ES2336622T3 - Recipiente de recogida de sangre total lista para usar. - Google Patents
Recipiente de recogida de sangre total lista para usar. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2336622T3 ES2336622T3 ES07725794T ES07725794T ES2336622T3 ES 2336622 T3 ES2336622 T3 ES 2336622T3 ES 07725794 T ES07725794 T ES 07725794T ES 07725794 T ES07725794 T ES 07725794T ES 2336622 T3 ES2336622 T3 ES 2336622T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- hemolysis
- reagent
- differential
- whole blood
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5002—Partitioning blood components
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Un tubo de muestras para la recolección y procesado de una muestra de sangre total, conteniendo este tubo de muestras un reactivo para la hemólisis diferencial de dicha muestra de sangre total, en el que dicho reactivo para la hemólisis diferencial comprende una sal y un anti-coagulante, en el que dicha sal se selecciona de entre KBr; KJ; KSCN o una sal que consiste en uno o más de los cationes **(Ver fórmula)** en los que m es 0 o 1 y n es 4 o 6 y los aniones son cloruro, tetrafluoroborato, octilsulfato, yoduro y/o tiocianato, en el que dicho tubo de muestras es un tubo listo para su uso y de un solo muestreo, y en el que dicha hemólisis diferencial está presente si 50 alícuotas de 10 μL de hemolisado, es decir, una muestra de sangre diluída 1:10 en salina fisiológica y mezclado 1:1 con dicho reactivo para la hemólisis diferencial, puede aplicarse en un filtro de un sistema de HPLC con un diámetro de 2 mm y 0,5 μm de tamaño de poro sin bloquear dicho filtro.
Description
Recipiente de recogida de sangre total lista
para usar.
La presente invención está relacionada con un
tubo de muestras para recoger y procesar una muestra de sangre
total. El tubo de muestras contiene un reactivo para hemólisis
diferencial de sangre total, en el que dicho reactivo para
hemólisis diferencial comprende una sustancia química para hemólisis
diferencial y un anticoagulante, y en el que dicho tubo de muestras
es un tubo desechable listo para usar. También está relacionada con
el uso de dicho tubo de muestras en el procesamiento de una muestra
de sangre total para cromatografía líquida y también para el uso de
una muestra de sangre procesada en dicho tubo de muestras en un
análisis basado en cromatografía líquida.
En la rutina de análisis clínicos, la sangre es
la fuente más importante de muestras a analizar. Aunque la sangre
total es la primera muestra obtenida, la muestra de sangre total
normalmente debe procesarse posteriormente para poder permitir una
manipulación adecuada o para una detección de analitos fiable.
Cuanto más constituyentes haya en una muestra,
más complicado es el análisis de una analito concreto en la
muestra. Los hematíes contienen una gran cantidad de proteínas y
constituyentes de bajo peso molecular que potencialmente
interfieren con cualquier analito a detectar. Esta es una de las
principales razones de por qué se utiliza preferiblemente en la
rutina de análisis clínicos plasma sanguíneo (a menudo referido para
simplificar como plasma, es decir, una muestra de sangre total
anticoagulada; sin células ni hematíes) o suero sanguíneo (a menudo
referido para simplificar como suero, es decir, sangre total
coagulada; sin células, ni hematíes y la mayoría de proteínas del
sistema de coagulación, especialmente fibrina/fibrinógeno),
respectivamente. Las muestras de sangre total también tienden a ser
más difíciles de manipular, por ejemplo, en comparación con el
suero o plasma. La sangre total tiende a ser menos estable y la
lenta ruptura de los hematíes impide una medición fiable de varios
analitos de interés. Además, el transporte y almacenamiento de una
muestra de sangre total requiere especiales medidas de
precaución.
En el caso de que un analito deba medirse a
partir de sangre total, es una práctica general recoger la muestra
de sangre total y tratar dicha muestra durante o inmediatamente
después de la recogida de sangre con un anticoagulante apropiado.
En la rutina de análisis clínicos, se utilizan los tubos
pre-rellenados con un anticoagulante apropiado para
recoger muestras de sangre total. Como el nombre indica estos
anticoagulantes bloquean la activación del sistema de coagulación.
Las células sanguíneas y los hematíes permanecerán intactos tanto
como sea posible. La sangre anticoagulada debe manipularse con
mucho cuidado para evitar problemas provocados, por ejemplo, por la
sedimentación de células sanguíneas o hematíes o provocados por la
lisis de hematíes. Normalmente se utilizan alícuotas de dichas
muestras de sangre total anticoagulada en la detección de un analito
de interés, por ejemplo, de un analito que está comprendido, al
menos parcialmente, dentro de los hematíes.
Además, en este momento no parece ser factible
utilizar una muestra de sangre total en ninguno de los métodos de
detección en línea existentes. Por ejemplo, no es posible utilizar
una muestra de sangre total en un proceso rutinario de diagnóstico
clínico que necesita un paso de separación en base a la
cromatografía líquida (CL). La separación por cromatografía líquida
de rutina se basa normalmente en una columna que consiste en esencia
de una unidad de filtro o tapón de vidrio poroso para proteger el
material de la columna y el material de la columna necesario para
la separación del (los) analito(s) de interés. Si la sangre
total se aplica a dicha columna, la columna se bloqueará tarde o
temprano o incluso de forma inmediata, dependiendo del tamaño de la
columna y el sistema. Este problema hace prácticamente imposible el
uso de sangre total en un proceso de detección en línea en
combinación con un método de CL como por ejemplo el preferido en el
diagnóstico clínico de rutina. En la actualidad parece que la
separación/manejo apropiado de una muestra de sangre, por ejemplo,
mediante centrifugación, filtración, precipitación o extracción de
analito es esencial, antes de que dicha muestra procesada pueda
analizarse de forma adecuada y fiable.
Tal como se ha indicado antes, el suero o plasma
puede obtenerse a partir de sangre total y utilizarse en la
detección de un analito. Las células y hematíes en teoría pueden
también eliminarse mediante filtración o centrifugación a partir de
sangre total. No obstante, estos métodos no son apropiados para su
uso en el diagnóstico de rutina, ni permitiría una correcta
medición de aquellos analitos al menos parcialmente presentes dentro
de los hematíes.
En otra forma de procesamiento de muestras, el
analito de interés se separa primero de las principales sustancias
que potencialmente interfieren, mediante la precipitación selectiva
o métodos de extracción. La extracción puede realizarse en fase
líquida o en una fase sólida. Esto se puede ejemplificar mediante la
ilustración de algunos procedimientos utilizados en la detección de
fármacos inmunosupresores.
Los fármacos inmunosupresores son por ejemplo,
mofetil micofenolato (MMF), rapamicina (RAPA también conocida como
sirolimus) y tacrolimus (FK-506). El fármaco
terapéutico para monitorizar fármacos inmunosupresores es
especialmente importante para los pacientes trasplantados así como
para los pacientes que padecen SIDA (véase por ejemplo: Drug. Ther.
Perspect 17 (2001) 8-12). La mayoría de pacientes
que se someten a un trasplante de órgano sólido requieren de
terapia con inmunosupresores de por vida para prevenir el rechazo de
aloinjertos. Pero, debido a que la mayoría de agentes
inmunosupresores presentan rangos terapéuticos estrechos, también
denominados como ventana terapéutica, y están asociados con
diferentes toxicidades y el potencial para las interacciones con
otros fármacos, es particularmente importante la monitorización de
fármacos (TDM) junto con la evaluación clínica de los pacientes.
El mofetil micofenolato es un profármaco. Tras
la administración oral, el mofetil micofenolato (MMF) sufre una
hidrólisis rápida en el intestino y en la sangre para formar su
metabolito activo, el ácido micofenólico (MPA). El MMF está
disponible ampliamente y está aprobado en los EE.UU. y Reino Unido
para la prevención del rechazo de aloinjerto renal, hepático o
cardíaco en combinación con corticosteroides y ciclosporina. El
fármaco ha demostrado superioridad sobre la azatioprina en reducir
la incidencia de rechazo agudo de aloinjertos renales. La
concentración mínima terapéutica está en el rango de
1-3,5 mg/L. MMF puede medirse desde plasma y desde
sangre total.
Tacrolimus es un antibiótico macrólido que se
aprobó por primera vez por la Administración de fármacos y alimentos
de EE.UU. (FDA) en 1994 para la prevención del rechazo de
aloinjerto de hígado. Es hasta 100 veces más potente que la
ciclosporina in vitro, y clínicamente, está asociada con una
mayor reducción en la incidencia de rechazo de tejido. Tacrolimus
ha demostrado eficacia tanto como terapia inmunosupresora primaria
en pacientes que padecen varios procesos de trasplante y como
terapia de rescate para pacientes con rechazo de aloinjerto agudo
refractario tras el trasplante de hígado o riñón. La concentración
mínima terapéutica está en el rango De 5-20
\mug/L.
Debido a que al menos parte del tacrolimus
presente en la circulación está compartimentado en los hematíes, se
utiliza una muestra de sangre total en la rutina de medición clínica
de este fármaco. Tacrolimus puede por ejemplo, detectarse mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), espectrometría de
masas por HPLC (EM), ensayo de receptores de radioligandos (RRA), o
mediante un inmunoensayo (IA). Las últimas dos metodologías no
detectan tacrolimus y algunos de sus diferentes metabolitos con la
misma sensibilidad. Esto puede llevar a una interferencia en el
procedimiento utilizado (Murthy, J. N., et al., Clin.
Biochem. 31 (1998) 613-617). Al menos en la
detección de los diferentes metabolitos de tacrolimus, el
procedimiento de HPLC-EM puede considerarse la
norma común. Todos los procedimientos mencionados antes, no
obstante, requieren de la extracción de tacrolimus a partir de
sangre total. Normalmente se utiliza acetonitrilo en la rutina
clínica para la extracción de tacrolimus a partir de sangre total y
no parece que
exista ningún método que permita la medición en línea de tacrolimus a partir de una muestra de sangre total.
exista ningún método que permita la medición en línea de tacrolimus a partir de una muestra de sangre total.
Sirolimus es, como el tacrolimus, un antibiótico
macrólido. Se aprobó por primera vez en 1999 por la FDA para la
prevención de rechazo de aloinjerto tras el trasplante de riñón, y
de hecho ha mostrado resultados prometedores al respecto cuando se
utiliza de forma aguda en combinación con ciclosporina y
corticosteroides. In vitro, el sirolimus es hasta 100 veces
más potente que la ciclosporina, y clínicamente, puede presentar
sinergismo con la ciclosporina, puede que permitiendo una reducción
en la dosis de ciclosporina. La concentración mínima terapéutica
está en el rango de 5-15 \mug/L.
Como ocurre con el tacrolimus, una cantidad
significativa de sirolimus está presente en los hematíes. Por lo
tanto la extracción de una muestra de sangre total es necesaria sin
tener en cuenta el método de detección utilizado. En la rutina
clínica una muestra sospechosa de contener sirolimus se somete a
HPLC y el sirolimus se detecta mediante luz ultravioleta (UV) o
mediante EM/EM. Recientemente también se ha descrito un inmunoensayo
de enzima de micropartículas (Jones, K., et al., Clinical
Therapeutics 22, Supl. B (2000) B49-B61).
Folato es el nombre colectivo de un grupo de
moléculas relacionadas que difieren en su estado de oxidación. Los
folatos son parte del grupo de vitamina B soluble en agua y son
importantes como coenzimas para el metabolismo de la homocisteina y
en la transferencia de grupos de un carbono necesarios para la
replicación de DNA. Un estado inadecuado de folato está relacionado
con el aumento de riesgo de defectos de la médula espinal, está
asociado con enfermedades cardiovasculares, anemia, con ciertos
tipos de cáncer y con la enfermedad de Alzheimer. Las
concentraciones de folato en suero o plasma reflejan la ingesta
reciente, mientras que las concentraciones de folato en los
hematíes son más indicativas de almacenamiento corporal (Gunter,
E.W., et al., Clin. Chem. 42 (1996)
1689-1694; Fazili, Z., et al., Clin. Chem. 51
(2005) 2318-2325; Pfeiffer, C.M., et al.,
Clin. Chem. 50 (2004) 423-432). El folato total en
eritrocitos (folato en eritrocitos = RBC-folato) es
la mejor medida del estado del folato en el organismo. Estudios
recientes han mostrado que la 5-metil
tetrahidrofolato es el vitámero de folato dominante en los hematíes
circulantes. Para el diagnóstico de la deficiencia de folato se
recomienda realizar las determinaciones no solo a partir de suero o
de plasma sino también a partir de hematíes, ya que el folato está
localizado en más del 95% de los últimos. La concentración en los
hematíes refleja con más certeza el estado actual del folato.
