WO2007105731A1

WO2007105731A1 - 氷核形成活性を有するタンパク質

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Publication number: WO2007105731A1
Application number: PCT/JP2007/054982
Authority: WO
Inventors: Satoru Chiba; Mitsutoshi Kubota; Satoko Nishizawa; Naoko Okamoto; Kenichi Suzuki
Original assignee: Nippon Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Nissui Corp
Priority date: 2006-03-13
Filing date: 2007-03-13
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2008-09-13
Also published as: EP2006296A1; WO2007105734A1; CN101400695A; US20090136649A1; AU2007225747A1; JPWO2007105734A1; JPWO2007105731A1; EP2006296A4; EP2006295A4; EP2006295A9; CN101400696A; AU2007225750A1; US20090054626A1; EP2006295A2

Abstract

　甲殻類由来のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約200,000の分子量であり、還元した場合、約86,000のバンドと約90,000のバンドを示し、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示される氷核形成活性を有するタンパク質。　このタンパク質は、ミール、キチン、キトサン原料に利用される以外はその大半が廃棄される甲殻類の殻に多く含まれるために、大量調製が可能で、かつ安価に生産することが出来る。また、食品由来のタンパク質であるから食品への添加に応用しやすい。本発明のタンパク質は、氷核形成活性および氷結晶の再結晶化阻害活性を有するため、冷凍食品等の品質保持などの目的に広く利用が可能である。

Description

明細書

氷核形成活性を有するタンパク質

技術分野

[0001] 本発明は、氷核形成活性を有するタンパク質、特に氷結晶の再結晶化阻害活性を有する氷核形成活性を有するタンパク質およびその製造方法、利用に関する。背景技術

[0002] 水は 0°Cで氷になるといわれている力厳密には、純水を冷やしても 0°Cでは凍り始めず、凝固点以下の温度でも凍結しない過冷却現象が知られている。水の凍結は、温度が o°c以下になると水の中に存在する何らかの物質が氷の核になり、結晶が成長するという過程で進行する。この凍結現象をコントロールすることができれば、食品の冷凍保存技術、微生物や生物組織の保存技術などをはじめ、人口降雨技術、冷熱輸送技術などあらゆる分野での利用が可能になると考えられている。

[0003] 水の凍結に関係する物質として注目されてレ、るのが、氷核タンパク質（Ice Nuclear Protein; INP)と不凍タンパク質（Anti-Freeze Protein; AFP)である。

[0004] 氷核活性細菌は、 - 20°Cでも凍結しなレ、純水を— 2〜― 4°Cで凍結させる能力をもつ細菌のことで、水が凍結を開始するときの核として働くことが明らかとなっており、このような細菌は植物に凍霜害を引き起こす原因になることが知られている。この氷核活性細菌としてはシユードモナス（Pseudomonas)属、エルウイニイァ（Erwinia)属の細菌が知られている（非特許文献 1、 2)。氷核タンパク質は、これら氷核活性細菌から得られる氷核活性を有するタンパク質である。氷核タンパク質は、微生物由来のものが大半であり、食品分野での利用も提案されている（特許文献 1 _4)力 S、あまり実用化されていないのが現状である。

特許文献 1 :特開平 6— 181729号

特許文献 2：特許 3028246号

特許文献 3 :特開平 6— 113712号

特許文献 4：特許 3090932号

非特許文献 l : Appl. Microbiol. 28， _P456, (1974) 非特許文献 2 : Proc. 4th Int. Cont. Plant. Path. Bact. P725, (1978) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、安全性、活性、生産性、価格等の面で、食品をはじめとする広い分野で使用できる氷核形成活性を有する物質を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0006] 発明者は、多くの種類の生物種から不凍タンパク質が見出されていることから、南極海に生息するォキアミにもそのようなタンパク質が含まれている力、もしれないとの考えに基づき、試験を開始したが、公知の文献に記載されているような方法では不凍活性を有する物質を得ることができなかった。抽出方法を工夫することにより、不凍活性を有するタンパク質を見出し、さらに氷核活性を有するタンパク質も見出した。さらにォキアミ以外の甲殻類にも注目した結果、同様の抽出方法を採用することにより類似の性質を有するタンパク質を得ることに成功した。

[0007] さらに、それら氷核活性を有するタンパク質が氷結晶の再結晶化阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。

[0008] 本発明は、（1)〜（2)の氷結晶の再結晶化阻害方法を提供する。

(1)氷核形成活性を有するタンパク質を用いる氷結晶の再結晶化阻害方法。

(2)氷核形成活性を有するタンパク質が甲殻類由来のタンパク質である（1)の氷結晶の再結晶化抑制方法。

[0009] 本発明は、（3)〜（5)の氷核形成活性を有するタンパク質を提供する。

(3)甲殻類由来の氷核形成活性を有するタンパク質。

(4)甲殻類由来のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場合、約 86,000のバンドと約 90,000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質である（3)の氷核形成活性を有するタンパク質。

