioned ordinary immunochromatography.
  • the immunochromatographic method is characterized by its simple, rapid, and inexpensive aspects, and it requires a complicated method using a centrifugal separator and a method using an expensive plasma separation prefilter in advance.
  • the method of separation undermined the advantages of the immunochromatographic method.
  • the plasma separation pad pre-installed on the Immunokur-Matograph strip has responded to such demands, leaving room for improvement in the power speed and reproducibility, and, for example, as in the case of the enzyme immunochromatography method. In the case of a method of flowing another liquid later, it was difficult to apply.
  • Patent Document 1 JP-A-2002-214236
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-350428
  • Patent Document 3 Patent No. 2940990
  • Patent Document 4 JP-A-10-221334
  • Patent Document 5 JP-A-2000-111555
  • an object of the present invention is to provide an immunochromatography method in which a whole blood sample is processed by a quick and simple method, and the whole blood sample is hemolyzed, and the immunochromatographic development membrane is not affected even if it is temporarily colored red. It is an object of the present invention to provide an immunochromatographic method capable of analyzing a whole blood sample quickly, simply and inexpensively by combining the methods.
  • the object of the present invention is to provide (1) a process of preparing a sample derived from whole blood by performing (1) hemolyzing whole blood and performing a chromatographic development enabling process according to the present invention (hereinafter referred to as a whole blood-derived sample preparation process and Name);
  • red pigment removal step a step of removing the red blood cell-derived red pigment on the immunochromatographic development membrane by developing the washing solution on the immunochromatographic development membrane
  • the problem can be solved by an immunochromatography method characterized by including the following.
  • the chromatographic development enabling process is a process of solubilizing, removing, or reducing the size of whole blood components larger than the pore size of the immunochromatographic developed membrane.
  • whole blood is hemolyzed by contacting the whole blood with a surfactant, and a whole blood component larger than the pore size of the immunochromatographic development membrane is removed.
  • a sample derived from whole blood is prepared by solubilization.
  • whole blood is hemolyzed by passing the whole blood through a filter, and a component in whole blood which is larger than the pore size of the immunochromatographic developing membrane is removed, thereby obtaining whole blood.
  • whole blood is hemolyzed by sonication or high-pressure crushing, and a component in whole blood larger than the pore size of the immunochromatographic developing membrane is reduced.
  • a sample derived from whole blood is prepared by particle formation.
  • the whole blood is hemolyzed and a whole blood component larger than the pore size of the immunochromatographic development membrane is solubilized.
  • a sample derived from whole blood is prepared.
  • the present invention provides (1) a strip for immunochromatography
  • the concentration of the surfactant in the whole blood diluent is a concentration at which whole blood is hemolyzed when preparing a sample for immunochromatography by diluting whole blood with the whole blood diluent.
  • the invention relates to a kit for immunochromatography.
  • the immunochromatographic method of the present invention there is no need to devise a technique for preventing the whole blood sample from being hemolyzed, which has been required by the conventional method, so that simple whole blood sample processing and immunochromatographic development are possible. Accordingly, simple and short-time immunochromatographic measurement using a whole blood sample as a test sample can be performed at low cost and hardly affected by variations in viscosity of whole blood.
  • whole blood is lysed (for example, by lysis or crushing of red blood cells), and for example, components in whole blood larger than the pore size of an immunochromatographic developing membrane are solubilized or reduced in particle size, for example.
  • components in whole blood larger than the pore size of an immunochromatographic developing membrane are solubilized or reduced in particle size, for example.
  • the pore size of the developing membrane to be used for normal I Takeno chromatography is about 2-20 beta m, erythrocytes having a diameter of about of about 8 ⁇ ⁇ , more the size of white blood cells, or slightly smaller platelets
  • a surfactant so that the pores in the membrane can be developed without clogging. S is possible.
  • the whole blood-derived sample causes the immunochromatographic development membrane to be colored red.
  • the red component is washed out by washing away the red component derived from the lysed whole blood with a washing solution or a substrate solution in the case of an enzymatic method.
  • the components can be removed, and the original target staining line colored by an immune reaction, enzyme reaction, or the like can be observed.
  • the present invention is based on such findings.
  • the method of preparing a whole blood-derived sample is capable of lysing whole blood, and performing a chromatographic development enabling process. It is not particularly limited as long as it is possible.
  • the “chromatographic development enabling process” refers to a process for enabling chromatographing on an immunochromatographic developing film in a developing step described later, and more specifically, is not limited to this.
  • whole blood components larger than the pore size (preferably the lower limit of the pore size) of the immunochromatographic developing membrane for example, various blood cell components (for example, red blood cells, white blood cells, or platelets), Blood cell membrane after hemolysis (including erythrocyte membranes, various leukocyte membranes, platelet membranes, etc.), or aggregates derived from fibrin or phospholipids, etc.), for example, solubilization, removal, or particle reduction Process.
  • Examples of the method for preparing a whole blood-derived sample include a method using a surfactant, a method using a filter, a method using sonication or high-pressure crushing, and a method using an organic solvent. Can be mentioned. In the whole blood-derived sample preparation step, any one of these methods can be performed alone or in combination of two or more.
  • the whole blood is hemolyzed by bringing the collected blood into contact with the surfactant, and the whole blood component larger than the pore size of the immunochromatographic development membrane.
  • a sample derived from whole blood is prepared by solubilizing
  • a component in whole blood that is larger than the pore size of the immunochromatographic developed membrane is solubilized by the surfactant, so that the immunochromatographic developed membrane can be used in the developing step described below.
  • the whole blood-derived sample can be developed without clogging the holes.
  • Surfactants have the property of being easily collected at the interface between two substances, and significantly change the properties of the interface between the two substances.
  • the surfactant molecule is composed of a part of the lipophilic group and the hydrophilic group having opposite properties.
  • Surfactants that can be used in the present invention can be used as long as they have such properties.
  • nonionic surfactants and anionic surfactants which are classified by ion type, can be used. It is also possible to use an agent, a cationic surfactant, or an amphoteric surfactant.
  • nonionic surfactant examples include, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylaryl ether, polyoxyethylene derivative, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, Examples thereof include polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene alkylamine, and alkyl alcohol amide.
  • anionic surfactant examples include a fatty acid salt, an alkyl sulfate ester salt, an alkyl benzene sulfonate, an alkyl naphthalene sulfonate, and an alkyl sulfosuccinate.
  • cationic surfactant examples include an alkylamine salt and a quaternary ammonium salt.
  • amphoteric surfactant examples include alkyl betaine, amine oxide, and dimethylammoniopropanesulfonic acid.
  • alkyl betaine alkyl betaine
  • amine oxide amine oxide
  • dimethylammoniopropanesulfonic acid alkyl betaine
  • sodium cholate or sodium deoxycholate having a steroid skeleton which is known as a membrane protein solubilizing agent, is also a surfactant that can be used in the present invention.
  • these surfactants can be used alone or in combination of two or more, but are not limited to the surfactants exemplified here. Further, it is also conceivable to use a supplementary treatment, for example, coexistence of salts, urea, and / or an organic solvent, or a filtration treatment (passing through a filter), a sonication treatment or a high-pressure crushing treatment described later.
  • a surfactant solution which surfactant concentration in the surfactant solution depends on the characteristics of the surfactant. It may be more viscous than whole blood itself, and may interfere with solubilization of whole blood components, which is difficult to mix with whole blood. Conversely, if the concentration of the surfactant in the surfactant solution is too low, solubilization of the components in whole blood is delayed or impossible, and as a result, normal immunochromatographic development may not be performed.
  • polyoxyethylene monolaurate (trade name: Tween20; manufactured by Sigma), which is one of polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters classified as a nonionic surfactant, is used alone.
  • the final concentration in the hemolysis reaction system (hereinafter the same applies) can be used within a range of preferably 230%, more preferably 3-20%, and even more preferably 1020%.
  • polyethylene glycol mono-para-iso-octylphenyl ester (trade name: TritonX_100; manufactured by Sigma), which is one of the polyoxyethylene alkyl ethers classified as nonionic surfactants, it is preferable to use it alone. It can be used in a range of 0.1-30%, more preferably 0.320%, and still more preferably 0.510%. Polio classified as a nonionic surfactant In the case of certain polyoxyethylene lauryl ethers (trade name: Kaku Margen 108; manufactured by Kao Corporation), the range is preferably 0.01% to 20%, more preferably 1.1% to 20%, and still more preferably 2.5% to 10%. Can be used with polyethylene glycol mono-para-iso-octylphenyl ester (trade name: TritonX_100; manufactured by Sigma), which is one of the polyoxyethylene alkyl ethers classified as nonionic surfactants, it is preferable to use it alone. It can be used in a range of 0.1-30%,
  • sodium dodecyl sulfate which is one of the alkyl sulfates classified as anionic surfactants, is used alone, it is preferably 0.01% to 20%, more preferably 0.05% to 7%, and still more preferably 0.05% to 7%. It can be used in a range of preferably 0.05-5%, particularly preferably 0.1-2.5%.
  • Paramityltrimethylammonium chloride which is one of the quaternary ammonium salts classified as a cationic surfactant [trade name: PB40 (40% solution of paramityltrimethylammonium chloride); NOF Corporation When used alone, it can be used in a range of preferably 0.1 to 30%, more preferably 0.320%, and still more preferably 0.55%.
  • Stearyl betaine (trade name: Amphitol 86B; manufactured by Kao Corporation) or 3-[(3-coramidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (trade name: CHAPS; Dojin Chemical) classified as an amphoteric surfactant Is used alone, preferably in a range of 0.1 to 30%, more preferably 0.3 to 20%, and still more preferably 0.5 to 10%.