Una serie de métodos está disponible para medir
el folato en diferentes matrices. Los principales métodos
analíticos son los ensayos microbiológicos, radio inmunoensayo,
quimioluminescencia, métodos cromatográficos y métodos de
espectrometría de masas. La mayoría de métodos están basados en la
unión competitiva de folato a la proteína de unión a folato.
Para la medición de RBC-folato,
es obviamente obligatorio el uso de un reactivo hemolizante. Por
ejemplo el ensayo Elecsys^{TM} (Elecsys es una marca registrada
de un miembro del grupo Roche) para la determinación de folato en
los hematíes (RBC-folato) utiliza ácido ascórbico
como reactivo de lisis. El reactivo hemolizante Elecsys
RBC-folato se utiliza junto con el ensayo folato
Elecsys para la determinación cuantitativa de folato en los
hematíes (RBC-folato). La sangre total tratada con
anticoagulantes (heparina o EDTA) se diluye con una solución de
ácido ascórbico (0,2%) y se incuba durante aproximadamente 90
minutos a 20-25ºC. La lisis de los hematíes tiene
lugar, con la liberación del folato intracelular. El hemolizado se
utiliza entonces como una muestra "prediluida" (en analogía al
suero) para una posterior medición en el ensayo Elecsys de folato.
El valor de hematocrito determinado en sangre total y el efecto de
la dilución debido al pretratamiento de la muestra está compensado
por el cálculo de la concentración de folato en los eritrocitos
(Greiling, H., Gressner, A.M., Lehrbuch der Klinischen Chemie und
Pathobiochemie, 3rd ed., Stuttgart, New York, Schattauer (1995) pp.
460-462; Gunter, E.W., et al., Clin. Chem. 42
(1996) 1689-1694).
El hemolizado generado por el tratamiento con
ácido ascórbico no puede utilizarse para los procedimientos
cromatográficos rutinarios. Para el uso de dicho hemolizado en el
procedimiento cromatográfico o determinación de espectrometría de
masas es necesario eliminar los restos celulares y proteínas
precipitadas antes del análisis.
Los restos celulares y proteínas precipitadas
normalmente se eliminan de la muestra mediante centrifugación,
filtración fuera de línea o extracción en fase sólida.
La extracción en fase sólida (SPE) es una
técnica cromatográfica utilizada ampliamente, por ejemplo, para la
preconcentración y limpieza de muestras analíticas, para la
purificación de varias sustancias, y para la eliminación de
sustancias tóxicas o valiosas de soluciones acuosas. La SPE se
realiza normalmente utilizando un columna o cartucho que contiene
una resina apropiada. Los procedimientos de SPE se han desarrollado
utilizando sorbentes que pueden interaccionar con analitos mediante
mecanismos hidrofóbicos, de intercambio de iones, quelación,
adsorción y otros mecanismos, para unir y eliminar los analitos de
los fluidos. Ya que las diferentes aplicaciones de SPE para
diferentes clases de analitos pueden requerir diferentes sorbentes,
existe una necesidad concomitante de sorbentes con propiedades
específicas que tienen una selectividad única para el analito o
clase de analitos de interés. Ejemplos representativos de materiales
de SPE y columnas de SPE, respectivamente, se pueden encontrar en US
6.322.695 y US 6.723.236.
Al igual que con otros analitos de interés, no
parece haber un método disponible que permita la detección de
sirolimus o tacrolimus en un procedimiento en línea a partir de una
muestra de sangre total.
La concentración de hemoglobina así como la
proporción de hemoglobina glucosilada (HbA1c) respecto a la
hemoglobina no glucosilada son analitos importantes en hematología
y diabetes. En dicha evaluación los hematíes comprendidos en una
muestra de sangre total se lisan y la hemoglobina se mide. La
patente US 6.050.956 describe un tubo de hemólisis que se
pre-rellena con una cantidad estandarizada de un
líquido disolvente de sangre. No obstante, la sangre total se
recoge primero en un tubo de recogida de sangre rutinaria. Tras esto
la sangre se diluye 1 más 100 en el tubo de hemólisis. Debido a la
alta concentración de hemoglobina es posible una dilución 1 más 100
de sangre total y sin hemólisis diferencial, es decir, no es
necesaria la hemólisis que evite efectos secundarios negativos como
la precipitación de proteína y/o liberación de DNA.
Varias familias de patentes de Coulter
International Inc., como US 5.874.310; PE 1 000 356; PE 0 874 988;
PE 0 305 491; PE 0 743 519 o PE 0 185 048 están relacionadas con el
campo de la hematología y especialmente con el análisis de
eritrocitos. La PE 1 000 356 por ejemplo, describe un diluyente
mejorado para la dilución de una muestra de sangre que es adecuada
para la enumeración y dimensionado de células sanguíneas,
determinación de parámetros de hemoglobina y diferenciación de
subpoblaciones de leucocitos en una muestra de sangre única. El
análisis se realiza mediante el uso de instrumentación electrónica
adecuada. Para dichos análisis, la sangre se recoge normalmente por
un médico, después se trasporta al laboratorio de análisis, y poco
después se añade el reactivo de lisis para su análisis.
Obviamente el transporte cuidadoso de una
muestra de sangre total anticoagulada es crucial. Debe evitarse la
congelación y las temperaturas elevadas. Existe también un peligro
biológico significativo asociado al transporte de una muestra de
sangre total anticoagulada. Un tubo que se derrama o se rompe
durante el transporte puede contaminar el material de empaquetado o
puede ser infeccioso.
Es obvio a partir de la discusión anterior del
estado de la técnica que la sangre total aún está menospreciada en
la rutina de análisis clínicos. Todos los procedimientos de rutina
aún hoy parecen requerir un tratamiento de anticoagulación, alta
dilución de la muestra, y/o separación o fraccionamiento de un
analito de interés o de una cierta clase de compuestos del resto de
compuestos comprendidos en dicha muestra. Además, no parece estar
disponible un método para una medición en línea de una muestra de
sangre total.
Será, no obstante, altamente deseable si la
sangre total pudiera utilizarse directamente y fácilmente como una
muestra. Esto será especialmente ventajoso en un procedimiento de
detección en línea utilizando un paso de separación de
cromatografía líquida (CL). También es obvio que el procesamiento
directo de una muestra de sangre total que deja a la muestra
procesada más fácil de almacenar, manejar y transportar representará
un progreso importante para las aplicaciones diagnósticas de rutina
clínica.
También se ha encontrado sorprendentemente y
podrá establecerse que es posible con grandes ventajas recoger una
muestra de sangre total en un tubo de muestras desechable de sangre
total lista para usar y que está precargada con un reactivo para
hemólisis diferencial de dicha muestra de sangre total. El tubo de
muestras de acuerdo con la presente invención facilita enormemente
el uso de una muestra de sangre total, hace el manejo de dicha
muestra más fácil y también el transporte de dicha muestra fácil y
cómoda, y permite la detección directa de analitos a partir de una
muestra de sangre total. El recogida de sangre total en un tubo de
muestras de acuerdo con la presente invención por ejemplo, hace de
la sangre total una muestra apropiada para la separación directa
por cromatografía y detección de analito por ejemplo, mediante
espectroscopía de masas. Esto es especialmente valioso para un
analito que también está presente en una cantidad relevante dentro
de los hematíes, como folato o los fármacos inmunosupresores
sirolimus y tacrolimus.
En una primera realización, la presente
invención está relacionada con un tubo de muestras para recoger y
procesar una muestra de sangre total, el tubo de muestras contiene
un reactivo para la hemólisis diferencial de dicha muestra de
sangre total, en el que dicho reactivo para la hemólisis diferencial
comprende un compuesto químico para la hemólisis diferencial y un
anticoagulante como se describe en la reivindicación 1, y en el que
dicho tubo de muestras es un tubo de muestra desechable y listo para
usar.
En otra realización la presente invención está
relacionada con el uso del tubo de muestras de acuerdo con la
presente invención en el procesamiento de una muestra de sangre
total para cromatografía líquida.
En otra realización, la presente invención
describe el uso de una muestra de sangre procesada obtenida mediante
hemólisis diferencial en un tubo de muestras de acuerdo con esta
invención en un análisis basado en cromatografía líquida.
La presente invención está relacionada con un
tubo de muestras para recoger y procesar una muestra de sangre
total, el tubo de muestras que contiene un reactivo para la
hemólisis diferencial de dicha muestra de sangre total, en el que
dicho reactivo para hemólisis diferencial comprende una sustancia
química para hemólisis diferencial y un anticoagulante como se
describe en la reivindicación 1, y en el que dicho tubo de muestras
es un tubo de muestras desechable y listo para usar.
Un "anticoagulante" en el sentido de la
presente invención es un agente utilizado para evitar la coagulación
de un espécimen de sangre de laboratorio. Estos agentes incluye
heparina y varios agentes que impiden la disponibilidad de los
iones de calcio para el proceso de coagulación previniendo así la
formación de coágulos; Estos agentes incluyen por ejemplo ácido
etilendiaminotetraacético (comúnmente denominado EDTA), EGTA,
citrato, oxalato y fluoruro. Los anticoagulantes preferibles para
el uso en un reactivo para hemólisis diferencial en un tubo de
muestras de acuerdo con la presente invención son heparina, EGTA y
citrato. Preferiblemente el anticoagulante es heparina o
citrato.
Un "tubo de muestras" de acuerdo con la
presente invención puede ser cualquier dispositivo con un reservorio
apropiado para recibir la muestra de sangre a recoger. Tal como
apreciará el experto en la materia, el tubo de muestras
preferiblemente será de hecho un tubo. Preferiblemente el tubo de
muestras tiene un tamaño y dimensión adaptados para ajustarse a los
requisitos de la estación de recepción de muestras de un analizador
automatizado, por ejemplo, un analizador Elecsys® de Roche
Diagnostics. El tubo de muestras puede tener un fondo cónico o
preferiblemente redondeado. En la rutina clínica, los tamaños de
tubo estándar que se usan son compatibles con los sistemas
analizadores presentes en el mercado. Los tubos estándar y
preferibles por ejemplo, presentan las siguientes dimensiones: 13x75
mm; 13x100 mm, o 16x100 mm.
Los artículos "un" y "uno" se utilizan
aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) de
los objetos gramaticales del artículo. Por ejemplo, "un
hematíe" se refiere a un hematíe o más de uno.
El tubo de muestras de acuerdo con la presente
invención está precargado con un reactivo para hemólisis
diferencial, es decir, contienen este reactivo. El tubo se
proporciona al usuario en un formato listo para usar. El usuario no
necesita preparar o manipular el reactivo para hemólisis
diferencial, ya que este se proporciona en una cantidad y
concentración apropiada para lograr la hemólisis diferencial de la
muestra de sangre.
En otra realización preferible, el tubo de
muestras de la presente invención posee una presión interna por
debajo de la presión atmosférica. Preferiblemente, el tubo de
muestras acomoda las ventajas asociadas con la marca vacutainer® que
distribuye BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ.
El tubo de recogida de sangre de acuerdo con la
presente invención se utiliza una única vez, es decir, es
desechable.
El tubo de muestras de acuerdo con la presente
invención no sólo es adecuado para recoger una muestra de sangre
total sino que también está adaptado para permitir el procesamiento
de la muestra de sangre total. Al recoger sangre total en un tubo
de muestras precargado con el reactivo para hemólisis diferencial,
se logra el resultado deseado, es decir, la hemólisis
diferencial.