(5)甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属するものである（3)又は (4)の氷核形成活性を有するタンパク質。

[0010] 本発明は、（6)〜（8)の氷核形成活性を有するタンパク質を含む氷核形成活性を有する甲殻類抽出物を提供する。

(6)甲殻類由来の氷核形成活性を有するタンパク質を含む氷核形成活性を有する甲殻類抽出物。

(7)甲殻類由来の氷核形成活性を有するタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SD S)一ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場合、約 86, 000のバンドと約 90, 000のバンドを示し、 N末端ァミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質である（6)の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物。

(8)甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属するものである（6)又は（7)の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物。

[0011] 本発明は、（9)〜（： 12)の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法を提供する。

(9)甲殻類の肉及び/又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び/又は内臓の抽出液をそのまま、あるいは、さらに精製して用いることを特徴とする甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

(10)精製により、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場合、約 86,000 のバンドと約 90,000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質を濃縮することを特徴とする（9)の甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

(11)甲殻類の殻、肉及び/又は内臓力界面活性剤を添加した抽出液で抽出することを特徴とする（9)又は（10)の甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

(12)甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属するものである（9)、（10)又は（11)の甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

[0012] 本発明は、（13)〜（： 17)の氷結晶の再結晶化を抑制することにより食品の凍結による品質劣化を抑制する方法を提供する。 (13)氷核形成活性を有するタンパク質を添加することを特徴とする氷結晶の再結晶化を抑制することにより食品の凍結による品質劣化を抑制する方法。

(14)氷核形成活性を有するタンパク質として（3)ないし（5)いずれかのタンパク質又は（6)ないし（8)のいずれかの甲殻類抽出物を添加する（13)の方法。

(15)食品が冷凍食品である（13)又は（14)の方法。

(16)冷凍食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である（13)、 (1 4)又は（15)の方法。

(17)冷凍食品が魚肉すり身、又は魚肉落し身である（16)の方法。

[0013] 本発明は、（18)〜（21)の氷核形成活性を有するタンパク質または氷核形成活性を有する甲殻類抽出物を含む食品の品質改良剤及び当該品質改良剤を添加した食品を提供する。

(18) (1)ないし（5)のいずれかの氷核形成活性を有するタンパク質、（6)ないし (8) のいずれかの氷核形成活性を有する甲殻類抽出物、又は、（9)ないし（12)いずれ力の方法で製造した氷核形成活性を有するタンパク質を含む食品の品質改良剤。

(19) (18)の品質改良剤を添加したことを特徴とする品質改良された食品。

(20)食品が冷凍食品である（19)の食品。

(21)食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である（19)又は（20 )の食品。

発明の効果

[0014] 本発明の氷核形成活性を有するタンパク質は、食品への添加に適した甲殻類由来のタンパク質であるから、各種食品に添加することができる。氷核形成活性を有するタンパク質については過冷却にならず、凍りやすいという性質を利用する用途は提案されている力食品への利用は極めて限られていた。し力、し、本発明では、氷核形成活性を有するタンパク質に氷結晶の再結晶化阻害活性を見出し、製造工程において冷凍工程を経る食品に添加することにより、冷凍による品質劣化を抑制することができる。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]実施例 1のォキアミから抽出したタンパク質のクロマトグラフィーのチャートを示した図である。

[図 2]実施例 1の Sephacryl S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィーのチャートを示した図である。