  • the concentration is lower than the above concentration range, the same effect as the above condition can be obtained by combining a plurality of surfactants.
  • 0.1% concentration (as the final concentration in the hemolysis system) did not allow solubilization of whole blood, immunochromatography, and Activators (Emulgen 108, Traiton X-100, Tween20, Amphitol 86B, and CHAPS) were solubilized and immonochromatized by mixing a total of five 0.1% concentrations as described in Example 3. Color and development are possible.
  • the solvent for diluting the surfactant does not necessarily have to be a 100% aqueous solution, and it is possible to lyse hemoglobin with a solvent containing an organic solvent and develop it by immunochromatography.
  • the PB40 is a 40% solution of paramytyltrimethylammonium chloride, and 20-30% of isopropyl alcohol is present in the solvent.
  • the concentration of the surfactant is limited to the above-mentioned surfactant concentration because the suitable concentration is largely different due to, for example, the pretreatment of a whole blood sample, the combination of the above-mentioned auxiliary means, and the characteristics of the immunochromatographic test. Not something.
  • the ratio of mixing the surfactant solution with whole blood is also an important factor for normal immunochromatographic development.
  • the ratio of the surfactant solution is too low, the components in whole blood are not sufficiently solubilized, which may hinder normal immunochromatographic development. It is desirable to increase the ratio of the surfactant solution in order to keep the development time shorter and more stable.
  • the ratio of the surfactant solution is too high, the ratio of whole blood relatively decreases, and as a result, the measurement sensitivity may be weakened.
  • the applicable ratio depends on the type or concentration of the surfactant used, but the amount of the surfactant solution relative to whole blood is preferably 1/10 or more.
  • the concentration of the surfactant solution and the mixing ratio with whole blood may, in addition to the effects described above, inhibit the reaction on the immunochromatography, or cause the background derived from non-specific staining. May be increased. Therefore, it is preferable to individually select the optimum surfactant type, concentration, mixing ratio with whole blood, or mixing time depending on the measurement method, measurement item, measurement time, and the like.
  • a filter In a method using a filter, whole blood collected is passed through a filter, thereby obtaining a whole blood.
  • a sample derived from whole blood is prepared by lysing blood and removing components in whole blood larger than the pore size of the immunochromatographic developing membrane.
  • the component force in whole blood which is larger than the pore size of the immunochromatographic developing membrane, is removed by the filter, so that the pores of the immunochromatographic developing membrane are clogged even in the later-described developing step.
  • a sample derived from whole blood can be developed without performing the method.
  • a filter that can be used in the whole blood-derived sample preparation step of the method of the present invention includes, for example, a syringe filter.
  • Whole blood is aspirated from a blood collection tube using a suitable syringe, for example, a 1 mL syringe (Termo), and a syringe filter is fitted to the end of the syringe, and pressure is applied to remove the whole blood in the syringe.
  • a suitable syringe for example, a 1 mL syringe (Termo)
  • a syringe filter is fitted to the end of the syringe, and pressure is applied to remove the whole blood in the syringe.
  • the pore size of the filter is preferably smaller than the pore size (preferably the lower limit of the pore size) of the immunochromatographic development membrane.For example, if the pore size average of the immunochromatography development membrane is 5 / m, the pore size of one filter Is preferably less than 5 / im. Also, when the pore size of the immunochromatographic development membrane is 5-8 / im, the pore size of the filter is preferably 5 ⁇ or less.
  • the pore size indicates a range including approximately 80% of the total pore size, and the filter pore size means the maximum pore size.
  • the collected blood is subjected to sonication or high-pressure crushing so that the whole blood is lysed and the whole blood larger than the pore size of the immunochromatographic developing membrane is used.
  • a whole blood-derived sample is prepared by reducing the size of the components.
  • whole blood components larger than the pore size of the immunochromatographic development membrane are reduced to small particles by sonication or high-pressure crushing, so that the pores of the immunochromatography development membrane are also used in the subsequent development step. The ability to develop whole blood-derived samples without clogging.
  • Examples of the sonication that can be used in the whole blood-derived sample preparation step of the method of the present invention include sonication that is used for normal cell disruption.
  • a high-pressure crushing treatment for example, a method using a pressure load device (for example, a French press or the like) is mentioned. Power s. While a French press applies high pressure to a sample, when recovering a part of the sample, the pressure can be rapidly reduced to crush the cells, and the pore size of the immunochromatographic membrane in whole blood can be reduced. It is also effective in crushing and dispersing larger whole blood components.
  • the means for preparing a whole blood-derived sample is not particularly limited.
  • organic solvent that can be used in the whole blood-derived sample preparation step, it is possible to lyse whole blood and to solubilize components in whole blood that are larger than the pore size of the immunochromatographic developing membrane.
  • the organic solvent is not particularly limited as long as the organic solvent can be used.
  • examples of the organic solvent include ketones (for example, acetone and the like), alcohols (for example, methanol, ethanol, and 2-propanol), and acetonitrile.
  • the concentration of the organic solvent used may be determined, for example, by the type of organic solvent or various conditions (e.g., mixing conditions with whole blood, immunochromatography, or a measurement method as described above for the surfactant). Can be determined as appropriate according to the conditions for implementing the above.
  • the developing step in the method of the present invention can be carried out in the same manner as the developing step in ordinary immunochromatography, except that the sample obtained in the step of preparing a whole blood-derived sample is used. Since the whole blood-derived sample used in this development step is preliminarily solubilized, removed, or made into small particles, the components in the whole blood that may clog pores of the immunochromatographic development membrane may be developed by immunochromatography. It is possible to develop immunochromatography without clogging the pores of the membrane.
  • the red dye eluted from the red blood cells in the crushed whole blood remains red in the immunochromatographic development membrane, and it is difficult to observe staining or the like of the determination line. Then, after the whole blood-derived sample is developed, in the red pigment removal step in the method of the present invention, another liquid is developed to remove the red pigment from the immunochromatographic development membrane.
  • This red dye removing liquid is not particularly limited as long as it is a liquid that can be removed by spreading out the red dye by spreading on the immunochromatographic developing film.
  • the red pigment removing liquid for example, only the red component is washed away
  • a simple washing solution e.g., water or a buffer solution
  • the substrate liquid can also be used as a liquid for removing a red dye, and can also play a role of flushing out the red component.
  • the red pigment removal liquid is not particularly limited in its start of development as long as the red pigment can be removed when the whole blood-derived sample is fully developed. For example, it is common to start the development of the red pigment removal liquid after the development of the whole blood-derived sample has started.However, depending on the position of the development start position, the red pigment removal liquid may be used just before the development of the whole blood-derived sample. You can also start deploying.
  • the kit for immunochromatography of the present invention comprises at least (1) a strip for immunochromatography and (2) a diluted whole blood solution containing a surfactant.
  • a surfactant that can be used in the whole blood-derived sample preparation step of the method of the present invention can be used.
  • the concentration of the surfactant in the whole blood diluent is such that whole blood is lysed when a sample for immunochromatography (that is, a sample derived from whole blood) is prepared by diluting whole blood with the whole blood diluent. There is no particular limitation as long as it is the concentration.
  • the whole blood diluent may be, if desired, a binding substance (eg, an antibody or an antigen) that specifically binds to the analyte in the test sample (ie, whole blood) and / or a stabilization reagent for stabilization.
  • a binding substance eg, an antibody or an antigen
  • examples that can further include an agent (eg, protein, sugar, or high molecular compound, etc.)
  • a hemolyzed and solubilized whole blood sample was prepared using a surfactant, and specific IgE was measured by enzyme immunochromatography.
  • Nitrocellulose membrane (HF180; pore size 5-8 ⁇ m; manufactured by Millipore) 5 mm X 25 mm Cut to size.
  • an aqueous solution of mite allergen-extracted protein (Dermatophagoides pteronyssinus; manufactured by Glia) [concentration lmg / mL; diluted with 5 mmol / L borate buffer (pH 8.5) Dialyzed aqueous solution] was applied linearly with a width of lmm.
  • the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour and then at 37 ° C. for 30 minutes to immobilize the mite-extracted protein. It was stored in a silica gel desiccator and dried overnight at room temperature to prepare a mite allergen-immobilized membrane.
  • alkaline phosphatase of the small intestine was diluted with a phosphate buffer to a volume of 2 mg ZmL, dialyzed, and adjusted to 7.5 mmol ZL with N-succinimidyl 3_ (2-pyridylthio) propionate ( (SPDP) 100 / i L. After reacting at 4 ° C for 5 hours, the mixture was dialyzed against a phosphate buffer to prepare pyridyldithiopropionate (PDP) -introduced alkaline phosphatase.
  • PDP pyridyldithiopropionate
  • the anti-IgE antibody Fab 'and the PDP-introduced alkaline phosphatase were mixed in equal amounts of 1 mL each, and then 40 ⁇ L of 1 mol / L hydroxylamine was added. After reacting at 4 ° C for 3 days, the mixture was subjected to gel filtration using a gel filtration column (TSKgel G3000SW; manufactured by Tosoh Corporation) to remove unreacted anti-IgE antibody Fab 'and PDP-introduced alkaline phosphatase. An aqueous anti-IgE antibody solution was prepared.
  • the enzyme-labeled anti-IgE antibody solution prepared in Example 1 (1 one 2), such that the antibody 1 mu g amounts, 5. 5MmolZL phosphate buffer containing 0% sucrose (P H7. 2) Then, apply 10 ⁇ L of the diluted solution to an absorption pad (PREM1420; manufactured by Pall) cut into 5 mm ⁇ 5 mm, and dry in a silica gel desiccator at room temperature overnight under reduced pressure ( ⁇ 100 mmHg). An enzyme-labeled antibody pad was prepared.