En otra realización preferible de la presente
invención, el tubo de muestras para recoger y procesar una muestra
de sangre total se caracteriza además en que el reactivo para
hemólisis diferencial provoca la lisis de las membranas celulares
de los hematíes y a la vez no provoca la precipitación de los
constituyentes de la muestra.
"Hematíes" en el sentido de la presente
invención son células sanguíneas rojas que no presentan núcleo.
Dichas células sanguíneas rojas sin núcleo celular son por ejemplo,
los glóbulos rojos maduros encontrados en el torrente circulatorio
de los mamíferos. Esta invención no está relacionada con glóbulos
rojos nucleados como por ejemplo, los de las especies de aves.
Estos últimos deben ceñirse a los criterios para células nucleadas o
eucariotas.
\newpage
"Mamífero" con el propósito de la presente
invención se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de
zoo, de deportes, o de compañía, como perros, gatos, ganado,
caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el
mamífero es un humano.
Una "célula eucariota" o una "célula
nucleada" en el sentido de la presente invención es una célula
derivada de un organismo eucariota y aún posee su núcleo celular.
Ejemplos de células eucariotas son las células derivadas de tejido
nucleado, células de cultivo de tejido nucleado y células sanguíneas
nucleadas. En una realización preferible, la célula eucariota es
una célula sanguínea nucleada como un trombocito, un monocito,
neutrófilos, eosinófilos o un leucocito. Las células de organismos
inferiores, como bacterias, aún conteniendo material genético, no
son células
eucariotas.
eucariotas.
Cuando se utiliza la presente invención, una
muestra de sangre total se rellena en el tubo de muestras listo
para usar. La muestra se mezcla con el reactivo para la hemólisis
diferencial comprendida en dicho tubo, por lo que se logra la
hemólisis diferencial. El uso de un reactivo apropiado para
hemólisis diferencial asegura que se cumplen dos requisitos: a) las
membranas de los hematíes se lisan y b) y a la vez no se provoca la
precipitación de los constituyentes de la muestra. Este proceso: es
decir, romper las membranas de los hematíes pero a la vez no
provocar la precipitación de los constituyentes de la muestra, se
denomina aquí hemólisis diferencial. La muestra procesada se
refiere como sangre hemolizada de forma diferencial o como muestra
de sangre hemolizada de forma diferencial.
Preferiblemente el reactivo para hemólisis
diferencial levará a la lisis al menos al 95% de los hematíes
presentes en una muestra. Es más preferible que el reactivo para
hemólisis diferencial lleve a la lisis al menos al 97%, 98%, 99%,
99,5% de los hematíes presentes en una muestra.
Sin querer que se una a la siguiente teoría, se
puede asumir que el equilibrio ventajoso al que la membrana de un
hematíe se rompe pero que a la vez no provoca la precipitación de
los constituyentes de la muestra es esencial para superar al menos
alguno de los problemas conocidos en la materia. Al aplicar un
reactivo apropiado para hemólisis diferencial bajo las condiciones
apropiadas, se pierde la integridad de la membrana celular que es
por ejemplo, esencial para proteger el contenido de los hematíes del
plasma sanguíneo. El contenido de los hematíes (por ejemplo, la
hemoglobina pero también otros analitos de interés) se libera en el
líquido circundante. A la misma vez no se provoca la precipitación
de constituyentes de la muestra.
Tal como apreciará un experto en la materia, los
constituyentes de la muestra que pueden interferir con el último
análisis puede especialmente ser DNA y proteínas desnaturalizadas,
respectivamente. Siempre que el núcleo de células eucariotas, por
ejemplo, linfocitos o monocitos no se destruyan, no se libera DNA de
estos núcleos. Siempre que no precipiten las proteínas, las
proteínas comprendidas en la muestra sometida a hemólisis
diferencial no interferirán, al menos no de una forma significativa,
con el paso de cromatografía o con el análisis.
La integridad de los hematíes puede por ejemplo
evaluarse fácilmente mediante tintes vivos apropiados. En una
realización preferible de acuerdo con la presente invención se
utiliza azul de tripano para poder evaluar la integridad de una
membrana de hematíe. Los hematíes intactos no acumulan azul de
tripano, mientras que un hematíe con la membrana rota se tiñe con
azul de tripano. La integridad de la membrana de un hematíe se
evalúa fácilmente al microscopio tras teñir una muestra con azul de
tripano. El porcentaje de hematíes rotos se calcula contando
hematíes intactos antes y después del tratamiento, y dividir después
el primer número entre el segundo y multiplicando después este
valor por 100. Los hematíes que se solubilizan son preferibles a los
hematíes lisados.
El tratamiento apropiado será adecuado para
lisar un hematíe, pero a la vez ni provocará la precipitación de
los constituyentes de la muestra. Se espera que el tratamiento
apropiado para la hemólisis en un método descrito aquí también
afectará las membranas externas de células eucariotas. No obstante,
se puede y se debe tener cuidado que el DNA contenido en el núcleo
celular no se libere en la muestra. El reactivo de hemólisis y las
condiciones para la hemólisis diferencial utilizadas preferiblemente
dejarán la membrana nuclear intacta y también el núcleo
macroscópicamente intacto o al menos el DNA no se liberará de las
proteínas nucleares circundantes y estabilizantes del DNA. Si el
DNA se liberara en una cantidad significativa, dicho DNA podría
interferir con el manejo de la muestra. El DNA liberado por ejemplo,
tiende a hacer muy viscoso un líquido. Así no es posible pipetear o
transferir dicha muestra o pasarla a través de ciertos filtros o
columnas.
Debe también tenerse cuidado para que no ocurra
precipitación de proteínas. Tal como apreciará el experto en la
materia, existen muchas proteínas y muy diferentes presentes en una
muestra biológica, por ejemplo, en una muestra de sangre total.
Todas estas proteínas poseen propiedades individuales que influyen
su tendencia a precipitar o agregar.
Se ha encontrado que es posible describir y
definir si el procesamiento de la muestra con el reactivo para
hemólisis diferencial se realiza - como indica el término - bajo
condiciones apropiadas para lisar las membranas celulares de los
hematíes por un lado y al mismo tiempo no provocar la precipitación
de los constituyentes de la muestra. Ambas, los hematíes no lisados
así como los constituyentes de la muestra precipitados poseen un
impacto negativo sobre las propiedades de dicha muestra.
Si las condiciones para la hemólisis diferencial
son apropiadas se puede determinar fácilmente y preferiblemente
utilizando el siguiente procedimiento estandarizado. Una muestra de
sangre total con un hematocrito de 40 se diluye 1:10 y luego se
mezcla 1:1 con el reactivo de hemólisis candidato. La eficacia de un
reactivo para sacar a relucir la hemólisis diferencial se observa
visualmente. Tras la lisis de los hematíes, la mezcla aparece
clara. Si ocurre la precipitación de constituyentes de la muestra,
la muestra pasa a ser turbia, viscosa o ambas.
Tal como se ha indicado antes, las condiciones
utilizadas en un método de hemólisis diferencial utilizando la
presente invención puede evaluarse fácilmente de forma visual. Si
una muestra de sangre total se incuba con un reactivo candidato
apropiado para la hemólisis diferencial, puede reconocerse la
concentración mínima necesaria para hemolizar los hematíes como la
concentración que deja transparente o clara la muestra de sangre
turbia. La mayor concentración posible es la que aún conduce a una
muestra trasparente y no viscosa.
Es bastante fácil determinar la concentración
mínima apropiada del reactivo de hemólisis candidato como la
concentración que conduce a un cambio en la transparencia de una
muestra de sangre total tratada. Este cambio en la transparencia se
correlaciona bien con la idoneidad de dicha muestra procesada para
el análisis directo por HPLC.
La concentración máxima posible de reactivo de
hemólisis es la concentración en la que aún no se provoca la
liberación de DNA y/o precipitación de una proteína. La muestra que
se vuelve viscosa o turbia o ambas de ese modo ya no es adecuada
para una aplicación directa de HPLC. Mientras que la viscosidad y
turbidez puede seguirse visualmente es preferible que la
concentración máxima de un reactivo de hemólisis se confirma
mediante un método de HPLC como se describe más adelante.
Ambos, una muestra de sangre total que aún
comprende demasiados hematíes no lisados así como una muestra
tratada de sangre total que comprende los constituyentes
precipitados de la muestra no serán adecuados para ningún
procedimiento cromatográfico. Este es el motivo por lo que las
condiciones apropiadas que ocasionan la hemólisis diferencial se
determinan preferiblemente aplicando de forma estandarizada una
muestra de sangre total tratada con un reactivo candidato para la
hemólisis diferencial a una columna de HPLC.
La hemólisis incompleta y/o precipitación de
constituyentes de la muestra se evalúan al aplicar 50 veces 10
\mul de la muestra de sangre total procesada a una columna de
HPLC. Para evaluar si un agente químico candidato o reactivo para
hemólisis diferencial es apropiado, dicho reactivo de hemólisis se
mezcla con una muestra de sangre total. Preferiblemente se utiliza
la sangre con EDTA que se ha prediluido 1:10 en salino fisiológico.
Se mezcla en una proporción 1:1 con el reactivo de hemólisis
candidato y la mezcla se incuba durante 30 min. a 20ºC. La dilución
final de la sangre total en esta mezcla es entonces 1:20. Se aplican
50 alícuotas de 10 \muL de esta mezcla, es decir una muestra
procesada de sangre total a un filtro con un diámetro de 2 mm y 0,5
\mum de tamaño de poro que es parte de un sistema de HPLC. En el
caso que el vidrio poroso sea parte de una columna de HPLC, la fase
estacionaria debe seleccionarse para que no provoque ninguna
interferencia o bloqueo. Se monitoriza la contrapresión. Se compara
un reactivo candidato para la hemólisis diferencial que provoque un
aumento en la contrapresión de 20 bar o más -si la contrapresión
para la inyección 50 y la contrapresión para la primera inyección
se comparan entre ellas- no se considerará apropiado. De esta forma
puede identificarse fácilmente la concentración mínima y la máxima
de un reactivo apropiado para la hemólisis diferencial. La
concentración mínima es la mínima concentración del reactivo
candidato de hemólisis que produce hemólisis diferencial tal como se
evalúa en la descripción anterior.
Preferiblemente el filtro utilizado en la
evaluación anterior de un reactivo candidato para hemólisis
diferencial es un vidrio poroso para HPLC. También es preferible
que el vidrio poroso sea parte de una columna de HPLC de 20 mm de
longitud rellenada con 3,5 \mum de partículas Symmetry® C18 con un
tamaño de poro de 100 \ring{A} como material de lecho, y con una
columna interna de diámetro de 2 mm.
Tal como el experto en la materia apreciará
fácilmente la muestra de sangre total utilizada para dicha
evaluación se obtiene a partir de un individuo sano, es decir, un
individuo que no tenga ninguna enfermedad y con valores bioquímicos
dentro de los rangos de normalidad.
Se ha encontrado y establecido en la presente
invención que las condiciones apropiadas pueden establecerse para
muchos reactivos para poder alcanzar los requisitos para la
hemólisis diferencial.
El reactivo para la hemólisis diferencial
utilizado en la presente invención preferiblemente está basado en
el agua como solvente, una sustancia química o reactivo que ocasiona
la hemólisis diferencial como se ha descrito antes, un
anticoagulante y también es preferible que comprenda un tampón, una
enzima y/o un conservante. Una sustancia química para hemólisis
diferencial es una sustancia solubilizante de membrana o activa en
la lisis de membranas. El reactivo para hemólisis diferencial
preferiblemente está basado en una sustancia química activa en la
lisis de hematíes o membranas que posea un peso molecular inferior a
1000 Daltons y que ocasione la solubilización diferencial de la
membrana.
El reactivo utilizado para la hemólisis
diferencial está basado en uno o más de las siguientes sustancias
químicas activas en la lisis de hematíes: KBr; KJ; y KSCN o en una
sal que consiste de uno o más de los siguientes cationes y
aniones:
\newpage
El catión preferiblemente se selecciona de
en el que m es 0 o 1 y n es 4 o
6.