[図 3]実施例 2において本タンパク質試料 1の分子量を確認した、 SDS-ポリアクリルァミドゲルを用いた電気泳動の写真である。

[図 4]実施例 3の本タンパク質試料 1の氷核形成活性の測定結果を示す図である。

[図 5]実施例 3の本タンパク質試料 1の氷核形成活性の温度安定性を示す図である。

[図 6]実施例 4の本タンパク質試料 1の氷結晶の再結晶化阻害活性を示す図である。

[図 7]実施例 7のォキアミ熱水抽出物の電気泳動の写真である。

[図 8]実施例 8の本タンパク質試料 1を添加した落とし身の塩溶解性を示す図である。

[図 9]実施例 8の本タンパク質試料 1を添カ卩した落とし身の DMA生成量を示す図である。

[図 10]実施例 9の鶏卵に本タンパク質試料 1を添加した場合の凍結温度曲線を示す図である。

[図 11]実施例 10のすり身に本タンパク質試料 1を添加した場合の凍結解凍時の温度履歴を示す図である。

[図 12]実施例 10のすり身の加熱ゲルに本タンパク質試料 1を添加した場合の凍結曲線を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明において氷核形成活性を有するタンパク質 (以下、氷核タンパク質とも記す。）とは、水が凍結する際に過冷却になるのを抑制する作用を有するタンパク質であり、微生物由来のものが知られている。氷核形成活性は水の凍結のきっかけとなるもので、水の過冷却状態を氷点下のより高い温度で終了させる。人口雪の製造などにも用いられているが、冷凍食品への応用も検討されている。より高い温度で冷凍することができるのでエネルギーの節約のため、あるいは、液状食品の凍結濃縮、凍結乾燥など、過冷却を抑制できるという性質から予想される用途が提案されている。しかし、それらの用途のためには、微生物由来の場合、安全性などの懸念からか利用は進んでいない。 [0017] 本発明者らは、氷核タンパク質が単に過冷却を抑制するだけでなぐ氷結晶の再結晶化阻害活性を有することを見出した。凍結した水が温度上昇によりわずかに溶けた場合に、溶けた水が再度、残存している氷結晶のまわりに氷結するため、氷結晶の大きさはどんどん成長し大きくなつたり、小さい氷結晶同士が結合して大きな結晶を形成したりする現象がある。この現象は氷結晶の再結晶化と呼ばれる。氷結晶の再結晶化阻害活性とは、この再結晶化を抑制する活性である。すなわち、小さい氷結晶を小さいままで維持する活性である。本発明者らは、氷核タンパク質にはそのような氷結晶の成長あるレヽは結合を抑制し、氷結晶を小さレ、サイズのままで保持する性質を有することを見出した。この性質を見出したことにより、冷凍食品などの凍結の際だけでなぐ冷凍保存中の温度変化による食品の品質劣化も抑制することができ、氷核タンパク質の利用価値を高め、利用範囲を拡張することができる。

[0018] 本発明において、氷結晶の再結晶化阻害活性の有無は、氷結晶を顕微鏡で観察し、微小氷結晶数を観察する方法により測定した。すなわち、 30%スクロース溶液に溶解した氷結晶の再結晶化阻害活性を有するタンパク質試料 2 μ 1をカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟み、温度制御のできる光学顕微鏡 (ォリンパス社製 ΒΗ2型顕微鏡、リンカム社製 LK600温度制御装置）のステージに乗せ、冷却ステージ内の温度を 20°C 30°C 20°C 30°C 20°C 30°C 10°C の順に 0.1°C/秒で冷却、加熱を繰り返した後、— 10°Cで 30分保持し、 10.01 35 μ m²の面積を有する氷結晶を微小氷結晶として、その個数を数えた。氷結晶の再結晶化阻害活性を有する物質を添加しないと氷結晶は大きく成長し微小氷結晶が少なくなるが、氷結晶の再結晶化阻害活性あると微小氷結晶数が多くなる。

[0019] 本発明者らは、甲殻類からの抽出物に氷核形成活性を有することを見出した。微生物由来の氷核タンパク質では、安全性の面から使用がためらわれることが多レ、が、甲殻類はそれ自体が食品であり、本発明の氷核タンパク質は安心して食品に使用できるものである。甲殻類の肉、内臓等を圧搾して得た体液、あるいは、肉、内蔵、殻の水などの溶媒による抽出液がこの氷核形成活性を有する。この活性は、実施例に示すように 0 90°C程度の温度では安定なので、広く食品への利用が可能である。

[0020] 本発明において氷核形成活性は、タンパク質の添カ卩により水の凍結温度を上昇させる程度で評価した。具体的には、水道水 10mlにタンパク質溶液を 100 /i l加え、 5°C に設定しておいた冷却恒温槽中で 10分間インキュベーションし、その後、 0.3°C/分で温度を低下させ、凍結温度 (過冷却温度）を測定した。凍結温度が高いほど氷核形成活性が高いと評価する。

[0021] 本発明において甲殻類とは、節足動物大顎亜門甲殻網を指し、さらにカシラエビ亜網 (C印 harocarida)、ムカデェビ亜網 (Remipedia)、ミジンコ亜網 (Branchiopoda)、ァゴァシ亜網 (Maxillopoda)、ェビ亜網 (Malacostraca)に分類される動物を指す。特に水産産業上食用として多く利用されているェビ目（十脚目）に含まれるェビ、ザリガニ、力二、ォキアミ目のォキアミ、ナンキヨクオキアミ、シヤコ目のシヤコなどが挙げられる。