  • PREM1420 manufactured by Pall
  • a cellulose pad (AP25; manufactured by Millipore) was cut into a size of 5 mm ⁇ 20 mm to obtain an absorbent pad.
  • Example 1 On a plastic adhesive sheet (manufactured by BioDot) cut into a size of 5 mm x 60 mm, the sample addition pad prepared in Example 1 (1-14) was applied from the upstream side to the downstream side in the developing direction. Both ends of the AP-labeled antibody pad prepared in 1-3), the allergen-immobilized membrane prepared in Example 1 (1_1), and the absorption pad prepared in Example 1 (1-5) was overlapped with an adjacent member by about lmm and affixed, thereby producing an immunochromatographic strip.
  • hemolysis refers to a state in which the red blood cell membrane is solubilized and a red component such as hemoglobin in the red blood cells is eluted, thereby becoming more transparent.
  • the immunochromatographic strip was inserted into a microplate well in which 50 ⁇ L of the sample obtained by hemolyzing and solubilizing the whole blood was dispensed in advance with the sample addition pad facing down.
  • the sample was chromato-developed by leaning and capillary action. Then, 10 minutes after the start of the chromatographic development, 200 ⁇ L of an aqueous solution of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphoric acid (BCIP; manufactured by Boehringer GmbH) was further developed with the chromatograph.
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphoric acid
  • the amount of mite-specific IgE in each sample is a value measured by a conventional quantitative measurement method (Alastat-specific IgE antibody measurement kit; sold by Jatron, manufactured by DPC, USA) and is an international standard unit. Expressed in IU / mL.
  • Tables 1 to 8 show the results of visually determining the degree of coloring in the allergen solid phase region (lmm width band) after the completion of chromatographic development.
  • the symbols ⁇ 1 '', ⁇ Soil '', ⁇ + '', and ⁇ ++ '' shown in Table 1 Table 8 and Table 9 Table 19 described below indicate no coloring, weak coloring, clear coloring, respectively. And strong coloring.
  • the surfactant concentration in the table indicates the concentration of the surfactant solution used in Example 1 (2-2), and the final concentration of the surfactant in the hemolysis reaction system is as shown in the table. 1/2 of
  • a whole blood sample solubilized and solubilized with a surfactant was prepared according to the following procedure, and specific IgE was measured by colloidal gold immunochromatography.
  • Example 1 As described in Example 1 (1_1), an aqueous solution of mite allergen-extracted protein was linearly applied to a nitrocellulose membrane with a width of lmm to prepare a mite allergen-immobilized membrane.
  • the anti-human IgE mouse monoclonal antibody (1 mg) was diluted with a phosphate buffer (2 mmol / L, pH 7.0) to a concentration of 0.1 mg / mL, and dialyzed. Then, the gold colloid suspension (GOLD
  • the precipitated gold colloid-labeled antibody was resuspended in 100 mL of a borax buffer solution ( ⁇ 80) containing 0.5% sucrose and 0.02% Tween20, and at 10 ° C 16, OOO X The mixture was centrifuged at g for 1 hour, and the supernatant was removed. Further, the precipitated colloidal gold-labeled antibody was resuspended in 100 mL of Borax buffer ( ⁇ 80) containing 0.5% sucrose and 0.02% Tween 20, and the suspension was incubated at 10 ° C. After centrifugation at 16,000 X g for 1 hour, the supernatant was removed.
  • Example 1 (1-13) was repeated except that the gold-colloid-labeled anti-IgE antibody suspension prepared in Example 2 (1-2) was used instead of the enzyme-labeled anti-IgE antibody aqueous solution. By repeating, a gold colloid-labeled antibody pad was produced.
  • Example 1 (1-6) The procedure of Example 1 (1-6) was repeated, except that the gold-colloid-labeled antibody pad prepared in Example 2 (1-3) was used instead of the enzyme-labeled antibody pad. An immunochromatographic strip was prepared.
  • Example 1 (2-1) various solutions were prepared, and in the same manner as in Example 1 (2-2), a sample was prepared by mixing human whole blood and the above-mentioned solutions in equal amounts of 100 ⁇ L each. Then, the presence or absence of hemolysis was examined.
  • Example 2 In place of the enzymatic immunochromatographic strip, the gold colloid for immunochromatographic strip prepared in Example 2 (1-4) was used, and 5_bromo_4_chromopore_3-indolylphosphoric acid ( ⁇ CIP; Boehringer) The procedure of Example 1 (2-3) was repeated, except that the phosphate buffer was developed instead of the aqueous solution (mannheim) to develop the gold colloid iminochromatographic method.
  • Tables 9 to 16 show the results of visually determining the degree of coloring in the allergen-immobilized region (lmm width band) after the completion of the chromatographic development.
  • Detergent port Deionized water Physiological saline Phosphate buffer Blood presence / absence Hemolysis No hemolysis No hemolysis
  • CHAPS volume mixed whole blood sample
  • a hemolyzed and solubilized whole blood sample was prepared using a surfactant mixture containing five types of surfactants at equal concentrations according to the procedure described below, and the specificity was determined by enzyme immunochromatography. IgE was measured.
  • Example 1 An enzyme immunochromatographic strip was prepared by repeating the procedure described in (1).
  • whole blood was lysed using a syringe filter, and a sample derived from whole blood was prepared by removing components in whole blood larger than the pore size of the filter, and the enzyme immunochromatography was performed. Specific IgE was measured by the method.
  • Example 1 (1) By repeating the operation described in Example 1 (1), an immunochromatographic strip using HF180 (pore size 5-8 zm) as a nitrocellulose membrane was produced. Also, except that HF240 (pore size 3-5 ⁇ m) was used instead of HF180, the procedure described in Example 1 (1) was repeated to obtain HF240 (pore size 3-5 zm) as a nitrocellulose membrane. An immunochromatographic strip using was also prepared. The pore size indicates a range including approximately 80% of the total pore diameter. (2) Preparation of Filtered Whole Blood Sample and Immunochromatographic Measurement
  • Example 4 (1) Using the two types of enzyme immunochromatographic strips prepared in Example 4 (1), the various filtrates were subjected to immunochromatographic development according to the method described in Example 1 (2-3). Thereafter, as described in Example 1 (2-3), 5-bromo-4_black_mouth_3-indolyl phosphoric acid ( ⁇ CIP; manufactured by Boehringer Mannheim) 200 / i L was further developed by chromatography. The sample used was the same as the sample described in Example 1 (2-3).
  • ⁇ CIP 5-bromo-4_black_mouth_3-indolyl phosphoric acid
  • Table 18 and Table 19 show the results of visually determining the degree of coloring in the allergen-immobilized region (lmm width band) after the completion of the chromatographic development.
  • the immunochromatographic method of the present invention can be applied to the use of analyzing a whole blood sample.
  • the present invention has been described in connection with the specific embodiments, but modifications and improvements obvious to those skilled in the art are included in the scope of the present invention.