\vskip1.000000\baselineskip
El anión se selecciona de cloruro,
tetrafluoroborato, octilsulfato, yoduro y tiocianato. También es
posible utilizar mezclas de las sustancias químicas anteriormente
mencionadas. Tal como apreciará el experto en la materia, estas son
las sustancias químicas que facilitan la hemólisis diferencial
mientras que otros ingredientes de un reactivo de hemólisis pueden
funcionar como tampón o como conservante.
Preferiblemente la sustancia química utilizada
para la hemólisis diferencial es una sal mientras que el catión
preferiblemente se selecciona de entre
en el que m es 0 o 1 y n es 4 o 6,
y cuando el anión se selecciona preferiblemente de cloruro,
tetrafluoroborato, octilsulfato, yoduro y
tiocianato.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sustancias químicas apropiadas para la
hemólisis diferencial se seleccionan preferiblemente del grupo que
consiste de tetrafluoroborato de
1-butil-4-metilpiridinio;
tetrafluoroborato de
1-butil-3-metil-imidazolio;
octilsulfato de
1-butil-3-metil-imidazolio;
cloruro de
1-butil-3-metilpiridinio;
cloruro de 1-hexilpiridinio; cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio;
cloruro de N-octilpiridinio; cloruro de
3-carbamoil-1-octiloximetilpiridinio;
KBr; KJ; y KSCN, y de combinaciones de los mismos.
También es preferible la sustancia química
utilizada para la hemólisis diferencial seleccionada del grupo que
consiste en tetrafluoroborato de
1-butil-4-metilpiridinio;
tetrafluoroborato de
1-butil-3-metil-imidazolio;
octilsulfato de
1-butil-3-metil-imidazolio;
cloruro de
1-butil-3-metil
piridinio; cloruro de 1-hexilpiridinio; cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio;
cloruro de N-octilpiridinio; y cloruro de
3-carbamoil-1-octiloximetilpiridinio.
Es además preferible utilizar una mezcla de uno de estos reactivos y
de KSCN.
Como resultará obvio para el experto en la
materia, una vez se ha identificado una concentración apropiada de
un reactivo candidato para la hemólisis diferencial en el método
definido anteriormente que se basa en una dilución 1 en 20 de una
muestra de sangre total en un reactivo candidato de hemólisis, se
puede utilizar otra proporción de muestra de sangre total a un
reactivo de hemólisis ajustado como se prefiera.
En el caso que el analito de interés se espere
que esté altamente concentrado en la muestra de sangre en
investigación, la concentración del reactivo de hemólisis puede
mantenerse igual como se ha identificado en la configuración
anterior y proporciones inferiores de sangre total respecto al
reactivo de hemólisis, por ejemplo puede usarse, 1:30, 1:40 o 1:50.
Preferiblemente la sustancia química activa en la lisis de hematíes
en el reactivo para hemólisis diferencial se utiliza en al menos la
mínima concentración suficiente para lograr la hemólisis diferencial
como se ha determinado antes.
En el caso que el analito de interés esté
presente en más bien una concentración baja, puede no ser necesario
diluir la muestra de sangre total en 1:20, sino en menos. Esto es
factible si se ajusta la concentración del reactivo de hemólisis
adecuadamente, de forma que la concentración final relativa de
reactivo de hemólisis respecto a la sangre total en la mezcla del
reactivo de hemólisis y la muestra de sangre total se mantenga
igual que la proporción identificada para la concentración mínima
necesaria del reactivo de hemólisis como se ha determinado en la
evaluación anteriormente descrita. La concentración máxima es la
máxima concentración posible del reactivo de hemólisis candidato
que conduce a una hemólisis diferencial pero no provoca la
precipitación de constituyentes de la muestra como se ha evaluado
en la configuración anteriormente descrita.
A modo de ejemplo: Se ha encontrado que el
cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio/KSCN
si se usa a una concentración final del 1% y 0,4%, respectivamente,
es apropiado para lograr el resultado deseado, es decir, la
hemólisis diferencial de una muestra de sangre total a una dilución
final de 1:20. La dilución de un analito en la muestra de sangre
procesada, puede reducirse si por ejemplo la concentración de este
reactivo de hemólisis se ajusta al 2% para el cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio
y al 0,8% para KSCN, respectivamente. Este reactivo de hemólisis
ajustado si se mezcla finalmente 1:1 con una muestra de sangre total
diluida 1:5 también conduce a una hemólisis diferencial de la
muestra de sangre total, ya que la proporción de sangre total
respecto al reactivo de hemólisis se mantiene constante. Si se
mezcla 1 ml de un reactivo de hemólisis que comprende un 10% de
cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio
y 4% de KSCN, respectivamente, con 1 ml de sangre total diluida 1:1
en PBS, también se observa hemólisis. Alternativamente se puede
añadir 1 ml de sangre total a 2 ml de un reactivo de hemólisis que
comprende un 10% de cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio
y un 4% de KSCN, respectivamente.
En muchas aplicaciones de rutina se espera que
la proporción ideal entre la muestra de sangre total y un reactivo
de hemólisis será entre 10:1 y 1:20. Preferiblemente en un método
que utiliza la presente invención la muestra de sangre total se
mezcla con el reactivo de hemólisis a una proporción de entre de 5 a
1 y de 1 a 15. Más preferiblemente, la proporción está entre de 2 a
1 y de 1 a 10, también preferiblemente entre de 1 a 1 y de 1 a 5.
La concentración final, es decir, la más alta posible de un reactivo
de hemólisis ajustado utilizado en la rutina clínica dependerá de la
solubilidad y también del precio de tal reactivo.
En el caso de que se utilice tetrafluoroborato
de
1-butil-4-metilpiridinio
o tetrafluoroborato de
1-butil-3-metilimidazolio,
respectivamente, como el único compuesto químico solubilizante de
la membrana en un reactivo para la hemólisis diferencial, el tubo
de muestras de acuerdo con la presente invención preferiblemente lo
comprende a una concentración del 10 al 30%, siendo también
preferibles las concentraciones del 12 al 25%.
En el caso de que se utilice sulfato de
1-butil-3-metil-imidazoliooctilo
como el único compuesto químico solubilizante de la membrana en un
reactivo para la hemólisis diferencial, el tubo de muestras de
acuerdo con la presente invención preferiblemente lo comprende a
una concentración del 1 al 30%, siendo también preferibles las
concentraciones del 2 al 10%.
En el caso de que se utilice
1-butil-3-metilpiridinio
como catión en un reactivo para la hemólisis diferencial, este se
utiliza preferiblemente junto con yoduro o rodanida como anión y el
tubo de muestras de acuerdo con la presente invención
preferiblemente comprende
1-butil-3-metilpiridinio
a una concentración del 5 al 30%, siendo también preferibles las
concentraciones del 10 al 25%.
En el caso de que se utilice cloruro de
1-hexilpiridinio como el único compuesto químico
solubilizante de la membrana en un reactivo para la hemólisis
diferencial, el tubo de muestras de acuerdo con la presente
invención preferiblemente lo comprende a una concentración del 15
al 30%, siendo también preferibles las concentraciones del 20 al
25%.
En el caso de que se utilicen cloruro de
1-hexilpiridinio en combinación con una
concentración equimolar de KSCN como compuestos químicos
solubilizantes de la membrana en un reactivo para la hemólisis
diferencial, el tubo de muestras de acuerdo con la presente
invención preferiblemente comprende cloruro de
1-hexilpiridinio a una concentración del 4 al 30%,
siendo también preferibles las concentraciones del 5 al 20%.
En el caso de que se utilice cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio
como el único compuesto químico solubilizante de la membrana en un
reactivo para la hemólisis diferencial, el tubo de muestras de
acuerdo con la presente invención preferiblemente lo comprende a
una concentración del 5 al 30%, siendo también preferibles las
concentraciones del 10 al 25%.
En el caso de que se utilice cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio
en combinación con una concentración equimolar de KSCN en un
reactivo para la hemólisis diferencial, el tubo de muestras de
acuerdo con la presente invención preferiblemente comprende el
cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio
a una concentración del 1 al 30%, siendo también preferibles las
concentraciones del 1 al 20%, así como del 1 al 10 o del 1 al
5%.
En el caso de que se utilice cloruro de
N-octilpiridinio como el único compuesto químico
solubilizante de la membrana en un reactivo para la hemólisis
diferencial, el tubo de muestras de acuerdo con la presente
invención preferiblemente lo comprende a una concentración del 10
al 30%, siendo también preferibles las concentraciones del 10 al
25%.
En el caso de que se utilice cloruro de
3-carbamoil-1-octiloximetilpiridinio
como el único compuesto químico solubilizante de la membrana en un
reactivo para la hemólisis diferencial, el tubo de muestras de
acuerdo con la presente invención preferiblemente lo comprende a
una concentración del 0,5 al 30%, siendo también preferibles las
concentraciones del 0,75 al 25%, así como del 1 al 10 o del 1 al
5%.
Otros compuestos químicos preferibles para su
utilización en una hemólisis diferencial en un tubo de hemólisis de
acuerdo con la presente invención son los cationes de
1-hexilpiridinio en combinación con aniones de SCN,
cationes de
I-metil-1-octilpirrolidinio
en combinación con aniones de SCN, y cationes de
3-carbamoil-1-octiloximetilpiridinio.
Preferiblemente el compuesto químico utilizado
para la hemólisis diferencial que comprende el tubo listo para usar
de la presente invención se utiliza a una concentración no superior
al 50% peso/volumen, siendo también preferible a una no superior al
30%, o también preferible a una no superior al 25 o 20%
peso/volumen.
La hemólisis diferencial viene acompañada de la
liberación de los constituyentes intracelulares como las proteínas,
lo que incluye las proteasas. En ciertas aplicaciones, como la
detección de proteínas, será ventajoso bloquear la actividad de las
enzimas, por ejemplo, de las proteasas. En una realización
preferible el tubo de muestras de acuerdo con la presente invención
contendrá un reactivo para la hemólisis diferencial que además
comprende un inhibidor de enzimas. Preferiblemente el inhibidor de
enzimas es inhibidor de proteasas.
Existe un número creciente de proteasas y
también de los correspondientes inhibidores de proteasa de los que
se puede seleccionar un inhibidor de proteasas adecuado según sea
necesario. Una clase importante de proteasas son las llamadas
serina proteasas que poseen el aminoácido serina en su centro
activo. Ejemplos conocidos de serina proteasas son la tripsina,
quimiotripsina, calicreína y uroquinasa. El experto en la materia
estará familiarizado con el hecho de que ciertos inhibidores de
proteasas son activos frente a las serina proteasas. El potencial
inhibitorio de tales proteasas y su espectro de actividad se
describe por ejemplo, en los prospectos de los proveedores
comerciales, como Serva, Heidelberg, o Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim. Preferiblemente, el inhibidor de serina proteasas se
selecciona de entre el grupo que consiste en
AEBSF-HCl (por ejemplo, Nº cat. 12745 Serva),
APMSFHCl (por ejemplo, Nº cat. 12320 Serva), aprotinina (por
ejemplo, Nº cat. 10 981 532 001 Roche Diagnostics), quimiostatina
(por ejemplo, Nº cat. 11 004 638 001 Roche Diagnostics), Pefabloc®
SC (por ejemplo, Nº cat. 11 585 916 001 Roche Diagnostics), y PMSF
(por ejemplo, Nº cat. 10 837 091 001 Roche Diagnostics).
Otra clase importante de proteasas son las
denominadas cisteína proteasas que poseen el aminoácido cisteína en
su centro activo. Ejemplos bien conocidos de cisteína proteasas son
la papaína y la calpaína. El experto en la materia estará
familiarizado con el hecho de que ciertos inhibidores de proteasas
son activos frente a las cisteína proteasas. Algunos de estos
inhibidores también son activos frente a las serina proteasas, por
ejemplo, el PMSF puede utilizarse tanto como un inhibidor de las
cisteína proteasas como de un inhibidor de serina proteasas. El
potencial inhibitorio de tales proteasas y su espectro de actividad
se describe por ejemplo, en los prospectos de los proveedores
comerciales, como Serva, Heidelberg, o Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim. Preferiblemente el inhibidor de cisteína proteasas se
selecciona de entre el grupo que consiste en leupeptina (por
ejemplo, Nº cat. 11 034 626 001 Roche Diagnostics), PMSF (véase
anteriormente) y E-64 (por ejemplo, Nº cat. 10 874
523 001 Roche Diagnostics).