[0022] 本発明の氷核形成活性を有するタンパク質を精製、濃縮するには、タンパク質を抽出し、分離、濃縮するための一般的な方法を用いることができる。すなわち、甲殻類に存在するすべての組織を破砕し、得られた懸濁液を遠心分離し、不溶性物質を取り除く。この際に界面活性剤（陰イオン系、非イオン系、両性イオン系、陽イオン系、高分子界面活性剤など)を使用することにより可溶化が促進され、抽出性が増す。特に、非イオン系の界面活性剤が適している。得られた上澄みは次に示す一般的な方法でタンパク質を分離 ·濃縮することができる。塩析による方法として硫安分画による分離'濃縮方法。有機溶媒による分離'濃縮方法としてアセトン、エタノール、プロパノール、メタノールを用いた方法。塩酸、硫酸、三塩化酢酸を用いた酸沈殿法。水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール、デキストランを用いた分離'濃縮方法。限外ろ過 (膜濃縮）による分離'濃縮方法。イオン交換クロマトグラフィー担体、疎水クロマトダラフィー担体、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担体、逆相クロマトグラフィー担体、及びゲルろ過クロマトグラフィー担体でそれぞれ吸着 '分離することができる。さらには上澄みを加熱処理して他のタンパク質を熱変性させ沈殿させることもできる。また得られた分離物は凍結乾燥やスプレードライなどで粉末化することもできる。

[0023] 具体的には、本発明のタンパク質は肉、内臓、殻のいずれにも含まれているので、それら原料の冷凍品、生のまま、あるいは乾燥品をホモジナイザーで粉砕した上で水を加えて懸濁し、約 50°Cで 30分間、抽出する。この抽出物を遠心分離処理（1500 0Gで 3分間）すると、上清として氷核タンパク質溶液が得られる。抽出温度は 0〜80 °C、特に 0〜60°C程度が好ましい。温度を高くするとかえって抽出効率が低下する傾向があるからである。この粗抽出液のままでも氷核活性があるのでそのまま使用すること力 Sできる。濃縮、精製するには、「ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリノレアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場合、約 86,000のバンドと約 90,000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質」を濃縮、精製することを指標にして上述のタンパク質の精製、濃縮方法を組み合わせて行うことができる。

[0024] 本発明の氷核タンパク質は、氷結晶の再結晶化阻害活性を有するので、製造工程に凍結工程を含む食品、あるいは冷凍食品などの凍結による品質劣化を抑制するために使用することができる。特に冷凍耐性の低い食品、例えば、卵、魚肉、小麦粉などを原料とする食品の品質劣化を抑制することができる。

[0025] 魚肉のすり身、落し身においては、 TMAO (トリメチルァミン— N—ォキシド）が冷凍保存中に DMA (ジメチルァミン）とホルムアルデヒドに分解されるのを抑制する。ホルムアルデヒドは冷凍変性の原因として知られている。冷凍魚肉では、冷凍中に氷結晶の再結晶化が繰り返され、凍結濃縮が生じ、そのため、 TMAOの分解が促進されると考えられ、本発明の氷核タンパク質の氷結晶の再結晶化阻害活性により、この凍結濃縮が抑制され、結果として TMAOの分解が抑制されると考えられる。

[0026] 本発明のタンパク質は氷核形成活性、氷結晶の再結晶化阻害活性を有するので、食品に添加することにより、凍結による食品の劣化を抑制することができる。食品への添加量は、食品の種類、使用目的による力食品の総重量に対して、実施例 1の本タンパク試料 1程度の純度の場合で 0.00001%〜10%、好ましくは 0.001%〜0.1%程度添加するのが好ましい。

[0027] 以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1

[0028] く南極ォキアミ（ホール)からの氷核形成活性を有するタンパク質の抽出.精製〉冷凍南極ォキアミ 80gに対して 50mM炭酸水素アンモニゥム（pH7. 9)、lmM P MSFを含む抽出液 420mlを用いてホモジナイザーで懸濁した。この懸濁液に Triton -X100 (シグマ社製）を 0.1%になるように加えて、氷冷下で 1時間攪拌した。その後、この懸濁液を 10,000 X gで 30分間遠心分離を行い、得られた上清に対して硫安分画を行った。すなわち 35〜65%飽和の硫安を加えて得られる沈殿を 10,000 X gで 30 分間遠心分離を行い回収した。この沈殿に対して 1M硫酸アンモニゥム、 50mM炭酸水素アンモニゥム（PH7. 9) (A液）を含む溶液を加えて懸濁した。この懸濁液を 10 ，000 X g 20分間遠心して得られた上清を上記 A液の緩衝液で平衡化してある 2.6cm X 20cm (106ml)の疎水カラムクロマトグラフィー（TOYOPEARL Phenyl 650M 東ソ一社）に供与し、 50mM炭酸水素アンモニゥム (_PH7. 9) (B溶液）を用いて直線濃度勾配でタンパク質を溶出した。その結果、図 1に示すクロマトグラフィーの Aピークの画分を得た。