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Abstract

　（１）全血を溶血させると共に、クロマト展開可能化処理を実施することにより、全血由来試料を調製する工程；（２）前記工程で得られた全血由来試料を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程；及び（３）続いて、洗浄液をイムノクロマトグラフ展開膜上で展開させることにより、イムノクロマトグラフ展開膜上の赤血球由来赤色色素を除去する工程を含む、イムノクロマトグラフ法を開示する。 　前記イムノクロマトグラフ法によれば、迅速簡便かつ安価に全血試料を分析することができる。

Description

技術分野
[0001] 本発明は、新規のィムノクロマトグラフ法に関する。
背景技術
[0002] 近年、血液を被験試料として使用するィムノクロマトグラフ製品が増えている。しかし 、全血をそのままィムノクロマトグラフ展開させると、通常、ィムノクロマトグラフ展開に 明
支障をきたす。そこで、予め全血から血漿又は血清分離し、血球成分等を除かなけ 田
ればならない。血漿/血清分離法として最も一般的な方法は遠心分離法である。し かし、遠心分離法は遠心機器が必要であり、一般の臨床医が診察室で用いることは 少ない。また、フィルターを用いて血漿を分離する方法（例えば、プラズマフィルター； 富士フィルム)もある力 遠心分離法と同様、時間がかかる上、更なるコストも必要とな る。また、 目詰まりを起こさず、溶血させることなく必要量の血漿量を確保するために は、プラズマフィルターの濾過面積を大きくする必要があるため、大量の全血を必要 とする。
[0003] そこで、最近ではィムノクロマトグラフストリップ自体に各種血漿 Z血清分離パッドを 設置した方法が開発されている。具体的には、ィムノクロマトグラフストリップの全血サ ンプル供給部直下に前記分離パッドを設置し、血球成分を前記分離パッドに保持さ せ、血球成分を短時間ではィムノクロマトグラフ展開膜に流出しないようにする一方 で、血漿成分を先行してィムノクロマトグラフ展開膜へ展開させる方法である。
[0004] 前記方法はいずれも全血中の赤血球の破裂を防ぎ、溶血させずに血漿成分を分 離する為の工夫がなされている。例えば、血球捕捉膜にカルボキシメチルセルロース 膜を用いた特開 2002—214236号公報（特許文献 1)、プロパノール及び/又はァク リルアミドを用いた特開 2002-350428号公報（特許文献 2)、あるいは、親水性焼結 多孔質物質を用いた特許第 2940990号明細書 (特許文献 3)等、多くの特許が出願 又は登録されている。いずれも溶血を防ぐことに特長がある。なぜなら、溶血すると、
'展開膜の判定部分を含む膜全体が赤く着色してしまい、結果とし て判定が非常に困難になるからである。
[0005] ィムノクロマトグラフ法以外では全血をあえて界面活性剤等で溶血させる試薬（日 本光電セルタックケミ）が公知であり、また、溶血式測定法（特許文献 4)も公知である 、それらの測定系は赤色が測定に影響しない為、問題が無い。しかし、赤色に染 色することを特徴とする金コロイドィムノクロマトグラフ法を始め、各種発色又は着色 基材を用い、 目視にて結果判定を行う、ィムノクロマトグラフ法を用いた試薬では、溶 血による赤色着色は致命的な問題となる。そこで赤血球が破砕又は溶血しない緩や かな条件で、血漿分離パッドに血球成分を保持するような工夫を施す為、ィムノクロ マトグラフ展開に至るまで時間力 Sかかることが多レ、。また、その展開する血漿量は全 血試料の粘性に大きく影響される為、定量性を損なうことも多い。更に、全血試料の 粘性等マトリックスの影響によって、血漿の分離溶出速度が大きく異なることも多かつ た。故に、全血試料滴下後の時間ではなぐあえて血漿分離パッドによる血漿分離後 の展開時間を計測し、その後の染色度の補正測定を行う機器 (ロシュ)さえ発売され ている。
[0006] 更に、血球成分を長時間、完全に血漿分離パッドに保持することは技術的に難しく
、血球成分はある程度、ィムノクロマトグラフ展開膜まで到達してしまう。故に、酵素ィ ムノクロマトグラフ法等のように被験試料をィムノクロマトグラフ展開させた後、被験試 料液とは別の、例えば、洗浄液や酵素基質液など更に展開させる場合、血漿分離パ ッドから染みだしてィムノクロマトグラフ展開膜に到達した血球成分が、後から展開し てくる前記成分の展開を阻害してしまい、結果として正常なィムノクロマトグラフ法によ る測定をすることは出来な力 た。
[0007] 一方、特殊な例ではあるが、赤血球上の抗原を測定するィムノクロマトグラフ法で、 孔径が非常に大きいィムノクロマトグラフ展開膜（5— 100 z m)を用い、あえて赤血 球を破砕しないままィムノクロマトグラフ展開膜を展開させる試薬 (特許文献 5)が公 知である。しかし、これも前記通常のィムノクロマトグラフ法等同様、赤血球成分を破 砕しなレ、ことを特徴としてレ、る。
[0008] ィムノクロマトグラフ法は、その簡便、迅速かつ安価な面が大きな特長であり、手間 の力かる遠心分離機を用いる方法や、高価な血漿分離プレフィルターを用いて予め 分離する方法はィムノクロマトグラフ法の長所を損なうものであった。その点、ィムノク 口マトグラフストリップに予め設置した血漿分離パッドはその要望に応えるものだった 力 迅速性や再現性に改善余地を残し、また、例えば、酵素ィムノクロマトグラフ法の ように、被験試料の後から別の液体を流す方法の場合、適用することが難しかった。
[0009] 特許文献 1 :特開 2002— 214236号公報
特許文献 2：特開 2002 - 350428号公報
特許文献 3：特許第 2940990号明細書
特許文献 4 :特開平 10— 221334号公報
特許文献 5 :特開 2000 - 111555号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] このように、血液（全血）を試料とするィムノクロマトグラフ法の場合、従来は予め血 清血漿分離するか、あるいは、ィムノクロマトグラフストリップ上で血漿分離パッドを用 いて血球成分のィムノクロマトグラフ展開膜への展開を遅らせる方法が取られていた 。いずれも全血中の赤血球を破壊せず、赤色色素を流出させないことを前提とした 工夫がなされている。しかし、予め血清血漿分離する方法は手間やコスト的に不利な 点が多ぐまた、ィムノクロマトグラフストリップ上で血漿分離パッドを用いた方法は、全 血試料の粘性により測定時間等の再現性に問題があり、特に被験試料とは別の液体 を後から展開させる一部のィムノクロマトグラフ法においては、応用が難しかった。 従って、本発明の課題は、全血試料を迅速簡便な方法で処理し、そして、全血試 料が溶血し、ィムノクロマト展開膜が一時的に赤色に着色しても影響のないィムノクロ マトグラフ法と組み合わせることにより、迅速簡便かつ安価に全血試料を分析すること のできる、ィムノクロマトグラフ法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0011] 前記課題は、本発明による、（1)全血を溶血させると共に、クロマト展開可能化処理 を実施することにより、全血由来試料を調製する工程 (以下、全血由来試料調製工程 と称する）；
(2)前記工程で得られた全血由来試料を、ィムノクロマトグラフ展開膜上で展開させ る工程 (以下、展開工程と称する）；及び
(3)続いて、洗浄液をィムノクロマトグラフ展開膜上で展開させることにより、ィムノクロ マトグラフ展開膜上の赤血球由来赤色色素を除去する工程 (以下、赤色色素除去ェ 程と称する）
を含むことを特徴とする、ィムノクロマトグラフ法により解決することができる。
本発明方法の好ましい態様によれば、前記クロマト展開可能化処理が、ィムノクロ マトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を、可溶化、除去、又は小粒子化す る処理である。
[0012] 本発明方法の更に好ましい態様によれば、全血と界面活性剤とを接触させることに より、全血を溶血させると共に、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中 成分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する。
本発明方法の別の好ましい態様によれば、全血をフィルター通過させることにより、 全血を溶血させると共に、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分 を除去することによって、全血由来試料を調製する。
本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、全血を音波処理又は高圧破砕処 理することにより、全血を溶血させると共に、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも 大きな全血中成分を小粒子化することによって、全血由来試料を調製する。
本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、全血と有機溶剤とを接触させること により、全血を溶血させると共に、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血 中成分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する。
また、本発明は、（1)ィムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
(2)界面活性剤を含有する全血希釈液
を含み、前記全血希釈液における前記界面活性剤の濃度が、全血を前記全血希釈 液で希釈してィムノクロマトグラフ用試料を調製した場合に、全血が溶血する濃度で あることを特徴とする、ィムノクロマトグラフ法用キットに関する。
発明の効果
[0013] 本発明のィムノクロマトグラフグラフ法によれば、従来法で必要であった全血試料を 溶血させない為の工夫が不要となり、簡便な全血試料処理とィムノクロマトグラフ展開 により、安価で、しかも、全血の粘性のバラツキの影響を受けにくい、全血試料を被験 試料とする簡便且つ短時間のィムノクロマトグラフ測定が可能である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明方法では、全血を溶血 (例えば、赤血球の溶解又は破砕による）し、例えば 、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を、例えば、可溶化又は 小粒子化するか、あるいは、取り除くことにより、全血由来試料をィムノクロマトグラフ 展開膜の孔 (ポア）に目詰まりしないで展開させ、前記全血由来試料に続いて、別の 液体試料を展開させることで、ィムノクロマトグラフ展開膜上の赤色溶血成分（主にへ モグロビン）を洗い流すことで、前記課題を解決することができる。