Otra clase importante de proteasas son las
denominadas metaloproteasas. Las metaloproteasas se caracterizan por
contener un ion metálico por ejemplo, Zn^{2+}, Ca^{2+} o
Mn^{2+} en el centro activo. Ejemplos conocidos de metaloproteasas
son las enzimas digestivas como las carboxipeptidasas A y B y la
termolisina. El experto en la materia estará familiarizado con el
hecho de que ciertos inhibidores de proteasas son activos frente a
las metaloproteasas. La forma más fácil de inactivar las
metaloproteasas son las sustancias que se unen al ion metálico y
forman un complejo quelato metálico con éste. Preferiblemente, se
utilizan el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido
etilenglicolbis-(aminoetileter)tetraacético (EGTA), y/o
ácido
1,2-diamino-ciclohexano-N,N,N',N'-tetraacético
(CDTA) para inactivar metaloproteasas. Otros inhibidores de
metaloproteasas apropiados son el fosforamidon (=
N-(a-ramnopiranosil-oxihidroxifosfinil)-L-leucil-L-triptofano,
sal disódica; por ejemplo, Nº cat. 10 874 531 001 Roche
Diagnostics) y la bestatina (por ejemplo, Nº cat. 10 874 515 001
Roche Diagnostics). El potencial inhibitorio de estos inhibidores de
proteasas y su espectro de actividad se describe por ejemplo, en
los correspondientes prospectos de proveedores comerciales, como
Serva, Heidelberg, o Roche Diagnostics GmbH, Mannheim. Los
inhibidores preferibles de las metaloproteasas son el EDTA, EGTA y/o
bestatina.
Otra clase importante de proteasas es conocida
como aspártico proteasas (acídicas). Las aspártico proteasas se
caracterizan por poseer un residuo de ácido aspártico en el centro
activo. Ejemplos bien conocidos de aspártico proteasas son la
pepsina, catepsina D, quimosina y renina. El experto en la materia
estará familiarizado con el hecho de que ciertos inhibidores de
proteasas son activos frente a las aspártico proteasas. Los
inhibidores de ácido aspártico proteasas preferibles son la
\alpha2-macroglobulina (por ejemplo, Nº cat. 10
602 442 001 Roche Diagnostics) y la pepstatina (por ejemplo, Nº
cat. 11 359 053 001 Roche Diagnostics).
Para ciertas aplicaciones será posible utilizar
un reactivo para la hemólisis diferencial que comprenda un inhibidor
de proteasas para un determinado tipo de proteasas.
Representa una realización preferible de acuerdo
con la presente invención la utilización de un cóctel de dos o más
inhibidores de proteasas para inhibir la degradación no deseada de
una analito proteico en una muestra de sangre hemolizada
diferencialmente. Preferiblemente, el reactivo para la hemólisis
diferencial utilizado en un tubo de muestras de acuerdo con la
presente invención comprenderá al menos dos inhibidores de proteasa
diferentes con actividad frente a dos clases de proteasas
seleccionadas de entre el grupo que consiste en las serina
proteasas, cisteína proteasas, metaloproteasas y aspártico
proteasas. También es preferible que al menos tres de estas clases
de enzima estén inhibidas mediante un cóctel inhibidor apropiado.
Preferiblemente, el diluyente de muestras de heces de acuerdo con la
presente invención contendrá un cóctel de inhibidores de proteasas
que está compuesto por inhibidores de proteasas que son activos
frente a las serina proteasas, cisteína proteasas, metaloproteasas
y aspártico proteasas, respectivamente.
Preferiblemente, se utilizarán 10 o menos
inhibidores de proteasas diferentes y serán suficientes para
alcanzar una inhibición de proteasas suficiente para la
estabilización de un analito proteico de interés en una muestra de
sangre hemolizada de forma diferencial.
Preferiblemente, el inhibidor de proteasas se
selecciona de entre el grupo que consiste en aprotinina,
quimiostatina, leupeptina, EDTA, EGTA, CDTA, pepstatina A, fluoruro
de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y Pefabloc® SC. Preferiblemente, el
inhibidor de proteasas que se adiciona al reactivo para hemólisis
diferencial contendrá uno o más de los inhibidores de proteasas
quimiostatina, leupeptina, CDTA, pepstatina A, PMSF y Pefabloc® SC.
También es preferible que contenga aprotinina, leupeptina, EDTA y
Pefabloc® SC.
Se describe un tubo de muestreo, que contiene un
compuesto químico para la hemólisis diferencial y un anticoagulante,
como se ha descrito anteriormente, y que adicionalmente comprende
una nucleasa. El almacenamiento de larga duración o el transporte
de una muestra de sangre hemolizada de forma diferencial pueden
venir acompañados de la liberación de ácidos nucleicos,
especialmente puede liberarse DNA de los núcleos de las células
eucariotas sanguíneas. En el caso de que una cantidad significativa
de DNA se liberara, esto podría dar lugar a una elevada viscosidad
de la muestra y tal muestra no podría utilizarse ya para la rutina
diagnóstica. Este efecto puede contrarrestarse mediante la
utilización de una nucleasa. El tubo de muestras contiene entonces
un reactivo para hemólisis diferencial que comprende una DNasa. Una
DNasa preferible es la benzonasa.
En una realización preferible, la presente
invención está relacionada con la utilización de un tubo de muestras
listo para su uso y de un solo uso que comprende un compuesto
químico para la hemólisis diferencial y un anticoagulante para el
procesado de una muestra de sangre total para cromatografía líquida.
Las realizaciones descritas anteriormente como preferibles para el
tubo de muestras y el reactivo para hemólisis diferencial que éste
contiene también se aplican a la utilización de tal tubo de
muestras en el procesado de una muestra de sangre total para
cromatografía
líquida.
líquida.
La cromatografía líquida (CL) es una técnica
analítica extremadamente importante que se utiliza para la
separación, identificación y cuantificación de un analito de
interés incluso si está presente en una mezcla compleja de
diferentes constituyentes en una muestra. Durante la CL los
componentes químicos en una mezcla se mueven a través de una fase
estacionaria mediante el flujo de una fase móvil líquida. La
separación en una cromatografía líquida se consigue mediante las
diferencias en las interacciones de los analitos tanto con la fase
móvil como con la estacionaria. Como puede apreciar el experto en
la materia debe escogerse tanto una fase estacionaria como una fase
móvil apropiadas para los analitos que se están investigando.
Además, el usuario debe identificar las condiciones apropiadas de
cromatografía para mantener la buena definición de las bandas de
analito a medida que una muestra se mueve a través de la columna de
fase estacionaria hacia el detector.
La cromatografía líquida de alta resolución,
también denominada cromatografía líquida de alta presión, abreviada
HPLC, es una forma especial de cromatografía líquida y actualmente
se utiliza con frecuencia en bioquímica y química analítica. Se
fuerza el paso del analito a través de una columna de fase
estacionaria en un líquido (fase móvil) a elevada presión, lo que
disminuye el tiempo que los componentes separados permanecen en la
fase estacionaria y por lo tanto el tiempo que han de difundir a lo
largo de la columna. Esto da lugar a picos más estrechos en el
cromatograma resultante y por lo tanto a una mayor resolución y
sensibilidad comparado con la CL.
La fase móvil se escoge para asegurar una buena
solubilidad de los solutos en la muestra. Respecto a la fase
estacionaria, preferiblemente se utilizan
micro-partículas de sílice (sencillas o modificadas
químicamente), ya que su gran superficie acentúa la diferencia en
las interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. La
utilización de una fase estacionaria que interacciona fuertemente
con los solutos en relación con las interacciones entre la fase
móvil y los solutos resulta en tiempos de retención muy largos, una
situación que no es analíticamente útil. Por lo tanto, la fase
estacionaria debe seleccionarse para que proporcione interacciones
de débiles a moderadas con el soluto en relación con las de la fase
móvil. Como consecuencia, la naturaleza del soluto determina el
tipo de CL seleccionada. Las interacciones más fuertes deben ocurrir
en la fase móvil para asegurar la solubilidad de la muestra y la
fácil elución, mientras la fase estacionaria debe responder a
diferencias más sutiles entre los solutos. Por ejemplo, los
compuestos polares neutros a menudo se analizan mejor utilizando
una fase móvil polar junto con una fase estacionaria apolar que
distingue las diferencias sutiles en el carácter dispersivo de los
solutos. Uno de los aspectos más potentes del HPLC es que la fase
móvil puede variarse para alterar el mecanismo de retención. Pueden
añadirse modificadores a la fase móvil para controlar la retención.
Por ejemplo, el pH es una importante variable en las fases móviles
acuosas.
Pueden distinguirse cinco clases generales de
CL:
1. la cromatografía de fase normal indica la
utilización de una fase estacionaria polar junto con una fase móvil
apolar (dispersiva).
2. la cromatografía de fase reversa, la
posibilidad opuesta, indica la utilización de una fase estacionaria
apolar y una fase móvil polar (compuesta de uno o más de los
solventes agua, metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano).
3. la cromatografía de intercambio iónico
involucra interacciones iónicas. En este caso la fase móvil debe
apoyar la ionización para asegurar la solubilidad de los solutos
iónicos. La fase estacionaria también debe ser parcialmente iónica
para promover cierta retención. En consecuencia, las interacciones
con la fase estacionaria son fuertes, y esto se refleja a menudo en
tiempos de análisis mayores y picos anchos.
4. la cromatografía de exclusión por tamaño
involucra separaciones basadas sólo en el tamaño molecular e
idealmente requieren que no haya una interacción energética de los
solutos con la fase estacionaria.
5. la cromatografía de afinidad se basa en una
interacción específica, por ejemplo, entre los miembros de un par de
unión específico, como un antígeno y el correspondiente anticuerpo o
receptor y el correspondiente ligando. Por ejemplo el primer
componente de un par de unión se une a una fase estacionaria
apropiada y se utiliza para capturar el segundo componente del par
de unión. El segundo componente puede liberarse y aislarse mediante
los medios apropiados.
En las aplicaciones de rutina la fase
estacionaria, el denominado material lecho, por ejemplo, partículas
de sílice poroso recubierto de alquilsilanol en una aplicación de
PR-HPLC, se empaqueta en una columna apropiada. El
diámetro de las partículas de la fase estacionaria normalmente está
en el rango de 1 a 10 \mum para la mayoría de aplicaciones de
HPLC, variando el promedio del tamaño de poro de estas partículas
entre unos pocos nanómetros y cientos de nanómetros. Las partículas
no porosas también se utilizan en algunas aplicaciones de HPLC.
Además, también pueden utilizarse los denominados materiales
monolíticos en las aplicaciones de HPLC. Las partículas pequeñas
del material de la fase estacionaria necesitan la elevada presión
utilizada en el HPLC. El material de lecho normalmente esta
protegido mediante vidrio poroso. Los tapones de vidrio poroso
tienen un tamaño de poro de 1 \mum, 0,45 \mum o 0,2 \mum.
Cuanto menores sean las partículas normalmente menor es el tamaño de
poro del vidrio poroso. Si una muestra comprende un constituyente
capaz de bloquear el vidrio poroso del HPLC, esto va en detrimento
de cualquier análisis de rutina.
Una muestra de sangre total, así como una
muestra de sangre total "tratada en exceso" que comprende
precipitados de constituyentes de la muestra causa un rápido
bloqueo de cualquier columna o vidrio poroso de HPLC de rutina.
Como el experto en la materia apreciará el bloqueo del vidrio poroso
utilizado en una columna de HPLC ocurrirá más rápidamente cuanto
menor sea el tamaño de poro del vidrio poroso, cuanto menor sea el
diámetro de las partículas de la fase estacionaria y cuanto menor
sea el diámetro de la columna. En el caso de que el vidrio poroso
no se hubiera seleccionado adecuadamente, es decir, con un tamaño de
poro demasiado grande, el tamaño de las partículas del material de
la columna también sería importante y la propia columna se
bloquearía más rápidamente cuanto menores fueran las partículas.