[0029] さらにこの画分を透析膜に入れ、その周囲にポリエチレングリコール 6000 (和光純薬工業株式会社製)をまぶし、 4°C下で約 3時間静置し約 10倍に濃縮した。これを次に 10mM炭酸水素アンモニゥム (pH7.9)溶液に 4°Cで一晩透析した。透析後、同溶液で予め平衡化しておいた 1.6011 60^11の3印1^0 S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィ一に供与した。図 2に示すクロマトグラフィーの矢印で示すピークの画分を得た。この画分を透析膜に入れ、蒸留水にて透析した後、それを凍結乾燥した。この精製方法により 80gの冷凍南極ォキアミから 80mgのタンパク質 (本タンパク質試料 1)を得た。

実施例 2

[0030] <本タンパク質試料 1の分子量等性質確認 >

本タンパク質試料 1の分子量を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した。 10%アクリルアミドゲルを用いて、 0. 1%SDS、 25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、 192mMグリシン（pH8. 6)を含む緩衝液を用いて、 12mAで約 2時間泳動を行った後、 CBB R-250でタンパク質を染色した。その結果このタンパク質は約 86kD a又は 90kDaの単量体によって構成される約 200kDaのサブユニット構造を有することが示された（図 3 ;最左列は分子量マーカー、左から 2列目は 200kDaのサブュニットを、 3列目は 86kDa又は 90kDaの単量体を示す）。糖鎖の確認は SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルを約 1時間室温で 7. 5%の酢酸溶液に浸した。次いで 0 .2%過ヨウ素酸に移し、 4°Cで 45分間インキュベートした。さらにシッフ試薬（和光純薬工業 (株)）に移し、 45分間冷凍した。その後、シッフ試薬を除き、 10%酢酸で洗浄した。その結果、 86kDa、 90kDa、 200kDaのバンドが発色し、これらのタンパク質には糖が付いていることが示された（図 3 ;右から 2列目）。脂質の確認は Nile Blue Aにより検出した。 Nile blue A溶液は 0.25gを 100mlの蒸留水に溶解し、その後濃硫酸を lmlカ卩え、その後、 2時間ボイルし、フィルターでろ過して作成した。この溶液中に電気泳動後のゲルを移し 50°Cで 30分間インキュベーションした。その後、 5% 酢酸溶液に移し、 50°Cで 2日間インキュベートし、さらにその後 0. 5%塩酸溶液に 5 分間インキュベートし、蒸留水で洗浄した。その結果、 86kDa、 90kDa、 200kDaのバンドが発色し、これらのタンパク質に脂肪酸が結合していることが示された（図 3 ;最右列)。

ぐアミノ酸配列分析 >

本タンパク質試料 ₁のN末端アミノ酸配列を分析した。すなわち、分子量の確認の方法と同様に SDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、セミドライ式転写装置を用いてポリフッ化ビニリデン膜に転写した。そして本タンパク質試料 1のバンドを切出し、その N末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（ABI社製 473A型プロティンシーケンサ一）で分析した。その結果、本タンパク質試料の N末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番号 1及び 2に示したとおりであることが明らかとなった。またこのことから、本タンパク質試料 1中には、類似のアミノ酸配列を持つアイソフォームが存在することが示された。

実施例 3

[0031] ぐ氷核形成活性の測定 >

上記本タンパク質試料 1につレ、て以下の方法で氷核形成活性を測定した。水道水 10mlにタンパク質溶液を 100 μ ΐカ卩え、 5°Cに設定しておいた冷却恒温槽中で 10分間インキュベーションし、その後、 0.3°C/分で温度を低下させ、凍結温度 (過冷却温度）を測定した。

[0032] その結果、図 4に示すように、タンパク質濃度が 0〜200 /i g/mlで濃度依存的に過却温度が上昇し、 100 μ g/mlで— 8°Cまで上昇した。対照とした水道水の過冷却温度は— 13°Cであった。したがって本タンパク質試料 1は過冷却温度を上昇する氷核形成活性を有するタンパク質であることが示された。

<氷核形成活性の温度安定性 >

本タンパク質試料 1の温度安定性について試験した。試料を 50mM 炭酸水素アンモニゥム水溶液 (_PH7. 9)に溶解し (タンパク質濃度 7.5mg/ml)、 0 90°Cにそれぞれ 1時間保持し、その後、氷核形成活性を測定した。その結果、 0°Cで保持した試料の活性に対して氷核形成活性は 90〜： 106%保持しており熱に安定であることが示された（図 5)。