[0015] 通常ィムノクロマトグラフ法に利用される展開膜の孔径は 2— 20 β m程度であるが、 直径が約 8 μ ΐη程度の赤血球、それ以上の大きさの白血球、又はやや小さい血小板 等の血球成分や、リン脂質ゃフイブリン由来の凝集体等を、例えば、界面活性剤を用 レ、、溶解すると同時に可溶化することで、前記膜中の孔に目詰まりしないで展開させ ること力 S可能である。前記全血由来試料はィムノクロマトグラフ展開膜を赤色に着色さ せてしまうが、例えば、洗浄液や、酵素法の場合の基質液等で前記溶血した全血由 来の赤色成分を洗い流すことで赤色成分を除くことが可能で、免疫反応及び酵素反 応等により着色した本来の目的染色ラインを観察することができる。本発明は、このよ うな知見に基づくものである。
[0016] 本発明方法の全血由来試料調製工程において、全血由来試料を調製する方法は 、全血を溶血させることができ、し力、も、クロマト展開可能化処理を実施することができ る限り、特に限定されるものではない。
本明細書において「クロマト展開可能化処理」とは、後述の展開工程におけるィムノ クロマトグラフ展開膜上でのクロマト展開を可能とするための処理を意味し、より具体 的には、これに限定されるものではないが、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径 (好まし くは孔径の下限値)よりも大きな全血中成分 [例えば、各種血球成分 (例えば、赤血 球、白血球、又は血小板等）、溶血後の血球膜 (赤血球膜、各種白血球膜、及び血 小板膜等を含む）、又はフイブリン若しくはリン脂質等由来の凝集塊など]等を、例え ば、可溶化、除去、又は小粒子化する処理を意味する。 [0017] 全血由来試料を調製する方法としては、例えば、界面活性剤を用いる方法、フィル ターを用いる方法、音波処理若しくは高圧破砕処理を利用する方法、有機溶剤を用 レ、る方法などを挙げることができる。全血由来試料調製工程では、これらの方法のい ずれか一つを単独で、あるいは、 2つ以上を組み合わせて実施することができる。
[0018] 界面活性剤を用いる方法では、採血した全血と界面活性剤とを接触させることによ り、全血を溶血させると共に、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成 分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する。界面活性剤を用いる方法 では、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分が、界面活性剤によ つて可溶化されることにより、後述の展開工程においても、ィムノクロマトグラフ展開膜 の孔に目詰まりすることなく全血由来試料を展開させることができる。
[0019] 界面活性剤とは、 2物質間の界面に集まりやすい性質を持ち、その 2物質間の界面 の性質を著しく変えるものである。このような性質を持っために界面活性剤分子は、 親油基と親水基の相反する性質の部分からなっている。本発明で用いることのできる 界面活性剤は、このような性質を持った物質であれば使用可能であり、例えば、ィォ ン型による分類でいう、非イオン界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界 面活性剤、又は両性界面活性剤のレ、ずれも使用可能である。
[0020] 非イオン界面活性剤として、具体的には、例えば、ポリオキシエチレンアルキルェ 一テル、ポリオキシエチレンアルキルァリルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ソ ルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシ エチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシェチレ ンアルキルァミン、又はアルキルアル力ノールアミド等を挙げることができる。
陰イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、脂肪酸塩、アルキル硫酸エス テノレ塩、アルキルベンゼンスルフォン酸塩、アルキルナフタレンスルフォン酸塩、又は アルキルスルホコハク酸塩等を挙げることができる。
陽イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルアミン塩、又は第 4級 アンモニゥム塩等を挙げることができる。
両性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルべタイン、ァミンオキサイド 、又はジメチルアンモニォプロパンスルホン酸等を挙げることができる。 [0021] 更に、前記分類の他に、膜タンパク質可溶化剤として知られる、例えば、ステロイド 骨格を有するコール酸ナトリウム又はデォキシコール酸ナトリウム等も本発明で使用 可能な界面活性剤である。
本発明方法では、これらの界面活性剤を、 1種類のみ単独で、あるいは、 2種類以 上を組み合わせて使用することができるが、ここに例示した界面活性剤に限定される ものではない。また、補助的な処理、例えば、塩類、尿素、及び/又は有機溶剤を共 存させたり、あるいは、後述の濾過処理 (フィルター通過）又は音波処理若しくは高圧 破砕処理と併用する方法も考えられる。
[0022] これらの各種界面活性剤を適用するにあたっては、使用する濃度を適時設定する こと力 Sできる。具体的に適用可能な濃度は、使用する界面活性剤によって異なるが、 使用する界面活性剤の持つセルミセル濃度付近、あるいは、セルミセル濃度以上に 界面活性剤を添加する条件が好適に使用することができる。これらの濃度調整した 界面活性剤を、以下、界面活性剤液と称するが、界面活性剤液中の界面活性剤濃 度は、その界面活性剤の特性にもよるが、濃度が高くすぎると、全血そのものよりも粘 性が高くなり、全血との混合が難しぐ全血中成分の可溶化に支障をきたす場合があ る。また、逆に界面活性剤液中の界面活性剤濃度が低すぎると、全血中成分の可溶 化が遅ぐあるいは不可能となり、結果として正常なィムノクロマトグラフ展開がなされ ない場合がある。
[0023] 具体的には、非イオン性界面活性剤に分類されるポリオキシエチレンソルビタン脂 肪酸エステルの 1つであるポリオキシエチレンモノラウレート（商品名 Tween20 ;シグ マ社製)を単独で用いる場合、溶血反応系における最終濃度として (以下、同様)、 好ましくは 2 30%、より好ましくは 3— 20%、更に好ましくは 10 20%となる範囲で 使用すること力 Sできる。
非イオン性界面活性剤に分類されるポリオキシエチレンアルキルエーテルの 1つで あるポリエチレングリコール モノ—パラーイソ—ォクチルフエニルエステル（商品名 Trit onX_l 00 ;シグマ社製）を単独で用いる場合、好ましくは 0. 1— 30%、より好ましく は 0. 3 20%、更に好ましくは 0. 5 10%となる範囲で使用することができる。 非イオン性界面活性剤に分類されるポリオ- あるポリオキシエチレンラウリルエーテル (商品名工マルゲン 108 ;花王社製)等の場 合、好ましくは 0. 01— 20%、より好ましくは 1一 20%、更に好ましくは 2. 5— 10%と なる範囲で使用することができる。
[0024] 陰イオン界面活性剤に分類されるアルキル硫酸エステル塩の 1つであるドデシル硫 酸ナトリウムを単独で用いる場合、好ましくは 0. 01 20%、より好ましくは 0. 05— 7 %、更に好ましくは 0. 05-5%,特に好ましくは 0. 1-2. 5%となる範囲で使用する こと力 Sできる。
[0025] 陽イオン界面活性剤に分類される第四級アンモニゥム塩の 1つである塩化パラミチ ルトリメチルアンモニゥム [商品名 PB40 (塩化パラミチルトリメチルアンモニゥムの 40 %溶液）；日本油脂社製]を単独で用いる場合、好ましくは 0. 1— 30%、より好ましく は 0. 3 20%、更に好ましくは 0. 5 5%となる範囲で使用することができる。
[0026] 両性界面活性剤として分類されるステアリルべタイン（商品名アンヒトール 86B ;花 王社製）又は 3— [ (3—コラミドプロピル)ジメチルアンモニォ]プロパンスルホン酸（商 品名 CHAPS ;同仁化学社製）をそれぞれ単独で用いる場合、好ましくは 0. 1— 30 %、より好ましくは 0. 3— 20%、更に好ましくは 0· 5— 10%となる範囲で使用するこ とができる。
[0027] また、前記濃度範囲より低濃度でも、複数の界面活性剤を組み合わせることで、前 記条件と同様の効果を得ることができる。例えば、実施例 1に記載のとおり、単独使 用では 0. 1%濃度 (溶血反応系における最終濃度として）により全血の可溶化、ィム ノクロマト染色、及び展開ができなかった 5種類の界面活性剤（ェマルゲン 108、トラ ィトン X— 100、 Tween20、アンヒトール 86B、及び CHAPS)を、実施例 3に記載の とおり、それぞれ 0. 1 %濃度ずつ計 5種類混合することで、可溶化、ィムノクロマト染 色、及び展開が可能である。
[0028] 逆に、前記濃度範囲より高濃度でも、例えば、予め水等で希釈されて販売されてい る界面活性剤の場合は、前記条件と同様の効果を得ることができる。例えば、ポリエ チレングリコーノレ モノ—パラーイソ—ォクチルフエ二ルエステルが、 10%水溶液の形 態で、例えば「界面活性剤 X」と命名されて発売されている場合、その界面活性剤 X を希釈等することなくそのまま全血と等量混合して使用すると、界面活性剤 Xの最終 濃度は 50%となるが、それは実質上 TritonX— 100の最終濃度 5%品と同様の効果 が得られる。
また、界面活性剤を希釈する溶媒は必ずしも 100%の水溶液である必要は無ぐ有 機溶剤を含んだ溶媒でも溶血させ、ィムノクロマト展開させることは可能である。例え ば、前記 PB40は塩化パラミチルトリメチルアンモニゥムの 40%溶液であり、溶媒中に は 20 30%のイソプロピルアルコールが存在している。
更に、例えば、全血試料の前処理、前記の補助的な手段の組み合わせ、更には、 ィムノクロマトグラフテストの特性により、好適濃度は大幅に異なるため、ここに挙げた 界面活性剤濃度に限定されるものではない。
[0029] 前記界面活性剤液を全血と混合する比率も、正常なィムノクロマトグラフ展開にとつ て重要な要素である。まず、界面活性剤液の比率が低すぎると、全血中成分が充分 に可溶化されず、正常なィムノクロマトグラフ展開を阻害する場合がある。カロえて、展 開時間をより短ぐ安定して行う為には、界面活性剤液の割合を高くすることが望まし レ、。しかし、一方で界面活性剤液の比率が高すぎると、相対的に全血比率が下がり、 結果として測定感度が弱まってしまう場合がある。適用可能な比率は、使用する界面 活性剤種又は濃度によって異なるが、全血に対する界面活性剤液量は好ましくは 1 /10倍量以上が望ましい。
[0030] なお、界面活性剤液の濃度と全血との混合比率は、前記で述べた影響に加え、ィ ムノクロマトグラフ上の反応に阻害を与えたり、あるいは、非特異的染色由来のバック グラウンドを高くしてしまう場合もある。従って、測定方法、測定項目、又は測定時間 等によって、最適な界面活性剤種、濃度、全血との混合比率、又は混合時間を個別 に選定することが好ましい。