Mediante el muestreo de una muestra de sangre
total directamente en un tubo de muestras de acuerdo con la
presente invención se obtiene una muestra de sangre total procesada
que puede aplicarse directamente a una columna de HPLC, sin correr
el riesgo de bloquear la columna. Se describe un método de
recolección de una muestra de sangre en un tubo de muestras listo
para su uso de acuerdo con la presente invención, convirtiendo así
la muestra de sangre total en una muestra de sangre hemolizada de
forma diferencial y sometiendo luego dicha muestra de sangre
procesada a un paso de HPLC.
Preferiblemente, las partículas de la fase
estacionaria utilizada en tal paso de HPLC están en el rango entre
1 y 10 \mum, y también preferiblemente en el rango entre 2 y 7
\mum de diámetro. Preferiblemente el vidrio poroso utilizado en
tal paso de HPLC tiene un tamaño de poro de 0,45 \mum o también
preferiblemente de 0,2 \mum.
En otra realización preferible, la presente
invención está relacionada con la utilización de una muestra de
sangre hemolizada de forma diferencial obtenida mediante la
recolección de sangre total en un tubo de muestras de acuerdo con
la presente invención en un análisis basado en una cromatografía
líquida de un analito de interés.
El analito de interés puede detectarse mediante
cualquier método apropiado. Los detectores apropiados y preferibles
detectan la presencia de un compuesto a su paso, y proporcionan una
señal electrónica a una estación registradora o computadora de
datos. El resultado normalmente está en forma de cromatograma y la
sustancia de interés normalmente se encuentra en cierto pico. El
área del pico o la altura del pico pueden utilizarse para
cuantificar la cantidad de analito presente en la muestra
investigada.
El detector de un sistema de HPLC es el
componente que emite una respuesta debido al compuesto de la muestra
en elución, y en consecuencia, señala un pico en el cromatograma.
Se encuentra posicionado inmediatamente posterior a la fase
estacionaria para detectar los compuestos a medida que se eluyen de
la columna. El experto en la materia puede controlar los parámetros
de detección y sensibilidad. Existen muchos tipos de detectores que
pueden utilizarse con una HPLC. Algunos de los detectores más
comunes incluyen: índice refractivo (RI), ultravioleta (UV),
fluorescencia, radioquímica, electroquímica, infrarrojo cercano (IR
cercano), espectroscopía de masas (EM), resonancia magnética nuclear
(RMN) y dispersión de la luz (LS).
Los detectores de índice refractivo (RI) miden
la capacidad de las moléculas de la muestra de alterar o refractar
la luz. Esta propiedad de cada molécula o compuesto se denomina su
índice refractivo. En la mayoría de detectores de RI, la luz pasa a
través de una cámara de flujo bi-modular hacia un
fotodetector. Un canal de la cámara de flujo está dirigido a la
fase móvil que pasa por la columna mientras el otro está dirigido
sólo a la fase móvil. La detección ocurre cuando la luz se altera
debido a la elución de muestras desde la columna, y esto se observa
como una disparidad entre los dos canales.
Los detectores de fluorescencia miden la
capacidad de un compuesto de absorber y luego volver a emitir luz a
determinadas longitudes de onda, respectivamente. Cada compuesto
capaz de emitir luz fluorescente tiene una longitud de onda de
excitación y de emisión características. La luz de excitación pasa
por la cámara de flujo mientras un fotodetector colocado en
posición ortogonal mide la luz emitida a una longitud de onda
específica.
La detección radioquímica involucra la
utilización de material radiomarcado, normalmente tritio (^{3}H) o
carbono 14 (^{14}C). Funciona mediante la detección de la
fluorescencia asociada con la ionización de partículas beta, y es
más popular en la investigación con metabolitos.
Los detectores electroquímicos miden los
compuestos que sufren una reacción de oxidación o reducción. Esto se
consigue habitualmente midiendo la ganancia o pérdida de electrones
de las muestras en migración a su paso entre los electrodos a una
determinada diferencia de potencial eléctrico.
La espectrometría de masas es una técnica
analítica utilizada para medir la proporción entre masa y carga
(m/z (o m/q)) de los iones. Generalmente es más usado para analizar
la composición de una muestra física al generar un espectro de
masas que representa las masas de los componentes de la muestra. La
técnica tiene varias aplicaciones, lo que incluye: identificar
compuestos desconocidos mediante la masa del compuesto y/o
fragmentos del mismo; determinar la composición isotópica de uno o
más elementos en un compuesto; determinar la estructura de los
compuestos observando la fragmentación del compuesto; cuantificar la
cantidad de un compuesto en una muestra utilizando métodos
cuidadosamente diseñados (la espectrometría de masas no es
inherentemente cuantitativa); estudiar los fundamentos de la
química iónica en fase gas (la química de los iones y neutrales en
el vacío); determinar otras propiedades físicas, químicas o incluso
biológicas de los compuestos con una variedad de otras
aproximaciones.
Un espectrómetro de masas es un dispositivo
utilizado para la espectrometría de masas, y produce un espectro de
masas de una muestra para analizar su composición. Esto normalmente
se consigue al ionizar la muestra, separar los iones de diferentes
masas y registrando su abundancia relativa midiendo las intensidades
de flujo iónico. Un espectrómetro de masas típico comprende tres
partes: una fuente de iones, un analizador de masas y un
detector.
El tipo de fuente de iones es un factor
contribuyente que influencia enormemente qué tipos de muestras
pueden analizarse mediante espectrometría de masas. La ionización
de electrones y la ionización química se utilizan para los gases y
vapores. En las fuentes de ionización química, el analito se ioniza
mediante reacciones químicas ion-molécula durante
colisiones en la fuente. Dos técnicas que se utilizan a menudo con
muestras biológicas líquidas y sólidas incluyen la ionización por
electropulverización (ESI) y la desorción/ionización láser asistida
por la matriz (MALDI). Otras técnicas incluyen el bombardeo de
átomos rápidos (FAB), termopulverización, ionización química a
presión atmosférica (APCI), espectrometría de masas de iones
secundarios (SIMS) e ionización térmica.
En una realización preferible, la detección de
un analito en un método que utiliza la presente invención se realiza
mediante espectroscopia de masas.
La detección mediante resonancia magnética
nuclear (RMN) se basa en el hecho de que ciertos núcleos con masas
de número impar, lo que incluye H y ^{13}C, giran alrededor de un
eje al azar. Sin embargo, cuando se sitúan en un campo magnético
potente, los giros se alinean de forma paralela o
anti-paralela al campo magnético, estando
favorecida la orientación paralela ya que es ligeramente menos
energética. Estos núcleos magnéticos pueden absorber energía RF
cuando se sitúan en un campo magnético de una potencia específica.
Cuando ocurre esta absorción, se dice que los núcleos están en
resonancia. De forma interesante para los científicos analistas,
los diferentes átomos de una molécula están en resonancia a
diferentes frecuencias en una determinada potencia del campo. La
observación de las frecuencias de resonancia de una molécula permite
al usuario conocer información estructural acerca de la
molécula.
molécula.
Cuando una fuente emite un haz paralelo de luz
que choca con partículas en solución, se refleja, absorbe,
transmite o dispersa parte de la luz. Estos fenómenos pueden medirse
mediante un detector de dispersión de la luz (LS). Las formas más
importantes de detección de LS se denominan nefelometría y
turbidometría. La nefelometría se define como la medida de la
intensidad de luz dispersada que emana de un volumen iluminado de
una suspensión. La proporción entre intensidad dispersada e
intensidad de iluminación se compara con un estándar de propiedades
conocidas. La turbidometría se define como la medida de la reducción
de luz transmitida debido a las partículas en solución. Ésta mide
la dispersión de la luz como la reducción en la luz que se transmite
a través de la solución de partículas. Por lo tanto, cuantifica la
luz residual transmitida.
Los detectores de infrarrojo cercano operan
mediante el escaneo de los compuestos en un espectro entre 700 y
1100 nm. El estiramiento y alteración de las vibraciones de enlaces
químicos concretos en cada molécula se detectan a determinadas
longitudes de onda.
En una realización preferible de acuerdo con la
presente invención una muestra de sangre total derivada de un
mamífero o una muestra de sangre total anticoagulada derivada de un
mamífero se recogerá en el tubo de muestras listo para su uso de
acuerdo con la presente invención y el analito de interés
comprendido en la muestra procesada así obtenida se detectará en
línea, es decir, sin ningún paso adicional como la filtración,
precipitación o centrifugación. La presente descripción, por lo
tanto, está relacionada con un método de análisis de una muestra de
sangre completa, que comprende los pasos de recoger la muestra en un
tubo de muestras listo para su utilización de acuerdo con la
presente invención, obtener una muestra de sangre total hemolizada
de forma diferencial, someterla esta muestra procesada a un paso de
HPLC y detectar así o posteriormente un analito de interés en dicha
muestra.
Un analito de acuerdo con la presente invención
puede ser cualquier molécula inorgánica u orgánica, lo que incluye
una biomolécula. Preferiblemente, el analito no será un ácido
nucleico, especialmente no será un DNA. Preferiblemente, el analito
se selecciona de entre el grupo que consiste en un polipéptido, un
carbohidrato y una molécula fármaco inorgánica u orgánica.
Preferiblemente, el analito de interés posee un PM de 10.000 Da o
inferior, también preferiblemente de 9 kDa o inferior, de 8 kDa o
inferior, de 7 kDa o inferior, de 6 kDa o inferior o de 5 kDa o
inferior, respectivamente.
Un polipéptido o proteína es una molécula que se
compone esencialmente de aminoácidos y que posee al menos dos
aminoácidos unidos mediante un enlace peptídico. En el caso del
analito de interés a investigar con el método aquí descrito, el
polipéptido preferiblemente consistirá en al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 12, 15, 20, 25 y 30 y hasta alrededor de 100 aminoácidos.
Preferiblemente el polipéptido contendrá entre 5 y 100, también
preferiblemente entre 10 y 40 aminoácidos. Los analitos peptídicos
adecuados de interés son por ejemplo, las hormonas peptídicas y
otros polipéptidos presentes en la circulación y especialmente los
polipéptidos liberados por los hematíes, por ejemplo, debido a la
incubación de una muestra de sangre total en un tubo de muestras
como el aquí descrito.
Preferiblemente el método tal como se ha
descrito se utiliza en la detección en línea de un analito a partir
de una muestra de sangre total en la que dicho analito está al menos
localizado parcialmente dentro de un hematíe.
Un analito diana preferible de acuerdo con la
presente invención se selecciona a partir del grupo que consiste en
las drogas de abuso y los fármacos inmunosupresores.
Los analitos diana preferibles son las drogas de
abuso. La droga de abuso se selecciona preferiblemente del grupo
que consiste en anfetaminas, cocaína y metabolitos de cocaína como
benzoilecgnonina, metanfetamina, opiáceos y derivados de opiáceos,
cannabinoides como tetrahidrocannabinol y fenciclidina.
Los analitos diana preferibles son los fármacos
inmunosupresores. El fármaco inmunosupresor se selecciona
preferiblemente del grupo que consiste en ciclosporina (CsA),
mofetilmicofenolato (MMF), rapamicina (RAPA también conocida como
sirolimus), tacrolimus (FK-506) azatioprina (AZA), y
metilprednisolona (MP).
Otro analito diana preferible es el folato,
especialmente el folato total comprendido en el plasma sanguíneo y
en los hematíes.
Los analitos preferibles a medir de una muestra
de sangre total que se recogen en un tubo de muestras de acuerdo con
la presente invención son sirolimus, tacrolimus y folato.