実施例 4

[0033] <氷結晶の再結晶化阻害活性の測定 >

本タンパク質試料 1の氷結晶の再結晶化阻害活性として、氷結晶を顕微鏡で観察し、微小氷結晶数を観察した。すなわち、 30%スクロース溶液に溶解した本タンパク質試料 2 /i 1をカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟み、光学顕微鏡 (ォリンパス社製 BH2型）のステージに乗せ温度制御装置 (リンカム社製 LK600)により冷去 Pステージ内の温度を 20°C 30°C 20°C 30°C 20°C 3 0°C 10°Cの順に 0. 1°C/秒で冷却、加熱を繰り返した後、 10°Cで 30分保持し、 10. 01 35 x m²の面積を有する氷結晶を微小氷結晶として数えた。その結果、図 6に示すように、本タンパク質試料 1は、不凍活性を有しないにもかかわらず、濃度 2. 2 X 10— ^1(> 2. 2 X 10— ²mg/mlで魚類不凍タンパク質（AZF Protein Inc. AFP Typelll)とほぼ同様の氷結晶の再結晶化阻害活性が確認された。

[0034] ここで、他の氷核形成活性を有するタンパク質についてもこのような氷結晶の再結晶化阻害活性を有するかどうかについて試験した。サンプルとして氷核活性細菌である「菌体破砕物キサントモナス属製 (和光純薬工業）」を用い同様の実験を行った。図 6に示されるように、細菌由来の氷核形成タンパク質においても氷結晶の再結晶化阻害活性が確認された。これまでに氷核形成活性を有するタンパク質が再結晶化阻害活性を有するという報告例はないが、氷核形成タンパク質が、氷核形成時に多数の氷核を産生することにより、一つ一つの氷結晶の大きさを制限し、最終的な氷結晶の大きさに影響を与えていると推察される。この氷核形成タンパク質が氷結晶の再結晶化阻害活性を有するという結果は、新たな知見である。実施例 5

[0035] <南極ォキアミの各部位からの氷核形成活性を有するタンパク質の精製 >

上記氷核形成活性を有するタンパク質がォキアミのどの部位に多く含まれるかを確認するために眼球、身肉、肝瞎臓、殻に分けて、 SDS—ポリアクリルアミド電気泳動で確認したところいずれの部位にも存在することが確認された。特に殻に多く含まれることが確認されたので南極ォキアミの殻力も実施例 1と同じ方法で精製したところ、 10gの殻から 20mgのタンパク質が得られた。

実施例 6

[0036] く甲殻類由来タンパク質の氷核形成活性の測定 >

ォキアミ以外の甲殻類由来タンパク質の氷核形成活性の観察を行った。実施例 1と同様の方法により、タラバガ二、ズワイガニ、アメリカザリガニの殻からタンパク質を精製し、観察を行った結果、氷核形成活性を有することが確認された (表 1)。

[0037] [表 1]

実施例 7

<南極ォキアミからの氷核形成活性を有するタンパク質の熱水抽出 >

冷凍南極ォキアミ 15gをホモジナイザーで粉碎した上で水 15gを加えて懸濁し、異なる温度条件（50°C、 80°C、 100°C)で 30分間、インキュベートとし抽出物を作製した。次に得られた抽出物を遠心分離処理（15000Gで 3分間）し、得られた抽出液の SDS-ポリアクリルアミド電気泳動分析を行った。図 7に電気泳動結果を示す。尚、レーン Aには 50。C抽出物をレーン Bは 50°C抽出物の遠心上清、レーン Cは 80°C抽出物、レーン D は 80°C抽出物上清、レーン Eは 100°C抽出物、レーン Fは 100°C抽出物上清をァプラィした。図 7に示したように 80°C以上の抽出では目的とするタンパク質がほとんど確認されていない。一方、 50°C抽出物の遠心上清には大量に目的物が含まれており、効率よく抽出することが可能であることが確認された。

実施例 8

[0039] <食品への応用 1：水産物ースケソゥタラ落とし身への添加 _>

三陸沖で漁獲された鮮魚であるスケソゥタラから肉を採取し、 3mmメッシュのミンサ一で挽肉状にした。それを 500g取り、水 50g、砂糖 50gを加え、さらに本タンパク質試料 1をそれぞれ 0〜0. 1%になるように加え、卓上ミキサーで 25秒間攪拌した。これを落とし身サンプノレとして使用した。