また、界面活性剤の種類によっては、ィムノクロマトグラフ展開を可能とする濃度で あっても、ィムノクロマトグラフ上で起こる抗原抗体反応等の各種結合反応、酵素反 応、あるいは、金コロイド等の性状を阻害する場合もある。よって、その至適濃度を決 めるに当たっては、各ィムノクロマトグラフ法及び/又は各測定項目において、個々 に充分な至適条件を検討することが好ましレ、。
[0031] フィルターを用いる方法では、採血した全血をフィルター通過させることにより、全 血を溶血させると共に、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を 除去することによって、全血由来試料を調製する。フィルターを用いる方法では、ィム ノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分力 s、フィルターによって除去さ れることにより、後述の展開工程においても、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰 まりすることなく全血由来試料を展開させることができる。
[0032] 本発明方法の全血由来試料調製工程において用いることのできるフィルタ一として は、例えば、シリンジフィルターを挙げることができる。採血管から、適当なシリンジ、 例えば、 lmL容量シリンジ（テルモ社）により全血を吸引し、前記シリンジの先端にシ リンジフィルターを勘合させ、圧力をかけることでシリンジ中の全血をシリンジフィルタ 一で濾過することができる。濾過時の圧力により、血球等は破砕され、フィルターの孔 径よりも大きな塊、例えば、破砕された赤血球の膜断片や、脂質等の凝集塊は除去 され、フィルタ一孔径よりも小さな粒子のみ、濾液中に回収される。フィルターの孔径 は、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径 (好ましくは孔径の下限値)よりも小さいことが好 ましぐ例えば、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径平均が 5 / mである場合、フィルタ 一の孔径は 5 /i m未満であることが好ましい。また、ィムノクロマトグラフ展開膜のポア サイズが 5— 8 /i mである場合、フィルターの孔径は 5 μ ΐη以下であることが好ましレ、。 なお、前記ポアサイズは、全孔径の概ね 80%が含まれる範囲を示し、フィルタ一孔径 は、最大孔径を意味する。
[0033] 音波処理又は高圧破砕処理を利用する方法では、採血した全血を音波処理又は 高圧破砕処理することにより、全血を溶血させると共に、ィムノクロマトグラフ展開膜の 孔径よりも大きな全血中成分を小粒子化することによって、全血由来試料を調製する 。この方法では、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分が、音波 処理又は高圧破砕処理によって小粒子化されることにより、後述の展開工程におい ても、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰まりすることなく全血由来試料を展開さ せること力 Sできる。
[0034] 本発明方法の全血由来試料調製工程において用いることのできる音波処理として は、通常の細胞破砕に用いられる超音波処理を挙げることができる。また、高圧破砕 処理としては、例えば、圧力負荷機器 (例えば、フレンチプレス等）を用いる方法を挙 げること力 sできる。フレンチプレスは、試料に高い圧力をかける一方で、一部試料を 回収する際、急激に圧力を減らすことで、細胞破砕することが可能であり、全血中の 、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分の破砕分散にも有効であ る。
その他、全血を溶血させ、前記全血中成分を可溶化、小粒子化、又は除去すること が可能であれば、全血由来試料の調製手段は特に限定されるものではない。
[0035] 全血由来試料調製工程で用いることのできる有機溶剤としては、全血を溶血させる ことができ、しかも、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶 化することのできる有機溶剤である限り、特に限定されるものではなレ、。前記有機溶 媒としては、例えば、ケトン類（例えば、アセトン等）、アルコール類（例えば、メタノー ノレ、エタノール、又は 2_プロパノール等）、又はァセトニトリル等を挙げることができる 。前記有機溶剤の使用濃度は、界面活性剤で先述したのと同様に、例えば、有機溶 剤の種類又は各種条件 (例えば、全血との混合条件、又はィムノクロマトグラフ法若し くは測定方法の実施条件など）に応じて適宜決定することができる。
[0036] 本発明方法における展開工程は、前記全血由来試料調製工程で得られた試料を 用いること以外は、通常のィムノクロマトグラフ法における展開工程と同様に実施する こと力 Sできる。本展開工程で用いる全血由来試料は、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔 に目詰まりする可能性のある全血中成分が予め可溶化、除去、又は小粒子化されて いるので、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰まりすることなぐィムノクロマトグラフ 展開が可能である。
[0037] 但し、そのままでは破砕した全血中の赤血球から溶出した赤色色素がィムノクロマト グラフ展開膜を赤く着色したままとなり、判定ラインの染色等を観察することが困難で ある。そこで全血由来試料を展開した後、本発明方法における赤色色素除去工程で は、別の液体を展開することにより、前記赤色色素をィムノクロマトグラフ展開膜上か ら排除する。
この赤色色素除去用液体は、ィムノクロマトグラフ展開膜上を展開することにより、 赤色色素を押し流すことにより除去することのできる液体である限り、特に限定される ものではない。前記赤色色素除去用液体として、例えば、赤色成分を押し流すだけ の単なる洗浄液 (例えば、水又は緩衝液など）を用いることもできるし、あるいは、例え ば、一部の酵素ィムノクロマトグラフ法などのように、酵素発色基質を後から展開する 系の場合は、前記基質液を赤色色素除去用液体として兼用し、前記赤色成分を押し 流す役割も果たすことも可能である。
[0038] 前記赤色色素除去用液体は、全血由来試料が充分に展開されたところで、赤色色 素を除去することができる限り、その展開の開始は特に限定されるものではない。例 えば、全血由来試料の展開開始後に、赤色色素除去用液体の展開を開始すること が一般的だが、展開開始位置の工夫によっては全血由来試料を展開開始する直前 に赤色色素除去用液体の展開を開始することもできる。
[0039] 本発明のィムノクロマトグラフ法用キットは、少なくとも、 （1)ィムノクロマトグラフ用スト リップと、（2)界面活性剤を含有する全血希釈液とを含む。前記界面活性剤としては 、本発明方法の全血由来試料調製工程において用いることのできる界面活性剤を使 用すること力 Sできる。前記全血希釈液における界面活性剤の濃度は、全血を全血希 釈液で希釈してィムノクロマトグラフ用試料 (すなわち、全血由来試料）を調製した場 合に、全血が溶血する濃度である限り、特に限定されるものではない。
全血希釈液は、所望により、被験試料 (すなわち、全血）中の分析対象物質と特異 的に結合する結合物質 (例えば、抗体又は抗原等）、及び/又は、試薬安定化の為 の安定化剤（例えば、タンパク質、糖、又は高分子化合物等）を更に含むことができる 実施例
[0040] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限 定するものではない。
《実施例 1》
本実施例では、以下に示す手順に従って、界面活性剤を用いて溶血及び可溶化 した全血試料を調製し、酵素ィムノクロマトグラフ法により特異 IgEを測定した。
[0041] (1)酵素法ィムノクロマトグラフ用ストリップの作製
(1-1)アレルゲン固定化膜の作製
ニトロセルロース膜（HF180；ポアサイズ 5— 8 μ m；ミリポア社製）を 5mm X 25mm のサイズに切断した。膜の一端（上流方向）から 15mmの位置に、ダニアレルゲン抽 出タンパク質水溶液 (ャケヒヨウヒダニ抽出物；グリア社製） [濃度 lmg/mL； 5mmol /Lホウ酸緩衝液 (pH8. 5)で希釈後、透析した水溶液]を幅 lmmの直線状に塗布 した。
そのまま、室温下で 1時間静置し、続いて、 37°Cで 30分間静置して、ダニ抽出タン パク質を固定化した。シリカゲルデシケーター内に保存し、室温下で一夜乾燥させる ことにより、ダニアレルゲン固定化膜を作製した。
[0042] (1一 2)酵素標識化抗 IgE抗体の調製
抗ヒト IgEマウスモノクローナル抗体をペプシン処理した後、 2—メルカプトェチルアミ ンにより還元し、ゲル濾過により精製 Fab'フラグメント lmgを調製した。
一方、これとは別に、ゥシ小腸アルカリフォスファターゼ 2mgを、 2mgZmLとなるよ うにリン酸緩衝液で希釈した後、透析し、 7. 5mmolZLに調製した N—スクシンイミジ ル 3_ (2—ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP) 100 /i Lをカロえた。 4°Cにて 5時間反 応させた後、リン酸緩衝液で透析してピリジルジチォプロピオネート（PDP)導入アル カリフォスファターゼを調製した。
前記抗 IgE抗体 Fab'と前記 PDP導入アルカリフォスファタ一ゼとを lmLずつ等量 混合してから、 lmol/Lヒドロキシルァミン 40 μ Lを添加した。 4°Cで 3日間反応させ た後、ゲル濾過カラム (TSKgel G3000SW;東ソ一社製）を用いてゲル濾過し、未 反応の抗 IgE抗体 Fab'及び PDP導入アルカリフォスファターゼを除去し、酵素標識 化抗 IgE抗体水溶液を作製した。
[0043] (1一 3)酵素標識化抗体パッドの作製
実施例 1 (1一 2)で調製した酵素標識化抗 IgE抗体水溶液を、抗体 1 μ g量となるよう に、 5. 0%ショ糖を含む 5mmolZLリン酸塩緩衝液 (PH7. 2)で希釈した後、その希 釈液 10 μ Lを 5mm X 5mmに切断した吸収パッド（PREM1420；ポール社製）に塗 布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≤100mmHg)乾燥して、酵 素標識化抗体パッドを作製した。
[0044] (1-4)試料添加パッドの作製
グラスファイバーパッドを 5mm X 18mmに切断し、 0. 5%ショ糖、 0. 2%Tween20 、及び 0. 1%ポリビニールアルコール (重合度 =約 500)を含む水溶液に浸した後、 過剰の水溶液を除去し、風乾して、試料添加パッドを作製した。
[0045] (1一 5)吸収パッドの作製
セルロースパッド（AP25 ; Millipore社製）を、 5mm X 20mmのサイズに切断し、吸 収パッドとした。
[0046] (1—6)ィムノクロマトグラフグラフ用ストリップの作製