En otra realización la presente invención está
relacionada con el uso de un tubo de muestras que contiene un
reactivo para hemólisis diferencial de una muestra de sangre total,
en la que dicho reactivo para hemólisis diferencial comprende una
sustancia química activa en la lisis de hematíes y un
anticoagulante, y en el que dicho tubo de muestras es un tubo de
muestras desechable listo para usar en el procesamiento de una
muestra de sangre total para cromatografía líquida. Las
realizaciones descritas anteriormente preferibles respecto al
reactivo para hemólisis diferencial contenido en el tubo de muestras
de acuerdo con la presente invención también sirven para el uso del
reactivo de hemólisis en el procesamiento de una muestra de sangre
total para cromatografía líquida.
El tubo de muestras desechable listo para usar
para una muestra de sangre total de acuerdo con la presente
invención y su utilización en el ambiente de diagnóstico de rutina
posee la gran ventaja que la muestra de sangre total tras el
muestreo se procesa directamente en una muestra de sangre hemolizada
de forma diferencial. Esto obvia las medidas de precaución
necesarias de otra manera para manipular y almacenar la muestra de
sangre total o de un muestra de sangre total anticoagulada. La
sangre hemolizada de forma diferencial puede manipularse como una
muestra de plasma o suero. No puede ocurrir sedimentación de células
ni aumento gradual en la hemólisis que pueda interferir con una
correcta medición del analito. El transporte de una muestra de
sangre hemolizada de forma diferencial es fácil y adecuado. Si está
presenta una partícula vírica, también puede solubilizarse y
destruirse si entra en contacto con un reactivo para hemólisis
diferencial. Aunque no se ha analizado, se espera no obstante que
incluso el riesgo biológico se reducirá enormemente si se utiliza un
tubo de muestras de sangre total de acuerdo con la presente
invención.
Los siguientes ejemplos y figuras se
proporcionan para ayudar a entender la presente invención, el
verdadero alcance de la misma que se establece en las
reivindicaciones anexadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 Microscopía óptica de sangre total
hemolizada diluida 1 en 10 con agua. Se ha aplicado tinción
May-Grünwald. Las membranas de eritrocitos y de los
núcleos son visibles.
Figura 2 Microscopía óptica de sangre total
hemolizada diluida 1 en 10 con tetrafluoroborato de
1-butil-4-metilpiridinio
(25%). Se ha aplicado tinción May-Grünwald. No hay
hematíes o membranas, los núcleos están aún intactos.
Figura 3 Microscopía óptica de sangre total
hemolizada diluida 1 en 10 con agua. Se ha utilizado tinción con
azul de tripano.
Figura 4 Microscopía óptica de sangre total
hemolizada diluida 1 en 10 con tetrafluoroborato de
1-butil-4-metilpiridinio
(25%). Se ha utilizado tinción con azul de tripano. a) Tiempo de
incubación 2,5 min.: Sólo se observan unos pocos hematíes residuales
b) Tiempo de incubación 15 min.: No se observan hematíes ni
membranas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.1
Solución A: Se diluye sangre total estabilizada
con EDTA fresco con una solución de cloruro sódico 0,15 molar en la
proporción 1:10 (50 \muL EDTA-sangre más 450
\muL de solución de cloruro sódico).
Solución B: Se prepara una solución del reactivo
de hemólisis candidato en cloruro sódico 0,15 molar en la que la
concentración del reactivo de hemólisis es el doble de la
concentración final deseada en el hemolizado, por ejemplo, para
obtener una concentración final de 25% de tetrafluoroborato de
1-butil-4-metilpiridinio,
se prepara una solución del 50% (50 mg de sal más 50 mL de cloruro
sódico 0,15 molar en agua). En el caso de la adición de un segundo
anión, por ejemplo, yodo (cloruro de
1-butil-3-metilpiridinio/KJ)
la sal descrita se añade en una cantidad equimolar.
El hemolizado se prepara mezclando la solución A
y B en volúmenes iguales, por ejemplo, 500 \muL de solución A más
500 \muL de solución B.
Tras mezclar el hemolizado se inspecciona
visualmente la turbidometría y claridad inmediatamente después de
mezclar, tras 1 minuto, 2, 5, 6, 7, 20 y 40 minutos. El tiempo hasta
que se observa una solución clara se registra.
Como es obvio a partir de la tabla anterior, se
pueden identificar mediante evaluación visual buenos reactivos
candidatos para la hemólisis diferencial.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
Solución A: Se diluye sangre total estabilizada
con EDTA fresco con una solución de cloruro sódico 0,15 molar en la
proporción 1:10 (50 \muL EDTA-sangre más 450
\muL de solución de cloruro sódico).
Solución B: Se prepara una solución del reactivo
de hemólisis en cloruro sódico 0,15 molar en la que la concentración
del reactivo de hemólisis es el doble de la concentración final
deseada en el hemolizado, por ejemplo, para obtener una
concentración final de 25% de tetrafluoroborato de
1-butil-4-metilpiridinio,
se prepara una solución del 50% (50 mg de sal más 50 mL de cloruro
sódico 0,15 molar en agua). En el caso de la adición de un segundo
anión, por ejemplo, yodo (cloruro de
1-butil-3-metilpiridinio/KJ)
la sal descrita se añade en una cantidad equimolar.
El hemolizado se prepara mezclando la solución A
y B en volúmenes iguales, por ejemplo, 20 \muL de solución A más
20 \muL de solución B.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la mezcla del hemolizado, se deposita una
gota en un portaobjetos para microscopio, se seca a temperatura
ambiente y se tiñe con reactivo de tinción
May-Grünwald (Nº cat. de Merck 1.01424 Solución Azul
de Metileno Eosina de May-Grünwald). Tras la
tinción de May-Grünwald, los núcleos se tiñen en una
amplia gama de púrpuras, el citoplasma se observa en tonos de azul
hasta rosa claro, pueden estar presentes gránulos rojizos a
liliáceos en el citoplasma de algunos tipos de células, los
basófilos presentarán gránulos azul oscuro casi negro en el
citoplasma, los eosinófilos presentarán gránulos naranja brillante
en el citoplasma, y los hematíes se tiñen de rosa a naranja.
La microscopía se realiza mediante microscopía
óptica con aceite de inmersión (magnificación x630).
Resultados comparativos - El lisado de la Figura
1 se obtuvo con agua y el lisado de la Figura 2 se obtuvo con un
reactivo apropiado para la hemólisis diferencial, respectivamente -
muestran que la adición de un reactivo de hemólisis apropiado
conduce en pocos minutos a una lisis completa de los hematíes.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra de sangre total procesada se mezcla
(1:1) con una solución de azul de tripano (Nº de Cat. de Merck
1.11732; Azul de tripano C.I. 23850) y se dispensa en una cámara de
Neugebauer para observar al microscopio. La microscopía se realiza
mediante microscopía óptica con aceite de inmersión (magnificación
x630).
Resultados comparativos - El lisado de la Figura
3 se obtuvo con agua y los lisados de las Figuras 4a) y b) se
obtuvieron con un reactivo apropiado para la hemólisis diferencial,
respectivamente - muestran que la adición de un reactivo de
hemólisis apropiado conduce en pocos minutos a una lisis completa de
los hematíes.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la eficiencia de lisis, se inyecta
una muestra de sangre total hemolizada preparada de acuerdo con el
ejemplo 1 en un sistema de HPLC y se monitoriza la contrapresión del
sistema.
El sistema de HPLC consiste en un cromatógrafo
líquido HP 1090 (Agilent) con un sistema de dispensación de
solventes DR 5, un termostato equipado con dispensador de muestra
automático y un inyector automático. La eficacia de lisis se evalúa
aplicando 50 veces 10 \muL de la muestra de sangre total tratada
en una columna de HPLC con partículas de 5 \mum de Symmetry C18
como material de lecho, una columna interna de 2 mm de diámetro,
una longitud de columna de 20 mm y un tapón de vidrio poroso con un
tamaño de poro de 0,5 \mum. El eluyente es un gradiente de agua
con ácido fórmico al 0,1% hasta acetonitrilo con 0,1% de ácido
fórmico en 5 minutos y a una tasa de flujo de 0,2 mL/min. El
aumento observado de contrapresión después de 50 inyecciones es
inferior a 20 bar.
Si se logra la lisis con agua destilada sólo, el
aumento observado de contrapresión bajo las condiciones anteriores
de HPLC es más de 100 bar.
\vskip1.000000\baselineskip
El reactivo de lisis se prepara mezclando 11,25
mL de solución de tiocianato de potasio (0,1 molar; es decir, 9,72
gramos de KSCN disueltos en 1 litro de agua destilada) con 12,5 mL
de tetrafluoroborato de
1-butil-4-metilpiridinio
(BMPBF_{4}) y 23,7 mL de cloruro sódico (0,15 molar en agua).
Este reactivo para hemólisis diferencial posee así una
concentración de alrededor del 25% de BMPBF_{4}. El tiocianato de
potasio está presente en una concentración molar mucho inferior y
así más probablemente no contribuye significativamente a los efectos
observados.
Se pipetean 250 microlitros de sangre total
anticoagulada con EDTA en un vial con 5 mililitros de este reactivo
de lisis. Para la hemólisis, el contenido del tubo se mezcla
agitando suavemente. Se obtiene un lisado ópticamente claro al cabo
de cinco minutos. El lisado se guarda a 4ºC. Se analiza la
estabilidad del lisado tras 1, 4 y 7 días mediante inspección
visual. El lisado permanece ópticamente claro durante 7 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Este reactivo de lisis se prepara mezclando 23,7
mL de solución de tiocianato de potasio (0,2 molar; 9,72 gramos de
KSCN disueltos en 0,5 litros de agua destilada) con 1000 mg de
cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio
(Me-octPCl) y 23,7 mL de cloruro sódico (0,15 molar
en agua). Este reactivo para hemólisis diferencial posee así una
concentración de alrededor del 2% de Me-octPCl.
Se pipetean 250 microlitros de sangre total
anticoagulada con EDTA en un vial con 5 mililitros de este reactivo
de lisis. Para la hemólisis, el contenido del tubo se mezcla
agitando suavemente. Se obtiene un lisado ópticamente claro al cabo
de cinco minutos. El lisado se guarda a 4ºC. Se analiza la
estabilidad del lisado tras 1, 4 y 7 días mediante inspección
visual. El lisado permanece ópticamente claro durante 7 días.
\vskip1.000000\baselineskip
En comparación con el Ejemplo 3.2, se prepara un
reactivo de lisis más concentrado al mezclar 470 \muL de solución
de tiocianato de potasio (1 molar) con 300 \muL de solución de
cloruro sódico (0,15 molar en agua) y 110 mg de cloruro de
1-metil-1-octilpirrolidinio.
Este reactivo para hemólisis diferencial posee una concentración de
alrededor del 15% de Me-octPCl.
Se pipetean 20 microlitros de sangre total
anticoagulada con EDTA en un contenedor con 80 microlitros de este
reactivo de lisis. Para la hemólisis, el contenido del tubo se
mezcla agitando suavemente. Se obtiene un lisado ópticamente claro
al cabo de cinco minutos. El lisado se guarda a 4ºC. Se analiza la
estabilidad del lisado tras 1 y 2 días mediante inspección visual.
El lisado permanece ópticamente claro.
\vskip1.000000\baselineskip
Este reactivo de lisis se prepara mezclando 80
microlitros de agua con 50 \muL de solución de cloruro sódico
(0,15 molar en agua) y 20 mg de cloruro de
3-carbamoil-1-octiloximetilpiridinio.
Este reactivo para hemólisis diferencial posee una concentración de
alrededor del 10% de COMPCl.
Se pipetean 50 microlitros de sangre total
anticoagulada con EDTA en un contenedor con 130 microlitros de este
reactivo de lisis. Para la hemólisis, el contenido del tubo se
mezcla agitando suavemente. Se obtiene un lisado ópticamente claro
al cabo de cinco minutos. El lisado se guarda a 4ºC. Se analiza la
estabilidad del lisado tras 1 y 2 días mediante inspección visual.
El lisado permanece ópticamente claro.
De los experimentos descritos anteriormente,
resulta obvio al experto en la materia que ahora es posible y
ventajoso incluir el anticoagulante directamente en el tubo de
muestras listo para usar, obteniendo así un tubo de muestras que
contiene un reactivo para hemólisis diferencial de una muestra de
sangre total, en el que dicho reactivo para hemólisis diferencial
también comprende un anticoagulante.