[0040] 次にそれぞれを— 25°Cでー晚凍結し、その後— 10°Cで 2週間保存したものを保存性評価の指標となる塩溶解性、 TMAO分解度の測定用に用いた。

塩溶解†牛の沏 I定

落とし身 3gに 0.1M KC1 20mM Tris_HCl(pH7.5)溶液を 27ml加え、ホモジナイズした (10，000rpm X 30秒 3回）、その後、 5,000rpm X 10分間の遠心分離を行い、沈殿物を得て、さらにその沈殿物に上記同液を 27ml加えて攪拌する。再び 5，000rpm X lO分間の遠心分離を行い、得られた沈殿物に 0.5M KC1 20mM Tris_HCl(pH7.5)溶液を 27 ml加えて攪拌し、 1M ATP30 /i lカ卩えて一晚氷蔵下で保存する。その後攪拌し、ピウレット法にてその懸濁溶液の蛋白質濃度と容量を測定しておく。さらに懸濁溶液は 7， OOOrpm X 15分間遠心分離を行レ、、得られた上澄みの蛋白質濃度をビウレット法で測定し、併せて容量も測定した。以上の測定より、先の上澄み中の蛋白質量と懸濁液中の蛋白質量の比から塩溶解性を算出した。その結果、図 8に示すように塩溶解性については本タンパク質試料 1の添カ卩量とともに増加しており、本タンパク質試料 1 の添加により冷凍保存時のスケソゥタラ落とし身の劣化が抑制される傾向が示された

TMAOの分解反応の測定

落とし身サンプル 10gに対して蒸留水 10ml、 10%トリクロ口酢酸（TCA) 10mlを加えてホモジナイズする（12,000卬 m X 2分間）。その後遠心分離（7,500 X 20分）して上澄みを得る。沈殿物には 5%TCA溶液を 5ml加えよく攪拌し、遠心分離を行い上澄みを得る。この操作を 2回行い、ここまで得られた上澄みを 50mlメスフラスコ加え、さらに 5 %TCA溶液でメスアップし、これを TCA抽出液とする。 TCA抽出液 lmlと蒸留水 3mlを混合し、銅—アンモニア試薬 0.4ml、 5%二硫化炭素— ベンゼン溶液を添カ卩し、 40°C 5分間インキュベートした。その後、振とうを繰り返し、遠心分離 (3,500 X 5分）を行い、得られた上澄みに対して無水硫酸ナトリウム約 0.2g 入りの試験管に移し、その溶液を 440nmで吸光値を測定する。生成する DMA量は次の式で表される。

DMA量 (mM)= (440nm測定値） ÷ 1.3 X 2 X 50÷ 1000÷ (サンプル重量） X 1000

TMAOの分解による DMAの生成量は図 9に示すように本タンパク質試料 1の添加量により低下することが示された。本タンパク質試料 1の添カ卩により TMAOの分解により DMAと同等量のホルムアルデヒドが生じる。 DMAの生成量が抑制されたことは、ホルムアルデヒドの生成が抑制されたことを意味し、ホルムアルデヒドによる冷凍保存時のスケソゥタラ落とし身の冷凍変性が抑制されることを示す。

実施例 9

[0041] <食品への応用 2 :鶏卵の生全卵 >

鶏卵の生全卵 30mlに本タンパク質試料 1をタンパク質濃度で 0. 56mg添加した。次いで、その全卵を塩化ビニリデン性のケーシング（タレハロン DB56R)に入れて— 20°Cで 1日保管した。凍結時にはその温度履歴を測定した（図 10)。また凍結後、室温にて解凍し、沸騰水中で加熱し、ゲルを作製した。その結果、過冷却温度がコントロールでは _ 11°Cであるのに対して、本標品添加すると _8.56°Cへ上昇していることがわかった。また解凍後の全卵はコントロールではサラつとした流動性であるものが、本標品を添カ卩した全卵では未凍結とほぼ同じ様に粘性のあるものであつた。加熱ゲル断面を走查型電子顕微鏡で観察すると本標品添力卩品はゲルのネットワークが緻密であることがわかった。本標品の添カ卩により凍結全卵の品質を向上させることができた。

実施例 10

[0042] <食品への応用 3 :すり身 >

スケソゥタラ冷凍すり身 30gに本タンパク質試料 1をタンパク質濃度で 0. 56mg添加し、フードカッターで混合した。次いでそのすり身を塩化ビニリデン性のケーシング (タレハロン DB56R)に入れて— 20°Cでー晚保管した後、解凍した。凍結解凍時には温度履歴を記録した（図 11)。また解凍した後、ケーシングに詰めて沸騰水中で 3 0分間加熱した。その結果、凍結温度はコントロールでは 9°C付近で過冷却を起こす力本標品を添加すると 3°C付近で凍結が開始し、さらに過冷却は起きなレ、。また室温（25°C)での解凍では本標品を含むすり身は約 1時間 30分ほど遅れて解凍が始まる。またこれらのすり身の加熱ゲルの凍結曲線（図 12)を見ると最大氷結晶生成帯（一 1°C〜一 5°C)の通過時間は本標品を添加したほうが約 10分早く通過することがわかった。