5mm X 60mmのサイズに切断したプラスティック粘着シート（BioDot製）に、展開 方向に関して上流側から下流側に向かって、実施例 1 (1一 4)で作製した試料添加パ ッド、実施例 1 (1 - 3)で作製した AP標識化抗体パッド、実施例 1 (1_1)で作製したダ 二アレルゲン固定化膜、及び実施例 1 (1一 5)で作製した吸収パッドの順に、各々そ の両端を隣接する部材と lmm程度重ね合わせて貼付することにより、ィムノクロマト グラフグラフ用ストリップを作製した。
[0047] (2)溶血及び可溶化処理した全血試料の調製とィムノクロマトグラフ測定
(2 - 1)界面活性剤液の調製
脱イオン水、生理食塩水（150mmol/L塩化ナトリウム液）、 10mmol/Lリン酸緩 衝液（ρΗ7· 5, 150mmol/L塩化ナトリウム）を調製し、また、トライトン X-100 (シグ マエ業株式会社）、 Tween20 (シグマ社製）、ドデシル硫酸ナトリウム、ェマルゲン 10 8 (花王社製）、 PB40 (日本油脂社製）、アンヒトール 86B (花王社製）、又は CHAPS (同仁化学社製）を前記リン酸緩衝液でそれぞれ、 0. 2、 1. 0、 5. 0、又は 20%濃度 となるよう調製した。
[0048] (2-2)全血と界面活性剤液の等量混合試料の作製と溶血観察
へパリン抗凝固剤入り採血管にて採血したヒトの全血と前記各種濃度界面活性剤 液とを 100 z Lずつ等量混合した試料を作製した。なお、混合 10分後に目視にて観 察を行い、溶血の有無を調べた。ここで言う溶血とは、赤血球膜が可溶化され、赤血 球中のヘモグロビン等赤色成分が溶出することで、より透明色になった状態を指す。
[0049] (2_3)酵素ィムノクロマトグラフ測定
前記ィムノクロマトグラフ用ストリップを、試料添加パッドを下にして、前記全血を溶 血可溶化した試料 50 μ Lを予め分注しておいたマイクロプレートウエルに差し込んで 立て掛け、毛細管現象により検体をクロマト展開させた。その後、前記クロマト展開の 開始から 10分経過後に、 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリルリン酸（BCIP ;ベーリン ガーマンノヽィム社製）水溶液 200 μ Lを更にクロマト展開させた。
なお、前記検体としては、検体 1 (ダニ特異的 IgE = OIUZmL)、検体 2 (ダニ特異 的 IgE = 3IUZmL)、及び検体 3 (ダニ特異的 IgE= 10IUZmL)を使用した。各検 体中のダニ特異的 IgE量は、従来の定量測定法（アラスタツト特異的 IgE抗体測定キ ット；ャトロン社販売，米国 DPC社製）にて測定した値であり、国際標準単位である IU /mLで表記した。
[0050] クロマト展開終了後、アレルゲン固相領域（lmm幅バンド）における着色程度を目 視判定した結果を表 1一表 8に示す。表 1一表 8及び後述の表 9一表 19に示す各記 号「一」、「土」、「 +」、及び「 + +」は、それぞれ、着色無し、微弱な着色、明確な着色 、及び強い着色を意味する。なお、表中の界面活性剤濃度は、実施例 1 (2 - 2)で使 用した界面活性剤液の濃度を示しており、溶血反応系における界面活性剤の最終 濃度は、表に示す濃度の 1/2である。
[0051] [表 1] 非界面活性剤液 等量混合全血試料
界面活性剤; 1度 脱イオン水 生理食塩水 リン酸緩衝液 溶血有無 溶血あリ 溶血なし 溶血なし ダニ特異的 I g E抗体量
( I U /m L )
検体 1 0 展開不良 展開不良 展開不良 検体 2 3 展開不良 展開不良 展開不良 検体 3 1 0 展開不良 展開不良 展開不良
[0052] [表 2] W e e n 20 等量混合全血試料
界面活性剤溏度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 溶血あり 溶血 し 溶皿なし 溶血なし ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
ca "r
検体 1 0 展開不良 展開不氏 展開不良 検体 2 3 + 展開不良 展開不良 展開不良 検体 3 10 + + 展開不良 展開不良 展開不良
ドデシル硫酸ナトリウム 等量混合全血試料
界面活性剤濃度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 浴皿 rfnお奴 IリJ /¾皿お V 浴皿 rfnおい y /谷皿 rfnおい ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0
検体 2 3 土 土 検体 3 10 + +
[0054] [表 4] ェマルゲン 108 等量混合全血試料
界面活性剤濂度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 溶血あり 溶血あり 溶血あり 溶血なし ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0 一 展開不良 展開不良 検体 2 3 + + 展開不良 展開不良 検体 3 10 + + ++ 展開不良 展開不良
[0055] [表 5] 卜フイ 卜ノ Λ— 1 ϋ ϋ 寺靈 π主皿 BS科
界面活性剤漉度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 溶血あり 溶血あリ 溶血あり 溶血なし ター 1 ヒ fjl坏薑
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 検体 2 3 十 十 十 展閱不艮 検体 3 1 0 ++ ++ ++ 展開不良 表 6]
P D 4 U 寺愈/ S口主皿 5¾科
界面活性剤濂度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 溶血あり 溶血あり 溶血あり 溶血なし
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 展開不良 検体 2 3 展開不良 + + 展開不良 検体 3 1 0 展開不良 + + ++ 展開不良
[0057] [表 7] アンヒトール 86 Β 等量混合全血試料
界面活性剤港度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 溶血あり 溶血あり 溶血あり 溶血なし ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 検体 2 3 + + + 展開不良 検体 3 1 0 + + + + + + 展開不良
[0058] [表 8] C H A P S 等量混合全血試料
界面活性剤濂度 2 0 % 5 % 1 % 0 . 2 % 滚 ffn右無 溶血あり 溶血あり 溶血あり 溶血なし ダニ特異的 I g E抗体量
( I U /m L )
検体 1 0 展開不良 検体 2 3 + + + 展開不良 検体 3 1 0 + + + + + + 展開不良
[0059] 《実施例 2》
本実施例では、以下に示す手順に従って、界面活性剤を用いて溶血可溶化した全 血試料を調製し、金コロイドィムノクロマトグラフ法により特異 IgEを測定した。
[0060] (1)金コロイドィムノクロマトグラフ用ストリップの作製
(1-1)アレルゲン固定化膜の作製
実施例 1 (1_1)に記載の通り、ニトロセルロース膜にダニアレルゲン抽出タンパク質 水溶液を幅 lmmの直線状に塗布し、ダニアレルゲン固定化膜を作製した。
[0061] (1 - 2)金コロイド標識化抗 IgE抗体の調製
抗ヒト IgEマウスモノクローナル抗体 lmgを、 0· lmg/mLとなるようにリン酸緩衝液 (2mmol/L, pH7. 0)で希釈した後、透析した。続いて、金コロイド懸濁液（GOLD
COLLOID 20 ; British BioCell International製） lOOmLを撹拌しながら、 前記抗ヒト IgEマウスモノクローナル抗体水溶液 lOmLをゆっくり滴下し、室温下で 10 分間撹拌した。更に、撹拌しながら 10%ゥシ血清アルブミン (A-7888 ; Sigma製； 以下、 BSAと称する）水溶液 10mLをゆっくり滴下した後、室温下で更に 10分間撹 拌した。この水溶液に 5%ショ糖と 0. 2%Tween20とを含む水溶液 15mLを加え、混 和した後、 10°Cにて 16, 000 X gで 1時間遠心分離し、上清を除去した。
[0062] 沈殿した金コロイド標識化抗体を、 0. 5%ショ糖及び 0. 02%Tween20を含むボラ ックス緩衝液（ρΗ8· 0) 100mLに再懸濁し、 10°Cにて 16, OOO X gで 1時間遠心分 離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識化抗体を、 0. 5%ショ糖及び 0 . 02%Tween20を含むボラックス緩衝液（ρΗ8· 0) lOOmLに再懸濁し、 10°Cにて 16, 000 X gで 1時間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識 化抗体を、 0. 5%ショ糖及び 0. 02%Tween20を含むボラックス緩衝液（ρΗ8· 0) に再懸濁した後、粒子密度が約 1013/mL (波長 520nmにおける吸光度 =約14)に なるように濃度調整し、金コロイド標識化抗 IgE抗体懸濁液とした。
[0063] (1一 3)金コロイド標識化抗体パッドの作製
酵素標識化抗 IgE抗体水溶液の代わりに、実施例 2 (1 - 2)で調製した金コロイド標 識化抗 IgE抗体懸濁液を用いること以外は、実施例 1 (1一 3)の操作を繰り返すことに より、金コロイド標識化抗体パッドを作製した。
[0064] (1—4)ィムノクロマトグラフ用ストリップの作製
酵素標識化抗体パッドの代わりに、実施例 2 (1 - 3)で調製した金コロイド標識化抗 体パッドを用いること以外は、実施例 1 (1—6)の操作を繰り返すことにより、金コロイド ィムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
[0065] (2)溶血及び可溶化処理した全血試料の調製とィムノクロマトグラフ測定
(2— 1)界面活性剤液調製と全血との混和及び溶血観察
実施例 1 (2— 1)と同様に、各種溶液を調製し、実施例 1 (2— 2)と同様に、ヒトの全血 と前記各種溶液を 100 μ Lずつ等量混合した試料を作製し、溶血の有無を調べた。
[0066] (2-2)金コロイドィムノクロマトグラフ測定
酵素法ィムノクロマトグラフストリップの代わりに、実施例 2 (1— 4)で作製した金コロイ ドィムノクロマトグラフ用ストリップを用い、 5_ブロモ _4_クロ口 _3—インドリルリン酸（Β CIP；ベーリンガーマンハイム社製）水溶液の代わりにリン酸緩衝液をクロマト展開さ せる以外は、実施例 1 (2— 3)の操作を繰り返すことにより、金コロイドィムノクロマトグ ラフ法の展開を行った。
[0067] クロマト展開終了後、アレルゲン固相化領域（lmm幅バンド）における着色程度を 目視判定した結果を表 9一表 16に示す。
[0068] [表 9] 4 Aム rfn
非界面;古！！ 准
界面活性剤港度 脱イオン水 生理食塩水 リン酸緩衝液 血有無 溶血あり 溶血なし 溶血なし