Claims (5)
1. Un tubo de muestras para la recolección y
procesado de una muestra de sangre total, conteniendo este tubo de
muestras un reactivo para la hemólisis diferencial de dicha muestra
de sangre total, en el que dicho reactivo para la hemólisis
diferencial comprende una sal y un anti-coagulante,
en el que dicha sal se selecciona de entre KBr; KJ; KSCN o una sal
que consiste en uno o más de los cationes
en los que m es 0 o 1 y n es 4 o 6
y los aniones son cloruro, tetrafluoroborato, octilsulfato, yoduro
y/o tiocianato, en el que dicho tubo de muestras es un tubo listo
para su uso y de un solo muestreo, y en el que dicha hemólisis
diferencial está presente si 50 alícuotas de 10 \muL de
hemolisado, es decir, una muestra de sangre diluída 1:10 en salina
fisiológica y mezclado 1:1 con dicho reactivo para la hemólisis
diferencial, puede aplicarse en un filtro de un sistema de HPLC con
un diámetro de 2 mm y 0,5 \mum de tamaño de poro sin bloquear
dicho
filtro.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El tubo de muestras de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho reactivo para la hemólisis
diferencial causa la lisis de las membranas celulares de los
hematíes y que al mismo tiempo no provoca una precipitación de los
constituyentes de la muestra.
3. El tubo de muestras de acuerdo con la
reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho reactivo para
la hemólisis diferencial comprende adicionalmente un inhibidor de
proteasas.
4. La utilización del tubo de muestras de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el
procesado de una muestra de sangre total para la cromatografía
líquida.
5. La utilización de una muestra de sangre
procesada obtenida mediante una hemólisis diferencial con un tubo de
muestras de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en
un análisis basado en la cromatografía líquida.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06011606 | 2006-06-06 | ||
| EP06011606 | 2006-06-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2336622T3 true ES2336622T3 (es) | 2010-04-14 |
Family
ID=37311856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07725794T Active ES2336622T3 (es) | 2006-06-06 | 2007-06-04 | Recipiente de recogida de sangre total lista para usar. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7863040B2 (es) |
| EP (1) | EP2030013B1 (es) |
| JP (1) | JP5030240B2 (es) |
| CN (1) | CN101467038B (es) |
| AT (1) | ATE452336T1 (es) |
| CA (1) | CA2649666C (es) |
| DE (1) | DE602007003832D1 (es) |
| ES (1) | ES2336622T3 (es) |
| WO (1) | WO2007140963A1 (es) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2447875T3 (es) | 2007-10-02 | 2014-03-13 | Theranos, Inc. | Dispositivos modulares para punto de cuidados y usos de los mismos |
| US7834313B2 (en) * | 2008-08-08 | 2010-11-16 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Mass spectrometry assay for plasma-renin |
| JP6151021B2 (ja) | 2009-06-01 | 2017-06-21 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | クロマトグラフ分離用ハイブリッド材料 |
| US11439977B2 (en) | 2009-06-01 | 2022-09-13 | Waters Technologies Corporation | Hybrid material for chromatographic separations comprising a superficially porous core and a surrounding material |
| CN109078626A (zh) * | 2009-12-15 | 2018-12-25 | 沃特世科技公司 | 实施体积排阻色谱的设备和方法 |
| JP5856162B2 (ja) | 2010-07-26 | 2016-02-09 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | 粒度分布の狭い実質的に非多孔質のハイブリッドコアを含む表面多孔質材料 |
| EP4024029A3 (en) | 2011-01-21 | 2022-09-14 | Labrador Diagnostics LLC | Systems and methods for sample use maximization |
| US8475739B2 (en) | 2011-09-25 | 2013-07-02 | Theranos, Inc. | Systems and methods for fluid handling |
| US9632102B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-04-25 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-purpose analysis |
| US9664702B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-05-30 | Theranos, Inc. | Fluid handling apparatus and configurations |
| US20140170735A1 (en) | 2011-09-25 | 2014-06-19 | Elizabeth A. Holmes | Systems and methods for multi-analysis |
| US10012664B2 (en) | 2011-09-25 | 2018-07-03 | Theranos Ip Company, Llc | Systems and methods for fluid and component handling |
| US9810704B2 (en) | 2013-02-18 | 2017-11-07 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
| WO2014151450A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Microfluidic distributing device |
| US9416776B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-08-16 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Microfluidic distributing device |
| ES2938089T3 (es) | 2015-08-13 | 2023-04-04 | Takeda Pharmaceuticals Co | Tubos de extracción de sangre al vacío que contienen inhibidores de proteasa para la evaluación de la activación del sistema de contacto |
| US20190134604A1 (en) | 2016-03-06 | 2019-05-09 | Waters Technologies Corporation | Porous materials with controlled porosity; process for the preparation thereof; and use thereof for chromatographic separations |
| CN108913322A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-11-30 | 湖南金裕环保科技有限公司 | 冷轧厂用平整液、制备方法及其使用方法 |
| CN111257453B (zh) * | 2020-02-11 | 2022-05-27 | 万舒（北京）医药科技有限公司 | 测定生物样品中的阿司匹林的方法、抗凝液及抗凝管 |
| JP7573112B2 (ja) * | 2020-12-22 | 2024-10-24 | ラジオメーター・メディカル・アー・ペー・エス | 血液学のために試薬を監視および調整する方法 |
| CN113049796B (zh) * | 2021-03-17 | 2022-04-19 | 上海良昕医疗器材有限公司 | 一种poct糖化血红蛋白分析仪 |
| WO2025119902A1 (en) * | 2023-12-04 | 2025-06-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Hemoglobin determination methods and systems |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2850603A1 (de) * | 1978-11-22 | 1980-06-19 | Merck Patent Gmbh | Haemolysierloesung und verfahren zur haemolyse von blut |
| JPS59196084A (ja) * | 1983-04-22 | 1984-11-07 | Terumo Corp | 血液処理器 |
| JPS6073356A (ja) * | 1983-09-29 | 1985-04-25 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 血液分析用試薬 |
| US4751179A (en) | 1984-05-31 | 1988-06-14 | Coulter Electronics, Inc. | Method and reagents for differential determination of four populations of leukocytes in blood |
| IL85532A (en) | 1987-03-13 | 1992-03-29 | Coulter Electronics | Method and lytic reagent system for isolation,identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples |
| JPH0774799B2 (ja) * | 1988-04-28 | 1995-08-09 | 積水化学工業株式会社 | 血中成分の測定法 |
| US5180677A (en) * | 1988-07-05 | 1993-01-19 | Fisher Scientific Company | Lysing reagent for leukocyte differentiation method |
| US5116615A (en) * | 1989-01-27 | 1992-05-26 | Immunolytics, Inc. | Method for treating benign prostatic hypertrophy |
| US5639630A (en) * | 1995-05-16 | 1997-06-17 | Bayer Corporation | Method and reagent composition for performing leukocyte differential counts on fresh and aged whole blood samples, based on intrinsic peroxidase activity of leukocytes |
| US5817518A (en) | 1995-12-18 | 1998-10-06 | Coulter International Corp. | Reagent and method for differential determination of leukocytes in blood |
| JPH10248828A (ja) | 1997-03-10 | 1998-09-22 | Nissho Corp | 溶血管 |
| JPH1123547A (ja) * | 1997-07-09 | 1999-01-29 | Tokuyama Sekisui Ind Corp | 液体クロマトグラフ用サンプリングループ及び液体クロマトグラフ |
| US5935857A (en) | 1997-08-01 | 1999-08-10 | Coulter International Corp. | Blood diluent |
| US5874310A (en) * | 1997-11-21 | 1999-02-23 | Coulter International Corp. | Method for differentiation of nucleated red blood cells |
| WO1999064480A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Waters Investments Limited | Novel ion exchange porous resins for solid phase extraction and chromatography |
| JP3429709B2 (ja) * | 1998-08-07 | 2003-07-22 | 積水化学工業株式会社 | 安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
| JP4391733B2 (ja) * | 1998-08-07 | 2009-12-24 | 積水化学工業株式会社 | ヘモグロビン類の測定方法 |
| JP3429679B2 (ja) * | 1998-08-07 | 2003-07-22 | 積水化学工業株式会社 | 安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
| JP2003207497A (ja) * | 2002-01-10 | 2003-07-25 | Sekisui Chem Co Ltd | 溶離液と溶血試薬及びヘモグロビン類の測定方法 |
| US6723236B2 (en) | 2002-03-19 | 2004-04-20 | Waters Investments Limited | Device for solid phase extraction and method for purifying samples prior to analysis |
| CA2489176C (en) * | 2002-06-11 | 2013-10-15 | Chempaq A/S | Lysing reagent, cartridge and automatic electronic cell counter for simultaneous enumeration of different types of white blood cells |
| ES2335011T3 (es) * | 2003-05-27 | 2010-03-18 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Procedimiento inmunocromatografico. |
-
2007
- 2007-06-04 AT AT07725794T patent/ATE452336T1/de active
- 2007-06-04 CA CA2649666A patent/CA2649666C/en active Active
- 2007-06-04 JP JP2009513586A patent/JP5030240B2/ja active Active
- 2007-06-04 EP EP07725794A patent/EP2030013B1/en active Active
- 2007-06-04 ES ES07725794T patent/ES2336622T3/es active Active
- 2007-06-04 DE DE602007003832T patent/DE602007003832D1/de active Active
- 2007-06-04 WO PCT/EP2007/004925 patent/WO2007140963A1/en not_active Ceased
- 2007-06-04 CN CN200780021092XA patent/CN101467038B/zh active Active
-
2008
- 2008-12-04 US US12/327,854 patent/US7863040B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2009540276A (ja) | 2009-11-19 |
| JP5030240B2 (ja) | 2012-09-19 |
| HK1134341A1 (en) | 2010-04-23 |
| CN101467038B (zh) | 2013-11-13 |
| US7863040B2 (en) | 2011-01-04 |
| US20090246866A1 (en) | 2009-10-01 |
| ATE452336T1 (de) | 2010-01-15 |
| EP2030013B1 (en) | 2009-12-16 |
| DE602007003832D1 (de) | 2010-01-28 |
| CA2649666A1 (en) | 2007-12-13 |
| EP2030013A1 (en) | 2009-03-04 |
| CN101467038A (zh) | 2009-06-24 |
| WO2007140963A1 (en) | 2007-12-13 |
| CA2649666C (en) | 2011-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2336622T3 (es) | Recipiente de recogida de sangre total lista para usar. | |
| ES2690319T3 (es) | Hemólisis diferencial de una muestra de sangre completa | |
| ES2417140T3 (es) | Preparación de muestras para CL-EM/EM mediante la utilización de partículas magnéticas | |
| JP5362564B2 (ja) | 細胞ヘモグロビンの測定方法 | |
| ES2352335T3 (es) | Detección de un analito en una muestra de sangre entera hemolizada. | |
| Javorska et al. | Modern methods for vancomycin determination in biological fluids by methods based on high‐performance liquid chromatography–A review | |
| EP1865318A1 (en) | Reagent for sample analysis, kit for sample analysis and method for sample analysis | |
| US10591496B2 (en) | Analyte extraction apparatus and method | |
| Khanna et al. | Separation and isolation of CD9-positive extracellular vesicles from plasma using flow cytometry | |
| US20190351407A1 (en) | Fiber rod, blood collection instrument, and blood test kit | |
| KR20180016510A (ko) | 혈액 분석 방법 및 혈액 검사 키트 | |
| US20230324412A1 (en) | Methods and compositions to determine the quality of red blood cell units | |
| HK1134341B (en) | Ready-to-use whole blood collection vessel | |
| HK1134135B (en) | Differential hemolysis of a whole blood sample | |
| HK1142131B (en) | Detection of an analyte in a sample of hemolyzed whole blood | |
| Norouzi | Extraction of indoxyl sulfate to its determination in patients with kidney disease | |
| HK1142131A (en) | Detection of an analyte in a sample of hemolyzed whole blood | |
| Korecka et al. | Quantitation of sirolimus using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS) |