産業上の利用可能性

本発明のタンパク質は、ミール、キチン、キトサン原料に利用される以外はその大半が廃棄される甲殻類の殻に多く含まれるために、大量調製が可能で、かつ安価に生産することが出来る。また、食品由来のタンパク質であるから食品への添加に応用しやすい。本発明のタンパク質は、氷核形成活性および氷結晶の再結晶化阻害活性を有するため、冷凍食品等の品質保持などの目的に広く利用が可能である。

[配列表フリーテキスト]

配列番号: 1

N末端アミノ酸配列

配列番号： 2

N末端アミノ酸配列

[配列表]

く 110〉 Nippon buisan Kaisha Ltd.

く 120〉氷核形成活性を有するタンパク質

く 130〉 YCT-1257

く 141〉 2007-03-13

く 150〉 JP 2006-67758

く 151〉 2006-03-13

く 160〉 2

く 210〉 1

く 211〉 20 く 212〉 PRT

く 213〉南極ォキアミ (Euphausiacea sp.)

く 400〉 DYDVAHEQQDVNAFLTKITG (一文字記号）

Asp Tyr Asp Val Ala His Glu Gin Gin Asp Val Asn Ala Phe Leu Thr

Lys He Thr Gly (三文字記号）

く 210〉 2

く 211〉 18

く 212〉 PRT

く 213〉南極ォキアミ (Euphausiacea sp.)

く 400〉 SDPKFQQDINTRLXNVYE (一文字記号）

¾er Asp Pro Lys Phe uln ln Asp lie Asn i'hr Arg Leu Xaa Asn Val

Tyr Glu (三文字記号)

Claims

請求の範囲

[1] 氷核形成活性を有するタンパク質を用いる氷結晶の再結晶化阻害方法。

[2] 氷核形成活性を有するタンパク質が甲殻類由来のタンパク質である請求項 1の氷結晶の再結晶化抑制方法。

[3] 甲殻類由来の氷核形成活性を有するタンパク質。

[4] 甲殻類由来のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場合、約 86,000のバンドと約 90,000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質である請求項 3の氷核形成活性を有するタンパク質。

[5] 甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属するものである請求項 3又は 4の氷核形成活性を有するタンパク質。

[6] 甲殻類由来の氷核形成活性を有するタンパク質を含む氷核形成活性を有する甲殻類抽出物。

[7] 甲殻類由来の氷核形成活性を有するタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場合、約 86, 000のバンドと約 90, 000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質である請求項 6の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物。

[8] 甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属するものである請求項 6又は 7の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物。

[9] 甲殻類の肉及び Z又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び/又は内臓の抽出液をそのまま、あるいは、さらに精製して用いることを特徴とする甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

[10] 精製により、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場合、約 86,000のバンドと約 90,000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質を濃縮することを特徴とする請求項 9の甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

[11] 甲殻類の殻、肉及び/又は内臓力界面活性剤を添加した抽出液で抽出することを特徴とする請求項 9又は 10の甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

[12] 甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属するものである請求項 9、 10又は 11の甲殻類由来の氷核形成活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。

[13] 氷核形成活性を有するタンパク質を添加することを特徴とする氷結晶の再結晶化を抑制することにより食品の凍結による品質劣化を抑制する方法。

[14] 氷核形成活性を有するタンパク質として請求項 3なレ、し 5レ、ずれかのタンパク質又は請求項 6ないし 8のいずれかの甲殻類抽出物を添カ卩する請求項 13の方法。

[15] 食品が冷凍食品である請求項 13又は 14の方法。

[16] 冷凍食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である請求項 13、 1 4又は 15の方法。

[17] 冷凍食品が魚肉すり身、又は魚肉落し身である請求項 16の方法。

[18] 請求項 1ないし 5いずれかの氷核形成活性を有するタンパク質、請求項 6ないし 8いずれかの氷核形成活性を有する甲殻類抽出物、又は、請求項 9ないし 12いずれかの方法で製造した氷核形成活性を有するタンパク質を含む食品の品質改良剤。

[19] 請求項 18の品質改良剤を添加したことを特徴とする品質改良された食品。

[20] 食品が冷凍食品である請求項 19の食品。

[21] 食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である請求項 19又は 20 の食品。