> 一 共 trj 1 g [ ί几 里
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 展開不良 展開不良 検体 2 3 展開不良 展開不良 展開不良 検体 3 10 展開不良 展開不良 展開不良
[0069] [表 10]
Tw θ θ n 20 等量混合全血試料
リ . £. 。 溶血有無 溶血あり 溶血なし 溶血なし 溶血なし ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 展開不良 展開不良 検体 2 3 ± 展開不良 展開不良 展開不良 検体 3 10 + 展開不良 展開不良 展開不良 表 11] ドデシル硫酸ナトリウム 等量混合全血試料
界面活性剤漉度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 溶血あり 溶血あり 溶血あり 溶血あり ダニ特異的 I g E抗体量
( I UZmL)
検体 1 0
検体 2 3 士 土
検体 3 10 ± ± ±
[0071] [表 12] ェマルゲン 1 08 等量混合全血試料
界面活性剤濃度 20% 5% 1 % 0. 2% 浴 無 rfn い 奴
皿 r&Md レリ 浴皿おい n
,谷 ιΑι LI r 皿の V /谷皿 1し ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/m L)
検体 1 0 展^]不艮 展^ B 艮 検体 2 3 土 土 展開不良 展開不良 検体 3 1 0 + + 展開不良 展開不良 表 13] 卜ライ卜ン X - 1 00 等量混合全血試料
界面活性剤濃度 20% 5% 1 % 0. 2% 浴皿 rAi 1
溶血有無 り I 浴皿めリ 浴皿 ihめ I I チ、 1 リ 浴皿 し ダニ特異的 I g E抗体量
( I UZm L)
検体 1 0 旗 IW个氏 検体 2 3 土 展開不良 検体 3 1 0 + + + 展開不良 表 14]
PB40 等量混合全血試料
界面活性剤漉度 20% 5% 1 % 0. 2% 溶血有無 / ^谷皿 rnめ j& L 、 レリI /谷皿 rfnおリ 浴皿 rihめ奴 い
レリ ¾1 iΠfti1チ¾..1し ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 展開不良 検体 2 3 展開不良 土 展開不良 検体 3 1 0 展開不良 + + 展開不良 表 15] アンヒトール 86B 等量混合全血試料
界面活性剤濃度 20% 5% 1 % 0. 2% k
溶血有 溶血めリ 溶血めリ 溶血めレリ 、 溶血 し ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0 展開不艮 検体 2 3 ± ± 展開不良 検体 3 10 + + 展開不良 表 16]
CHAPS 等量混合全血試料
界面活性剤濃度 20% 5% 1 % 0. 2% ftfe J r
溶血有無 溶皿めリ 浴皿あ奴 皿ぁ奴 I I 浴皿 ** I 浴½ し ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 検体 2 3 土 土 土 展開不良 検体 3 10 + + + 展開不良
[0076] 《実施例 3》
本実施例では、以下に示す手順に従って、 5種類の界面活性剤を等濃度で含有す る界面活性剤混合液を用いて、溶血可溶化した全血試料を調製し、酵素ィムノクロマ トグラフ法により特異 IgEを測定した。
[0077] (1)酵素法ィムノクロマトグラフ用ストリップの作製
実施例 1 (1)に記載の操作を繰り返すことにより、酵素法ィムノクロマトグラフストリツ プを作製した
[0078] (2)界面活性剤混合液の調製、全血との混和、及び溶血観察
5種類の界面活性剤（トライトン X_100、 Tween20、ェマルゲン 108、アンヒトール 86B、及び CHAPS)をそれぞれ等濃度（0.04、 0.2、 1、又は 4%濃度）で含むよう に、濃度の異なる 4種類の界面活性剤混合液 (各混合液における 5種類の界面活性 剤の総濃度として、 0. 2、 1. 0、 5. 0、又は 20%濃度）を、 10mmol/Lリン酸緩衝液 (pH7. 5, 150mmol/L塩ィ匕ナトリウム）を用いて調製した。実施例 1 (2—2)と同様 に、ヒトの全血と前記界面活性剤混合液とを 100 μ Lずつ等量混合した試料を作製し 、溶血の有無を調べた。
[0079] (3)酵素法ィムノクロマトグラフ測定
実施例 1 (2— 3)に記載の方法と同様に、ィムノクロマトグラフ測定を行レ、、 目視判定 を行った。結果を表 17に示す。なお、表中の界面活性剤濃度は、実施例 3 (2)で使 用した界面活性剤混合液における 5種類の各界面活性剤の各々の濃度である。
[0080] [表 17] 複数界面活性剤 等量混合全血試料
界面活性剤濃度 4 % 1 % 0. 2 % 0. 0 4 % 溶血有無 溶血あり 溶血あり 溶血あり 溶血なし ダニ特異的 I g E抗体量
( I U /m L )
検体 1 0 展開不良 検体 2 3 + + + 展開不良 検体 3 1 0 + + + + + + 展開不良
[0081] 《実施例 4》
本実施例では、以下に示す手順に従って、シリンジフィルターを用いて、全血を溶 血させると共に、フィルターの孔径よりも大きな全血中成分を除いた全血由来試料を 調製し、酵素ィムノクロマトグラフ法により特異 IgEを測定した。
[0082] (1)酵素法ィムノクロマトグラフ用ストリップの作製
実施例 1 (1)に記載の操作を繰り返すことにより、ニトロセルロース膜として HF180 ( ポアサイズ 5— 8 z m)を用いるィムノクロマトグラフストリップを作製した。また、前記 H F180の代わりに HF240 (ポアサイズ 3— 5 μ m)を用いること以外は、実施例 1 (1)に 記載の操作を繰り返すことにより、ニトロセルロース膜として HF240 (ポアサイズ 3— 5 z m)を用いるィムノクロマトグラフストリップも作製した。なお、前記ポアサイズは、全 孔径の概ね 80%が含まれる範囲を示している。 [0083] (2)フィルター処理した全血試料の調製とィムノクロマトグラフ測定
(2— 1)各種シリンジフィルターによる全血濾過液の調製
抗凝固剤（へパリン)入りの採血管にて採血したヒトの全血を、 5 μ mフィルター（ザ ルトリウス社）、 3 z mフィルター（アドバンテック社）、 1. 2 z mフィルター（ザルトリウス 社）、 0. (アドバンテック社）、又は 0. 2 z m (アドバンテック社）（いずれも 26m πιΦシリンジフィルター）で濾過し、その濾液を回収した。なお、濾過後、 目視にて観 察を行い、溶血の有無を調べた。なお、各フィルターの前記孔径は、最大孔径を意 味する。
[0084] (2_2)酵素ィムノクロマトグラフ測定
実施例 4 (1)で調製した 2種類の酵素ィムノクロマトグラフグラフ用ストリップを用い、 実施例 1 (2 - 3)に記載の方法にて、前記各種濾液をィムノクロマト展開させた。 その後、実施例 1 (2— 3)に記載の通り、 5—ブロモー 4_クロ口 _3—インドリルリン酸（Β CIP ;ベーリンガーマンハイム社製） 200 /i Lを更にクロマト展開させた。なお、検体は 、実施例 1 (2— 3)に記載の検体と同等品を用いた。
クロマト展開終了後、アレルゲン固相化領域（lmm幅バンド）における着色程度を 目視判定した結果を表 18及び表 19に示す。
[0085] [表 18]
H F 1 8 0膜使用ストリップ
シリンジフィルタ一濾過液試料
フィルタ一孔径 濾過なし 5 3 1 . 2 0 . 8 0 . 2 溶血有無 なし あり あり あり あり あり ダニ特異的 I g E抗体量
( I U /m L )
検体 1 0 展開不良
検体 2 3 展開不良 + + + + + 検体 3 1 0 展開不良 + + + + + + + + + +
[0086] [表 19] H F 240膜使用ストリップ
シリンジフィルター濾過液試料
フィルタ一孔径 （j!i m) 濾過なし 5 3 1. 2 0. 8 0. 2 溶血有無 なし あり あり あり あり あり ダニ特異的 I g E抗体量
( I U/mL)
検体 1 0 展開不良 展開不良
検体 2 3 展開不良 展開不良 + + + + 検体 3 1 0 展開不良 展開不良 + + + + + + + + 産業上の利用可能性
本発明のィムノクロマトグラフグラフ法は、全血試料の分析の用途に適用することが できる。 以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲
[1] (1)全血を溶血させると共に、クロマト展開可能化処理を実施することにより、全血 由来試料を調製する工程；
(2)前記工程で得られた全血由来試料を、ィムノクロマトグラフ展開膜上で展開させ る工程;及び
(3)続いて、洗浄液をィムノクロマトグラフ展開膜上で展開させることにより、ィムノクロ マトグラフ展開膜上の赤血球由来赤色色素を除去する工程
を含むことを特徴とする、ィムノクロマトグラフ法。
[2] 前記クロマト展開可能化処理が、ィムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全 血中成分を、可溶化、除去、又は小粒子化する処理である、請求項 1に記載のィムノ クロマトグラフ法。
[3] 全血と界面活性剤とを接触させることにより、全血を溶血させると共に、ィムノクロマ トグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することによって、全血由来 試料を調製する、請求項 2に記載のィムノクロマトグラフ法。
[4] 全血をフィルター通過させることにより、全血を溶血させると共に、ィムノクロマトダラ フ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を除去することによって、全血由来試料を調 製する、請求項 2に記載のィムノクロマトグラフ法。
[5] 全血を音波処理又は高圧破砕処理することにより、全血を溶血させると共に、ィムノ クロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を小粒子化することによって、全 血由来試料を調製する、請求項 2に記載のィムノクロマトグラフ法。
[6] 全血と有機溶剤とを接触させることにより、全血を溶血させると共に、ィムノクロマトグ ラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することによって、全血由来試料 を調製する、請求項 2に記載のィムノクロマトグラフ法。
[7] (1)ィムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
(2)界面活性剤を含有する全血希釈液
を含み、前記全血希釈液における前記界面活性剤の濃度が、全血を前記全血希釈 液で希釈してィムノクロマトグラフ用試料を調製した場合に、全血が溶血する濃度で あることを特 ί数とする、
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